專利名稱：一種多表位瘧疾疫苗及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗及其編碼基因，特別是涉及一種瘧疾疫苗及其編碼基因。
瘧原蟲(chóng)生活史復(fù)雜，歷經(jīng)了4個(gè)不同的時(shí)期首先是感染的按蚊在叮咬時(shí)將瘧原蟲(chóng)子孢子注入血液，然后在幾分鐘內(nèi)子孢子迅速到達(dá)肝臟侵入肝細(xì)胞，接著在1-2周的時(shí)間，瘧原蟲(chóng)在宿主細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，導(dǎo)致感染的肝細(xì)胞破裂，釋放出成千上萬(wàn)的裂殖子，再次侵入紅細(xì)胞，一部分形成雌雄配子體，進(jìn)入有性期。從瘧原蟲(chóng)的生活周期可以看到，一旦到了裂殖子再次侵入紅細(xì)胞的階段，就很難通過(guò)疫苗和藥物的手段對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)的裂殖子進(jìn)行殺傷，所以目前人們對(duì)瘧疾疫苗的設(shè)計(jì)主要集中在針對(duì)瘧疾感染的紅細(xì)胞前期和紅細(xì)胞內(nèi)期的抗原，從而構(gòu)建了紅細(xì)胞前期疫苗(MHC)、紅細(xì)胞內(nèi)期疫苗、抗傳播疫苗、多價(jià)雜合瘧疾疫苗。
瘧疾疫苗的研制和運(yùn)用可為瘧疾的綜合治理提供有利的武器，對(duì)瘧疾疫苗的研究已經(jīng)近50年，最早是采用瘧原蟲(chóng)死疫苗或射線減毒的瘧原蟲(chóng)活疫苗，這種疫苗能夠保護(hù)人類免受瘧疾的侵襲，但用它來(lái)預(yù)防每年200到500萬(wàn)的新感染人群顯然是不可行的。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)及分子免疫學(xué)的迅速發(fā)展，已通過(guò)基因重組或人工合成多肽的方法獲得大量不同種屬瘧原蟲(chóng)的不同期的特異性抗原，在針對(duì)約氏瘧原蟲(chóng)產(chǎn)生具有保護(hù)性的抗體及細(xì)胞免疫反應(yīng)方面也取得了巨大的進(jìn)展。紅細(xì)胞前期疫苗候選抗原主要是瘧原蟲(chóng)的環(huán)子孢子蛋白CSP的運(yùn)用，惡性瘧原蟲(chóng)CSP的重復(fù)區(qū)外含有B細(xì)胞表位，這些B細(xì)胞表位可以直接激活B細(xì)胞，從而防止肝細(xì)胞感染或防止原蟲(chóng)在肝內(nèi)發(fā)育。因?yàn)橐恢桓腥疚玫耐僖合俪：袔浊€(gè)子孢子，而每個(gè)子孢子能感染一個(gè)肝細(xì)胞，所以該類疫苗可以有效降低瘧疾發(fā)病率，但保護(hù)力卻不能得到完全保證的，因?yàn)橹灰幸粋€(gè)子孢子進(jìn)入肝細(xì)胞，它即可以繁殖進(jìn)入紅內(nèi)期。紅細(xì)胞內(nèi)期疫苗的候選抗原有許多，主要包括有裂殖子主要表面抗原MSA1、MSA2及環(huán)狀體感染紅細(xì)胞表面抗原RESA，MSA1含有至少2個(gè)B細(xì)胞表位及3個(gè)T細(xì)胞表位，所以抗MSA1抗體可以抑制裂殖子侵入紅細(xì)胞，從而降低原蟲(chóng)密度。這幾個(gè)抗原都含有B細(xì)胞及T細(xì)胞激活表位，提示它們本身具有克服MHC限制的能力，可能成為理想的疫苗候選抗原。以這三種血液期保護(hù)性抗原的免疫活性部分構(gòu)建的Spf66雜合多價(jià)疫苗，是第一個(gè)抗惡性瘧原蟲(chóng)的化學(xué)合成疫苗，1988年由patarroyo率先合成，此雜合疫苗的45肽由惡性瘧原蟲(chóng)子孢子表面抗原重復(fù)序列NANP及血液期三個(gè)抗原的活性部分pfs35.1、pfs55.1、pfs83.1組成，抗45肽的抗體可以抑制體外活子孢子入侵肝細(xì)胞、體外裂殖子入侵RBC、蚊體中卵囊的發(fā)育，提示該疫苗對(duì)惡性瘧的各期都可能有效。惡性瘧Spf66自誕生起，已經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)次的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及不同瘧疾流行地區(qū)人群接種實(shí)驗(yàn)，主要臨床結(jié)果不完全一致，大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞，證實(shí)了Spf66使用安全、有免疫原性，且對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)及間日瘧原蟲(chóng)的攻擊都有較好的保護(hù)作用，但保護(hù)率差異較大，所以對(duì)它的有效性還存在爭(zhēng)議。抗傳播疫苗采用的為瘧原蟲(chóng)配子體期表達(dá)的特異蛋白pfs48/45，此蛋白誘生的特異性抗體能阻止配子受精及合子的發(fā)育，所以該類疫苗雖無(wú)直接的保護(hù)作用，但有降低及阻斷傳播的作用，其缺陷之一是某些抗體可能反而引起傳播增強(qiáng)。瘧疾核酸疫苗的研究最早是在1994年由Hoffman等用含約氏瘧原蟲(chóng)CSP基因的真核表達(dá)載體，肌肉注射小鼠后，產(chǎn)生了抗環(huán)子孢子蛋白的特異性抗體和CTL反應(yīng)，兩種反應(yīng)的水平均高于減毒子孢子的免疫，用5×105子孢子攻擊感染后的肝期原蟲(chóng)負(fù)荷下降86％，已接受2-3次免疫接種的小鼠，再以102子孢子攻擊，結(jié)果顯示對(duì)子孢子攻擊小鼠有68％被保護(hù)，說(shuō)明核酸疫苗接種可用于抗瘧疾感染。瘧疾DNA疫苗的首次臨床試驗(yàn)從1997年開(kāi)始，采用了瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白，結(jié)果顯示這種單一的DNA疫苗能被較好地耐受、安全且具有免疫原性，但這種疫苗只能對(duì)單一階段的瘧原蟲(chóng)起作用，預(yù)防范圍受到較大限制。
本發(fā)明的瘧疾疫苗，其活性成分為序列1編碼的蛋白質(zhì)。
所述疫苗中還可以含有醫(yī)用佐劑，例如福氏佐劑。
帶有序列1的質(zhì)粒，帶有序列1的生物細(xì)胞，特別是帶有序列1的真核細(xì)胞，尤其是帶有序列1的大腸桿菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
SPf66是惡性瘧原蟲(chóng)紅外期的T細(xì)胞表位，CSTE即CSP(368-397)，是惡性瘧原蟲(chóng)紅內(nèi)期的B細(xì)胞表位，含有廣譜的Th細(xì)胞表位CST3(378-397)及Tc細(xì)胞表位CSP(368-390)，NKNDD是發(fā)現(xiàn)于我國(guó)海南的一株惡性瘧的B細(xì)胞表位，CTB是霍亂毒素B亞基，無(wú)毒性，能與多種HLA-B，HLA-C分子結(jié)合，具有很強(qiáng)的免疫原性，能刺激產(chǎn)生粘膜IgA和血清IgG抗體，且是理想的載體蛋白和佐劑，能加強(qiáng)抗原表位的抗原性。本發(fā)明創(chuàng)造性地將SPf66、CSTE及NKNDD有機(jī)結(jié)合，又巧妙地選用CTB作為核酸疫苗的佐劑，以解決瘧疾抗原性弱的問(wèn)題。將各表位分別進(jìn)行基因合成，組合后融合在CTB基因的3’端，構(gòu)成融合基因CTB/SPf66/NKNDD/CSTE，以此融合基因構(gòu)建了瘧疾亞單位疫苗和DNA疫苗，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的疫苗對(duì)瘧原蟲(chóng)的攻擊具有明顯的保護(hù)作用，對(duì)于瘧疾預(yù)防將有巨大意義。
本發(fā)明的疫苗具有多階段、多價(jià)激發(fā)多種免疫反應(yīng)的特性，免疫了這種多價(jià)疫苗的接種者被感染的按蚊叮咬后，入侵的瘧原蟲(chóng)將被不同時(shí)期抗原產(chǎn)生的多重免疫殺傷和滅活，從而顯著降低感染，減輕病癥并阻斷傳播。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例2、本發(fā)明疫苗對(duì)感染瘧原蟲(chóng)的小鼠的保護(hù)性以200只小鼠為模型，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組以本發(fā)明的疫苗免疫，免疫后誘導(dǎo)了較高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫。以超量瘧原蟲(chóng)分別攻擊實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的小鼠，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組的小鼠免疫保護(hù)率達(dá)70％，對(duì)照組的保護(hù)率小于5％，說(shuō)明用本發(fā)明疫苗免疫的小鼠對(duì)瘧原蟲(chóng)具有免疫性。
實(shí)施例3、本發(fā)明疫苗對(duì)感染瘧原蟲(chóng)的恒河猴的保護(hù)性以10只恒河猴為模型，5只為實(shí)驗(yàn)組，5只為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組以本發(fā)明的疫苗免疫，免疫后誘導(dǎo)了較高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫。以超量猴瘧原蟲(chóng)攻擊實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的恒河猴，結(jié)果5只免疫組的動(dòng)物全部沒(méi)有感染，保護(hù)率為100％，而對(duì)照組的5只恒河猴全部感染，且感染持續(xù)30天以上。說(shuō)明用本發(fā)明的疫苗可以有效地對(duì)付瘧原蟲(chóng)。
序列表<160>2<170><210>1<211>676<212>DNA<213>artificial sequence<214>人工序列<220><223><400>1acacctcaaa atattactga tttgtgtgca gaataccaca acacacaaat acatacgcta60aatgataaga tattttcgta tacagaatct ctagctggaa aaagagagat ggctatcatt 120acttttaaga atggtgcaac ttttcaagta gaagtaccag gtagtcaaca tatagattca 180caaaaaaaag cgattgaaag gatgaaggat accctgagga ttgcatatct tactgaagct 240aaagtcgaaa agttatgtgt atggaataaa acgcctcatg cgattgccgc aattagtatg 300gcaaatgaat tctaacgcta accctggtga tgaactggaa acccagaacg tgtacgcagc 360cccgaatgcg aatccgtaca gcctgttcca gaaagagaaa atggtgctgc cgaacgccaa 420cccgccggcg aacaagaaga acgcgggtcc caacaagaac gatgataaca agaacgatga 480taacaagaac gatgataaca agaacgatga taacaagaac gatgataaca agaacgatga 540taacaagaac gatgataaca agaacgatga taacaagggg aaacctaaag acgaattaga 600ttatgaagat attgaaaaga agatcgctaa gatggaaaag gctagcagtg ttttcaacgt 660tgtggtacca tgataa 67權(quán)利要求
1.序列1的DNA。
2.帶有序列1的質(zhì)粒。
3.帶有序列1的生物細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物細(xì)胞，其特征在于所述生物細(xì)胞為真核細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物細(xì)胞，其特征在于所述生物細(xì)胞為大腸桿菌。
6.一種多表位瘧疾疫苗，它的活性成分為序列1編碼的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多表位瘧疾疫苗，其特征在于所述疫苗中還含有醫(yī)用佐劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多表位瘧疾疫苗，其特征在于所述醫(yī)用佐劑為福氏佐劑。
全文摘要
本發(fā)明為一種多表位瘧疾疫苗及其編碼基因。本發(fā)明的目的是提供一種多階段、多價(jià)激發(fā)多種免疫反應(yīng)的多表位瘧疾疫苗。本發(fā)明的瘧疾疫苗，它的活性成分為序列1編碼的蛋白質(zhì)，疫苗內(nèi)還可以含有醫(yī)用佐劑，特別是福氏佐劑。本發(fā)明的疫苗對(duì)瘧原蟲(chóng)的攻擊具有明顯的保護(hù)作用，對(duì)于瘧疾預(yù)防將有巨大意義。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1417329SQ0113139
公開(kāi)日2003年5月14日 申請(qǐng)日期2001年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月31日
發(fā)明者馬清鈞, 鐘輝, 曹誠(chéng) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所