專(zhuān)利名稱(chēng)：淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。
二.
背景技術(shù)：
及

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所述淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因是發(fā)明人在南京醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系昆蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用抑制性差減雜交(suppression substractionhybridization，SSH)結(jié)合基因芯片技術(shù)分離，并采用快速末端擴(kuò)增法(rapid amplification cDNA ends，RACE)篩選淡色庫(kù)蚊溴氰菊酯抗性品系cDNA表達(dá)文庫(kù)獲得。序列經(jīng)拼接獲得淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因cDNA全長(zhǎng)，為909bp；其開(kāi)放閱讀框架為783bp，編碼261個(gè)氨基酸。查閱GENBANK，其為新基因。該基因在抗溴氰菊酯淡色庫(kù)蚊中高表達(dá)，因此推測(cè)淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因可能與淡色庫(kù)蚊溴氰菊酯抗藥性相關(guān)。
由于淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因在GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中為新基因，本發(fā)明人對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)和功能研究成果均為開(kāi)創(chuàng)性的。美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)情報(bào)中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)已正式接收該基因?yàn)镚ENBANK的新成員，接收號(hào)為AY034060。
淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因核苷酸序列909bp1 UCGAGGGCCGAAUUCCGUUGCUGUCGACUUCCUCUCGUCCGGUAAACCGAAUCCAACGCA 6061 AUGGCCAAGUUAUUAGUGUUGACCACCUGUGCCCUUCUGGGCUUAACAUCUGGUGCCUCC 120121 CUCAAGUCCACCUUGAUGCCGAGCUUUUCGCGCGCAGGGAAAAUCGUCGGAGGGUUCCAG 180181 AUCGACGUCGUCGACGUCCCGUACCAGGUGUCGCUGCAGCGCAAUAACCGUCACCACUGC 240241 GGCGGAUCGAUUAUCGACGAGAGAUGGGUGCUGACGGCGGCCCACUGUACGGAGAAUACC 300301 GACGCCGGUAUCUACAGUGUGCGCGUCGGUUCGUCGGUACACGCCACCGGAGGACAGCUG 360361 GUCCCGGUGAAGGCCGUCCACAACCAUCCGGACUAUGAUCGCGAGGUCACCGAGUUUGAC 420421 UUUUGCUUGCUGGAGUUGGGCGAGCGUUUGGAGUUUGGCCACGCCGUUCAACCGGUUGAU 480481 CUGGUGCGGGACGAACCGGCUGACGAGAGUCAGUCGCUGGUUUCCGGCUGGGGAGACACG 540541 AGAUCGCUGGAGGAAUCCACCGAUAUCCUGAGGGGUGUUUUAGUUCCGUUAGUGAACCGC 600601 GAGGAAUGUGCCGAAGCUUACCAGAAGCUUGGUAUGCCGGUUACGGAGAGCAUGAUCUGC 660661 GCUGGAUUCGCCAAGGAAGGAGUCAAGGACGCCUGCCAAGGGGACAGCGGUGGUCCCCUG 720721 GUCGUGGACGGUCAACUGGCUGGAGUAGUAUCCUGGGGAAAGGGUUGCGCUGAACCUGGA 780781 UAUCCGGGAAUUUACUCCAAUGUUGUGUACGUCCGCGGUUGGAUCAAAAAGGUGGCCAAG 840841 GUUUAAAAACCCAAUAAAGUCUUAAAAUUUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 900901 AAAAAAAAA 909淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因氨基酸序列261aaMAKLLVLTTCALLGLTSGASLKSTLMPSFSRAGKIVGGFQIDVVDVPYQVSLQRNNRHHCGGSIIDERWVLTAAHCTENTDAGIYSVRVGSSVHATGGQLVPVKAVHNHPDYDREVTEFDFCLLELGERLEFGHAVQPVDLVRDEPADESQSLVSGWGDTRSLEESTDILRGVLVPLVNREECAEAYQKLGMPVTESMICAGFAKEGVKDACQGDSGGPLVVDGQLAGVVSWGKGCAEPGYPGIYSNVVYVRGWIKKVAKV淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的全新基因，目前人類(lèi)對(duì)于此基因的認(rèn)識(shí)和了解僅限于本發(fā)明人所做的研究工作。由于該基因在抗溴氰菊酯淡色庫(kù)蚊中高表達(dá)，因此該基因很可能與淡色庫(kù)蚊溴氰菊酯抗藥性發(fā)生密切相關(guān)，其表達(dá)量的上調(diào)可能引起抗藥性。該基因可用于①通過(guò)制備該基因的融合蛋白，研究該基因與抗藥性的關(guān)系，為昆蟲(chóng)抗藥性治理提供新的思路。
②制備特異性抗體，用于野外蚊蟲(chóng)抗藥性的監(jiān)測(cè)。現(xiàn)階段野外蚊蟲(chóng)抗藥性大規(guī)模檢測(cè)尚無(wú)行之有效的方法，可用該基因編碼蛋白的特異性抗體制成試劑盒，可大大簡(jiǎn)化操作步驟。
三.本發(fā)明的技術(shù)方案1.用抑制性差減雜交分離淡色庫(kù)蚊溴氰菊酯抗性相關(guān)基因取羽化3天內(nèi)未吸血的淡色庫(kù)蚊雌性成蚊，分別以對(duì)溴氰菊酯抗性品系、敏感品系為檢測(cè)組(tester)、對(duì)應(yīng)的為驅(qū)逐組(driver)，進(jìn)行正向、反向SSH，以獲取抗性相關(guān)高表達(dá)基因。分別提取兩品系蚊蟲(chóng)的總RNA、mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，置換法合成第二鏈，然后經(jīng)RsaI酶切、接頭連接、2輪差減雜交和2輪PCR，獲得正、反向差減雜交產(chǎn)物。雜交產(chǎn)物純化后將克隆入質(zhì)粒表達(dá)載體PinPointTMXa-1 T-Vector，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109。正、反向SSH分別獲得523和286個(gè)差減克隆，質(zhì)粒插入片段大小約300-600bp。
2.基因芯片鑒定克隆在抗性品系和敏感品系中的表達(dá)差異用PCR擴(kuò)增獲得的809個(gè)差減克隆，PCR產(chǎn)物經(jīng)濃縮、變性處理，用自動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)制于尼龍膜載體上，制成cDNA芯片。提取抗性品系和敏感品系mRNA，反轉(zhuǎn)錄后經(jīng)同位素33P標(biāo)記為抗性探針和敏感探針。將兩種探針?lè)謩e與2張相同的芯片雜交，通過(guò)洗膜、壓片、放射自顯影和信號(hào)掃描獲取量化的雜交信號(hào)，cDNA芯片共獲得差異表達(dá)克隆221個(gè)。其中在抗性品系中胰蛋白酶比敏感品系表達(dá)高3.2倍。
3.構(gòu)建淡色庫(kù)蚊抗性品系cDNA表達(dá)文庫(kù)以淡色庫(kù)蚊對(duì)溴氰菊酯的抗性品系為樣本，提取總RNA和mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一、二鏈。經(jīng)過(guò)EcoRI接頭連接、片段的磷酸化和NotI酶切等步驟，使cDNA片段的3’和5’兩端分別為NotI和EcoRI粘端。將這些帶有粘性末端的cDNA片段定向克隆入λExCell/NotI/EcoRI/CIP噬菌體載體，蛋白質(zhì)包裝使之成為有感染活性的噬菌體，最后將其轉(zhuǎn)染宿主菌一大腸桿菌NM522。淡色庫(kù)蚊抗性品系cDNA表達(dá)文庫(kù)庫(kù)容量為4.72×105個(gè)重組子，cDNA片段與載體重組率為100％。文庫(kù)插入片段大小平均約1.1kb。
4.RACE獲得淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因采用快速擴(kuò)增cDNA末端法篩選已構(gòu)建的cDNA文庫(kù)。根據(jù)已測(cè)定的淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因片段的序列設(shè)計(jì)2個(gè)引物，分別與插入片段兩側(cè)的文庫(kù)載體序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取胰蛋白酶基因的5’和3’RACE序列，然后通過(guò)T/A克隆插入Pinpoint質(zhì)粒載體，經(jīng)過(guò)測(cè)序、拼接獲取全長(zhǎng)序列。淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因全長(zhǎng)序列(GenBank/NCBI AY034060)，總長(zhǎng)度為909bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?83bp，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)編碼261個(gè)氨基酸。
盡管從原核生物到真核生物，全球科學(xué)家已就多物種的胰蛋白酶基因進(jìn)行了研究，但這是首次獲得的在淡色庫(kù)蚊抗藥性品系體內(nèi)高表達(dá)的胰蛋白酶全長(zhǎng)基因，這對(duì)進(jìn)一步研究昆蟲(chóng)抗藥性機(jī)制及其治理具有重要意義。
1.淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因核苷酸序列909bp1 UCGAGGGCCGAAUUCCGUUGCUGUCGACUUCCUCUCGUCCGGUAAACCGAAUCCAACGCA 6061 AUGGCCAAGUUAUUAGUGUUGACCACCUGUGCCCUUCUGGGCUUAACAUCUGGUGCCUCC 120121 CUCAAGUCCACCUUGAUGCCGAGCUUUUCGCGCGCAGGGAAAAUCGUCGGAGGGUUCCAG 180181 AUCGACGUCGUCGACGUCCCGUACCAGGUGUCGCUGCAGCGCAAUAACCGUCACCACUGC 240241 GGCGGAUCGAUUAUCGACGAGAGAUGGGUGCUGACGGCGGCCCACUGUACGGAGAAUACC 300301 GACGCCGGUAUCUACAGUGUGCGCGUCGGUUCGUCGGUACACGCCACCGGAGGACAGCUG 360361 GUCCCGGUGAAGGCCGUCCACAACCAUCCGGACUAUGAUCGCGAGGUCACCGAGUUUGAC 420421 UUUUGCUUGCUGGAGUUGGGCGAGCGUUUGGAGUUUGGCCACGCCGUUCAACCGGUUGAU 480481 CUGGUGCGGGACGAACCGGCUGACGAGAGUCAGUCGCUGGUUUCCGGCUGGGGAGACACG 540541 AGAUCGCUGGAGGAAUCCACCGAUAUCCUGAGGGGUGUUUUAGUUCCGUUAGUGAACCGC 600601 GAGGAAUGUGCCGAAGCUUACCAGAAGCUUGGUAUGCCGGUUACGGAGAGCAUGAUCUGC 660661 GCUGGAUUCGCCAAGGAAGGAGUCAAGGACGCCUGCCAAGGGGACAGCGGUGGUCCCCUG 720721 GUCGUGGACGGUCAACUGGCUGGAGUAGUAUCCUGGGGAAAGGGUUGCGCUGAACCUGGA 780781 UAUCCGGGAAUUUACUCCAAUGUUGUGUACGUCCGCGGUUGGAUCAAAAAGGUGGCCAAG 840841 GUUUAAAAACCCAAUAAAGUCUUAAAAUUUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 900901 AAAAAAAAAA 9092.淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因氨基酸序列261aaMAKLLVLTTCALLGLTSGASLKSTLMPSFSRAGKIVGGFQIDVVDVPYQVSLQRNNRHHCGGSIIDERWVLTAAHCTENTDAGIYSVRVGSSVHATGGQLVPVKAVHNHPDYDREVTEFDFCLLELGERLEFGHAVQPVDLVRDEPADESQSLVSGWGDTRSLEESTDILRGVLVPLVNREECAEAYQKLGMPVTESMICAGFAKEGVKDACQGDSGGPLVVDGGLAGVVSWGKGCAEPGYPGIYSNVVYVRGWIKKVAKV
權(quán)利要求
1.一種淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因，其特征是淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因氨基酸序列為MAKLLVLTTCALLGLTSGASLKSTLMPSFSRAGKIVGGFQIDVVDVPYQVSLQRNNRHHCGGSIIDERWVLTAAHCTENTDAGIYSVRVGSSVHATGGQLVPVKAVHNHPDYDREVTEFDFCLLELGERLEFGHAVQPVDLVRDEPADESQSLVSGWGDTRSLEESTDILRGVLVPLVNREECAEAYQKLGMPVTESMICAGFAKEGVKDACQGDSGGPLVVDGQLAGWSWGKGCAEPGYPGIYSNVVYVRGWIKKVAKV
2.一種淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因，其特征是應(yīng)用抑制性差減雜交，結(jié)合基因芯片技術(shù)分離，并采用快速末端擴(kuò)增法篩選淡色庫(kù)蚊溴氰菊酯抗性品系cDNA表達(dá)文庫(kù)獲得。
3.一種淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因制備的融合蛋白，其特征是融合蛋白可用作制備治理昆蟲(chóng)抗藥性的有關(guān)藥物。
4.一種淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因制備的特異性抗體，其特征是可用該抗體制成試劑盒，用于野外蚊蟲(chóng)抗藥性的監(jiān)測(cè)與抗性機(jī)理的研究。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域,所述淡色庫(kù)蚊胰蛋白酶基因(Culex pipiens pallens trypsin)基因全長(zhǎng)為909bp,其開(kāi)放閱讀框架為783bp,編碼261個(gè)氨基酸。該基因在GENBANK中的編號(hào)為AY034060。本發(fā)明應(yīng)用抑制性差減雜交(suppression substraction hybridization,SSH)結(jié)合基因芯片技術(shù)分離,并采用快速末端擴(kuò)增法(rapid amplification cDNAends,RACE)篩選淡色庫(kù)蚊溴氰菊酯抗性品系cDNA表達(dá)文庫(kù)獲得。利用該基因制備融合蛋白及特異性抗體,用于制備與抗藥性治理有關(guān)的藥物及試劑盒。
文檔編號(hào)C07K16/40GK1354253SQ01138030
公開(kāi)日2002年6月19日 申請(qǐng)日期2001年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月24日
發(fā)明者馬磊, 朱昌亮, 沈波, 田海生, 李秀蘭, 胡鶯, 楊明夏 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)