專利名稱：蚓激酶及其在血栓性疾病治療中的應(yīng)用的制作方法
一、研究領(lǐng)域本研究涉及蚓激酶cDNA的克隆、核苷酸序列分析及生產(chǎn)其編碼蛋白的方法和表達(dá)產(chǎn)物對纖維蛋白的溶解活性等方面；該基因的表達(dá)產(chǎn)物可能應(yīng)用于人類血栓性疾病的預(yù)防和治療。
國內(nèi)外研究現(xiàn)狀二、血栓性疾病的發(fā)病率和死亡率均較高，并呈逐年升高趨勢。
目前臨床上用于治療血栓性疾病的藥物，有的副作用較大，易引起出血，有的價(jià)格昂貴，且需靜脈給藥，使用不方便(秦智勇.溶栓療法治療急性血栓性腦梗死的實(shí)驗(yàn)研究.國外醫(yī)學(xué)腦血管疾病分冊，1998，6(1)31；CollenD.Thrombolytic therapy.Thrombosis and Haemostasis.1997，78(1)742.)。1983年Mihara等從蚯蚓粗提物中分離到一組具有纖溶酶活性的蛋白質(zhì)，首次命名為蚓激酶(Mihara H，Sumi H，Akazawa T，et al.Fibriolytic enzymeextracted from the earthworm.Thromb Haemostas，1983，50258.)。大量研究表明蚓激酶無論靜脈或口服給藥，均具有溶栓作用(姜東勝，張國楨，王寶珍，等.赤子愛勝蚓纖溶酶的藥理性質(zhì)探討.上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，20(1)16.；揚(yáng)樹東，王平，李金榮，等.蚯蚓纖溶活性成分的抗凝及溶血栓作用.心肺血管雜志，1997，16(3)228.；短平，胡淑麗，曾耀輝.蚯蚓溶栓酶對大鼠凝血及纖溶指標(biāo)的影響。時(shí)珍國藥研究，1997，8(1)14)。蚓激酶作為蛋白質(zhì)口服藥物，先后在韓國和中國上市，在腦血管血栓性疾病治療中顯示出明顯的療效(龐式琪，丁銘臣，謝淑萍，等.抗血栓新藥博洛克治療缺血性腦血管病的臨床觀察.中華神經(jīng)精神科雜志，1993，26(4)229.；黃德銘，陳百華，張國楨，等.蚯蚓酶治療腦血栓形成的臨床探討.1992，12(4)3.)。目前應(yīng)用的蚓激酶多是一組分子量20-60KD，pI3-5，具有激酶和溶酶活性的絲氨酸蛋白酶混合物，不易失活，具有較好的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性，多數(shù)為單體酶。藥效學(xué)研究顯示蚓激酶具有纖溶、抗凝、減輕缺血性腦損傷、改善血液流變性等多方面的作用，主要用于腦血管血栓性疾病的治療(揚(yáng)明，董桂華，張風(fēng)琴，等。赤愛勝蚯蚓纖溶酶的研究IV.蚯蚓溶栓酶對家兔血栓溶解及大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血的保護(hù)作用研究。生物技術(shù)，1995，5(3)9.；王彥生，富成志.雙胸蚯蚓溶栓酶對沙土鼠腦缺血再灌注腦勻漿中ET，TXB2和6-keto-PGF1α的影響。沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，11(1)5.；張祖徇，鐘良偉，鄭國平，等.蚯蚓酶制劑對家兔血液流變學(xué)的影響.山西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1992，23(1)1)。研究發(fā)現(xiàn)，蚓激酶在治療中出凝血時(shí)間沒有明顯延長，未發(fā)現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)等不良副作用，是目前較為安全的溶栓藥物，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。有不少實(shí)驗(yàn)室曾嘗試蚓激酶基因的克隆和表達(dá)研究，但無文獻(xiàn)報(bào)道，先后有四條蚓激酶全長基因登陸到GeneBank上，基因表達(dá)及功能研究尚不清楚。我們根據(jù)其同源序列應(yīng)用RT-PCR克隆到一條新的蚓激酶基因，并對其生物活性進(jìn)行了初步探討。
三、本發(fā)明總結(jié)利用RT-PCR技術(shù)從蚯蚓腸道組織發(fā)現(xiàn)一種蚓激酶，堿基序列同已GeneBank登陸的序列有99％同源性，編碼的氨基酸序列有三個(gè)不一致。構(gòu)建原核及真核表達(dá)載體，證明其表達(dá)產(chǎn)物具有纖溶酶活性。蚓激酶可能用于人類血栓性疾病的預(yù)防和治療。
四、主要圖表說明為了更好地理解本研究的內(nèi)容，下面對主要圖表加以說明

圖1顯示蚓激酶全長編碼區(qū)cDNA序列。
圖2蚓激酶完整的氨基酸序列。
五、實(shí)施例1.材料赤子愛勝蚓，購自北京蚯蚓養(yǎng)殖廠；總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑及PCR試劑盒均購于Promega公司；原核表達(dá)載體pBV 220，本實(shí)驗(yàn)室保存，pET22b+由北京生物工程研究所趙志虎博士提供，真核表達(dá)載體pPIC9、pHIL-S1和pcDNA3.1(+)為本實(shí)驗(yàn)室保存，脂質(zhì)體購自CLONTECH公司；JM103、JM109及BL21細(xì)菌菌株、GS115酵母株和COS-7細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存。
2、赤子愛勝蚓總RNA的提取選一條大小適中的赤子愛勝蚓，在清水中浸泡過夜，使其翻盡腸中泥沙，稱取約100mg組織，剪碎，迅速將其投入置有預(yù)冷TRIZOL的勻漿器中，充分勻漿，而后按TRIZOLTM試劑盒進(jìn)行操作，RNA甲醛變性電泳證明RNA完整性良好，紫外分光光度計(jì)測定濃度，表明RNA純度較高，-20℃保存。
3、反轉(zhuǎn)錄及目的序列PCR以O(shè)ligo(dT)為起始引物，加入2μg總RNA，用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄，體系25μl。先將引物和模板混合70℃保溫5分鐘，然后迅速冷至0-4℃，加入其它反應(yīng)成分，補(bǔ)DEPC水至25μl，37℃，60分鐘，-20℃保存。根據(jù)GeneBank U25643端序列合成引物上游5’atg tta ctt ctcgcc ctt gc 3’；下游5’tca gtt gtt gtt ggt aat aat gtc t3’，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR10×REACTION緩沖液，5μl；25mM MgCl2，2μl；2.5mM dNTPs，1.6μl；20uM引物各0.2μl；模板2μl；Taq聚合酶，2μl；加水至20μl。反應(yīng)條件為95預(yù)變性5分鐘；95℃30秒，50℃30秒，72℃60秒；共30個(gè)循環(huán)，而后72℃延伸7分鐘.用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。凝膠成像儀掃描成像，電泳結(jié)果表明，PCR得到一約850bp的單一產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物回收，并將其克隆到pUCm-T載體上，用氯化鈣法制備的感受態(tài)E.coli JM109，轉(zhuǎn)化后鋪在含氨芐青霉素的LB平板上，進(jìn)行藍(lán)白班篩選，將具白班的克隆挑5個(gè)進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切鑒定。電泳分析，取有與PCR產(chǎn)物一致的質(zhì)粒，以通用引物T7，SP6雙向測序(上海生工)，得到一852bp的全長序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本序列與U25643有高達(dá)99％的同源性，有完整的讀框，該序列編碼283個(gè)氨基酸。其中成熟肽含240氨基酸，其推演編碼蛋白質(zhì)分子量為26.6KD。
4、原核表達(dá)載體構(gòu)建及其表達(dá)根據(jù)擴(kuò)增序列設(shè)計(jì)引物，上游為5’cg gaa ttc a atg att gtc gga gga att gaa g 3’，下游為5’cc aag ctt cta gtt gtt ggt aat aat gtc t 3’.以陽性克隆cDNA為模板進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后回收，將回收產(chǎn)物用EcoRI，HindIII雙酶切，同時(shí)用該組酶切pBV220空載體，然后將目的片段定向克隆到pBV220上，取約10ng的連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化氯化鈣法制備的感受態(tài)E.coli JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含氨芐青霉素的LB平板上30℃培養(yǎng)過夜，挑轉(zhuǎn)化子于10mL含氨芐青霉素的LB液體基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoRI，HindIII雙酶切，將含有外源基因的重組子測序，結(jié)果顯示插入方向正確，堿基序列無突變。將單個(gè)陽性克隆于5mL含氨芐青霉素的LB液體基中30℃培養(yǎng)過夜，次日取5％轉(zhuǎn)接，30℃培養(yǎng)至OD600≅0.4~0.5]]>，迅速提高培養(yǎng)溫度42℃，繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)，離心收集細(xì)菌，SDS-PAGE檢測，表明有特異的蛋白表達(dá)帶，分子量約為26.6KD，與理論值一致，纖維蛋白平板法檢測該表達(dá)產(chǎn)物具有纖溶活性。
5.COS-7細(xì)胞表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)根據(jù)蚓激酶cDNA序列設(shè)計(jì)引物，上游為5’cc aag ctt atg tta ctt ctc gcc ctt gc 3’，下游為5’cg gaa ttc tca gtt gtt aat aat gtc t 3’，以陽性克隆cDNA為模板進(jìn)行PCR，電泳分離目的帶，用EcoRI，NotI雙酶切目的片段及pcDNA3.1(+)空載體，如前法進(jìn)行定向連接，轉(zhuǎn)化篩選重組子，并進(jìn)性酶切，PCR鑒定正確連接的重組子。而后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，細(xì)胞在培養(yǎng)基，5％CO2，37C條件下培養(yǎng)48小時(shí)，轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間取出少量培養(yǎng)上清，應(yīng)用纖維蛋白平板法檢測纖溶活性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后24小時(shí)至48小時(shí)的上清具有纖溶活性。
6.重組蚓激酶的理化特性及動(dòng)物體內(nèi)療效評價(jià)研究正在進(jìn)行中。
總之，本發(fā)明公開了一種蚓激酶的核苷酸序列，并觀察了表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性，此序列可重組于任何表達(dá)載體，以進(jìn)行原核、真核(如細(xì)菌、酵母、昆蟲、高等動(dòng)植物、培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞等)的表達(dá)。
由于重組蚓激酶具有纖溶活性，因此，本發(fā)明的重組多肽產(chǎn)品或配有稀釋劑、輔劑等的制品可能應(yīng)用臨床治療各種血栓性疾病。
權(quán)利要求
1.一種蚓激酶，具有如下cDNA序列ATGTTACTTCTCGCCCTTGCATCGTTGGTAGCGGTGGGTTTTGCGCAACCACCAGTCTGGTACCCCGGTGGTCAATGCGGTGTCAGCCAGTACTCAGATGCTGGTGACATGGAACTTCCTCCCGGAACAAAAATTGTCGGAGGAATTGAAGCCAGACCATACGAGTTCCCATGGCAGGTGTCCGTCCGAAGGAAGTCTTCCGATTCCCATTTCTGCGGAGGTAGCATTATCAACGATCGTTGGGTTGTCTGCGCTGCTCACTGCATGCAGGGAGAGAGCCCTGCCCTGGTTTCCTTGGTCGTCGGTGAGCACGACAGCAGCGCTGCGAGTACAGTACGTCAGACTCATGACGTTGACAGCATCTTCGTCCACGAGGACTACAACGGAAATACCTTTGAGAACGACGTTTCTGTCATCAAGACAGTTAACGCCATCGCTATCGACATCAACGTTGGGCCAATCTGCGCTCCAGATCCAGCCAACGATTACGTCTACCGTAAGAGCCAGTGCTCCGGATGGGGAACTGTCAACTCAGGTGGAGTCTGCTGCCCCAACGTTCTGCGATATGTGACACTGAACGTCACAACCAACGCCTTCTGCGATGATATCTACAGCCCATTATATACAATTACCAGCGACATGATCTGCGCCACGGACAACACCGGACAGAACGAGAGAGACTCTTGCCAGGGTGACTCTGGCGGCCCTCTGAGCGTCAAGGATGGCAGCGGAATCTTCAGCCTCATTGGTATTGTGTCTTGGGGAATCGGTTGCGCATCTGGATATCCAGGAGTCTACGCCCGCGTCGGATCCCAAACTGGATGGATCACAGACATTATTACCAACAACTGA
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述cDNA序列，它包括所列cDNA序列的互補(bǔ)鏈，以及類似的人工合成序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述cDNA編碼蛋白，其氨基酸序列如下MLLLALASLV AVGFAQPPVW YPGGQCGVSQ YSDAGDMELP PGTKIVGGIEARPYEFPWQV SVRRKSSDSH FCGGSIINDR WVVCAAHCMQ GESPALVSLVVGEHDSSAAS TVRQTHDVDS IFVHEDYNGN TFENDVSVIK TVNAIAIDINVGPICAPDPA NDYVYRKSQC SGWGTVNSGG VCCPNVLRYV TLNVTTNAFCDDIYSPLYTI TSDMICATDN TGQNERDSCQ GDSGGPLSVK DGSGIFSLIGIVSWGIGCAS GYPGVYARVG SQTGWITDII TNN-
4.一種重組生產(chǎn)權(quán)利要求3所述蛋白的方法，其特征是將權(quán)利要求1-2所述DNA序列置于合適載體，轉(zhuǎn)化原核或真核宿主細(xì)胞，得到蚓激酶。
5.權(quán)利要求3，所述的蛋白在制備治療血栓性疾病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用同源結(jié)構(gòu)域克隆到的，能編碼一種蚓激酶的全長cDNA序列、其所編碼的氨基酸序列和可能的功能。其氨基酸序列全長為852bp，能編碼283個(gè)氨基酸組成蛋白的開放閱讀框架，理論推算此蛋白分子量為31KD，由原核或真核產(chǎn)生的重組蚓激酶具有體外溶栓活性，提示重組蚓激酶有可能應(yīng)用臨床治療各種血栓性疾病。
文檔編號C07H21/00GK1408858SQ0114141
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月24日
發(fā)明者從玉文, 董國清, 王金惠, 苑曉玲, 善亞軍, 陳家佩 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所