專利名稱：丙型肝炎病毒第一高變區(qū)抗原及其融合抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一系列具有高交叉反應(yīng)性的丙型肝炎病毒第一高變區(qū)抗原及含多個不同第一高變區(qū)的融合抗原。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)基因是1989年首次克隆成功，自此掀起了研究HCV的熱潮(Choo QL.et al.Isolation of a cDNA clone derived from blood-bornenon-A，non-B viral hepatitis genome，Science，1989；244359-362)。HCV病毒為單鏈RNA病毒，全長約9500個堿基，編碼一個約為3000個氨基酸殘基的多蛋白前體，繼而在宿主及病毒基因編碼蛋白酶的作用下，加工成C、E1、E2、NS2-5等多種成熟蛋白。HCV整個基因組具有很高的變異性，其中位于E2區(qū)N端的27個氨基酸變異性最大，通常稱為第一高變區(qū)(HVR1)，由于HVR1是目前已知丙型肝炎病毒中唯一的中和性抗原表位(Farci P.etalPrevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees after antibody-mediated invitro neutralization.Proc Natl Acad Sci USA，1994；9615394-15399)，其抗體的水平與病情有關(guān)(Zibert.A etal Antibodies in Human Sera Specific toHypervariable Region 1 of Hepatitis C Virus Can Block Viral Attachment，Virology，1995；203653-661)，所以HVR1抗體可能和疾病轉(zhuǎn)歸關(guān)系密切。利用RT-PCR等方法將HVR1的基因克隆表達(dá)后可用于HVR1抗體水平檢測，但該方法程序復(fù)雜，并且只能檢測單株病毒的抗體。這樣，至今仍然沒有簡單而有效的檢測HVR1抗體的手段，亟需具有極高交叉反應(yīng)性的HVR1抗原，通過ELISA對病人的HVR1抗體進(jìn)行檢測。
丙型肝炎病毒是一種危害性極大的病毒，慢性化比率高達(dá)70％，其中有50％的病人發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌，目前對丙型肝炎的治療方法主要是干擾素或干擾素與病毒唑合并使用，價格昂貴，副作用大，療效差(Fried MW andHoofnagle JH.Therapy of hepatitis C，Semin Liver Dis，1995；1582-91)。所以丙型肝炎疫苗的研制倍受關(guān)注。但也由于丙型肝炎病毒的中和性表位位于變異性最大的HVR1，這給HCV疫苗的研制帶來很大困難，成功的關(guān)鍵在于獲得高免疫交叉反應(yīng)的高變區(qū)抗原。最近有不少研究證明HVR1仍具有一定的交叉免疫反應(yīng)性，并初步篩選到這樣一些HVR1(Puntoriero G et al.Towards asolution for hepatitis C virus hypervariabilitymimotopes of the hypervariableregion 1 can induce antibodies cross-reacting with a large number of viral variants，J.EMBO，1998；173521-3533)。但我們認(rèn)為通過一條HVR1引起的交叉性畢竟是有限的，我們設(shè)想如果能將幾個具有高交叉免疫反應(yīng)性的HVR1片段用基因重組的方法連到一起，可能會獲得可與絕大多數(shù)病人血清發(fā)生免疫反應(yīng)的多肽，可為疫苗研究提供真正有效的免疫原。
本發(fā)明的目的是提供一系列具有高交叉反應(yīng)性的單片段的重組HVR1抗原。
本發(fā)明的另一個目的是提供一個高交叉反應(yīng)性的含多個HVR1的融合抗原。

發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的發(fā)明人從大量文獻(xiàn)報(bào)道(國內(nèi)與國外)不同的HVR1序列中，篩選出可能具有高交叉反應(yīng)性的HVR1，合成基因重組表達(dá)，并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其交叉反應(yīng)性，它們的氨基酸序列為STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQKSTHVTGGVQGHSLRGLTSLFTSGPAQKITRVTGGVQGHSLRSLTSLFTPGPAQKSTHVTGAVQGRSLQSFTSFLSPGPSQK
DTHVTGGAAARGASGLANLFTSGPAQKGTYVTGGATAHTASGFASLFTTGSKQNTTHVTAGTAAHATSSFTKLFAPGAKQNETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGKSQNNTYVTGGSAAHTTSRFTSLFSPGPQQNTTTTTGGVQGHTTRGLVRLFSLGSKQNDTTVTGGQAARTTQSFTSLFPPGPSQK或QTTTTGGSASHAVSSLTGLFSPGSKQN。
用基因重組的方法將其中的兩個或兩個以上的序列連接在一起，可獲得具有更高交叉反應(yīng)的重組HVR1融合抗原，優(yōu)選的是將以下四個HVR1基因用連接臂連接后，表達(dá)的重組融合抗原STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQKSGGGSSGGGSTHVTGGVQGHSLRGLTSLFTSGPAQKGGGSSGGGSSTHVTGAVQGRSLQSFTSFLSPGPSQKGGGSSGGGSETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGKSQN本發(fā)明可通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)。
利用Goldkey計(jì)算機(jī)軟件(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院編寫，有市售)精選了12條代表性HVR1抗原序列，合成基因后，分別重組表達(dá)，然后用ELASA確定其與血清的交叉反應(yīng)性，并從中選擇交叉反應(yīng)性高的HVR1序列用于組合連接。
因?yàn)镠VR1基因片段只有81個堿基，不是很長，故抗原基因的合成采用化學(xué)合成法?；瘜W(xué)合成基因較PCR法可省去提取模板基因的操作，方便快速。更主要也只有用化學(xué)合成才可以根據(jù)需要獲得相應(yīng)序列的基因，同時也可選擇在大腸桿菌的偏性密碼子合成HVR1基因，有利于在E.coli中獲得高效的表達(dá)，這是PCR法不能達(dá)到的。選用化學(xué)合成法，根據(jù)抗原表位的肽序列，和大腸桿菌中高表達(dá)的偏性密碼子，推斷出核苷酸序列加以合成?；瘜W(xué)法合成基因一次能合成的長度有限，一股不超過60個堿基。對HVR1的基因可先合成兩條3’端有一段互補(bǔ)重疊的基因片段，將二者退火后用聚合酶延伸，獲得正負(fù)雙鏈DNA基因。
為了便于基因間的相互連接，并在連接后可獲得較好的抗原活性，在抗原表位間需有一連接臂，我們在表位的上下游分別加上G-G-G-S和S-G-G-G，所以在合成基因時應(yīng)加上相應(yīng)的基因。最后為了便于基因克隆到表達(dá)載體，還合成了兩條和連接臂相配的通用引物，引入兩個酶切位點(diǎn)Xho I和Xba I，以適合表達(dá)載體pBVIL1(參見中國專利申請表達(dá)載體pBVIL1及其構(gòu)建方法和用途，申請?zhí)?0100695.9)。
合成基因的兩端已引入酶切位點(diǎn)Xho I和Xba I，所以各基因片段均可方便地用雙酶切法插入載體pBVIL1中，構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒。構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒需用PCR法鑒定，以證明各基因片段已獲正確地插入。
各單片段HVR1抗原表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli HB101后，通過熱誘導(dǎo)培養(yǎng)，取全菌液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，證明各表達(dá)質(zhì)粒均已獲得了高效的表達(dá)，再經(jīng)離子交換柱及凝膠過濾純化，均可獲得電泳純的單片段的HVR1抗原純品。用ELASA檢測單個片段與HCV病人血清的交叉反應(yīng)性，選出其中相對高交叉反應(yīng)性的HVR1抗原序列，用于下一步的連接。
多HVR1融合抗原表達(dá)質(zhì)粒是在各HVR1抗原表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成的。把其中一個含HVR1-1#基因的質(zhì)粒作為載體；另一含有基因HVR1-2#的質(zhì)粒作為模板，用含有Spe I的通用引物及含有BamH I的原IL-1基因3’端引物，擴(kuò)增出含有HVR1-2#和部分IL-1的基因片段，插入用Xho I和Xba I雙切的HVR1-1#基因的后面，獲得含有HVR1-1#和HVR1-2#兩個基因的質(zhì)粒。由于新質(zhì)粒中，HVR1-1#和HVR1-2#基因間的連接是由互補(bǔ)酶Xba I和Spe I之間的相連，連接后酶切位點(diǎn)不復(fù)存在，因此，新質(zhì)粒又可作為新的載體，與另一含有HVR1-n#基因質(zhì)粒的擴(kuò)增基因片段連接。重復(fù)三次，可獲得質(zhì)粒pBVIL1/HVR1-1#+2#+4#+8#。轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)、表達(dá)后，獲得純化的HVR1四片段融合抗原。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明的不同的HVR1抗原均有一定的交叉性，多HVR1融合抗原的交叉性更有本質(zhì)的提高，與隨機(jī)HCV病人血清的交叉反應(yīng)率高達(dá)到90/91，顯著高于目前文獻(xiàn)上60-75％交叉率的報(bào)道(Watanabe K et al.Thehypervariable Region 1 Protein of Hepatitis C Virus Broadly Reactive with Sera ofPatients with Chronic Hepatitis C Has a Similar Amino Acid Sequence with theConsensus Sequence，Virology，1999；264153-158)，是真正意義的高交叉反應(yīng)的HVR1融合抗原。
附圖簡要說明

圖1為HVR1抗原間連接及多表位抗原表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意2為HVR1四次連接中獲得的轉(zhuǎn)化菌SDS-PAGE示意3為高交叉反應(yīng)性HVR1抗原序列具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)地描述，該實(shí)施例是用于解釋、而不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1.12條代表抗原表位的選擇我們通過Goldkey軟件對國內(nèi)123條HVR1序列進(jìn)行分析，根據(jù)氨基酸出現(xiàn)頻率的高低得到了HVR1的共同序列1#，并按各序列之間相似度的不同挑選了6條HVR1序列作為代表(序列2#～7#)，序列8#、9#為國外發(fā)表序列，10～12#為文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為可能具有高交叉反應(yīng)的HVR1序列。
1#STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQK2#STHVTGGVQGHSLRGLTSLFTSGPAQK3#ITRVTGGVQGHSLRSLTSLFTPGPAQK4#STHVTGAVQGRSLQSFTSFLSPGPSQK5#DTHVTGGAAARGASGLANLFTSGPAQK6#GTYVTGGATAHTASGFASLFTTGSKQN7#TTHVTAGTAAHATSSFTKLFAPGAKQN
8# NTYVTGGSAAHTTSRfTSLFSPGPQQN9# ETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGKSQN10#TTTTTGGVQGHTTRGLVRLFSLGSKQN11#DTTVTGGQAARTTQSFTSLFPPGPSQK12#DTTVTGGQAARTTQSFTSLFTPGPSQK其中，1#為我國的共同序列，2#～7#為我國的HVR1序列，并按其與1#同源性的高低排列，8#、9#為國外發(fā)表序列，10#～12#為國外交叉性較高的HVR1序列，主要用來做與1～9#HVR1的交叉性的比較。
實(shí)施例2.HVR1#～12#抗原的克隆與表達(dá)1、含HVR1單片段抗原表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1.1合成基因片段的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)各合成基因的需要，設(shè)計(jì)了如下提到的基因片段?；蚱涡蛄性O(shè)計(jì)后均委托上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1#FGGTGGTGGATCTTCCACCCACGTAACCGGCGGCGTACAGGGCCGAACCACCCGAGGCCTGRACCTCCACCACTTTTCTGGGAAGGGCCAGGAGGGAACAGGGAGGTGAAGGACTGGGTGGT2#FGGTGGTGGATCTTCCACCCACGTAACCGGCGGCGTACAGGGCCACTCCCTGCGAGGCCTGRACCTCCACCACTGTTCTGTTTGGAGCCAGGGGAGAACAGGCCGGTCAGGGAGGATACAGC3#FGGTGGTGGATCTATCACCCGAGTAACCGGCGGCGTACAGGGCCACTCCCTGCGATCCCTGRACCTCCACCACTGTTCTGTTTGGAGCCCAGGGAGAACAGTCGTACCAGGCCTCGGGTGGT4#FGGTGGTGGATCTTCCACCCACGTAACCGGC GCTGTACAGGGCCGATCCCTGCAGTCCTTCRACCTCCACCACTGTTCTGGGATTTGCCAGGGGAGAAGATGGAGGTCAGGCCGAAAGCAGC5#FGGTGGTGGATCTGACACCCACGTAACCGGCGGCGCTGCTGCTCGAGGCGCTTCCGGCCTGRACCTCCACCACTGTTCTGCTGAGGGCCAGGGGAGAACAGGGAGGTGAATCGGGAGGTGGT6#FGGTGGTGGATCTGGCACCTACGTAACCGGCGGCGCTACCGCTCACACCGCTTCCGGCTTCRACCTCCACCACTGTTCTGTTTAGCGCCAGGAGCGAACAGTTTGGTGAAGGAGGAGGTAGC7#FGGTGGTGGATCTACCACCCACGTAACCGCTGGCACCGCTGCTCACGCTACCTCCTCCTTCRACCTCCACCACTGTTCTGTTTGGAGCCGGTGGTGAACAGGGAAGCGAAGCCGGAAGCGGT8#FGGTGGTGGATCTGAAACCCACACCTCCGGCGGCTCCGTAGCTCGAGCTGCTTTCGGCCTGRACCTCCACCACTTTTCTGGGAAGGGCCAGGGGACAGGAAGGAGGTGAAGGACTGCAGGGA9#FGGTGGTGGATCTAACACCTACGTAACCGGCGGCTCCGCTGCTCACACCACCTCCCGATTCRACCTCCACCACTTTTCTGAGCAGGGCCGGAGGTGAACAGGTTAGCCAGGCCGGAAGCGCC10#FGGTGGTGGATCTACCACCACCACCACCGGCGGCGTACAGGGCCACACCACCCGAGGCCTGRACCTCCACCACTTTTCTGAGCAGGGCCAGGGGTGAACAGGGAGGTCAGGGATCGCAGGGA11#FGGTGGTGGATCTCAGACCACCACCACCGGCGGCTCCGCTTCCCACGCTGTATCCTCCCTGRACCTCCACCACTTTTCTGAGCAGGGCCGGAGGTGAACAGGGAGGTCAGGCCTCGCAGGGA12#FGGTGGTGGATCTGACAC CACCGTAACCGGCGGCCAGGCTGCTCGAACCACCCAGTCCTTCRACCTCCACCACTTTTCTGGGAAGGGCCAGGGGTGAACAGGGAGGTCAGGCCTCGGGTGGT通用引物F1GCCTCGAGGGTGGTGGATCT通用引物R1GCTCTAGAACCTCCACCACT通用引物F2GCACTAGTGGTGGTGGATCT通用引物R2GCGGATCCTTAGGAAGACACAAA1.2 PCR法獲得HVR1#～12#基因HVR1#～12#的基因合成方法，除所用合成基因片段不同外，均用兩步PCR合成法第一步在PCR擴(kuò)增管中，依次加入H2O 41μl，10×PCR Buffer 5μl，分別加入各自基因的合成的一對基因片段(20pmol/μl)R、F各1μl，10mmol/L 4dNTP 1μl，2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl，混勻，1000rpm離心30秒，然后放入PCR擴(kuò)增儀(GeneAmp PCR System 2400)中擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94℃ 1分鐘后，94℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 1分，5個循環(huán)。
第二步以第一步的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增。即在PCR擴(kuò)增管中，依次加入H2O 40μl，10×PCR Buffer 5μl，20pmol/μl通用引物R1、F1各1μl，1/10的第一步PCR產(chǎn)物1μl，10mmol/L 4dNTP 1μl，2U/μl的TaqDNA聚合酶1μl，混勻，1000rpm離心30秒，然后放入PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94℃ 3分鐘后，94℃ 1分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，30個循環(huán)后再72℃延伸5分鐘。
PCR產(chǎn)物純化用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的“小量PCR產(chǎn)物純化”試劑盒進(jìn)行純化，即于PCR產(chǎn)物中加入PB 0.25ml，全量移入吸附柱，然后按說明書方法進(jìn)行清洗和洗脫，然后電泳鑒定。
1.3表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1.3.1 PCR產(chǎn)物及表達(dá)載體pBVIL1雙酶切取以上純化的PCR產(chǎn)物及pBVIL1表達(dá)載體各30ul分別放于Eeppendorf離心管中，各加入10×buffer(H)4ul、Xba I(10u/ul)和Xho I(12u/ul)各1ul，加滅菌蒸餾水至40ul，置37℃水浴酶切過夜。
酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳純化和回收PCR產(chǎn)物及載體pBVIL1經(jīng)雙酶切后，用1.2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化，具體方法按《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)的方法進(jìn)行。純化基因再用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的小量膠回收試劑盒回收即在紫外燈下分別切下含質(zhì)粒和目的基因的瓊脂糖，放于Eeppendorf離心管中，各加入S1液，置55℃水浴10分鐘使膠溶解，加入等量異丙醇，混勻，55℃溫浴1分鐘，然后分別移入吸附柱后，按試劑盒說明書進(jìn)行純化。
1.3.2連接于滅菌Eeppendorf離心管中加入上述酶切后的載體及目的基因各1ul、10×T4 DNA Ligase buffer 1ul、T4 DNA Ligase(12u/ul)1ul，加滅菌蒸餾水至10ul，置16℃過夜。
1.3.3轉(zhuǎn)化在超凈工作臺中，用無菌吸頭取100μl感受態(tài)細(xì)胞(感受態(tài)細(xì)胞按《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)的方法進(jìn)行)懸液于Eppendorf中，加入上述連接物5μl，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30分。立即轉(zhuǎn)移到42℃水浴中放置2分鐘，每管加入0.5ml LB培養(yǎng)基(不加抗生素)，30℃水浴搖床培養(yǎng)60分鐘后，各取0.2ml分別涂于LB瓊脂培養(yǎng)基平皿上(含抗生素)，室溫晾干后，置37℃恒溫箱倒置培養(yǎng)過夜。挑選數(shù)個菌落，分別接種于LB中(5ml/管)，培養(yǎng)過夜，次日各取0.1ml轉(zhuǎn)移到LB中(2ml/管)，32℃培養(yǎng)3小時，42℃水浴搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，收菌，用SDS-PAGE鑒定，選擇目的基因獲得高表達(dá)菌株，作進(jìn)一步鑒定。
1.3.4質(zhì)粒提取及鑒定取上述SDS-PAGE鑒定證明目的基因獲得高表達(dá)的菌株，按《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版)方法提取質(zhì)粒。以質(zhì)粒為模板，用各基因的F1引物和通用引R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增(方法同上述第二步)，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。
2.抗原的表達(dá)與純化2.1表達(dá)菌株的培養(yǎng)取-70℃保存的表達(dá)菌株20ul接種于LB培養(yǎng)基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30℃空氣搖床培養(yǎng)過夜，次日按5％的比例轉(zhuǎn)種于LB培養(yǎng)基(同上)，30℃空氣搖床培養(yǎng)約3小時，當(dāng)OD600值達(dá)到0.7時，立即將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到42℃水浴搖床中，誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時。將菌液合并，6000rpm離心20分鐘，棄上清，收集沉淀部分。
2.2提取包涵體將沉淀稱濕重，用10倍體積的20mmol/L pH8.0 TE緩沖液將沉淀懸起，加入溶菌酶(1mg/ml懸液)，在室溫下磁力攪拌10分鐘。在冰浴中超聲波破碎菌，每次超30秒鐘，間隔30秒鐘，共超10次。8℃，12000rpm，離心20分鐘，棄上清，沉淀用1mol/L NaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.0 TE配制)溶解，加1％β-巰基乙醇。再于20℃，12000rpm，離心10分鐘，去沉淀取上清。
2.3純化將上述溶解的包涵體溶液過Q-Sepharose FF陰離子交換柱，用平衡液(pH8.0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0.1％β-巰基乙醇)清洗后，用不同濃度的NaCl(用平衡液配制)洗脫，收集各洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，收集0.05mol/L NaCl洗脫峰。再過Sephardex G-50凝膠過濾柱，收集第一洗脫峰。各種純化重組表位抗原均用SDS-PAGE鑒定。
3.單片段HVR1抗原活性鑒定將純化的單片段抗原及，用pH7.2的磷酸鹽緩沖液稀釋到2.0ug/ml，包被ELISA測定板，經(jīng)封閉后，對中國紅十字會北京血站提供的15份HCV陽性血清，進(jìn)行了測定。結(jié)果如表1所示。
實(shí)施例3.選出與我國HCV感染株具有高交叉反應(yīng)性的HVR1根據(jù)表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選出4條具有高交叉反應(yīng)性的HVR1多肽序列1#、2#、4#、8#。該4條HVR1多肽的綜合交叉性能覆蓋其他的HVR1多肽。
實(shí)施例4.用分子重組的方法進(jìn)行4條HVR1的連接含HVR1#基因的質(zhì)粒作為載體；另一含有基因HVR2#的質(zhì)粒作為模板，用含有Spe I的通用引物F2及含有BamH I的原IL-1基因3’端通用引物R2，擴(kuò)增出含有HVR2#和部分IL-1的基因片段，插入用Xho I和Xba I雙切的HVR1#基因的后面，獲得含有HVR1#和HVR2#兩個基因的質(zhì)粒(圖1)。由于新質(zhì)粒中，HVR1#和HVR2#基因間的連接是由互補(bǔ)酶Xba I和Spe I之間的相連，連接后酶切位點(diǎn)不復(fù)存在，因此，新質(zhì)粒又可作為新的載體，與而另一含有HVR1基因的質(zhì)粒增連接，重復(fù)上述過程，再經(jīng)3輪循環(huán)可獲得含四片段HVR1的質(zhì)粒。圖2可明顯看出HVR1序列逐個連接上，并獲得很好的表達(dá)。
實(shí)施例5四片段HVR1融合抗原的獲得及高交叉性的測定對含有四片段表達(dá)菌種的操作按實(shí)施例2中的2抗原的純化與表達(dá)，即可獲得電泳純的四片段HVR1融合抗原(L4HVR1)。經(jīng)ELISA連接后的抗原交叉性有了本質(zhì)的提高，能與所有的15份HCV陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。為了更進(jìn)一步鑒定四片段HVR1融合抗原在HCV陽性血清中的檢出率，我們用302醫(yī)院92份HCV陽性血清(經(jīng)華美公司試劑盒確定)進(jìn)行檢測(結(jié)果見表2)檢出率高達(dá)90/91份，充分說明HVR1四片段融合抗原多肽是高交叉反應(yīng)的，該抗原的序列如圖3所示。表112條代表HVR1多肽抗原與15份陽性血清交叉性(黑體代表陽性)

表2.HVR1四片段融合抗原多肽(L4HVR1)活性鑒定OD 檢出份數(shù) ％ 累計(jì)％＞2.0 56 61.5 61.51.5～2.0 14 15.4 76.91.0～1.5 13 14.3 91.20.5～1.0 66.6 97.80.371 11.1 980.065 11.權(quán)利要求
1.有高交叉反應(yīng)性的丙型肝炎病毒第一高變區(qū)抗原，其氨基酸序列為STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQK，STHVTGGVQGHSLRGLTSLFTSGPAQK，ITRVTGGVQGHSLRSLTSLFTPGPAQK，STHVTGAVQGRSLQSFTSFLSPGPSQK，DTHVTGGAAARGASGLANLFTSGPAQK，GTYVTGGATAHTASGFASLFTTGSKQN，TTHVTAGTAAHATSSFTKLFAPGAKQN，ETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGKSQN，或NTYVTGGSAAHTTSRFTSLFSPGPQQN。
2.含多個丙型肝炎病毒第一高變區(qū)的融合抗原，其特征在于所說的丙型肝炎病毒第一高變區(qū)選自權(quán)利要求1中的兩種或兩種以上序列。
3.權(quán)利要求2所述的融合抗原，其特征在于所說的丙型肝炎病毒第一高變區(qū)選自權(quán)利要求1中的四種序列。
4.權(quán)利要求3所述的融合抗原，其特征在于所說的四種丙型肝炎病毒第一高變區(qū)序列為STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQK，STHVTGGVQGHSLRGLTSLFTSGPAQK，STHVTGAVQGRSLQSFTSFLSPGPSQK，和ETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGKSQN。
5.權(quán)利要求4所述的融合抗原，其特征在于所說的四種丙型肝炎病毒第一高變區(qū)序列融合后的序列為STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQKSGGGSSGGGSTHVTGGVQGHSLRGLTSLFTSGPAQKSGGGSSGGGSTHVTGAVQGRSLQSFTSFLSPGPSQKSGGGSSGGGSETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGKSQN
全文摘要
本發(fā)明從已報(bào)道的不同的HVR1序列中篩選出12條可能具有高交叉反應(yīng)的HVR1序列，進(jìn)行了重組表達(dá)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從中選擇了4條交叉反應(yīng)性高的HVR1序列，用于進(jìn)一步組合連接。連接后的融合抗原較單片段HVR1抗原的交叉反應(yīng)性有顯著提高，在丙型肝炎患者中的檢出率高達(dá)90/91，是目前已知交叉反應(yīng)性最廣HVR1抗原。由于HVR1含有丙型肝炎病毒中唯一的中和性抗原表位，因此本發(fā)明可用于檢測丙型肝炎患者體內(nèi)的中和性抗體及制備丙型肝炎疫苗。
文檔編號C07K14/085GK1408723SQ01141879
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月18日
發(fā)明者凌世淦, 宋曉國, 張賀秋, 修冰水 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所