專利名稱：一種個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法及應(yīng)用，屬于生物制藥或制劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在腫瘤導(dǎo)向治療和定位診斷中抗腫瘤特異性抗體的制備是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。然而制備針對不同腫瘤的抗腫瘤特異性抗體卻十分困難，嚴(yán)重地阻礙了腫瘤導(dǎo)向治療和定位診斷研究進展。其主要的原因有二第一是除同一病毒誘導(dǎo)的不同患者腫瘤之間存在著相同的腫瘤特異性抗原外，即便是同類型腫瘤在不同患者之間其腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原也不盡相同，因此不可能制出能與所有腫瘤或者同類型腫瘤發(fā)生特異性結(jié)合的抗腫瘤特異性抗體。第二是免疫原性較弱的腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原極易被腫瘤細胞上的其他免疫原性較強的抗原如種屬抗原所掩蓋，直接用腫瘤細胞免疫動物難以制備抗腫瘤特異性抗體。因此，若能克服上述困難，制備出患者個體化抗腫瘤特異性抗體對腫瘤導(dǎo)向治療和定位診斷具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種制備患者個體化抗腫瘤特異性抗體的方法并將這種抗體用于進行腫瘤導(dǎo)向治療和定位診斷的藥物制劑。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的這種個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法，包括誘導(dǎo)動物免疫耐受、免疫動物、提取抗體三個步驟，其特征在于使用腫瘤患者正常組織細胞誘導(dǎo)動物免疫耐受，動物免疫功能成熟后再用患者的腫瘤細胞免疫動物，制備抗該腫瘤的特異性抗體。
所述的個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法中所述誘導(dǎo)動物免疫耐受的腫瘤患者正常組織細胞包括患者腫瘤原發(fā)器官的正常細胞、患者白細胞、患者白細胞與正常人腫瘤原發(fā)器官細胞混合物。
所述的個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法中所述的適用于免疫耐受的動物包括敘利亞倉鼠、大鼠、小鼠、家兔、狗、羊。
所述的個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法中所述誘導(dǎo)動物免疫耐受的方法包括a給新生24小時內(nèi)敘利亞倉鼠腹腔注射1～8×106腫瘤患者白細胞，誘導(dǎo)動物對患者正常細胞的免疫耐受；或b給新生24小時內(nèi)敘利亞倉鼠腹腔注射1～8×106患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞，誘導(dǎo)動物對患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞的免疫耐受；或c給新生24小時內(nèi)敘利亞倉鼠腹腔注射1～4×106正常人腫瘤原發(fā)器官正常細胞和1～6×106腫瘤患者白細胞，誘導(dǎo)動物對患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞的免疫耐受；或d給成年敘利亞倉鼠腹腔注射環(huán)胞霉素A1-10天，然后靜脈注射1～8×106腫瘤患者白細胞，誘導(dǎo)動物對患者正常細胞的免疫耐受；或e給成年敘利亞倉鼠腹腔注射環(huán)胞霉素A1-10天，然后靜脈注射1～8×106患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞，誘導(dǎo)動物對患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞的免疫耐受；或f給成年敘利亞倉鼠腹腔注射環(huán)胞霉素A1-10天，然后靜脈注射1～4×106正常人腫瘤原發(fā)器官正常細胞和1～6×106腫瘤患者白細胞，誘導(dǎo)動物對患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞的免疫耐受。
所述的個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法中所述免疫動物的方法包括給對患者腫瘤正常組織細胞產(chǎn)生了免疫耐受的成熟動物多點(足掌、國窩淋巴結(jié)周圍、背部兩側(cè)、頜下、耳后等5-10點)皮下注射腫瘤細胞進行免疫，間隔4～7天注射1次，共注射2～5次。
所述的個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法中所述的抗腫瘤特異性抗體的制備方法包括a免疫動物末次注射后3～7天，無菌采血制血清，分別用該患者的腫瘤細胞和腫瘤原發(fā)器官正常細胞與該血清反應(yīng)，取只與腫瘤細胞發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的血清，依次用40％、35％、33％飽和硫酸銨鹽析濃縮抗體，得到抗腫瘤特異性抗體；或b取只與腫瘤細胞發(fā)生抗原抗體反應(yīng)動物的脾臟，篩選特異性針對該腫瘤的脾細胞，進行體外培養(yǎng)或同種動物腹腔接種，從體外培養(yǎng)上清液或腹腔液中依次用40％、35％、33％飽和硫酸銨鹽析濃縮抗體，得到抗腫瘤特異性抗體；或c取只與腫瘤細胞發(fā)生抗原抗體反應(yīng)動物的脾細胞與骨髓瘤細胞進行雜交制備雜交瘤，通過體外培養(yǎng)或同種動物腹腔接種，從體外培養(yǎng)上清液或腹腔液中依次用40％、35％、33％飽和硫酸銨鹽析濃縮抗體，得到抗腫瘤特異性單克隆抗體；或d用來源于所述動物的抗體免疫另種動物，制備抗腫瘤特異性抗體的抗體(即抗抗體)，方法包括取敘利亞倉鼠IgG100-600μg與完全福氏佐劑(石臘油+羊毛脂+卡介苗)混合，給家兔(或綿羊)多點(如足掌、國窩淋巴結(jié)周圍、背部兩側(cè)、頜下、耳后等5-10點)皮下注射進行免疫，間隔7-20天注射1次，共注射5-8次；末次注射后5-7天，無菌采血制血清，依次用40％、35％、33％飽和硫酸銨鹽析濃縮抗體，即得抗敘利亞倉鼠IgG抗體。
所述的個體化抗腫瘤特異性抗體作為臨床上治療腫瘤藥物應(yīng)用，包括個體化抗腫瘤特異性抗體及其復(fù)合制劑可以作為治療腫瘤的特異性導(dǎo)向藥物制劑。
這種個體化抗腫瘤特異性抗體及其復(fù)合制劑作為個體化腫瘤導(dǎo)向治療藥物，方案之一是a直接將個體化抗腫瘤特異性抗體作為治療腫瘤的特異性導(dǎo)向藥物制劑；所述的個體化抗腫瘤特異性抗體及其復(fù)合制劑作為個體化腫瘤導(dǎo)向治療藥物，其它方案還包括b將個體化抗腫瘤特異性抗體與核素或白喉毒素或溶細胞藥物連接制備含有抗腫瘤特異性抗體；或c將個體化抗腫瘤特異性抗體的Fab片段與-核素或白喉毒素或溶細胞藥物連接制備含有抗腫瘤特異性抗體的復(fù)合制劑；或d將抗腫瘤特異性抗體的基因片段制備針對腫瘤的特異性轉(zhuǎn)基因病毒制劑；或e將抗腫瘤特異性抗體或其Fab片段與生物素連接，然后再與親和素-核素或親和素-白喉毒素或親和素-溶細胞藥物復(fù)合物連接制備抗腫瘤特異性抗體或其Fab片段-生物素-親和素-核素或白喉毒素或溶細胞藥物復(fù)合制劑。
所述的個體化抗腫瘤特異性抗體及其復(fù)合制劑作為個體化腫瘤導(dǎo)向治療藥物，其它方案還包括將抗腫瘤特異性抗體的抗體(抗抗體)或其Fab片段與核素或白喉毒素或溶細胞藥物連接制備抗腫瘤特異性抗體-抗抗體或其Fab片段-核素或白喉毒素或溶細胞藥物復(fù)合制劑。
這種個體化抗腫瘤特異性抗體及其復(fù)合制劑還可以作為個體化定位診斷制劑，包括制備抗腫瘤特異性抗體或其Fab片段-核素復(fù)合物診斷制劑；或抗腫瘤特異性抗體-抗抗體或其Fab片段-核素復(fù)合物診斷制劑；或抗腫瘤特異性抗體或其Fab片段-生物素-親和素-核素復(fù)合物制劑。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案由于先用腫瘤患者正常組織細胞誘導(dǎo)動物相應(yīng)的免疫耐受，動物成熟后再用腫瘤細胞免疫動物，可使動物不對腫瘤細胞表面的其他抗原發(fā)生反應(yīng)，僅對腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原發(fā)生反應(yīng)，即便是免疫原性較弱也不易被掩蓋，用這種方法較容易地制備針對該患者腫瘤的特異性抗體。
具體實施例方式
一用敘利亞倉鼠制備含有抗腫瘤特異性抗體的復(fù)合制劑實施例1、誘導(dǎo)敘利亞倉鼠對患者腫瘤原發(fā)器官細胞的免疫耐受有以下六種方法(1)、給新生24小時內(nèi)敘利亞倉鼠腹腔注射腫瘤患者白細胞1～8×106，誘導(dǎo)動物對患者正常細胞的免疫耐受。(2)、給新生24小時內(nèi)敘利亞倉鼠腹腔注射1～8×106患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞，誘導(dǎo)動物對患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞的免疫耐受。(3)、給新生24小時內(nèi)敘利亞倉鼠腹腔注射1～4×106正常人腫瘤原發(fā)器官正常細胞和1～6×106腫瘤患者白細胞，誘導(dǎo)動物對患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞的免疫耐受。(4)、給成年敘利亞倉鼠腹腔注射環(huán)胞霉素A7天，然后靜脈注射1～8×106腫瘤患者白細胞，誘導(dǎo)動物對患者正常細胞的免疫耐受。(5)、給成年敘利亞倉鼠腹腔注射環(huán)胞霉素A7天，然后靜脈注射1～8×106患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞，誘導(dǎo)動物對患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞的免疫耐受。(6)、給成年敘利亞倉鼠腹腔注射環(huán)胞霉素A7天，然后靜脈注射1～4×106正常人腫瘤原發(fā)器官正常細胞和1～6×106腫瘤患者白細胞，誘導(dǎo)動物對患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞的免疫耐受。2、制備針對患者腫瘤的特異性抗體三種方法給對患者腫瘤正常組織細胞產(chǎn)生了免疫耐受的成熟敘利亞倉鼠，多點(如足掌、國窩淋巴結(jié)周圍、背部兩側(cè)、頜下、耳后等5～10點)皮下注射腫瘤細胞進行免疫，間隔4～7天注射1次，共注射2～5次。(1)、末次注射后3～7天，無菌采血制血清，分別用該患者的腫瘤細胞和腫瘤原發(fā)器官正常細胞與該血清反應(yīng)，取只與腫瘤細胞發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的血清，依次用40％、35％、33％飽和硫酸銨鹽析濃縮抗體，即得抗腫瘤特異性抗體。(2)、取只與腫瘤細胞發(fā)生抗原抗體反應(yīng)動物的脾臟，篩選特異性針對該腫瘤的脾細胞，進行體外培養(yǎng)或同種動物腹腔接種，從體外培養(yǎng)上清液或腹腔液中依次用40％、35％、33％飽和硫酸銨鹽析濃縮抗體，即得抗腫瘤特異性抗體。(3)、取只與腫瘤細胞發(fā)生抗原抗體反應(yīng)動物的脾細胞與骨髓瘤細胞進行雜交制備雜交瘤，通過體外培養(yǎng)或同種動物腹腔接種，從體外培養(yǎng)上清液或腹腔液中依次用40％、35％、33％飽和硫酸銨鹽析濃縮抗體，即得抗腫瘤特異性單克隆抗體。3、制備抗敘利亞倉鼠IgG抗體取敘利亞倉鼠IgG100-600μg與完全福氏佐劑(石臘油+羊毛脂+卡介苗)11混合，給家兔(或綿羊)多點(如足掌、國窩淋巴結(jié)周圍、背部兩側(cè)、頜下、耳后等5-10點)皮下注射進行免疫，間隔7-20天注射1次，共注射5-8次。末次注射后5-7天，無菌采血制血清，依次用40％、35％、33％飽和硫酸銨鹽析濃縮抗體，即得抗敘利亞倉鼠IgG抗體。4、制備抗體或Fab片段-核素或白喉毒素或溶細胞藥物復(fù)合制劑(1)、制備抗體-核素復(fù)合制劑用常規(guī)方法將抗體與核素連接。(2)、制備抗體-白喉毒素復(fù)合制劑用常規(guī)方法將抗體與白喉毒素連接。(3)、制備抗體-溶細胞藥物復(fù)合制劑用常規(guī)方法將抗體與溶細胞藥物連接。(4)、用木瓜酶或胃蛋白酶水解抗體，提取分離Fab片段，分別用上述(1)、(2)、(3)方法與核素或白喉毒素或溶細胞藥物連接，制備抗體Fab段-核素、抗體Fab段-白喉毒素、抗體Fab段-溶細胞藥物復(fù)合制劑。5、置備抗腫瘤特異性抗體(或Fab片段)-生物素＝親和素-核素或白喉毒素或溶細胞藥物復(fù)合制劑。(1)、制備抗腫瘤特異性抗體(或Fab片段)-生物素復(fù)合制劑用常規(guī)方法將抗腫瘤特異性抗體(或Fab片段)與生物素連接。(2)、制備親和素-核素復(fù)合制劑用常規(guī)方法將親和素與核素連接。(3)、制備親和素-白喉毒素復(fù)合制劑用常規(guī)方法將親和素與白喉毒素連接。(4)、制親和素-溶細胞藥物復(fù)合制劑用常規(guī)方法將親和素與溶細胞藥物連接。(5)、置備抗腫瘤特異性抗體(或Fab片段)-生物素＝親和素-核素或白喉毒素或溶細胞藥物復(fù)合制劑用常規(guī)方法將抗腫瘤特異性抗體(或Fab片段)與生物素連接。再分別與(2)、(3)、(4)連接，制備抗腫瘤特異性抗體(或Fab片段)-生物素＝親和素-核素復(fù)合制劑、抗腫瘤特異性抗體(或Fab片段)-生物素＝親和素-白喉毒素復(fù)合制劑、抗腫瘤特異性抗體(或Fab片段)-生物素＝親和素-溶細胞藥物復(fù)合制劑。6、制備針對腫瘤的特異性轉(zhuǎn)基因病毒用常規(guī)方法將抗腫瘤特異性抗體的基因或其V區(qū)片段基因插入或取代病毒基因，使病毒表面攜帶能與該腫瘤特異性結(jié)合的蛋白，制備能特異性感染該腫瘤細胞的轉(zhuǎn)基因病毒。
上述實施例中還可以用成年期或新生期或胚胎晚期大鼠、小鼠、家兔、狗、羊等動物制備抗腫瘤特異性抗體、抗抗體或復(fù)合制劑。二、抗腫瘤特異性抗體作為導(dǎo)向治療藥物的應(yīng)用實施例(1)、將定量的抗腫瘤特異性抗體直接作為抗腫瘤藥物制劑，注射于該腫瘤患者體內(nèi)，抗體與腫瘤細胞結(jié)合后，通過激活補體等途徑使腫瘤細胞死亡。(2)、將定量的抗腫瘤特異性抗體(或其Fab片段)-核素復(fù)合物制劑注射于該腫瘤患者體內(nèi)，抗體(或其Fab片段)與腫瘤細胞結(jié)合，通過核素射線使腫瘤細胞死亡。(3)、將一定量的抗腫瘤特異性抗體-抗抗體(或其Fab片段)-核素復(fù)合物制劑注射于該腫瘤患者體內(nèi)，抗腫瘤特異性抗體與腫瘤細胞結(jié)合，通過核素射線使腫瘤細胞死亡。(4)、將一定量的抗腫瘤特異性抗體(或其Fab片段)-白喉毒素復(fù)合物制劑注射于該腫瘤患者體內(nèi)，抗體(或其Fab片段)與腫瘤細胞結(jié)合，通過白喉毒素的溶細胞作用使腫瘤細胞死亡。(5)、將一定量的抗腫瘤特異性抗體-抗抗體(或其Fab片段)-白喉毒素復(fù)合物制劑注射于該腫瘤患者體內(nèi)，抗腫瘤特異性抗體與腫瘤細胞結(jié)合，通過白喉毒素的溶細胞作用使腫瘤細胞死亡。(6)、將一定量的抗腫瘤特異性抗體(或其Fab片段)-溶細胞藥物復(fù)合物制劑注射于該腫瘤患者體內(nèi)，抗體(或其Fab片段)與腫瘤細胞結(jié)合，通過溶細胞藥物的溶細胞作用使腫瘤細胞死亡。(7)、將一定量的抗腫瘤特異性抗體-抗抗體(或其Fab片段)-溶細胞藥物復(fù)合物制劑注射于該腫瘤患者體內(nèi)，抗腫瘤特異性抗體與腫瘤細胞結(jié)合，通過溶細胞藥物的溶細胞作用使腫瘤細胞死亡。(8)、將一定量的抗腫瘤特異性抗體(或其Fab片段)-生物素-親和素-核素復(fù)合物制劑注射于該腫瘤患者體內(nèi)，抗腫瘤特異性抗體與腫瘤細胞結(jié)合，通過核素射線使腫瘤細胞死亡。(9)將一定量的抗腫瘤特異性抗體(或其Fab片段)-生物素-親和素-白喉毒素復(fù)合物制劑注射于該腫瘤患者體內(nèi)，抗腫瘤特異性抗體與腫瘤細胞結(jié)合，通過白喉毒素的溶細胞作用使腫瘤細胞死亡。(10)、將一定量的抗腫瘤特異性抗體(或其Fab片段)--生物素-親和素-溶細胞藥物復(fù)合物制劑注射于該腫瘤患者體內(nèi)，抗腫瘤特異性抗體與腫瘤細胞結(jié)合，通過溶細胞藥物的溶細胞作用使腫瘤細胞死亡。(11)、將一定量的能特異性感染該腫瘤細胞的轉(zhuǎn)基因病毒制劑接種于該腫瘤患者體內(nèi)，病毒特異性地感染腫瘤細胞，使腫瘤細胞死亡。上述(1)～(10)實例治療前均須用微量同種物進行過敏性皮試，反應(yīng)陰性可直接應(yīng)用，否則須脫敏后應(yīng)用。三、抗腫瘤特異性抗體復(fù)合制劑用于個體化腫瘤定位診斷的實施例(1)、將一定量的抗腫瘤特異性抗體(或其Fab片段)-核素復(fù)合物制劑注射于該腫瘤患者體內(nèi)，抗體與腫瘤細胞結(jié)合，用相應(yīng)攝像儀器通過測定核素射線，進行腫瘤的定位診斷或判斷復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。(2)、將一定量的抗腫瘤特異性抗體-抗抗體(或其Fab片段)-核素復(fù)合物制劑注射于該腫瘤患者體內(nèi)，抗腫瘤特異性抗體與腫瘤細胞結(jié)合，用相應(yīng)攝像儀器通過測定核素射線，進行腫瘤的定位診斷或判斷復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。(3)將一定量的抗腫瘤特異性抗體(或其Fab片段)-生物素-親和素-核素復(fù)合物制劑注射于該腫瘤患者體內(nèi)，抗腫瘤特異性抗體與腫瘤細胞結(jié)合，用相應(yīng)攝像儀器通過測定核素射線，進行腫瘤的定位診斷或判斷復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
上述診斷制劑注射前均須用微量同種物進行過敏性皮試，反應(yīng)陰性可直接應(yīng)用，否則須脫敏后應(yīng)用。四、特異性殺傷患者腫瘤細胞體外試驗——補體依賴性細胞毒效應(yīng)腫瘤細胞及其相應(yīng)器官正常組織來自臨床患者手術(shù)切除的原位癌細胞和遠離原癌部位的同器官正常組織標(biāo)本。手術(shù)標(biāo)本離體后立即切成約1mm薄片，分別放入含有RPMI1640培養(yǎng)液的標(biāo)本瓶中，冰壺內(nèi)帶回實驗室，制成1×1mm組織塊及細胞懸液。加入二甲基亞砜，分裝安瓶封口液氮冷凍保存。實驗時速溶復(fù)蘇，復(fù)蘇后迅速用Hank‘s液洗三遍，最終用RPMI1640培養(yǎng)液(含10％小牛血清、1％青鏈霉素)制成1×106/ml細胞懸液。
按表1進行加樣試驗表1試驗分組細胞懸液 抗腫瘤血清 未免疫血清 補體癌細胞組實驗組 300ul50ul - 50ul對照組 300ul - 50ul 50ul正常細胞組實驗組 300ul50ul - 50ul對照組 300ul - 50ul 50ul注抗腫瘤血清用遠離原癌部位的同器官正常組織細胞給新生24小時敘利亞倉鼠腹腔注射，誘導(dǎo)相應(yīng)免疫耐受。四周齡時，再用原癌細胞免疫該鼠數(shù)次，然后眼球后動脈放血，制血清，取該鼠脾細胞通過溶血空斑試驗只與癌細胞發(fā)生反應(yīng)倉鼠的血清；用其脾細胞與少量殺死后原癌細胞一起體外培養(yǎng)，換液時，離心取上清即得。
未免疫血清未經(jīng)任何處理的正常五周齡敘利亞倉鼠血清。
補體新鮮豚鼠血清。
用24孔培養(yǎng)板，每實驗組選4孔按表1加液，振蕩混勻，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，在終止培養(yǎng)前4-6小時，每組三孔加5mg/mlMTT(四甲基偶氮唑鹽)20ul繼續(xù)培養(yǎng)，終止時各加含0.04mol/L HCl的酸化異丙醇1.2ml，振蕩10分鐘，用721分光光度計選定波長590nm，用不加MTT孔作本組調(diào)零測各組光密度OD值；將每組三個OD值計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差.用公式計算溶細胞率＝(對照組平均OD值-實驗組平均OD值)/對照組平均OD值×100％。
用癌細胞組溶細胞率與原癌器官正常細胞組溶細胞率進行比較，并做顯著性檢驗。實驗結(jié)果見表2和表3表2抗腫瘤血清對原腫瘤及其原器官正常組織的補體依賴性細胞毒效應(yīng)試驗分組 倉鼠數(shù)溶細胞率 P值肝細胞癌8 94.65±5.68p＜0.001肝細胞 8 0.03±1.32乳腺癌 7 96.52±6.23p＜0.001乳腺細胞7 0.02±1.34胃腺癌 9 97.68±8.65p＜0.001胃腺細胞9 0.87±2.67表3抗腫瘤脾細胞上清液對原腫瘤及其原器官正常組織的補體依賴性細胞毒效應(yīng)試驗分組 倉鼠數(shù)溶細胞率 P值肝細胞癌8 84.36±6.32p＜0.001肝細胞 8 0.08±2.35乳腺癌 7 91.34±8.37p＜0.001乳腺細胞7 0.35±3.93胃腺癌 9 83.18±9.23p＜0.001胃腺細胞9 0.68±6.2權(quán)利要求
1.一種個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法，包括誘導(dǎo)動物免疫耐受、免疫動物、提取抗體三個步驟，其特征在于使用腫瘤患者正常組織細胞誘導(dǎo)動物免疫耐受，動物免疫功能成熟后再用患者的腫瘤細胞免疫動物，制備抗該腫瘤的特異性抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法，其特征在于所述誘導(dǎo)動物免疫耐受的腫瘤患者正常組織細胞包括患者腫瘤原發(fā)器官的正常細胞、患者白細胞、患者白細胞與正常人腫瘤原器官細胞混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法，其特征在于適用于免疫耐受的動物包括敘利亞倉鼠、大鼠、小鼠、家兔、狗、羊。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法，其特征在于所述誘導(dǎo)動物免疫耐受的方法包括a給新生24小時內(nèi)敘利亞倉鼠腹腔注射1～8×106腫瘤患者白細胞，誘導(dǎo)動物對患者正常細胞的免疫耐受；或b給新生24小時內(nèi)敘利亞倉鼠腹腔注射1～8×106患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞，誘導(dǎo)動物對患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞的免疫耐受；或c給新生24小時內(nèi)敘利亞倉鼠腹腔注射1～4×106正常人腫瘤原發(fā)器官正常細胞和1～6×106腫瘤患者白細胞，誘導(dǎo)動物對患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞的免疫耐受；或d給成年敘利亞倉鼠腹腔注射環(huán)胞霉素A1-10天，然后靜脈注射1～8×106腫瘤患者白細胞，誘導(dǎo)動物對患者正常細胞的免疫耐受；或e給成年敘利亞倉鼠腹腔注射環(huán)胞霉素A1-10天，然后靜脈注射1～8×106患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞，誘導(dǎo)動物對患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞的免疫耐受；或f給成年敘利亞倉鼠腹腔注射環(huán)胞霉素A1-10天，然后靜脈注射1～4×106正常人腫瘤原發(fā)器官正常細胞和1～6×106腫瘤患者白細胞，誘導(dǎo)動物對患者腫瘤原發(fā)器官正常細胞的免疫耐受。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法，其特征在于所述免疫動物的方法包括給對患者正常組織細胞產(chǎn)生了免疫耐受的成熟動物多點(足掌、國窩淋巴結(jié)周圍、背部兩側(cè)、頜下、耳后等5-10點)皮下注射腫瘤細胞進行免疫，間隔4-7天注射1次，共注射2-5次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法，其特征在于所述的特異性抗體的制備方法包括a免疫動物末次注射后3-7天，無菌采血制血清，分別用該患者的腫瘤細胞和腫瘤原發(fā)器官正常細胞與該血清反應(yīng)，取只與腫瘤細胞發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的血清，依次用40％、35％、33％飽和硫酸銨鹽析濃縮抗體，得到抗腫瘤特異性抗體；或b取只與腫瘤細胞發(fā)生抗原抗體反應(yīng)動物的脾臟，篩選特異性針對該腫瘤的脾細胞，進行體外培養(yǎng)或同種動物腹腔接種，從體外培養(yǎng)上清液或腹腔液中依次用40％、35％、33％飽和硫酸銨鹽析濃縮抗體，得到抗腫瘤特異性抗體；或c取只與腫瘤細胞發(fā)生抗原抗體反應(yīng)動物的脾細胞與骨髓瘤細胞進行雜交制備雜交瘤，通過體外培養(yǎng)或同種動物腹腔接種，從體外培養(yǎng)上清液或腹腔液中依次用40％、35％、33％飽和硫酸銨鹽析濃縮抗體，得到抗腫瘤特異性單克隆抗體；或d用來源于所述動物的抗體免疫另種動物，制備抗腫瘤特異性抗體的抗體(即抗抗體)，方法包括取敘利亞倉鼠IgG100-600μg與完全福氏佐劑(石臘油+羊毛脂+卡介苗)混合，給家兔(或綿羊)多點(如足掌、國窩淋巴結(jié)周圍、背部兩側(cè)、頜下、耳后等5-10點)皮下注射進行免疫，間隔7-20天注射1次，共注射5-8次；末次注射后5-7天，無菌采血制血清，依次用40％、35％、33％飽和硫酸銨鹽析濃縮抗體，即得抗敘利亞倉鼠IgG抗體。
7.個體化抗腫瘤特異性抗體作為臨床上治療腫瘤藥物應(yīng)用，其特征在于個體化抗腫瘤特異性抗體及其復(fù)合制劑可以作為治療腫瘤的特異性導(dǎo)向藥物制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的個體化抗腫瘤特異性抗體及其復(fù)合制劑作為個體化腫瘤導(dǎo)向治療藥物，其特征包括a個體化抗腫瘤特異性抗體直接作為制劑；或b將個體化抗腫瘤特異性抗體的Fab片段與核素或白喉毒素或溶細胞藥物連接制備抗腫瘤特異性抗體；或c將個體化抗腫瘤特異性抗體的Fab片段與核素或白喉毒素或溶細胞藥物連接制備抗腫瘤特異性抗體的藥物復(fù)合制劑；或d將個體化抗腫瘤特異性抗體基因片段制備針對腫瘤的特異性轉(zhuǎn)基因病毒制劑；或e將個體化抗腫瘤特異性抗體或其Fab片段與生物素連接，然后再與親和素-核素或親和素-白喉毒素或親和素-溶細胞藥物連接制備抗腫瘤特異性抗體或其Fab片段-生物素-親和素-核素或白喉毒素或溶細胞藥物復(fù)合制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的個體化抗腫瘤特異性抗體及其復(fù)合制劑作為個體化腫瘤導(dǎo)向治療藥物，其特征在于將抗腫瘤特異性抗體的抗體或其Fab片段與核素或白喉毒素或溶細胞藥物連接制備抗腫瘤特異性抗體-抗抗體或其Fab片段-核素或白喉毒素或溶細胞藥物復(fù)合制劑。
10.個體化抗腫瘤特異性抗體及其復(fù)合制劑作為個體化定位診斷制劑，其特征在于制備抗腫瘤特異性抗體或Fab片段-核素復(fù)合診斷制劑；或抗腫瘤特異性抗體-抗抗體或其Fab片段-核素復(fù)合診斷制劑；或抗腫瘤特異性抗體或其Fab片段-生物素-親和素-核素復(fù)合診斷制劑。
全文摘要
本發(fā)明提出一種個體化抗腫瘤特異性抗體的制備方法并將這種抗體用于進行腫瘤導(dǎo)向治療和定位診斷的藥物制劑。這種抗體的制備方法包括誘導(dǎo)動物免疫耐受、免疫動物、提取抗體三個步驟,其特征在于:使用腫瘤患者正常組織細胞誘導(dǎo)動物免疫耐受,動物免疫功能成熟后再用患者的腫瘤細胞免疫動物,制備抗該腫瘤的特異性抗體。
文檔編號C07K16/18GK1344746SQ0114203
公開日2002年4月17日 申請日期2001年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月7日
發(fā)明者劉文泰, 李麗華 申請人:劉文泰