專利名稱：分離變性蛋白/包涵體蛋白復(fù)性混合液中蛋白聚集體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種分離變性蛋白/包涵體蛋白復(fù)性混合液中蛋白聚集體的方法。
背景技術(shù)：
無(wú)論在蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)室研究還是工業(yè)生產(chǎn)中，蛋白質(zhì)的復(fù)性技術(shù)扮演著重要的角色。人們目前表達(dá)的蛋白已有4000多種，其中利用大腸桿菌表達(dá)的蛋白要占90％以上，而這些蛋白大多數(shù)是以無(wú)活性的包涵體形式表達(dá)的，必須利用高濃度的變性劑溶解蛋白以后，使目標(biāo)蛋白復(fù)性。特別是對(duì)生產(chǎn)有藥用價(jià)值的蛋白，包涵體表達(dá)的蛋白復(fù)性效率的高低，決定了藥用蛋白產(chǎn)品的成本和應(yīng)用。
在現(xiàn)有的蛋白復(fù)性手段中，傳統(tǒng)的稀釋復(fù)性、透析復(fù)性以及最近的層析復(fù)性，都不可避免存在蛋白聚集體的形成。由于變性劑中的蛋白分子，以無(wú)活性的伸展肽鏈的形式存在，大量暴露到水環(huán)境的疏水殘基在變性劑瞬間除去的情況下，容易因?yàn)槭杷嗷プ饔枚奂?，形成含有多個(gè)分子的蛋白聚集體；變性蛋白在變性劑除去的過(guò)程中，蛋白折疊成中間體，不穩(wěn)定的中間體結(jié)構(gòu)中一些疏水殘基暴露在水中，也會(huì)產(chǎn)生聚集體，使一些折疊中間體轉(zhuǎn)向形成聚集體的反應(yīng)，不能進(jìn)一步折疊成天然的結(jié)構(gòu)形式。聚集體的形成涉及到至少兩個(gè)以上分子之間的作用力，屬高級(jí)反應(yīng)。蛋白復(fù)性緩沖液中蛋白的濃度越大，形成的聚集體就越多，聚集體形成又降低蛋白質(zhì)復(fù)性的效率。所以上述復(fù)性方法中需要的蛋白終濃度較低，但是，蛋白終濃度越低，需要的緩沖液的量就越多，需要更大的容器，這樣不僅造成生產(chǎn)成本的提高，而且給以后的蛋白處理帶來(lái)困難。大量的蛋白緩沖液需要增大設(shè)備的處理容量，也消耗更多的能量。所以，在蛋白的復(fù)性過(guò)程中，蛋白的聚集體的形成是不可避免的。
蛋白聚集體存在于蛋白復(fù)性的緩沖液中，其聚集體的存在使得一些沒有完全折疊的多態(tài)鏈或者中間體與其結(jié)合，而形成更大的聚集體；正確折疊復(fù)性的蛋白也會(huì)因?yàn)榫奂w的的疏水相互作用力的吸附而丟失蛋白活性，而造成復(fù)性收率的降低；特別對(duì)于蛋白的層析柱復(fù)性工藝中，如果直接收集混合在一起的復(fù)性組分，蛋白復(fù)性的收率就很低；而對(duì)從柱子里流出的組分進(jìn)行分部收集，便可以大大提高蛋白復(fù)性的收率。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)從柱子里流出的組分中無(wú)活性的成分主要是蛋白聚集體成分，蛋白聚集體成分的存在，降低了活性蛋白的收率。
理論上，在蛋白復(fù)性過(guò)程中除去變性劑，蛋白應(yīng)該能自發(fā)的折疊復(fù)性，有人稱蛋白多肽鏈的序列為遺傳的另一種密碼。但是，實(shí)際情況相當(dāng)復(fù)雜，在蛋白復(fù)性過(guò)程中除了形成聚集體之外，蛋白折疊過(guò)程中也可能形成錯(cuò)誤折疊，含有二硫鍵的蛋白有可能形成分子內(nèi)或者分子間錯(cuò)配的二硫鍵；新合成的肽鏈在細(xì)胞內(nèi)折疊時(shí)，分子伴侶、折疊酶、氧化還原環(huán)境等細(xì)胞內(nèi)的因素，結(jié)合到新合成的肽鏈或者折疊的中間體上，穩(wěn)定蛋白的結(jié)構(gòu)，可以大大提高蛋白的折疊效率；并且，一些錯(cuò)誤折疊的蛋白結(jié)構(gòu)或者聚集體結(jié)構(gòu)，可以被細(xì)胞內(nèi)識(shí)別，并被降解或者糾下；二硫鍵形成酶可以促進(jìn)正確二硫鍵的形成，并促進(jìn)分子內(nèi)二硫鍵的重排，減少或者消除錯(cuò)配二硫鍵的可能。但是在體外蛋白的復(fù)性過(guò)程中，沒有細(xì)胞內(nèi)的適于蛋白折疊的環(huán)境，也缺少輔助蛋白折疊的成分，蛋白折疊過(guò)程中，尤其折疊的中間體，很容易形成不同的折疊的終點(diǎn)，所以不可避免的會(huì)形成蛋白錯(cuò)誤折疊的成分和蛋白的二硫鍵的錯(cuò)配；通過(guò)體內(nèi)或者體外的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白在折疊過(guò)程中，形成不止一種中間體，有些是錯(cuò)誤的中間體，很容易造成聚集體和錯(cuò)誤折疊的結(jié)構(gòu)的形成。
另外，蛋白在復(fù)性過(guò)程中，所存在的多種成分，嚴(yán)重影響復(fù)性蛋白的使用。對(duì)于蛋白的結(jié)構(gòu)或者其它性質(zhì)的研究來(lái)講，由于成分結(jié)構(gòu)的不單一，使得一些研究數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，因?yàn)檫@些研究數(shù)據(jù)是基于溶液中多個(gè)蛋白分子數(shù)據(jù)的平均值獲得的。而對(duì)于藥用蛋白來(lái)講，其影響就更為嚴(yán)重；藥用蛋白成分的不均一，聚集體和錯(cuò)誤折疊成分的存在，不分離而直接注射入體內(nèi)，極易引起體內(nèi)的免疫排斥反應(yīng)，甚至威脅生命的安全。所以，對(duì)復(fù)性后的蛋白的組分必須進(jìn)行分離，以獲得單一的組分。并且，對(duì)于聚集體或者錯(cuò)誤折疊的組分能回收的話，利用高濃度的變性劑重新溶解聚集體，解開錯(cuò)誤折疊的成分，加入DTT等其他還原試劑解開錯(cuò)誤的二硫鍵，再經(jīng)過(guò)復(fù)性，可以提高蛋白復(fù)性的收率，降低產(chǎn)品的成本，尤其對(duì)于較難表達(dá)或者表達(dá)稀少的昂貴蛋白成分，分離后進(jìn)行再一步的變性復(fù)性處理是必要的。
在蛋白復(fù)性緩沖液中加入變性劑，多被用來(lái)溶解包涵體蛋白，提高蛋白在溶液中的穩(wěn)定性(CN 1122339A，CN 118178A)；多聚物分子，經(jīng)常在復(fù)性過(guò)程或者分離蛋白的過(guò)程中使用，以提高活性蛋白在水相緩沖液中的穩(wěn)定性(JP平4-237496，JP昭56-34784，JP平9-227600)。但是，沒有使用低濃度的添加物來(lái)分離復(fù)性后的各個(gè)成分的例子，雖然復(fù)性過(guò)程中錯(cuò)誤折疊和聚集體的存在是公認(rèn)的事實(shí)。為了克服復(fù)性后的蛋白使用中的這些缺點(diǎn)，發(fā)展了這種分離的方法。
在蛋白復(fù)性的文獻(xiàn)中，雖然聚集體的形成是一個(gè)公認(rèn)的復(fù)性中的難點(diǎn)也是復(fù)性研究中的熱點(diǎn)，但是很少有對(duì)復(fù)性后的蛋白進(jìn)行分離的報(bào)道。原因在于復(fù)性后蛋白的成分相當(dāng)復(fù)雜，并且各種結(jié)構(gòu)的蛋白分子之間和蛋白分子同分離的介質(zhì)之間有各種作用力，彼此之間的作用力使得各種成分的分離相當(dāng)困難。利用一般的凝膠過(guò)濾層析或者離子交換層析等分離手段，不能把各個(gè)成分有效地分開在普通的凝膠過(guò)濾層析譜圖上僅顯示一個(gè)寬的峰。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種有效的，適于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)中應(yīng)用的分離變性蛋白/包涵體蛋白復(fù)性混合液中蛋白聚集體的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供的分離變性蛋白/包涵體蛋白復(fù)性混合液中蛋白聚集體的方法，其特征在于，首先用含有1-3mol/L變性劑和0.1-0.5mol/L鹽離子的凝膠過(guò)濾層析緩沖液平衡凝膠過(guò)濾層析柱，再將變性蛋白/包涵體蛋白復(fù)性混合液進(jìn)凝膠過(guò)濾層析柱，用該含有變性劑和鹽離子的凝膠過(guò)濾層析緩沖液對(duì)其進(jìn)行洗脫，便分離出變性蛋白/包涵體蛋白復(fù)性混合液中的蛋白聚集體；所述的變性劑為脲、鹽酸胍、Triton或SDS；所述的鹽離子來(lái)自含有Na+、K+或NH4+離子的鹽酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽。
本發(fā)明通過(guò)改變緩沖液中變性劑和鹽離子的濃度，對(duì)復(fù)性蛋白混合液中的各組分進(jìn)行分離，可以改變聚集體和未折疊組分的含量，以收集不同要求的組分；通過(guò)改變緩沖液中變性劑的濃度，可以觀察到聚集體逐步的降低，而錯(cuò)誤折疊的成分逐步的增加，說(shuō)明聚集體主要是疏水相互作用而不是分子間的二硫鍵形成的。
本發(fā)明通過(guò)對(duì)凝膠過(guò)濾緩沖液成分的調(diào)節(jié)，成功的分離復(fù)性蛋白溶液中的聚集體及其它成分，為獲得單一的、活性蛋白的組分提供了可靠手段，并通過(guò)調(diào)節(jié)各個(gè)成分的含量，提供了分析組分形成和改變組分的有效方法。


附圖1為變性天然雞卵白溶菌酶復(fù)性后的分離圖譜；附圖2為不同脲濃度對(duì)分離復(fù)性后天然雞卵白溶菌酶的影響圖譜；附圖3為不同鹽離子濃度對(duì)分離復(fù)性后天然雞卵白溶菌酶的影響圖譜。
實(shí)施方式實(shí)施例1分離變性天然雞卵白溶菌酶蛋白復(fù)性混合液中的蛋白聚集體，以制得單一成分的天然雞卵白溶菌酶蛋白，其步驟如下1.收集復(fù)性后的天然雞卵白溶菌酶蛋白混合液，混合液中含有正確折疊復(fù)性的蛋白，尚未折疊或者錯(cuò)誤折疊錯(cuò)的蛋白、以及蛋白聚集體等多種成分；2.分離出復(fù)性后的天然雞卵白溶菌酶蛋白混合液中的蛋白聚集提體1)在0.1mol/L Tris-HCl，pH8.7的凝膠過(guò)濾層析緩沖液中加入0.15mol/L的NaCl和2mol/L的脲，制備一種含有0.15mol/L的NaCl和2mol/L的脲的凝膠過(guò)濾層析緩沖液；并用該緩沖液平衡Superdex 75(10/30)凝膠過(guò)濾層析柱；2)將收集的復(fù)性后的天然雞卵白溶菌酶蛋白混合液進(jìn)柱，并用上述加入了NaCl和脲的凝膠過(guò)濾層析緩沖液對(duì)其進(jìn)行流速為0.4mL/min的洗脫，便可分離出其中的蛋白聚集體，從而得到單一成分的天然雞卵白溶菌酶蛋白。
附圖1是本實(shí)施例典型的分離圖譜，經(jīng)過(guò)分析，可以確定其中的峰1是蛋白聚集體的吸收峰，峰2是完全復(fù)性的活性天然雞卵白溶菌酶蛋白的吸收峰，比活為52000U/mg，峰3是尚未折疊或者錯(cuò)誤折疊的蛋白組分的吸收峰。
實(shí)施例2用含有變性劑和鹽離子的緩沖液洗脫復(fù)性后天然雞卵白溶菌酶蛋白，并以不含變性劑和鹽離子的緩沖液作為對(duì)照，研究復(fù)性蛋白組分的形成情況所使用的凝膠過(guò)濾層析柱為Superdex 75預(yù)裝柱，洗脫流速為0.4mL/min，附圖2中的曲線1為使用不含變性劑和鹽離子的凝膠過(guò)濾層析緩沖液洗脫復(fù)性后的天然雞卵白溶菌酶蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)僅僅有一個(gè)洗脫峰(后面的峰為離子后峰)，并且出峰時(shí)間比較晚，提示三個(gè)峰的成分之間以及與層析柱發(fā)生了吸附作用；當(dāng)所使用的凝膠過(guò)濾層析緩沖液中含有低濃度的NaC，在改變其緩沖液中的脲濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)蛋白聚集體的峰逐漸降低，峰3組分逐漸增加，表示蛋白聚集體大部分由于疏水相互作用形成；而正確折疊的蛋白組分沒有改變；但是加入脲和還原劑后，所有組分成單峰，出峰時(shí)間提前，說(shuō)明峰3的未折疊或者錯(cuò)誤折疊的組分已經(jīng)形成了二硫鍵并且分子表觀體積比較小，附圖2顯示了整個(gè)過(guò)程；當(dāng)所使用的凝膠過(guò)濾層析緩沖液中脲濃度為3mol/L，在改變其緩沖液中NaCl的濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)折疊的組分與未折疊組分逐漸分離，一直到?jīng)]有變化，附圖3顯示了這個(gè)過(guò)程；從該實(shí)施例可以看出，本發(fā)明不僅提供了有效的分離不同復(fù)性成分的方法，而且提供了研究不同成分的手段。
實(shí)施例3，使用含有1.5mol/L鹽酸胍和0.1mol/L碳酸鉀(或0.1mol/L的醋酸鉀)的Tris-HCl緩沖液洗脫人溶菌酶包涵體復(fù)性后混合液中的蛋白聚集體，制得單一成分的天然雞卵白溶菌酶蛋白，可得到同實(shí)施例1類似的分離效果。
實(shí)施例4，使用含有1mol/L鹽酸胍、0.1％Triton X-100(0.015mol/L)和0.1mol/L的(NH4)2SO4(或NH4Cl)的緩沖液洗脫變性天然雞卵白溶菌酶蛋白復(fù)性混合液中的蛋白聚集體，制得單一成分的天然雞卵白溶菌酶蛋白，可得到同實(shí)施例1類似的分離效果。
實(shí)施例5，使用含有1mol/L脲、0.1％SDS(0.01mol/L)和0.1mol/L的K2HPO4的緩沖液洗脫變性天然雞卵白溶菌酶蛋白復(fù)性混合液中的蛋白聚集體，制得單一成分的天然雞卵白溶菌酶蛋白，可得到同實(shí)施例1類似的分離效果。
權(quán)利要求
1.一種分離變性蛋白/包涵體蛋白復(fù)性混合液中蛋白聚集體的方法，其特征在于，首先用含有1-3mol/L變性劑和0.1-0.5mol/L鹽離子的凝膠過(guò)濾層析緩沖液平衡凝膠過(guò)濾層析柱，再將變性蛋白/包涵體蛋白復(fù)性混合液進(jìn)凝膠過(guò)濾層析柱，用該含有變性劑和鹽離子的凝膠過(guò)濾層析緩沖液對(duì)其進(jìn)行洗脫，便分離出變性蛋白/包涵體蛋白復(fù)性混合液中的蛋白聚集體
2.按權(quán)利要求1所述的分離變性蛋白/包涵體蛋白復(fù)性混合液中蛋白聚集體的方法，其特征在于，所述的變性劑為脲、鹽酸胍、Triton或SDS。
3.按權(quán)利要求1的所述分離變性蛋白/包涵體蛋白復(fù)性混合液中蛋白聚集體的方法，其特征在于，所述的鹽離子來(lái)自含有Na+、K+或NH4+離子的鹽酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及的分離變性蛋白/包涵體蛋白復(fù)性混合液中蛋白聚集體方法，其特征在于，在蛋白復(fù)性工藝過(guò)程中，變性的復(fù)性蛋白溶液中含有不同狀態(tài)的蛋白，將含有不同狀態(tài)的蛋白的復(fù)性蛋白溶液利用凝膠過(guò)濾層析技術(shù)進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析分離，并在每升凝膠過(guò)濾層析的復(fù)性的緩沖液中加入1～3mol的變性劑和0.1～0.5mol的鹽離子；所述的變性劑為脲、鹽酸胍、Triton或SDS；所述的鹽離子來(lái)自含有Na
文檔編號(hào)C07K1/00GK1410436SQ01142300
公開日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2001年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月27日
發(fā)明者蘇志國(guó), 李明 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所