專利名稱：提取河豚毒素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種由動物材料提取的物質，特別是由河豚魚提取河豚毒素的方法。
背景技術：
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一種海洋生物毒素，存在于河豚魚、蠑螈、法螺、蟹、章魚等體內，目前主要來源還是河豚魚的內臟，TTX的分子式C11H17O8N3，分子量319。劇毒，小白鼠的LD10μg/kg。
TTX由于在極微量的情況下就能阻斷細胞鈉離子的通道，而對鉀離子通道沒有影響，具有高度的專一性，因此是十分有用的神經生理研究用工具藥。
臨床醫(yī)學上已證明TTX是良好的鎮(zhèn)靜劑、解痙劑、鎮(zhèn)痛劑，特別對癌癥等惡性疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用，與傳統(tǒng)的杜冷丁、嗎啡等鎮(zhèn)痛藥相比雖然響應時間稍長，但其鎮(zhèn)痛作用可達12-20小時，而且無成癮性。近來TTX在戒毒方面也顯示出良好的效果，一般戒毒者只需每日注射30μgTTX一針，5-7天為一個療程，毒癮即可得到控制，并可大大減輕一般戒毒中常常出現的戒毒綜合癥。
TTX目前主要從河豚魚的內臟中提取，由于TTX在河豚魚中含量極低，不到1ppm，對其分離和提純十分困難，以往的提取工藝十分復雜，要通過幾十道工序才能得到TTX的晶體，不僅消耗大量的人力、物力，也容易造成環(huán)境的污染。
傳統(tǒng)的TTX提取工藝包括有下列步驟新鮮的河豚魚內臟加福爾馬林—切碎—加水—加溫—冷卻沉淀—分離得清液—加溫—去油層—清液加堿—沉淀—分離—沉淀物加酸上活性炭柱脫色—濾液加堿—沉淀—得TTX粗品—加酸溶解—上色譜柱—洗脫—加堿沉淀結晶—加酸溶解—過濾—加堿結晶—分離—干燥—得TTX純品。
上述過程，除了工藝復雜意外，其中相轉換損失、高溫對TTX的破壞、活性炭吸附等因素，均使TTX的提取得率大大降低，因而成為這一技術領域進步的一大障礙。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題，是提供一種改進的提取河豚魚毒素的方法，它能提高TTX的提取得率，簡化提取工藝，并能減少廢棄物對環(huán)境的污染。
解決上述技術問題采用的步驟包括有首先將新鮮的河豚魚內臟切碎、磨漿、壓濾、加熱去蛋白和油脂，得濃縮清液；進行連續(xù)過濾，分別按下列次序進行將上述的濃縮清液在過濾膜孔徑為1μm至5μm的過濾器中進行過濾，得新清液；將上述的新清液在過濾膜孔徑為0.1μm至0.8μm的過濾器中進行過濾，得澄清液，再將上述的澄清液，在過濾膜孔徑為1nm至5nm的過濾器中進行過濾，得純清液；將上述的純清液濃縮上色譜柱、洗脫結晶，得TTX純品。
本發(fā)明采用連續(xù)過濾程序，使其提取工藝程序簡化，有利規(guī)模生產；免除傳統(tǒng)工藝中的相反應，減少相轉換損失，不采用高溫，避免高溫破壞TTX，不再用活性炭(或其它吸附劑)吸附，這些因素均使本發(fā)明的方法可大大提高提取得率；同時，其相應的污染物也明顯減少，有利環(huán)境保護。
4.將上述的純清液濃縮，得濃縮純清液，即上液相色譜柱，用醋酸作洗脫液洗脫，用氨水調節(jié)PH8.0～10.0，溫度8℃至12℃，靜置20～30小時，結晶沉淀，將結晶用水洗滌，然后冷卻干燥，得純度大于99％的TTX純晶。
為進一步說明本發(fā)明的提取方法，下面以10kg新鮮河豚魚內臟提取TTX為例，其相應提取步驟如下1、將10Kg新鮮的河豚魚卵巢用絞肉機絞碎后用球磨機磨成肉漿。
2、將上述肉漿加水10Kg，用攪拌機攪拌30分鐘，然后用板框壓濾機壓濾，壓濾所得濾液儲存?zhèn)溆茫粸V餅加入10Kg水后用攪拌機攪拌30分鐘，再經壓濾分離。然后再重復一次。將三次所得濾液混合備用。
3、將上述濾液放入帶攪拌的夾套反應鍋中，攪拌轉速每分鐘20轉。加熱至沸10分鐘。然后靜置、冷卻，將反應鍋中濾液通過15μm過濾膜除去熱固性蛋白，得清液。
4、將上述清液減壓蒸餾，溫度60℃-70℃，真空度350mm汞柱，時間60分鐘，然后靜置分層，將上層油脂除去，得濃縮清液。
5、將濃縮清液先通過3μm過濾膜，得新清液，然后通過0.25μm過濾膜過濾，得澄清液，將上述澄清液通過5nm的過濾膜，得純清液。
6、將純清液減壓蒸餾，濃縮至1000ml，得濃縮純清液，即上液相色譜柱。色譜條件如下制備型高效液相色譜儀，固定相為400*40mmLC-18，流動相為濃縮純清液，流速5ml-50ml/min，用示差折光檢測器檢測，按記錄儀的峰圖收集餾份。分離柱為弱酸性陽離子樹脂。
7、用5％的醋酸洗脫，得300ml洗脫液，將洗脫液減壓蒸餾得濃縮液，用氨水調節(jié)濃縮液PH至9.0，溫度10℃左右，靜置24小時可見白色結晶沉淀。
8、過濾，將沉淀取出，用水洗滌，然后真空干燥即得河豚毒素結晶150mg，純度為97％。若顏色偏黃，可用重結晶方式可得白色結晶純度99％的TTX120mg，和傳統(tǒng)提取方比較，其TTX提取率提高達35％。
權利要求
1.一種提取河豚毒素的方法，其特征在于包括下列步驟a、將河豚魚內臟切碎、磨漿、壓濾、加熱去蛋白和油脂，得濃縮清液；b、連續(xù)過濾，分別按下列次序進行將上述的濃縮清液在過濾膜孔徑為1μm至5μm的過濾器中進行過濾，得新清液；將上述的新清液在過濾膜孔徑為0.1μm至0.8μm的過濾器中進行過濾，得澄清液；將上述的澄清液，在過濾膜孔徑為1nm至5nm的過濾器中進行過濾，得純清液；c、將上述的純清液濃縮上色譜柱、洗脫結晶，得TTX純品。
2.根據權利要求1所述的提取河豚魚毒素的方法，其特征是上述各種孔徑的過濾膜可為纖維素(CA)膜、聚砜(PA)膜、聚丙烯(PP)膜、聚四氟乙烯(PTFE)膜或尼龍膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提取河豚魚毒素(TTX)的方法，涉及一種由動物材料提取的物質，主要解決提高TTX的提取得率等技術問題，相應采用的技術方案是，將河豚魚內臟切碎、磨漿、壓濾、加熱去蛋白和油脂，再進行連續(xù)過濾，得純清液，將上述純清液濃縮上色譜柱、洗脫結晶，得TTX純品，本發(fā)明的方法適用于提取河豚魚內臟的TTX。
文檔編號C07D491/00GK1425666SQ01142658
公開日2003年6月25日 申請日期2001年12月14日 優(yōu)先權日2001年12月14日
發(fā)明者梁映華 申請人:上海華騰生物工程有限公司