專利名稱：超敏反應(yīng)激衛(wèi)素受體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及超敏反應(yīng)激衛(wèi)素受體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物演化出復(fù)雜的一系列生物化學(xué)途徑，使它們能夠識(shí)別和應(yīng)答環(huán)境信號(hào)(包括病原體感染)。病原體和植物之間的相互作用主要有兩類相容型和不相容型。當(dāng)病原體與植物相容，通常發(fā)生疾病。如果病原體與植物是不相容的，那么所述植物通常抵抗該特定病原體。在不相容的相互作用中，植物在感染位點(diǎn)周圍的小區(qū)域引起局部壞死或組織死亡，從而限制病原體繁殖。人們將植物的該反應(yīng)定義為超敏反應(yīng)(“HR”)(Kiraly，Z.“侵入者觸發(fā)的防御超敏反應(yīng)性”Plant DiseaseAn Advanced Treatise5201-224 J.G.Horsfall和E.B.Cowling編輯，Academic Press，New York(1980)；(Klement“超敏反應(yīng)性”Phytopathogenic Prokaryotes2149-177，M.S.Mount和G.H.Lacy編輯，Academic Press，New York(1982))。局部細(xì)胞死亡不僅限制病原體進(jìn)一步傳播，而且引起系統(tǒng)性抗性，防止其它病原體的隨后感染。因此，HR是植物對(duì)由細(xì)菌、真菌、線蟲和病毒引起的疾病的抗性的一般形式。
一組名為hrp(超敏反應(yīng)和致病性，Hypersensitive Response andPathogenicity)的基因負(fù)責(zé)引發(fā)針對(duì)致病性細(xì)菌的HR，所述致病性細(xì)菌包括歐文氏菌(Erwinia spp)、假單胞菌(Pseudomonas spp)、黃單胞菌(Xanthomonas spp)和茄羅爾斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)(Willis等“植物致病性細(xì)菌的hrp基因”Mol.Plant-Microbe Interact.4132-138(1991)，Bonas，U.“植物致病性細(xì)菌的hrp基因”第79-98頁，Current Topics in Microbiology and Immunology，第192卷，植物和動(dòng)物的發(fā)病機(jī)理分子機(jī)制和細(xì)胞機(jī)制，J.L.Dangl編輯，Springer-Verlag，Berlin(1994)；Alfano等，“植物中的細(xì)菌病原體Live Up Against theWall”Plant Cell81683-98(1996)。一般地說，多個(gè)hrp基因集合在30-40kb DNA內(nèi)。其中任何一個(gè)hrp基因突變將導(dǎo)致在宿主植物內(nèi)喪失細(xì)菌致病性以及在非宿主植物中引起HR。在遺傳和生化特征鑒定的基礎(chǔ)上，所述hrp基因的功能可以分為三類1)編碼細(xì)胞外定位HR激衛(wèi)素的結(jié)構(gòu)基因，例如解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)的harpin(Wei等“Harpin植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素”Science25785(1992))；2)編碼分泌裝置的分泌基因，所述分泌裝置將HR激衛(wèi)素和其它蛋白從細(xì)菌胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面或細(xì)胞外空間(Van Gijsegem等，“致病性決定子在植物和動(dòng)物致病性細(xì)菌中的進(jìn)化保守性”Trends Microbiol.1175-180(1993)；He等，“丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonas syringae pv.Syringae)harpinpss通過Hrp途徑分泌的蛋白在植物中引發(fā)超敏反應(yīng)”Cell731255(1993)；Wei等，“解淀粉歐文氏菌的Hrp I在harpin分泌中起作用并是新蛋白質(zhì)家族的成員”J.Bacteriol.1757985-67(1993)，Arlat等“在特定矮牽牛基因型中引發(fā)超敏樣反應(yīng)的蛋白PopAl通過茄假單胞菌(Pseudomonas solanacearum)的Hrp途徑分泌”EMBO J.13543-53(1994)，Galan等，“細(xì)菌病原體與它們的宿主細(xì)胞間的相互作用”Ann.Rev.Cell Dev.Biol.12221-55(1996)；Bogdanove等，“解淀粉歐文氏菌通過III型途徑分泌harpin并且包含耶爾森氏菌(Yersinia)yopN的一種同源物”J.Bacteriol.1781720-30(1996)；Bogdanove等，“解淀粉歐文氏菌的hrp連鎖致病性操縱子dspEF與丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringae pathovar tomato)的avrE座位之間的同源性和功能相似性”Proc Natl Acad Sci USA951325-30(1998))；和3)控制hrp基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因(Wei，Z.M.，“harpin植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素”Science25785(1992)；Wei等，“hrpL應(yīng)對(duì)環(huán)境刺激時(shí)，激活解淀粉歐文氏菌hrp基因”J.Bacteriol.1741875-82(1995)；Xiao等，“一種由最近鑒定的其它轉(zhuǎn)錄起始因子識(shí)別的單啟動(dòng)子序列指導(dǎo)致病性表達(dá)以及丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的宿主范圍決定子”J.Bacteriol1763089-91(1994)；Kim等，“解淀粉歐文氏菌的hrpA操縱子和hrpC操縱子編碼分泌harpin的III型途徑的成分”J.Bacteriol1791690-97(1997)；Kim等，“解淀粉歐文氏菌的HrpW一種包含與獨(dú)特類型果膠酸裂解酶同源的結(jié)構(gòu)域的新型harpin”J.Bacteriol.1805203-10(1998)；Wengelnik等，“野油菜黃單胞菌辣椒斑點(diǎn)病致病變種(Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria)的一種關(guān)鍵hrp調(diào)節(jié)蛋白hrpG與兩種成分反應(yīng)調(diào)節(jié)物同源”Mol.Plant-Microbe Interact.9704-12(1996))。由于hrp基因在植物和微生物相互作用中的作用，它們已經(jīng)成為細(xì)菌致病性和植物防御研究的焦點(diǎn)。
除局部防御反應(yīng)外，HR還激活同一植株的未感染部分防御系統(tǒng)。這導(dǎo)致名為系統(tǒng)性獲得性抗性(“SAR”)的對(duì)繼發(fā)感染的一般性系統(tǒng)性抗性(Ross，R.F.“植物中由局部病毒感染誘導(dǎo)的系統(tǒng)性獲得性抗性”Virology14340-58(1961)；Malamy等，“水楊酸和植物抗病性”Plant J.2643-654(1990))。SAR賦予對(duì)廣泛范圍病原體的長期系統(tǒng)性抗病性，并且與某組基因的表達(dá)有關(guān)(Ward等“引起系統(tǒng)性獲得性抗性的物質(zhì)作用下的協(xié)同基因活性”Plant Cell31085-94(1991))。SAR是植物抗病性的重要成分，很久以來就引起人們的興趣，因?yàn)檎T導(dǎo)植物保護(hù)其自身的潛力可能顯著減少或消除對(duì)化學(xué)殺蟲劑的需求。生物環(huán)境因子(微生物)和非生物環(huán)境因子(化學(xué)制品)可以誘導(dǎo)SAR(Gorlach等“Benzothiadiazole是一類新型系統(tǒng)性獲得性抗性的誘導(dǎo)劑，其在小麥內(nèi)激活基因表達(dá)和抗病性”Plant Cell8629-43(1996))。在歷史上，使用弱毒病原體作為SAR的生物環(huán)境誘導(dǎo)因子。據(jù)報(bào)道，無毒植物生長促進(jìn)細(xì)菌(PGPR)也能夠誘導(dǎo)一些植物對(duì)抗各種疾病的抗性。生物環(huán)境因子誘導(dǎo)的SAR已經(jīng)成為許多研究的研究對(duì)象，尤其是70年代晚期和80年代早期的研究。然而，由于下列原因，僅獲得非常有限的成功1)生活生物在不同環(huán)境條件下行為表現(xiàn)不一致；2)相當(dāng)多為關(guān)于有意在環(huán)境中引入弱毒病原體的無法預(yù)期后果的考慮；和3)應(yīng)用生活微生物到多種環(huán)境條件的技術(shù)復(fù)雜性。為克服使用生活生物誘導(dǎo)SAR的限制，科學(xué)家長期以來一直尋找來自病原體的HR激衛(wèi)素以用于誘導(dǎo)SAR。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，1992年從在蘋果和梨中引起火疫病的致病性細(xì)菌解淀粉歐文氏菌分離了第一種宿主范圍廣泛的蛋白質(zhì)HR激衛(wèi)素。所述HR激衛(wèi)素被命名為“harpin”。它包含403個(gè)氨基酸，分子量約40kDa。所述harpin蛋白對(duì)熱穩(wěn)定，富含甘氨酸，不含半胱氨酸。編碼所述harpin蛋白的基因包含在1.3kB DNA片段中，所述片段位于hrp基因簇的中間。Harpin分泌入細(xì)胞外空間，對(duì)蛋白酶消化非常敏感。自從由解淀粉歐文氏菌分離第一種harpin后，已經(jīng)從其它主要植物致病細(xì)菌群分離出幾種harpin或harpin樣蛋白。除解淀粉歐文氏菌的harpin外，已經(jīng)分離和特征鑒定了下列harpin或harpin樣蛋白菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)的HrpN、解淀粉歐文氏菌的HrpN(Wei等“harpin由植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素”Science，25785(1992))以及斯氏歐文氏菌(Erwinia stewartii)的HrpN；丁香假單胞菌的HrpZ(He等，“丁香假單胞菌丁香致病變種harpinpss通過Hrp途徑分泌的蛋白，在植物中引發(fā)超敏反應(yīng)”Cell731255(1993))、茄羅爾斯通氏菌的PopA(Arlat等“在特定矮牽牛基因型中引發(fā)超敏樣反應(yīng)的蛋白PopAl通過茄假單胞菌的Hrp途徑分泌”EMBO J.13543-53(1994))；解淀粉歐文氏菌的HrpW(Kim等，“解淀粉歐文氏菌的HrpW一種包含與獨(dú)特家族的果膠酸裂解酶同源的結(jié)構(gòu)域的新型harpin”J.Bacteriol.1805203-10(1998))、以及丁香假單胞菌的HrpW。所有目前描述的harpin或harpin樣蛋白都具有共同特征。它們是對(duì)熱穩(wěn)定并且富含甘氨酸的蛋白，不含半胱氨酸殘基，對(duì)于蛋白酶消化非常敏感，引發(fā)HR，并且在多種植物中引發(fā)針對(duì)許多疾病的抗性。根據(jù)它們所共同擁有的生化和生物物理特征以及生物學(xué)功能，這些來自不同致病細(xì)菌的HR激衛(wèi)素屬于一個(gè)新的蛋白家族-即harpin蛋白家族。所述特征(尤其是它們?cè)趶V泛范圍植物中誘導(dǎo)HR的能力)將所述harpin蛋白家族與其它宿主特異性蛋白質(zhì)HR激衛(wèi)素區(qū)別開來，所述宿主特異性蛋白質(zhì)HR激衛(wèi)素例如來自疫霉屬菌(Phytophthora spp)的elicitin(Bonnet等，“煙草和其它植物中由激衛(wèi)素觸發(fā)的獲得性抗性”Eur.J.Plant Path.102181-92(1996)；Keller等“煙草中elicitin誘導(dǎo)的系統(tǒng)性獲得性抗性的生理學(xué)特征和分子特征”Plant Physiol110365-76(1996))或來自黃枝孢菌(Cladosporium fulvum)的無毒蛋白(例如Avr9)，它們僅能在特定植物品種或特定植物物種中引發(fā)HR。
本質(zhì)上，當(dāng)發(fā)生細(xì)菌感染時(shí)，細(xì)菌表達(dá)并分泌harpin蛋白，其信號(hào)使植物發(fā)起針對(duì)感染的防御。Harpin作為激活植物防御和其它生理系統(tǒng)的信號(hào)起作用，包括SAR、生長增強(qiáng)和對(duì)某些昆蟲損害的抗性。
下面描述目前對(duì)于關(guān)鍵植物分子的了解，所述關(guān)鍵植物分子在與激衛(wèi)素相互作用并隨后觸發(fā)順序信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)中有重要作用。植物抗性基因(R)與病原體無毒基因(avr)的相互作用基因與基因相互作用的概念是“對(duì)于宿主中每個(gè)決定抗性的基因(R基因)，在病原體中有對(duì)應(yīng)的決定無毒的基因(avr基因)”。在該模型中，病原體無毒基因產(chǎn)生特定配體分子，名為激衛(wèi)素。只有攜帶匹配抗性基因的植物對(duì)該激衛(wèi)素應(yīng)答并引起HR。在過去幾年中，已經(jīng)克隆和測序了幾種抗病性基因即R基因。預(yù)期R基因可能編碼涉及最終導(dǎo)致防御反應(yīng)的信號(hào)識(shí)別或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成分。所克隆的R基因可以分為四類(1)胞質(zhì)蛋白激酶；(2)具有胞外域的蛋白激酶；(3)具有富含亮氨酸重復(fù)區(qū)以及核苷酸結(jié)合位點(diǎn)的胞質(zhì)蛋白；以及(4)具有看起來編碼胞外蛋白的富含亮氨酸重復(fù)區(qū)的蛋白。(綜述見Bent，A.F.“植物抗病性基因功能符合結(jié)果”Plant Cell 81757-71(1996)；Baker B.等，“植物-微生物相互作用中的信號(hào)傳遞”Science276726-33(1997))?？寺〉牡谝环NR基因Pto編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶。Pto的蛋白產(chǎn)物直接與相關(guān)無毒基因蛋白AvrPro相互作用，這一點(diǎn)已經(jīng)在酵母雙雜交系統(tǒng)中得到證明。實(shí)驗(yàn)顯示只有AvrPro和Pto蛋白共同存在時(shí)才能在植物中引發(fā)HR(Tang等，“通過AvrPto和Pto激酶的物理相互作用啟動(dòng)植物抗病性”Science 2742060-63(1996)；Scofield等，“番茄的細(xì)菌葉斑病中基因與基因特異性的分子基礎(chǔ)”Science2742063-65(1996)；Zhou等“賦予番茄細(xì)菌葉斑病抗性的Pto激酶與結(jié)合發(fā)病機(jī)理相關(guān)基因順式元件的蛋白相互作用”EMBO J.163207-18(1997))。來自克隆R基因的結(jié)果支持這樣一個(gè)觀點(diǎn)植物與病原體的相互作用涉及蛋白與蛋白的相互作用。Syringolide是一種水溶性低分子量激衛(wèi)素，其在攜帶Rpg4抗病性基因的大豆栽培品種中觸發(fā)防御反應(yīng)。已經(jīng)從大豆分離出一種34kDa的蛋白，據(jù)認(rèn)為該蛋白是有生理活性的syringolide受體(Ji等，“針對(duì)syringolide激衛(wèi)素的34kDa大豆結(jié)合蛋白的特征鑒定”Proc.Natl.Acad.Sci.USA953306-11(1998))。推定的elicitin的結(jié)合因子elicitin是由疫霉分泌的小蛋白家族，有高度同源性。單獨(dú)elicitin本身能夠在煙草和其它植物中引起超敏反應(yīng)(局部細(xì)胞死亡)并觸發(fā)系統(tǒng)性獲得性抗性(Bonnet等，“激衛(wèi)素在煙草和其它植物中觸發(fā)的獲得性抗性”Eur.J.Plant Path.102181-92(1996)；Keller等，“elicitin在煙草中引起的系統(tǒng)性獲得性抗性的生理特征和分子特征”Plant Physiol110365-76(1996))。然而，HR引發(fā)的范圍以及在植物中所誘導(dǎo)的系統(tǒng)性抗性比harpin家族激衛(wèi)素狹窄得多。象harpin一樣，elicitin在煙草細(xì)胞中誘導(dǎo)一系列代謝事件，包括積累植物抗毒素、產(chǎn)生乙烯、跨膜電解質(zhì)泄漏、H2O2積累以及表達(dá)植物防御相關(guān)基因(Yu L等，“疫霉屬的elicitin和植物中的基礎(chǔ)抗性”Proc.Natl.(1995)；Keller等，“轉(zhuǎn)基因煙草中病原體誘導(dǎo)的elicitin產(chǎn)生引起超敏反應(yīng)和非特異性抗病性”The Plant Cell11223-35(1999))。在煙草質(zhì)膜中已經(jīng)鑒定出推定的受體樣結(jié)合因子，所述結(jié)合因子對(duì)elicitin家族的一個(gè)成員crytogein具有特異性高親和力(Wendehenne等，“煙草質(zhì)膜上存在對(duì)蛋白質(zhì)激衛(wèi)素特異性、高親和力位點(diǎn)的證據(jù)”FEBS Letters374203-207(1995))。最近，發(fā)現(xiàn)兩種堿性elicitin(即crytogein和cinnamomin)和兩種酸性elicitin(即capsicein和parasiticein)能夠與煙草質(zhì)膜上的同一結(jié)合位點(diǎn)相互作用(Bourque等，“比較各種elicitin在煙草細(xì)胞中的結(jié)合特性和早期生物學(xué)效應(yīng)”Plant Physiol.1181317-26(1998))。然而，還沒有分離出所述受體樣因子的基因。糖蛋白激衛(wèi)素推定的結(jié)合因子已經(jīng)從大雄疫霉(Phytophthora megasperma)(Parker等，“來自Phytophthora megasperma f.sp.glycinea的細(xì)胞外糖蛋白在培養(yǎng)的歐芹(Parsley)細(xì)胞和原生質(zhì)體中引發(fā)植物抗毒素合成”Mol.PlantMicrobe Interact.419-27(1991))。所述糖蛋白內(nèi)一種13個(gè)氨基酸的寡肽(“Pep-13”)能夠象全長糖蛋白那樣在植物中誘導(dǎo)反應(yīng)。使用同位素標(biāo)記的寡肽，已經(jīng)在歐芹微粒體膜中觀察到高親和力結(jié)合模式。估計(jì)每個(gè)細(xì)胞上有約1600到2000個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)證據(jù)顯示位于質(zhì)膜上的Pep-13的蛋白受體不太豐富(Nurnberger等，“一種真菌寡肽激衛(wèi)素與歐芹質(zhì)膜的高親和力結(jié)合觸發(fā)多種防御反應(yīng)”Cell78449-60(1994))。Harpin蛋白結(jié)合因子已經(jīng)從植物病原體分離出在多種不同非宿主植物中引發(fā)HR的harpin蛋白(Wei等“Harpin植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素”Science25785(1992))。已經(jīng)鑒定來自植物細(xì)菌病原體的一個(gè)harpin蛋白家族。它們均具有相似的生物活性。據(jù)可靠記載，harpin蛋白能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生活性氧、改變離子流、導(dǎo)致局部細(xì)胞死亡和誘導(dǎo)系統(tǒng)性獲得性抗性(“SAR”)(Wei等“Harpin植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素”Science25785(1992)；He等，“丁香假單胞菌丁香致病變種harpinpss通過Hrp途徑分泌的蛋白，在植物中引發(fā)超敏反應(yīng)”Cell731255-66(1993)；Baker，C.J.等，“harpin在煙草中由解淀粉歐文氏菌引起的超敏反應(yīng)的激衛(wèi)素，在懸浮細(xì)胞中引發(fā)活性氧產(chǎn)生”Plant Physiol.1021341-44(1993))。目前還沒有分離出harpin結(jié)合因子。據(jù)報(bào)道，從甜椒分離的稱為HRAP的兩性蛋白能夠解離多聚體形式的harpinpss(來自丁香假單胞菌的hrpZ)。據(jù)信所述HRAP的生物學(xué)活性是其增強(qiáng)harpinpss介導(dǎo)的超敏反應(yīng)的能力。HRAP蛋白并不直接結(jié)合harpinpss(Chen等，“一種來自甜椒的兩性蛋白能夠解離harpinpss多聚體形式并增強(qiáng)harpinpss介導(dǎo)的超敏反應(yīng)”Physiological&Molecular Pathology52139-49(1998))。使用熒光染料標(biāo)記的針對(duì)harpinpss的抗體檢查harpinpss與煙草懸浮細(xì)胞間的相互作用，發(fā)現(xiàn)harpinpss與培養(yǎng)的細(xì)胞相互作用，但不與已經(jīng)消化并除去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體相互作用。這解釋為harpinpss位于所述植物細(xì)胞的外層部分，可能在細(xì)胞壁上。然而，不排除所述結(jié)合因子位于質(zhì)膜上的可能性。
本發(fā)明尋求鑒定超敏反應(yīng)激衛(wèi)素蛋白或多肽的受體以及所述受體的應(yīng)用。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及植物中作為植物病原體超敏反應(yīng)激衛(wèi)素的受體的分離蛋白。另外還公開編碼所述受體的核酸分子，以及包含所述核酸分子的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植物種子。
本發(fā)明的蛋白可用于鑒定植物細(xì)胞靶向物質(zhì)的方法形成包括所述蛋白和一種候選物質(zhì)的反應(yīng)混合物，評(píng)價(jià)所述反應(yīng)混合物中所述蛋白與所述候選物質(zhì)的結(jié)合，然后鑒定在所述反應(yīng)混合物中結(jié)合所述蛋白的候選化合物為植物細(xì)胞靶向物質(zhì)。
本發(fā)明的核酸分子可用于鑒定植物細(xì)胞靶向物質(zhì)的方法形成包括用本發(fā)明核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以及一種候選物質(zhì)的反應(yīng)混合物，評(píng)價(jià)所述反應(yīng)混合物中所述宿主產(chǎn)生的蛋白與候選物質(zhì)的結(jié)合，然后鑒定在所述反應(yīng)混合物中結(jié)合所述蛋白或所述宿主細(xì)胞的候選化合物為植物細(xì)胞靶向物質(zhì)。
本發(fā)明的又一方面涉及增強(qiáng)植物對(duì)用超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理的接受能力的方法，所述方法包括提供用本發(fā)明核酸分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物種子。
本發(fā)明還涉及賦予植物抗病性、增強(qiáng)生長、控制昆蟲和/或賦予植物脅迫抗性的方法，所述方法包括提供用DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物種子，所述DNA構(gòu)建物有效使編碼一種按照本發(fā)明的受體的核酸分子表達(dá)沉默。
本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)具有重要意義?？梢允褂迷撏贫ǖ氖荏w蛋白作為新方法，篩選植物對(duì)昆蟲抗性、植物抗病性和植物對(duì)脅迫抗性以及增強(qiáng)生長的新型誘導(dǎo)劑。該蛋白是走向了解harpin在植物中誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的第一步。對(duì)該途徑進(jìn)一步的研究將提供更多新型植物疫苗以及發(fā)展增強(qiáng)生長產(chǎn)品的可能靶。此外，該蛋白可以作為錨蛋白提供將任何物質(zhì)靶向植物細(xì)胞的新途徑。
附圖簡述

圖1顯示用解淀粉歐文氏菌超敏反應(yīng)激衛(wèi)素(即harpin)進(jìn)行篩選的酵母雙雜交以及圖解顯示harpin與一種cDNA編碼的多肽之間的相互作用。Harpin與包含一個(gè)DNA結(jié)合域(“BD”)的LexA蛋白融合。所述cDNA編碼的多肽與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域(“AD”)融合。所述相互作用將所述激活域靶向兩個(gè)不同的依賴于LexA的啟動(dòng)子，隨后激活HIS3和lacZ報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄。
圖2A-B顯示解淀粉歐文氏菌超敏反應(yīng)激衛(wèi)素(即harpin)是良好的酵母雙雜交誘餌。報(bào)道基因在包含下列質(zhì)粒的酵母菌株L40中不表達(dá)表達(dá)LexA-harpin融合物的質(zhì)粒，以及表達(dá)單獨(dú)的GAL4激活域或與不相關(guān)蛋白融合的GAL4激活域的質(zhì)粒。因此，harpin在該酵母雙雜交系統(tǒng)中不是自動(dòng)有活性的。此外，報(bào)道基因在包含下列質(zhì)粒的酵母菌株L40中不表達(dá)表達(dá)GAL4激活域-harpin融合物的質(zhì)粒，以及表達(dá)單獨(dú)的LexA或與不相關(guān)蛋白融合的LexA的質(zhì)粒。圖2A顯示一個(gè)β-半乳糖苷酶測定，在所述測定中藍(lán)色指示lacZ報(bào)道基因的表達(dá)。圖2B顯示一個(gè)缺乏亮氨酸、色氨酸和組氨酸的合成基本(“SD”)培養(yǎng)基平板。在所述平板上生長指示HIS3報(bào)道基因的表達(dá)。
圖3A-B顯示HrBP1(超敏反應(yīng)激衛(wèi)素結(jié)合蛋白1 hypersensitiveresponse elicitor binding protein 1)與超敏反應(yīng)激衛(wèi)素(即harpin)之間的相互作用是特異性的。報(bào)道基因在包含如下質(zhì)粒的酵母菌株L40中表達(dá)表達(dá)GAL4激活域-HrBP1融合物的質(zhì)粒，以及表達(dá)與超敏反應(yīng)激衛(wèi)素(即harpin)融合的LexA的質(zhì)粒，報(bào)道基因在包含以下質(zhì)粒的酵母菌株L40中不表達(dá)表達(dá)GAL4激活域-HrBP1融合物的質(zhì)粒，以及表達(dá)單獨(dú)的LexA或與不相關(guān)蛋白融合的LexA的質(zhì)粒。圖3A顯示一個(gè)β-半乳糖苷酶測定，在所述測定中藍(lán)色指示lacZ報(bào)道基因的表達(dá)。圖3B顯示一個(gè)缺乏亮氨酸、色氨酸和組氨酸的合成基本(“SD”)培養(yǎng)基平板。在所述平板上生長指示HIS3報(bào)道基因的表達(dá)。
圖4A-B顯示HrBP1與超敏反應(yīng)激衛(wèi)素(即harpin)在另一取向上的相互作用。報(bào)道基因在包含如下質(zhì)粒的酵母菌株L40中表達(dá)表達(dá)LexA-HrBP1融合物的質(zhì)粒，以及表達(dá)與harpin融合的GAL4激活域的質(zhì)粒，報(bào)道基因在包含以下質(zhì)粒的酵母菌株L40中不表達(dá)表達(dá)LexA-HrBP1融合物的質(zhì)粒，以及表達(dá)單獨(dú)的GAL4激活域或與不相關(guān)蛋白融合的GAL4激活域的質(zhì)粒。因此，harpin與HrBP1之間的相互作用是特異性的。圖4A顯示一個(gè)β-半乳糖苷酶測定，在所述測定中藍(lán)色指示lacZ報(bào)道基因的表達(dá)。圖4B顯示一個(gè)缺乏亮氨酸、色氨酸和組氨酸的合成基本(“SD”)培養(yǎng)基平板。在所述平板上生長指示HIS3報(bào)道基因的表達(dá)。
圖5顯示HrBP1的基因結(jié)構(gòu)以及HrBP1基因外顯子和內(nèi)含子的示意圖。當(dāng)把HrBP1 cDNA序列與公共數(shù)據(jù)庫公開的擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因組DNA序列相比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子。
圖6顯示用與HrBP1編碼區(qū)堿基651-855互補(bǔ)的RNA探針(SEQ.ID.NO.9)進(jìn)行的RNA印跡分析。
圖7A-B顯示rHrBP1(R6)與harpin的相互作用是特異性的。報(bào)道基因在包含如下質(zhì)粒的酵母菌株L40中表達(dá)表達(dá)GAL4激活域-rHrBP1融合物的質(zhì)粒，以及表達(dá)與harpin或harpin 137-180氨基酸融合的LexA的質(zhì)粒，報(bào)道基因在包含以下質(zhì)粒的酵母菌株L40中不表達(dá)表達(dá)GAL4激活域-rHrBP1融合物的質(zhì)粒，以及表達(dá)單獨(dú)的LexA、或與不相關(guān)蛋白融合的LexA、或與harpin 210-403氨基酸融合LexA的質(zhì)粒。圖7A顯示一個(gè)β-半乳糖苷酶測定，在所述測定中藍(lán)色指示lacZ報(bào)道基因的表達(dá)。圖7B顯示一個(gè)缺乏亮氨酸、色氨酸和組氨酸的合成基本(“SD”)培養(yǎng)基平板。在所述平板上生長指示HIS3報(bào)道基因的表達(dá)。
圖8顯示用于在擬南芥中“剔除”HrBP1基因的構(gòu)建物。
圖9A-C顯示在野生型植株和HrBP1“剔除”轉(zhuǎn)基因擬南芥植株上進(jìn)行的丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000測定。圖9A是接種丁香假單胞菌7天后拍到的照片。圖9B為收獲的葉碟。從葉碟提取細(xì)菌并接種到含100μg/ml利福平的King’s B瓊脂平板。圖9C顯示從圖9B的平板得到的細(xì)菌計(jì)數(shù)。這表示一條反義轉(zhuǎn)基因系(anti-senseline)，d代表雙鏈RNA轉(zhuǎn)基因系。
圖10顯示用于在煙草中過量表達(dá)HrBP1的構(gòu)建物。
圖11A-B顯示將野生型煙草植株和過量表達(dá)HrBP1的煙草植株轉(zhuǎn)移到土壤52天后它們的高度。圖11A是將植株轉(zhuǎn)移到土壤52天后拍攝的圖片。圖11B顯示每品系8株植株的平均高度。
圖12A-B顯示在野生型煙草植株和過量表達(dá)HrBP1的煙草植株上TMV測定的結(jié)果。圖12A是接種TMV 3天后拍到的照片。圖12B顯示接種TMV 3天后每個(gè)轉(zhuǎn)基因系5株植株的平均病毒斑直徑。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及分離的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素蛋白或多肽的受體。還公開編碼所述受體的DNA分子，以及包含所述分子的表達(dá)系統(tǒng)、宿主細(xì)胞和植物。公開所述受體本身的應(yīng)用以及編碼它們的DNA分子的應(yīng)用。植物病原體超敏反應(yīng)激衛(wèi)素受體可以得自單子葉植物或雙子葉植物。
在擬南芥中發(fā)現(xiàn)所述受體的一個(gè)例子，其具有如下SEQ.ID.No.1的氨基酸序列Met Ala Thr Ser Ser Thr Phe Ser Ser Leu Leu Pro Ser Pro Pro Ala1 5 10 15Leu Leu Ser Asp His Arg Ser Pro Pro Pro Ser Ile Arg Tyr Ser Phe20 25 30Ser Pro Leu Thr Thr Pro Lys Ser Ser Arg Leu Gly Phe Thr Val Pro35 40 45Glu Lys Arg Asn Leu Ala Ala Asn Ser Ser Leu Val Glu Val Ser Ile50 55 60Gly Gly Glu Ser Asp Pro Pro Pro Ser Ser Ser Gly Ser Gly Gly Asp65 70 75 80Asp Lys Gln Ile Ala Leu Leu Lys Leu Lys Leu Leu Ser Val Val Ser85 90 95Gly Leu Asn Arg Gly Leu Val Ala Ser Val Asp Asp Leu Glu Arg Ala100 105 110Glu Val Ala Ala Lys Glu Leu Glu Thr Ala Gly Gly Pro Val Asp Leu115 120 125Thr Asp Asp Leu Asp Lys Leu Gln Gly Lys Trp Arg Leu Leu Tyr Ser130 135 140Ser Ala Phe Ser Ser Arg Ser Leu Gly Gly Ser Arg Pro Gly Leu Pro145 150 155 160Thr Gly Arg Leu Ile Pro Val Thr Leu Gly Gln Val Phe Gln Arg Ile165 170 175Asp Val Phe Ser Lys Asp Phe Asp Asn Ile Ala Glu Val Glu Leu Gly180 185 190Ala Pro Trp Pro Phe Pro Pro Leu Glu Ala Thr Ala Thr Leu Ala His195 200 205Lys Phe Glu Leu Leu Gly Thr Cys Lys Ile Lys Ile Thr Phe Glu Lys210 215 220Thr Thr Va1 Lys Thr Ser Gly Asn Leu Ser Gln Ile Pro Pro Phe Asp225 230 235 240Ile Pro Arg Leu Pro Asp Ser Phe Arg Pro Ser Ser Asn Pro Gly Thr245 250 255Gly Asp Phe Glu Val Thr Tyr Val Asp Asp Thr Met Arg Ile Thr Arg260 265 270Gly Asp Arg Gly Glu Leu Arg Val Phe Val Ile Ala275 280
該蛋白名為HrBP1p，由具有如下SEQ.ID.No.2的cDNA分子編碼tttttccttc tcaacaatgg cgacttcttc tactttctcg tcactactac cttcaccacc 60agctcttctt tccgaccacc gttctcctcc accatccatc agatactcct tttctccctt 120aactactcca aaatcgtctc gtttgggttt cactgtaccg gagaagagaa acctcgctgc 180taattcgtct ctcgttgaag tatccattgg cggagaaagt gacccaccac catcatcatc 240tggatcagga ggagacgaca agcaaattgc attactcaaa ctcaaattac ttagtgtagt 300ttcgggatta aacagaggac ttgtggcgag tgttgatgat ttagaaagag ctgaagtggc 360tgctaaagaa cttgaaactg ctgggggacc ggttgattta accgatgatc ttgataagct 420tcaagggaaa tggaggctgt tgtatagtag tgcgttctct tctcggtctt taggtggtag 480ccgtcctggt ctacctactg gacgtttgat ccctgttact cttggccagg tgtttcaacg 540gattgatgtg tttagcaaag attttgataa catagcagag gtggaattag gagccccttg 600gccatttccg ccattagaag ccactgcgac attggcacac aagtttgaac tcttaggcac 660ttgcaagatc aagataacat ttgagaaaac aactgtgaag acatcgggaa acttgtcgca 720gattcctccg tttgatatcc cgaggcttcc cgacagtttc agaccatcgt caaaccctgg 780aactggggat ttcgaagtta cctatgttga tgataccatg cgcataactc gcggggacag 840aggtgaactt agggtattcg tcattgctta attctcaaag ctttgacatg taaagataaa 900taaatacttt ctgcttgatg cagtctcatg agttttgtac aaatcatgtg aacatataaa 960tgcgctttat aagtaaatga gtgtcttgtt caatgaatca 1000
包含編碼所述受體的SEQ.ID.No.2 cDNA分子的基因組DNA為如下SEQ.ID.No.3aattagaaaa attaacaacc aacatctagt tagaatattt aatttgcacc aatgtcttcg 60agtatagtga aaaaaataga agatcgaata tcgaatagta cgtatagaat catctagatc 120cattcgaact aacgtctact tttcttttcc agcattaaca tgtagcttgt cattagcatt 180tacatgttgc aaataacaca aattgggaaa ttgaaagact aaaaaacctt gtacagcaga 240tggtttaaca cgtggattca tggacacaaa cagaaaacgg cagaactaag cacaaaaacg 300tcaactaagc atatcaaagc ttttaatgca agcctaatat aaacacaagt ggttatccat 360aatctgttct taatctcttg cagtagttat cttttcatta ttcgcaattc gcaattctat 420attcttatat ttcaacttgt tcttcttcca aattgtaatt atatctacat cgtcttagct 480tgaccattat agctccagta ccaagttctc ttcttaactt taatatcagc tactattctc 540atactgtaaa tatcttttgt tcaccaaaca tatatttcga accaaactgc taaaagctta 600tcataaattg cagttctagc cacacaattt tgcagttcca accattaaat gccacaaaat 660ttggacgatt tcttaagaca agaagaacat agcaaccaaa ccttattgat taaatatgaa 720atgtctccat aaaactggga gatttcccca aataaagaga acacggcaaa tgttcacgta 780atctccaaga tgaatgttta attttttctt tcagaaaaaa acaaaaaaac ttaactcaat 840atagacaact agaatggata ccaactaagc aaaagaaatt caaaagacaa atatatattg 900gatatgaagt tacattattt tcaaacttta tatactacta aaagcctaaa aatttgttct 960aaaatgatat ccaaataaat ggaaggcatg aatgtcatat gactaaaaga gaaaaacaca 1020cctgtatata agtattggat catgctgcct ccgagtgaca aaacatacga tgtgggtctt 1080tattgggcca tacttaaatg gaaaaaggag aaaaaaaatt gggcaatgtc tatggtcgaa 1140atttatatgt tttacatcaa taaaatcaat atttaatttt atatatgtgg gtcttaatct 1200agtattatct acatagatta aaatcaaagt actgcatatg gtccataata atacaaccaa 1260agcaaattaa aattttgtgg cacaaaacga catcatttta ctcagaaagt aatatgcaat 1320ttcgtttacg cacacacgta tacgcgctaa taacccgtgg tgcttctcaa atcacataat 1380aattaaagtc ttcttcttct tcttcttctc tacaaattat ctcactctct tcgttttttt 1440ttccttctca acaatggcga cttcttctac tttctcgtca ctactacctt caccaccagc 1500tcttctttcc gaccaccgtt ctcctccacc atccatcaga tactcctttt ctcccttaac 1560tactccaaaa tcgtctcgtt tgggtttcac tgtaccggag aagagaaacc tcgctgctaa 1620ttcgtctctc gttgaagtat ccattggcgg agaaagtgac ccaccaccat catcatctgg 1680atcaggagga gacgacaagc aaattgcatt actcaaactc aaattacttg tgagtctgat 1740tcaaaccaat cggtgaaatt ataagaaatt ggtttcgttt ctttggaatt agggtttata 1800ttactgttaa gattcgatta tagagtgaat tttgggaaga tttttcagat ttgatttgtg 1860atgtgttgtg ttgtgagaaa ttgcagagtg tagtttcggg attaaacaga ggacttgtgg 1920cgagtgttga tgatttagaa agagctgaag tggctgctaa agaacttgaa actgctgggg 1980gaccggttga tttaaccgat gatcttgata agcttcaagg gaaatggagg ctgttgtata 2040gtagtgcgtt ctcttctcgg tctttaggtg gtagccgtcc tggtctacct actggacgtt 2100tgatccctgt tactcttggc caggtaattc ttgaatcatt gctctgtttt tacccgtcaa 2160gattcggttt ttcgggtaag ttgttgagga gtttatgtgc atggtctagt ctatcatcaa 2220tagtcttgct tgagtttgaa tggggctgag ctaagaatct agctttctga ggttacaatt 2280tggtaatgtc atcttatact cgaaagcaaa cttttttcta tattgtcaag tttatgtgta 2340cggtctggtc tatcattggt agtctttgtt gagcttgaat ggtgaggagc ttagaatcta 2400gcaatgtcat ctactcctta atcatttttt tctatattgc caagtttatg tgtacggtct 2460tagtcaatca tctttattct tggttgagtt tgaatggtga tgagcttaga atctagcttt 2520ctttggttta aatttggcaa agaaccatac ctgaatcggt agaaagcaaa cttctttaat 2580attatctctt gtttctgaat cattaaaaca ggtgtttcaa cggattgatg tgtttagcaa 2640agattttgat aacatagcag aggtggaatt aggagcccct tggccatttc cgccattaga 2700agccactgcg acattggcac acaagtttga actcttaggt ttgcatttcc ctttctctca 2760ttaagtttat cgaattgtgt aagagcaaaa taacttatct gtatctttga catttatggg 2820gaaaacaggc acttgcaaga tcaagataac atttgagaaa acaactgtga agacatcggg 2880aaacttgtcg cagattcctc cgtttgatat cccgaggctt cccgacagtt tcagaccatc 2940gtcaaaccct ggaactgggg atttcgaagt tacctatgtt gatgatacca tgcgcataac 3000tcgcggggac agaggtgaac ttagggtatt cgtcattgct taattctcaa agctttgaca 3060tgtaaagata aataaatact ttctgcttga tgcagtctca tgagttttgt acaaatcatg 3120tgaacatata aatgcgcttt ataagtaaat gagtgtcttg ttcaatgaat catatgaaag 3180aatttgtatg actcagaaaa ttggacaatg atatagacct tccaaatttt gcaccctcta 3240atgtgagata ttagtgattt tttcttaggt tggtagagag aacggattgg caaaaaaata 3300tcgaaggtca atgattaaca gcaaaaccat atcttgatga ttcaaaatat agagttaaca 3360agcaaagatg agacaatctt atacgagaga gctaaaacaa atggattcca aatccagcaa 3420gtacaaaaat cgcagaaaat aagatgaaac caacttaaaa cagagatgtt ccctttccct 3480tcttgtcacc accgatctcg aaatgcttgc acctctgaaa taaacaacaa accaacacaa 3540tgtaagcaaa ttaccaagtt acaaatccgg tataatgaac tgatctatgt tctatgcacc 3600ttgataggac gctgcgaaaa gtgcttgcag ctttgacact gaagcctcaa aacaatcttc 3660ttcgtggtct tagcctgtta acaagattca caagatgtat ctcagtccaa aactgagact 3720attggaatgt ctgtttcctc acagctcact tccaaaattc tactataaat ggttccttaa 3780aactacctca tttcaactaa ctagacctaa ttcaaactga aaaaacaatc aatgcatgat 3840aatcaatgtt acctttttgt ggaagacagg cttagtctga ccaccataac cagattgttt 3900acggtcataa cgacgctttc cttgagcagc aagactgtct ttacccttct tgtattgggt 3960aaccttgtgc aaagtatgct ttttgcattc cttgttctta cagtaagtgt tctttgtctt 4020tggaatgttc accttcaaaa ttcataaaat caaaaatgaa tcactcacac acatacaaaa 4080tcaagagact tttaaggtta atcaaaatac aaacatcatt tagattgaaa acttttatga 4140tagatctgaa aaacaataca ataaatcaat caaccatgta ttgttgttct tcaaagtcaa 4200cgaactttac aaattccaaa atcacatcga aagagaagaa acaatttacc attttcgcgt 4260
在水稻中發(fā)現(xiàn)依照本發(fā)明的受體的另一個(gè)例子，其具有如下SEQ.ID.No.4的部分氨基酸序列Val Ala Ala Leu Lys Val Lys Leu Leu Ser Ala Val Ser Gly Leu Asn1 5 10 15Arg Gly Leu Ala Gly Ser Gln Glu Asp Leu Asp Arg Ala Asp Ala Ala20 25 30Ala Arg Glu Leu Glu Ala Ala Ala Gly Gly Gly Pro Val Asp Leu Glu35 40 45Arg Asp Val Asp Lys Leu Gln Gly Arg Trp Arg Leu Val Tyr Ser Ser50 55 60Ala Phe Ser Ser Arg Thr Leu Gly Gly Ser Arg Pro Gly Pro Pro Thr65 70 75 80Gly Arg Leu Leu Pro Ile Thr Leu Gly Gln Val Phe Gln Arg Ile Asp85 90 95Val Val Ser Lys Asp Phe Asp Asn Ile Val Asp Val Glu Leu Gly Ala100 105 110Pro Trp Pro Leu Pro Pro Val Glu Leu Thr Ala Thr Leu Ala His Lys115 120 125Phe Glu Ile Ile Gly Thr Ser Ser Ile Lys Ile Thr Phe Asp Lys Thr130 135 140Thr Val Lys Thr Lys Gly Asn Leu Ser Gln Leu Pro Pro Leu Glu Val145 150 155 160Pro Arg Ile Pro Asp Asn Leu Arg Pro Pro Ser Asn Thr Gly Ser Gly165 170 175Glu Phe Glu Val Thr Tyr Leu Asp Gly Asp Thr Arg Ile Thr Arg Gly180 185 190Asp Arg Gly Glu Leu Arg Val Phe Val Ile Ser195 200該蛋白名為R6p，由具有對(duì)應(yīng)于如下SEQ.ID.No.5的相應(yīng)部分序列的cDNA分子編碼cgtggctgcg ctcaaagtca agcttctgag cgcggtgtcc gggctgaacc gcggcctcgc 60ggggagccag gaggatcttg accgcgccga cgcggcggcg cgggagctcg aggcggcggc 120gggtggcggc cccgtcgacc tggagaggga cgtggacaag ctgcaggggc ggtggaggct 180ggtgtacagc agcgcgttct cgtcgcggac gctcggcggc agccgccccg gcccgcccac 240cggccgcctc ctccccatca ccctcgggca ggtgtttcag aggatcgatg ttgtcagcaa 300ggacttcgac aacatcgtcg atgtcgagct cggcgcgcca tggccgctgc cgccggtgga 360gctgacggcg accctggctc acaagtttga gatcatcggc acctcgagca taaagatcac 420attcgacaag acgacggtga agacgaaggg gaacctgtcc cagctgccgc cgctggaggt 480ccctcgcatc ccggacaacc tccggccgcc gtccaacacc ggcagcggcg agttcgaggt 540gacctacctc gacggcgaca cccgcatcac ccgcggggac agaggggagc tcagggtgtt 600
本發(fā)明受體識(shí)別的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素能夠在所述激衛(wèi)素所接觸的植物組織中引發(fā)局部壞死。
超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白有代表性的合適細(xì)菌來源包括歐文氏菌(Erwinia)、假單胞菌和黃單胞菌(Xanthomonas)(例如，如下細(xì)菌解淀粉歐文氏菌、菊歐文氏菌、斯氏歐文氏菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)、丁香假單胞菌、茄假單胞菌、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)以及它們的混合物)。
超敏反應(yīng)激衛(wèi)素蛋白或多肽的真菌來源的例子是疫霉。疫霉屬的合適物種包括Phytophthora parasitica、隱地疫霉(Phytophthoracryptogea)、樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)、辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、大雄疫霉和柑橘褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)。
美國專利第5,850,015號(hào)和美國專利第6,001,959號(hào)公開來自菊歐文氏菌的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白，這兩份專利特此通過引用結(jié)合到本文中。該超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白分子量為34kDa，對(duì)熱穩(wěn)定，甘氨酸含量大于16％，基本不含半胱氨酸。
來自解淀粉歐文氏菌的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白分子量約39kDa，pI約4.3，在100℃對(duì)熱穩(wěn)定至少10分鐘。該超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白的甘氨酸含量大于21％，基本不含半胱氨酸。在下列文獻(xiàn)中更全面地描述了所述來自解淀粉歐文氏菌的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白Beer的美國專利第5,849,868號(hào)，以及Wei，Z.-M.等，“Harpin植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素”Science25785-88(1992)，這兩份文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
得自丁香假單胞菌的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白的分子量為34-35kDa。它富含甘氨酸(約13.5％)，缺少半胱氨酸和酪氨酸。在下列文獻(xiàn)中有關(guān)于得自丁香假單胞菌的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素及其編碼DNA分子的其它信息美國專利第5,708,139號(hào)和美國專利第5,858,786號(hào)，以及He等，“丁香假單胞菌丁香致病變種harpinpss通過Hrp途徑分泌的蛋白，在植物中引發(fā)超敏反應(yīng)”Cell731255-66(1993)，這些文獻(xiàn)都通過引用結(jié)合到本文中。
茄假單胞菌的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白在下面文獻(xiàn)中有描述Arlat，M.，F(xiàn).Van Gijsegem，J.C.Huet，J.C.Pemollet和C.A.Boucher，“在特定矮牽牛基因型中引發(fā)超敏樣反應(yīng)的蛋白PopAl通過茄假單胞菌的Hrp途徑分泌”EMBO J.13543-533(1994)，特此通過引用結(jié)合到本文中。該蛋白有344個(gè)氨基酸，分子量33.2kDa，pI為4.16，對(duì)熱穩(wěn)定，富含甘氨酸(20.6％)。
野油菜黃單胞菌甘氨酸致病變種(Xanthomonas campestris pv.glycines)的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白具有對(duì)應(yīng)于如下SEQ.ID.No.6的部分氨基酸序列Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr20 25該序列是來自野油菜黃單胞菌甘氨酸致病變種的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白的氨基末端序列，僅具有26個(gè)殘基。它與在其它野油菜黃單胞菌致病變種中確定的菌毛亞單位蛋白相匹配。
來自野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種(Xanthomonas campestris pv.pelargonii)的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白對(duì)熱穩(wěn)定，對(duì)蛋白酶敏感，分子量為20kDa。它具有如下SEQ.ID.No.7的氨基酸序列Met Asp Ser Ile Gly Asn Asn Phe Ser Asn Ile Gly Asn Leu Gln Thr1 5 10 15Met Gly Ile Gly Pro Gln Gln His Glu Asp Ser Ser Gln Gln Ser Pro20 25 30Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Gln Leu Leu Ala Met Phe Ile35 40 45Met Met Met Leu Gln Gln Ser Gln Gly Ser Asp Ala Asn Gln Glu Cys50 55 60Gly Asn Glu Gln Pro Gln Asn Gly Gln Gln Glu Gly Leu Ser Pro Leu65 70 75 80Thr Gln Met Leu Met Gln Ile Val Met Gln Leu Met Gln Asn Gln Gly85 90 95Gly Ala Gly Met Gly Gly Gly Gly Ser Val Asn Ser Ser Leu Gly Gly100 105 110Asn Ala該氨基酸序列由如下SEQ.ID.No.8的核苷酸序列編碼atggactcta tcggaaacaa cttttcgaat atcggcaacc tgcagacgat gggcatcggg 60cctcagcaac acgaggactc cagccagcag tcgccttcgg ctggctccga gcagcagctg 120gatcagttgc tcgccatgtt catcatgatg atgctgcaac agagccaggg cagcgatgca 180aatcaggagt gtggcaacga acaaccgcag aacggtcaac aggaaggcct gagtccgttg 240acgcagatgc tgatgcagat cgtgatgcag ctgatgcaga accagggcgg cgccggcatg 300ggcggtggcg gttcggtcaa cagcagcctg ggcggcaacg cc342在Cui等，“胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜軟腐亞種(Erwiniacarotovora subsp.carotovora)菌株Ecc71的RsmA突變體過量表達(dá)hrpNEcc并在煙草葉中引發(fā)超敏反應(yīng)樣應(yīng)答”MPMI，9(7)565-73(1996)中描述了胡蘿卜軟腐歐文氏菌超敏反應(yīng)激衛(wèi)素蛋白或多肽的分離，特此通過引用結(jié)合到本文中。該蛋白有356個(gè)氨基酸，分子量為35.6kDa，pI為5.82，對(duì)熱穩(wěn)定，富含甘氨酸(21.3％)。
在下面文獻(xiàn)中描述斯氏歐文氏菌的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素蛋白或多肽Ahmad等，“harpin對(duì)于斯氏歐文氏菌在玉米中的致病性不是必需的”8th Int’l.Cong.Molec.Plant-Microbe Interact.，1996年7月14-19和Ahmad等，“harpin對(duì)于斯氏歐文氏菌在玉米中的致病性不是必需的”Ann.Mtg.Am.Phytopath.Soc.，1996年7月27-31，特此通過引用結(jié)合到本文中。
Phytophthora parasitica、隱地疫霉、樟疫霉、辣椒疫霉、大雄疫霉和柑橘褐腐疫霉的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素蛋白或多肽在下列文獻(xiàn)中有描述Kaman等，“疫霉細(xì)胞外蛋白激衛(wèi)素大多數(shù)對(duì)細(xì)菌和真菌植物病原體特異性誘導(dǎo)抗性”Molec.Plant-Microbe Interact.，6(1)15-25(1993)，Ricci等，“在煙草中引發(fā)壞死和獲得性抗性的致病性真菌疫霉蛋白的結(jié)構(gòu)和活性”Eur.J.Biochem.，185555-63(1989)，Ricci等，“Phytophthora parasitica的分離物差異產(chǎn)生Parasiticein，以及煙草中引發(fā)壞死和抗性”Plant Path.41298-307(1992)，Baillreul等，“一種煙草的新型超敏反應(yīng)激衛(wèi)素一種真菌糖蛋白引發(fā)細(xì)胞死亡、防御基因表達(dá)、產(chǎn)生水楊酸并誘導(dǎo)系統(tǒng)性獲得性抗性”Plant J.，8(4)551-60(1995)，和Bonnet等，“在煙草和其它植物中由激衛(wèi)素觸發(fā)的獲得性抗性”Eur.J.Plant Path.，102181-92(1996)，特此通過引用結(jié)合到本文中。這些來自疫霉屬的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素都稱為elicitin。所有已知的elicitin都有98個(gè)氨基酸并且顯示＞66％的序列同一性。根據(jù)物理化學(xué)特性，它們可以分為兩類，即堿性elicitin和酸性elicitin。該分類也對(duì)應(yīng)于elicitin在引發(fā)HR樣癥狀的能力上的差異。至于在煙草植物上引起葉壞死，堿性elicitin比酸性elicitin有效100倍。
WO99/11133描述了來自格蘭氏陽性細(xì)菌如密執(zhí)安棍狀桿菌(Clavibacter michiganesis)的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素，該文獻(xiàn)特此通過引用結(jié)合到本文中。
上面的激衛(wèi)素是示例性引發(fā)劑?？梢匀缦妈b定其它激衛(wèi)素在編碼激衛(wèi)素的基因能夠表達(dá)的環(huán)境下，培養(yǎng)引發(fā)超敏反應(yīng)的真菌或細(xì)菌。使用來自培養(yǎng)物上清的無細(xì)胞制備物浸潤合適的植物組織，測試所述制備物中的激衛(wèi)素活性(即局部壞死)。
至于本發(fā)明的針對(duì)所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素的受體，本發(fā)明的方法包括上述受體蛋白的片段。此外，也可以利用來自其它植物的全長受體蛋白的片段。
可以通過幾種方法產(chǎn)生合適片段。第一種方法是，亞克隆基因片段，通過常規(guī)分子遺傳操作產(chǎn)生編碼已知受體蛋白的基因的亞克隆。然后所述亞克隆體外表達(dá)或在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生能夠按照上述程序測試受體活性的更小的蛋白或肽。
另一種方法是，可以用蛋白水解酶如胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白酶A或胰蛋白酶消化全長受體蛋白，產(chǎn)生受體蛋白片段。根據(jù)所述受體蛋白的氨基酸序列，不同的蛋白水解酶可能在不同位點(diǎn)切割所述受體蛋白。蛋白水解產(chǎn)生的一些片段可能是有活性的受體。
又一種方法是，根據(jù)對(duì)所述受體蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的知識(shí)，使用PCR技術(shù)以及選定代表所述蛋白特定部分的特定引物組，合成所述受體蛋白的片段。然后將它們克隆進(jìn)合適載體，表達(dá)截短的肽或蛋白。
也可以使用化學(xué)合成制造合適的片段。使用要合成的受體的已知氨基酸序列進(jìn)行所述合成。或者，全長受體在高溫高壓下處理也會(huì)產(chǎn)生片段。然后可以通過常規(guī)程序(例如層析、SDS-PAGE)分離這些片段。
可以通過例如缺失或添加氨基酸制造變體，所述氨基酸對(duì)所述多肽的特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性質(zhì)影響最小。例如，多肽可以綴合到所述蛋白N末端的信號(hào)(或前導(dǎo))序列，所述信號(hào)(或前導(dǎo))序列共翻譯或翻譯后指導(dǎo)所述蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。所述多肽也可以綴合標(biāo)記或其它易于合成、純化或鑒定所述多肽的序列。
合適的DNA分子是這樣的DNA分子所述DNA分子在嚴(yán)格條件下與包含SEQ.ID.No.2的50個(gè)連續(xù)堿基核苷酸序列的DNA分子雜交，所述嚴(yán)格條件的特征在于包含0.9M檸檬酸鈉緩沖劑的雜交緩沖液(“SSC”)，在37℃下進(jìn)行，用SSC緩沖液在37℃洗滌時(shí)保持結(jié)合；最好為在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中含有20％甲酰胺的雜交緩沖液，在42℃下進(jìn)行，用0.2×SSC緩沖液在42℃洗滌時(shí)保持結(jié)合。
最好通過常規(guī)技術(shù)以純化形式(最好至少約60％純度、更優(yōu)選80％純度)產(chǎn)生本發(fā)明的受體。一般地說，本發(fā)明的受體產(chǎn)生但不分泌入重組宿主細(xì)胞的生長培養(yǎng)基?；蛘撸景l(fā)明的受體蛋白分泌入生長培養(yǎng)基。在非分泌蛋白的情況下，為分離所述受體蛋白，繁殖攜帶重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞(如大腸桿菌)，通過超聲處理或化學(xué)處理裂解，然后離心勻漿物，除去細(xì)菌碎片。常規(guī)應(yīng)用層析程序，進(jìn)一步純化所述細(xì)胞裂解物(如在合適大小的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱上進(jìn)行凝膠過濾，分離所述受體蛋白)。如果需要，可以通過離子交換或HPLC進(jìn)一步純化蛋白組份。
可以使用常規(guī)重組DNA技術(shù)將編碼所述受體蛋白的DNA分子摻入細(xì)胞。一般地說，這涉及將所述DNA分子插入與其異源(即不是正常存在)的表達(dá)系統(tǒng)。將所述異源DNA分子以有義取向插入所述表達(dá)系統(tǒng)或載體的正確可讀框。所述載體包含轉(zhuǎn)錄和翻譯所插入的蛋白編碼序列所需的元件。
Cohen和Boyer的美國專利第4,237,224號(hào)描述使用限制酶切割和用DNA連接酶連接，產(chǎn)生重組質(zhì)粒形式的表達(dá)系統(tǒng)，該專利特此通過引用結(jié)合到本文中。然后通過轉(zhuǎn)化將這些重組質(zhì)粒引入單細(xì)胞培養(yǎng)物(包括原核生物)和在組織培養(yǎng)物中生長的真核細(xì)胞，并使其在所述培養(yǎng)物中復(fù)制。
也可以將重組基因引入病毒，例如痘苗病毒。通過將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)用病毒感染的細(xì)胞，產(chǎn)生重組病毒。
合適的載體包括但不限于下面病毒載體例如，λ載體系統(tǒng)gt11、gt WES.tB、Charon 4以及質(zhì)粒載體如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/-或KS+/-(見Stratagene的“Stratagene克隆系統(tǒng)”產(chǎn)品目錄(1993)，La Jolla，Calif，特此通過引用結(jié)合到本文中)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(見F.W.Studier等，“使用T7 RNA聚合酶指導(dǎo)克隆基因的表達(dá)”Gene ExpressionTechnology第185卷(1990)，特此通過引用結(jié)合到本文中)、以及它們的任何衍生物。可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、帶動(dòng)轉(zhuǎn)移或電穿孔將重組分子引入細(xì)胞。使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)克隆程序?qū)⑺鯠NA序列克隆進(jìn)所述載體，所述標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Mannual，Cold Springs Laboratory，Cold Springs Harbor，New York(1989)介紹的技術(shù)，特此通過引用結(jié)合到本文中。
可以利用多種宿主-載體系統(tǒng)表達(dá)編碼蛋白的序列。最重要的是所述載體系統(tǒng)必須與所使用的宿主細(xì)胞相容。宿主-載體系統(tǒng)包括但不限于以下系統(tǒng)用噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；微生物例如包含酵母載體的酵母；感染病毒(如痘苗病毒、腺病毒等)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)；感染病毒(如桿狀病毒)的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；以及感染細(xì)菌的植物細(xì)胞。這些載體的表達(dá)元件在它們的強(qiáng)度和特異性上各不相同。根據(jù)所使用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用多種合適轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任何一種。
不同的遺傳信號(hào)和加工過程控制許多水平的基因表達(dá)(如DNA轉(zhuǎn)錄和信使RNA(mRNA)翻譯)。
DNA的轉(zhuǎn)錄依賴于啟動(dòng)子的存在，啟動(dòng)子是一段DNA序列，指導(dǎo)RNA聚合酶的結(jié)合并因此促進(jìn)mRNA合成。真核啟動(dòng)子的DNA序列與原核啟動(dòng)子的DNA序列不同。此外，真核啟動(dòng)子及其伴隨的遺傳信號(hào)可能在原核系統(tǒng)中不被識(shí)別或不起作用，并且原核啟動(dòng)子在真核細(xì)胞中不被識(shí)別并且不起作用。
相似地，mRNA在原核細(xì)胞中的翻譯依賴于正確原核細(xì)胞信號(hào)的存在，所述原核細(xì)胞信號(hào)與真核細(xì)胞中的信號(hào)不同。mRNA在原核細(xì)胞中的有效翻譯需要在所述mRNA上存在一個(gè)名為Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。該序列是mRNA的一個(gè)短核苷酸序列，位于起始密碼子之前，所述起始密碼子一般是AUG，編碼蛋白氨基末端的甲硫氨酸。所述SD序列與16S rRNA(核糖體RNA)的3′末端互補(bǔ)，可能通過與rRNA形成雙鏈體，允許核糖體的正確定位，從而促進(jìn)mRNA結(jié)合核糖體。關(guān)于最大化基因表達(dá)的綜述，見Roberts和Lauer，Methods in Enzymology，68473(1979)，特此通過引用結(jié)合到本文中。
啟動(dòng)子在它們的“強(qiáng)度”(即它們促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力)上有所不同。為表達(dá)克隆基因，最好使用強(qiáng)啟動(dòng)子以獲得高水平轉(zhuǎn)錄，并因此獲得高水平的基因表達(dá)。根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可以使用多種合適啟動(dòng)子中的任何一種。例如，當(dāng)在大腸桿菌、其噬菌體或質(zhì)粒中克隆時(shí)，可以使用下列啟動(dòng)子控制臨近DNA區(qū)段的高水平轉(zhuǎn)錄T7噬菌體啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、recA啟動(dòng)子、核糖體RNA啟動(dòng)子、大腸桿菌噬菌體λ的PR啟動(dòng)子和PL啟動(dòng)子以及其它啟動(dòng)子，其中包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等等。此外，可以使用通過重組DNA或其它合成DNA技術(shù)產(chǎn)生的雜種trp-lacUV5(tac)啟動(dòng)子或其它大腸桿菌啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄所述插入基因。
可以選擇除非特異性誘導(dǎo)、否則抑制啟動(dòng)子作用的細(xì)菌宿主細(xì)胞株和表達(dá)載體。在某些操作中，加入特異性誘導(dǎo)物對(duì)于有效轉(zhuǎn)錄插入DNA是必需的。例如，通過加入乳糖或IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)lac操縱子。多種其它操縱子如trp、pro等處于不同控制之下。
在原核細(xì)胞中的有效基因轉(zhuǎn)錄和翻譯也需要特異性起始信號(hào)。這些轉(zhuǎn)錄和翻譯起始信號(hào)在“強(qiáng)度”上各不相同，它們的“強(qiáng)度”分別根據(jù)所合成的基因特異性信使RNA和蛋白的量而測定。包含啟動(dòng)子的所述DNA表達(dá)載體也可以包含任何組合的各種“強(qiáng)”轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起始信號(hào)。例如，在大腸桿菌中的有效翻譯需要在起始密碼子(“ATG”)的5′約7-9堿基處有一個(gè)SD序列以提供核糖體結(jié)合位點(diǎn)。因此，可以使用宿主細(xì)胞核糖體能夠利用的任何SD-ATG組合。這樣的組合包括但不限于以下基因的SD-ATG組合大腸桿菌噬菌體λ的cro基因或N基因，大腸桿菌色氨酸E、D、C、B或A基因。此外，可以使用通過涉及摻入合成核苷酸的重組DNA技術(shù)或其它技術(shù)產(chǎn)生的任何SD-ATG組合。
一旦已經(jīng)將編碼所述受體蛋白的分離的DNA分子克隆進(jìn)表達(dá)系統(tǒng)，就可以將其摻入宿主細(xì)胞。根據(jù)所述載體/宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可以通過上面提到的各種形式轉(zhuǎn)化進(jìn)行所述摻入。合適的宿主細(xì)胞包括但不限于細(xì)菌、病毒、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲、植物等等。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及增強(qiáng)植物對(duì)用超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理的接受能力提供用編碼超敏反應(yīng)激衛(wèi)素的受體蛋白的核酸分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物種子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超敏反應(yīng)激衛(wèi)素可用于賦予植物抗病性、增強(qiáng)植物生長、控制昆蟲和/或賦予多種植物對(duì)脅迫的抗性。考慮到本發(fā)明的受體與所述激衛(wèi)素的相互作用，預(yù)期可以如下增強(qiáng)這些有益效應(yīng)對(duì)受到本發(fā)明的受體編碼基因轉(zhuǎn)化的植物進(jìn)行所述激衛(wèi)素處理。
可以按照本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的技術(shù)，制備包含編碼按照本發(fā)明的受體的基因的轉(zhuǎn)基因植物。
可以通過使用微量移液管，將包含上述受體編碼基因的載體直接微量注射進(jìn)植物細(xì)胞，以機(jī)械轉(zhuǎn)移所述重組DNA。Crossway，Mol.Gen. Genetics，202179-85(1985)，特此通過引用結(jié)合到本文中。也可以使用聚乙二醇將所述遺傳材料轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞。Krens等，Nature，29672-74(1982)，特此通過引用結(jié)合到本文中。
另一種用基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法是粒子轟擊(也稱為生物發(fā)射轉(zhuǎn)化)所述宿主細(xì)胞。可以用幾種方法中的一種完成該方法。第一種方法涉及朝細(xì)胞發(fā)射惰性或生物活性顆粒。Sanford等的美國專利第4,945,050號(hào)、美國專利第5,036,006號(hào)和美國專利第5,100,792號(hào)公開該技術(shù)，特此通過引用結(jié)合到本文中。一般地說，該程序涉及在有效穿透細(xì)胞外表面并摻入細(xì)胞內(nèi)部的條件下，朝所述細(xì)胞發(fā)射惰性或生物活性顆粒。當(dāng)使用惰性顆粒時(shí)，可以通過用包含所述異源DNA的載體包被所述顆粒，將所述載體引入細(xì)胞?；蛘?，可以用所述載體環(huán)繞所述靶細(xì)胞，通過喚醒(wake)所述顆粒將所述載體攜帶入所述細(xì)胞。也可以將生物活性顆粒(如包含所述載體和異源DNA的干燥細(xì)菌細(xì)胞)發(fā)射入植物細(xì)胞。
又一種引入方法是將原生質(zhì)體與其它實(shí)體(或者是小細(xì)胞、細(xì)胞、溶酶體，或者是其它可融合的脂表面體)融合。Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，791859-63(1982)，特此通過引用結(jié)合到本文中。
也可以通過電穿孔將所述DNA分子引入所述植物細(xì)胞。Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，825824(1985)，特此通過引用結(jié)合到本文中。在該技術(shù)中，在包含所述表達(dá)盒的質(zhì)粒存在下，對(duì)植物原生質(zhì)體進(jìn)行電穿孔。高場強(qiáng)電流脈沖可逆地使生物膜可通透，允許引入所述質(zhì)粒。電穿孔植物原生質(zhì)體重新形成細(xì)胞壁、分裂、然后再生。
另一種將所述DNA分子引入植物細(xì)胞的方法是用所述基因事先轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)感染植物細(xì)胞。在本領(lǐng)域內(nèi)已知的合適條件下，培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞到形成芽或根，然后進(jìn)一步發(fā)育成植株。一般地說，該程序涉及用細(xì)菌懸浮物接種植物組織，在25-28℃下在不含抗生素的再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述組織48到72小時(shí)。
農(nóng)桿菌屬是格蘭氏陰性家族根瘤菌科(Rhizobiaceae)的代表性屬。其物種引起冠癭病(根癌農(nóng)桿菌)和發(fā)根病(毛根農(nóng)桿菌)。冠癭瘤和發(fā)根中的植物細(xì)胞受到誘導(dǎo)產(chǎn)生稱為冠癭堿的氨基酸衍生物，該過程進(jìn)受到細(xì)菌催化。引起冠癭堿表達(dá)的細(xì)菌基因是嵌合表達(dá)盒的控制元件的方便來源。此外，測定冠癭堿的存在可用于鑒定轉(zhuǎn)化組織。
可以通過根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒或毛根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒將異源遺傳序列引入合適的植物細(xì)胞。在農(nóng)桿菌感染時(shí)，將Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒傳遞給植物細(xì)胞，并且所述質(zhì)粒穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組。J.Schell，Science，2371176-83(1987)，特此通過引用結(jié)合到本文中。
轉(zhuǎn)化后，必須再生所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
下列文獻(xiàn)中描述了從培養(yǎng)原生質(zhì)體再生植株Evans等，Handbookof Plant Cell Cultures，第1卷(MacMillan Publishing Co.，New York，1983)；和Vasil I.R.(編輯)，Cell Culture and Somatic Cell Genetics ofPlants，Acad.Press，Orlando，第I卷，1984，和第III卷(1986)，特此通過引用結(jié)合到本文中。
已知實(shí)際上所有植物都可以從培養(yǎng)細(xì)胞或組織再生，包括但不限于甘蔗、甜菜、棉花、果樹和豆科植物的所有主要品種。
再生方法在植物各物種之間各不相同，但一般首先提供轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的懸浮物或包含轉(zhuǎn)化外植體的培養(yǎng)皿。形成愈傷組織，從愈傷組織誘導(dǎo)芽，然后生根?；蛘撸梢栽谟鷤M織中誘導(dǎo)胚形成。這些胚象天然胚一樣萌芽形成植株。培養(yǎng)基通常會(huì)包含各種氨基酸和激素，如生長素和細(xì)胞分裂素。在培養(yǎng)基中加入谷氨酸和脯氨酸也是有利的，尤其是對(duì)于玉米和苜蓿這樣的物種。有效再生將依賴于培養(yǎng)基、基因型以及所述培養(yǎng)物的歷史。假如這三個(gè)變量得到控制，那么再生通常是可重復(fù)的。
當(dāng)將所述表達(dá)盒穩(wěn)定摻入轉(zhuǎn)基因植物后，可以通過有性雜交將其傳遞給其它植物。根據(jù)需要雜交的物種，可以使用多種標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)中的任何一種。
一旦產(chǎn)生這種類型的轉(zhuǎn)基因植株，就可以按照常規(guī)程序培養(yǎng)所述植株本身。或者，從所述轉(zhuǎn)基因植株收獲轉(zhuǎn)基因種子或無性繁殖體(如插條)。然后可以將所述種子種植在土壤中，用常規(guī)程序培養(yǎng)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株。從所種植的轉(zhuǎn)基因種子繁殖轉(zhuǎn)基因植株。
這些激衛(wèi)素處理方法可能涉及在一定條件下應(yīng)用非傳染形式的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白于用依照本發(fā)明的受體基因轉(zhuǎn)化的所有或部分植株或植物種子，所述條件有效使所述激衛(wèi)素賦予抗病性、增強(qiáng)生長、控制昆蟲和/或賦予脅迫抗性?；蛘?，可以應(yīng)用所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素蛋白或多肽于植株，以便從所述植株本身回收的種子能夠賦予植物抗病性、增強(qiáng)植物生長、產(chǎn)生昆蟲控制和/或賦予對(duì)脅迫的抗性。
為應(yīng)用超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白于植株或植物種子以賦予所述植株或由所述種子生長出的植株抗病性、產(chǎn)生植物生長、控制昆蟲和/或賦予它們對(duì)脅迫的抗性，在另一種可替代方法中可以利用轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物種子。當(dāng)利用轉(zhuǎn)基因植株時(shí)，這涉及提供用下列DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株編碼依照本發(fā)明的受體的DNA分子，以及編碼超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白的DNA分子。在有效允許所述DNA分子賦予植物抗病性、增強(qiáng)植物生長、控制昆蟲和/或賦予對(duì)脅迫的抗性的條件下，培養(yǎng)所述植株?；蛘?，可以提供用如下DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物種子并將所述種子種植于土壤中編碼超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白的DNA分子，以及編碼受體的DNA分子。在有效允許所述DNA分子賦予植物抗病性、增強(qiáng)植物生長、控制昆蟲和/或賦予對(duì)脅迫的抗性的條件下，從所種植的種子繁殖出植株。
可以以多種方法實(shí)施應(yīng)用超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白于植物或植物種子的實(shí)施方案，包括1)應(yīng)用分離的激衛(wèi)素或2)應(yīng)用不引起疾病并且受到編碼所述激衛(wèi)素的基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。在后一種實(shí)施方案中，通過應(yīng)用包含編碼所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白的DNA分子的細(xì)菌，將所述激衛(wèi)素應(yīng)用于植物或植物種子。所述細(xì)菌必須能夠分泌或向外轉(zhuǎn)運(yùn)所述激衛(wèi)素，以便所述激衛(wèi)素能夠接觸植物細(xì)胞或植物種子細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，所述細(xì)菌在植物內(nèi)部產(chǎn)生所述激衛(wèi)素，或者在種子上產(chǎn)生所述激衛(wèi)素，或者就在將所述細(xì)菌引入植物或植物種子之前產(chǎn)生所述激衛(wèi)素。
可以利用所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理來處理各種不同的植物或它們的種子，以賦予抗病性、增強(qiáng)生長、控制昆蟲和/或賦予對(duì)脅迫的抗性。合適的植物包括雙子葉植物和單子葉植物。更具體地說，可用的作物包括苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、卷心菜、孢子甘藍(lán)、甜菜、歐洲防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、懸鉤子、鳳梨、大豆、煙草、番茄、高梁和甘蔗。合適觀賞植物的例子有擬南芥、非洲紫苣苔(Saintpaulia)、矮牽牛花、天竺葵、一品紅、菊花、香石竹和百日菊。
至于應(yīng)用本發(fā)明的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素賦予抗病性，可能不會(huì)賦予對(duì)感染的絕對(duì)免疫，但會(huì)降低疾病的嚴(yán)重性，并且延遲癥狀發(fā)生發(fā)展。侵蝕斑的數(shù)目、大小和真菌病原體的孢子生成的程度都減少了。這種賦予抗病性的方法具有以下潛力治療以前無法治療的疾病、系統(tǒng)治療由于費(fèi)用可能無法單獨(dú)治療的疾病以及避免使用感染性物質(zhì)或?qū)Νh(huán)境有害的物質(zhì)。
按照本發(fā)明的賦予植物病原體抗性的方法可以用于賦予對(duì)廣泛種類病原體的抗性，所述病原體包括病毒、細(xì)菌和真菌。通過本發(fā)明的方法，可以獲得尤其是對(duì)下列病毒的抗性煙草花葉病毒(Tobaccomosaic virus)和番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus)。按照本發(fā)明可以賦予植物對(duì)尤其是下列細(xì)菌的抗性茄假單胞桿菌、丁香假單胞菌煙草致病變種(Pseudomonas syringae pv.tabaci)和野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種。通過使用本發(fā)明的方法，可以使植物抵抗尤其是下列真菌尖鐮孢(Fusarium oxysporum)和致病疫霉(Phytophthorainfestans)。
至于應(yīng)用本發(fā)明的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素蛋白或多肽增強(qiáng)植物生長，可以獲得各種形式的植物生長增強(qiáng)或促進(jìn)。這可以在早至從種子開始的植物生長、遲至在植物生命晚期發(fā)生。例如，依照本發(fā)明的植物生長包括產(chǎn)量更高、產(chǎn)生的種子量增加、種子發(fā)芽率提高、植株大小增加、生物量更高、果實(shí)更多和更大、果實(shí)著色更早、以及果實(shí)和植株成熟更早。結(jié)果是栽培者獲得顯著的經(jīng)濟(jì)效益。例如，在短暫的生長季節(jié)在其它情況下會(huì)阻礙作物生長的地區(qū)，早發(fā)芽和早成熟允許作物在該地區(qū)生長。種子發(fā)芽率的提高改善作物植株密度并更有效地利用種子。產(chǎn)量更高、大小增加和生物量生產(chǎn)增強(qiáng)使給定土地小區(qū)上年產(chǎn)出更高。
應(yīng)用超敏反應(yīng)激衛(wèi)素控制昆蟲包括防止昆蟲接觸已經(jīng)施用超敏反應(yīng)激衛(wèi)素的植株、防止由于取食傷害(feeding injury)對(duì)植株造成的直接昆蟲性損害、使昆蟲離開這樣的植株、殺死接近這樣的植株的昆蟲、干擾在這樣的植株上的昆蟲幼蟲取食、防止昆蟲定居于宿主植物、防止定居的昆蟲釋放毒植物素等等。本發(fā)明還防止昆蟲感染引起的隨后對(duì)植物的病害。
激衛(wèi)素處理有效對(duì)抗廣泛種類的昆蟲。歐洲玉米螟是玉米(臼齒形玉米和甜玉米)的主要害蟲，但也食用超過200種植物物種，所述物種包括嫩莢菜豆、黃莢種菜豆和利馬豆以及食用菜豆、胡椒、馬鈴薯和番茄，還有許多雜草物種。其它損害廣泛種類蔬菜作物的昆蟲幼蟲取食害蟲(insect larval feeding pest)包括甜菜夜蛾、粉紋夜蛾、美洲棉鈴蟲、草地粘蟲、小菜蛾、甘藍(lán)根蠅蛆、蔥蠅、玉米種蠅、瓜野螟(甜瓜野螟)、胡椒帶實(shí)蠅、番茄蠹蛾和蛆?？偲饋碚f，這組昆蟲害蟲代表世界范圍內(nèi)蔬菜生產(chǎn)在經(jīng)濟(jì)上最重要的一組害蟲。
超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理也可用于賦予植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性。脅迫包括任何對(duì)于植物生理和發(fā)育具有不利效應(yīng)的環(huán)境因子。所述環(huán)境脅迫的例子包括與氣候有關(guān)的脅迫(如干旱、水災(zāi)、霜、低溫、高溫、光過量以及光不足)、空氣污染脅迫(如二氧化碳、一氧化碳、二氧化硫、NOX、碳?xì)浠衔?、臭氧、紫外線輻射、酸雨)、化學(xué)脅迫(如殺昆蟲劑、殺真菌劑、除草劑、重金屬)和營養(yǎng)脅迫(如肥料、微量營養(yǎng)、大量營養(yǎng))。
當(dāng)處理整株植株或部分植株(包括葉、莖、根等)，可以通過多種程序應(yīng)用所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白。這可能(但不是必須)涉及將所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白滲入所述植株。合適的應(yīng)用方法包括高壓或低壓噴灑、注射以及在應(yīng)用激衛(wèi)素之前打磨葉片(leafabrasion)。在處理植物種子或無性繁殖體(如插條)時(shí)，可以通過低壓或高壓噴灑、包被、浸漬或注射而應(yīng)用所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素蛋白或多肽。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能夠設(shè)想出其它合適的應(yīng)用程序，只要所述應(yīng)用程序能產(chǎn)生所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白與植株或植物種子的細(xì)胞的接觸。一旦用本發(fā)明的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理種子后，就可以將所述種子種植在天然或人工土壤中，用常規(guī)程序培育以產(chǎn)生植株。從用激衛(wèi)素處理的種子繁殖出植株后，可以一次或多次應(yīng)用所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素蛋白或多肽來處理所述植株，以賦予植物疾病抗性、增強(qiáng)植物生長、控制在所述植物上的昆蟲和/或賦予脅迫抗性。
可以單獨(dú)應(yīng)用所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白于植物或植物種子，或者將其與其它物質(zhì)混合，應(yīng)用于植物或植物種子。或者，可以單獨(dú)應(yīng)用所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白于植物，并在不同時(shí)間應(yīng)用其它物質(zhì)。
適于處理植株或植物種子的組合物包含處于一種載體中的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白。合適的載體包括水、水性溶液、漿液或干粉。
雖然并非必要，但這種組合物可以包含其它添加劑，包括肥料、殺蟲劑、殺真菌劑、殺線蟲劑以及它們的混合物。合適的肥料包括(NH4)2NO3。合適殺蟲劑的一個(gè)例子是馬拉硫磷。可用的殺真菌劑包括克菌丹。
其它合適的添加劑包括緩沖劑、潤濕劑、包被劑和磨擦劑。此外，所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素多肽或蛋白可以與其它常規(guī)種子用制劑和處理材料(包括粘土和多糖)一起應(yīng)用于植物種子。
在涉及應(yīng)用包含超敏反應(yīng)激衛(wèi)素編碼基因的轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因種子的可替代技術(shù)中，不一定將超敏反應(yīng)激衛(wèi)素局部應(yīng)用于所述植株或種子。取而代之的是，按照上述本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的程序產(chǎn)生用編碼所述激衛(wèi)素的DNA分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種DNA構(gòu)建物，所述構(gòu)建物是植物內(nèi)編碼植物病原體超敏反應(yīng)激衛(wèi)素受體的核酸分子的反義核酸分子。所述構(gòu)建物的一個(gè)例子是具有SEQ.ID.No.2或3的核苷酸序列的DNA分子的反義DNA分子。或者，所述DNA構(gòu)建物具有SEQ.ID.No.2或3的核苷酸序列(或其部分)及其互補(bǔ)鏈的DNA分子，用于產(chǎn)生帶有反向重復(fù)(即雙鏈)RNA的單一轉(zhuǎn)錄物。該轉(zhuǎn)錄物以及上面討論的反義核酸分子可以用于誘導(dǎo)使編碼超敏反應(yīng)激衛(wèi)素受體的核酸分子沉默。
所述受體感受超敏反應(yīng)激衛(wèi)素是植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的第一步，該途徑最終將導(dǎo)致抗病性、生長增強(qiáng)、控制昆蟲和對(duì)脅迫的抗性。使所述受體沉默提供了發(fā)現(xiàn)和研究該途徑下游成份的有力工具。此外，所述受體也可以是所述植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)劑。使所述受體沉默將在不需超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理的情況下賦予植物抵抗疾病和脅迫、控制昆蟲和增強(qiáng)生長的能力。
實(shí)施例實(shí)施例1-材料和方法在下面實(shí)施例中使用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)是簡單的。本文描述的所有DNA操作都為常規(guī)方法(Sambrook等，“Molecular CloningALaboratory Manual”第二版，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)；Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley(1987)，特此通過引用結(jié)合到本文中)。本文描述的用于實(shí)施本發(fā)明的質(zhì)粒和微生物從商業(yè)來源獲得，或從以前出版物的作者獲得。使用Clone Manager 5(Scientific & Educational Software，Durham，NorthCarolina)分析序列。
酵母菌株L40在30℃下在YPD或不同的基本合成離去選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。大腸桿菌菌株DH5α和HB101在LB培養(yǎng)基上于37℃下培養(yǎng)。
酵母雙雜交系統(tǒng)基于以下事實(shí)許多真核轉(zhuǎn)錄因子由物理上分開、功能上獨(dú)立的DNA結(jié)合域(DNA-BD)和激活域(AD)組成。DNA-BD和AD都是激活基因所需的。當(dāng)通過重組DNA技術(shù)在物理上分離DNA-BD和AD并在同一宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，它們并不直接相互作用，因此不能激活反應(yīng)基因(Ma等，“轉(zhuǎn)化真核轉(zhuǎn)錄抑制劑成為激活劑”Cell55443(1998)和Brent等，“一種真核轉(zhuǎn)錄激活劑具有原核抑制劑的DNA特異性”Cell43729(1985)，特此通過引用結(jié)合到本文中)。但假如使DNA-BD和AD在啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)物理接近，將會(huì)恢復(fù)轉(zhuǎn)錄激活功能。因此，酵母啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和雙雜交系統(tǒng)已經(jīng)成為研究大分子相互作用的基本遺傳工具。
在本文利用的雙雜交系統(tǒng)中，誘餌載體(bait vector)pVJL11(Jullien-Flores，V.，“連接Ral GTPase到Rho途徑。RLIP76一種具有CDC42/Rac GTPase激活蛋白活性的Ral效應(yīng)物”J.Biol.Chem.2722473(1995)，特此通過引用結(jié)合到本文中)內(nèi)編碼的DNA-BD是原核LexA蛋白，而捕獲載體pGAD10或pGAD GH(Clontech；Hannon，GJ.，“通過Rb相關(guān)p130與CDK2和細(xì)胞周期蛋白的相互作用分離Rb相關(guān)p130”Genes Dev.72378(1993)，特此通過引用結(jié)合到本文中)編碼的所述激活域來自酵母GAL4蛋白。pVJL11還具有一個(gè)TRP1標(biāo)記，而pGAD具有一個(gè)LEU2標(biāo)記。誘餌蛋白(與DNA-BD融合)與文庫編碼蛋白(與AD融合)的相互作用產(chǎn)生一種對(duì)LexA操縱基因有結(jié)合親和力的新型轉(zhuǎn)錄激活劑。酵母宿主L40{MATa his3D200trp1-901 leu2-3，112 ade2 LYS2∷(lexAop)4-HIS3 URA3∷(lexAop)8-lacZ}帶有兩個(gè)報(bào)道基因lacZ和HIS3，這兩個(gè)報(bào)道基因都具有上游LexA結(jié)合位點(diǎn)。所述HIS3營養(yǎng)報(bào)道基因提供敏感的生長選擇，可以從幾百萬個(gè)候選菌落中鑒定出單個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子。所述報(bào)道基因的表達(dá)指示出候選蛋白與所述誘餌蛋白之間的相互作用。見圖1。
使用解淀粉歐文氏菌harpin作為誘餌蛋白，篩選在pGAD10載體(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，California)中克隆的擬南芥MATCHMAKER cDNA文庫。一個(gè)cDNA文庫編碼的蛋白鑒定為強(qiáng)harpin相互作用蛋白，因此是推定的harpin受體。本發(fā)明報(bào)道該cDNA的核酸序列和推定的氨基酸序列。實(shí)施例2將解淀粉歐文氏菌的HrpN亞克隆進(jìn)酵母雙雜種誘餌載體pVJL11。使用1.3Kb harpin片段(Wei等，“Harpin植物病原體解淀粉歐文氏菌產(chǎn)生的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素”Science25785(1992)，特此通過引用結(jié)合到本文中)作為模板，通過PCR擴(kuò)增harpin編碼區(qū)。在所述編碼區(qū)的5′末端加入Bam HI位點(diǎn)，在3′末端加入Sal I位點(diǎn)。將Bam HI和Sal I消化PCR片段連接到用同樣限制酶消化的誘餌載體pVJL11。pVJL11具有在酵母中選擇的TRP1標(biāo)記和在大腸桿菌中選擇的Amp抗性。在大腸桿菌菌株DH5α中擴(kuò)增所述質(zhì)粒DNA。當(dāng)用空捕獲質(zhì)粒pGAD GH和幾種不相關(guān)蛋白在雙雜交系統(tǒng)中測試時(shí)，HrpN并不顯示自動(dòng)激活或與不相關(guān)蛋白非特異性的相互作用，如圖2所示。實(shí)施例3通過乙酸鋰(LiAc)介導(dǎo)的方法(Ito等，“轉(zhuǎn)化用堿性陽離子處理的完整酵母細(xì)胞”J.Bacteriol.153163(1983)和Vojtek等，“哺乳動(dòng)物Ras與絲氨酸/蘇氨酸激酶Raf直接相互作用”Cell74205(1993)，特此通過引用結(jié)合到本文中)，將HrpN-pVJL11轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母菌株L40。篩選所述擬南芥MATCHMAKER cDNA文庫(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)中的harpin相互作用蛋白。將約680萬初級(jí)文庫轉(zhuǎn)化子接種到缺乏組氨酸、亮氨酸和色氨酸的平板。在去除組氨酸平板上總共生長出148個(gè)菌落，其中55個(gè)在測試β-半乳糖苷酶表達(dá)時(shí)染色為陽性。在缺乏亮氨酸、色氨酸和組氨酸的合成基本(SD)培養(yǎng)基上選擇三輪，然后使用β-半乳糖苷酶測定通過第二個(gè)報(bào)道基因lacZ的表達(dá)確認(rèn)后，47個(gè)克隆看起來是強(qiáng)相互作用候選物。實(shí)施例4從所述47個(gè)獨(dú)立的酵母菌落提取質(zhì)粒DNA，將其引入攜帶leuB突變的大腸桿菌菌株HB101。因此，由于pGAD10攜帶LEU2標(biāo)記，在基本營養(yǎng)平板上選擇捕獲質(zhì)粒(cDNA-pGAD10)。
使用harpin作為誘餌，在酵母雙雜交系統(tǒng)中再次測試所述47個(gè)從大腸桿菌純化的獨(dú)立回收捕獲質(zhì)粒。也用不相關(guān)蛋白對(duì)它們進(jìn)行測試。25個(gè)是相互作用候選物，20個(gè)是強(qiáng)特異性相互作用候選物。序列分析顯示20個(gè)獨(dú)立cDNA克隆實(shí)際上來自同一基因，在5′末端有不同完整性。使用PE Prism BigDyeTM染料終止子反應(yīng)試劑盒進(jìn)行所述序列反應(yīng)。在Thatagen(Bothell，WA)上運(yùn)行測序凝膠。
使用八種質(zhì)粒中一種具有最長cDNA插入片段(1kb)的質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步的分析。當(dāng)其共轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母菌株L40時(shí)，顯示在所述雙雜交系統(tǒng)中對(duì)空誘餌和不相關(guān)蛋白呈陰性，指出harpin與該受體候選物之間的相互作用是特異性的。見圖3。實(shí)施例5將所述最長的cDNA插入片段HrBP1亞克隆進(jìn)誘餌載體pVJL11的Bam HI和Sal I位點(diǎn)。該構(gòu)建物不顯示報(bào)道基因的自動(dòng)激活，也不在酵母雙雜交系統(tǒng)中與不相關(guān)蛋白相互作用。然而，當(dāng)用HrBPl-pVJL11和HrpN-pGAD GH共轉(zhuǎn)化L40時(shí)，所述報(bào)道基因的表達(dá)受到激活，指出HrBPlp(由HrBPl編碼的蛋白)與harpin之間的特異性相互作用。見圖4。實(shí)施例6使用QIAGEN RNeasy植物小試劑盒(Qiagen，Inc.，Valencia，California)，從兩周齡的擬南芥提取總RNA。使用QIAGEN Oligotex柱(Qiagen，Inc.，Valencia，California)從所述總RNA進(jìn)一步純化Poly A+RNA。使用HrBP1的翻譯區(qū)作為探針，進(jìn)行RNA印跡分析。從總RNA和Poly A+RNA中都檢測到一種表觀分子量為約1.1Kb的種類。因此，從酵母雙雜交系統(tǒng)篩選得到的HrBP1最長的cDNA看來是全長cDNA。通過引物延伸測定進(jìn)一步確認(rèn)所述cDNA的5′端的完整性。
如上所述，使用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選harpin相互作用蛋白。將解淀粉歐文氏菌的HrpN亞克隆進(jìn)酵母雙雜種誘餌載體pVJL11，該載體攜帶TRPl標(biāo)記。在酵母中從該構(gòu)建物表達(dá)lexA harpin融合蛋白。篩選所述擬南芥MATCHMAKER cDNA文庫(ClontechLaboratories，Inc.，Palo Alto，CA)中的超敏反應(yīng)激衛(wèi)素相互作用蛋白。篩選680萬獨(dú)立菌落，HrBP1鑒定為強(qiáng)特異性harpin相互作用候選物。將HrBP1作圖到擬南芥基因組DNA，3號(hào)染色體，P1克隆MLM24(Nakamura，“擬南芥3號(hào)染色體的結(jié)構(gòu)分析”直接遞交到DDBJ/EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(1998)，特此通過引用結(jié)合到本文中)。發(fā)現(xiàn)四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子(見圖5)。外顯子4包括一個(gè)130bp的非翻譯3′區(qū)。從第一個(gè)甲硫氨酸開始的符合讀框的可讀框編碼包含284個(gè)氨基酸的多肽(稱為HrBP1p)。HrBP1p的預(yù)測分子量為30454.3，其pI為5.72。該肽中沒有明顯的疏水跨膜區(qū)。SMART SimpleModular Architecture Research Tool(V3.1)預(yù)測前18個(gè)氨基酸是信號(hào)序列。在酵母雙雜交系統(tǒng)中HrBP1-AD融合捕獲物對(duì)空誘餌和不相關(guān)蛋白呈陰性，指出harpin與該受體候選物之間相互作用具有特異性。當(dāng)采用相反取向，即HrBP1p與DNA-BD融合，而harpin與AD融合，它們?nèi)匀惶禺愋缘叵嗷プ饔谩?br> HrBP1與用Blast搜索程序獲得的保藏在主要序列數(shù)據(jù)庫中的序列沒有顯著的序列相似性。因此，HrBP1p是一種新型蛋白。實(shí)施例7將HrBP1 cDNA亞克隆進(jìn)載體pET-28a(Novagen，Madison，WI)的Nde I和Sal I位點(diǎn)。HrBP1p在大腸桿菌中從該載體作為His標(biāo)記蛋白表達(dá)，用Ni-NTA resion(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)根據(jù)生產(chǎn)廠家提供的說明書純化。該重組蛋白增加harpin在煙草植株中誘導(dǎo)HR的能力。使用去除His標(biāo)記的HrBP1重組蛋白產(chǎn)生抗HrBP1抗體，以便利對(duì)HrBP1的生物化學(xué)和功能研究。在蛋白質(zhì)印跡中使用抗HrBP1抗體的初步定位研究顯示HrBP1p在擬南芥屬的任何部分都存在，包括其葉、莖和根。實(shí)施例8在1％瓊脂糖凝膠上分離來自14種不同植物物種的10μg總RNA，然后轉(zhuǎn)移到Amersham Hybond NX膜(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，New Jersey)。使用Ambion Strip-EZ RNA試劑盒(Ambion Inc.，Houston，Texas)產(chǎn)生RNA探針，該探針與HrBP1編碼區(qū)的堿基651-855互補(bǔ)。使用Ambion ULTRAhyb(Ambion Inc.，Houston，Texas)，按照廠家建議的程序進(jìn)行膜雜交。
用于產(chǎn)生所述RNA印跡探針的HrBP1片段的序列(SEQ.ID.No.9)如下gatcaagata acatttgaga aaacaactgt gaagacatcg ggaaacttgt cgcagattcc 60tccgtttgat atcccgaggc ttcccgacag tttcagacca tcgtcaaacc ctggaactgg 120ggatttcgaa gttacctatg ttgatgatac catgcgcata actcgcgggg acagaggtga 180acttagggta ttcgtcattg cttaa 205該RNA印跡分析找到一條在所有測試的植物物種中存在的與HrBP1相似大小的帶，這指出HrBP1樣基因普遍存在，所測試的植物物種包括煙草、小麥、玉米、柑桔、棉花、草、三色堇、胡椒、馬鈴薯、番茄、大豆、向日葵和利馬豆。見圖6。實(shí)施例9使用harpin作為誘餌，通過酵母雙雜種篩選從水稻克隆HrBP1同源物R6。它不僅與全長harpin相互作用，而且與包含第二HR域的harpin片段相互作用(見圖7)。然而，它不是全長的cDNA；其5′末端缺失一些序列信息。來自水稻的HrBP1樣cDNA的部分序列編碼一種203個(gè)氨基酸的肽R6-p，該肽起始于HrBP1p的氨基酸84。它們?cè)诘鞍踪|(zhì)水平上有74.4％相同，87.2％呈陽性，在DNA水平上65％相同。
下面顯示HrBP1(SEQ.ID.No.1，起始于氨基酸84)和R6(SEQ.ID.No.4)在蛋白質(zhì)水平上的序列對(duì)比在蛋白質(zhì)水平上同一性＝151/203(74.4％)，陽性＝177/203(87.2％)，缺口＝2/203(0％)R6-p 1 VAALKVKLLSAVSGLNRGLAGSQEDLDRADAAARELEAAAGGGPVDLERDVDKLQGRWRL+A LK+KLLS VSGLNRGL S +DL+RA+ AA+ELE A GGPVDL D+DKLQG+WRLHrBP1p 84 TALLKLKLLSVVSGLNRGLVASVDDLERAEVAAKELETA--GGPVDLTDDLDKLQGKWRLR6-p 61 VYSSAFSSRTLGGSRPGPPTGRLLPITLGQVFQRIDVVSKDFDNIVDVELGAPWPLPPVE+YSSAFSSR+LGGSRPG PTGRL+P+TLGQVFQRIDV SKDFDNI +VELGAPWP PP+EHrBP1p 142 LYSSAFSSRSLGGSRPGLPTGRLIPVTLGQVFQRIDVFSKDFDNIAEVELGAPWPFPPLER6-p 121 LTATLAHKFEIIGTSSIKITFDKTTVKTKGNLSQLPPLEVPRIPDNLRPPSNTGSGEFEVTATLAHKFE++GT IKITF+KTTVKT GNLSQ+PP ++PR+PD+ RP SN G+G+FEVHrBP1p 202 ATATLAHKFELLGTCKIKITFEKTTVKTSGNLSQIPPFDIPRLPDSFRPSSNPGTGDFEVR6-p 181 TYLDGDTRITRGDRGELRVFVIS 203TY+D RITRGDRGELRVFVI+HrBP1p 262 TYVDDTMRITRGDRGELRVFVIA 284R6(SEQ.ID.No.5)與起始于核苷酸265(即所述可讀框的核苷酸249))的HrBP1(SEQ.ID.No.2)在DNA水平上的序列對(duì)比在DNA水平上同一性＝397/610(65％)(點(diǎn)代表相同堿基)R6 1 cgtggctgcgctcaaagtcaagcttctgagcgcggtgtccgggctgaaccgcggcctcgcHrBP1 249 aa.t..atta......c....at.a..t..t.ta..t..g..at.a...a.a..a..t.tR6 61 ggggagccaggaggatcttgaccgcgccgacgcggcggcgcgggagctcgaggcggcggcHrBP1 309 ..c...tgtt..t...t.a..aa.a..t..a.t...t..taaa..a..t..aa.t..---R6 121 gggtggcggccccgtcgacctggagagggacgtggacaagctgcaggggcggtggaggctHrBP1 366 ---...g..a..g..t..tt.aaccgat..tc.t..t.....t..a...aaa........R6 181 ggtgtacagcagcgcgttctcgtcgcggacgctcggcggcagccgccccggcccgcccacHrBP1 423 .t....t..t..t........t..t...t.tt.a..t..t.....t..t..t.ta..t..R6 241 cggccgcctcctccccatcaccctcgggcaggtgtttcagaggatcgatgttgtcagcaaHrBP1 483 t..a..tt.ga....tg.t..t..t..c...........ac....t.....gt.t.....R6 301 ggacttcgacaacatcgtcgatgtcgagctcggcgcgccatggccgctgccgccggtggaHrBP1 543 a..t..t..t.....a.ca..g..g..at.a..a..c..t.....at.t.....at.a..R6 361 gctgacggcgaccctggctcacaagtttgagatcatcggcacctcgagcataaagatcacHrBP1 603 agcc..t.....at....a...........ac..t.a.....t.gc.ag..c.....a..R6 421 attcgacaagacgacggtgaagacgaaggggaacctgtcccagctgccgccgctggaggtHrBP1 663 ...t..g..a..a..t........atc...a...t....g...a.t..t...t.t..ta.R6 481 ccctcgcatcccggacaacctccggccgccgtccaacaccggcagcggcgagttcgaggtHrBP1 723 ...ga.gc.t..c....gtt..a.a..at....a...c.t..a.ct..g..t.....a..R6 541 gacctacctcgacggcgacacccgcatcacccgcggggacagaggggagctcagggtgttHrBP1 783 t.....tg.t..t.atac..tg.....a..t..............t..a..t.....a..R6 601 cgtcatctcgHrBP1 843 ......tg.t實(shí)施例10擬南芥Columbia植株置于環(huán)境受控的房間內(nèi)，在高壓蒸汽滅菌的罐裝混合物中培養(yǎng)，晝夜溫度23-20℃，光周期14小時(shí)光照。
使用轉(zhuǎn)基因方法對(duì)HrBP1進(jìn)行功能分析。將與SEQ.ID.No.2互補(bǔ)的反義HrBP1亞克隆進(jìn)二元載體pPZP212，并置于NOS啟動(dòng)子控制下。用該構(gòu)建物通過農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥植株。所使用的根癌農(nóng)桿菌菌株是GV3101(C58C1 Rifr)pMP90(Gmr)。這些反義系命名為“as”系。
也用構(gòu)建物轉(zhuǎn)化擬南芥屬植株，該構(gòu)建物具有反向重復(fù)、HrBP1編碼區(qū)堿基4-650的有義鏈(即SEQ.ID.No.2的堿基20-666)以及HrBP1 cDNA堿基20-516的互補(bǔ)序列(即SEQ.ID.No.2)。該構(gòu)建物在轉(zhuǎn)化植株中產(chǎn)生雙鏈mRNA。這些轉(zhuǎn)基因系命名為“d”系。
圖8顯示用于轉(zhuǎn)化擬南芥屬的構(gòu)建物。
反義方法和雙鏈方法都是使HrBP1的表達(dá)沉默。發(fā)現(xiàn)所述雙鏈DNA方法對(duì)于使HrBP1基因沉默更有效。一些轉(zhuǎn)基因擬南芥屬系顯示自發(fā)的HR樣斑。最嚴(yán)重的系發(fā)育延遲，看起來非常嚴(yán)重，并且不產(chǎn)生種子。實(shí)施例11植株置于環(huán)境受控的房間內(nèi)，在高壓蒸汽滅菌的罐裝混合物中培養(yǎng)，晝夜溫度23-20℃，光周期14小時(shí)光照。如下用丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000接種25天大的植株將所述植株的地面以上部分浸在108細(xì)胞/ml的細(xì)菌懸浮液中10秒鐘。接種DC3000后七天，用鉆孔器收獲葉碟。在10mM MgCl2中從葉碟提取細(xì)菌，然后接種到含100μg/ml利福平的King’s B瓊脂上。平板在28℃培養(yǎng)2天(圖9B)，然后計(jì)數(shù)菌落。在圖9A中，野生型擬南芥屬植株比轉(zhuǎn)基因植株有更顯著的患病。細(xì)菌計(jì)數(shù)(圖9B)顯示轉(zhuǎn)基因植株葉內(nèi)生長的DC3000至少低一個(gè)數(shù)量級(jí)。HrBP1看起來是擬南芥中植物防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)劑。它的沉默行為賦予植物抵抗丁香假單胞菌番茄致病變種DC3000的能力。實(shí)施例12將HrBP1編碼區(qū)(即SEQ.ID.No.2的堿基17-871)亞克隆進(jìn)二元載體pPZP212，該載體處于NOS啟動(dòng)子的控制之下(見圖10)。用該構(gòu)建物通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草植株。所使用的根癌農(nóng)桿菌菌株是LBA4404。實(shí)施例13HrBP1在NOS啟動(dòng)子控制下在煙草植株中過量表達(dá)。圖10顯示用于轉(zhuǎn)化煙草的構(gòu)建物。選出三個(gè)高表達(dá)系用于對(duì)T2代行研究。
當(dāng)用純化的harpin浸潤時(shí)，轉(zhuǎn)基因系發(fā)展HR比野生型植株快得多，這與以前的實(shí)驗(yàn)一致，在該實(shí)驗(yàn)中His標(biāo)記的HrBP1增加煙草對(duì)harpin蛋白的敏感性。HrBP1過量表達(dá)系比野生型Xanthi NN植株高約20-30％(見圖11)。實(shí)施例14用煙草花葉病毒以及硅藻土磨擦葉的上表面，用TMV接種61天大的野生型和過量表達(dá)HrBP1的Xanthi NN煙草植株。人工接種2天后出現(xiàn)病斑。圖12A中的照片在接種后3天拍攝。測量疾病點(diǎn)的直徑。轉(zhuǎn)基因植株葉上的病斑直徑平均比野生型植株上的病斑少33.4％(圖12B)。因此，轉(zhuǎn)基因植株葉的病斑面積是野生型植株葉病斑面積的約44.3％。HrBP1在煙草中看起來是植物生長和抗病性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的正調(diào)節(jié)物。
雖然已經(jīng)就舉例說明的目的詳細(xì)描述本發(fā)明，但應(yīng)該理解所述細(xì)節(jié)僅是舉例說明的目的，本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以不偏離后面權(quán)利要求定義的本發(fā)明精神和范圍而作出各種改變。
序列表<110>Eden Bioscience Corporation<120>超敏反應(yīng)激衛(wèi)素受體及其應(yīng)用<130>21829/63<140><141><150>60/191,649<151>2000-03-23<150>60/250,710<151>2000-12-01<160>9<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>284<212>PRT<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1Met Ala Thr Ser Ser Thr Phe Ser Ser Leu Leu Pro Ser Pro Pro Ala1 5 10 15Leu Leu Ser Asp His Arg Ser Pro Pro Pro Ser Ile Arg Tyr Ser Phe20 25 30Ser Pro Leu Thr Thr Pro Lys Ser Ser Arg Leu Gly Phe Thr Val Pro35 40 45Glu Lys Arg Asn Leu Ala Ala Asn Ser Ser Leu Val Glu Val Ser Ile50 55 60Gly Gly Glu Ser Asp Pro Pro Pro Ser Ser Ser Gly Ser Gly Gly Asp65 70 75 80Asp Lys Gln Ile Ala Leu Leu Lys Leu Lys Leu Leu Ser Val Val Ser85 90 95Gly Leu Asn Arg Gly Leu Val Ala Ser Val Asp Asp Leu Glu Arg Ala100 105 110Glu Val Ala Ala Lys Glu Leu Glu Thr Ala Gly Gly Pro Val Asp Leu115 120 125Thr Asp Asp Leu Asp Lys Leu Gln Gly Lys Trp Arg Leu Leu Tyr Ser130 135 140Ser Ala Phe Ser Ser Arg Ser Leu Gly Gly Ser Arg Pro Gly Leu Pro145 150 155 160Thr Gly Arg Leu Ile Pro Val Thr Leu Gly Gln Val Phe Gln Arg Ile165 170 175Asp Val Phe Ser Lys Asp Phe Asp Asn Ile Ala Glu Val Glu Leu Gly180 185 190Ala Pro Trp Pro Phe Pro Pro Leu Glu Ala Thr Ala Thr Leu Ala His195 200 205Lys Phe Glu Leu Leu Gly Thr Cys Lys Ile Lys Ile Thr Phe Glu Lys210 215 220Thr Thr Val Lys Thr Ser Gly Asn Leu Ser Gln Ile Pro Pro Phe Asp225 230 235 240Ile Pro Arg Leu Pro Asp Ser Phe Arg Pro Ser Ser Asn Pro Gly Thr245 250 255Gly Asp Phe Glu Val Thr Tyr Val Asp Asp Thr Met Arg Ile Thr Arg260 265 270Gly Asp Arg Gly Glu Leu Arg Val Phe Val Ile Ala275 280<210> 2<211> 1000<212> DNA<213> 擬南芥<400> 2tttttccttc tcaacaatgg cgacttcttc tactttctcg tcactactac cttcaccacc 60agctcttctt tccgaccacc gttctcctcc accatccatc agatactcct tttctccctt 120aactactcca aaatcgtctc gtttgggttt cactgtaccg gagaagagaa acctcgctgc 180taattcgtct ctcgttgaag tatccattgg cggagaaagt gacccaccac catcatcatc 240tggatcagga ggagacgaca agcaaattgc attactcaaa ctcaaattac ttagtgtagt 300ttcgggatta aacagaggac ttgtggcgag tgttgatgat ttagaaagag ctgaagtggc 360tgctaaagaa cttgaaactg ctgggggacc ggttgattta accgatgatc ttgataagct 420tcaagggaaa tggaggctgt tgtatagtag tgcgttctct tctcggtctt taggtggtag 480ccgtcctggt ctacctactg gacgtttgat ccctgttact cttggccagg tgtttcaacg 540gattgatgtg tttagcaaag attttgataa catagcagag gtggaattag gagccccttg 600gccatttccg ccattagaag ccactgcgac attggcacac aagtttgaac tcttaggcac 660ttgcaagatc aagataacat ttgagaaaac aactgtgaag acatcgggaa acttgtcgca 720gattcctccg tttgatatcc cgaggcttcc cgacagtttc agaccatcgt caaaccctgg 780aactggggat ttcgaagtta cctatgttga tgataccatg cgcataactc gcggggacag 840aggtgaactt agggtattcg tcattgctta attctcaaag ctttgacatg taaagataaa 900taaatacttt ctgcttgatg cagtctcatg agttttgtac aaatcatgtg aacatataaa 960tgcgctttat aagtaaatga gtgtcttgtt caatgaatca 1000<210> 3<211> 4260<212> DNA<213> 擬南芥<400> 3aattagaaaa attaacaacc aacatctagt tagaatattt aatttgcacc aatgtcttcg 60agtatagtga aaaaaataga agatcgaata tcgaatagta cgtatagaat catctagatc 120cattcgaact aacgtctact tttcttttcc agcattaaca tgtagcttgt cattagcatt 180tacatgttgc aaataacaca aattgggaaa ttgaaagact aaaaaacctt gtacagcaga 240tggtttaaca cgtggattca tggacacaaa cagaaaacgg cagaactaag cacaaaaacg 300tcaactaagc atatcaaagc ttttaatgca agcctaatat aaacacaagt ggttatccat 360aatctgttct taatctcttg cagtagttat cttttcatta ttcgcaattc gcaattctat 420attcttatat ttcaacttgt tcttcttcca aattgtaatt atatctacat cgtcttagct 480tgaccattat agctccagta ccaagttctc ttcttaactt taatatcagc tactattctc 540atactgtaaa tatcttttgt tcaccaaaca tatatttcga accaaactgc taaaagctta 600tcataaattg cagttctagc cacacaattt tgcagttcca accattaaat gccacaaaat 660ttggacgatt tcttaagaca agaagaacat agcaaccaaa ccttattgat taaatatgaa 720atgtctccat aaaactggga gatttcccca aataaagaga acacggcaaa tgttcacgta 780atctccaaga tgaatgttta attttttctt tcagaaaaaa acaaaaaaac ttaactcaat 840atagacaact agaatggata ccaactaagc aaaagaaatt caaaagacaa atatatattg 900gatatgaagt tacattattt tcaaacttta tatactacta aaagcctaaa aatttgttct 960aaaatgatat ccaaataaat ggaaggcatg aatgtcatat gactaaaaga gaaaaacaca 1020cctgtatata agtattggat catgctgcct ccgagtgaca aaacatacga tgtgggtctt 1080tattgggcca tacttaaatg gaaaaaggag aaaaaaaatt gggcaatgtc tatggtcgaa 1140atttatatgt tttacatcaa taaaatcaat atttaatttt atatatgtgg gtcttaatct 1200agtattatct acatagatta aaatcaaagt actgcatatg gtccataata atacaaccaa 1260agcaaattaa aattttgtgg cacaaaacga catcatttta ctcagaaagt aatatgcaat 1320ttcgtttacg cacacacgta tacgcgctaa taacccgtgg tgcttctcaa atcacataat 1380aattaaagtc ttcttcttct tcttcttctc tacaaattat ctcactctct tcgttttttt 1440ttccttctca acaatggcga cttcttctac tttctcgtca ctactacctt caccaccagc 1500tcttctttcc gaccaccgtt ctcctccacc atccatcaga tactcctttt ctcccttaac 1560tactccaaaa tcgtctcgtt tgggtttcac tgtaccggag aagagaaacc tcgctgctaa 1620ttcgtctctc gttgaagtat ccattggcgg agaaagtgac ccaccaccat catcatctgg 1680atcaggagga gacgacaagc aaattgcatt actcaaactc aaattacttg tgagtctgat 1740tcaaaccaat cggtgaaatt ataagaaatt ggtttcgttt ctttggaatt agggtttata 1800ttactgttaa gattcgatta tagagtgaat tttgggaaga tttttcagat ttgatttgtg 1860atgtgttgtg ttgtgagaaa ttgcagagtg tagtttcggg attaaacaga ggacttgtgg 1920cgagtgttga tgatttagaa agagctgaag tggctgctaa agaacttgaa actgctgggg 1980gaccggttga tttaaccgat gatcttgata agcttcaagg gaaatggagg ctgttgtata 2040gtagtgcgtt ctcttctcgg tctttaggtg gtagccgtcc tggtctacct actggacgtt 2100tgatccctgt tactcttggc caggtaattc ttgaatcatt gctctgtttt tacccgtcaa 2160gattcggttt ttcgggtaag ttgttgagga gtttatgtgc atggtctagt ctatcatcaa 2220tagtcttgct tgagtttgaa tggggctgag ctaagaatct agctttctga ggttacaatt 2280tggtaatgtc atcttatact cgaaagcaaa cttttttcta tattgtcaag tttatgtgta 2340cggtctggtc tatcattggt agtctttgtt gagcttgaat ggtgaggagc ttagaatcta 2400gcaatgtcat ctactcctta atcatttttt tctatattgc caagtttatg tgtacggtct 2460tagtcaatca tctttattct tggttgagtt tgaatggtga tgagcttaga atctagcttt 2520ctttggttta aatttggcaa agaaccatac ctgaatcggt agaaagcaaa cttctttaat 2580attatctctt gtttctgaat cattaaaaca ggtgtttcaa cggattgatg tgtttagcaa 2640agattttgat aacatagcag aggtggaatt aggagcccct tggccatttc cgccattaga 2700agccactgcg acattggcac acaagtttga actcttaggt ttgcatttcc ctttctctca 2760ttaagtttat cgaattgtgt aagagcaaaa taacttatct gtatctttga catttatggg 2820gaaaacaggc acttgcaaga tcaagataac atttgagaaa acaactgtga agacatcggg 2880aaacttgtcg cagattcctc cgtttgatat cccgaggctt cccgacagtt tcagaccatc 2940gtcaaaccct ggaactgggg atttcgaagt tacctatgtt gatgatacca tgcgcataac 3000tcgcggggac agaggtgaac ttagggtatt cgtcattgct taattctcaa agctttgaca 3060tgtaaagata aataaatact ttctgcttga tgcagtctca tgagttttgt acaaatcatg 3120tgaacatata aatgcgcttt ataagtaaat gagtgtcttg ttcaatgaat catatgaaag 3180aatttgtatg actcagaaaa ttggacaatg atatagacct tccaaatttt gcaccctcta 3240atgtgagata ttagtgattt tttcttaggt tggtagagag aacggattgg caaaaaaata 3300tcgaaggtca atgattaaca gcaaaaccat atcttgatga ttcaaaatat agagttaaca 3360agcaaagatg agacaatctt atacgagaga gctaaaacaa atggattcca aatccagcaa 3420gtacaaaaat cgcagaaaat aagatgaaac caacttaaaa cagagatgtt ccctttccct 3480tcttgtcacc accgatctcg aaatgcttgc acctctgaaa taaacaacaa accaacacaa 3540tgtaagcaaa ttaccaagtt acaaatccgg tataatgaac tgatctatgt tctatgcacc 3600ttgataggac 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Asp Leu Glu35 40 45Arg Asp Val Asp Lys Leu Gln Gly Arg Trp Arg Leu Val Tyr Ser Ser50 55 60Ala Phe Ser Ser Arg Thr Leu Gly Gly Ser Arg Pro Gly Pro Pro Thr65 70 75 80Gly Arg Leu Leu Pro Ile Thr Leu Gly Gln Val Phe Gln Arg Ile Asp85 90 95Val Val Ser Lys Asp Phe Asp Asn Ile Val Asp Val Glu Leu Gly Ala100 105 110Pro Trp Pro Leu Pro Pro Val Glu Leu Thr Ala Thr Leu Ala His Lys115 120 125Phe Glu Ile Ile Gly Thr Ser Ser Ile Lys Ile Thr Phe Asp Lys Thr130 135 140Thr Val Lys Thr Lys Gly Asn Leu Ser Gln Leu Pro Pro Leu Glu Val145 150 155 160Pro Arg Ile Pro Asp Asn Leu Arg Pro Pro Ser Asn Thr Gly Ser Gly165 170 175Glu Phe Glu Val Thr Tyr Leu Asp Gly Asp Thr Arg Ile Thr Arg Gly180 185 190Asp Arg Gly Glu Leu Arg Val Phe Val Ile Ser195 200<210> 5<211> 613<212> DNA<213> 稻<400> 5cgtggctgcg ctcaaagtca agcttctgag cgcggtgtcc gggctgaacc gcggcctcgc 60ggggagccag gaggatcttg accgcgccga cgcggcggcg cgggagctcg aggcggcggc 120gggtggcggc cccgtcgacc tggagaggga cgtggacaag ctgcaggggc ggtggaggct 180ggtgtacagc agcgcgttct cgtcgcggac gctcggcggc agccgccccg gcccgcccac 240cggccgcctc ctccccatca ccctcgggca ggtgtttcag aggatcgatg ttgtcagcaa 300ggacttcgac aacatcgtcg atgtcgagct cggcgcgcca tggccgctgc cgccggtgga 360gctgacggcg accctggctc acaagtttga gatcatcggc acctcgagca taaagatcac 420attcgacaag acgacggtga agacgaaggg gaacctgtcc cagctgccgc cgctggaggt 480ccctcgcatc ccggacaacc tccggccgcc gtccaacacc ggcagcggcg agttcgaggt 540gacctacctc gacggcgaca cccgcatcac ccgcggggac agaggggagc tcagggtgtt 600cgtcatctcg tga613<210> 6<211> 26<212> PRT<213> 野油菜黃單胞菌甘氨酸致病變種(Xanthomonas campestris pv.glycines)<400> 6Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr20 25<210> 7<211> 114<212> PRT<213> 野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種(Xanthomonas campestris pv.pelargonii)<400> 7Met Asp Ser Ile Gly Asn Asn Phe Ser Asn Ile Gly Asn Leu Gln Thr1 5 10 15Met Gly Ile Gly Pro Gln Gln His Glu Asp Ser Ser Gln Gln Ser Pro20 25 30Ser Ala Gly Ser Glu Gln Gln Leu Asp Gln Leu Leu Ala Met Phe Ile35 40 45Met Met Met Leu Gln Gln Ser Gln Gly Ser Asp Ala Asn Gln Glu Cys50 55 60Gly Asn Glu Gln Pro Gln Asn Gly Gln Gln Glu Gly Leu Ser Pro Leu65 70 75 80Thr Gln Met Leu Met Gln Ile Val Met Gln Leu Met Gln Asn Gln Gly85 90 95Gly Ala Gly Met Gly Gly Gly Gly Ser Val Asn Ser Ser Leu Gly Gly100 105 110Asn Ala<210> 8<211> 342<212> DNA<213> 野油菜黃單胞菌天竺葵致病變種<400> 8atggactcta tcggaaacaa cttttcgaat atcggcaacc tgcagacgat gggcatcggg 60cctcagcaac acgaggactc cagccagcag tcgccttcgg ctggctccga gcagcagctg 120gatcagttgc tcgccatgtt catcatgatg atgctgcaac agagccaggg cagcgatgca 180aatcaggagt gtggcaacga acaaccgcag aacggtcaac aggaaggcct gagtccgttg 240acgcagatgc tgatgcagat cgtgatgcag ctgatgcaga accagggcgg cgccggcatg 300ggcggtggcg gttcggtcaa cagcagcctg ggcggcaacg cc342<210> 9<211> 205<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列描述探針<400> 9gatcaagata acatttgaga aaacaactgt gaagacatcg ggaaacttgt cgcagattcc 60tccgtttgat atcccgaggc ttcccgacag tttcagacca tcgtcaaacc ctggaactgg 120ggatttcgaa gttacctatg ttgatgatac catgcgcata actcgcgggg acagaggtga 180acttagggta ttcgtcattg cttaa 20權(quán)利要求
1.一種分離蛋白，它在植物中作為植物病原體超敏反應(yīng)激衛(wèi)素的受體起作用。
2.依照權(quán)利要求1的蛋白，其中所述植物病原體選自歐文氏菌屬(Erwinia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃單胞菌屬(Xanthamonas)、疫霉屬(Phytophthora)和棍狀桿菌屬(Clavibacter)。
3.依照權(quán)利要求2的蛋白，其中所述植物病原體是歐文氏菌屬病原體。
4.依照權(quán)利要求3的蛋白，其中所述植物病原體是解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)。
5.依照權(quán)利要求1的蛋白，其中所述蛋白來自單子葉植物。
6.依照權(quán)利要求5的蛋白，其中所述蛋白來自水稻。
7.依照權(quán)利要求1的蛋白，其中所述蛋白具有SEQ.ID.No.4的部分氨基酸序列。
8.依照權(quán)利要求1的蛋白，其中所述蛋白來自雙子葉植物。
9.依照權(quán)利要求8的蛋白，其中所述蛋白來自擬南芥(Arabidopsisthaliana)。
10.依照權(quán)利要求1的蛋白，其中所述蛋白具有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。
11.依照權(quán)利要求1的蛋白，其中所述蛋白是重組蛋白。
12.一種分離的核酸分子，所述核酸分子編碼依照權(quán)利要求1的蛋白。
13.依照權(quán)利要求12的核酸分子，其中所述植物病原體選自歐文氏菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬、疫霉屬和棍狀桿菌屬。
14.依照權(quán)利要求13的核酸分子，其中所述植物病原體是歐文氏菌屬病原體。
15.依照權(quán)利要求14的核酸分子，其中所述植物病原體是解淀粉歐文氏菌。
16.依照權(quán)利要求12的核酸分子，其中所述蛋白來自單子葉植物。
17.依照權(quán)利要求16的核酸分子，其中所述蛋白來自水稻。
18.依照權(quán)利要求12的核酸分子，其中所述蛋白具有SEQ.ID.No.4的部分氨基酸序列。
19.依照權(quán)利要求12的核酸分子，其中所述核酸分子在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.5的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃。
20.依照權(quán)利要求12的核酸分子，其中所述核酸具有包含SEQ.ID.No.5的核苷酸序列。
21.依照權(quán)利要求12的核酸分子，其中所述蛋白來自雙子葉植物。
22.依照權(quán)利要求21的核酸分子，其中所述蛋白來自擬南芥。
23.依照權(quán)利要求12的核酸分子，其中所述蛋白具有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。
24.依照權(quán)利要求12的核酸分子，其中所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.2或9的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃。
25.依照權(quán)利要求12的核酸分子，其中所述核酸具有SEQ.ID.No.2的核苷酸序列。
26.依照權(quán)利要求12的核酸，其中所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.3的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09MSSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃。
27.依照權(quán)利要求12的核酸，其中所述核酸具有包含SEQ.ID.No.3的核苷酸序列。
28.一種反義核酸分子，所述反義核酸分子是依照權(quán)利要求12的核酸的反義核酸分子。
29.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含依照權(quán)利要求12的核酸分子，所述核酸分子對(duì)于所述表達(dá)載體是異源核酸分子。
30.依照權(quán)利要求29的表達(dá)載體，其中所述核酸分子以有義取向位于所述表達(dá)載體的正確可讀框中。
31.依照權(quán)利要求29的表達(dá)載體，其中(1)所述蛋白具有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列；(2)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.2或9的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(3)所述核酸包含SEQ.ID.No.2的核苷酸序列；(4)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.3的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(5)所述核酸包含SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；(6)所述蛋白具有SEQ.ID.No.4的氨基酸序列；(7)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.5的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；或者(8)所述核酸包含SEQ.ID.No.5的核苷酸序列。
32.一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含依照權(quán)利要求28的核酸分子，所述核酸分子對(duì)于所述表達(dá)載體是異源核酸分子。
33.一種轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞是用依照權(quán)利要求12的核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
34.依照權(quán)利要求33的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。
35.依照權(quán)利要求33的宿主細(xì)胞，其中所述DNA分子用一種表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
36.依照權(quán)利要求33的宿主細(xì)胞，其中(1)所述蛋白具有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列；(2)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.2或9的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(3)所述核酸包含SEQ.ID.No.2的核苷酸序列；(4)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.3的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(5)所述核酸包含SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；(6)所述蛋白具有SEQ.ID.No.4的氨基酸序列；(7)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.5的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；或者(8)所述核酸包含SEQ.ID.No.5的核苷酸序列。
37.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是用依照權(quán)利要求28的核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
38.一種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物是用權(quán)利要求12的DNA分子轉(zhuǎn)化的植物。
39.依照權(quán)利要求38的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、卷心菜、孢子甘藍(lán)、甜菜、歐洲防風(fēng)、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、懸鉤子、鳳梨、大豆、煙草、番茄、高梁和甘蔗。
40.依照權(quán)利要求38的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自擬南芥、非洲紫苣苔(Saintpaulia)、矮牽?；?petunia)、天竺葵屬(pelargonium)、一品紅(poinsttia)、菊花(chrysanthemum)、香石竹(carnation)和百日菊(zinnia)。
41.依照權(quán)利要求38的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物。
42.依照權(quán)利要求38的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物來自雙子葉植物。
43.依照權(quán)利要求38的轉(zhuǎn)基因植物，其中(1)所述蛋白具有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列；(2)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.2或9的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(3)所述核酸包含SEQ.ID.No.2的核苷酸序列；(4)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.3的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(5)所述核酸包含SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；(6)所述蛋白具有SEQ.ID.No.4的氨基酸序列；(7)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.5的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；或者(8)所述核酸包含SEQ.ID.No.5的核苷酸序列。
44.一種轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物是用依照權(quán)利要求28的核酸轉(zhuǎn)化的植物。
45.一種轉(zhuǎn)基因植物種子，所述轉(zhuǎn)基因植物種子是用權(quán)利要求12的DNA分子轉(zhuǎn)化的種子。
46.依照權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述植物選自苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、卷心菜、孢子甘藍(lán)、甜菜、歐洲防風(fēng)、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、懸鉤子、鳳梨、大豆、煙草、番茄、高梁和甘蔗。
47.依照權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述植物選自擬南芥、非洲紫苣苔、矮牽?；?、天竺葵屬、一品紅、菊花、香石竹和百日菊。
48.依照權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述植物是單子葉植物。
49.依照權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物種子，其中所述植物是雙子葉植物。
50.依照權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物種子，其中(1)所述蛋白具有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列；(2)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.2或9的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09MSSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(3)所述核酸包含SEQ.ID.No.2的核苷酸序列；(4)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.3的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09MSSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(5)所述核酸包含SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；(6)所述蛋白具有SEQ.ID.No.4的氨基酸序列；(7)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.5的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；或者(8)所述核酸包含SEQ.ID.No.5的核苷酸序列。
51.一種轉(zhuǎn)基因植物種子，所述轉(zhuǎn)基因植物種子是用依照權(quán)利要求28的核酸分子轉(zhuǎn)化的種子。
52.一種鑒定靶向植物細(xì)胞的物質(zhì)的方法，所述方法包括形成包含依照權(quán)利要求1的蛋白以及候選物質(zhì)的反應(yīng)混合物；評(píng)價(jià)所述反應(yīng)混合物中所述蛋白與所述候選物質(zhì)之間的結(jié)合；鑒定在所述反應(yīng)混合物中結(jié)合所述蛋白的候選化合物為植物細(xì)胞靶向物質(zhì)。
53.依照權(quán)利要求52的方法，其中所述蛋白來自單子葉植物。
54.依照權(quán)利要求53的方法，其中所述蛋白來自水稻。
55.依照權(quán)利要求52的方法，其中所述蛋白具有包含SEQ.ID.No.4的氨基酸序列。
56.依照權(quán)利要求52的方法，其中所述蛋白來自雙子葉植物。
57.依照權(quán)利要求56的方法，其中所述蛋白來自擬南芥。
58.依照權(quán)利要求52的方法，其中所述蛋白具有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列。
59.一種鑒定靶向植物細(xì)胞的物質(zhì)的方法，所述方法包括形成包含一種用依照權(quán)利要求12的核酸分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及候選物質(zhì)的反應(yīng)混合物；評(píng)估所述反應(yīng)混合物中所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白與所述候選物質(zhì)之間的結(jié)合；鑒定所述反應(yīng)混合物中結(jié)合所述宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白的候選化合物為植物細(xì)胞靶向物質(zhì)。
60.依照權(quán)利要求59的方法，其中所述蛋白來自單子葉植物。
61.依照權(quán)利要求60的方法，其中所述蛋白來自水稻。
62.依照權(quán)利要求59的方法，其中所述蛋白來自雙子葉植物。
63.依照權(quán)利要求62的方法，其中所述蛋白來自擬南芥。
64.依照權(quán)利要求59的方法，其中(1)所述蛋白具有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列；(2)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.2或9的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(3)所述核酸包含SEQ.ID.No.2的核苷酸序列；(4)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.3的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(5)所述核酸包含SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；(6)所述蛋白具有SEQ.ID.No.4的氨基酸序列；(7)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.5的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；或者(8)所述核酸包含SEQ.ID.No.5的核苷酸序列。
65.一種增強(qiáng)植物對(duì)超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理的接受能力的方法，所述方法包括提供用依照權(quán)利要求12的核酸分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物種子。
66.依照權(quán)利要求65的方法，其中(1)所述蛋白具有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列；(2)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.2或9的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(3)所述核酸包含SEQ.ID.No.2的核苷酸序列；(4)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.3的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(5)所述核酸包含SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；(6)所述蛋白具有SEQ.ID.No.4的氨基酸序列；(7)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.5的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；或者(8)所述核酸包含SEQ.ID.No.5的核苷酸序列。
67.依照權(quán)利要求65的方法，其中提供一種轉(zhuǎn)基因植物。
68.依照權(quán)利要求65的方法，其中提供一種轉(zhuǎn)基因植物種子，并且所述方法還包括在有效允許所種植的植物種子生長的條件下，種植所述植物種子。
69.依照權(quán)利要求65的方法，其中所述植物選自苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、卷心菜、孢子甘藍(lán)、甜菜、歐洲防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、嫩莖花椰菜、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、懸鉤子、鳳梨、大豆、煙草、番茄、高梁和甘蔗。
70.依照權(quán)利要求65的方法，其中所述植物選擇擬南芥、非洲紫苣苔、矮牽?；?、天竺葵屬、一品紅、菊花、香石竹和百日菊。
71.依照權(quán)利要求65的方法，其中所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理的目的是賦予抗病性。
72.依照權(quán)利要求65的方法，其中所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理的目的是增強(qiáng)植物生長。
73.依照權(quán)利要求65的方法，其中所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理的目的是控制昆蟲。
74.依照權(quán)利要求65的方法，其中所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理的目的是賦予脅迫耐受性。
75.依照權(quán)利要求65的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物種子還用編碼超敏反應(yīng)激衛(wèi)素的第二種核酸轉(zhuǎn)化，其中所述第二種核酸的表達(dá)實(shí)現(xiàn)超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理。
76.依照權(quán)利要求65的方法，其中所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理包括應(yīng)用一種超敏反應(yīng)激衛(wèi)素于所述植物或植物種子。
77.依照權(quán)利要求76的方法，其中所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素以獨(dú)立形式應(yīng)用。
78.一種賦予植物抗病性、增強(qiáng)生長、控制昆蟲和/或賦予脅迫抗性的方法，所述方法包括提供用一種DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或植物種子，所述DNA構(gòu)建物有效使依照權(quán)利要求12的核酸分子表達(dá)沉默。
79.依照權(quán)利要求78的方法，其中所述蛋白來自單子葉植物。
80.依照權(quán)利要求79的方法，其中所述蛋白來自水稻。
81.依照權(quán)利要求78的方法，其中所述蛋白來自雙子葉植物。
82.依照權(quán)利要求81的方法，其中所述蛋白來自擬南芥。
83.依照權(quán)利要求78的方法，其中(1)所述蛋白具有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列；(2)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.2或9的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(3)所述核酸包含SEQ.ID.No.2的核苷酸序列；(4)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.3的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(5)所述核酸包含SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；(6)所述蛋白具有SEQ.ID.No.4的氨基酸序列；(7)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.5的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；或者(8)所述核酸包含SEQ.ID.No.5的核苷酸序列。
84.依照權(quán)利要求78的方法，其中提供一種轉(zhuǎn)基因植物。
85.依照權(quán)利要求78的方法，其中提供一種轉(zhuǎn)基因植物種子，并且所述方法還包括在有效允許所種植的植物種子生長的條件下，種植所述植物種子。
86.依照權(quán)利要求78的方法，其中所述植物選自苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、卷心菜、孢子甘藍(lán)、甜菜、歐洲防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、懸鉤子、鳳梨、大豆、煙草、番茄、高梁和甘蔗。
87.依照權(quán)利要求78的方法，其中所述植物選自擬南芥、非洲紫苣苔、矮牽?；?、天竺葵屬、一品紅、菊花、香石竹和百日菊。
88.依照權(quán)利要求78的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物種子還用編碼超敏反應(yīng)激衛(wèi)素的第二種核酸轉(zhuǎn)化，其中所述第二種核酸的表達(dá)實(shí)現(xiàn)超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理。
89.依照權(quán)利要求78的方法，所述方法還包括應(yīng)用一種超敏反應(yīng)激衛(wèi)素于所述植物或植物種子。
90.依照權(quán)利要求89的方法，其中所述超敏反應(yīng)激衛(wèi)素以獨(dú)立形式應(yīng)用。
91.依照權(quán)利要求78的方法，其中賦予植物抗病性。
92.依照權(quán)利要求78的方法，其中增強(qiáng)植物生長。
93.依照權(quán)利要求78的方法，其中控制植物昆蟲。
94.依照權(quán)利要求78的方法，其中賦予植物對(duì)脅迫的抗性。
95.依照權(quán)利要求78的方法，其中所述DNA構(gòu)建物是一種編碼受體的核酸分子的反義核酸分子，所述受體是植物中對(duì)植物病原體超敏反應(yīng)激衛(wèi)素的受體。
96.依照權(quán)利要求78的方法，其中所述DNA構(gòu)建物可以轉(zhuǎn)錄成為兩種連接在一起的的核酸，其中第一種核酸編碼植物中對(duì)植物病原體超敏反應(yīng)激衛(wèi)素的受體，第二種核酸編碼所述第一種核酸的反向互補(bǔ)物。
97.一種賦予植物抗病性、增強(qiáng)生長、控制昆蟲和/或賦予脅迫抗性的方法，所述方法包括提供用依照權(quán)利要求12的核酸分子轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物種子。
98.依照權(quán)利要求97的方法，其中(1)所述蛋白具有SEQ.ID.No.1的氨基酸序列；(2)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.2或9的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(3)所述核酸包含SEQ.ID.No.2的核苷酸序列；(4)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.3的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；(5)所述核酸包含SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；(6)所述蛋白具有SEQ.ID.No.4的氨基酸序列；(7)所述核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ.ID.No.5的核苷酸序列雜交，所述嚴(yán)格條件是在0.9M鹽水/0.09M SSC緩沖液中包含20％甲酰胺的雜交緩沖液，溫度為42℃；或者(8)所述核酸包含SEQ.ID.No.5的核苷酸序列。
99.依照權(quán)利要求97的方法，其中提供一種轉(zhuǎn)基因植物。
100.依照權(quán)利要求97的方法，其中提供一種轉(zhuǎn)基因植物種子，并且所述方法還包括在有效允許所種植的植物種子生長的條件下，種植所述植物種子。
101.依照權(quán)利要求97的方法，其中所述植物選自苜蓿、水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、馬鈴薯、甘薯、豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、卷心菜、孢子甘藍(lán)、甜菜、歐洲防風(fēng)、蕪菁、花椰菜、嫩莖花椰菜、蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、懸鉤子、鳳梨、大豆、煙草、番茄、高梁和甘蔗。
102.依照權(quán)利要求97的方法，其中所述植物選自擬南芥、非洲紫苣苔、矮牽牛花、天竺葵屬、一品紅、菊花、香石竹和百日菊。
103.依照權(quán)利要求97的方法，其中賦予植物抗病性。
104.依照權(quán)利要求97的方法，其中增強(qiáng)植物生長。
105.依照權(quán)利要求97的方法，其中控制昆蟲。
106.依照權(quán)利要求97的方法，其中賦予植物脅迫耐受性。
107.依照權(quán)利要求97的方法，其中所述蛋白來自單子葉植物。
108.依照權(quán)利要求107的方法，其中所述蛋白來自水稻。
109.依照權(quán)利要求97的方法，其中所述蛋白來自雙子葉植物。
110.依照權(quán)利要求109的方法，其中所述蛋白來自擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的蛋白，所述蛋白在植物中作為植物病原體超敏反應(yīng)激衛(wèi)素的受體起作用。本發(fā)明還公開了編碼所述受體的核酸分子，以及包含所述核酸分子的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植物種子。所述蛋白和所述核酸都可以用于鑒定具有如下作用的植物細(xì)胞靶向物質(zhì)增強(qiáng)植物對(duì)超敏反應(yīng)激衛(wèi)素處理的接受能力，并且直接賦予植物生長增強(qiáng)以及抗病性、對(duì)昆蟲的抗性和對(duì)脅迫的抗性。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1429269SQ01809741
公開日2003年7月9日 申請(qǐng)日期2001年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月23日
發(fā)明者X·宋, H·范, Z·－M·衛(wèi) 申請(qǐng)人:伊登生物科學(xué)有限公司