專利名稱：識(shí)別潛在的免疫優(yōu)勢(shì)乙酰膽堿受體α亞基肽的制作方法
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病是特別重要的一類有害的免疫反應(yīng)，它影響9,000,000多人口，構(gòu)成美國的一個(gè)主要健康問題。在自身免疫性疾病中，機(jī)體缺失自我耐受，免疫系統(tǒng)把自身組織當(dāng)作外來目標(biāo)攻擊。這些疾病在缺少治療時(shí)，一般發(fā)展為慢性疾病，許多情況下導(dǎo)致患者死亡。
原始的治療自身免疫性疾病的方法一般為免疫抑制。這種方法明顯的弊端在于削弱機(jī)體對(duì)真正外來物質(zhì)激發(fā)免疫反應(yīng)的反應(yīng)能力。僅稍微成熟的治療方法依賴于移除目標(biāo)組織中的免疫復(fù)合物。這種方法也有副作用并且難于實(shí)現(xiàn)。除了使用含有害副作用的免疫抑制劑，任何的自身免疫性疾病幾乎沒有有效的治療方法?，F(xiàn)有30多種發(fā)病率各不相同的器官特異和全身形式的自身免疫性疾病。那些有相對(duì)較多患者的疾病，例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病和多發(fā)性硬化，由于明顯的經(jīng)濟(jì)原因被經(jīng)常鎖定為開發(fā)新治療方法的目標(biāo)。
對(duì)于T淋巴細(xì)胞在保持免疫耐受和自身免疫性病理中作用認(rèn)識(shí)的加深，觸發(fā)了許多抗原特異的治療方法的發(fā)展，這些方法擬于抑制或消除自身反應(yīng)性T細(xì)胞，同時(shí)保持保護(hù)性免疫反應(yīng)。這些方案依賴于自身免疫性疾病中自身抗原和自身抗原肽表位的識(shí)別。對(duì)于許多自身免疫性疾病，包括那些有較多患者的疾病，這方面的信息是未知的、不完全的或有爭議的。
重癥肌無力(MG)是影響神經(jīng)肌肉接頭并可威脅生命的一種自身免疫性疾病。患者人數(shù)約在25,000至100,000間波動(dòng)(Drachman(1994)N.Eng.J.Med.3301797-1810；MG Foudation，1997)，患者人數(shù)預(yù)期隨著平均人口年齡的增長而增長。MG以乙酰膽堿受體(AChR)自身抗體為特征。動(dòng)物體內(nèi)模型和免疫抑制藥物實(shí)驗(yàn)說明，這些自身抗體的產(chǎn)生依賴于CD4+T細(xì)胞。在MG的情況下，自身抗體與神經(jīng)肌肉接頭肌膜表面的乙酰膽堿受體(AChR)結(jié)合，引起AChR的內(nèi)吞和補(bǔ)體介導(dǎo)的損傷。AChR的丟失減少了肌肉做功的效率，產(chǎn)生從疲勞到呼吸衰竭的癥狀。
MG為抗原特異療法的發(fā)展和臨床檢測(cè)提供許多便利，包括一個(gè)明確鑒定的自身抗原AChR的存在。AChR被普遍認(rèn)為是自身反應(yīng)性T和B細(xì)胞的靶位，不像在多發(fā)性硬化等疾病中可以是多種髓磷脂蛋白(包括髓磷脂堿性蛋白、蛋白脂質(zhì)蛋白、髓磷脂少突細(xì)胞糖蛋白、髓磷脂相關(guān)糖蛋白、αB-晶體蛋白、CNPase和熱休克蛋白)。而且也可方便獲得明確的臨床參數(shù)。例如，檢測(cè)由于膽堿酯酶阻斷造成肌肉受損而使功能暫時(shí)減退的拉力試驗(yàn)，抗AChR抗體的檢測(cè)是MG的診斷工具。早期發(fā)病患者的疾病與HLA-DR3相關(guān)，晚期發(fā)病與HLA-DR2相關(guān)。而且，肌電圖可以方便地檢測(cè)肌肉功能，ELISA及其它相對(duì)簡單的分析可以得到抗AChR抗體的水平，所以MG的臨床檢測(cè)得益于疾病活動(dòng)度的簡單的和明確的替代標(biāo)記物。除了這些優(yōu)點(diǎn)，在MG的治療方面還沒有實(shí)驗(yàn)其它方案。
開發(fā)MG抗原特異治療方法的最大困難是目前缺少關(guān)于免疫優(yōu)勢(shì)AChR表位的特性的一致意見。
AChR是一個(gè)五聚體離子通道，在成人受神經(jīng)支配的肌肉中由α2βεδ組成，在胚胎和去神經(jīng)支配的肌肉中及胸腺肌樣細(xì)胞中由α2βγδ組成。AChRα亞基既是乙酰膽堿的結(jié)合位點(diǎn)，其67-76的結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)又是與自身抗體結(jié)合的(Tzartos等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852899-2903)主要免疫原區(qū)(MIR)，即自身抗原結(jié)合的優(yōu)勢(shì)位點(diǎn)。雖然有許多關(guān)于優(yōu)勢(shì)AChR T細(xì)胞表位的文獻(xiàn)報(bào)道，其中許多研究并不確定，所以并沒有明確一致的意見(見綜述，例如，Manfredi等，(1992)J.Lab.Clin.Med.113-21；Hawke等，(1996)Immunol.Today 17307-311)。這些實(shí)驗(yàn)中的大多數(shù)沒有檢驗(yàn)HLA-DR限制。另外，一些研究基于對(duì)合成AChR肽具有反應(yīng)性的T細(xì)胞系的產(chǎn)生鑒定了免疫優(yōu)勢(shì)肽，但在許多情況下，這些T細(xì)胞不能對(duì)天然AChR產(chǎn)生反應(yīng)(Matsuo等，(1995)J.Immunol.1553683-3692；Hawke等，supra)。這樣就不明確是否這些T細(xì)胞是分析系統(tǒng)中的假象。
以往的研究檢驗(yàn)了MG患者外周血單核細(xì)胞對(duì)一組AChR肽的反應(yīng)(見Harcourt等，(1988)J.Clin.Invest.821894；和Newsom-Davis等，(1989)J.Autoimmun.2101)。然而這些研究或者檢驗(yàn)了一組不完全的AChR肽，或者檢驗(yàn)了連續(xù)肽的重疊限于幾個(gè)氨基酸的一組肽，可能錯(cuò)過某些相關(guān)表位。其它情況下，HLA-DR對(duì)T細(xì)胞反應(yīng)的限制并無測(cè)定。另一些可能對(duì)MG有重要意義的研究識(shí)別了結(jié)合HLA-DR等位基因的免疫優(yōu)勢(shì)肽，但T細(xì)胞對(duì)這些肽的反應(yīng)仍未被證實(shí)。除了這些進(jìn)展，該技術(shù)缺乏對(duì)HLA-DR相關(guān)免疫優(yōu)勢(shì)AChR肽的一致意見。
目前對(duì)MG的治療并非特異，許多情況下存在有害的副作用。例如，移除抗體的血液透析是一項(xiàng)昂貴的操作，抗體滴度在透析結(jié)束后可以迅速回升，并超過透析前標(biāo)準(zhǔn)。類固醇和其它免疫抑制劑(例如，ACTH、咪唑硫嘌呤和環(huán)胞霉素A)有時(shí)也被使用，但經(jīng)常引發(fā)腎毒性、高血壓或其它健康危險(xiǎn)。胸腺切除有時(shí)有療效，但經(jīng)常失敗，并需要術(shù)后五年以上才見效，對(duì)兒童及老年患者禁忌。
因此，該領(lǐng)域需要沒有主要副作用且不影響整個(gè)免疫系統(tǒng)的治療自身免疫性疾病特別是MG的有效方法。本發(fā)明即著手于這些和其它需求。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及可用于抑制重癥肌無力時(shí)免疫系統(tǒng)自身免疫反應(yīng)的組合物。本發(fā)明組合物的作用靶點(diǎn)設(shè)計(jì)為識(shí)別與MHC成分相聯(lián)系的特異抗原的輔助T細(xì)胞。本發(fā)明組合物結(jié)合T細(xì)胞且引起靶T細(xì)胞的無反應(yīng)性，提供了較前副作用更少的特異性療法。
本發(fā)明提供了識(shí)別與HLA-DR2和HLA-DR3有較高親和力的AChR亞基肽，HLA-DR2和HLA-DR3在具有這些單倍型的患者中可能代表免疫優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位。這些肽可被用于誘導(dǎo)靶位T細(xì)胞的無反應(yīng)性并用于MG的治療。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述肽。其它實(shí)施方案中，該肽被用于藥物組合物治療MG，或與MHC分子結(jié)合用于藥物組合物。另一方案中，本發(fā)明提供了一種治療MG的方法。
附圖簡述

圖1表示HLA-DR2和HLA-DR3親和力DELFIA分析中檢測(cè)到的重疊AChR肽位置。
圖2列出結(jié)合HLA-DR2和HLA-DR3的每個(gè)AChR肽的IC50值。大于100,000nM的IC50值以“＞”表示。
圖3表示AChRα肽1/IC50值的柱狀圖，說明了肽與HLA-DR2和HLA-DR3的相對(duì)親和力。
圖4表示對(duì)HLA-DR2具有高親和力的AChRα肽的可能的DRB1*1501基序排列。與公開的HLA-DR2基序最適的AChRα肽順序和IC50值共同標(biāo)出。
圖5表示對(duì)HLA-DR3具有高親和力的AChRα肽的可能的DRB1*0301基序排列。與公開的HLA-DR3基序最適的AChRα肽順序和IC50值共同標(biāo)出。
圖6列出HLA-DR2和HLA-DR3的候選免疫優(yōu)勢(shì)AChR肽。那些IC50值≤10,000nM的肽被列出。
圖7表示正常健康個(gè)體樣本PBMCs的ELISPOT測(cè)定結(jié)果。特定抗原的反應(yīng)指數(shù)為2或大于2時(shí)認(rèn)為是陽性。
圖8表示MG患者樣本PBMCs的ELISPOT測(cè)定結(jié)果。如果特定抗原的反應(yīng)指數(shù)大于2則T細(xì)胞反應(yīng)鑒定為陽性。
圖9表示正常健康個(gè)體(“正?！?或MG患者(“患者”)對(duì)不同AChR肽陽性反應(yīng)性的百分比對(duì)比。
圖10表示DR2+正常健康個(gè)體(“正?！?或DR2+MG患者(“患者”)對(duì)AChR肽反應(yīng)性的百分比對(duì)比。
具體實(shí)施方案的說明I.前言本發(fā)明提供可用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能的肽。例如，該肽可與MHC分子結(jié)合，并抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的有害免疫反應(yīng)，特別是重癥肌無力。而且該肽自身可誘導(dǎo)無反應(yīng)性并應(yīng)用于疾病治療。
以下分別描述該肽和可與之形成復(fù)合物的MHC成分，并且說明該肽和復(fù)合物的制備、評(píng)價(jià)和使用方法。適于制備和使用本發(fā)明MHC肽復(fù)合物的一般方法由美國專利5,468,481和PCT專利申請(qǐng)WO96/40944公布。
本發(fā)明特別提供了新的乙酰膽堿受體(AChR)肽、MHCII類多肽和MHCII類多肽AChR肽復(fù)合物。本發(fā)明提供分離的(從天然來源)、合成的和重組產(chǎn)生的AChR肽和MHCII類多肽形式。這些肽和蛋白可在體外或體內(nèi)重組表達(dá)。使用本領(lǐng)域任何已知的方法可以制備和分離本發(fā)明的肽、多肽和復(fù)合物，本發(fā)明提供一些示例性的制備這些蛋白的方法。而且，制備MHCII類肽復(fù)合物的方法在以下文獻(xiàn)有說明，例如，美國專利5,194,425，公布于1993年3月16日；5,130,297，公布于1992年7月14日；5,284,935，公布于1994年2月8日；5,260,422，公布于1993年11月9日；和5,468,481，公布于1995年11月21日；和PCT專利申請(qǐng)NO.WO96/40944。
本發(fā)明的核酸操作和編碼AChR肽、MHCII類分子和AChR肽MHCII類肽復(fù)合物基因的重組表達(dá)技術(shù)在科學(xué)和專利文獻(xiàn)(見，例如，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd Ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1998)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.New York(1997)；和Tijssen等，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular BiologyHybridization WithNucleic Acid Probes，Part I.Theory and Nucleic AcidPreparation，Elsevier，N.Y.(1993))中描述。使用各種本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的方法在核酸內(nèi)引入突變。例如，快速實(shí)施定點(diǎn)誘變的有效方法是聚合酶鏈反應(yīng)延伸的重疊(Urban(1997)Nucleic Acids Res.252227-2228)。證實(shí)感興趣的核酸序列的測(cè)序方法多選用雙脫氧測(cè)序法(Sequenase，U.S.Biochemica1)，或本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的其它試劑盒和方法?？梢允褂酶鞣N本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的轉(zhuǎn)化原核和真核細(xì)胞的方法和體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)(見，例如，Weising(1988)Ann.Rev.Gene t.22421-477；Sambrook等；和Tijssen等，均同上)。
本發(fā)明中的AChR肽、MHCII類分子和MHCII類肽肽復(fù)合物可使用本領(lǐng)域熟知的化學(xué)方法全部或部分合成(見，例如，Caruthers(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)NucleicAcids Res.Symp.Ser.225-232；和Banga，Therapeutic Peptidesand Proteins，F(xiàn)ormulation，Processing and Delivery SystemsTechnomic Publishing Co.，Lancaster，PA(1995))。例如，可以使用不同的固相技術(shù)(見，例如，Roberge(1995)Science 269-202；和Merrifield(1997)Methods Enzymol.2893-13)合成肽，也可遵照制造者提供的使用說明利用ABI431A肽合成儀(Perkin Elmer)自動(dòng)合成肽。II.定義在此使用的“肽”或“寡肽”是指一系列殘基，尤其是兩者之間典型地通過α-氨基和鄰近氨基酸的羰基之間的肽鍵連接的L-氨基酸。只要保持正確的表位，肽的長度并不是關(guān)鍵。典型的肽長度少于約30個(gè)氨基酸，通常由約10-25個(gè)殘基，優(yōu)選14-20個(gè)殘基組成。
“AChR寡肽”是具有來源于AChR的一部分的序列，特異地結(jié)合MHC分子并誘導(dǎo)重癥肌無力相關(guān)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。寡肽可以包括來源于AChR的序列(例如，7-22或36-49位殘基)，或與之基本相似的序列。該術(shù)語在以下介紹中也包括這些序列的各種類似物。
術(shù)語“殘基”指通過酰胺鍵或酰胺鍵模擬物插入寡肽的氨基酸(D或L)或氨基酸模擬物。本發(fā)明中的肽鍵模擬物包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的變異肽主鏈。
在此使用的“氨基酸模擬物”是天然存在的氨基酸以外的部分，在結(jié)構(gòu)和功能上當(dāng)作本發(fā)明肽中氨基酸的替代物。如果這種部分基本不干擾肽結(jié)合AChR的能力，即可當(dāng)作氨基酸殘基的替代物。氨基酸模擬物包括非蛋白氨基酸，例如，β-γ-δ氨基酸、β-γ-δ亞氨基酸(例如哌啶-4-羧基酸)和許多L-α氨基酸的衍生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員已獲知許多合適的氨基酸模擬物，包括環(huán)己基丙氨酸、3-環(huán)己基丙酸、L-金剛烷丙氨酸，金剛烷乙酸等。適用于本發(fā)明的肽類似物見Morgan和Gainor(1989)Ann.Repts.Med.Chem.24243-252。
如果兩個(gè)多肽的氨基酸殘基序列在最大相關(guān)比對(duì)時(shí)相同，它們被稱為“相同”的多肽。
“序列同一性百分比”是通過在對(duì)比窗口中對(duì)比兩個(gè)最優(yōu)比對(duì)的序列而判斷，其中在兩個(gè)序列間進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)時(shí)，對(duì)比窗口中的多核苷酸或氨基酸序列部分通過與參考序列(不包括添加或刪除)比較有無添加或刪除(即空位)。百分比的計(jì)算是用兩個(gè)序列中相同核苷酸堿基或氨基酸殘基的位點(diǎn)數(shù)得到匹配位點(diǎn)數(shù)，用匹配位點(diǎn)數(shù)除以對(duì)比窗口中全部的位點(diǎn)數(shù)再乘以100，既是序列同一性百分比。
對(duì)于氨基酸或核苷酸序列所使用的術(shù)語“基本上相同”，一般指序列至少有60％相同。優(yōu)選的多肽或多核苷酸的同一性百分比可以是60％至100％間的任何整數(shù)。更優(yōu)選的實(shí)施方案包括至少80％、85％、90％、95％或99％。“基本上相似的”多肽包含以上提及的序列，除了不相同的殘基位點(diǎn)可以因?yàn)楸Ｊ氐陌被嶙兓煌！氨Ｊ氐陌被崽娲铩笔侵赣邢嗨苽?cè)鏈殘基的可交換性。例如，含脂肪側(cè)鏈的氨基酸組是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；含脂肪-羥基側(cè)鏈的氨基酸組是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸組是天冬酰胺和谷氨酰胺；含芳香側(cè)鏈的氨基酸組是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。含堿性側(cè)鏈的氨基酸組是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的氨基酸組是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸替代物組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
最佳的序列比對(duì)可以使用Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math.2482的局部同一性運(yùn)算法則，Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同一性比對(duì)運(yùn)算法則，Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)852444的相似性搜索方法，計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的這些運(yùn)算法則(GAP，BESTFIT，BLAST，F(xiàn)ASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics，Genetics Compute Group(GCG)，575 ScienceDr.，Madison，WI)或檢查。
適用于確定序列相同和相似百分比的優(yōu)選運(yùn)算法則是BLAST和BLAST2.0，該運(yùn)算法則分別見Altschul等(1977)Nuc.Acids.Res.253389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410。BLAST和BLAST2.0同此處描述的參數(shù)一起使用，確定本發(fā)明核苷酸序列和氨基酸序列同一性百分比。運(yùn)行BLAST分析的軟件可以從國家生物技術(shù)信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。對(duì)于氨基酸序列使用評(píng)分矩陣計(jì)算累積分值。字命中在各方向的延伸在遇到以下情況時(shí)中斷累積比對(duì)分值從最大獲得值中降低了量X；由于累積一個(gè)或更多的得分為負(fù)值的殘基比對(duì)，累積分值達(dá)到0或0以下；或達(dá)到任一序列的末端。BLAST運(yùn)算法則的參數(shù)W、T和X決定了運(yùn)算的敏感性和速度。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序默認(rèn)字長為3，期望值(E)為10，和BLOSUM62評(píng)分矩陣(見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915)比對(duì)(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4和兩鏈的對(duì)比。
短語“分離的”指基本上或本質(zhì)上沒有其天然狀態(tài)下通常與之伴隨的成分的物質(zhì)。
此處使用的術(shù)語“免疫優(yōu)勢(shì)”或“免疫優(yōu)勢(shì)肽”是指作為免疫反應(yīng)主要靶位的肽或肽表位。代表性的免疫優(yōu)勢(shì)肽是較其它存在的表位召集更大量的抗體并與抗體有更高的親和力的表位。這些位點(diǎn)的識(shí)別因被靶定為對(duì)抗自身免疫性疾病的靶位而重要。免疫優(yōu)勢(shì)是復(fù)合抗原(或表位內(nèi)某些殘基)中某些表位的特征，這使得它們?cè)诿庖咴曰蚩乖陨戏浅ｊP(guān)鍵。
此處使用的術(shù)語“分離的MHC成分”是指MHC糖蛋白或MHC糖蛋白的有效部分(即包括抗原結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)和被恰當(dāng)?shù)腡細(xì)胞受體識(shí)別所必須的序列)，它們不處在天然狀態(tài)，例如，與正常表達(dá)MHC的細(xì)胞的細(xì)胞膜無關(guān)。如下面的詳細(xì)描述，MHC成分可以重組產(chǎn)生，由適當(dāng)?shù)募?xì)胞源溶解產(chǎn)生或與脂質(zhì)體相關(guān)。對(duì)于人類MHC分子，特別優(yōu)選人類淋巴母細(xì)胞。
術(shù)語“重組的”用于例如，細(xì)胞、核酸、蛋白或載體時(shí)，指該細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已被異源核酸或蛋白的引入或天然核酸或蛋白的改變而修飾，或該細(xì)胞來源于如此修飾過的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)天然(非重組)形式細(xì)胞沒有的基因，或使天然基因表達(dá)異常，低表達(dá)或根本不表達(dá)。
術(shù)語“異源的”用于指核酸的部分時(shí)，是指該核酸包含天然狀態(tài)中互相不處于相同關(guān)系中的兩個(gè)或更多亞序列。例如，該核酸一般是重組產(chǎn)生，具有來源于無關(guān)基因的兩個(gè)或更多序列，它們的排列產(chǎn)生一個(gè)新的功能性核酸，比如一種來源的啟動(dòng)子和另一來源的編碼區(qū)。相似的是，異源蛋白是指天包含然狀態(tài)中互相不處于相同關(guān)系中的兩個(gè)或更多亞序列的蛋白(例如融合蛋白)。
術(shù)語“可操作性連接”是指核酸表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子、或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的排列)和另一核酸序列之間的功能性連接，其中表達(dá)控制序列指導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二個(gè)序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。III.MHC成分編碼MHC的糖蛋白在人類和鼠系統(tǒng)中已被深入研究。MHC基因復(fù)合物在小鼠被稱為H-2復(fù)合物，在人類被稱為HLA復(fù)合物。MHC糖蛋白被分為I類糖蛋白，發(fā)現(xiàn)于所有細(xì)胞表面，主要被細(xì)胞毒性T細(xì)胞識(shí)別；II類糖蛋白，發(fā)現(xiàn)于包括例如巨噬細(xì)胞等輔助細(xì)胞的一些細(xì)胞表面，參與向輔助T細(xì)胞呈遞抗原。一些組織相容性蛋白已被分離并鑒定。對(duì)于MHC糖蛋白結(jié)構(gòu)和功能的概括性綜述見Paul，F(xiàn)undamentalImmunology，2nd Ed.，Ravens Pres s N.Y.(1989)和Albert等，Molecular Biology of the Cell，2nd Ed.，Garland Publishing，Inc.，N.Y.& London(1989)。
本發(fā)明中MHCII類分子尤為有用。由伸展出細(xì)胞膜雙層的兩個(gè)II類鏈的N-末端結(jié)構(gòu)域部分構(gòu)成一個(gè)II類MHC分子。一條鏈的N-末端部分的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與MHCI類抗原序列的α1和α2區(qū)同源。MHCII類分子的抗原結(jié)合袋由α1和β1結(jié)構(gòu)域組成。II類分子兩端的結(jié)合袋開放所以能容納長的肽。HLA-DR1的三維結(jié)構(gòu)已有描述(Brown等(1993)Nature 36433)。II類基因的克隆允許II類MHC結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行以下所述的操作。
本發(fā)明復(fù)合物的MHC糖蛋白部分可通過從淋巴細(xì)胞分離并篩選其結(jié)合所需肽抗原的能力而獲得。淋巴細(xì)胞來源于用復(fù)合物處理的個(gè)體物種。例如，它們可以從患目標(biāo)自身免疫性疾病個(gè)體的人B細(xì)胞中分離，該細(xì)胞通過用本領(lǐng)域已知技術(shù)轉(zhuǎn)染復(fù)制缺陷的Epstein-Barr病毒而永生。
純化II類組織相容性蛋白的方法是本領(lǐng)域所熟知的?？梢允褂貌煌募夹g(shù)從多種細(xì)胞中分離得到。例如，該糖蛋白在蛋白酶處理、3MKCL處理或去污劑處理后溶解。優(yōu)選的方法是用去污劑從淋巴細(xì)胞抽提II類蛋白后，再進(jìn)行親和層析(見例如，Turkewitz等，(1983)MolecularImmunology 201139-1147。不同的方法已被開發(fā)用于生產(chǎn)不呈遞內(nèi)源性抗原的所需MHCII類組織相容性異源二聚體(Stern和Wiley(1992)Cell 68465-77；Ljunggren等(1990)Nature 346476-80；和Schumacher等(1990)Cell 62563-67)。
做為選擇，MHC成分也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)重組表達(dá)。一些II類蛋白的每個(gè)氨基酸序列已獲知，其基因或cDNAs也已克隆。因此，這些核酸可被用于表達(dá)MHC多肽。如果不能獲得所需的MHC基因或cDNA，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的克隆方法分離基因?？杀皇褂玫姆椒ㄊ羌兓鐼HC多肽，獲得部分氨基酸序列，根據(jù)該氨基酸序列合成核苷酸探針，使用該探針識(shí)別具有來自于cDNA或基因組文庫的所需基因的克隆?？梢詫⒔囟毯腿L的核酸與指導(dǎo)所需宿主中基因表達(dá)的信號(hào)進(jìn)行可操作性連接，從而用克隆的編碼MHC多肽的核苷酸序列表達(dá)MHC多肽。可選用許多適當(dāng)?shù)暮捅绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的宿主。
然后可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法使MHC多肽在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或通過細(xì)胞分泌。
用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的核苷酸序列可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法修飾，而產(chǎn)生具有多種所需特性的MHC多肽。許多技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，MHC多肽可通過氨基酸插入、取代、缺失等改變天然存在序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)水平。也可使用蛋白融合技術(shù)給予MHC多肽新的活性或新活性的組合?？梢岳眠@些修飾方法的一些組合產(chǎn)生最終經(jīng)修飾的MHC多肽。
可以根據(jù)多種所需目的制備氨基酸序列變體，包括重組多肽的簡易純化和制備。修飾后的多肽可有效的使用于調(diào)整治療半衰期、提高療效和減少治療時(shí)副作用的嚴(yán)重性或發(fā)生。氨基酸序列變體通常為天然不存在的預(yù)定變體，但它們顯示與天然序列MHC同樣的肽結(jié)合和T細(xì)胞結(jié)合能力。例如，可以產(chǎn)生包括僅僅一部分(通常至少約60-80％，代表性的是90-95％)一級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽片段。在某些實(shí)施方案中，MHC多肽基本上由來源于全長多肽的α1或β1結(jié)構(gòu)域組成。這些片段代表性地包括約50-100個(gè)氨基酸，優(yōu)選約60-90個(gè)，更優(yōu)選約70-80個(gè)。另外，可以選用合成法制備多肽(見，例如，Merrifield(1986)Science 232341-347；Atherton等，Solid Phase PeptideSynthesisA Practical Approach，IRL Press，Oxford)?？梢允褂冒被岱治龌驕y(cè)序(例如，the Edman degradation procedure；見，例如，Creighton Proteins，Structures and MolecularPrinciples，F(xiàn)reeman and Co.，New York NY(1983)或者使用其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的適當(dāng)?shù)姆椒ㄗC實(shí)合成肽的組成。
一般來說，編碼MHC多肽的序列的修飾可通過多種熟知的技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變(見，Gillman和Smith(1979)Gene 881-97；和Roberts等(1987)Nature 328731-734)而容易地完成?？梢酝ㄟm當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄖ械某Ｒ?guī)篩選對(duì)大多數(shù)修飾進(jìn)行所需特征的評(píng)估。例如，使用以下描述的分析方法可以輕易評(píng)估多種修飾對(duì)多肽結(jié)合肽或影響T細(xì)胞增殖的能力的影響。其它特性的修飾，例如氧化還原作用或熱穩(wěn)定性、疏水性、蛋白質(zhì)水解易受性或聚集傾向，都可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分析。
某些應(yīng)用中，修飾了MHC cDNA編碼序列，使之缺失跨膜結(jié)構(gòu)域并表達(dá)得到的可溶MHC多肽。例如可以使用寡核苷酸指導(dǎo)的缺失誘變或聚合酶鏈反應(yīng)截短MHC cDNA。寡核苷酸指導(dǎo)的體外突變可見Kunkel等(1987)Meth.Enzymol.154367-382(亦見，Ausubel等，supra)。IV.肽可以認(rèn)為，抗原呈遞細(xì)胞(APCS)表面的MHC糖蛋白呈遞抗原發(fā)生在抗原蛋白水解成小的肽單位之后。認(rèn)為這些片段長度為8-18個(gè)殘基，包括限制位(由MHC分子識(shí)別)和表位(由輔助性T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體識(shí)別)。表位自身是識(shí)別輔助性T細(xì)胞的抗原特異受體的連續(xù)的或非連續(xù)的5-6個(gè)氨基酸的序列。限制位是負(fù)責(zé)聯(lián)系肽和MHC糖蛋白的連續(xù)或非連續(xù)的序列。
例如，可以通過篩選與HLA-DR2和HLA-DR3結(jié)合的一組重疊的AChR肽，而識(shí)別MG中重要的肽?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種結(jié)合分析檢測(cè)肽與MHC復(fù)合物的結(jié)合親和力。適當(dāng)結(jié)合分析的實(shí)例是基于銪的競爭性結(jié)合分析(見，例如，Tompkins等，J.Immunol.Methods 163209-216)。而且，本發(fā)明的肽誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)的能力可以使用多種以下描述的本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。
典型地，本發(fā)明的肽將包含對(duì)應(yīng)于AChR的氨基酸序列，或與其基本相同或相似的氨基酸序列。本發(fā)明的肽可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)從天然來源分離、合成或重組表達(dá)。
具有所需活性的肽為了提供某些需要的特性而必須加以修飾，所述特性例如，在提高或至少基本保持未修飾肽結(jié)合所需MHC分子和誘導(dǎo)適當(dāng)T細(xì)胞的無反應(yīng)性的所有生物學(xué)活性同時(shí)，改進(jìn)藥理學(xué)特性。例如，肽可以有多種變化，例如保守或非保守的取代，這些變化在使用時(shí)提供某些優(yōu)勢(shì)，例如改進(jìn)MHC的結(jié)合。單氨基酸取代的效應(yīng)也可使用D-氨基酸探測(cè)。這些修飾可以使用已熟知的肽合成過程達(dá)到，描述見，例如，Merrifield(1986)Science 232341-347；Barany和Merrifield，The Peptides，Gross and Meienhofer，eds.(N.Y.，Academic Press)，pp.1-284(1979)；及Stewart和Young，SolidPhase Peptide Synthesis，(Rockford，I11.，Pierce)，2nd Ed.(1984)。
通過延伸或減少肽氨基酸序列，例如，通過添加或刪除氨基酸修飾肽。本發(fā)明的肽也可通過改變某些殘基的順序或組成而修飾，容易理解，在不對(duì)生物學(xué)活性產(chǎn)生不良影響的條件下，一般不應(yīng)改變那些生物學(xué)活性關(guān)鍵的氨基酸殘基，例如，關(guān)鍵的接觸位點(diǎn)或保守殘基。非關(guān)鍵的氨基酸不限定于天然存在于蛋白中的氨基酸，例如L-α-氨基酸或它們的D-異構(gòu)體；而是也包括非天然氨基酸，例如β-γ-δ-氨基酸和許多L-α-氨基酸的衍生物。
典型地，一系列具有單氨基酸取代的肽被用于檢測(cè)靜電、疏水性對(duì)結(jié)合等的作用。例如，在沿著肽長度的一系列正電荷(例如，Lys或Arg)或負(fù)電荷(例如Glu)氨基酸的取代，揭示了對(duì)于各種MHC分子和T細(xì)胞受體的不同敏感性模式。而且，可以使用具有小的，相對(duì)中性的部分，例如，Ala、Gly、Pro或可利用的相似殘基的多個(gè)取代。取代可為同寡聚物或異寡聚物。取代或添加殘基的數(shù)量和類型依賴于基本接觸位點(diǎn)和某些進(jìn)行探詢的功能特性(例如，親水性與疏水性)間的必須空間。這種取代較其母肽可以提高M(jìn)HC分子或T細(xì)胞受體的結(jié)合親和力。在任何情況下，這種取代應(yīng)使用經(jīng)選擇的氨基酸殘基或其它分子片段，以避免例如可能破壞結(jié)合的空間或電荷干擾。
代表性的氨基酸取代是單殘基的取代。取代、刪除、插入或它們的任何組合都可用于構(gòu)建目的肽。取代變體是指肽的至少一個(gè)殘基被移除，并且該位點(diǎn)插入了不同的殘基。當(dāng)需要精確調(diào)節(jié)太的特征時(shí)，一般根據(jù)以下表1進(jìn)行取代。
表1原始?xì)埢纠缘娜〈彼?絲氨酸精氨酸 賴氨酸；組氨酸天冬酰胺 谷氨酰胺天冬氨酸 谷氨酸半胱氨酸 絲氨酸谷氨酰胺 天冬酰胺谷氨酸 天冬氨酸甘氨酸 脯氨酸組氨酸 賴氨酸；精氨酸異亮氨酸 亮氨酸；纈氨酸亮氨酸 異亮氨酸；纈氨酸賴氨酸 精氨酸；組氨酸甲硫氨酸 亮氨酸；異亮氨酸苯丙氨酸 酪氨酸；色氨酸絲氨酸 蘇氨酸蘇氨酸 絲氨酸色氨酸 酪氨酸；苯丙氨酸酪氨酸 色氨酸；苯丙氨酸纈氨酸 異亮氨酸；亮氨酸功能上的大量改變(例如，對(duì)于MHC分子或T細(xì)胞受體的親和)由選擇較表1低保守的取代產(chǎn)生，即選擇對(duì)維持(a)取代區(qū)域的肽主鏈結(jié)構(gòu)，例如折疊或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)分子的電荷或疏水性或(c)側(cè)鏈的大小的作用更顯著不同的殘基。一般期望產(chǎn)生肽特性最大改變的取代是(a)用親水性殘基，例如絲氨酸，取代疏水性殘基，例如，亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸，或前者被后者取代；(b)用具有正電性側(cè)鏈的殘基，例如，賴氨酸、精氨酸或組氨酸，取代負(fù)電性殘基，例如，谷氨酸或天門冬氨酸；或前者被后者取代；或(c)用具有大側(cè)鏈的殘基，例如，苯丙氨酸，取代不具有側(cè)鏈的氨基酸，如谷氨酸，或前者被后者取代。
該肽也可包括免疫原性肽上的兩個(gè)或多個(gè)殘基的同型空間配位體。此處同型空間配位體的含義是兩個(gè)或更多殘基的一個(gè)序列可以取代另一序列，因?yàn)榈趥€(gè)序列的空間構(gòu)象適合于第二個(gè)序列的特異結(jié)合位點(diǎn)。該術(shù)語特別包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的肽主鏈的修飾。這種修飾包括酰胺氮、α-碳、酰胺羰基的修飾、酰胺鍵的完全取代、伸展、刪除或主鏈交聯(lián)(一般見，Spatola，Chemistry and Biochemistry ofAmino Acids，Peptides and Proteins，Vol.VII(WeinsteinEd.，1983))。
而且，可以通過與其它分子的鍵而修飾肽。例如，可以引入不同的N-或C-端基對(duì)分子的物理和/或化學(xué)特性進(jìn)行改變。這些改變可以用于影響，例如，分子的粘附、穩(wěn)定性、生物可利用度、定位或檢測(cè)。對(duì)于診斷的目的，多種標(biāo)記可以和末端連接，直接或間接提供可檢測(cè)信號(hào)。因此，本發(fā)明肽可以根據(jù)最終目的，使用多種方法進(jìn)行修飾而仍舊保持生物活性。
因此，除了直接來源于AChR氨基酸序列的肽，這些序列的一些構(gòu)象類似物也可使用。在此使用的“構(gòu)象類似物”是空間或兩極組織與結(jié)合于MHC成分的AChR氨基酸序列十分相似的分子。本發(fā)明的構(gòu)象類似物可以完全由發(fā)現(xiàn)于AChR序列以外的氨基酸殘基構(gòu)成。V.復(fù)合物的形成本發(fā)明的可溶性MHC異源二聚體肽復(fù)合物可以用作治療性阻斷特定T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合的拮抗劑。而且，該分子可以誘導(dǎo)目標(biāo)T細(xì)胞的無細(xì)胞免疫反應(yīng)性或增生無反應(yīng)性。
該復(fù)合物的元件可以使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)合。例如，混合兩種組分，抗原肽可以與MHC蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)非共價(jià)結(jié)合。使用任何一種標(biāo)準(zhǔn)程序，例如超濾或透析可以除去過量的肽。使用標(biāo)準(zhǔn)程序，例如，光親和標(biāo)記(見，例如，Hall(1985)Biochemistry 245702-5711；Leuscher(1990)J.Biol.Chem.26511177-11184；Wraith(1989)Cell 59247-255)或其它任何適當(dāng)?shù)逆I方式(見，例如，Husain(1995)Biochem.Mol.Biol.Int.36669-677；Traut(1995)Biochem.Cell Biol.73949-958；Haselgrubler(1995)Bioconjug.Chem.6242-248；和Carroll(1994)Bioconjug.Chem.5248-256)它們也可以與抗原結(jié)合袋共價(jià)結(jié)合。
另外，II類肽復(fù)合物可以設(shè)計(jì)為一個(gè)連續(xù)的重組多肽(見，例如，PCT公開WO96/40944，1996年12月19日；WO96/40194，1996年12月19日；和WO97/04360，1997年11月6日)。定位于期望的自身免疫性疾病(例如，重癥肌無力)的可溶性融合MHC異二聚體肽分子含有與該自身免疫性疾病相關(guān)的抗原肽(例如，AChR肽)，該抗原肽恰當(dāng)位于NHC分子的結(jié)合溝，而不需溶解MHC或外源性加載獨(dú)立制造的肽。在該復(fù)合物中，MHC成分和抗原肽永久連接成單鏈構(gòu)象。這些復(fù)合物消除無效和非特異肽加載。通過重組法生產(chǎn)要求保護(hù)的MHC肽復(fù)合物可以產(chǎn)生特異和高產(chǎn)的蛋白，終產(chǎn)品僅包括所選擇的適當(dāng)構(gòu)象的MHC肽復(fù)合物。
使用已知每個(gè)氨基酸的密碼子可以合成編碼肽的寡核苷酸。優(yōu)選使用那些在用于表達(dá)的生物體中優(yōu)選利用的密碼子設(shè)計(jì)寡核苷酸。本領(lǐng)域已獲知多種生物體和細(xì)胞類型的密碼子優(yōu)選利用。利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，適當(dāng)?shù)男蛄锌梢該饺刖幋a來源于MHC成分的肽的序列。摻入位點(diǎn)使得當(dāng)分子表達(dá)和折疊時(shí)，AChR肽抗原結(jié)合將與MHC成分的抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，并且作為目標(biāo)T細(xì)胞的一個(gè)表位。
例如，使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，此處公開的AChR肽可以與源于MG相關(guān)MHC抗原的多肽的N-端抗原結(jié)合位點(diǎn)相連接。如果該重組復(fù)合物使用于小鼠，則AChR肽可以摻入應(yīng)編碼I-Ab-α或I-Ab-β鏈的序列。如果AChR肽將被摻入β鏈，寡核苷酸作為前導(dǎo)肽的取代物插入。本領(lǐng)域已知替代多核苷酸中序列的方法。
可以使用相似的方案把AChR肽摻入編碼源于適當(dāng)?shù)娜祟怘LA抗原的肽的序列。例如，人類單倍型DR2W2與MG相關(guān)。因此，AChR肽可被摻入編碼DR2等位基因β-鏈的序列。已知DR亞區(qū)中負(fù)責(zé)主要血清學(xué)特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)DR1-9，來源于多種DR單倍型的編碼HLA-DR-β鏈的序列也是已知的(見，例如，Bell等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA846234-6238)。
自身免疫抗原肽和MHC成分可以通過肽鍵鏈接。然而，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員還有其它顯而易見的鍵方式，包括，例如，通過糖蛋白的糖基團(tuán)連接，包括，例如，α-和/或β-鏈的糖成分。
評(píng)定可溶性融合MHC異二聚體肽復(fù)合物的物理和生物學(xué)特性有多種方法。本領(lǐng)域常規(guī)使用例如電噴射和矩陣輔助激光解吸附(Matrix-Assisted Laser Desorption)/Flight質(zhì)譜離子化時(shí)間(Ionization Time Of Flight mass spectrometry)(MALDI TOF)分析法，提供分子量等信息和證實(shí)二硫鍵構(gòu)象。使用FACs分析檢測(cè)單鏈復(fù)合物適當(dāng)折疊。一些標(biāo)準(zhǔn)分析法，例如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)可用于進(jìn)一步檢測(cè)可溶性融合MHC的濃度和證實(shí)正確折疊(見，例如，WO96/40944)。VI.檢測(cè)本發(fā)明肽和復(fù)合物誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)本發(fā)明的肽和AChRMHCII類分子可以使用本領(lǐng)域熟知的多種體外模型進(jìn)行分析。
僅MHCII類肽與TCR結(jié)合不足以激活CD4+T細(xì)胞。需要額外的“共刺激”信號(hào)。本發(fā)明MHCII類肽復(fù)合物與TCR的相互作用缺少共刺激信號(hào)。因此，也誘導(dǎo)抗原特異的T細(xì)胞的無反應(yīng)性(Boussiotis(1994)Curr.Opin.Immunol.6797-807；Park(1997)Eur.J.Immunol.271082-1090)。該“耐受”或“無細(xì)胞免疫反應(yīng)性”免疫抑制和再激發(fā)無反應(yīng)性可由T細(xì)胞克隆無細(xì)胞免疫反應(yīng)性、免疫抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的無反應(yīng)性實(shí)現(xiàn)(Schwartz(1989)Cell 571073-1081；Quill(1987)J.Immunol.1383704-3712)。通過監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝、細(xì)胞因子或淋巴因子分泌或任何形式的細(xì)胞活化來檢測(cè)免疫抑制或再激發(fā)無反應(yīng)性(即耐受，無細(xì)胞免疫反應(yīng)性)的程度。
本發(fā)明的肽誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)可以同樣使用上述方法檢測(cè)。
T細(xì)胞活化可以使用本領(lǐng)域熟知的多種方法檢測(cè)。例如，通過檢測(cè)3H-胸苷攝入或3-(4，5-二甲基-噻唑-2-7’)-2，5二苯基溴化四唑鎓攝入而分析T細(xì)胞增生(見，例如，Liu(1997)J.Neurochem.69581-593)。另外，由于T細(xì)胞在激活時(shí)合成并分泌細(xì)胞因子，MHCII類肽復(fù)合物的免疫抑制效應(yīng)和由本發(fā)明的肽誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)可通過檢測(cè)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄、翻譯或分泌而評(píng)估。因此，可以定量各種細(xì)胞因子和淋巴因子，例如，白細(xì)胞介素、干擾素(INFs)(例如，gamma INF)、腫瘤壞死因子(TNFs)(例如，TNFβ)等。檢測(cè)細(xì)胞因子和淋巴因子產(chǎn)生和/或分泌的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于免疫測(cè)定，例如酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)。
其它可使用的測(cè)定方法包括ELISPOT測(cè)定法。ELISPOT測(cè)定法是ELISA方法的改進(jìn)，可以檢測(cè)反應(yīng)于抗原刺激的個(gè)體T細(xì)胞的淋巴因子分泌(Czerkinsky等，(1998)J.Immunol.Methods 11029-36)。該方法在濾紙(例如，硝酸纖維素或PVDF濾紙)上平鋪捕獲特定淋巴因子的單克隆抗體并在微孔中加入外周血單核細(xì)胞(PBMCs)+抗原。T細(xì)胞在刺激時(shí)分泌的淋巴因子被平鋪的抗淋巴因子抗體局部捕獲。捕獲期(一般24小時(shí))結(jié)束時(shí)沖洗掉細(xì)胞并檢測(cè)分泌的淋巴因子。使用本發(fā)明的ELISPOT測(cè)定法可以測(cè)量不同淋巴因子的分泌，包括，IL-2，IL-4等。分泌的淋巴因子可以使用例如，二級(jí)抗淋巴因子抗體檢測(cè)。該二級(jí)抗淋巴因子抗體可以被標(biāo)記或直接或間接與標(biāo)記或容易檢測(cè)到的酶(例如，堿性磷酸酶)偶聯(lián)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以獲知并得到本發(fā)明內(nèi)容中可以使用的各種標(biāo)記物和酶。在被刺激T細(xì)胞分泌淋巴因子的部位出現(xiàn)班點(diǎn)。該技術(shù)較ELISA法更敏感，并被許多研究小組應(yīng)用于MG患者T細(xì)胞反應(yīng)性的研究(見，例如，Link等(1991)J.Clin.Invest.872191-2196；Sun等，(1992)Eur.J.Immnuol.21553-1559；Yi等(1994)J.Neuroimmunol.50177-186；Newsom-Davis等(1989)J.Autoimmun.2101-108；Ahlberg等(1992)J.Immunol.36435-442；Link等(1992)J.Immunol.36405-414)。
ELISPOT測(cè)定法的一種改進(jìn)方法稱為克隆擴(kuò)充ELISA斑(或CEE-SPOT)測(cè)定法，也可在本發(fā)明內(nèi)容中使用。CEE-SPOT測(cè)定法中，在合適的時(shí)間(例如，7天)中用抗原刺激PBMCs，以便在再刺激和淋巴因子捕獲之前(例如，第10天)促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞增殖。這種反應(yīng)性T細(xì)胞的克隆擴(kuò)充明顯地提高了測(cè)定敏感性。使用這種測(cè)定可以測(cè)量產(chǎn)生的淋巴因子，包括，如IL-2，IL-4等。一般說來，淋巴因子在濾紙上被捕獲，優(yōu)選PVDF濾紙，以改進(jìn)班點(diǎn)的本底和強(qiáng)度。一般使用攝象機(jī)成像和計(jì)算機(jī)分析進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。該測(cè)定類型也可先使用完整蛋白刺激T細(xì)胞，再用來源于蛋白的肽刺激，以便識(shí)別來源于天然加工的表位。
已經(jīng)觀察到，延長用可溶性MHCII類肽復(fù)合物孵育靜止T細(xì)胞的時(shí)間導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡，所以亦可監(jiān)測(cè)細(xì)胞死亡(Arimilli(1996)Immunol.Cell Biol.7496-104)。細(xì)胞死亡可以通過多種已知的方法檢測(cè)，例如，染料排斥通透性。凋亡的評(píng)估可以使用，例如，細(xì)胞DNA斷裂、觀察(用推進(jìn)電子顯微鏡)、凋亡相關(guān)蛋白例如bc1-2等的檢測(cè)和定量等(見，例如，Arimilli(1996)supra)。
本發(fā)明的可溶性MHC異二聚體肽復(fù)合物也可使用一些自身免疫反應(yīng)動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)檢測(cè)，特別是實(shí)驗(yàn)性過敏性重癥肌無力模型。VII.本發(fā)明藥物組合物的制劑和給藥如果包括MHC亞基的跨膜區(qū)，本發(fā)明的組合物在摻入脂單層或雙層后可便利的給藥。為此目的一般使用脂質(zhì)體，但也可使用任何形式的脂膜，例如細(xì)胞(例如，紅細(xì)胞)的細(xì)胞膜或平面脂膜。該組合物也可便利地?fù)饺胛⒛z粒(micelle)中。
使用以下描述的標(biāo)準(zhǔn)方法制備脂質(zhì)體。然而，如果去除跨膜區(qū)，該組合物可以以一種用于含肽藥物的方式便利地給藥。
給藥是全身的，并在注射后起效，優(yōu)選為靜脈注射，因此可以使用與注射給藥途徑相容的制劑。適當(dāng)?shù)闹苿┮娪赗emington’sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)。可以制備多種包括本發(fā)明復(fù)合物的和藥物學(xué)有效載體的組合物。該藥物組合物適于多種藥物遞送系統(tǒng)。本藥物遞送方法簡要綜述于Langer(1990)Science 2491527-1533。
制備本發(fā)明的藥物組合物時(shí)，經(jīng)常需要修飾本發(fā)明的復(fù)合物，以改變它們的藥代動(dòng)力學(xué)特性和生物分布。藥代動(dòng)力學(xué)一般的討論見Remington’s Pharmaceutical Science，Supra，Chapters 37-39。本領(lǐng)域的任何普通技術(shù)人員都知道改變藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布的多種方法(見，例如，Langer，Supar)。例如，增加復(fù)合物血清半衰期的方法包括去除參與將該化合物從血流中清除的糖類的處理。優(yōu)選地，基本上所有的糖部分通過處理被去除。如果至少約75％，優(yōu)選約90％，最優(yōu)選約99％的糖部分被去除，則認(rèn)為基本上所有的糖部分通過處理被去除。與蛋白、多糖或如聚乙二醇的合成聚合物等可溶性大分子的偶聯(lián)同樣起效。其它方法包括保護(hù)小泡內(nèi)的復(fù)合物，所述復(fù)合物由蛋白、脂類(例如脂質(zhì)體)、糖或合成聚合物組成。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)表面活性劑可以在本發(fā)明中使用。適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┌?，月桂酸鈉、油酸鈉、月桂基硫酸鈉、辛氧基乙二醇單十二烷基醚、octoxyno19和PLURONIC F-127(WyandotteChemicals Corp.)。優(yōu)選的表面活性劑是與靜脈注射相容的非離子型聚氧乙烯和聚氧丙烯去污劑，例如TWEEN-80，PLURONIC F-68等。優(yōu)選的去污劑是十二烷基-β-麥芽糖。而且，如描述在脂質(zhì)體生產(chǎn)中所使用的磷脂也可作為微膠粒形成。
由于本發(fā)明的MHC亞基包含親脂跨膜區(qū)和相對(duì)親水的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，在常規(guī)表面活性劑或磷脂和亞基的存在下形成混合的微膠粒。本發(fā)明的混合微膠?？梢园魏蝸喕⒘字?或表面活性劑的組合。因此，微膠?？砂瑏喕腿ノ蹌喕字腿ノ蹌┑慕M合，或亞基和磷脂。
對(duì)于包含本發(fā)明復(fù)合物的藥物組合物，劑量的變化應(yīng)根據(jù)，例如，特定復(fù)合物、給藥方式、治療的不同疾病和其嚴(yán)重性、患者的總體健康和狀況以及處方醫(yī)生的判斷。鼠類的給藥劑量一般為約10μg至500μg。優(yōu)選的總體劑量為約50μg至300μg。例如，在疾病的治療過程中，三次25μg或100μg的劑量有效?？倓┝糠秶鸀榧s0.015至15μg/kg，優(yōu)選為約0.15至10μg/kg。
藥物組合物用于腸胃外、表面、口服或局部給藥，例如通過氣溶膠或經(jīng)皮給藥，用于預(yù)防和/或治療性處理。藥物組合物根據(jù)給藥方式可以以各種單位劑型給藥。例如，適于口服給藥單位劑型包括粉劑、片劑、藥丸和膠囊。
藥物組合物優(yōu)選靜脈給藥。因此，本發(fā)明提供用于靜脈給藥的組合物，包含溶解或懸浮于可接受載體，優(yōu)選水性載體的復(fù)合物溶液。可以使用各種水性載體，例如，水、緩沖液、0.4％的鹽水等。例如，磷酸緩沖液(PBS)特別適于本發(fā)明可溶復(fù)合物的給藥。優(yōu)選的制劑是含0.02％TWEEN-80的PBS。這些組合物可以使用常規(guī)的已知技術(shù)滅菌或過濾滅菌。得到的水溶液可以被包裝進(jìn)行使用，例如凍干，凍干制劑在給藥前應(yīng)與無菌水溶液混合。該組合物可以包含藥學(xué)可接受的使之接近生理狀況的輔助物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、潤濕劑等，例如，醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸鹽等。
復(fù)合物的濃度變化范圍較廣，即從最少約0.05重量％，通常為或至少約1重量％至10-30重量％，主要按照所選用的特定給藥方式根據(jù)液體體積，粘度等選擇。優(yōu)選的靜脈給藥濃度是PBS的約0.02-0.1％或更多。
對(duì)于固體組合物，可以使用常規(guī)的無毒固體載體，包括，例如藥用級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對(duì)于口服給藥，藥學(xué)可接受的無毒組合物通過摻入任何常規(guī)使用的賦形劑，如以上列出的載體和一般為10-95％的活性成份而形成。
對(duì)于氣溶膠給藥，復(fù)合物優(yōu)選以極細(xì)的形式與表面活性劑和推進(jìn)劑(propellant)一起給藥。表面活性劑當(dāng)然必須無毒優(yōu)選為溶于推進(jìn)劑。這些試劑的代表是包含6至22個(gè)碳原子的脂肪酸例如，己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油硬酸和油酸與脂肪族多元醇或其環(huán)酐，例如，乙二醇、甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇、山梨糖醇、衍生于山梨糖醇的己糖醇酐的酯或部分酯，以及這些酯的聚氧乙烯和聚氧丙烯衍生物?；旌硝?，例如混合或天然甘油酯也可使用。表面活性劑可以構(gòu)成組合物的0.1重量％至20重量％，優(yōu)選0.25％-5重量％。組合物的平衡一般是推進(jìn)劑。液化的推進(jìn)劑一般在環(huán)境條件下氣化，在壓力下濃縮。適當(dāng)?shù)囊夯七M(jìn)劑是包含5個(gè)碳原子的低級(jí)烷，例如丁烷和丙烷；優(yōu)選氟化或氟氯化烷。上述物質(zhì)的混合也可使用。生產(chǎn)氣溶膠時(shí)，用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑填充裝備合適閥門的容器，容器中包含極細(xì)的化合物和表面活性劑。該成分因此在高壓下維持直到閥門打開時(shí)釋放。
包含該復(fù)合物的組合物可用于治療、預(yù)防或診斷應(yīng)用。在治療應(yīng)用方面，組合物以足夠治愈或至少部分緩解該疾病和并發(fā)癥癥狀的量給藥于已經(jīng)患上述疾病的患者。足夠達(dá)到該效果的量被定義為“治療有效量”。該用途的有效量取決于疾病的嚴(yán)重性和患者的體重及一般狀況。如前面的討論，代表性的給藥量為約0.5mg/kg至約25mg/kg，優(yōu)選約3至15mg/kg。
在預(yù)防應(yīng)用方面，將包含本發(fā)明復(fù)合物的組合物給藥于易患特定疾病或具有患特定疾病危險(xiǎn)性的患者。該量被定義為“預(yù)防有效量”。此用途的精確給藥量仍依賴于患者的健康狀況和體重。該量一般在上述范圍內(nèi)。
在診斷應(yīng)用方面，將包含適當(dāng)復(fù)合物或其混合物的組合物給藥于懷疑具有自身免疫性疾病狀態(tài)的患者，以便判斷與疾病相關(guān)的自身反應(yīng)T細(xì)胞的存在。另外，也可監(jiān)測(cè)特定治療的效果。足夠達(dá)到該效果的量被定義為“診斷有效量”。該用途的精確給藥量依賴于患者的健康狀況等，一般在每劑0.01至1000mg，尤其是每個(gè)患者約10至100mg。
試劑盒也能應(yīng)用于治療或診斷用途。因此，本發(fā)明的組合物可以以容器中凍干的形式提供。試劑盒中包含可能與標(biāo)記或毒素偶聯(lián)的復(fù)合物，或非偶聯(lián)的復(fù)合物，以及Tris、磷酸鹽、碳酸鹽等緩沖液，穩(wěn)定劑，殺生物劑，血清白蛋白等的惰性蛋白和一套使用說明?；趶?fù)合物的量，這些物質(zhì)一般少于約5wt％，基于蛋白濃度，通常其總量至少占約0.001wt％。往往需要包含惰性補(bǔ)充劑或賦形劑，以稀釋活性成份，其中賦形劑可以占總組合物的約1-99wt％。在一種測(cè)定中使用了可以與復(fù)合物結(jié)合的抗體，它通常存在于獨(dú)立的管瓶中。按照本領(lǐng)域公知的技術(shù)可以將抗體與標(biāo)記偶聯(lián)和配制。
本說明書引用的所有出版物和專利申請(qǐng)?jiān)诖艘胱鳛閰⒖?，正如每個(gè)出版物和專利申請(qǐng)都特別地和獨(dú)立地引入作為參考。
雖然前述的發(fā)明已經(jīng)通過以清楚理解為目的的圖解和實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都顯然容易理解根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)可以進(jìn)行某些改變和修飾，而不離開所附權(quán)利權(quán)利要求的精神或范圍。VI.實(shí)施例實(shí)施例1檢測(cè)對(duì)HLA-DR結(jié)合一組重疊AChR肽的IC50值通過解離增強(qiáng)的lenthanide免疫熒光測(cè)定(“DELFIA”)競爭結(jié)合測(cè)定，檢測(cè)一組68個(gè)重疊AChRα肽(具有7個(gè)氨基酸重疊的14聚體)對(duì)HLA-DR4的相對(duì)親和力。圖1說明在對(duì)HLA-DR2和HLA-DR3親和力的DELFIA測(cè)定中檢驗(yàn)的重疊AChR肽的位置。顯示出了AChRα亞基序列，每個(gè)跨膜區(qū)(M1-M4)以有陰影的框表示。10倍稀釋(優(yōu)選1-100，000nM)的非標(biāo)記AChRα肽與生物素化的髓磷脂堿性蛋白肽MBP84-102在pH5.5下共同孵育，檢測(cè)結(jié)合溶解HLA-DR2(DRB1*1501和DRB5*0101的混合物)或HLA-DR3(DRB1*0301和DRB3*0101的復(fù)合物)的IC50。IC50的檢測(cè)優(yōu)選使用銪-鏈霉抗生物素解離增強(qiáng)的lenthanide免疫熒光測(cè)定(DELFIA)，IC50的計(jì)算一般通過使用含軟件程序SOFTmaxPro的4參數(shù)擬合分析。圖2列出了結(jié)合HLA-DR2和HLA-DR3的每個(gè)AChR肽的IC50值。圖3的1/IC50圖顯示了這些肽的相對(duì)親和力。該圖說明了與HLA-DR1-4具有最高相對(duì)親和力的AChRα肽相對(duì)位置。與HLA-DR2具有高的相對(duì)親和力的肽包括AChRα7-22、113-126、204-217、310-327、419-437和421-434。
基于與噬菌體展示文庫的結(jié)合研究，合成肽及洗脫肽的測(cè)序，一些研究小組已經(jīng)報(bào)道了與DRB1*1501和DRB5*0101結(jié)合的結(jié)合基序。與DR2顯示高親和力的肽片段被發(fā)現(xiàn)包含文獻(xiàn)引證的潛在的T細(xì)胞表位和共有DR2結(jié)合基序。圖4說明匹配這些提出的基序的與HLA-DR2具有高親和力的AChRα肽的可能排列。與HLA-DR3具有高親和力的肽少于與HLA-DR2具有高親和力的肽。顯示高親和力的肽包括7-22、36-49、145-163、195-212和400-413。DR3肽基序以n+3位幾乎普遍存在D殘基為特征，其中n是結(jié)合DR3袋1的錨定殘基。圖5說明匹配這些提出的基序的與DR3具有高親和力的AChRα肽的可能排列。圖6基于IC50≤10,000nM列出與DR2和DR3相關(guān)的候選免疫優(yōu)勢(shì)肽的總結(jié)。
而且，一組69個(gè)合成重疊AChRα肽(14個(gè)氨基酸中重疊7位)與HLA-DR4的相對(duì)親和力是使用溶解的DR4通過基于銪的競爭結(jié)合測(cè)定而檢測(cè)的。計(jì)算抑制已知DR4結(jié)合肽的50％的結(jié)合所要求的AChRα肽濃度?；贗C50值鑒別高親和力肽。
表2總結(jié)了從ELISPOT研究中選出的五個(gè)高親和力DR2結(jié)合肽的結(jié)果。這些肽和它們的IC50值都在表2中給出。表2結(jié)合HLA-DR2表現(xiàn)出低IC50值的AChRα肽片段。較低的IC50值說明對(duì)HLA-DR的較高結(jié)合親和力。
*IC50值絕對(duì)高于標(biāo)準(zhǔn)值實(shí)施例2AChR肽的T細(xì)胞反應(yīng)性上述肽對(duì)患者和正常健康個(gè)體PBMCs的T細(xì)胞反應(yīng)性通過改進(jìn)的ELISPOT測(cè)定檢測(cè)。本研究包括從30位正常人和9位MG患者處得到的PBMCs。檢測(cè)T細(xì)胞活性時(shí)，上述肽與TT/PPD為陽性對(duì)照，培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。簡言之，將PBMCs和抗原孵育7天，第8天進(jìn)行抗原特異性克隆擴(kuò)充。對(duì)每個(gè)抗原進(jìn)行的抗原特異性細(xì)胞刺激特征通過檢測(cè)到的γ-IFN的分泌而測(cè)量，γ-IFN的分泌是使用一對(duì)抗-γIFN抗體檢測(cè)斑點(diǎn)數(shù)而檢測(cè)。每個(gè)抗原獲得的斑點(diǎn)數(shù)通過從培養(yǎng)基對(duì)照獲得的斑點(diǎn)數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)。對(duì)每個(gè)PBMC樣品和抗原都確立了定義為抗原的斑點(diǎn)數(shù)和培養(yǎng)基對(duì)照的斑點(diǎn)數(shù)的比值的反應(yīng)指數(shù)。圖7和8分別給出了用于正常和患者PBMCs的反應(yīng)指數(shù)對(duì)抗原的圖形。
對(duì)比患者和正常個(gè)體的分析結(jié)果，沒有發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞對(duì)所檢測(cè)的5個(gè)AcHR表位反應(yīng)性的明顯不同。如所期望的，一些MG患者顯示了對(duì)這些所檢測(cè)AcHR表位的反應(yīng)性，但是其中并無顯示高反應(yīng)性的患者。有趣的是，正常PBMCs也顯示了對(duì)這些自身抗原表位的反應(yīng)性。這明顯表明，包括T細(xì)胞對(duì)特定抗原的反應(yīng)性的一些其它因素，可能導(dǎo)致活躍疾病過程的起始。類似的研究也在多發(fā)性硬化和其它自身免疫性疾病中進(jìn)行。
雖然在改項(xiàng)目中研究的患者數(shù)量比正常健康個(gè)體少的多，患者和正常健康個(gè)體中T細(xì)胞的任何初步反應(yīng)趨勢(shì)的存在得到了檢測(cè)。對(duì)比了反應(yīng)指數(shù)大于2的患者或正常健康個(gè)體的百分比。DR2+患者中反應(yīng)趨勢(shì)的存在也同樣得到檢測(cè)。圖9和圖10給出該數(shù)據(jù)分析的結(jié)果。
如果忽略所有正常健康個(gè)體和患者的HLA型，對(duì)AcHR421-434、400-413和36-49肽有反應(yīng)性的患者百分比大約是對(duì)這些肽有反應(yīng)性的正常健康個(gè)體百分比的兩倍。這進(jìn)一步說明這些肽可能是活躍疾病過程中的致病性T細(xì)胞表位。僅有DR2+患者的相似分析說明，除了AcHRα204-217的所有肽都可能是致病性T細(xì)胞表位。
因此，檢測(cè)的69條AcHRα肽中，5條顯示了與DR2的高結(jié)合親和力(見實(shí)施例1)，這5條中的4條顯示了與正常個(gè)體相比，對(duì)MG患者有偏倚的T細(xì)胞反應(yīng)性。
根據(jù)前述的說明可以理解，盡管為了說明的目的在此描述了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，可以在不離開本發(fā)明的精神和范圍的前提下進(jìn)行各種修改。
權(quán)利要求
1.一種組合物，包含一種分離的AChR寡肽，該寡肽包含約12-20個(gè)氨基酸殘基，其中寡肽與一種選自以下組的肽具有基本相似的序列LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中肽的序列選自LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中的肽包含一種D-氨基酸或氨基酸模擬物。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中的寡肽是一種免疫優(yōu)勢(shì)肽。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中的肽與具有一種抗原結(jié)合位點(diǎn)的分離的MHCII類成分相結(jié)合，其中肽與抗原結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中MHC成分是一種HLA-DR2分子。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中肽選自LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQ。
8.權(quán)利要求5的組合物，其中MHC成分是一種HLA-DR3分子。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中肽選自LVAKLFKDYSSVVRPVQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYKFVMQRLPL。
10.一種組合物，包含一種抗原肽和一種具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的分離的MHC成分，其中抗原肽與抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，并且其中的肽與一種選自以下組的肽具有基本相似的序列LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中MHC成分是HLA-DR2。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中肽選自LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQ。
13.權(quán)利要求10的組合物，其中MHC成分是HLA-DR3。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中肽選自LVAKLFKDYSSVVRPVQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
15.一種藥物組合物，包含藥學(xué)可接受的載體和權(quán)利要求1的肽。
16.權(quán)利要求15的藥物組合物，其中肽與分離的MHCII類分子結(jié)合。
17.權(quán)利要求16的藥物組合物，其中MHC成分選自HLA-DR2和HLA-DR3。
18.一種治療患者的重癥肌無力的方法，包括給予患者權(quán)利要求15的藥物組合物。
19.一種治療患者的重癥肌無力的方法，包括給予患者權(quán)利要求16的藥物組合物。
20.一種治療患者的重癥肌無力的方法，包括給予患者權(quán)利要求17的藥物組合物。
21.一種誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物中靶T細(xì)胞的無反應(yīng)性的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物一種治療有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含一種抗原肽和一種具有抗原結(jié)合位點(diǎn)的分離的MHCII類成分，其中抗原肽與抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，并且其中抗原肽與一種選自以下組的肽具有基本相似的序列LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFITIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
22.權(quán)利要求21的方法，其中抗原肽的序列選自LVAKLFKDYSSVVRPVVEVTVGLQLIQLINTGHITWTPPAIFKSHFVMQRLPLYFIVNNWVRKFIDTIPNIMFFSIPNIMFFSTMKRPSREKQQLIQLINVDEVNQIMKLGTWTYDGSVVAINPESDDTPYLDITYHFVMQRLPL。
23.權(quán)利要求21的方法，其中MHC成分是HLA-DR2。
24.權(quán)利要求21的方法，其中MHC成分是HLA-DR3。
25.權(quán)利要求21的方法，其中藥物組合物經(jīng)靜脈內(nèi)給藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及自身免疫性疾病，特別是重癥肌無力的治療。本發(fā)明提供來源于乙酰膽堿受體的新的自身免疫優(yōu)勢(shì)肽，并提供制備該肽的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含這些與適當(dāng)?shù)闹饕M織相容性復(fù)合物(MHC)分子結(jié)合的肽的復(fù)合物及制備這些復(fù)合物的方法。本發(fā)明中的復(fù)合物可以用于重癥肌無力的治療和預(yù)防性處理。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1432024SQ01810422
公開日2003年7月23日 申請(qǐng)日期2001年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月31日
發(fā)明者S·德斯潘德, E·斯帕克, N·韋納, S·阿里米利 申請(qǐng)人:科里克薩公司