專(zhuān)利名稱(chēng)：抗表皮生長(zhǎng)因子受體的人源化抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人源化抗體及其片段，特別是，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)特異的人源化抗體。
背景技術(shù)：
EGFR是一種腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面抗原，是眾所周知的抗體的靶標(biāo)。Durrant等人(Prenatal Diagnosis，14，131-140，1994)描述了一種小鼠單克隆抗體，稱(chēng)為“340”，它可與EGFR高特異性地結(jié)合。表達(dá)該抗體的細(xì)胞系保藏于ECACC，保藏號(hào)為97021428。單克隆抗體340針對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系791T。免疫沉淀研究表明，340識(shí)別來(lái)自骨肉瘤腫瘤和胎盤(pán)組織的一種分子量為170kDa的膜糖蛋白。對(duì)純化抗原的末端氨基酸測(cè)序顯示與表皮生長(zhǎng)因子受體有序列同一性。為了證實(shí)340抗原是EGF受體，放射性標(biāo)記的EGF和EGF受體抗體顯示與S340抗體抗原結(jié)合。而且，340能與EGF競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合其受體，EGF能與340競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合其抗原。大量研究表明，340能與結(jié)腸直腸、胃、卵巢、骨肉瘤腫瘤細(xì)胞系結(jié)合。該抗體也能識(shí)別胚胎滋養(yǎng)層，并且已經(jīng)用于從母體血液中分選胎細(xì)胞。
其它幾種小鼠單克隆抗體顯示可識(shí)別EGF受體。它們大致分為兩類(lèi)可與受體結(jié)合但不抑制EGF結(jié)合的抗體，可與受體結(jié)合并且抑制EGF結(jié)合的抗體。340單克隆抗體屬于后者。
發(fā)現(xiàn)患者對(duì)嚙齒動(dòng)物抗體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答限制了嚙齒動(dòng)物(特別是小鼠)單克隆抗體在人類(lèi)治療和體內(nèi)診斷中的應(yīng)用?；颊弋a(chǎn)生所謂的“HAMA”(人抗小鼠抗體)反應(yīng)限制了抗體到達(dá)其抗原靶標(biāo)的能力，使抗體的效能降低。為了減少HAMA反應(yīng)，研制了嵌合抗體，其中小鼠可變(V)區(qū)與人恒定(C)區(qū)連接。該抗體證明在臨床上有用，但是小鼠V區(qū)成分仍為患者中產(chǎn)生免疫原性提供了基礎(chǔ)(LoBuglio等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，86，4220-4224，1989)。因此發(fā)展了人源化抗體技術(shù)，用于將嚙齒動(dòng)物抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)移植到人V區(qū)上并與人C區(qū)連接，產(chǎn)生“非人類(lèi)”成分只是與人構(gòu)架區(qū)相鄰的CDR的抗體。然而，不久即認(rèn)識(shí)到，簡(jiǎn)單移植CDR通常導(dǎo)致人源化抗體親和力降低，因此為了恢復(fù)親和力需要在人V區(qū)構(gòu)架中引入某些非人類(lèi)氨基酸。
生產(chǎn)人源化抗體的這些方法的共同方面是生產(chǎn)在人體中基本沒(méi)有免疫原性的抗體。然而，實(shí)現(xiàn)手段是向嚙齒動(dòng)物抗體中引入盡可能多的人類(lèi)序列。眾所周知，某些短肽序列或“表位”在人體中可能有免疫原性。因此發(fā)展了通過(guò)計(jì)算機(jī)分析鑒定這些表位并置換氨基酸產(chǎn)生非免疫原性肽的技術(shù)(WO98/52976和WO00/34317)。
發(fā)明者已經(jīng)生產(chǎn)了免疫原性降低的人源化340抗體(稱(chēng)為“340Ch”(對(duì)于小鼠人嵌合體)或“SC100”(對(duì)于去免疫的(deimmunised)抗體))，目的在于提供臨床上有用的治療工具。他們意外地發(fā)現(xiàn)這些人源化抗體與原始鼠抗體類(lèi)似地結(jié)合表達(dá)EGFR的細(xì)胞，但抑制這些細(xì)胞生長(zhǎng)的能力增強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種人源化形式的抗體340，它可由保藏于ECACC、保藏號(hào)為97021428的細(xì)胞系獲得。
優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體含有人類(lèi)抗體構(gòu)架中提供的抗體340的CDRH3。該抗體還可含有340重鏈或輕鏈的一個(gè)或多個(gè)其它CDR。附圖中的圖2顯示了這些CDR。它可含有抗體340的超變區(qū)。超變區(qū)之外的可變區(qū)可以來(lái)自于人類(lèi)抗體的可變區(qū)。制備這些抗體的方法在本領(lǐng)域周知，例如Winter，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,225,539。
抗體超變區(qū)之外的可變區(qū)也可來(lái)自于單克隆抗體340。制備這些抗體的方法在本領(lǐng)域周知，包括，例如Boss(Celltech)的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,816,397和Cabilly(Genentech)的4,816,567所述。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體含有人類(lèi)抗體構(gòu)架和抗體340可變區(qū)的基本部分，優(yōu)選地如圖2所示的可變區(qū)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體含有人類(lèi)抗體構(gòu)架和如圖6所示的VHb、c、d或e之一，和如圖7所示的VKb、c或d之一。優(yōu)選的抗體含有人類(lèi)抗體構(gòu)架與VHd和VKd或VHd或VKb。
人類(lèi)抗體構(gòu)架優(yōu)選地是人類(lèi)抗體恒定區(qū)的全部或一部分。例如，圖2所示的基于VL區(qū)全部或一部分的人源化抗體可以在其C端與抗體輕鏈恒定域(包括人Cκ或Cλ鏈)連接。類(lèi)似地，圖2所示的基于VH區(qū)全部或一部分的抗體可以在其C端與來(lái)自任何抗體同種型(例如IgG、IgA、IgE和IgM)和任何同種型亞型(特別是IgG1和IgG4)的免疫球蛋白重鏈的全部或一部分連接，優(yōu)選IgG1。
單克隆抗體通過(guò)在配體受體的配體結(jié)合部位附近結(jié)合，并在空間上阻斷向配體接近，從而阻斷配體。此外，抗體也可分子模擬配體并在配體結(jié)合部位處相互作用。發(fā)明者在此表示，340抗體及其SC100衍生物是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈儾粌H在配體結(jié)合部位結(jié)合，而且顯示與通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)聚集的配體之兩個(gè)不同區(qū)域有氨基酸同源性。而且，CDRH3區(qū)的重要性在細(xì)胞結(jié)合研究中得到證實(shí)，當(dāng)改變?cè)搮^(qū)內(nèi)的一個(gè)氨基酸時(shí)，SC100與EGFr的結(jié)合大大降低。這意味著，含有與肽配體顯示同源性的CDR區(qū)的抗體能與配體有效地競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體。因此能阻斷與配體/受體相互作用有關(guān)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。在該實(shí)施例中，由于EGF既是生長(zhǎng)因子又是存活因子，用其受體阻斷其相互作用導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡。由于EGF受體在惡性腫瘤中普遍過(guò)量表達(dá)，用藥物或抗體阻斷EGF受體能抑制腫瘤生長(zhǎng)。這些試劑顯示在聯(lián)合化學(xué)治療中特別有效，能導(dǎo)致動(dòng)物模型的腫瘤消退。
由于抗體能以多種方式修飾，術(shù)語(yǔ)“抗體”應(yīng)視為包括含有具有所需特異性的結(jié)合域的所有特異性結(jié)合成員或物質(zhì)。因此，該術(shù)語(yǔ)包括抗體片段、衍生物、抗體的功能相當(dāng)物和同源物，包括含有免疫球蛋白結(jié)合域的任何多肽。
完整抗體的片段能行使結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的例子有(i)由VL、VH、CL和CH1域組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1域組成的Fd片段；(iii)由單一抗體的VL和VH域組成的Fv片段；(iv)由VH域組成的dAb片段(Ward，E.S.等人，Nature 341544-546(1989))；(v)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab’)2片段，即含有兩條連接的Fab片段的雙價(jià)片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH域和VL域通過(guò)一個(gè)允許兩個(gè)域結(jié)合的肽接頭連接，形成抗原結(jié)合部位(Bird等人，Science242423-426(1988)；Huston等人，PNAS USA 855879-5883(1988)；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)；(ix)“疊抗(diabodies)”，即通過(guò)基因融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異性片段(WO94/13804；P.Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448(1993))。
疊抗是多肽的多聚體，其中每條多肽含有含免疫球蛋白輕鏈結(jié)合區(qū)的第一個(gè)域和含免疫球蛋白重鏈結(jié)合區(qū)的第二個(gè)域，這兩個(gè)域連接(例如通過(guò)肽接頭)在一起，但不能彼此結(jié)合形成抗原結(jié)合部位，抗原結(jié)合部位由多聚體內(nèi)一條多肽的第一個(gè)域與多聚體內(nèi)另一條多肽的第二個(gè)域結(jié)合形成(WO94/13804)。
在使用雙特異性抗體時(shí)，可以是常規(guī)的雙特異性抗體，它們能用多種方法生產(chǎn)(Hollinger和Winter，Current Opinion Biotechnol.19934446-449)，例如化學(xué)制備或由雜交瘤產(chǎn)生，或者可以是上述任何雙特異性抗體片段。使用scFv二聚體或疊抗而不使用完整抗體可能是優(yōu)選的。疊抗和scFv可以只用可變域構(gòu)建為不含F(xiàn)c區(qū)，可能降低抗獨(dú)特型反應(yīng)的作用。雙特異性抗體的其它形式包括Traunecker等人，EMBO Journal 103655-3659(1991)所述的單鏈“Janusins”。
雙特異性疊抗，與雙特異性完整抗體不同，也是特別有用的，因?yàn)樗鼈円子跇?gòu)建和在大腸桿菌中表達(dá)。利用文庫(kù)噬菌體展示(WO94/13804)能容易地篩選具有適當(dāng)結(jié)合特異性的疊抗(和其它多種多肽，如抗體片段)。如果疊抗的一條臂保持恒定，例如，具有針對(duì)抗原X的特異性，則能構(gòu)建另一條臂不同的文庫(kù)，并篩選具有適當(dāng)特異性的抗體。
免疫球蛋白可變域的基本部分至少含有3個(gè)CDR區(qū)，以及間插構(gòu)架區(qū)。優(yōu)選地，該部分也包含至少約50％的第一個(gè)和第四個(gè)構(gòu)架區(qū)之一或兩者，50％是第一個(gè)構(gòu)架區(qū)的C端50％和第四個(gè)構(gòu)架區(qū)的N端50％。可變域基本部分N端或C端的其它殘基可以是與天然存在的可變域區(qū)通常無(wú)關(guān)的殘基。例如，構(gòu)建通過(guò)重組DNA技術(shù)制備的本發(fā)明的抗體可導(dǎo)致引入N端或C端殘基，它們由為了便于克隆或其它操作步驟而引入的接頭編碼，包括引入接頭將本發(fā)明的可變域與包括免疫球蛋白重鏈在內(nèi)的其它蛋白質(zhì)序列、其它可變域(例如在疊抗生產(chǎn)中)或如下詳述的蛋白質(zhì)標(biāo)記相連接。
盡管在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，含有基于基本如圖2所示的VL和VH區(qū)氨基酸序列的一對(duì)結(jié)合域的抗體是優(yōu)選的，但基于這些序列之一的單結(jié)合域也構(gòu)成本發(fā)明的其它方面。對(duì)于基于基本如圖2所示的VH區(qū)氨基酸序列的結(jié)合域，這些結(jié)合域可用作靶試劑，因?yàn)楸娝苤庖咔虻鞍譜H域能以特異方式結(jié)合靶抗原。
對(duì)于單鏈特異性結(jié)合域的任一種，這些域可用來(lái)篩選能形成雙域特異性結(jié)合成員的互補(bǔ)域，該成員具有與此處公開(kāi)的抗體同樣優(yōu)良或者相當(dāng)?shù)捏w內(nèi)特性。這可利用WO92/01047公開(kāi)的所謂等級(jí)雙組合法，通過(guò)噬菌體展示篩選法實(shí)現(xiàn)，其中用含有H或L鏈克隆的單個(gè)菌落感染編碼另一條鏈(L或H)的克隆的完整文庫(kù)，并用如參考文獻(xiàn)所述的噬菌體展示技術(shù)篩選產(chǎn)生的雙鏈特異性結(jié)合成員。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，能在不喪失結(jié)合EGFR能力的情況下，修飾CDR、超變區(qū)和可變區(qū)的序列。例如，本發(fā)明的CDR區(qū)與圖1和圖2的特定區(qū)是相同或高度同源的?！案叨韧础笔侵冈贑DR中可以進(jìn)行1-5個(gè)，優(yōu)選地1-4個(gè)，如1-3個(gè)或1-2個(gè)置換。另外也可以修飾超變區(qū)和可變區(qū)，使它們顯示與此處公開(kāi)的區(qū)域有基本同源性。(各CDR、超變區(qū)或可變區(qū)與未修飾的對(duì)應(yīng)物之間的)同源性程度優(yōu)選地至少為60％，更優(yōu)選地70％，進(jìn)一步優(yōu)選地80％，更加優(yōu)選地90％，或者最優(yōu)選地95％。這些修飾序列屬于本發(fā)明的范圍，只要它們具有以高于抗體340的速度結(jié)合EGFR和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。術(shù)語(yǔ)“抗體”也應(yīng)相當(dāng)?shù)剡M(jìn)行解釋。
兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的百分同一性的確定方法是比對(duì)用于最佳比較的序列(例如為了與序列最佳比對(duì)，能在第一條序列中引入缺口)，并比較相應(yīng)位點(diǎn)處的氨基酸殘基或核苷酸?！白罴驯葘?duì)”是產(chǎn)生最高百分同一性的兩條序列的比對(duì)。百分同一性取決于所比較的序列中相同氨基酸殘基或核苷酸的數(shù)量(即，％同一性＝相同位點(diǎn)數(shù)/位點(diǎn)總數(shù)×100)。
兩條序列之間百分同一性的確定能用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的數(shù)學(xué)算法實(shí)現(xiàn)。用于比較兩條序列的數(shù)學(xué)算法的一個(gè)實(shí)例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268的算法，如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877所述改進(jìn)。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215403-410的NBLAST和XBLAST程序使用了這種算法。BLAST核苷酸搜索能用NBLAST程序進(jìn)行，得分＝100，字長(zhǎng)＝12，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索能用XBLAST程序進(jìn)行，得分＝50，字長(zhǎng)＝3，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得為比較而引入缺口的序列比對(duì)，能使用Gapped BLAST，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402所述。此外，也能用PSI-Blast進(jìn)行迭代(iterated)搜索，檢測(cè)分子間的遠(yuǎn)近關(guān)系(同上)。當(dāng)使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，能使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。見(jiàn)http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)實(shí)例是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。ALIGN程序(2.0版)是CGC序列比對(duì)軟件包的一部分，它使用這種算法。本領(lǐng)域周知的其它序列分析算法包括如Torellis和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.，103-5所述的ADVANCE和ADAM；和如Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444-8所述的FASTA。在FASTA中，ktup是設(shè)置靈敏度和搜索速度的控制選項(xiàng)。
如此處所示，SC100的CDRH3顯示與生長(zhǎng)因子EGF有氨基酸同源性。以下描述的結(jié)果提示，SC100及其片段和衍生物能用作癌癥治療劑，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或誘導(dǎo)其凋亡，例如腫瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)的抑制，腫瘤細(xì)胞系的凋亡，裸鼠中腫瘤異種移植物的體內(nèi)抑制。因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括SC100或“SC100”家族其它多肽的“片段”或“衍生物”的應(yīng)用，它們能抑制EGF的結(jié)合。一組優(yōu)選的片段包括單克隆抗體SC100 CDR區(qū)的全部或一部分。SC100或SC100家族多肽的片段是指至少5-7個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸殘基片段。通常至少約7-9個(gè)連續(xù)氨基酸，一般至少約9-13個(gè)連續(xù)氨基酸，更優(yōu)選地至少約20-30個(gè)或更多的連續(xù)氨基酸，最優(yōu)選地至少約30-40個(gè)或更多的連續(xù)氨基酸。SC100或SC100家族多肽或SC100家族多肽片段的“衍生物”是指通過(guò)改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，例如通過(guò)操作編碼蛋白質(zhì)的核酸或改變蛋白質(zhì)本身而修飾的多肽。天然氨基酸序列的衍生物包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、添加、缺失和/或置換，產(chǎn)生能誘發(fā)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)的肽。優(yōu)選地，衍生物包括25個(gè)或更少氨基酸、更優(yōu)選地15個(gè)或更少、更優(yōu)選地10個(gè)或更少、更優(yōu)選地4個(gè)或更少、最優(yōu)選地只有1個(gè)或2個(gè)氨基酸的插入、添加、缺失和/或置換。
本發(fā)明也提供與偶聯(lián)配偶體(如效應(yīng)分子、標(biāo)記、藥物、毒素和/或載體或轉(zhuǎn)運(yùn)分子)連接的上述抗體。將本發(fā)明的抗體與肽酰和非肽酰偶聯(lián)配偶體偶聯(lián)的技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體分子是來(lái)自觸角足(Antennapedia)同源域的一種16氨基酸肽(例如，商品名“Penetratin”)，它能通過(guò)末端Cys殘基與肽偶聯(lián)。WO 91/18981描述了“Penetratin”分子及其性質(zhì)。
因此，本發(fā)明的抗體可以用檢測(cè)標(biāo)記物(例如放射性標(biāo)記物，如131I或99Tc)標(biāo)記，它們可以用抗體成像領(lǐng)域周知的常規(guī)化學(xué)法連接。標(biāo)記物也包括酶標(biāo)記物，如辣根過(guò)氧化物酶。標(biāo)記物還包括可通過(guò)與特異同源可檢測(cè)部分(例如標(biāo)記的抗生物素蛋白)結(jié)合檢測(cè)的化學(xué)部分(如生物素)。因此，本發(fā)明的抗體可以用功能標(biāo)記物標(biāo)記。功能標(biāo)記物包括毒素(如蓖麻毒素)和酶(如細(xì)菌羧肽酶或硝基還原酶)，它們能在癌癥部位將前體藥物轉(zhuǎn)化為活性藥物。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)化學(xué)合成整個(gè)或部分地生產(chǎn)。能利用建立的標(biāo)準(zhǔn)液體或優(yōu)選地固相肽合成法制備本發(fā)明的抗體，這些方法的概述可廣泛獲得(參見(jiàn)，例如，J.M.Stewart和J.D.Young，《固相肽合成》(Solid Phase Peptide Synthesis)，第二版，Pierce ChemicalCompany，Rockford，Illinois(1984)，M.Bodanzsky和A.Bodanzsky，《肽合成實(shí)踐》(The Practice of Peptide Synthesis)，Springer Verlag，New York(1984)；Applied Biosystems 430A用戶(hù)手冊(cè)，ABI Inc.，F(xiàn)osterCity，California)，或者它們可以在溶液中、通過(guò)液相法或通過(guò)固相、液相和溶液化學(xué)法的組合制備，例如，首先完成各個(gè)肽部分，然后在希望和適當(dāng)時(shí)，在除去存在的任何保護(hù)基之后，通過(guò)各自的碳酸或磺酸或其反應(yīng)衍生物的反應(yīng)引入殘基X。
生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的抗體(肽或多肽)的另一種合適方法是通過(guò)在表達(dá)系統(tǒng)中使用核酸，表達(dá)其編碼核酸。
因此，本發(fā)明也提供編碼本發(fā)明的抗體的核酸。
根據(jù)本發(fā)明的核酸一般是一種分離物，為分離和/或純化的形式，或者不含或基本不含與之天然結(jié)合的物質(zhì)，例如，除了可能有一條或多條用于表達(dá)的調(diào)節(jié)序列之外，不含或基本不含人類(lèi)基因組中該基因側(cè)翼的核酸。核酸可以是全部或部分合成的，包括基因組DNA、cDNA或RNA。根據(jù)本發(fā)明的核酸包括RNA，所示序列應(yīng)被視為RNA的相當(dāng)物，以U替換T。
編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽或肽的核酸序列能由熟練技術(shù)人員利用此處所述信息和參考文獻(xiàn)和本領(lǐng)域周知的技術(shù)制備(例如，參見(jiàn)，Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloning，A Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989，和Ausubel等人，《分子生物學(xué)簡(jiǎn)明方案》(Short Protocols in MolecularBiology)，John Wiley and Sons，1992)，只要這些核酸序列和克隆可以獲得。這些技術(shù)包括(i)利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增核酸樣品，例如從基因組來(lái)源，(ii)化學(xué)合成，或(iii)制備cDNA序列。編碼SC100片段的DNA可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的任何適宜方法生產(chǎn)并使用，包括獲取編碼DNA，鑒定位于表達(dá)部分任一側(cè)的適當(dāng)?shù)南拗泼缸R(shí)別位點(diǎn)，從DNA中切除該部分。該部分然后可在標(biāo)準(zhǔn)商品表達(dá)系統(tǒng)中與合適的啟動(dòng)子有效連接。另一種重組方法是用合適的PCR引物擴(kuò)增DNA的有關(guān)部分。能對(duì)序列進(jìn)行修飾，例如利用定點(diǎn)誘變，以使修飾的肽表達(dá)或考慮密碼子在用來(lái)表達(dá)該核酸的宿主細(xì)胞中的偏性。
為了獲得核酸序列的表達(dá)，能將該序列摻入含有一種或多種控制序列的載體中，該控制序列與核酸序列有效連接，以控制其表達(dá)。載體可包含其它序列，如引導(dǎo)插入核酸表達(dá)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子、核酸序列，使得多肽或肽產(chǎn)生為融合體和/或編碼分泌信號(hào)的核酸，使細(xì)胞分泌宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽。然后通過(guò)用該載體轉(zhuǎn)化載體在其中具有功能的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)該宿主細(xì)胞使其產(chǎn)生多肽，并從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收多肽，獲得多肽。原核和真核細(xì)胞均可用于此目的，包括大腸桿菌、酵母和真核細(xì)胞株，如COS或CHO細(xì)胞。
因此，本發(fā)明也包括制備本發(fā)明的抗體的方法，該方法包括由編碼該抗體的核酸(一般是根據(jù)本發(fā)明的核酸)表達(dá)。這可通過(guò)在引起或允許抗體表達(dá)的適當(dāng)條件下培養(yǎng)含該載體的宿主細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。多肽和肽也可在體外系統(tǒng)如網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中表達(dá)。
在多種不同宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)眾所周知。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、真核細(xì)胞(如哺乳動(dòng)物和酵母)和桿狀病毒系統(tǒng)。本領(lǐng)域中可用于表達(dá)異源多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞、COS細(xì)胞等。一種常用的、優(yōu)選的細(xì)菌宿主是大腸桿菌。
能選擇或構(gòu)建合適的載體，它們含有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，包括啟動(dòng)子序列、終止子片段、聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因和其它適當(dāng)序列。載體可以是質(zhì)粒、病毒，例如噬菌體或噬粒。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參見(jiàn)，例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，第二版，Sambrook等人，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社。核酸操作的許多技術(shù)和方法，例如核酸構(gòu)建體的制備、誘變、測(cè)序、向細(xì)胞中導(dǎo)入DNA和基因表達(dá)，以及蛋白質(zhì)分析，在《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》中詳述，Ausubel等人編寫(xiě)，John Wiley and Sons，1992。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種含有此處公開(kāi)的異源核酸的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的核酸可以整合到宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)中。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使其含有可促進(jìn)與基因組重組的序列，可以促進(jìn)整合。核酸可位于細(xì)胞內(nèi)的染色體外載體上，或者對(duì)于細(xì)胞是異源或外源的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供一種包括向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入核酸方法。這種導(dǎo)入(特別是體外導(dǎo)入)一般不加限制地稱(chēng)為“轉(zhuǎn)化”，可以使用任何可用的技術(shù)。對(duì)于真核細(xì)胞，合適的技術(shù)包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒(例如痘苗病毒，或者對(duì)于昆蟲(chóng)細(xì)胞為桿狀病毒)轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)于細(xì)菌細(xì)胞，合適的技術(shù)包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和利用噬菌體轉(zhuǎn)染。此外也能直接注射核酸。
在鑒定含有目的核酸的克隆時(shí)可以使用標(biāo)記基因，如抗生素抗性或敏感性基因，本領(lǐng)域眾所周知。
例如，在導(dǎo)入后，可通過(guò)在基因表達(dá)條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞(可包括實(shí)際轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，盡管這些細(xì)胞更可能是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的子代)，引起或允許由核酸表達(dá)，產(chǎn)生編碼的多肽(或肽)。如果多肽與合適的信號(hào)前導(dǎo)肽偶聯(lián)表達(dá)，它可由細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中。表達(dá)生產(chǎn)后，可以從宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離和/或純化多肽或肽，根據(jù)具體情況，隨后如希望地用于配制可能含有一種或多種其它成分的組合物，如含有一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑或載體的藥用組合物(例如見(jiàn)下文)。
如上所述，多肽也可以與效應(yīng)分子偶聯(lián)。效應(yīng)分子行使多種有用的功能，如抑制腫瘤生長(zhǎng)，使多肽進(jìn)入細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞，引導(dǎo)多肽至細(xì)胞內(nèi)的適當(dāng)位置。
例如，效應(yīng)分子可以是細(xì)胞毒性分子。細(xì)胞毒性分子可以是蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)有機(jī)化療劑。合適的化療劑的例子包括，例如阿霉素、紫杉醇和順鉑。
適于與本發(fā)明的多肽偶聯(lián)的效應(yīng)分子的其它例子包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、ras抑制劑和細(xì)胞周期抑制劑。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的例子包括蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑，如櫟精(Grazieri等人，Biochim.Biophs.Acta714，415(1981))；薰草菌素A(Onoda等人，J.Nat.Produc.52，1252(1989))；和除莠霉素A(Ushara等人，Biochem.Int.，41831(1988))。
蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)化療劑可以通過(guò)本領(lǐng)域周知的方法與本發(fā)明的抗體偶聯(lián)。這些方法包括，例如對(duì)于阿霉素的偶聯(lián)，如Greenfield等人，Cancer Research 50，6600-6607(1990)所述；對(duì)于鉑化合物的偶聯(lián)，如Arnon等人，Adv.Exp.Med.Biol.303，79-90(1991)和Kiseleva等人，Mol.Biol.(USSR)25，508-514(1991)所述。優(yōu)選阿霉素、紫杉醇和順鉑。
本發(fā)明的抗體能配制于含有藥學(xué)可接受載體的藥用組合物中。這些組合物除了上述物質(zhì)之一外，還可含有藥學(xué)可接受的賦形劑、緩沖液、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的其它物質(zhì)。這些物質(zhì)應(yīng)當(dāng)是無(wú)毒的，并且不干擾活性成分的效能。載體或其它物質(zhì)的確切性質(zhì)依賴(lài)于施用途徑，例如口服、靜脈內(nèi)、皮膚或皮下、經(jīng)鼻、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)途徑。制劑優(yōu)選地是液體，通常是含有pH6.8-7.6的非磷酸緩沖液的生理鹽溶液，或者可以是凍干粉末。
含有本發(fā)明的抗體或用于其施用的組合物優(yōu)選地以“治療有效量”對(duì)個(gè)體施用，該量足以顯示對(duì)個(gè)體有利。實(shí)際施用量和施用的速度和時(shí)程取決于所治療的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療處方，例如劑量的確定等，屬于普通執(zhí)業(yè)醫(yī)生和其它醫(yī)生的職責(zé)，一般要考慮所治療的疾病、患者的狀況、施用部位、施用方法和執(zhí)業(yè)醫(yī)生周知的其它因素。
本發(fā)明的抗體與癌癥的治療和最初治療或手術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)的預(yù)防特別有關(guān)。上述技術(shù)和方法的例子可見(jiàn)《Remington制藥學(xué)》，第16版，Oslo，A.(編寫(xiě))，1980。因此，本發(fā)明也提供(a)本發(fā)明的抗體或核酸在癌癥治療或預(yù)防藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用，和(b)一種治療或預(yù)防癌癥的方法，包括對(duì)患者施用治療有效量的本發(fā)明的抗體或核酸。
當(dāng)對(duì)人體施用有效量的本發(fā)明的抗體時(shí)，能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。最佳劑量由醫(yī)生根據(jù)許多參數(shù)確定，包括，例如年齡、性別、體重、所治療疾病的嚴(yán)重程度、所施用的活性成分和施用途徑。一般希望多肽和抗體的血清濃度能使EGF受體飽和。大約0.1nM過(guò)量的濃度通常足夠。例如，劑量為100mg/m2的抗體使得在大約8天時(shí)間內(nèi)血清濃度約為20nM。
大體原則是，抗體劑量可以是每周10-300mg/m2。為了使血清水平保持在使EGF受體飽和的過(guò)量濃度，應(yīng)當(dāng)以更頻繁的間隔使用相當(dāng)劑量的抗體片段。
合適的施用途徑包括靜脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi)施用。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。
本發(fā)明的抗體可以與其它藥學(xué)可接受的成分一起施用。這些成分包括，例如免疫系統(tǒng)刺激劑和化療劑，如上所述。
根據(jù)所治療的疾病，組合物可以單獨(dú)施用或聯(lián)合其它治療分開(kāi)、同時(shí)或連續(xù)施用。其它癌癥治療包括其它單克隆抗體、其它化療劑、其它放射治療技術(shù)或本領(lǐng)域周知的其它免疫治療。本發(fā)明的組合物的一種特殊用途是作為手術(shù)的輔助，即幫助減少腫瘤切除后癌癥復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)。
可以想象，注射(iv)是治療性施用本發(fā)明的抗體的主要途徑，也可采用靜脈內(nèi)施用或通過(guò)導(dǎo)管或其它手術(shù)置管施用?？梢允褂糜煞勰┲苿┲亟ǖ囊后w制劑。
抗體也可通過(guò)置于特定組織(包括血液)中的小球體、脂質(zhì)體、其它微顆粒輸送系統(tǒng)或緩釋制劑施用。緩釋載體的合適實(shí)例包括共用物形式的半透性聚合基質(zhì)，例如栓劑或微膠囊?？芍踩牖蛭⒛z囊緩釋基質(zhì)包括polylactides(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3,773,919、EP-A-0058481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，Biopolymers 22(1)547-556，1985)、聚(2-羥乙基-異丁烯酸)或乙烯乙烯基乙酸(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15167-277，1981，和Langer，Chem.Tech.1298-105，1982)。含多肽的脂質(zhì)體利用眾所周知的方法制備DE 3,218,121A；Epstein等人，PNAS USA，823688-3692，1985；Hwang等人，PNAS USA，774030-4034，1980；EP-A-0052522；E-A-0036676；EP-A-0088046；EP-A-0143949；EP-A-0142541；JP-A-83-11808；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,485,045和4,544,545。脂質(zhì)體通常是小的(約200-800埃)單層，其中液體含量超過(guò)約30mol.％膽固醇，調(diào)節(jié)比例以達(dá)到最佳多肽釋放速度。
本發(fā)明的抗體可以以局部方式向腫瘤部位或其它希望的部位施用，或者可以以靶向腫瘤或其它細(xì)胞的方式施用。
抗體劑量取決于所用試劑的性質(zhì)，例如，其結(jié)合活性和體內(nèi)血漿半衰期，制劑中多肽的濃度，施用途徑，施用部位和速度，有關(guān)患者的臨床耐受性，患者的病理狀況等，醫(yī)生可很好地掌握。例如，每名患者每次300μg多肽的劑量是優(yōu)選的，盡管劑量可以是每次約10μg-1mg。在一系列連續(xù)接種中使用不同的劑量；醫(yī)生可進(jìn)行最初的接種，然后用相對(duì)小量的抗體加強(qiáng)。
本發(fā)明的抗體能以多種方式對(duì)不同類(lèi)別的受體施用。能用抗體治療的癌癥類(lèi)型的實(shí)例包括結(jié)腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌和卵巢癌。
本發(fā)明也涉及優(yōu)化免疫程序，以提高對(duì)癌癥的保護(hù)免疫應(yīng)答。
本發(fā)明各方面的優(yōu)選特點(diǎn)加以必要修改能用于其它方面。此處所述的現(xiàn)有技術(shù)文件在此以法律許可的最大限度引用作為參考。
本發(fā)明將參照下列非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述。參考附圖


圖1顯示小鼠單克隆抗體340Vh和Hk序列的DNA序列；圖2顯示小鼠單克隆抗體340VH和VK序列的翻譯的蛋白質(zhì)序列。加粗的和下劃線標(biāo)出的序列代表連續(xù)的CDR，即對(duì)于每一條鏈，CDR1是第一種序列，CDR3是最后一種序列；圖3顯示用于擴(kuò)增鼠Vh和Vk序列的引物序列；圖4是用于表達(dá)重鏈的表達(dá)載體的圖示；圖5是用于表達(dá)輕鏈的表達(dá)載體的圖示；圖6顯示去免疫的重鏈序列的比對(duì)，包括去免疫的重鏈變體中MHC結(jié)合表位的位置；圖7顯示去免疫的輕鏈序列的比對(duì)，包括去免疫的輕鏈變體中MHC結(jié)合表位的位置；圖8顯示a340嵌合和a340小鼠單克隆抗體的A431細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果；圖9顯示Vhd去免疫變體的A431細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果；圖10顯示Vhe去免疫變體的A431細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果；圖11顯示Vhb去免疫變體的A431細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果；圖12說(shuō)明SC100單克隆抗體與EGF之間的氨基酸同源性。SC100抗體免疫球蛋白重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3的推斷的氨基酸序列顯示與公開(kāi)的表皮生長(zhǎng)因子序列的特定區(qū)域有明顯的同源性；圖13是比較EGF與SC100的分子模型。這些示圖分別顯示SC100重鏈和EGF，說(shuō)明圖6所示的兩個(gè)氨基酸同源區(qū)的結(jié)構(gòu)相似性。這些示圖特別顯示EGF結(jié)構(gòu)中兩個(gè)相似序列區(qū)如何靠近，SC100抗體CDRH3中的同源序列如何模擬它們；圖14a顯示去免疫的SC100抗體(克隆VhdVkd)(a)和去免疫的SC100(克隆VhdVkb)(b)與小鼠340單克隆抗體相比，對(duì)A431細(xì)胞生長(zhǎng)的％抑制。
實(shí)施例實(shí)施例1-來(lái)自α340的嵌合抗體的構(gòu)建使用Qiagen RNeasy試劑盒按照使用說(shuō)明書(shū)從5×106雜交瘤α340細(xì)胞中分離總RNA(Durrant等人，Prenatal Diagnostics，14，131，1994)。用Promega(Southampton，UK)逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液和dNTP將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA?？勺儏^(qū)重鏈(VH)和輕鏈(VL)cDNAs用Jones和Bendig(Bio/Technology，9，188，1991)的方法的引物組擴(kuò)增。凝膠純化擴(kuò)增的DNA，克隆到載體pGemT Easy(Promega)中。用373A型Applied Biosystems自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems，Warrington，UK)對(duì)PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序。得到的VH和VLDNA序列示于圖1中，蛋白質(zhì)序列示于圖2中(在此使用時(shí)VL與VK相同)。
互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的位置參照其它抗體序列確定(Kabat EA等人，US Department of Health and Human Services，1991)。α340VH能歸于小鼠重鏈亞類(lèi)III(B)(Kabat等人，1991)，α340VK能歸為小鼠Kappa鏈亞類(lèi)II(Kabat等人，1991)。
嵌合抗體由鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)連接組成。當(dāng)檢測(cè)去免疫的抗體時(shí)，嵌合抗體也用相同的人恒定區(qū)提供有用的控制(見(jiàn)下文)。載體VH-PCR1和VK-PCR1(Riechmann等人，Nature，332，323，1988)作為模板，用于在鼠VH和VK基因周?chē)?’側(cè)翼序列(包括前導(dǎo)信號(hào)肽、前導(dǎo)內(nèi)含子和鼠免疫球蛋白啟動(dòng)子)，和3’側(cè)翼序列(包括剪接位點(diǎn)和內(nèi)含子序列)。使用pfu校讀聚合酶(pfu turbo，Stratagene，La Jolla，California)，用與VH/VK-PCR1載體序列重疊的引物(見(jiàn)圖3)擴(kuò)增鼠VH和VK序列。這能構(gòu)建全長(zhǎng)嵌合重鏈和輕鏈。這些PCR引物用于從VH/VKPCR-1載體擴(kuò)增VH/VK區(qū)和5’和3’人類(lèi)區(qū)。
連接5’HuH/K、VH/K和3’HuH/K區(qū)，并用識(shí)別VH/K1和VH/K12PCR引物末端的側(cè)翼引物(VH/K13，VH/K14)擴(kuò)增，產(chǎn)生完整的嵌合抗體表達(dá)盒。該產(chǎn)物用BamHI和HindIII限制酶酶切，連接于BamHI/HindIII酶切的pUC19(酶來(lái)自Promega，pUC19來(lái)自Amersham Pharmacia)。如前所述通過(guò)測(cè)序證實(shí)表達(dá)盒的序列。
作為HindIII-BamHI片段從pUC19上切下鼠VH和VL表達(dá)盒，其中包含鼠重鏈免疫球蛋白啟動(dòng)子、前導(dǎo)信號(hào)肽、前導(dǎo)內(nèi)含子、VH或VL序列和剪接位點(diǎn)。將其轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體pSVgpt和pSVhyg中(圖4和圖5)，它們分別含有人IgG1或K恒定區(qū)和用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中選擇的標(biāo)記。證實(shí)表達(dá)載體中VH和VL的DNA序列是正確的。實(shí)施例2-α340去免疫序列的設(shè)計(jì)下列實(shí)施例描述了降低現(xiàn)有治療用抗體引發(fā)的人體免疫應(yīng)答的方法。實(shí)現(xiàn)方法包括兩步第一步將鼠重鏈和輕鏈序列與人種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)相比較。選擇最相似的種系序列作為去免疫序列的人類(lèi)模板，并引入使鼠種系序列轉(zhuǎn)化為人序列所必需的改變。對(duì)于抗體結(jié)構(gòu)和結(jié)合至關(guān)重要的殘基不包含于該方法中，并且不改變。保持于該階段的鼠殘基除了如N端殘基外主要是非表面的隱蔽殘基，它們?cè)谧罱K抗體中靠近CDRs。該方法生產(chǎn)大致類(lèi)似于“鑲嵌”(veneered)抗體的序列，表面殘基主要是人源的，而隱蔽殘基是鼠源序列。
在本實(shí)施例中，將α340抗體的可變區(qū)蛋白質(zhì)序列與人種系VH/K序列逐個(gè)比較。對(duì)于α340，α340VH鏈看似與種系序列VHDP42和JH6最相似。α340VK鏈顯示與VKDP15和JK2有最大相似性。
第二步包括確定負(fù)責(zé)免疫應(yīng)答的抗體VH/K表位，和為了去除這些序列修飾抗體序列。通過(guò)新的肽穿線(threading)法分析α340。應(yīng)用MPT1.0版軟件(Biovation，Aberdeen，UK)通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析。該軟件包按照WO98/52976所述的方法進(jìn)行肽穿線。該軟件能提供可能與18種不同MHCII類(lèi)DR等位基因結(jié)合的肽的索引，它們覆蓋了人群體中存在的96％以上的HLA DR同種異型。
用來(lái)模擬上述人種系序列的α340抗體鏈用該方法穿線，并鑒定可能的MHCII類(lèi)表位。通過(guò)將負(fù)責(zé)MHCII類(lèi)結(jié)合的氨基酸置換為類(lèi)似的殘基，突變這些表位。這些置換旨在保持總體抗體結(jié)構(gòu)和抗原結(jié)合能力，而去除MHC表位。
每條鏈設(shè)計(jì)幾種變體，用來(lái)產(chǎn)生具有不同水平的MHC結(jié)合鏈和來(lái)自原始鼠α340的突變的多種抗體。設(shè)計(jì)3種DIVK和4種DIVH變體(VKb，VKc，VKd，VHb，VHc，VHd和VHe)，能在各自的比對(duì)中用于顯示MHC表位，并引入突變以去除它們(見(jiàn)圖6和圖7)。
引入的突變包括α340抗體CDR中的兩個(gè)。VK區(qū)CDR1中含有VKb的I-L突變。VH區(qū)CDR3中類(lèi)似地含有VHe的V-A突變。這些置換對(duì)α340抗體的抗原結(jié)合能力有相當(dāng)大的影響，說(shuō)明生產(chǎn)具有不同突變的其它變體的重要性。實(shí)施例3-去免疫抗體序列的構(gòu)建去免疫的可變區(qū)通過(guò)重疊PCR重組法構(gòu)建?？寺〉氖骎H和VK基因作為模板，用于將構(gòu)架區(qū)誘變?yōu)樾枰娜ッ庖咝蛄?。合成幾組包含將要改變的區(qū)域的誘變引物對(duì)。
誘變引物對(duì)的應(yīng)用要求采用48℃-50℃的退火溫度。所有擴(kuò)增均使用pfu turbo校讀聚合酶(Stratagene，La Jolla，California)。α340嵌合VH和VK構(gòu)建體作為模板，用于導(dǎo)入5’側(cè)翼序列，包括前導(dǎo)信號(hào)肽、前導(dǎo)內(nèi)含子和鼠重鏈免疫球蛋白啟動(dòng)子，和3’側(cè)翼序列，包括剪接位點(diǎn)和內(nèi)含子序列以及將要修飾的可變區(qū)。為了產(chǎn)生嵌合表達(dá)盒，用相同側(cè)翼引物(VH/K13，VH/K14)進(jìn)行重疊PCR。將產(chǎn)生的去免疫的V區(qū)克隆到pUC19中，證實(shí)每個(gè)去免疫的VH和VL的完整DNA序列都是正確的。
去免疫的重鏈和輕鏈V區(qū)作為HindIII-BamHI片段從pUC19上切下，其包含鼠重鏈免疫球蛋白啟動(dòng)子、前導(dǎo)信號(hào)肽、前導(dǎo)內(nèi)含子、VH或VL序列和剪接位點(diǎn)。將其轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體pSVgpt和pSVhyg中，它們分別含有人IgG1或K恒定區(qū)和用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中選擇的標(biāo)記。證實(shí)表達(dá)載體中去免疫的VH和VL的DNA序列是正確的。為了制備用于轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體，用pvuI(Promega，Southampton，UK)消化約50μg VK和25μg VH質(zhì)粒(每次轉(zhuǎn)化)實(shí)現(xiàn)。然后乙醇沉淀DNA，干燥DNA沉淀。在轉(zhuǎn)化前將沉淀重懸浮于10μl分子生物學(xué)級(jí)水中(每次轉(zhuǎn)化)。實(shí)施例4-α340去免疫抗體的表達(dá)用于抗體表達(dá)的宿主細(xì)胞系是NS0，它是一種不產(chǎn)免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤，獲自歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，Porton，UK(ECACC號(hào)85110505)。重鏈和輕鏈表達(dá)載體以多種組合通過(guò)電穿孔共轉(zhuǎn)染NS0細(xì)胞。每條DIVH鏈與每條DIVK鏈轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生12種去免疫的變異抗體。另外也轉(zhuǎn)染嵌合VH和VK區(qū)，產(chǎn)生一種表達(dá)嵌合α340抗體(α340Ch)的細(xì)胞系。α340Ch抗體作為對(duì)照，顯示去免疫前抗體的結(jié)合。
NS0細(xì)胞在75cm3搖瓶(NalgeNunc Int.，Rochester，NY，USA)中的20ml Dulbecco′s改良Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中生長(zhǎng)，每500ml培養(yǎng)基中補(bǔ)充10％胎牛血清(FBS)、5ml抗生素/抗真菌素溶液(GibcoBRL，Paisley，UK.目錄號(hào)15240-062)、2.5ml慶大霉素(Gibco BRL，Paisley，UK.目錄號(hào)15710-049)和5ml丙酮酸鈉(Gibco BRL，Paisley，UK.目錄號(hào)11360-039)。一旦鋪滿，即離心細(xì)胞形成沉淀，重懸浮于0.5ml(每次轉(zhuǎn)化)相同培養(yǎng)基中。然后將這0.5ml細(xì)胞加至預(yù)先消化的DNA，沉淀，重懸浮，在冰上溫育5分鐘。然后將細(xì)胞等分到2mm比色杯(Biorad，Hercules，CA，USA)中，用Biorad Genepulser II以170伏和975μF脈沖，然后置于冰上恢復(fù)20分鐘。將細(xì)胞等分到20ml如上所述的DMEM/10％FBS中，在37℃和5％CO2下生長(zhǎng)過(guò)夜。
24小時(shí)后，離心細(xì)胞，重懸浮于85ml選擇性DMEM/10％FBS中(每500ml培養(yǎng)基中含有上述成分，加5ml 25mg/ml黃嘌呤和160μl2.5mg/ml霉酚酸。它們是psv重鏈載體gpt基因的選擇劑)。然后等分到4×96孔板中，每孔200μl等份。培養(yǎng)板培養(yǎng)10天，直到形成抗性集落。
對(duì)于人IgG，通過(guò)ELISA測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆產(chǎn)生的人抗體。篩選分泌抗體的細(xì)胞系，最初擴(kuò)增到24孔板中。然后放大到25cm3搖瓶和75cm3搖瓶中。通過(guò)與已知濃度的人對(duì)照抗體相比，經(jīng)ELISA測(cè)定抗體的產(chǎn)生。然后將每次轉(zhuǎn)染的最佳抗體生產(chǎn)克隆放大到175cm3搖瓶中，其它克隆在液氮中凍存。
VHC型轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不產(chǎn)生抗體。還不清楚這是為什么，但在三種不同情況下產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)染子集落，而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生抗體的集落。如述繼續(xù)生產(chǎn)含有VHb、VHd和VHe的變體，但VHc不繼續(xù)。實(shí)施例5-去免疫α340抗體的生產(chǎn)和檢測(cè)通過(guò)用0.5ml ProSepA(Bioprocessing Ltd)攪拌過(guò)夜，從500ml-11靜置培養(yǎng)液中純化抗體。然后通過(guò)親和層析分離Prosep A。用0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脫抗體，中和，并對(duì)PBS透析過(guò)夜。純化的抗體制品過(guò)濾除菌，貯存于4℃。對(duì)于人IgG，通過(guò)ELISA測(cè)定純化抗體的濃度。
通過(guò)ELISA檢測(cè)α340 DI抗體變體與A431細(xì)胞(ECCAC號(hào)85090402)的結(jié)合。這些上皮單層細(xì)胞過(guò)量表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，因此適于測(cè)定α340與EGFR抗原的結(jié)合。A431細(xì)胞在96孔板中的DMEM/10％FBS培養(yǎng)基和1％非必需氨基酸(NEAA，GibcoBRL，目錄號(hào)11140-035)中生長(zhǎng)至鋪滿。去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次。在免疫測(cè)定穩(wěn)定器(Quadratech)中室溫溫育1小時(shí)。棄去溶液，使培養(yǎng)板在室溫下干燥。然后將培養(yǎng)板在-4℃下貯存。
比較α340Ch抗體與原始鼠α340的實(shí)驗(yàn)表明，嵌合形式有類(lèi)似的結(jié)合(圖9)。用含0.05％Tween(Sigma)的PBS洗滌。對(duì)于嵌合和小鼠抗體，分別用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗人IgG(The Binding Site，Cambridge，UK)和綿羊抗小鼠IgG(The Binding Site，Cambridge，UK)進(jìn)行檢測(cè)。用鄰苯二胺底物(Sigma，Poole，Dorset，UK)顯色。
由于使用了可能具有不同結(jié)合能力的不同的第二抗體，結(jié)果無(wú)法直接比較。然而，清楚地表明，α340Ch與A431細(xì)胞的EGFR結(jié)合，并且能作為陽(yáng)性對(duì)照，用來(lái)比較DIα340變體的結(jié)合親和力。
為了測(cè)定DIα340變體，在免疫測(cè)定板上用倍比稀釋(從每孔100ng開(kāi)始)的DI變體和α340嵌合抗體(也從每孔100ng開(kāi)始)作為陽(yáng)性對(duì)照。進(jìn)行ELISA，以顯示哪種變體具有與α340Ch抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合能力。
圖10-12顯示3種去免疫α340重鏈與3種去免疫α340輕鏈組合的結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果。由去免疫的重鏈b和d結(jié)合去免疫的輕鏈b、c和d組成的抗體，顯示與A431的結(jié)合類(lèi)似于嵌合抗體，表明引入VK區(qū)的突變不會(huì)減弱α340與EGFR的結(jié)合。然而，引入VHe唯一的突變(VHCDR3中的V-A)使得與EGFR的結(jié)合活性降低約3-4倍。
選擇去免疫的VHd.VKb作為先導(dǎo)去免疫α340抗體，因?yàn)樗缓幸粋€(gè)可能的表位。除去這最后一個(gè)表位使抗體與EGFR的結(jié)合基本喪失。實(shí)施例6-SC100單克隆抗體與EGF之間的氨基酸同源性Biosoft的適用于Macintosh的Gene Jockey II軟件包進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的成對(duì)序列比較，以確定相似性/同源性區(qū)。SC100的CDRH3區(qū)與EGF的蛋白質(zhì)序列比較時(shí)，在EGF的兩個(gè)不同區(qū)域中發(fā)現(xiàn)氨基酸同源性。然而，當(dāng)在EGF的NMR解析結(jié)構(gòu)上突出這些區(qū)域時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)聚集在一起，類(lèi)似于SC100 CDRH3。實(shí)施例7-體外腫瘤生長(zhǎng)抑制的證實(shí)A431細(xì)胞在37℃和5％二氧化碳下培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI1640中。用胰蛋白酶/EDTA收獲活細(xì)胞的鋪滿培養(yǎng)物，洗滌，重懸浮為5×104細(xì)胞/ml。
然后將100μl等份細(xì)胞懸液分配到平底96孔培養(yǎng)板中，還含有含量提高的340小鼠抗體、去免疫的SC100(VHdVKd或VHd，VKb)抗體。培養(yǎng)液放置5天，通過(guò)結(jié)晶紫染色確定剩余活細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果是4個(gè)孔的平均值+SE。沒(méi)有誤差條的情況是由于數(shù)值太小而被數(shù)據(jù)點(diǎn)覆蓋。
VHdVKb和VHdVKd SC100克隆都能比小鼠單克隆抗體340更有效地抑制A431細(xì)胞的生長(zhǎng)。實(shí)際上，VHdVKb克隆顯示70％的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。
權(quán)利要求
1.一種人源化形式的抗體340，其可由保藏于ECACC、保藏號(hào)為97021428的細(xì)胞系獲得。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其含有人抗體構(gòu)架中提供的抗體340的CDRH3。
3.如權(quán)利要求2所述的抗體，它還含有抗體340的CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和CDRH2之一種或多種。
4.如權(quán)利要求3所述的抗體，其含有抗體340的超變區(qū)。
5.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的抗體，其含有抗體340可變區(qū)的基本部分。
6.如權(quán)利要求5所述的抗體，其含有如圖2所示的可變區(qū)。
7.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的抗體，其含有VHb、c、d或e之一，和VKb、c或d之一。
8.如權(quán)利要求7所述的抗體，其含有VHd和VKd或VHd和VKb。
9.如權(quán)利要求2-8中任意一項(xiàng)所述的抗體，其中人抗體構(gòu)架是人抗體恒定區(qū)的全部或一部分。
10.如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的抗體，它與一種偶聯(lián)配偶體或效應(yīng)分子連接。
11.編碼如上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的抗體的核酸。
12.一種載體，其含有一種或多種控制序列，所述控制序列與權(quán)利要求11所述的核酸有效連接，用來(lái)控制其表達(dá)。
13.一種細(xì)胞，其含有如權(quán)利要求11所述的核酸或如權(quán)利要求12所述的載體。
14.一種制備抗體的方法，該方法包括由權(quán)利要求11所述的核酸表達(dá)。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，包括在引起或允許抗體表達(dá)的適當(dāng)條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞。
16.一種藥用組合物，其含有如權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的抗體和一種藥學(xué)可接受的載體。
17.如權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的抗體或如權(quán)利要求11所述的核酸在藥物上的應(yīng)用。
18.如權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的抗體或如權(quán)利要求11所述的核酸在制備癌癥治療或預(yù)防藥物中的應(yīng)用。
19.一種治療或預(yù)防癌癥的方法，包括對(duì)患者施用治療有效量的如權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的抗體或如權(quán)利要求11所述的核酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人源化形式的抗體340，它可由保藏于ECACC、保藏號(hào)為97021428的細(xì)胞系獲得。發(fā)現(xiàn)該抗體殺死細(xì)胞的能力高于鼠抗體340。也提供編碼該抗體的核酸，以及該抗體在藥物上、特別是在癌癥治療中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1432063SQ0181064
公開(kāi)日2003年7月23日 申請(qǐng)日期2001年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月19日
發(fā)明者J·R·M·艾里斯, L·G·杜蘭特 申請(qǐng)人:梨樹(shù)化學(xué)株式會(huì)社