專利名稱：用作丙型肝炎病毒ns3-絲氨酸蛋白酶抑制劑的新型肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的丙型肝炎病毒(“HCV”)蛋白酶抑制劑、包含一種或多種所述抑制劑的藥用組合物、制備所述抑制劑的方法和使用所述抑制劑治療丙型肝炎和相關(guān)疾病的方法。本發(fā)明特別公開(kāi)用作HCV NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶抑制劑的新的肽化合物。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)為一種(+)-有義單鏈RNA病毒，它為非甲非乙型肝炎(NANBH)的主要病原體，尤其是血液相關(guān)性NANBH(BB-NANBH)(參見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)公布號(hào)WO 89/04669和歐洲專利申請(qǐng)公布號(hào)EP 381 216)。NANBH不同于其它類型的病毒誘導(dǎo)性肝疾病，例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丁型(δ)肝炎病毒(HDV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)和埃-巴二氏病毒(EBV)、以及不同于其它形式的肝疾病，例如酒精中毒性肝疾病和原發(fā)性膽汁性肝硬化。
最近，已經(jīng)鑒定、克隆和表達(dá)出了多肽加工和病毒復(fù)制所必需的HCV蛋白酶(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)5,712,145)。這種約3000個(gè)氨基酸的多蛋白自氨基末端至羧基末端包含核殼蛋白(C)、包膜蛋白(E1和E2)以及幾種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、2、3、4a、5a和5b)。NS3為約68kda的蛋白，由HCV基因組約1893個(gè)核苷酸編碼，并且具有2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域(a)由約200個(gè)N-末端氨基酸組成的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域；和(b)蛋白C-末端RNA依賴性ATP酶結(jié)構(gòu)域。由于蛋白質(zhì)序列、整體三維結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制的相似性，認(rèn)為NS3蛋白酶是胰凝乳蛋白酶家族的一個(gè)成員。其它胰凝乳蛋白酶樣酶有彈性蛋白酶、Xa因子、凝血酶、胰蛋白酶、纖溶酶、尿激酶、tPA和PSA。HCV NS3絲氨酸蛋白酶與所述多肽(多蛋白)于NS3/NS4a、NS4a/NS4b、NS4b/NS5a和NS5a/NS5b接點(diǎn)水解有關(guān)，因此在病毒復(fù)制期間負(fù)責(zé)生成四種病毒蛋白。這使HCV NS3絲氨酸蛋白酶成為抗病毒化學(xué)治療的令人關(guān)注的目標(biāo)。
已經(jīng)確定約6kda多肽的NS4a蛋白是NS3絲氨酸蛋白酶活性的輔因子。NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶對(duì)NS3/NS4a接點(diǎn)的自動(dòng)裂解在分子內(nèi)(即順式)進(jìn)行，而其它的裂解位點(diǎn)在分子間(即反式)進(jìn)行。
對(duì)HCV蛋白酶的天然裂解位點(diǎn)的分析揭示，P1存在半胱氨酸和P1’存在絲氨酸，并且這些殘基在NS4a/NS4b、NS4b/NS5a和NS5a/NS5b接點(diǎn)中是嚴(yán)格保守的。NS3/NS4a接點(diǎn)包含P1的蘇氨酸和P1’的絲氨酸。推定NS3/NS4a上的半胱氨酸→Thr取代解釋該接點(diǎn)需要順式而不是反式加工。參見(jiàn)例如Pizzi等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)91888-892，F(xiàn)ailla等(1996)Folding & Design 135-42。NS3/NS4a裂解位點(diǎn)也比其它位點(diǎn)更耐受誘變。參見(jiàn)例如Kollykhalov等(1994)J.Virol.687525-7533。還發(fā)現(xiàn)，裂解位點(diǎn)上游區(qū)的酸性殘基是有效裂解所需要的。參見(jiàn)例如Komoda等(1994)J.Virol.687351-7357。
已報(bào)道的HCV蛋白酶抑制劑包括抗氧化劑(參見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)公布號(hào)WO 98/14181)、某些肽類和肽類似物(參見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)公布號(hào)WO 98/17679，Landro等(1997)Biochem.369340-9348，Ingallinella等(1998)Biochem.378906-8914，Llinàs-Brunet等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.81713-1718)、基于70-氨基酸多肽水蛭蛋白酶抑制劑c的抑制劑(Martin等(1998)Biochem.3711459-11468，選自人胰腺分泌胰蛋白酶抑制劑(hPSTI-C3)和小體所有組成成分(MBip)的抑制劑親和性(Dimasi等(1997)J.Virol，717461-7469)，cVHE2(“camelized”可變結(jié)構(gòu)域抗體片段)(Martin等(1997)Protein.Eng.10607-614)和α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)(Elzouki等)(1997)J.Hepat.2742-28)。最近公開(kāi)了設(shè)計(jì)用來(lái)選擇性破壞丙型肝炎病毒RNA的核酶(參見(jiàn)BioWorldToday9(217)4(1998年11月10日))。
另外參見(jiàn)1998年4月30日公開(kāi)的PCT公布號(hào)WO 98/17679(Vertex Pharmaceuyticals Incorporated)、1998年5月28日公開(kāi)的WO98/22496(F.Hoffmann-La Roche AG)和1999年2月18日公開(kāi)的WO99/07734(Boehringer Ingelheim Canada Ltd)。
HCV與肝硬化有關(guān)，而且誘發(fā)肝細(xì)胞癌。目前HCV感染患者的預(yù)后很差。由于缺乏免疫性或者與HCV感染有關(guān)的豁免性(remission)，HCV感染比起其它形式的肝炎更難以治療。目前的資料表明，肝硬化診斷后四年的存活率小于50％。診斷為患有局灶性可切除性肝細(xì)胞癌的患者的五年存活率為10-30％，而局灶性不可切除性肝細(xì)胞癌的患者的五年存活率小于1％。
參見(jiàn)A.Marchett等Synlett，S1，1000-1002(1999)，它介紹了HCVNS3蛋白酶抑制劑的二環(huán)類似物的合成，其中所公開(kāi)的化合物的結(jié)構(gòu)式如下 另參見(jiàn)W.Han等Bioorganic & medicinal Chem.Lett，(2000)10，711-713，它介紹了某些包含烯丙基和乙基官能團(tuán)的α-酮酰胺類、α-酮酯類以及α-二酮類的制備。
另參見(jiàn)WO 00/09558(受讓人Boehringer Ingelheim Limited；2000年2月24日公開(kāi))，它公開(kāi)了下式的肽衍生物 其中各單元在其文中作了定義。該系列的示例性化合物為
另參見(jiàn)WO 00/09543(受讓人Boehringer Ingelheim Limited；2000年2月24日公開(kāi))，它公開(kāi)了下式的肽衍生物 其中各種單元在其文中作了定義。該系列的示例性化合物為 丙型肝炎的當(dāng)前療法包括干擾素-α(INFα)以及使用利巴韋林和干擾素的聯(lián)合療法。參見(jiàn)例如Beremguer等(1998)Proc.Assoc.Am.Physicians110(2)98-112。這些療法存在低持續(xù)應(yīng)答率并時(shí)常發(fā)生副作用的缺陷。參見(jiàn)例如Hoofnagle等(1997)N.Engl.J.Med.336347。目前，沒(méi)有疫苗可用于HCV感染。
等待批準(zhǔn)以及共同等待批準(zhǔn)的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/194,607(2000年4月5日申請(qǐng))、序列號(hào)60/198,204(2000年4月19日申請(qǐng))、序列號(hào)60/220,110(2000年7月21日申請(qǐng))、序列號(hào)60/220,109(2000年7月21日申請(qǐng))、序列號(hào)60/220,107(2000年7月21日申請(qǐng))、序列號(hào)60/254,869(2000年11月12日申請(qǐng))以及序列號(hào)60/220,101(2000年7月21日申請(qǐng))，它們公開(kāi)了作為丙型肝炎病毒NS-3絲氨酸蛋白酶抑制劑的各種類型肽和/或其它化合物。
HCV感染需要新的治療藥物及治療方法。因此，本發(fā)明一個(gè)目的是提供有效治療、預(yù)防或改善丙型肝炎的一種或多種癥狀的化合物。
本發(fā)明的另一目的是提供治療、預(yù)防或改善丙型肝炎的一種或多種癥狀的方法。
本發(fā)明再一目的是提供使用本發(fā)明化合物調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶活性、特別是HCV NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶活性的方法。
本發(fā)明又一目的是提供使用本發(fā)明化合物調(diào)節(jié)HCV多肽加工的方法。
發(fā)明概述在許多實(shí)施方案中，本發(fā)明提供HCV蛋白酶的一類新型抑制劑、包含一種或多種化合物的藥用組合物、包含一種或多種所述化合物的藥物制劑的制備方法以及治療、預(yù)防或者改善丙型肝炎的一種或多種癥狀的方法。還提供調(diào)節(jié)HCV多肽與HCV蛋白酶相互作用的方法。本發(fā)明提供的化合物中，優(yōu)選抑制HCV NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶活性的化合物。本申請(qǐng)公開(kāi)一種化合物，包括所述化合物的對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體、旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、外消旋體和前體藥物，以及所述化合物或所述前體藥物的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，所述化合物具有下式I的通用結(jié)構(gòu) 式I其中Y選自以下部分烷基、烷基-芳基、雜烷基、雜芳基、芳基-雜芳基、烷基-雜芳基、環(huán)烷基、烷氧基、烷基-芳氧基、芳氧基、雜芳氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、烷基-芳基氨基、芳基氨基、雜芳基氨基、環(huán)烷基氨基和雜環(huán)烷基氨基，前提是Y可以任選被X11或X12取代；X11為烷基、鏈烯基、鏈炔基、環(huán)烷基、環(huán)烷基-烷基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、雜芳基、烷基雜芳基或雜芳基烷基，前提是X11還可以任選被X12取代；X12為羥基、烷氧基、芳氧基、硫代基、烷硫基、芳硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷基磺?；?、芳基磺?；?、烷基亞磺酰氨基、芳基亞磺酰氨基、羧基、烷氧羰基、酰胺基、烷氧羰基氨基、烷氧羰基氧基、烷基脲基、芳基脲基、鹵素、氰基或硝基，前提是所述烷基、烷氧基和芳基還可以任選被獨(dú)立選自X12的部分取代；R1為COR5或B(OR)2，其中R5為H、OH、OR8、NR9R10、CF3、C2F5、C3F7、CF2R6、R6或COR7，其中R7為H、OH、OR8、CHR9R10或NR9R10，其中R6、R8、R9和R10獨(dú)立選自以下基團(tuán)H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基烷基、雜芳基烷基、[CH(R1’)]pCOOR11、[CH(R1’)]pCONR12R13、[CH(R1’)]pSO2R11、[CH(R1’)]pCOR11、[CH(R1’)]pCH(OH)R11、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)R’、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH((R3’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)COOR11CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)CONR12R13，其中R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R11、R12、R13和R’獨(dú)立選自以下基團(tuán)H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、烷基-芳基、烷基-雜芳基、芳基-烷基和雜芳烷基；Z選自O(shè)、N、CH或CR；W可以存在或者不存在，當(dāng)W存在時(shí)，W選自C＝O、C＝S、C(＝N-CN)或SO2；Q可以存在或者不存在，當(dāng)Q存在時(shí)，Q為CH、N、P、(CH2)p、(CHR)p、(CRR’)p、O、NR、S或SO2；當(dāng)Q不存在時(shí)，M可以存在或不存在；當(dāng)Q和M不存在時(shí)，A直接連結(jié)到L；A為O、CH2、(CHR)p、(CHR-CHR’)p、(CRR’)p、NR、S、SO2或化學(xué)鍵；E為CH、N、CR或朝向A、L或G的雙鍵；G可以存在或不存在，當(dāng)G存在時(shí)，G為(CH2)p、(CHR)p或(CRR’)p；當(dāng)G不存在時(shí)，則J存在并且E直接連結(jié)到G連結(jié)的式I碳原子上；J可以存在或不存在，當(dāng)J存在時(shí)，J為(CH2)p、(CHR)p或(CRR’)p、SO2、NH、NR或O；當(dāng)J不存在時(shí)，則G存在并且E直接連結(jié)到J連結(jié)的式I所示氮原子上；L可以存在或不存在，當(dāng)L存在時(shí)，L為CH、CR、O、S或NR；當(dāng)L不存在時(shí)，則M可以存在或不存在；當(dāng)M存在而L不存在時(shí)，則M直接獨(dú)立連結(jié)到E，并且J直接獨(dú)立連結(jié)到E；M可以存在或不存在，當(dāng)M存在時(shí)，M為O、NR、S、SO2、(CH2)p、(CHR)p(CHR-CHR’)p或(CRR’)p；p為數(shù)字0-6；R、R’、R2、R3和R4獨(dú)立選自以下基團(tuán)H；C1-C10烷基；C2-C10鏈烯基；C3-C8環(huán)烷基；C3-C8雜環(huán)烷基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、鹵素；(環(huán)烷基)烷基和(雜環(huán)烷基)烷基，其中所述環(huán)烷基由3-8個(gè)碳原子和0-6個(gè)氧、氮、硫或磷原子組成，并且所述烷基具有1-6個(gè)碳原子；芳基；雜芳基；烷基-芳基；以及烷基-雜芳基；其中所述烷基、雜烷基、鏈烯基、雜鏈烯基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)烷基部分可任選進(jìn)行化學(xué)上適當(dāng)?shù)娜〈鲂g(shù)語(yǔ)“取代”指任選并且化學(xué)上適當(dāng)?shù)谋?個(gè)或多個(gè)選自以下的部分取代烷基、鏈烯基、鏈炔基、芳基、芳烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、鹵素、羥基、硫代基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、亞磺酰氨基、亞砜、砜、磺酰脲、酰肼和異羥肟酸酯。
進(jìn)一步，其中所述N-C-G-E-L-J-N單元為五元或六元環(huán)結(jié)構(gòu)，前提是當(dāng)所述N-C-G-E-L-J-N單元為五元環(huán)結(jié)構(gòu)，或當(dāng)式I中包括N、C、G、E、L、J、N、A、Q和M的雙環(huán)結(jié)構(gòu)為五元環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，則所述五元環(huán)結(jié)構(gòu)沒(méi)有羰基作為環(huán)的一部分。
在式I各部分的上述定義中，各部分的優(yōu)選基團(tuán)如下R1的優(yōu)選定義為COR5，其中R5為H、OH、COOR8或CONR9R10，其中R8、R9和R10的定義同上。R1的更優(yōu)選部分為COCONR9R10，其中R9為H，R10為H、R14、[CH(R1’)]pCOOR11、[CH(R1’)]pCONR12R13、[CH(R1’)]pSO2R11、[CH(R1’)]pSO2NR12R13、[CH(R1’)]pCOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)，其中R14為H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、烷基-芳基、烷基-雜芳基、芳基-烷基、鏈烯基、鏈炔基或雜芳烷基。在上述R10基團(tuán)中，R10優(yōu)選部分為H、R14、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CH(R1’)SO2R11、CH(R1’)CH(R1’)SO2NR12R13、CH(R1’)CH(R1’)COR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)，其中R1’為H或烷基，R2’為苯基、取代的苯基、雜原子-取代的苯基、苯硫基、環(huán)烷基、哌啶基或吡啶基。
更優(yōu)選部分為R1’為H，R11為H、甲基、乙基、烯丙基、叔丁基、芐基、α-甲基芐基、α，α-二甲基芐基、1-甲基環(huán)丙基或1-甲基環(huán)戊基；R’更優(yōu)選部分為羥甲基或CH2CONR12R13，其中
NR12R13選自以下基團(tuán) 和 其中U6為H、OH或CH2OH；R14優(yōu)選自以下基團(tuán)H、Me、Et、正丙基、甲氧基、環(huán)丙基、正丁基、1-丁-3-炔基、芐基、α-甲基芐基、苯乙基、烯丙基、1-丁-3-烯基、OMe、環(huán)丙基甲基；
R2’優(yōu)選獨(dú)立選自以下的基團(tuán) 其中U1和U2可以相同或不同并且選自以下基團(tuán)H、F、CH2COOH、CH2COOMe、CH2CONH2、CH2CONHMe、CH2CONMe2、疊氮基、氨基、羥基、取代的氨基、取代的羥基；U3和U4可以相同或不同并且選自O(shè)和S；U5選自以下部分烷基磺?；⒎蓟酋；?、雜烷基磺?；?、雜芳基磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、雜烷基羰基、雜芳基羰基、烷氧羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、雜芳基氨基羰基或其組合；
R2優(yōu)選部分為

R3優(yōu)選部分為
其中R31＝OH或O-烷基；
Y19選自以下部分 Y20選自以下部分
R3的最優(yōu)選部分為 一些其它優(yōu)選部分為Z為N，R4為H，W為C＝O。此外，R4不存在時(shí)，式I中Z-C-R3部分可以為以下結(jié)構(gòu) 和
Y的優(yōu)選部分為



其中Y11選自H、COOH、COOEt、OMe、Ph、OPh、NHMe、NHAc、NHPh、CH(Me)2、1-三唑基、1-咪唑基和NHCH2COOH；Y12選自H、COOH、COOMe、OMe、F、Cl或Br；Y13選自以下部分
Y14選自MeSO2、Ac、Boc、iBoc、Cbz或Alloc；Y15和Y16獨(dú)立選自烷基、芳基、雜烷基和雜芳基；Y17為CF3、NO2、CONH2、OH、COOCH3、OCH3、OC6H5、C6H5、COC6H5、NH2或COOH；Y18為COOCH3、NO2、N(CH3)2、F、OCH3、CH2COOH、COOH、SO2NH2或NHCOCH3。
Y可以更優(yōu)選為

其中Y17＝CF3、NO2、CONH2、OH、NH2或COOH；
Y18＝F、COOH；Y的更加優(yōu)選部分為
式I所示的以下單元 為環(huán)結(jié)構(gòu)，它可以為五元或六元環(huán)結(jié)構(gòu)。但此環(huán)為五元環(huán)時(shí)，本發(fā)明要求五元環(huán)不包含羰基基團(tuán)作為環(huán)結(jié)構(gòu)的一部分。優(yōu)選五元環(huán)結(jié)構(gòu)為 其中R和R’定義同上。優(yōu)選的五元環(huán)結(jié)構(gòu)為
其中R20選自以下部分 此外，所述五元環(huán)與其相鄰的兩個(gè)環(huán)外羰基一起可以表示如下
本發(fā)明情況下，R21和R22可以相同或不同并且獨(dú)立選自以下部分
以下五元環(huán)結(jié)構(gòu)
的一些優(yōu)選實(shí)例如下
此外，式中的以下單元 可以表示為以下結(jié)構(gòu)b和c b的優(yōu)選定義為
在c中，G和J獨(dú)立選自以下基團(tuán)(CH2)p、(CHR)p、(CHR-CHR’)p和(CRR’)p；A和M獨(dú)立選自以下基團(tuán)O、S、SO2、NR、(CH2)p、(CHR)p、(CHR-CHR’)p和(CRR’)p；Q為CH2、CHR、CRR’、NH、NR、O、S、SO2、NR、(CH2)p、(CHR)p和(CRR’)p。
c的優(yōu)選定義為

當(dāng)環(huán)結(jié)構(gòu)如下圖示時(shí) 其最優(yōu)選的實(shí)例如下

以下單元 的一些更優(yōu)選部分為
除非另有定義，否則本發(fā)明使用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同含義。因此，例如術(shù)語(yǔ)烷基(包括烷氧基的烷基部分)指由具有1-8個(gè)，優(yōu)選1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈飽和烴除去一個(gè)原子后獲得的單價(jià)基團(tuán)；芳基-表示具有6-14個(gè)碳原子且具有至少1個(gè)苯型環(huán)的碳環(huán)基團(tuán)，碳環(huán)基團(tuán)的所有可取代的芳香族碳原子均可作為連接點(diǎn)。優(yōu)選芳基包括苯基、1-萘基、2-萘基和茚滿基，尤其是苯基和取代的苯基；芳烷基-表示含有芳基并通過(guò)低級(jí)烷基連接的部分；烷基芳基-表示含有低級(jí)烷基并通過(guò)芳基連接的部分；環(huán)烷基-表示具有3-8個(gè)，優(yōu)選5個(gè)或6個(gè)碳原子的飽和碳環(huán)，其任選被取代；雜環(huán)-表示(除以下定義的雜芳基以外)具有至少1個(gè)插入碳環(huán)結(jié)構(gòu)(由1個(gè)環(huán)或者2個(gè)稠環(huán)組成，其中每個(gè)環(huán)為5元、6元或7元環(huán)且可具有或者不具有不含離域pi電子的雙鍵)的O、S和/或N原子的飽和及不飽和環(huán)狀有機(jī)基團(tuán)，其環(huán)結(jié)構(gòu)具有2-8個(gè)、優(yōu)選3-6個(gè)碳原子，例如2-或3-哌啶基、2-或3-哌嗪基、2-或3-嗎啉基、或者2-或3-硫代嗎啉基；鹵素-表示氟、氯、溴和碘；雜芳基-表示具有至少1個(gè)插入碳環(huán)結(jié)構(gòu)的O、S和/或N原子且具有足夠數(shù)量的離域pi電子以提供芳族性質(zhì)的環(huán)狀有機(jī)基團(tuán)，其中芳族雜環(huán)具有2-14個(gè)、優(yōu)選4或5個(gè)碳原子，例如2-、3-或4-吡啶基，2-或3-呋喃基、2-或3-噻吩基、2-、4-或5-噻唑基、2-或4-咪唑基、2-、4-或5-嘧啶基、2-吡嗪基、或者3-或4-噠嗪基等。優(yōu)選雜芳基為2-、3-和4-吡啶基；所述雜芳基也可被任選取代。此外，如上所述，除有特別定義，術(shù)語(yǔ)“取代或未取代(的)”或“任選取代(的)”是指相關(guān)部分任選被屬于R12或R13的部分進(jìn)行化學(xué)上適當(dāng)?shù)娜〈?。本發(fā)明使用的“前體藥物”為藥物前體化合物，它在給予患者后在體內(nèi)通過(guò)一些化學(xué)或生理過(guò)程(例如前體藥物在生理pH或酶作用下轉(zhuǎn)換成需要的藥物形式)釋放出藥物。
本發(fā)明還包括式I化合物及其前體藥物的互變異構(gòu)體、旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體和其它旋光異構(gòu)體，及其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物和衍生物。
本發(fā)明的又一特征是包含作為活性成分的式I化合物(或其鹽、溶劑化物或異構(gòu)體)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥用組合物。
本發(fā)明還提供制備式I化合物的方法以及治療諸如HCV、AIDS(獲得性免疫缺陷綜合癥)的疾病及相關(guān)疾病的方法。所述治療方法包括給予患有一種或多種所述疾病的患者治療有效量的式I化合物或者包含式I化合物的藥用組合物。
還公開(kāi)了式I化合物在制備治療HCV、AIDS和相關(guān)疾病的藥物中的用途。
還公開(kāi)了治療丙型肝炎病毒相關(guān)性疾病的方法，該方法包括給予有效量的一種或多種本發(fā)明化合物。
還公開(kāi)了調(diào)節(jié)丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性的方法，該方法包括使HCV蛋白酶與一種或多種本發(fā)明化合物接觸。
還公開(kāi)了治療、預(yù)防或改善丙型肝炎的一種或多種癥狀的方法，該方法包括給予有效量的一種或多種本發(fā)明化合物。HCV蛋白酶為NS3或NS4a蛋白酶。本發(fā)明化合物抑制所述蛋白酶。它們還調(diào)節(jié)丙型肝炎(HCV)多肽的加工。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了作為HCV蛋白酶抑制劑、尤其是HCV NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶抑制劑的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的衍生物，其各種定義見(jiàn)上文。
具有優(yōu)良的HCV蛋白酶抑制活性的本發(fā)明代表性化合物與它們的活性一并列于下表1-5(Ki*值范圍為納摩爾，nM)。幾個(gè)化合物以及補(bǔ)充的化合物另外在權(quán)利要求中公開(kāi)。
表1化合物和HCV蛋白酶連續(xù)檢測(cè)結(jié)果
HCV連續(xù)檢測(cè)的Ki*范圍類別A＝1-100nM；類別B＝101-1000nM；類別C＞1000nM。
一些類型的本發(fā)明化合物以及合成不同類型的本發(fā)明式I化合物的方法列于下面，接著用示意圖說(shuō)明，之后是示例性的實(shí)施例。
(R＝叔丁基，X＝NH2)(R＝異丁基，X＝NH2)(R＝叔丁基，X＝OH)(R＝三氯乙基，X＝OH) (X＝OtBu) (X＝OH)(X＝OH) (X＝OtBu)(X＝NH2)(X＝NHMe)(X＝NMe2)
(X＝NH2)(X＝NMe2)(X＝NHMe)(X＝OH)(X＝OtBu)(X＝OH)(X＝NH2)(X＝NMe2) (X＝OtBu)(R＝叔丁基)(X＝OH) (R＝異丁基)(X＝NH2)(X＝NMe2)(X＝NMeOMe)
(X＝Me，Y＝CH2Me)(X＝OAc，Y＝Me)

































根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)，本發(fā)明化合物可與有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸、或者有機(jī)堿或無(wú)機(jī)堿形成藥學(xué)上可接受的鹽。用于此類鹽形成的合適的酸的實(shí)例為鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、丙二酸、水楊酸、蘋(píng)果酸、富馬酸、琥珀酸、抗壞血酸、馬來(lái)酸、甲磺酸和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它的礦物酸以及羧酸類。對(duì)于與堿形成鹽的合適堿為例如NaOH、KOH、NH4OH、氫氧化四烷基銨等。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含作為活性成分的本發(fā)明肽的藥用組合物。藥用組合物通常還包含藥學(xué)上可接受的載體稀釋劑、賦形劑或載體(本發(fā)明統(tǒng)稱為載體材料)。由于它們的HCV抑制活性，所述藥用組合物具有治療丙型肝炎和相關(guān)疾病的用途。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了制備包含作為活性成分的本發(fā)明化合物的藥用組合物的方法。在本發(fā)明的藥用組合物和方法中，活性成分一般以與適合的載體材料的混合物給藥，根據(jù)需要的給藥形式適當(dāng)?shù)剡x擇載體材料，即口服片劑、膠囊劑(固體填充、半固體填充或液體填充)、使用時(shí)配制用粉劑、口服凝膠劑、酏劑、可分散顆粒劑、糖漿劑、混懸劑等，并且符合常規(guī)制藥實(shí)踐。舉例來(lái)說(shuō)，對(duì)于以片劑或膠囊劑形式口服給藥，活性藥物成分可與任何口服非毒性的藥學(xué)上可接受的惰性載體組合，例如乳糖、淀粉、蔗糖、纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、滑石粉、甘露糖醇、乙醇(液體形式)等。此外，當(dāng)要求或者需要時(shí)，也可將合適的粘合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑和著色劑摻和到混合物中。粉劑和片劑也可包含約5-95％的本發(fā)明組分。合適的粘合劑包括淀粉、明膠、天然糖、玉米甜味劑、天然及合成樹(shù)膠如阿拉伯樹(shù)膠、藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇和蠟?？捎糜谏鲜鰟┬偷臐?rùn)滑劑實(shí)例有硼酸、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括淀粉、甲基纖維素、瓜爾膠等。
合適的情況下也可包含甜味劑、增香劑和防腐劑。下面更詳細(xì)地討論以上提及的一些術(shù)語(yǔ)，即崩解劑、稀釋劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑等。
另外，本發(fā)明的組合物可配制成持續(xù)釋放形式，從而控制任何一種或者多種成分或活性成分的釋放速率以達(dá)到最優(yōu)化的治療效果即HCV抑制活性等。持續(xù)釋放的合適劑型包括多層片劑，它包含多層不同崩解速率或者控釋聚合物基質(zhì)，活性成分浸漬在聚合物基質(zhì)中，加工成片劑形式，或者包含所述浸漬或囊化多孔聚合物基質(zhì)的膠囊劑。
液態(tài)制劑包括溶液劑、混懸劑和乳劑?？闪信e的實(shí)例有用于腸胃外注射的水溶液劑或者水-丙二醇溶液劑或者加入甜味劑和遮光劑(pacifiers)的口服溶液劑、混懸劑和乳劑。液態(tài)制劑還可包括鼻內(nèi)給藥的溶液劑。
適于吸入的氣霧制劑可包括溶液劑和粉末形式的固體，它們可以與藥學(xué)上可接受的載體例如惰性壓縮氣體(如氮?dú)?聯(lián)合應(yīng)用。
制備栓劑時(shí)，首先熔融低熔點(diǎn)的蠟，例如脂肪酸甘油酯(如可可脂)的混合物，并且通過(guò)攪拌或者類似的混合使活性成分均勻分散于其中。然后將熔融的均勻混合物傾入到適當(dāng)大小的模具中，使之冷卻并由此固化。
也包括這樣的固態(tài)制劑可在臨用前配制成口服或腸胃外給藥的液態(tài)制劑。所述液態(tài)制劑包括溶液劑、混懸劑和乳劑。
本發(fā)明化合物也可經(jīng)皮給藥。經(jīng)皮給藥的組合物可采用乳膏、洗劑、氣霧劑和/或乳劑形式，并且作為用于此目的的本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，所述組合物可包含在基質(zhì)型或者貯庫(kù)型貼劑中。
本發(fā)明化合物優(yōu)選口服、靜脈內(nèi)或皮下給藥。
藥用制劑優(yōu)選單位劑型。在所述劑型中，制劑細(xì)分為包含適量活性成分的適當(dāng)大小的單位劑量，例如包含達(dá)到所需目的的有效量。
根據(jù)特定的應(yīng)用，單位劑量制劑中的本發(fā)明活性成分劑量通常可以不同或調(diào)整，從約1.0毫克到約1,000毫克，優(yōu)選從約1.0到約950毫克，更優(yōu)選從約1.0到約500毫克，一般為約1到約250毫克。實(shí)際使用劑量可根據(jù)患者的年齡、性別、體重以及所治療的病情嚴(yán)重程度而變化。所述技術(shù)是本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員眾所周知的。
通常，包含活性成分的用于人的口服劑型可以每天給藥1次或2次。給藥量和給藥頻率需要根據(jù)主治醫(yī)師的判斷調(diào)節(jié)?？诜o藥的一般推薦日劑量范圍從約1.0毫克/天到1,000毫克/天，可以一次或分次給藥。
一些有用的術(shù)語(yǔ)說(shuō)明如下膠囊劑-指特殊容器或者包封物，它們由甲基纖維素、聚乙烯醇、或變性明膠或淀粉制成用于保持或容納包含活性成分的組合物。硬殼膠囊一般由相對(duì)高強(qiáng)度的明膠骨架和豬皮明膠的摻合物制成。膠囊本身可包含少量染料、不透明劑、增塑劑和防腐劑。
片劑-指包含活性成分及合適稀釋劑的壓縮或模壓固體劑型。通過(guò)壓縮混合物或經(jīng)濕法制粒、干法制粒或壓縮獲得的顆粒制備片劑。
口服凝膠劑-指活性成分分散于或溶于親水性半固體基質(zhì)中。
使用時(shí)配制用粉劑指包含活性成分和合適稀釋劑的粉末摻合物，它可用水或果汁混懸。
稀釋劑-指通常構(gòu)成組合物或者劑型的主要部分的物質(zhì)。合適的稀釋劑包括糖類，例如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨醇；從小麥、玉米、大米和馬鈴薯獲得的淀粉；以及纖維素，例如微晶纖維素。組合物中稀釋劑含量占總組合物的重量百分比從約10％到約90％，優(yōu)選約25％到約75％，更優(yōu)選約30％到約60％，更優(yōu)選約12％到約60％。
崩解劑-指加入到組合物中以便促使其分開(kāi)(崩解)并釋放出藥物的物質(zhì)。合適的崩解劑包括淀粉；“冷水可溶性”改性淀粉，例如羧甲基鈉淀粉；天然和合成樹(shù)膠類，如槐樹(shù)豆膠、卡拉牙膠、瓜爾膠、黃蓍膠和瓊脂；纖維素衍生物，如甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉；微晶纖維素和交聯(lián)微晶纖維素如交聯(lián)羧甲基纖維素鈉；藻酸鹽如藻酸和藻酸鈉；粘土如膨潤(rùn)土；以及泡騰混合物。組合物中崩解劑含量占組合物的重量百分比從約2％到約15％，更優(yōu)選約4％到約10％。
粘合劑-指使粉末粘合或者“膠著”在一起并使它們粘聚形成顆粒的物質(zhì)，因此在配制中用作“膠粘劑”。粘合劑增加稀釋劑或增量劑已有的粘性強(qiáng)度。合適的粘合劑包括糖類如蔗糖；從小麥、玉米、大米和馬鈴薯獲得的淀粉；天然樹(shù)膠類如阿拉伯樹(shù)膠、明膠和黃蓍膠；海藻衍生物如藻酸、藻酸鈉和藻酸鈣銨；纖維素材料如甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉和羥基丙基甲基纖維素；聚乙烯吡咯烷酮；以及無(wú)機(jī)物例如硅酸鎂鋁。組合物中粘合劑含量可占組合物的重量百分比從約2％到約20％，更優(yōu)選從約3％到約10％，更優(yōu)選從約3％到約6％。
潤(rùn)滑劑-指加入到劑型中以便在其被壓制后通過(guò)減少摩擦或磨損使片劑、顆粒劑等自模具或者沖模中脫出的物質(zhì)。合適的潤(rùn)滑劑包括金屬硬脂酸鹽如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鉀；硬脂酸；高熔點(diǎn)蠟；以及水溶性潤(rùn)滑劑，例如氯化鈉、苯甲酸鈉、乙酸鈉、油酸鈉、聚乙二醇和d’1-亮氨酸。潤(rùn)滑劑通常在壓制前的最后步驟加入，因?yàn)樗鼈儽仨毚嬖谟陬w粒的表面并介于顆粒與壓片機(jī)組件之間。組合物中潤(rùn)滑劑含量可占組合物重量百分比從約0.2％到約5％，優(yōu)選約0.5％到約2％，更優(yōu)選從約0.3％到約1.5％。
助流劑(glident)-防止結(jié)塊并改善顆粒的流動(dòng)性以使流動(dòng)平滑均勻的物質(zhì)。合適的助流劑包括二氧化硅和滑石粉。組合物中助流劑含量可占組合物的總重量百分比從約0.1％到約5％，優(yōu)選從約0.5％到約2％。
著色劑-使組合物或者劑型著色的賦形劑。所述賦形劑可包括食品級(jí)染料和吸附到合適吸附劑(例如粘土或氧化鋁)上的食品級(jí)染料。著色劑含量可占組合物的重量百分比從約0.1％到約5％，優(yōu)選從約0.1％到約1％。
生物利用度-指與標(biāo)準(zhǔn)物或者對(duì)照物相比，給藥劑型的活性藥物成分或者治療部分吸收進(jìn)入體循環(huán)的速率和程度。
制備片劑的常規(guī)方法是人們已知的。所述方法包括干法例如直接壓縮和壓制緊壓生產(chǎn)的顆粒，或者濕法或其它特殊方法。制備其它給藥形式例如膠囊劑、栓劑等的常規(guī)方法也是人們熟知的。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案公開(kāi)了上文公開(kāi)的藥用組合物在治療疾病例如丙型肝炎等中的用途。該方法包括給予患有一種或多種這種疾病并需要這種治療的患者治療有效量的本發(fā)明藥用組合物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物可以用于治療人類HCV，其治療模式可以是單一療法或聯(lián)合療法(例如雙重聯(lián)合、三重聯(lián)合等)，例如聯(lián)合應(yīng)用抗病毒劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑。所述抗病毒劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑實(shí)例包括利巴韋林(Schering-Plough Corporation，Madison，NewJersey)和LevovirinTM(ICN Pharmaceuticals，Costa Mesa，California)、VP50406TM(Viropharma，Incorporated，Exton，Pennsylvania)、ISIS 14803TM(ISIS Pharmaceuticals，Carlsbad，California)、HeptazymeTM(RibozymePharmaceuticals，Boulder，Colorado)、VX 497TM(Vertex Pharmaceuticals，Cambridge，Massachusetts)、ThymosinTM(SciClone Pharmaceuticals，SanMateo，California)、MaxamineTM(Maxim Pharmaceuticals，San Diego，California)、霉酚酸莫非替克(Hoffman-LaRoche，Nutley，New Jersey)、干擾素(例如干擾素α，聚乙二醇-干擾素α綴合物)等?！熬垡叶?干擾素α綴合物”為共價(jià)連結(jié)的干擾素α分子和聚乙二醇分子。聚乙二醇-干擾素α綴合物的實(shí)例包括干擾素α-2a(RoferonTM，HoffmanLa-Roche，Nutley，New Jersey)(其形式為聚乙二醇化干擾素α-2a(例如以商品名PegasysTM出售))、干擾素α-2b(IntronTM，Schering-PloughCorporation)(其為聚乙二醇化干擾素α-2b形式(例如以商品名PEG-IntronTM出售))、干擾素α-2c(Berofor AlphaTM，Boehringer Ingelheim，Ingelheim，Germany)或通過(guò)測(cè)定天然干擾素α的共有序列定義的共有干擾素(InfergenTM，Amgen，Thousand Oaks，California)。
如前所述，本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的互變異構(gòu)體、旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體和其它立體異構(gòu)體。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，本發(fā)明的一些化合物可能存在適當(dāng)?shù)漠悩?gòu)體形式。這樣的變化形式考慮在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案公開(kāi)了本發(fā)明公開(kāi)的化合物的制備方法。所述化合物可通過(guò)本領(lǐng)域已知的幾種技術(shù)制備。代表性的示例方法在以下反應(yīng)流程中概述。應(yīng)當(dāng)理解，雖然以下的示例性流程介紹了少量代表性本發(fā)明化合物的制備，但是適當(dāng)替代任何天然及非天然氨基酸將會(huì)形成基于所述替代的所需化合物。這樣的變化已考慮在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在以下流程、制備和實(shí)施例的說(shuō)明中所使用的縮寫(xiě)如下THF四氫呋喃DMFN，N-二甲基甲酰胺EtOAc乙酸乙酯AcOH乙酸HOOBt3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮EDCl1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽NMMN-甲基嗎啉ADDP1，1’-(偶氮二羰基(azodicarbobyl))二哌啶DEAD二乙基偶氮二羧酸酯MeOH甲醇EtOH乙醇Et2O乙醚DMSO二甲基亞砜HOBtN-羥基苯并三唑PyBrOP溴-三-吡咯烷基磷鎓六氟磷酸鹽
DCM二氯甲烷DCC1，3-二環(huán)己基碳二亞胺TEMPO2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧基Phg苯基甘氨酸Chg環(huán)己基甘氨酸Bn芐基Bzl芐基Et乙基Ph苯基iBoc異叔丁氧基羰基iPr異丙基tBu或But叔丁基Boc叔丁氧基羰基Cbz芐氧基羰基Cp環(huán)戊二烯基Ts對(duì)甲苯磺?；鵐e甲基HATUO-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽Bop苯并三唑-1-基-氧-三(二甲基氨基)六氟磷酸酯一般制備流程以下流程介紹中間體單元的合成方法
流程1
流程2
流程4
流程5
流程7
流程8 其中R＝ 和
流程9 其中R＝ 和
流程10
流程11
流程12 流程13
流程14
流程16 流程17

流程18 流程19 流程20
制備中間體制備實(shí)施例1步驟A化合物(1.1) 將化合物(1.08)(3.00g，12.0mmol；(S.L.Harbeson等J.Med.Chem.；37(18)1994；2918-2929；)的DMF(15mL)和CH2Cl2(15mL)溶液在-20℃攪拌下加入HOOBt(1.97g，12.0mmol)、N-甲基嗎啉(4.0mL，36.0mmol)和EDCl(2.79g，14.5mmol)，攪拌10分鐘，然后加入HCl·H2N-Gly-OBn(2.56g，13.0mmol)。將所得溶液在-20℃攪拌2小時(shí)，冷藏保存過(guò)夜，然后濃縮至干，接著用EtOAc(150mL)稀釋。將EtOAc溶液用飽和NaHCO3、H2O、5％H3PO4、鹽水洗滌兩次，用Na2SO4干燥，過(guò)濾，濃縮至干獲得化合物(1.09)(4.5g，94％)。LRMSm/z MH+＝395.1。
步驟B化合物(1.1) 將化合物(1.09)(7.00g，17.8mmol)的無(wú)水乙醇(300mL)溶液在室溫于氫氣氛并存在Pd-C(300mg，10％)下攪拌。反應(yīng)進(jìn)度通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)。在2小時(shí)后，將混合物通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，所得溶液經(jīng)真空濃縮獲得化合物(1.1)(5.40g，定量)。LRMS m/z MH+＝305.1。
制備實(shí)施例2步驟A化合物(1.3) 將以上制備實(shí)施例1步驟B的化合物(1.1)(1eq.)、化合物(1.2)(Novabiochem，第04-12-5147號(hào))(1.03eq.)、HOOBt(1.03eq.)、N-甲基嗎啉(2.2eq.)和二甲基甲酰胺(70mL/g)的混合物在-20℃攪拌。加入EDCl(1.04eq.)，反應(yīng)物攪拌48小時(shí)。將反應(yīng)混合物傾入5％KH2PO4水溶液，用乙酸乙酯(2×)萃取。合并的有機(jī)物依次用5％K2CO3冷水溶液、5％KH2PO4水溶液、鹽水洗滌，有機(jī)層用無(wú)水MgSO4干燥。過(guò)濾混合物，然后蒸發(fā)，真空干燥濾液，殘余物用Et2O-己烷研磨，過(guò)濾獲得標(biāo)題化合物(1.3)(86％收率)，C25H39N3O7(493.60)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝494.3。
步驟B化合物(1.4) 將制備實(shí)施例2步驟A的化合物(1.3)(3.0g)用4N HCl/二氧六環(huán)(36mL)處理，在室溫下攪拌7分鐘。將混合物傾入1.5L冷(5℃)己烷并攪拌，然后保持低溫0.5小時(shí)?；旌衔镌诟稍锟諝庵谐闉V，將收集的固體進(jìn)一步干燥獲得標(biāo)題化合物(1.4)(2.3g，88％收率)，C20H31N3O5·HCl，H1NMR(DMSO-d6/NaOD)δ7.38(m，5H)，5.25(m，1H)，4.3-4.1(m，1H)，3.8(m，2H)，3.4-3.3(m，被D2O屏蔽)，1.7-1.1(m，4H)，1.35(s，9H)，0.83(m，3H)。
制備實(shí)施例3化合物(1.5) 制備實(shí)施例2步驟A的化合物(1.3)按照以下制備實(shí)施例7步驟A基本相同的方法獲得化合物(1.5)。
制備實(shí)施例4化合物(1.6) 制備實(shí)施例3的化合物(1.5)按照制備實(shí)施例2步驟B基本相同的方法處理獲得化合物(1.6)。
制備實(shí)施例5步驟A化合物(2.09) 二甲胺鹽酸鹽(1.61g，19.7mmol)、N-Boc-苯基甘氨酸、化合物(2.08)(4.50g，17.9mmol，Bachem Co.#A-2225)、HOOBt(3.07g，18.8mmol)和EDCl(4.12g，21.5mmol)的無(wú)水DMF(200mL)和CH2Cl2(150mL)溶液在-20℃加入NMM(5.90mL，53.7mmol)。在上述溫度攪拌30分鐘后，將反應(yīng)混合物保存在冰箱中過(guò)夜(18h)。然后加溫至室溫，加入EtOAc(450mL)、鹽水(100mL)和5％H3PO4(100mL)。分出各層后，有機(jī)層用5％H3PO4(100mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2×150mL)、水(150mL)和鹽水(150mL)洗滌，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，然后真空濃縮獲得白色固體化合物(2.09)(4.86g)，使用時(shí)無(wú)需再提純。
步驟B化合物(2.1) 將制備實(shí)施例5步驟A的化合物(2.09)(4.70g，粗品)溶于4N HCl(60mL，240mmol)，所得溶液在室溫下攪拌。反應(yīng)進(jìn)度通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)。4小時(shí)后，真空濃縮上述溶液獲得白色固體化合物(2.1)，它在下一步反應(yīng)中直接使用無(wú)需再提純。LRMS m/z MH+＝179.0。
制備實(shí)施例6步驟A化合物(2.2) 按照制備實(shí)施例2步驟A基本相同的方法，用苯基甘氨酸N，N-二甲基酰胺鹽酸鹽代替苯基甘氨酸叔丁酯鹽酸鹽制備化合物(2.2)。質(zhì)譜(FAB)M+1＝465.3。
步驟B化合物(2.3) 使步驟A的化合物(2.2)(1.85g)與4N HCl/二氧六環(huán)(50mL)在室溫下反應(yīng)1小時(shí)?；旌衔镌?0℃水浴中真空蒸發(fā)，用異丙醚研磨，過(guò)濾，干燥獲得化合物(2.3)(1.57g，98％收率)，C18H28N4O4·HCl，質(zhì)譜。(FAB)M+1＝365.3
制備實(shí)施例7步驟A化合物(2.4) 將制備實(shí)施例5步驟A的化合物(2.2)(2.0g)的二氯甲烷(60mL)溶液用二甲基亞砜(3.0mL)和2，2-二氯乙酸(0.70mL)處理?；旌衔镌跀嚢柘吕鋮s至5℃，然后加入1M二環(huán)己基碳二亞胺/二氯甲烷溶液(8.5mL)。除去冷卻浴，攪拌混合物22小時(shí)。然后加入2-丙醇(0.5mL)，再攪拌1小時(shí)。過(guò)濾混合物，依次用冰冷的0.1N NaOH(50mL)、冰冷的0.1N HCl(50mL)、5％KH2PO4水溶液、飽和鹽水洗滌。有機(jī)溶液用無(wú)水硫酸鎂干燥，然后過(guò)濾。蒸發(fā)濾液，然后在硅膠上用色譜法提純，用乙酸乙酯洗脫獲得化合物(2.3)(1.87g，94％收率)，C23H34N4O6，質(zhì)譜(FAB)M+1＝463.3。
步驟B化合物(2.5) 按照制備實(shí)施例2步驟B基本相同的方法制備化合物(2.5)。
制備實(shí)施例8步驟A化合物(3.1) 在燒瓶中混合N-Cbz-羥脯氨酸甲酯(Bachem Biosciences，Incorporated，King of Prussia，Pennsylvania)、化合物(3.01)(3.0g)、甲苯(30mL)和乙酸乙酯(30mL)。將混合物劇烈地?cái)嚢瑁缓蠹尤隢aBr/水溶液(1.28g/5mL)。向此溶液加入2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧基自由基(TEMPO，17mg，Aldich Chemicals，Milwaukee，Wisconsin)?；旌衔镌跀嚢柘吕鋮s至5℃，然后在0.5小時(shí)內(nèi)滴加制備好的氧化劑溶液[用商業(yè)上可得到的漂白劑Clorox_(18mL)、NaHCO3(2.75g)和水配制成40mL]。向此溶液加入2-丙醇(0.2mL)。分出有機(jī)層，水層用乙酸乙酯萃取。合并有機(jī)層，先用2％硫代硫酸鈉洗滌，然后用飽和鹽水洗滌。有機(jī)溶液用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾，然后真空蒸發(fā)濾液，獲得適合下一步反應(yīng)用的淺黃色樹(shù)膠(2.9g，97％收率)，C14H15NO5(277.28)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝278.1。
步驟B化合物(3.2)
將上述步驟A的化合物(3.1)(7.8g)溶于二氯甲烷(100mL)，冷卻至15℃。在混合物中先加入1，3-丙二硫醇(3.1mL)，接著加入新蒸餾的醚合三氟化硼(3.7mL)。將混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。在劇烈攪拌的同時(shí)，小心地加入K2CO3/水溶液(2g/30mL)，接著加入飽和NaHCO3(10mL)。將有機(jī)層從水層(pH～7.4)分出，依次用水(10mL)，鹽水洗滌。有機(jī)溶液用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾，真空蒸發(fā)。殘余物在硅膠上用色譜法提純，洗脫時(shí)先用甲苯，再用梯度的己烷-Et2O(2∶3至0∶1)獲得褐色油狀物(7.0g，68％收率)，C17H21NO4S2(367.48)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝368.1。
步驟C化合物(3.3) 將以上步驟B的化合物(3.2)(45g)的乙腈(800mL)溶液立刻在20℃用新蒸餾的碘代三甲基硅烷(53mL)處理。將反應(yīng)物攪拌30分鐘，然后傾入新制備的二碳酸二叔丁酯(107g)、乙醚(150mL)和二異丙基乙胺(66.5mL)溶液。將混合物再攪拌30分鐘，然后用己烷(2×500mL)洗滌。將乙酸乙酯(1000mL)加入下面的乙腈層，然后將此層用10％KH2PO4水溶液(2×700mL)和鹽水洗滌。濾液在25℃的水浴中真空蒸發(fā)，再溶解于新的乙酸乙酯(1000mL)，然后依次用0.1N HCl、0.1NNaOH、10％KH2PO4和鹽水洗滌。有機(jī)溶液用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾，真空蒸發(fā)。殘余物(66g)在硅膠(2kg)上用色譜法提純，洗脫時(shí)先用己烷(2L)，然后用Et2O/己烷(55∶45，2L)，再用Et2O(2L)洗脫，獲得橙色樹(shù)膠，它在放置時(shí)緩慢地結(jié)晶(28g，69％收率)，C14H23NO4S2(333.46)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝334.1。
步驟D化合物(3.4) 以上步驟C的化合物(3.3)(11g)的二氧六環(huán)(150mL)溶液在20℃用1N LiOH水溶液(47mL)處理，攪拌30小時(shí)。在30℃水浴中真空濃縮混合物至一半的體積。將殘留物用水(300mL)稀釋，用Et2O(2×200mL)萃取。將水層用12N HCl(3-4mL)酸化至pH～4，用乙酸乙酯萃取，然后用鹽水洗滌。有機(jī)溶液用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾，然后真空蒸發(fā)獲得化合物(3.4)(8.1g，78％)，C13H21NO4S2(319.44)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝320.1。
步驟E化合物(3.5) 在以上步驟C的化合物(3.3)(1g)的二氧六環(huán)(5mL)溶液中加入4N HCl-二氧六環(huán)溶液(50mL)。將混合物劇烈地?cái)嚢?小時(shí)。在25℃的水浴中真空蒸發(fā)混合物。殘余物用Et2O研磨，然后過(guò)濾獲得標(biāo)題化合物(0.76g，93％收率)，C9H15NO2S2·HCl(269.81)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝234.0。
制備實(shí)施例9步驟A化合物(3.6) 按照制備實(shí)施例8步驟B的基本相同的方法，用乙烷二硫醇代替丙烷二硫醇，獲得化合物(3.6)。
步驟B化合物(3.7) 按照制備實(shí)施例8步驟C的基本相同的方法，用化合物(3.6)代替化合物(3.2)，獲得產(chǎn)物化合物(3.7)。
步驟C化合物(3.8)
按照制備實(shí)施例8步驟D的基本相同的方法，用化合物(3.7)代替化合物(3.3)，獲得產(chǎn)物化合物(3.8)。
步驟D化合物(3.9) 按照制備實(shí)施例8步驟E的基本相同的方法，用化合物(3.7)代替化合物(3.3)獲得產(chǎn)物化合物(3.9)。
制備實(shí)施例10步驟A化合物(4.1) 按照制備實(shí)施例2步驟A的基本相同的方法制備化合物(4.1)C33H48N4O9S2(708.89)。
步驟B化合物(4.2) 按照制備實(shí)施例2步驟B的基本相同的方法制備化合物(4.2)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝609.3。
步驟C化合物(4.3) 按照制備實(shí)施例2步驟A的基本相同的方法制備化合物(4.3)，C41H61N5O10S2(708.89)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝709.3。
步驟D化合物(4.4) 按照制備實(shí)施例7步驟A的基本相同的方法制備化合物(4.4)。
制備實(shí)施例11步驟A化合物(4.5) 按照制備實(shí)施例2步驟A的基本相同的方法制備化合物(4.5)。
步驟B化合物(4.6) 按照制備實(shí)施例2步驟B的基本相同的方法制備化合物(4.6)。
步驟C化合物(4.7) 按照制備實(shí)施例2步驟A的基本相同的方法，使制備實(shí)施例12的化合物(4.9)與以上步驟B的化合物(4.6)反應(yīng)獲得化合物(4.7)。
步驟D化合物(4.8) 按照制備實(shí)施例7步驟A基本相同的方法制備化合物(4.8)。
制備實(shí)施例12化合物(4.9)i-BuOCOCl+H-Chg-OH→lboc-Chg-OH(4.01) (4.02) (4.9)L-環(huán)己基甘氨酸(4.02)(1.0eq.)、二甲基甲酰胺(20mL/g)和二異丙基乙胺(1.1eq.)的溶液在5℃用氯甲酸異丁酯(4.01)(1.1eq.)處理。除去冷卻浴，將其攪拌6小時(shí)。將反應(yīng)混合物傾入5％KH2PO4水溶液，用乙酸乙酯(2×)萃取。合并的有機(jī)層依次用5％K2CO3冷水溶液、5％KH2PO4水溶液、鹽水洗滌，將有機(jī)層用無(wú)水MgSO4干燥。過(guò)濾混合物，真空蒸發(fā)濾液，如果需要?dú)堄辔镉蒙V法提純，否則殘余物用Et2O-己烷研磨，過(guò)濾獲得標(biāo)題化合物(4.9)，C13H23NO4(257.33)。
制備實(shí)施例13化合物(13.1)i-BuOCOCl+H-Thr(Bzl)-OH→Iboc-Thr(Bzl)-OH(4.01) (13.02)(13.1)按照制備實(shí)施例12基本相同的方法，用L-O-芐基蘇氨酸(13.02)(Wang等，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，(1997)No.5，621-624.)代替L-環(huán)己基甘氨酸(4.02)制備化合物(13.1)C16H23NO5(309.36)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝310.2。
制備實(shí)施例14 使制備實(shí)施例11步驟D的化合物(4.8)(1.0g)與無(wú)水三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，50mL)溶液反應(yīng)2小時(shí)。將溶液用二甲苯(100mL)稀釋，真空蒸發(fā)。將殘余物用Et2O研磨，過(guò)濾獲得標(biāo)題化合物(5.1)(0.9g)，C37H53N5O9S2(775.98)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝776.5。
步驟B化合物(5.2) 按照制備實(shí)施例2步驟A基本相同的方法，使化合物(5.1)與氨(0.5M 1，4-二氧六環(huán)溶液)反應(yīng)獲得標(biāo)題化合物(5.2)C37H54N6O8S2(774.99)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝775.4。
制備實(shí)施例15 將制備實(shí)施例14步驟A的化合物(5.1)(0.15g)、N，N-二甲胺(0.12mL的2M THF溶液)、二甲基甲酰胺(10mL)和PyBrOP偶合試劑(0.11g)的混合物冷卻至5℃，然后加入二異丙基乙胺(DIEA或DIPEA，0.12mL)。混合物在低溫?cái)嚢?分鐘，然后在室溫下攪拌6小時(shí)。將反應(yīng)混合物傾入5％H3PO4冷水溶液(50mL)，用乙酸乙酯(2×)萃取。合并的有機(jī)層依次用5％K2CO3冷水溶液、5％KH2PO4水溶液、鹽水洗滌。有機(jī)溶液用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾，真空蒸發(fā)。殘余物在硅膠上用色譜法提純，洗脫時(shí)用MeOH-CH2Cl2獲得標(biāo)題化合物(5.3)，C39H58N6O8S2(803.05)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝803.5。
制備實(shí)施例16步驟A化合物(6.2) 按照制備實(shí)施例2步驟A基本相同的方法，使化合物(6.1)羥脯氨酸芐酯鹽酸鹽與制備實(shí)施例12的化合物(4.9)反應(yīng)獲得標(biāo)題化合物(6.2)C25H36N2O6(460.56)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝461.2。
步驟B化合物(6.3) 按照制備實(shí)施例8基本相同的方法制備化合物(6.3)C25H34N2O6(458.55)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝459.2。
步驟C化合物(6.4) 將步驟B的化合物(6.3)(1g)、10％Pd/C(0.05g)和EtOH(100mL)的混合物在1個(gè)大氣壓H2氣氛下攪拌6小時(shí)。將混合物過(guò)濾，然后真空蒸發(fā)至干，獲得標(biāo)題化合物(6.4)(0.77g)，C18H28N2O6(368.42)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝369.2。
制備實(shí)施例17步驟A化合物(7.1) 按照制備實(shí)施例2步驟A基本相同的方法，使制備實(shí)施例16步驟C的化合物(6.4)與制備實(shí)施例6步驟B的化合物(2.3)反應(yīng)獲得化合物(7.1)，C36H54N6O9(714.85)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝715.9。
步驟B化合物(7.2) 化合物(7.1)按照制備實(shí)施例7步驟A的基本相同的方法反應(yīng)獲得化合物(7.2)，C36H52N6O9(712.83)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝713.5。
步驟C化合物(7.3) 以上步驟B的化合物(7.2)按照制備實(shí)施例8步驟B的基本相同的方法與1，4-丁二硫醇反應(yīng)獲得標(biāo)題化合物(7.3)，C40H60N6O8S2(817.07)，質(zhì)譜(FAB)M+1＝817.5。
利用上述方法制備附表2中的化合物。作為至此所有表格以及本說(shuō)明書(shū)中的實(shí)施例和流程的總注釋在實(shí)施例和表格中化學(xué)結(jié)構(gòu)化合價(jià)不夠的任何開(kāi)端氮原子是指NH，為末端氮時(shí)指-NH2。同樣，在實(shí)施例和表中化合價(jià)不夠的任何開(kāi)端氧原子是指-OH。
固相合成固相偶合反應(yīng)的一般方法合成是在反應(yīng)容器中完成，容器由在底部裝配有聚丙烯濾板(frit)的聚丙烯注射針筒構(gòu)成。Fmoc-保護(hù)的氨基酸在標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)下偶合。每個(gè)反應(yīng)容器中裝有100mg的初始Fmoc-Sieber樹(shù)脂(大約0.03mmol)。樹(shù)脂用每份2mL的DMF(2次)洗滌。用2mL20％v/v的哌啶DMF溶液處理20分鐘去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。樹(shù)脂用每份2mL的DMF(4次)洗滌。偶合在DMF(2mL)中完成，使用0.1mmol Fmoc-氨基酸、0.1mmol HATU[O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟膦酸鹽]和0.2mmol DIPEA(N，N-二異丙基乙胺)。振蕩2小時(shí)后，排干反應(yīng)容器，將樹(shù)脂用每份2mL的DMF(4次)洗滌。用下一個(gè)Fmoc-氨基酸或封端基團(tuán)重復(fù)偶合過(guò)程。
固相Dess-Martin氧化的一般方法合成是在反應(yīng)容器中進(jìn)行，容器由在底部裝配有聚丙烯濾板的聚乙烯注射針筒構(gòu)成。結(jié)合在樹(shù)脂上的羥基化合物(大約0.03mmol)用0.12mmol Dess-Martin全碘烷(Periodinane)和0.12mmol t-BuOH的2mL DCM溶液處理4小時(shí)。樹(shù)脂用每份2mL的20％v/v iPrOH的DCM溶液、THF、50％v/v THF水溶液(4次)、THF(4次)和DCM(4次)洗滌。
制備實(shí)施例18制備N-Fmoc-2’，3’-二甲氧基苯基甘氨酸化合物(901) 氰化鉀(1.465g，22.5mmol)和碳酸銨(5.045g，52.5mmol)的水(15mL)溶液中加入2，3-二甲氧基苯甲醛901A(2.5g，15mmol)的乙醇(15mL)溶液。將反應(yīng)物混合物在40℃加熱24小時(shí)。減壓蒸發(fā)使溶液體積減至10mL。加入濃鹽酸(15mL)，獲得白色沉淀化合物901B。過(guò)濾分離出化合物901B(2.2g，9.3mmol)。將化合物901B溶于10％w/w氫氧化鈉水溶液(15mL)，所得溶液加熱回流24小時(shí)。加入濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至中性(pH7)。將所得包含化合物901C的溶液減壓蒸發(fā)。將殘余物溶于5％w/w碳酸氫鈉水溶液(150mL)。溶液在冰浴中冷卻至0℃，并在0℃加入1，4-二氧六環(huán)(30mL)和9-芴基甲基琥珀酰亞胺基碳酸酯(2.7g，8mmol)的1，4-二氧六環(huán)(30mL)溶液。將反應(yīng)混合物加溫至室溫，在室溫下攪拌24小時(shí)。減壓蒸去1，4-二氧六環(huán)。用乙醚洗滌水溶液。加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至酸性(pH1)。加入乙酸乙酯，有機(jī)層用水和鹽水洗滌。有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥。減壓蒸去溶劑獲得所需的白色泡沫狀固體化合物901(3.44g，7.9mmol)。MS(LCMS-電噴霧)434.1MH+。
制備實(shí)施例19化合物(801) 將N-Fmoc-苯基丙氨酸801A(5g，12.9mmol)的無(wú)水DCM(22mL)溶液在干冰-丙酮浴中冷卻至-30℃，依次加入N-甲基吡咯烷(1.96mL，16.1mmol)和氯甲酸甲酯(1.2mL，15.5mmol)。反應(yīng)混合物在-30℃攪拌1小時(shí)，加入N，O-二甲基羥胺鹽酸鹽(1.51g，15.5mol)和N-甲基吡咯烷(1.96mL，16.1mmol)的無(wú)水DCM(8mL)溶液。將反應(yīng)混合物加溫至室溫，并在室溫下攪拌過(guò)夜。加入甲苯，將有機(jī)層用稀鹽酸、碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌。有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥。減壓蒸去溶劑獲得化合物801B(4g，9.29mmol)。
Red-Al(6.28mL，21.4mmol)的無(wú)水甲苯(8mL)溶液在干冰-丙酮浴中冷卻至-20℃，加入化合物801B(4g，9.29mmol)的無(wú)水甲苯(12mL)溶液。將反應(yīng)混合物在-20℃攪拌1.5小時(shí)。有機(jī)層用稀鹽酸、碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌。有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥。減壓蒸去溶劑，粗產(chǎn)物801C在下一步反應(yīng)直接使用無(wú)需再提純。
化合物801C(大約9.29mmol)的己烷(15mL)溶液中依次加入氰化鉀(24mg，0.37mmol)和叔丁基碘化銨(34mg，0.092mmol)的水(4mL)溶液以及丙酮合氰化氫(1.27mL，13.9mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。加入乙酸乙酯，有機(jī)層用水和鹽水洗滌。有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥。減壓蒸去溶劑獲得化合物801D(2.4g，6.03mmol)。
化合物801D(2.4g，6.03mmol)的1，4-二氧六環(huán)(11mL)溶液中加入濃鹽酸(11mL)。將反應(yīng)混合物在80℃加熱3小時(shí)。加入乙酸乙酯(25mL)和水(25mL)。有機(jī)層用鹽水洗滌，用無(wú)水硫酸鈉干燥。減壓蒸去溶劑獲得所需白色泡沫狀固體化合物801(2g，4.8mmol)。MS(LCMS-電噴霧)418.1MH+。
流程8
實(shí)施例(301J)流程8化合物(301J) 從100mg Fmoc-Sieber樹(shù)脂(0.03mmol)開(kāi)始，結(jié)合在樹(shù)脂上的化合物301B、301C、301D、301E、301F和301G按照固相偶合反應(yīng)的一般方法制備。按照固相Dess-Martin氧化的一般方法，將結(jié)合在樹(shù)脂上的化合物301G氧化成結(jié)合在樹(shù)脂上的化合物301H。將結(jié)合在樹(shù)脂上的化合物301H用4mL 2％v/v TFA的DCM溶液處理5分鐘。濾液加入到1mL AcOH中，將溶液真空離心濃縮獲得化合物301J(0.0069g，29％收率)。MS(LCMS-電噴霧)771.2MH+。
利用上文詳細(xì)說(shuō)明的固相合成技術(shù)和以下式I化合物的各種官能團(tuán)部分，制備表3中的化合物-W- Y-W-



-R4 -Z- -R3

-R2 -R1 -R5 -R7 -R9
-R10 -R1’ -R2’

表3.固相合成制備的化合物





































制備的其它化合物及其活性(Ki*)范圍在附表4和附表5中列出。制備表4和表5中化合物的方法概述如下
I)合成表4和表5化合物的中間體實(shí)施例I.合成4，4-二甲基脯氨酸甲酯(H-Pro(4，4-diMe)-OMe) 步驟1.合成N-叔丁氧基羰基-4-甲基-L-焦谷氨酸叔丁酯(Boc-PyroGlu(4-甲基)-OtBu) N-叔丁氧基羰基-焦谷氨酸叔丁酯(11.5g，40mmol)的THF(200mL)溶液在-78℃攪拌下于5分鐘內(nèi)滴加1M六甲基二硅疊氮化(disilazide)鋰的THF(42mL，42mmol)溶液。在30分鐘后，加入甲基碘(3.11mL，50mmol)。再在-78℃經(jīng)過(guò)2小時(shí)后，除去冷卻浴，加入50％氯化銨飽和水溶液(200mL)。將溶液攪拌20分鐘，然后用乙醚(3×200mL)萃取。合并的有機(jī)層用鹽水(200mL)洗滌，干燥(Na2SO4)，過(guò)濾并濃縮。殘余物色譜法(1∶1乙酸乙酯/己烷)獲得Boc-PyroGlu(4-甲基)-OtBu(10.6g，35.4mmol，88％)的異構(gòu)體混合物(2∶1順式∶反式)。
步驟2.合成N-叔丁氧基羰基-4，4-二甲基-L-焦谷氨酸叔丁酯(Boc-PyroGlu(4，4-二甲基)-OtBu) N-叔丁氧基羰基-4-甲基-L-焦谷氨酸叔丁酯(1.2g，4.0mmol)的四氫呋喃(20mL)溶液在-78℃攪拌下于5分鐘內(nèi)滴加1M六甲基二硅疊氮化鋰的四氫呋喃(4.4mL，4.4mmol)溶液。在30分鐘后，加入甲基碘(0.33mL，5.2mmol)。再在-78℃經(jīng)過(guò)3小時(shí)后，除去冷卻浴，加入50％氯化銨飽和水溶液(40mL)。將溶液攪拌20分鐘，然后用乙醚(2×50mL)萃取。合并的有機(jī)層用水(2×25mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2×25mL)、鹽水(50mL)洗滌，干燥(Na2SO4)，過(guò)濾并濃縮獲得Boc-PyroGlu(4，4-二甲基)-OtBu(0.673g，54％)步驟3.合成N-叔丁氧基羰基-4，4-二甲基脯氨酸叔丁酯(Boc-Pro(4，4-二甲基)-OtBu) 改進(jìn)已知方法Pedregal，C.；Ezquerra，J.；Escribano，A.；Carreno，M.C.；Garcia Ruano，J.L.Tetrahedron Letters 1994，35(13)，2053-2056)。
N-叔丁氧基羰基-4，4-二甲基焦谷氨酸叔丁酯(2.0mmol)的四氫呋喃(5mL)溶液在-78℃攪拌下于5分鐘內(nèi)滴加1M三乙基硼氫化鋰的四氫呋喃(2.4mL，2.4mmol)溶液。在30分鐘后，除去冷卻浴，加入飽和碳酸氫鈉水溶液(5mL)。將反應(yīng)混合物浸入冰/水浴中，加入30％的過(guò)氧化氫水溶液(10滴)。將溶液在0℃攪拌20分鐘，然后真空濃縮反應(yīng)混合物以除去四氫呋喃。將水溶液用水(10mL)稀釋，用二氯甲烷(3×40mL)萃取。干燥(Na2SO4)有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮。將殘余物溶于二氯甲烷(20mL)和三乙基硅烷(310μL，2.0mmol)，然后冷卻至-78℃，滴加三氟化硼合乙醚(270μL，2.13mmol)。繼續(xù)攪拌30分鐘，本發(fā)明期間再加入三乙基硅烷(310μL，2.0mmol)和三氟化硼合乙醚(270μL，2.13mmol)。在-78℃再攪拌2小時(shí)，除去冷卻浴，加入飽和碳酸氫鈉水溶液(4mL)。5分鐘后將混合物用二氯甲烷(3×40mL)萃取。干燥(Na2SO4)有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮獲得Boc-Pro(4，4-二甲基)-OtBu。
步驟4.合成4，4-二甲基脯氨酸(H-Pro(4，4-二甲基)-OH) N-叔丁氧基羰基-4，4-二甲基脯氨酸叔丁酯的二氯甲烷(5mL)和三氟乙酸(5mL)溶液在室溫下攪拌5小時(shí)。將溶液濃縮，高真空下干燥，在下一步直接使用無(wú)需再提純。
步驟5.合成N-叔丁氧基羰基4，4-二甲基脯氨酸(Boc-Pro(4，4-二甲基)-OH) 在4，4-二甲基脯氨酸三氟乙酸鹽(1.5mmol)的二氧六環(huán)(7mL)、乙腈(12mL)和二異丙基乙胺(700μL，4mmol)溶液中加入二碳酸二叔丁酯(475mg，2.18mmol)的乙腈(5mL)溶液。在室溫下攪拌12小時(shí)后，將溶液真空濃縮，溶于飽和碳酸氫鈉水溶液(50mL)，然后用乙醚(3×40mL)洗滌。水層用檸檬酸酸化至pH＝3，然后用二氯甲烷(3×40mL)萃取。合并的有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。
步驟6.合成4，4-二甲基脯氨酸甲酯鹽酸鹽(HCl·H-Pro(4，4-二甲基)-OMe) Boc-Pro(4，4-diMe)-OH(0.5g，2.06mmol)的無(wú)水甲醇(8ml)溶液中滴加亞硫酰氯(448 l，6.18mmol)，將反應(yīng)物在室溫下攪拌6小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮獲得無(wú)定形固體(377mg，95％)。
實(shí)施例II.合成N-叔丁氧基羰基-4-烷基-4-甲基脯氨酸的一般方法 R基團(tuán)為烯丙基和芐基的化合物按照以下步驟1-4合成步驟1.合成N-叔丁氧基羰基-4-烷基-4-甲基-L-焦谷氨酸叔丁酯 N-叔丁氧基羰基-4-甲基-L-焦谷氨酸叔丁酯(10.2g，mmol)(參見(jiàn)實(shí)施例I步驟1)的四氫呋喃(170mL)溶液在-78℃攪拌下于5分鐘內(nèi)滴加1M六甲基二硅疊氮化鋰的四氫呋喃(37.5mL，37.5mmol)溶液。在40分鐘后，加入烷基鹵(61.4mmol)。在-78℃經(jīng)過(guò)3小時(shí)后，除去冷卻浴，加入50％飽和氯化銨水溶液(200mL)。將溶液攪拌20分鐘，然后用乙醚(2×200mL)萃取。合并的有機(jī)層用己烷(150mL)稀釋，然后用飽和碳酸氫鈉水溶液(100mL)、水(2×100mL)和鹽水(100mL)洗滌，干燥(Na2SO4)，過(guò)濾并濃縮。殘余物用快速色譜法(用含20％乙酸乙酯的己烷)獲得純N-叔丁氧基羰基-4-烷基-4-甲基-L-焦谷氨酸叔丁酯。
步驟2.合成N-叔丁氧基羰基-4-烷基-4-甲基脯氨酸叔丁酯 改進(jìn)已知方法Pedregal，C.；Ezquerra，J.；Escribano，A.；Carreno，M.C.；Garcia Ruano，J.L.Tetrahedron Letters(1994)35(13)，2053-2056)。
N-叔丁氧基羰基-4-烷基-4-甲基焦谷氨酸叔丁酯(16.6mmol)的四氫呋喃(40mL)溶液在-78℃攪拌下于10分鐘內(nèi)滴加1M三乙基硼氫化鋰的四氫呋喃(20mL，20mmol)溶液。在120分鐘后，將冷卻浴加溫至-25℃，本發(fā)明溫度加入飽和碳酸氫鈉水溶液(40mL)。將反應(yīng)混合物浸入冰／水浴中，加入30％的過(guò)氧化氫水溶液(4mL)。將溶液在0℃攪拌10分鐘，然后將反應(yīng)混合物真空濃縮以除去四氫呋喃。將水溶液用水(300mL)稀釋，用二氯甲烷(3×200mL)萃取。干燥有機(jī)層(硫酸鈉)，過(guò)濾并濃縮。將殘余物溶于二氯甲烷(100mL)和三乙基硅烷(2.6mL，mmol)，然后冷卻至-78℃，滴加三氟化硼合乙醚(2.2mL，mmol)。繼續(xù)攪拌1小時(shí)，本發(fā)明期間再加入三乙基硅烷(2.6mL，mmol)和三氟化硼合乙醚(2.2mL，mmol)。在-78℃再攪拌小時(shí)，除去冷卻浴，加入飽和碳酸氫鈉水溶液(30mL)和水(150mL)。5分鐘后將混合物用二氯甲烷(3×200mL)萃取。干燥有機(jī)層(Na2SO4)，過(guò)濾并濃縮。
步驟3.合成4-烷基-4-甲基脯氨酸 將N-叔丁氧基羰基-4-烷基-4-甲基脯氨酸叔丁酯的二氯甲烷(5mL)和三氟乙酸(5mL)溶液在室溫下攪拌5小時(shí)。加入甲苯，將溶液濃縮，然后在高真空下干燥。
步驟4.合成N-叔丁氧基羰基4-烷基-4-甲基脯氨酸 4-烷基-4-甲基脯氨酸三氟乙酸鹽(1.5mmol)的二氧六環(huán)(7mL)、乙腈(12mL)和二異丙基乙胺(700μL，4mmol)溶液中加入二碳酸二叔丁酯(475mg，2.18mmol)的乙腈(5mL)溶液。在室溫下攪拌12小時(shí)后，將溶液真空濃縮，溶于飽和碳酸氫鈉水溶液(50mL)，然后用乙醚(3×40mL)洗滌。將水相用1N鹽酸酸化至pH＝3，然后用二氯甲烷(3×40mL)萃取。將合并的有機(jī)層干燥(Na2SO4)，過(guò)濾并濃縮。殘余物用快速色譜法提純，使用1∶1乙酸乙酯/己烷和1％乙酸。
實(shí)施例III.合成N-叔丁氧基羰基4-丙基-4-甲基脯氨酸 N-叔丁氧基羰基-4-烯丙基-4-甲基脯氨酸(400mg，1.48mmol)(參見(jiàn)實(shí)施例II步驟4)和10％碳載鈀(400mg)的甲醇(20mL)溶液在50psi氫化4小時(shí)。將混合物過(guò)濾并濃縮。
實(shí)施例IV.合成Boc-4-環(huán)己基脯氨酸 商業(yè)得到的Boc-4-苯基脯氨酸(750mg)和5％碳載Rh(750mg)的甲醇(15mL)溶液在50psi氫化24小時(shí)。將混合物過(guò)濾并濃縮獲得730mg產(chǎn)物。
實(shí)施例V制備芴基甲氧羰基-脯氨酸(4-螺環(huán)戊烷)-羰酸 步驟1.合成Boc-焦谷氨酸(4-烯丙基)-叔丁酯 商業(yè)上得到的N-Boc-叔丁基焦谷氨酸酯(10g，35.1mmol)的THF(175ml)冷卻(-78℃)溶液中在5分鐘內(nèi)加入六甲基二硅疊氮化鋰(36.8mL，36.8mmol)。繼續(xù)攪拌30分鐘。將烯丙基溴(6.1ml，70.2mmol)的THF(39mL)溶液滴加到第一種溶液中。在-78℃經(jīng)過(guò)兩小時(shí)后，反應(yīng)物中緩慢地加入飽和氯化銨(50mL)溶液猝滅。將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋，將各層分離。有機(jī)層用硫酸鈉干燥后濃縮?？焖僦V法利用2∶8乙酸乙酯∶己烷獲得產(chǎn)物(6g，53％)。NMRδppm(CDCl3)5.7(m，1H)，5.1(dd，2H)，4.4(m，1H)，2.6(m，2H)，2.4(m，1H)，1.8-2.2(m，1H)，1.45(s，9H)，1.4(s，9H)。
步驟2.合成N-Boc-焦谷氨酸(4，4-二烯丙基)-叔丁酯
將以上步驟1獲得的N-Boc-焦谷氨酸(4-烯丙基)-叔丁酯(2.68g，8.24mmol)在同樣條件下用烯丙基溴第二次烷基化?？焖偕V法利用15∶85乙酸乙酯∶己烷獲得2.13g澄清油狀產(chǎn)物(71％)。
步驟3.合成Boc-脯氨酸(4，4-二烯丙基)-叔丁酯 步驟aBoc-PyroGlu(4，4-二烯丙基)-叔丁酯(2.l3g，5.83mmol)的四氫呋喃(14ml)冷卻(-78℃)溶液在5分鐘內(nèi)加入三乙基硼氫化鋰(1M的四氫呋喃溶液，7.29ml，7.29mmol)。在-78℃經(jīng)過(guò)2小時(shí)后，將反應(yīng)物加溫至0℃，緩慢地加入飽和碳酸氫鈉水溶液(20ml)和30％過(guò)氧化氫(20滴)猝滅。繼續(xù)攪拌20分鐘。減壓除去四氫呋喃，獲得的白色稠厚殘余物用水(80ml)稀釋，用二氯甲烷萃取三次。干燥有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮后用于下一步無(wú)需再提純。
步聚b)在步驟(a)獲得的產(chǎn)物的二氯甲烷(14ml)溶液中加入三乙基硅烷(931μl，5.83mmol)，接著加入三氟化硼合乙醚(776μl，6.12mmol)。在30分鐘后再加入三乙基硅烷(931μl，5.83mmol)和三氟化硼合乙醚(776μl，6.12mmol)，將反應(yīng)物在-78℃攪拌3小時(shí)，本發(fā)明期間緩慢地加入飽和碳酸氫鈉溶液和水猝滅。將反應(yīng)混合物用二氯甲烷萃取，干燥有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮。用快速柱色譜法(含15％乙酸乙酯的己烷)獲得1.07無(wú)色油狀物(57％)。NMRδppm(CDCl3)5.7-5.8(m，2H)，5.1(m，4H)，4.1-4.2(2dd’s，1H旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)，3.5-3.3(dd，1H)和3.2(dd，1H)旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，2.2-2.0(m，5H)，1.7(m，1H)，1.46(s，9H)，1.43(s，9H)。
步驟4.合成Boc-脯氨酸(4-螺環(huán)戊烯)-叔丁酯 Boc-脯氨酸(4，4-二烯丙基)-叔丁酯(1.07g，3.31mmol)的二氯甲烷(66ml)溶液中加入5％二氯化二(三環(huán)己基膦基)亞芐基釕IV(Grubbs催化劑)，將混合物回流加熱1.5小時(shí)。濃縮反應(yīng)混合物，殘余物用快速柱色譜法(用含15％乙酸乙酯的己烷)提純。獲得黃色油狀物(0.57g，53％)。NMRδppm(CDCl3)5.56(bs，2H)，4.2和4.1(t，1H，旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)，3.2-3.5(m，2H)，2.2-2.5(m，5H)，1.9(dd，1H)1.47和1.46(2s’s，9H，旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)，1.45和1.44(2s’s，9H，旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)。
步驟5.合成Boc-脯氨酸(4-螺環(huán)戊烷)-叔丁酯 將Boc-脯氨酸(4-螺環(huán)戊烯)-叔丁酯(1.12g)的甲醇(18ml)、水(4ml)和乙酸(4ml)溶液置于Parr振蕩器中，在35psi并存在10％碳載鈀(300mg)下氫化3小時(shí)。將催化劑濾除，濃縮濾液至無(wú)色油狀物(1.26g)。NMRδppm(CDCl3)4.1和4.2(t，1H，旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體，3.4(d，1H)，3.2(d，1H)，2.1(m，1H)，1.9(m，1H)，1.6-1.7(m，10H)，1.5(3s’s，18H，旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體)。
步驟6.合成Fmoc-脯氨酸(4-螺環(huán)戊烷)羧酸 將Boc-脯氨酸(4-螺環(huán)戊烷)-叔丁酯(1.26，3.9mmol)用二氯甲烷(10ml)和三氟乙酸(15ml)處理3小時(shí)。濃縮反應(yīng)混合物，將獲得得黃色油狀物溶于水(6ml)。分次加入溶于二氧六環(huán)(6ml)的芴基甲基琥珀酰碳酸酯(1.45g，4.3mmol)，接著加入碳酸鉀(2.16g，15.6mmol)。將反應(yīng)物攪拌18小時(shí)后濃縮。殘余物用飽和碳酸氫鈉溶液(10mL)稀釋，然后用乙醚(3×10ml)洗滌。將水層用1N硫酸氫鈉溶液酸化至pH～1，用乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮獲得淡棕色泡沫物(1.3g，100％)。
實(shí)施例VI.合成Boc-Pro(4t-NH(Fmoc))-OH
步驟1.合成Nα-叔丁氧基羰基-順式-4-氯-L-脯氨酸芐酯 將商業(yè)性獲得的N-叔丁氧基羰基-反式-4-羥基-脯氨酸(8.79g，38mmol)、碳酸鉀(13.0g，94mmol)、芐基溴(4.5ml，38mmol)和二甲基甲酰胺(150mL)的混合物攪拌18小時(shí)。加入乙酸乙酯(100mL)后過(guò)濾。加入1M HCl(100mL)使白色混濁濾液變澄清。將各層分離，水層再加入乙酸乙酯(2×100mL)萃取。合并的有機(jī)層用水洗滌(2×50mL)，干燥(硫酸鈉)，過(guò)濾并濃縮。將甲苯加入粗制的芐基酯，將溶液過(guò)濾后再濃縮。加入二氯甲烷(70mL)和四氯化碳(70mL)，接著加入三苯膦(21.11g，80mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌10小時(shí)，用乙醇(7mL)猝滅，再攪拌5小時(shí)。將溶液濃縮至約100ml，然后加入二氯甲烷(40mL)，接著攪拌下加入乙醚(200mL)。將溶液冷卻4小時(shí)，過(guò)濾并濃縮獲得黃褐色油狀物，將它用快速色譜法提純(用乙醚/己烷/二氯甲烷2∶2∶1)獲得白色固體標(biāo)題化合物(9.13g，26.9mmol，71％)。
步驟2.合成Nα-叔丁氧基羰基-反式-4-疊氮基-L-脯氨酸芐酯
將Nα-叔丁氧基羰基-順式-4-氯-L-脯氨酸芐酯(9.0g，26.5mmol)和疊氮化鈉(7.36g，113mmol)的二甲基甲酰胺(270mL)溶液在75℃加熱2天。加入水(100mL)，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。合并的有機(jī)層用水洗滌(3×50mL)，干燥(硫酸鈉)，過(guò)濾并濃縮。油狀物用快速色譜法提純(乙酸乙酯/己烷1∶1)獲得標(biāo)題化合物(8.59g，24.8mmol，94％)。
步驟3.合成Boc-Pro(4t-NH(Fmoc))-OH N-α-叔丁氧基羰基-反式-4-疊氮基-L-脯氨酸芐酯(8.59g，24.8mmol)和10％碳載鈀(900mg)在乙醇(500mL)中的混合物用Parr氫化裝置于50psi氫化14小時(shí)。將混合物過(guò)濾，濃縮，溶于甲醇(60mL)，再過(guò)濾并濃縮獲得無(wú)色油狀物。將油狀物溶于包含碳酸鈉(5.31g，50.1mmol)的水(53mL)中，在40分鐘內(nèi)加入芴基甲基琥珀酰碳酸酯(8.37g，29.8mmol)的二氧六環(huán)(60mL)溶液。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌17小時(shí)，然后濃縮除去二氧六環(huán)，用水(200mL)稀釋。溶液用乙醚(3×100mL)洗滌。加入檸檬酸(小心！發(fā)泡！)和水(100mL)調(diào)節(jié)水溶液的pH至2?；旌衔镉枚燃淄?400mL，100mL，100mL)萃取，將合并的有機(jī)層干燥(硫酸鈉)，過(guò)濾并濃縮獲得標(biāo)題化合物。
實(shí)施例VII.合成N-叔丁氧基羰基-4-反式-(N-芴基甲氧羰基氨基甲基)-L-脯氨酸(Boc-Pro(4t-MeNHFmoc)-OH) 步驟1.合成叔丁氧基羰基順式-4-羥基-L-脯氨酸芐酯(Boc-Pro(4-cis-OH)-OBn) 順式-羥基-L-脯氨酸(5g，38.1mmol)的苯(45mL)和芐醇(45mL)混合物中加入一水合對(duì)甲苯磺酸(7.6g，40.0mmol)。將反應(yīng)混合物在125℃加熱20小時(shí)，同時(shí)用Dean-Stark捕集器除去水(2ml)。趁熱過(guò)濾溶液，然后加入乙醚(150ml)。將溶液在室溫冷卻3小時(shí)，然后在4℃冷卻3小時(shí)。收集所得固體，用乙醚(100mL)洗滌，真空干燥1小時(shí)獲得13.5g白色固體。將固體溶于二氧六環(huán)(40mL)和二異丙基乙胺(7.6mL)，然后在5分鐘內(nèi)加入二碳酸二叔丁酯(10g，45.8mmol)，同時(shí)用冰浴保持恒定的反應(yīng)溫度。在室溫經(jīng)過(guò)10小時(shí)后，將反應(yīng)混合物傾入冷水(200mL)中，用乙酸乙酯(3×200mL)萃取。合并的有機(jī)層用水(3×100mL)和飽和氯化鈉水溶液(50mL)洗滌，干燥(硫酸鈉)，過(guò)濾并濃縮。粗產(chǎn)物用快速色譜法(用40-60％乙酸乙酯的己烷)提純獲得標(biāo)題化合物(10.04g，31.24mmol，82％)。
步驟2.合成N-叔丁氧基羰基順式-4-甲磺酰氧基-L-脯氨酸芐酯(Boc-Pro(4-cis-OMS)-OBn) Boc-Pro(4-cis-OH)-OBn(8.45g，26.3mmol)的吡啶(65mL)溶液在0℃于7分鐘內(nèi)滴加甲磺酰氯(3.4mL，44mmol)。將反應(yīng)混合物在2小時(shí)內(nèi)加溫至室溫，然后攪拌過(guò)夜。在15分鐘內(nèi)加入10％水的吡啶(20mL)溶液，濃縮反應(yīng)混合物。將殘余物溶于水，用乙酸乙酯(2×200mL)萃取。合并的有機(jī)層用水(2×50mL)、飽和碳酸氫鈉水溶液(50mL)和飽和氯化鈉水溶液(50mL)洗滌，干燥(硫酸鈉)，過(guò)濾并濃縮。將所得殘余物溶于甲苯(100mL)，濃縮除去痕量吡啶。真空干燥殘余物30分鐘，獲得標(biāo)題化合物(10.7g，102％)，然后用于下一步驟而無(wú)需提純。
步驟3.N-叔丁氧基羰基-反式-4R-氰基-L-脯氨酸芐酯(Boc-Pro(4-trans-CN)-OBn) 將Boc-Pro(4-cis-OMs)-OBn(10.7g，26.3mmol)和四丁基氰化銨(15.0g，56mmol)的二甲基甲酰胺(100mL)溶液用油浴在55℃加熱28小時(shí)。冷卻后，加入水(150mL)，混合物用乙酸乙酯(3×200mL)萃取。合并的有機(jī)層用水(3×100mL)和飽和氯化鈉水溶液(100mL)洗滌，干燥(硫酸鈉)，過(guò)濾并濃縮。將所得殘余物用快速色譜法(1∶1乙醚/己烷)提純，然后用乙酸乙酯/己烷重結(jié)晶獲得標(biāo)題化合物(2.40g，7.26mmol，28％)。
步驟4.N-叔丁氧基羰基-4-反式-(N-芴基甲氧羰基氨基甲基)-L-脯氨酸(Boc-Pro(4t-MeNHFmoc)-OH) 以上步驟3的化合物(2.31g，7mmol)、水(10mL)、甲醇(85mL)和10％碳載鈀(700mg)的混合物用Parr氫化裝置在50psi氫化11小時(shí)。過(guò)濾并濃縮混合物。將水(15mL)和碳酸鈉(1.5g，14.2mmol)加入殘余物。在5分鐘內(nèi)加入芴基甲基琥珀酰碳酸酯(2.36g，7.0mmol)的二氧六環(huán)(17mL)溶液，在室溫下連續(xù)攪拌28小時(shí)。真空濃縮反應(yīng)物至體積為15mL，加入水(100mL)。溶液用乙醚(3×75mL)洗滌。加入檸檬酸(約20g，小心！發(fā)泡！)和水(100mL)調(diào)節(jié)水溶液的pH至2?；旌衔镉枚燃淄?4×100mL)萃取，干燥(硫酸鈉)合并的有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮。粗產(chǎn)物包含一種必須經(jīng)3步純化的主要雜質(zhì)。將粗產(chǎn)物溶于二氯甲烷(50mL)和三氟乙酸(50mL)，攪拌5小時(shí)后濃縮。殘余物用制備型反相HPLC提純。將純4-(N-芴基甲氧羰基氨基甲基)脯氨酸三氟乙酸鹽(1.887g，3.93mmol)溶于二氧六環(huán)(10mL)、乙腈(20mL)和二異丙基乙胺(1.4mL，8mmol)。反應(yīng)混合物中加入二碳酸二叔丁酯(1.1g，5mmol)的二氧六環(huán)(5mL)溶液。在攪拌18小時(shí)后，加入檸檬酸(小心發(fā)泡！)和水(100mL)調(diào)節(jié)溶液的pH至2。混合物用乙酸乙酯(3×150mL)萃取，合并的有機(jī)層用飽和氯化鈉水溶液(100mL)洗滌，干燥(硫酸鈉)，過(guò)濾并濃縮。將粗產(chǎn)物溶于飽和碳酸氫鈉水溶液(100mL)，然后用乙醚(3×75mL)洗滌。水相中加入檸檬酸調(diào)節(jié)pH＝3，然后用二氯甲烷(4×100mL)萃取。干燥(硫酸鈉)合并的有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮獲得標(biāo)題化合物(1.373g，2.94mmol，42％)。
實(shí)施例VIII.合成3，4-亞異丙基脯氨醇
步驟1.環(huán)丙烷化反應(yīng)(Tetrahedron Lett.1993.34(16)2691和2695) 異丙基三苯基碘化鏻(4.14g，9.58mmol)的四氫呋喃(60mL)溶液在0℃攪拌下于5分鐘加入正丁基鋰(1.6M的己烷溶液，5.64mL，9.02mmol)。30分鐘后，在10分鐘內(nèi)加入烯酰胺((5R，7S)-5-苯基-5，6，7，7a-四氫-6-氧雜pyrrolizin-3-酮)(1.206g，6.0mmol)(關(guān)于合成烯酰胺原料參見(jiàn)J.Org.Chem.1999，64(2)，547)的四氫呋喃(40mL)溶液。再經(jīng)過(guò)10分鐘后，除去冷卻浴，在室溫下攪拌反應(yīng)混合物4小時(shí)。將反應(yīng)物傾入水(400mL)中，用乙醚(400mL)和乙酸乙酯(2×400mL)萃取。用硫酸鈉干燥合并的有機(jī)萃取液，過(guò)濾并濃縮獲得所需的粗產(chǎn)物。殘余物用快速色譜法提純，洗脫時(shí)用3∶5∶2乙酸乙酯/己烷/二氯甲烷獲得純環(huán)丙烷化產(chǎn)物(750mg，3.08mmol，51％)。
步驟2.合成3，4-亞異丙基脯氨醇(P[3，4-(diMe-環(huán)丙基)]-乙醇)(J.Org.Chem.(1999)64(2)，330)
將以上步驟1獲得的產(chǎn)物(1.23g，5.06mmol)和氫化鋰鋁(1.0M的THF溶液，15mL，15mmol)的混合物加熱回流5小時(shí)。在冷卻至0℃后，在15分鐘內(nèi)滴加飽和硫酸鈉水溶液(1.5mL)小心地猝滅殘留的氫化鋁。用乙酸乙酯(40mL)稀釋混合物，然后用硅藻土過(guò)濾。用硫酸鈉干燥濾液，過(guò)濾并濃縮獲得粗制的N-芐基氨基醇(1.25g)，將其用于下一步無(wú)需再提純。粗制的N-芐基氨基醇(1.25g，5.06mmol)的1∶1乙酸/乙酸乙酯(30mL)溶液與10％Pd/C(1g)用Parr氫化裝置在50psi氫化16小時(shí)。過(guò)濾反應(yīng)混合物以除去碳載催化劑，濃縮濾液。將殘余物溶于水(30mL)，用50％NaOH調(diào)節(jié)pH至13?；旌衔镉靡颐?3×60mL)萃取。用硫酸鈉干燥合并的萃取液，過(guò)濾并濃縮獲得粗制的氨基醇(485mg，3.43mmol)。此產(chǎn)物用于下一步無(wú)需再提純。
實(shí)施例IX.合成iBoc-G(Chx)-Pro(3，4-亞異丙基)-羰酸 步驟1.合成異丁氧基羰基-環(huán)己基甘氨酸(Boc-G(Chx)-OH)
商業(yè)上可得到的環(huán)己基甘氨酸鹽酸鹽(15g，77.4mmol)的乙腈(320ml)和水(320ml)溶液中加入碳酸鉀。將氯甲酸異丁酯(11.1ml，85.1mmol)在15分鐘內(nèi)加入澄清的溶液中，攪拌反應(yīng)物17小時(shí)。減壓除去乙腈，殘留的水層用乙醚(100ml)萃取兩次。然后用6N鹽酸酸化水層至pH為1，用二氯甲烷(3×300ml)萃取。有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮獲得18.64g(94％)白色固體產(chǎn)物。
步驟2.合成異丁氧基羰基-環(huán)己基甘氨?；?3，4-亞異丙基脯氨酸(iBoc-G(Chx)-P[3，4-(diMe-環(huán)丙基)]-OH) a)偶合步驟iBoc-G(Chx)-OH(890mg，3.45mmol)的乙腈(20mL)溶液中加入HATU(1.33g，3.5mmol)、HOAt(476mg，3.5g)，然后加入二異丙基乙胺(2.5mL，14mmol)。2分鐘后，加入3，4-亞異丙基脯氨醇(485mg，3.43mmol)，攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜。加入飽和碳酸氫鈉水溶液后用乙醚和乙酸乙酯萃取。干燥合并的有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮。殘余物用快速色譜法提純，洗脫時(shí)用1∶1乙酸乙酯/己烷獲得純二肽醇iBoc-G(Chx)-3，4-亞異丙基脯氨醇(870mg，2.3mmol，67％)。
b)瓊斯氧化步驟二肽醇iBoc-G(Chx)-3，4-亞異丙基脯氨醇(100mg，0.26mmol)的丙酮(2mL)溶液在0℃攪拌下于5分鐘內(nèi)滴加瓊斯試劑(300μL)。[瓊斯試劑用三氧化鉻(13.4g)和濃硫酸(11.5mL)用水稀釋至總體積為50mL制備]。在0℃攪拌3小時(shí)后，加入異丙醇(500μL)，繼續(xù)攪拌10分鐘。用水(20mL)稀釋反應(yīng)混合物，用乙酸乙酯(3×70mL)萃取。將合并的有機(jī)層干燥，過(guò)濾并濃縮獲得二肽iBoc-G(Chx)-3，4-亞異丙基脯氨酸(100mg，0.25mmol，96％)。
實(shí)施例X.合成N-Cbz-3，4-橋亞甲基脯氨酸 步驟1.合成N-芐基-3，4-橋亞甲基脯氨醇 將亞芐基原料(J.Org.Chem.1999，64(2)，547)(4.6g，21.4mmol)和氫化鋰鋁(1.0M的THF溶液，64mL，64mmol)混合物加熱回流5小時(shí)。冷卻到0℃后，在15分鐘內(nèi)滴加飽和硫酸鈉水溶液(5mL)小心地猝滅殘留的氫化鋁。用乙酸乙酯(200mL)稀釋混合物，然后通過(guò)硅藻土過(guò)濾。濾液用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮獲得粗制的N-芐基氨基醇(3.45g)，它用于下一步無(wú)需再提純。
步驟2.合成N-芐氧基羰基-3，4-橋亞甲基脯氨醇(CBz-P(3，4-CH2)-醇) 粗制的N-芐基氨基醇(3g，14.76mmol)的甲醇(120mL)和濃HCl(1.5mL)溶液與10％Pd/C(300mg)在50psi氫化16小時(shí)。將反應(yīng)混合物過(guò)濾除去碳載催化劑，濃縮濾液。將殘余物溶于水/二氧六環(huán)(100mL)，加入二異丙基乙胺(3.2mL)。加入氯甲酸芐酯(2.76mL，16.2mmol)，攪拌反應(yīng)物過(guò)夜。將反應(yīng)混合物濃縮，溶于1M HCl(100mL)，用乙酸乙酯(3×200mL)萃取。合并的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過(guò)濾并濃縮。殘余物用快速色譜法(1∶3乙酸乙酯/己烷)提純獲得N-Cbz-3，4-橋亞甲基脯氨醇(2.4g)。
步驟3.合成N-芐氧基羰基-3，4-橋亞甲基脯氨酸(CBz-P(3，4-CH2)-OH) N-Cbz-3，4-橋亞甲基脯氨醇(2.2g，8.90mmol)的丙酮(68mL)溶液在0℃攪拌下于5分鐘內(nèi)滴加瓊斯試劑(6.6mL)。[瓊斯試劑三氧化鉻(13.4g)和濃硫酸(11.5mL)用水稀釋至總體積為50mL制備]在0℃攪拌3小時(shí)后，加入異丙醇(11mL)，再繼續(xù)攪拌10分鐘。反應(yīng)混合物用水(400mL)稀釋，用乙酸乙酯(3×500mL)萃取。合并的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過(guò)濾并濃縮獲得N-Cbz-3，4-橋亞甲基脯氨酸(2.25g，96％)實(shí)施例XI.合成Boc-(6S-乙酯基橋亞甲基)脯氨酸 按照公開(kāi)的方法合成標(biāo)題化合物Marrinozzi，M.；Nataini，B.；Ni，M.H.；Costantino，G.；Pellicciari R.IL Farmaco(1995)50(5)，327-331。
實(shí)施例XII.合成Boc-3-嗎啉羧酸 按照公開(kāi)的方法合成標(biāo)題化合物Kogami Y.，Okawa，K.Bull.Chem.Soc.Jpn.(1987)60，2963-2965。
實(shí)施例XIII.合成N-叔丁氧基羰基2-氮雜-3S-羥基羰基-[2，2，2]-二環(huán)辛烷 粗制的2-氮雜-2-(1-苯乙基)-3S-甲氧羰基-[2，2，2]-二環(huán)辛-5-烯(10mmol)(Tetrahedron(1992)48(44)9707-9718)和10％碳載鈀(1g)的甲醇(30mL)溶液用12N HCl酸化，然后用Parr氫化裝置在50psi氫化16小時(shí)。過(guò)濾反應(yīng)混合物除去碳載催化劑，濃縮濾液。殘余物溶于濃HCl，攪拌過(guò)夜。將溶液濃縮，再溶于乙腈(50mL)。加入二異丙基乙胺(3.5mL)和二碳酸二叔丁酯(1g)。將反應(yīng)混合物攪拌24小時(shí)，然后濃縮。殘余物溶于CH2Cl2和5％硫酸水溶液。反應(yīng)混合物用CH2Cl2萃取，濃縮合并的有機(jī)層。將殘余物溶于10％飽和碳酸氫鈉，用乙醚(2×)洗滌，用5％硫酸水溶液酸化。水層用乙酸乙酯(2×)萃取。合并的乙酸乙酯層經(jīng)干燥，過(guò)濾，濃縮獲得N-叔丁氧基羰基2-氮雜-3S-羥基羰基-[2，2，2]-二環(huán)辛烷(650mg)。
實(shí)施例XIV.合成異丁氧基羰基-環(huán)己基甘氨?；?4，4-二甲基脯氨酸(iBoc-G(Chx)-P(4，4-二甲基)-OH) 步驟1.合成iBoc-G(Chx)-P(4，4-二甲基)-OMe iBoc-G(Chx)-OH(實(shí)施例IX步驟1.)(377mg，1.95mmol)的乙腈(7mL)溶液中依次加入HCl·HN-Pro(4，4-二甲基)-OMe(實(shí)施例I步驟6)(377mg，1.95mmol)、N-羥基苯并三唑(239mg，1.75mmol)、TBTU(845mg，2.63mmol)和二異丙基乙胺(1.35mL，7.8mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮，殘留的殘余物溶于乙酸乙酯。有機(jī)層用每份10ml的飽和碳酸氫鈉溶液、1N鹽酸溶液和鹽水洗滌兩次。有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮獲得白色固體(612mg，79％)。
步驟2.合成iBoc-G(Chx)-P(4，4-二甲基)-OH 以上步驟1獲得的甲酯(612mg，1.54mmol)的甲醇(6ml)溶液在存在2M氫氧化鋰(1.16ml)下皂化3小時(shí)。減壓除去甲醇，殘余物用乙酸乙酯稀釋，用1N鹽酸酸化至pH＝2。將各層分離，有機(jī)層用水和鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。
實(shí)施例XV.合成L-苯基甘氨酸二甲基酰胺 步驟1.合成N-芐氧基羰基-L-苯基甘氨酸二甲基酰胺(CBz-Phg-NMe2)
將N-芐氧基羰基-L-苯基甘氨酸(25g，88mmols)溶于THF(800mL)并冷卻至-10℃。加入N-甲基嗎啉(9.7mL，88mmols)和氯甲酸異丁酯(11.4mL ，88.0mmols)，將混合物攪拌1分鐘。加入二甲胺(100mL，2M的THF溶液)，將反應(yīng)物加溫至室溫。過(guò)濾混合物，真空濃縮濾液獲得黃色油狀物N-芐氧基羰基-L-苯基甘氨酸二甲基酰胺(32.5g)。
步驟2.合成L-苯基甘氨酸二甲基酰胺(H-Phg-NMe2)將以上獲得的N-芐氧基羰基-L-苯基甘氨酸二甲基酰胺(32.5g)溶于甲醇(750ml)，加入10％活性碳載鈀(3.3g)。此混合物用Parr裝置在35psi氫氣氛下氫化2小時(shí)。過(guò)濾反應(yīng)混合物，真空除去溶劑，殘余物用甲醇-己烷重結(jié)晶獲得乳白色固體苯基甘氨酸二甲基酰胺(26g)。通過(guò)HPLC分析2，3，4，6-四-O-乙?；拎咸烟腔虼惽杷狨パ苌餃y(cè)定此產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量(ee)＞99％。
實(shí)施例XVI.合成(1-甲基環(huán)己基)甘氨酸
步驟1.1-甲基-1-羥甲基環(huán)己烷 1-甲基-L-羥基羰基環(huán)己烷(10g，70mmol)的四氫呋喃(300mL)溶液在0℃于90分鐘內(nèi)加入1M乙硼烷的四氫呋喃(200mL，200mmol)溶液。除去冷卻浴，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2天。在冷卻下，90分鐘內(nèi)緩慢地加入飽和硫酸氫鈉(10mL)猝滅殘留硼烷。再加入飽和硫酸氫鈉(200mL)，攪拌20分鐘后除去水層。有機(jī)層用水和飽和氯化鈉洗滌，干燥，過(guò)濾并濃縮。殘余物用快速色譜法(含20％乙醚的己烷)提純獲得1-甲基-1-羥甲基環(huán)己烷(6.17g，48mmol，69％)。
步驟2.1-甲基環(huán)己基甲醛 1-甲基-1-羥甲基環(huán)己烷(6.17g，48mmol)和三乙胺(20.1mL，144mmol)的二氯甲烷(150mL)溶液在0℃于15分鐘內(nèi)加入吡啶三氧化硫絡(luò)合物(22.9g，144mmol)的二甲基亞砜(150mL)溶液。在2小時(shí)內(nèi)將冷卻浴加溫至室溫，本發(fā)明期間將反應(yīng)混合物傾入冰鹽水(400mL)。將各層分離，水層用二氯甲烷(200mL)萃取。合并的有機(jī)層用己烷(600mL)稀釋，然后用1M HCl(2×150mL)、飽和氯化鈉(2×100mL)洗滌，干燥，過(guò)濾并濃縮。殘余物用快速色譜法提純獲得1-甲基環(huán)己基甲醛(1.77g，13.8mmol，29％)。
步驟3.合成N-甲?；?N-葡萄糖基-1-甲基環(huán)己基-叔丁基酰胺 合成2，3，4-三-O-新戊酰-D-阿拉伯糖基胺按照公開(kāi)的方法進(jìn)行(Kunz.H.；Pfrengle，W.；Ruck，K.；Wilfried，S.Synthesis(1991)1039-1042)。
1-甲基環(huán)己基甲醛(1.17g，8.34mmol)、2，3，4-三-O-新戊酰-D-阿拉伯糖基胺(8.3g，20.7mmol)、甲酸(850μL，22.2mmol)和叔丁基胩(2.4mL，21.2mmol)的四氫呋喃(170mL)溶液在-30℃加入0.5M氯化鋅的四氫呋喃(41mL，20.57mmol)溶液。將溶液在-20℃攪拌3天，然后濃縮。殘余物用CH2Cl2(500mL)稀釋，用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×500mL)、水(500mL)洗滌。將有機(jī)層干燥，過(guò)濾并濃縮獲得澄清油狀物。用快速色譜法(含20％乙酸乙酯的己烷)獲得純產(chǎn)物(4.3g，6.6mmol，33％)。
步驟4.合成(1-甲基環(huán)己基)甘氨酸
將以上步驟3獲得產(chǎn)物(4.3g，6.6mmol)的二氯甲烷(30mL)和飽和無(wú)水甲醇的HCl(30mL)溶液攪拌過(guò)夜。濃縮溶液，殘余物溶于水(100mL)，然后用戊烷(2×100mL)洗滌。濃縮水層，殘余物溶于6N HCl(50mL)，加熱回流30小時(shí)。濃縮溶液獲得粗制的(1-甲基環(huán)己基)甘氨酸鹽酸鹽(790mg，3.82mmol，58％)。
實(shí)施例XVII.合成(4，4-二甲基環(huán)己基)甘氨酸 步驟1.合成4，4-二甲基環(huán)己酮 將4，4-二甲基環(huán)己-2-烯-1-酮(12mL，91.2mmol)和Degussa型10％碳載鈀(2g)的混合物在40psi氫化18小時(shí)。將混合物過(guò)濾并濃縮(1H NMR顯示比例為5∶3的酮和醇混合物)。將混合物溶于丙酮(400mL)，冷卻至0℃。在30分鐘內(nèi)加入瓊斯試劑(40mL)，然后除去冷卻浴。2天后，蒸去過(guò)量的丙酮，將所得殘余物溶于水和乙醚。乙醚層用水洗滌至無(wú)色，干燥，過(guò)濾并濃縮獲得4，4-二甲基環(huán)己酮(7.4g，58.6mmol，64％)。
步驟2.合成4，4-二甲基環(huán)己基甲醛的甲基烯醇醚 甲氧基甲基三苯基氯化鏻(8.6g)的四氫呋喃(125mL)溶液在0℃于10分鐘內(nèi)加入正丁基鋰(1.6M的己烷溶液，14.3mL)。在30分鐘后，將反應(yīng)混合物冷卻至-78℃，在20分鐘內(nèi)加入4，4-二甲基環(huán)己酮(2.45g，19.1mmol)的四氫呋喃(50mL)溶液。1小時(shí)后除去冷卻浴，將反應(yīng)混合物緩慢地加溫至0℃。反應(yīng)物用飽和氯化銨(50mL)、乙酸乙酯(100mL)和己烷(100mL)稀釋。有機(jī)層用水和鹽水洗滌，干燥過(guò)濾并濃縮。將殘余物與己烷(70mL)攪拌10分鐘，過(guò)濾。濃縮濾液，用色譜法(含25％乙酸乙酯的己烷)獲得標(biāo)題化合物(1.925g，12.5mmol，65％)。
步驟34，4-二甲基環(huán)己基甲醛 將4，4-二甲基環(huán)己基甲醛的甲基烯醇醚(1.925g，12.5mmol)(以上步驟II)、四氫呋喃(100mL)和6M HCl(20mL)的溶液在室溫下攪拌4小時(shí)。反應(yīng)混合物用己烷、乙醚、鹽水和水稀釋。將有機(jī)層干燥，過(guò)濾并濃縮獲得4，4-二甲基環(huán)己基甲醛(1.0g，7.1mmol，57％)。
步驟4.合成N-甲酰基-N-葡萄糖基-4，4-二甲基環(huán)己基-叔丁基酰胺 4，4-二甲基環(huán)己基甲醛(1.17g，8.34mmol)、2，3，4-三-O-新戊酰-α-D-阿拉伯糖基胺(3.43g，8.55mmol)、甲酸(350μL，9.17mmol)和叔丁基胩(990μL，8.76mmol)的THF(70mL)溶液在-30℃加入0.5M氯化鋅的四氫呋喃(17mL，8.5mmol)溶液。將溶液在-20℃攪拌2天，然后濃縮。殘余物用二氯甲烷(200mL)稀釋，用飽和碳酸氫鈉水溶液(2×200mL)、水(200mL)洗滌。將有機(jī)層干燥，過(guò)濾并濃縮獲得澄清油狀物。用快速色譜法(含20％乙酸乙酯的己烷)獲得純產(chǎn)物(2.1g，3.3mmol，39％)。
步驟5.合成(4，4-二甲基環(huán)己基)甘氨酸 將以上步驟4獲得的Ugi產(chǎn)物(2.1g，3.3mmol)的二氯甲烷(20mL)和飽和無(wú)水甲醇的HCl(20mL)的溶液攪拌過(guò)夜。將溶液濃縮，殘余物溶于水(100mL)，然后用戊烷(2×100mL)洗滌。濃縮水層，將殘余物溶于6N HCl(40mL)并加熱回流30小時(shí)。濃縮溶液獲得粗制的(1-甲基環(huán)己基)甘氨酸鹽酸鹽(300mg，1.36mmol，41％)。
實(shí)施例XVIII.合成Boc-nVal-(CHOH)-Gly-OH 步驟1.制備Boc-正纈氨醇 將Boc-正纈氨酸(25.0g，0.115mol)的四氫呋喃(461mL)溶液冷卻至0℃，滴加硼烷/四氫呋喃絡(luò)合物(461mL 1.0M的四氫呋喃溶液)。在0℃經(jīng)過(guò)1小時(shí)后，將溶液在1.5小時(shí)內(nèi)加溫至室溫。TLC指示反應(yīng)完成。加入甲醇猝滅反應(yīng)。濃縮溶液獲得泡沫漿狀標(biāo)題化合物(22.56g，96％)。產(chǎn)物的TLC顯示獲得滿意的純度。Rf＝0.34(40％乙酸乙酯/己烷)。
步驟2.制備Boc-正纈氨醛 Boc-正纈氨醇(7.77g，38mmol)的無(wú)水二甲基亞砜(153mL)和甲苯(153mL)溶液中加入EDC(73.32g，382mmol)。將溶液冷卻至0℃后，滴加二氯乙酸(15.8mL，191mmol)。加入完畢后，將反應(yīng)物攪拌15分鐘。在2小時(shí)內(nèi)將溶液加溫至室溫。濃縮反應(yīng)混合物以除去甲苯，然后溶于乙酸乙酯。溶液依次用1N硫酸氫鈉、飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮獲得粗制的Boc-正纈氨醛，它直接用于下一步驟。TLC Rf＝0.84(40％乙酸乙酯/己烷)。
步驟3.合成Boc-nVal-(CHOH)-Gly-OEt 粗制的Boc-正纈氨醛(4.18g，20.77mmol)的二氯甲烷(83mL)溶液中加入異氰基乙酸乙酯(2.72ml，24.93mmol)和吡啶(6.72ml，83.09mmol)。將溶液冷卻至0℃后，滴加三氟乙酸(4.15ml，41.54mmol)。攪拌1小時(shí)后，將溶液在室溫下攪拌18小時(shí)，同時(shí)在無(wú)蓋容器中的反應(yīng)混合物在室溫下蒸發(fā)除去溶劑。將反應(yīng)混合物濃縮，然后溶于乙酸乙酯。溶液依次用1N硫酸氫鈉、飽和碳酸氫鈉和鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾后濃縮。殘余物用快速色譜法提純，洗脫時(shí)用20％-40％乙酸乙酯/己烷獲得2.8g黃色漿狀標(biāo)題化合物。用低分辨率質(zhì)譜證實(shí)存在所需要的產(chǎn)物(MH+333)。
步驟4.合成Boc-nVal-(CHOH)-Gly-OH 將獲得的產(chǎn)物(Boc-nVal-(CHOH)-Gly-OEt)(1.52g，4.70mmol)溶于乙醇(23ml)，用1N氫氧化鋰(18.81ml)在室溫下皂化2小時(shí)。將反應(yīng)混合物用Dowex_50 WX8離子交換樹(shù)脂酸化至pH≌2，攪拌20分鐘后過(guò)濾。將樹(shù)脂用乙醇和水充分洗滌，合并的濾液濃縮獲得白色泡沫狀物(0.48g，33％)。
實(shí)施例XVIV.合成(2R，3S，4S，5S)-N-CBz-3-氨基-2-羥基-4，5亞甲基-己酸叔丁酯 步驟1 二乙基膦?；宜崾宥□?4.7mL，20mmol)溶于THF(50mL)的溶液在-78℃加入1.6M正丁基鋰的己烷(12.4mL)溶液。30分鐘后，在10分鐘內(nèi)加入(1S，2S)-2-甲基環(huán)丙基甲醛(1g，12mmol)(Barrett，A.G.M.；Doubleday，W.W.；Kasdorf，K.；Tustin，G.J.，J.Org.Chem.(1996)61，3280)的乙醚(100mL)溶液。將反應(yīng)混合物加溫至0℃2小時(shí)，然后加溫至6℃12小時(shí)。反應(yīng)物用飽和氯化銨(20mL)猝滅，分出有機(jī)層，用50mL鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮獲得3.5g澄清油狀物。用快速色譜法(含20％乙酸乙酯的己烷)獲得純的不飽和叔丁酯(1.4g)。
步驟2 氨基甲酸芐酯(3.55g，23.5mmols)的正丙醇(24mL)溶液中加入氫氧化鈉(900mg，22.7mmol)的水(48mL)溶液，接著加入次氯酸叔丁基酯(2.57mL，22.7mmol)。在15分鐘后，將反應(yīng)物冷卻至0℃，加入(DHQ)2PHAL(350mg，0.45mmol)的正丙醇(24mL)溶液，接著加入上述不飽和叔丁酯(1.4g)的正丙醇(48mL)溶液。最后加入鋨酸鉀(110mg，0.30mmol)的水(2mL)溶液，溶液即刻形成深綠色，持續(xù)4小時(shí)。在6小時(shí)后，加入飽和硫酸鈉(50mL)，混合物用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。合并的有機(jī)層用鹽水(30mL)洗滌，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮?？焖偕V法(含20％乙酸乙酯的己烷)獲得所需要的cBz保護(hù)氨基的叔丁酯白色固體(316mg)。
步驟3
將CBz保護(hù)氨基的叔丁酯(316mg，0.9mmol)和32mg 10％碳載鈀在9mL甲醇中的混合物氫化8小時(shí)。過(guò)濾混合物并濃縮獲得為澄清油狀物的游離胺(195mg)。
實(shí)施例XX.合成1R，氯甲酸2-二甲基丙酯 商業(yè)上可得到的2R-羥基-3-甲基丁烷(410mg，4.65mmol)中加入20％碳酰氯的甲苯(1mL，2mmol)溶液。將溶液攪拌6小時(shí)產(chǎn)生氯甲酸酯(2mmol)，將它立即直接與需要的胺反應(yīng)。S-異構(gòu)體按照同樣的方法制備。
II)典型的液相合成HCV抑制劑實(shí)施例XXI.液相合成iBoc-G(Chx)-Pro(4，4-二甲基)-Leu-(CO)-Gly-Phg-二甲基酰胺
步驟1.合成叔丁氧基羰基-亮氨醛(Boc-Leu-CHO) 商業(yè)上可獲得的(Advanced Chem Tech)Boc-L-亮氨醇(O.78g，3.6mmol)的無(wú)水二氯甲烷(17.5ml)溶液中加入三乙胺(2ml，14.36mmol)，將混合物冷卻至O℃。加入二甲基亞砜(17.5ml)，接著加入吡啶三氧化硫絡(luò)合物(2.3g，14.36mmol)，將反應(yīng)物攪拌2小時(shí)。用TLC(1∶1乙酸乙酯∶己烷)確認(rèn)反應(yīng)完成。濃縮反應(yīng)混合物，殘余物用乙酸乙酯稀釋。乙酸乙酯層用1M鹽酸(2×5ml)洗滌，接著用飽和碳酸氫鈉溶液(2×75ml)和鹽水(75ml)洗滌。干燥(硫酸鈉)有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮獲得775mg產(chǎn)物。
步驟2.合成Boc-2-羥基-3-氨基-5-甲基己酰基-甘氨酸乙酯(Boc-Leu-(CHOH)-Gly-OEt) 溶液Boc-亮氨醛(0.77g，3.59mmol)的無(wú)水二氯甲烷(24ml)溶液中加入無(wú)水吡啶(1.16ml，14.36mmol)和異氰基乙酸乙酯(O.4ml，4.66mmol)。將反應(yīng)混合物冷卻至O℃，在2分鐘內(nèi)加入三氟乙酸(O.55ml，7/18mmol)。將反應(yīng)混合物蓋住，在4℃攪拌4天，在室溫下攪拌1天。反應(yīng)混合物用二氯甲烷(350ml)稀釋，用每份75ml的1M鹽酸、飽和碳酸氫鈉和鹽水各洗滌2次。將有機(jī)層干燥，過(guò)濾并濃縮。所得殘余物在2”×6”硅膠柱用快速色譜法提純，先用含10％乙酸乙酯的己烷(800ml)、接著用1∶1乙酸乙酯∶己烷(800ml)。合并產(chǎn)物相關(guān)部分，濃縮獲得980mg(79％)產(chǎn)物。
步驟3.合成Boc-Leu-(CHOH)-Gly-OH Boc-Leu-(CHOH)-Gly-Oet(0.98g，2.83mmol)的乙醇(11.3ml)溶液中加入2M氫氧化鋰(4.25ml)，將反應(yīng)物在室溫下攪拌5小時(shí)。減壓除去乙醇，水層用乙酸乙酯稀釋。有機(jī)層用1M鹽酸洗滌，接著用鹽水洗滌，干燥，過(guò)濾并濃縮獲得775mg(86％)白色固體產(chǎn)物。
步驟4.合成Boc-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-二甲基酰胺 Boc-Leu-(CHOH)-Gly-OH(0.37g，1.18mmol)的乙腈(23ml)溶液中依次加入苯基甘氨酸二甲基酰胺(實(shí)施例XV步驟2獲得)、EDC(0.34g，1.76mmol)、N-羥基苯并三唑(HOBt)(0.18g，1.18mmol)和二異丙基乙胺(DIEA)(0.82ml，4.7mmol)，將反應(yīng)物在室溫下攪拌18小時(shí)。濃縮反應(yīng)混合物，殘余物用乙酸乙酯稀釋，依次用每份75ml的1M鹽酸、飽和碳酸氫鈉和鹽水各洗滌兩次。然后干燥有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮。粗產(chǎn)物在2”×6”硅膠柱用快速色譜法提純，先用4∶1乙酸乙酯∶己烷(700ml)、接著用乙酸乙酯(1000ml)和含10％甲醇的二氯甲烷(600ml)洗脫。合并產(chǎn)物相關(guān)部分，濃縮獲得445mg(80％)白色固體。
步驟5.合成H-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-二甲基酰胺三氟乙酸鹽 Boc-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-二甲基酰胺(70mg，0.146mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液中加入三氟乙酸(1ml)，反應(yīng)物在室溫下攪拌1小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮，在下一步驟中使用無(wú)需再提純。
步驟6.合成iBoc-G(Chx)-Pro(4，4-二甲基)-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-二甲基酰胺 iBoc-G(Chx)-P(4，4-diMe)-OH(實(shí)施例XIV步驟2)(53mg，0.148mmol)的乙腈(3ml)溶液中依次加入TFA·2HN-Leu(CHOH)-Gly-Phg-NMe2(61mg，0.148mmol)、N-羥基苯并三唑(HOBt)(23mg，0.148mmol)、TBTU(71.5mg，0.222mmol)和二異丙基乙胺(103 1，0.593mmol)。反應(yīng)物在室溫下攪拌18小時(shí)，濃縮。將殘余物溶于乙酸乙酯，然后用1M鹽酸(2×5ml)、飽和碳酸氫鈉溶液(2×5ml)和鹽水(2×5ml)洗滌。干燥有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮。產(chǎn)物(100mg)在下一步驟中使用無(wú)需再提純。
步驟7.合成iBoc-G(Chx)-Pro(4，4-二甲基)-Leu-(CO)-Gly-Phg-二甲基酰胺 iBoc-G(Chx)-Pro(4，4-二甲基)-Leu-(CHOH)-Gly-Phg-二甲基酰胺(30mg，0.04mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液中加入商業(yè)性獲得的Dess-Martin試劑(Omega Chemical Company Inc.)(67.8mg，0.16mmol)，將反應(yīng)物在室溫下攪拌90分鐘。濃縮反應(yīng)混合物，將殘余物在5％硫代硫酸鈉中攪拌。然后將其用二氯甲烷稀釋，分出各層。有機(jī)層用硫代硫酸鈉(4×3ml)洗滌，接著用水和鹽水洗滌。有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。將粗產(chǎn)物溶于己烷和異丙醇，在正相Kromasil 5硅膠柱上(Phenomenex，250×21.20mm，100?？讖?，5μm膠粒)用HPLC提純，用含0-25％異丙醇的己烷(25ml/分鐘)進(jìn)行30分鐘梯度洗脫。合并產(chǎn)物相關(guān)部分，濃縮。用水冷凍干燥獲得6.7mg白色粉末。用低分辨率質(zhì)譜確認(rèn)所需要的質(zhì)譜(MH+＝741.4)。
III)固相合成固相合成可用于小量生產(chǎn)本發(fā)明的某些化合物。與常規(guī)固相合成肽一樣，用于固相合成肽基酮酰胺的反應(yīng)釜包括一個(gè)反應(yīng)容器，反應(yīng)容器至少有一面可滲透溶劑以及溶解的試劑，但不能滲透所選粒徑的合成樹(shù)脂。這樣的反應(yīng)釜包括帶有燒結(jié)玻璃濾板的玻璃固相反應(yīng)容器、帶有濾板的聚丙烯管或柱、或者由Irori Inc.，San Diego CA生產(chǎn)的KansTM反應(yīng)器。反應(yīng)釜類型根據(jù)所需要的固相樹(shù)脂體積選擇，不同類型的反應(yīng)釜可用在合成的不同階段。下面的方法將在接下來(lái)的實(shí)施例中引用方法A偶合反應(yīng)在樹(shù)脂的N-甲基吡咯烷(NMP)(10-15mL/克樹(shù)脂)懸浮液中加入N-Fmoc氨基酸(2eq)、HOAt(2eq)、HATU(2eq)和二異丙基乙胺(4eq)。讓混合物反應(yīng)4-48小時(shí)。將反應(yīng)物排出，樹(shù)脂依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷和乙醚(用10-15mL溶劑/克樹(shù)脂)洗滌。然后真空干燥樹(shù)脂。
方法B去除Fmoc保護(hù)Fmoc-保護(hù)的樹(shù)脂用20％哌啶的二甲基甲酰胺(10mL試劑/g樹(shù)脂)處理30分鐘。將反應(yīng)物排出，樹(shù)脂依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷和乙醚(10mL溶劑/克樹(shù)脂)洗滌。
方法C去除Boc保護(hù)Boc-保護(hù)的樹(shù)脂用1∶1的二氯甲烷和三氟乙酸混合物處理20-60分鐘(10mL溶劑/克樹(shù)脂)。將反應(yīng)物排出，樹(shù)脂依次用二氯甲烷、二甲基甲酰胺、5％二異丙基乙胺的二甲基甲酰胺溶液、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和二甲基甲酰胺(10mL溶劑/克樹(shù)脂)洗滌。
方法D縮氨基脲水解將樹(shù)脂懸浮于由三氟乙酸∶丙酮酸∶二氯甲烷∶水9∶2∶2∶1組成的裂解混合物(10mL/g樹(shù)脂)處理2小時(shí)。將反應(yīng)物排出，此步驟再重復(fù)3次。樹(shù)脂依次用二氯甲烷、水和二氯甲烷洗滌，真空干燥。
方法EHF裂解經(jīng)干燥的肽-nVal(CO)-G-O-PAM樹(shù)脂(50mg)置于包含一根小型攪拌棒的HF容器。加入清除劑苯甲醚(總體積的10％)。在存在谷氨酸和半胱氨酸氨基酸下，還加入苯硫基甲烷(10％)和1，2-乙二硫醇(0.2％)。然后將HF容器安裝在HF儀器(ImmunoDynamics)，系統(tǒng)充溢氮?dú)?分鐘。然后將其用干冰/異丙醇浴冷卻至-78℃。20分鐘后，蒸餾HF至所需體積(10mL HF/g樹(shù)脂)。讓反應(yīng)物在0℃繼續(xù)反應(yīng)1.5小時(shí)。用氮?dú)庵鸩揭瞥鏊蠬F。然后將二氯甲烷加入樹(shù)脂中，攪拌此混合物5分鐘。接著加入20％的乙酸水溶液(4mL)。攪拌20分鐘后，樹(shù)脂用多孔漏斗過(guò)濾，減壓除去二氯甲烷。殘余物和混合物用己烷(2×)洗滌除去清除劑。同時(shí)，將樹(shù)脂在1mL甲醇中浸濕。將水層(20％HOAc)返回樹(shù)脂中，將混合物攪拌5分鐘后過(guò)濾。減壓除去甲醇，冷凍干燥水層，然后將肽溶于10-25％甲醇(包含0.1％三氟乙酸)，用反相HPLC提純。
實(shí)施例XXII丙型肝炎抑制劑的典型的固相合成(iBoc-G(Chx)-P(4t-NHSO2Ph)-nV-(CO)-G-G(Ph)-NH2)
步驟1.合成Fmoc-nV-(dpsc)-Gly-OHA)合成異氰基乙酸烯丙酯(以下的步驟a-b)a)合成異氰基乙酸鉀鹽 將異氰基乙酸乙酯(96.6ml，0.88mol)滴加入乙醇(1.5L)和氫氧化鉀(59.52g，1.0mol)的冷凍溶液。將反應(yīng)物緩慢地加溫至室溫。2小時(shí)后，用玻璃漏斗濾出沉淀產(chǎn)物，用幾份冷凍乙醇洗滌。因此獲得的異氰基乙酸的鉀鹽經(jīng)過(guò)真空干燥獲得金黃褐色固體(99.92g，91.8％)。
b)合成異氰基乙酸烯丙酯 步驟a產(chǎn)物(99.92g，0.81mol)溶解于乙腈(810ml)中，加入烯丙基溴(92ml，1.05mol)。加熱回流4小時(shí)后獲得深褐色溶液。將反應(yīng)混合物濃縮，殘余物溶于乙醚(1.5L)，用水(500ml)洗滌三次。干燥有機(jī)層，過(guò)濾，濃縮獲得深褐色漿狀物。粗產(chǎn)物在7mm Hg(98℃)下真空蒸餾提純獲得澄清的油狀物(78.92g，78％)。NMRδppm(CDCl3)5.9(m，1H)，5.3(m，2H)，4.7(d，2H)，4.25(s，2H)。
B)合成9-芴基甲氧羰基-正纈氨醛(以下步驟a-c)a)合成9-芴基甲氧羰基-L-正纈氨酸甲酯(Fmoc-nVal-OMe)
商業(yè)獲得性Fmoc-正纈氨酸(25g，73.75mmol)的無(wú)水甲醇(469ml)冷凍溶液在1小時(shí)內(nèi)加入亞硫酰氯(53.76ml，737.5mmol)。TLC用乙酸乙酯經(jīng)過(guò)1小時(shí)后確認(rèn)反應(yīng)完成(Rf＝0.85)。將反應(yīng)混合物濃縮，殘余物溶于乙酸乙酯。有機(jī)層用每份200ml的飽和碳酸氫鈉、鹽水洗滌幾次。干燥有機(jī)層，過(guò)濾，濃縮獲得定量收率的白色固體Fmoc-norVal-OMe(26.03g)。NMRδppm(CD3OD)7.7(m，2H)，7.6(m，2H)，7.4(m，2H)，7.3(m，2H)，4.3(m，2H)，4.1(m，2H)，3.7(s，3H)，1.7(m，1H)，1.6(m，1H)，1.4(m，2H)，0.95(t，3H)。
b)合成9-芴基甲氧羰基-正纈氨醇(Fmoc-nValinol) Fmoc-nVal-OMe(26.03g，73.75mmol)的四氫呋喃(123ml)和甲醇(246ml)溶液中加入氯化鈣(16.37g，147.49mmol)。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，分幾批加入硼氫化鈉(11.16g，294.98mmol)。在獲得的稠糊狀物中加入甲醇(500ml)，反應(yīng)物在室溫下攪拌90分鐘。TLC用2∶3乙酸乙酯∶己烷確認(rèn)反應(yīng)完成(Rf＝0.25)。反應(yīng)通過(guò)緩慢加入0℃的100ml水猝滅。減壓除去甲醇，保留的水相用乙酸乙酯稀釋。有機(jī)層用水(3×500ml)、飽和碳酸氫鈉水溶液(3×500ml)和鹽水(500mol)洗滌。用硫酸鈉干燥有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮獲得白色固體(21.70g，90.5％)。NMRδppm(CD3OD)7.8(m，2H)，7.7(m，2H)，7.4(m，2H)，7.3(m，2H)，4.3-4.5(m，2H)，4.2(m，1H)，3.6(s，1H)，3.5(s，2H)，1.5(m，1H)，1.3-1.4(m，3H)，0.99(m，3H)。
c)合成9-芴基甲氧羰基-正纈氨醛(Fmoc-nVal-CHO) 在Fmoc-正纈氨醇(21.70g，66.77mmol)的二氯甲烷(668ml)溶液中加入三乙胺(37.23ml，267mmol)，將溶液冷卻至0℃。吡啶三氧化硫絡(luò)合物(42.51g，267mmol)的二甲基亞砜(96ml)懸浮液加入到上述的冷凍溶液中。1小時(shí)后，TLC用2∶3乙酸乙酯∶己烷確認(rèn)反應(yīng)完成。減壓除去二氯甲烷，將殘余物溶于乙酸乙酯中，用水(2×50ml)、1N飽和硫酸氫鈉(2×50ml)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2×50ml)和鹽水(50ml)洗滌。濃縮有機(jī)層獲得白色固體。獲得理論產(chǎn)量(21.57g)，反應(yīng)物直接用于下一步驟而無(wú)需再提純。
C)合成二苯基甲基氨基脲(dpsc)三氟乙酸鹽(以下的步驟a-b)a)合成Boc-氨基脲-4-基二苯基甲烷 羰基二咪唑(16.2g，0.10mol)的二甲基甲酰胺(225ml)溶液在30分鐘內(nèi)滴加肼基甲酸叔丁酯(13.2g，0.100mol)的二甲基甲酰胺(225ml)溶液。在接下來(lái)的30分鐘內(nèi)加入二苯基甲胺(18.3g，0.10mol)。將反應(yīng)物在室溫下攪拌1小時(shí)。加入水(10ml)后將混合物減壓濃縮至約150ml。將此溶液傾入水(500ml)中，用乙酸乙酯(400ml)萃取。乙酸乙酯相用每份75ml的1N HCl、H2O、飽和碳酸氫鈉溶液和氯化鈉各洗滌2次，用硫酸鎂干燥。將混合物過(guò)濾，濃縮溶液獲得白色泡沫狀產(chǎn)物29.5g(85％收率)。所得產(chǎn)物可以用乙酸乙酯/己烷重結(jié)晶提純，但是上述產(chǎn)物純度足以在下一步直接使用mp 142-143℃。1HNMR(CDCl3)d 1.45(s，9H)，6.10(dd，2H)，6.42(s，1H)，6.67(bs，1H)，7.21-7.31(m，10H)。C19H23N3O3的分析值C，66.84；H，6.79；N，12.31。實(shí)測(cè)值C，66.46；H，6.75；N；12.90。
b)合成二苯基甲基氨基脲(dpsc)三氟乙酸鹽 Boc-氨基脲-4-基二苯基甲烷(3.43g，10mmol)的二氯甲烷(12.5ml)溶液在室溫下用三氟乙酸(12.5ml)處理，攪拌30分鐘。將溶液滴加到75ml乙醚，過(guò)濾收集所得固體(2.7g，80％)。mp 182-184℃。1H NMR(CD3OD)d 6.05(s，1H)，7.21-7.35(m，10H)。13C NMR(CD3OD)d57.6，118.3(q，CF3)，126.7，127.9，141.6，156.9，160.9(q，CF3CO2H)。
D)合成Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-O烯丙基 Fmoc-nVal-CHO(步驟1B)(5.47g，16.90mmol)的二氯甲烷(170ml)溶液中加入異氰基乙酸烯丙酯(步驟1A)(2.46ml，20.28mmol)和吡啶(5.47ml，67.61mmol)。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，滴加三氟乙酸(3.38ml，33.80mmol)。將反應(yīng)物在0℃攪拌1小時(shí)，然后在室溫下攪拌48小時(shí)。TLC采用乙酸乙酯確認(rèn)反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物濃縮，并用快速色譜法(含20％-70％乙酸乙酯的己烷)提純。合并包含所需產(chǎn)品部分，濃縮獲得白色泡沫物(6.88g，87.3％)。TLC用1∶1乙酸乙酯/己烷顯示出一個(gè)斑點(diǎn)(Rf＝0.37)。NMRδppm(CD3OD)7.8(m，2H)，7.65(m，2H)，7.4(m，2H)，7.3(m，2H)，5.9(m，1H)，5.1-5.4(m，2H)，4.55-4.65(m，2H)，4.3-4.4(m，2H)，4.15-4.25(m，1H)，4.01(s，1H)，3.9-4.0(m，3H)，1.5-1.6(m，2H)，1.35-1.45(m，3H)，0.9(m，3H)。
E)合成Fmoc-nVal-(CO)-Gly-O烯丙基 Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-O烯丙基(步驟D)(5.01g，10.77mmol)的二甲基亞砜(100ml)和甲苯(100ml)溶液中加入EDC(20.6g，107.7mmol)。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，滴加二氯乙酸(4.44ml，53.83mmol)。反應(yīng)物在0℃下攪拌15分鐘，然后在室溫下攪拌1小時(shí)。再冷卻至0℃后，加入水(70ml)，減壓除去甲苯。殘余物用乙酸乙酯稀釋，用飽和碳酸氫鈉溶液、再用1N硫酸氫鈉和鹽水各洗滌幾次。用硫酸鈉干燥有機(jī)層，過(guò)濾，濃縮。獲得理論產(chǎn)量4.99g，反應(yīng)物直接用于下一步驟而無(wú)需再提純。TLC用1∶1乙酸乙酯/己烷顯示出一個(gè)斑點(diǎn)(Rf＝0.73)。
F)合成Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-O烯丙基 Fmoc-nVal-(CO)-Gly-O烯丙基(步驟E)(4.99g，10.75mmol)的乙醇(130ml)和水(42ml)溶液中依次加入二苯基甲基氨基脲(dpsc)三氟乙酸鹽(步驟1C)(7.6g，21.5mmol)和乙酸鈉3H2O(1.76g，12.9mmol)。將反應(yīng)混合物加熱回流90分鐘。反應(yīng)的完成用薄層色譜法用1∶1乙酸乙酯∶己烷確認(rèn)。減壓除去乙醇，殘余物溶于乙酸乙酯，用1N硫酸氫鈉(2×10ml)、飽和碳酸氫鈉水溶液(2×10ml)洗滌、接著用鹽水(2×10ml)洗滌。干燥有機(jī)層，過(guò)濾，濃縮。所得殘余物用快速色譜法提純(含20％到50％乙酸乙酯的己烷)獲得白色固體(5.76g，78％)。TLC用50∶50乙酸乙酯/己烷顯示出兩個(gè)斑點(diǎn)(順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體)，Rf＝0.42和0.50。
G)合成Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-OH Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-O烯丙基(步驟1G)(4.53g，6.59mmol)的四氫呋喃(300ml)溶液中先加入雙甲酮(4.62g，32.97mmol)，然后加入四(三苯膦)鈀(O)催化劑(0.76g，0.66mmol)。在90分鐘后，反應(yīng)的完成由TLC(9∶1二氯甲烷∶甲醇)確認(rèn)。將反應(yīng)混合物濃縮，殘余物溶于乙酸乙酯，用每份50ml的0.1M磷酸二氫鉀洗滌三次。有機(jī)層用50ml亞硫酸氫鈉處理，將兩相體系攪拌15分鐘。將兩相分離，此步驟再重復(fù)兩次。干燥有機(jī)層，濃縮，用快速柱色譜法(含20％-100％乙酸乙酯的己烷，然后用9∶1二氯甲烷∶甲醇)處理。合并純產(chǎn)物相應(yīng)部分，濃縮獲得白色固體(3.99g，94％)。TLC用9∶1二氯甲烷∶甲醇顯示出兩個(gè)斑點(diǎn)(順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體)。NMRδppm(CD3OD)7.75(m，2H)，7.6(m，3H)，7.2-7.4(m，14H)，6.1-6.2(m，1H)，4.25-4.4(m，2H)，4.1-4.2(m，2H)，3.85(s，2H)，1.6-1.8(m，2H)，1.3-1.5(m，2H)，0.95(t，3H)。
步驟2.合成H-Phg-MBHA樹(shù)脂 將商業(yè)上可得到的MBHA樹(shù)脂(2.6g，1.12mmol/g，2.91mmol)轉(zhuǎn)移到250ml配置了氮?dú)馊肟诘臒Y(jié)固相反應(yīng)容器。將其用每份30ml的二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分洗滌，按照方法A將其與商業(yè)上可得到的Fmoc-Phg-OH(2.17g，5.82mmol)偶合18小時(shí)，反應(yīng)效率為99.82％。然后按照方法B將樹(shù)脂去除Fmoc保護(hù)。對(duì)少量試樣的茚三酮定性分析呈現(xiàn)深藍(lán)色的樹(shù)脂和溶液，表明反應(yīng)成功。
步驟3.合成H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂 步驟II獲得的樹(shù)脂(2.6g，0.8mmol/g，2.91mmol)按照方法A與Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-O烯丙基(步驟1G)(5.82mmol，3.77g)反應(yīng)。在18小時(shí)后，用茚三酮定量分析顯示偶合效率為99.91％。將樹(shù)脂按照方法B除去Fmoc保護(hù)。對(duì)少量試樣的定性茚三酮分析呈現(xiàn)深藍(lán)色的樹(shù)脂和溶液，表明反應(yīng)成功。
步驟4.合成Boc-Pro(4t-NHFmoc)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂 將化合物H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂(以上的步驟3)(600mg，0.8mmol/g，0.67mmol)轉(zhuǎn)移到濾板型聚丙烯管中，按照方法A與Boc-Pro(4t-NHFmoc)-OH(實(shí)施例VI步驟3)(610mg，1.34mmol)偶合。在18小時(shí)后，用茚三酮定量分析偶合效率為99.96％。
步驟5.合成Boc-Pro(4t-NH2)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂 將前一步驟獲得的樹(shù)脂(Boc-Pro(4t-NHFmoc)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂)按照方法B除去Fmoc保護(hù)。對(duì)小量樣品的茚三酮定性分析呈現(xiàn)深藍(lán)色的樹(shù)脂和溶液，表明反應(yīng)成功。
步驟6.合成Boc-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂 將前一步驟獲得的樹(shù)脂(Boc-Pro(4t-NH2)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂)(0.2g，0.22mmol)懸浮于NMP(2ml)，加入2，4，6-三甲基吡啶(0.24ml，1.79mmol)和苯磺酰氯，將反應(yīng)物振蕩18小時(shí)。排出溶劑，樹(shù)脂用每份2ml的二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分洗滌。茚三酮定性分析顯示無(wú)色的珠粒和溶液。
步驟7.合成Fmoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂 將前一步驟獲得的樹(shù)脂(Boc-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂)按照方法C除去Boc保護(hù)。然后按照方法A偶合Fmoc-G(Chx)(0.17g，0.45mmol)。18小時(shí)后，茚三酮定性分析顯示無(wú)色珠粒，茚三酮定量分析顯示偶合效率為99.79％。
步驟8.合成iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂 將上一步獲得的樹(shù)脂(Fmoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂)按照方法B除去Fmoc保護(hù)。對(duì)小量樣品的茚三酮分析呈現(xiàn)深藍(lán)色的樹(shù)脂和溶液，表明反應(yīng)成功。將樹(shù)脂(0.2g，0.22mmol)懸浮于2ml NMP中，加入氯甲酸異丁酯(0.12ml，0.90mmol)，接著加入二異丙基乙胺(0.31ml，1.79mmol)，將反應(yīng)混合物在室溫下振蕩18小時(shí)。茚三酮定性分析顯示無(wú)色的珠粒和溶液，表明反應(yīng)成功。
步驟9.合成iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂 將前一步驟的化合物(iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂)(200mg)按照方法D進(jìn)行縮氨基脲水解。
步驟10.合成iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(CO)-Gly-Phg-NH2 將前一步驟的樹(shù)脂(iBoc-G(Chx)-Pro(4t-NHSO2Bn)-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA樹(shù)脂)(100mg)置于HF裂解條件(方法E)獲得所需的粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物用HPLC(2.2×25cm反相柱，包含由300?？讖降?0微米硅膠粒組成的C-18樹(shù)脂，洗脫用梯度含20-50％乙腈的水)提純。分析型HPLC(4.6×250mm反相柱，包含由300?？讖降?微米硅膠粒組成的C-18樹(shù)脂，洗脫時(shí)用25-75％乙腈(包含0.1％三氟乙酸))在13.5分鐘顯示一個(gè)峰。用低分辨率質(zhì)譜確認(rèn)所需要的物質(zhì)(MH+826.4)。
IV.用液相合成制備另外的化合物制備本發(fā)明另外的化合物的典型方法如下，由這樣的方法制備的化合物列于表5中。
實(shí)施例XXIII制備式XXIII化合物 步驟1.
將酮亞胺(ketimime)XXIIIa(50g，187.1mmol)的氮?dú)夥障碌臒o(wú)水THF(400mL)溶液攪拌冷卻至-78℃，用1M K-tBuO(220mL，1.15當(dāng)量)的THF溶液處理。將反應(yīng)混合物加溫至0℃，攪拌1小時(shí)，用溴甲基環(huán)丁烷(28mL，249mmol)處理。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌48小時(shí)，真空濃縮。殘余物溶于Et2O(300mL)，用HCl水溶液(2M，300mL)處理。所得溶液在室溫下攪拌5小時(shí)，用Et2O(1L)萃取。水層用NaOH(50％aq.)堿化至pH～12-14，用CH2Cl2(3×300mL)萃取。干燥合并的有機(jī)層(MgSO4)，過(guò)濾，濃縮獲得無(wú)色油狀的純胺(XXIIIb，18g)。
步驟2 胺XXIIIb(18g，105.2mmol)的CH2Cl2(350mL)溶液在0℃用二碳酸二叔丁基酯(23g，105.4mmol)處理，在室溫下攪拌12小時(shí)。在完成反應(yīng)后(TLC)，將反應(yīng)混合物真空濃縮，殘余物溶于THF/H2O(200ml，1∶1)，用LiOH·H2O(6.5g，158.5mmol)處理，在室溫下攪拌3小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮，堿性水層用Et2O萃取。水層用濃鹽酸酸化至pH～1-2，用CH2Cl2萃取。干燥(MgSO4)合并的有機(jī)層，過(guò)濾，真空濃縮獲得無(wú)色粘性油狀物XXIIIc，它直接用于下一步驟無(wú)需任何提純。
步驟3.

酸XXIIIc(15.0g，62mmol)的CH2Cl2(250mL)溶液用用BOP試劑(41.1g，93mmol)、N-甲基嗎啉(27mL)、N，O-二甲基羥胺鹽酸鹽(9.07g，93mmol)處理，在室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)混合物用1N HCl水溶液(250mL)稀釋，然后分離過(guò)層，水層用CH2Cl2(3×300ml)萃取。將合并的有機(jī)層干燥(MgSO4)，過(guò)濾并真空濃縮，用色譜法(SiO2，乙酸乙酯/己烷2∶3)提純獲得無(wú)色固體酰胺XXIIId(15.0g)。
步驟4
酰胺XXIIId(15g，52.1mmol)的無(wú)水THF(200mL)溶液在0℃滴加LiAiH4(1M，93mL，93mmol)溶液。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，在0℃用KHSO4溶液(10％aq.)小心地猝滅，攪拌0.5小時(shí)。反應(yīng)混合物用HCl水溶液(1M，150mL)稀釋，用CH2Cl2(3×200mL)萃取，合并的有機(jī)層用HCl水溶液(1M)、飽和NaHCO3、鹽水洗滌，干燥(MgSO4)。將混合物過(guò)濾并真空濃縮，獲得無(wú)色粘性油狀物XXIIIe(14g)。
步驟5.

醛XXIIIe(14g，61.6mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液用Et3N(10.73mL，74.4mmol)和丙酮氰醇(10.86g，127.57mmol)處理，在室溫下攪拌24小時(shí)。將反應(yīng)混合物真空濃縮，用HCl水溶液(1M，200mL)洗滌，用CH2Cl2(3×200mL)萃取。合并的有機(jī)層用H2O、鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，真空干燥，用色譜法(SiO2，乙酸乙酯/己烷1∶4)提純獲得無(wú)色液體XXIIIf(10.3g)。
步驟6 HCl*飽和的甲醇溶液(其制備是在0℃通入HCl氣體至CH3OH(700ml))用上述氰醇XXIIIf處理，加熱回流24小時(shí)。將反應(yīng)物真空濃縮獲得XXIIIg，它用于下一步驟無(wú)需再提純。
*或者也可使用通過(guò)加入AcCl到無(wú)水甲醇制備的6M HCl。
步驟7.
上述胺的鹽酸鹽XXIIIg的CH2Cl2(200mL)溶液用Et3N(45.0mL，315mmol)和Boc2O(45.7g，209mmol)在-78℃處理。然后將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過(guò)夜，用HCl(2M，200mL)稀釋，萃取入CH2Cl2，干燥(MgSO4)合并的有機(jī)層，過(guò)濾，真空濃縮，用色譜法(乙酸乙酯/環(huán)己烷1∶4)提純獲得羥基酯XXIIIh。
步驟8.
上述甲酯XXIIIh(3g，10.5mmol)的THF/H2O(1∶1)溶液用LiOH·H2O(645mg，15.75mmol)處理，在室溫下攪拌2小時(shí)。反應(yīng)混合物用HCl水溶液(1M，15mL)酸化，真空濃縮。真空干燥殘余物。
上述酸的CH2Cl2(50mL)和DMF(25mL)溶液用NH4Cl(2.94g，55.5mmol)、EDCl(3.15g，16.5mmol)、HOOBt(2.69g，16.5mmol)和NMM(4.4g，44mmol)處理。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3天。真空除去溶劑，殘余物用HCl水溶液(250mL)稀釋，用CH2Cl2萃取。合并的有機(jī)層用飽和NaHCO3水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，真空濃縮獲得XXIIIi，它直接用于下一步驟。(或者還可使XXIIIf(4.5g，17.7mmol)與H2O2(10mL)水溶液LiOH·H2O(820mg，20.8mmol)在0℃于50mL CH3OH中反應(yīng)0.5小時(shí)直接得到XXIIIi)
步驟9.
將前一步驟獲得的XXIIIi的溶液溶于4N HCl的二氧六環(huán)溶液，在室溫下攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物真空濃縮獲得固體XXIIIj，它直接使用無(wú)需再提純。
步驟10.
氨基酯XXIIII的制備按照R.Zhang和J.S.Madalengoitia(J.Org.Chem.1999，64，330)的方法制備，除了使Boc保護(hù)的氨基酸基團(tuán)與HCl的甲醇溶液反應(yīng)而使Boc基團(tuán)脫去以外。
商品氨基酸Boc-Chg-OH XXIIIk(Senn chemicals，6.64g，24.1mmol)和胺的鹽酸鹽XXIIII(4.5g，22mmol)的CH2Cl2(100mL)溶液在0℃用BOP試劑處理，在室溫?cái)嚢?5小時(shí)。將反應(yīng)混合物真空濃縮，然后用1M HCl水溶液稀釋，萃取入EtOAc(3×200mL)。合并的有機(jī)層用飽和NaHCO3(200mL)洗滌，干燥(MgSO4)，過(guò)濾并真空濃縮，用色譜法(SiO2，乙酸乙酯/環(huán)己烷3∶7)獲得無(wú)色固體XXIIIm(6.0g)。
步驟11.
甲酯XXIIIm(4.0g，9.79mmol)的THF/H2O(1∶1)溶液用LiOH·H2O(401mg，9.79mmol)處理，在室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)混合物用HCl水溶液酸化，真空濃縮獲得游離酸。
酸(1.5g，3.74mmol)的DMF/CH2Cl2(1∶150mL)溶液用胺XXIIIj(772mg，3.74mmol)、EDCl(1.07g，5.61mmol)、HOOBt(959mg，5.61mmol)和NMM(2.15mL，14.96mmol)在-10℃處理。反應(yīng)混合物在0℃攪拌48小時(shí)，真空濃縮。殘余物用1M HCl水溶液稀釋，用CH2Cl2萃取，合并的有機(jī)層用NaHCO3水溶液、HCl水溶液、鹽水萃取，干燥(MgSO4)，過(guò)濾并真空濃縮獲得黃褐色固體XXIIIn(2.08g)。
步驟12.
酰胺XXIIIn(2.08g，3.79mmol)的甲苯和DMSO(1∶120mL)溶液在0℃用EDCl(7.24g，37.9mmol)和二氯乙酸(2.42g，19.9mmol)處理，在室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)混合物用CH2Cl2稀釋，用飽和NaHCO3和鹽水洗滌。將有機(jī)層干燥(MgSO4)，過(guò)濾，真空濃縮，然后用色譜法(SiO2，丙酮/己烷3∶7)提純獲得無(wú)色固體XXIII。
實(shí)施例XXIV制備式XXIV化合物
步驟1.
將Boc-tert-LeuXXIVa(Fluka，5.0g 21.6mmol)的無(wú)水CH2Cl2/DMF(50mL，1∶1)溶液冷卻至0℃，用胺XXIIII(5.3g，25.7mmol)、NMM(6.5g，64.8mmol)和BOP試劑(11.6g，25.7mmol)處理。將反應(yīng)物在室溫?cái)嚢?4小時(shí)，用HCl水溶液(1M)稀釋，用CH2Cl2萃取。合并的有機(jī)層用HCl(水溶液，1M)、飽和NaHCO3、鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過(guò)濾并真空濃縮，用色譜法(SiO2，丙酮/己烷1∶5)提純獲得無(wú)色固體XXIVb。
步驟2
將甲酯XXIVb(4.0g，10.46mmol)溶液溶于HCl(4M二氧六環(huán)溶液)，在室溫下攪拌3小時(shí)。將反應(yīng)混合物真空濃縮獲得用于下一步驟的胺鹽酸鹽。
將上述胺鹽酸鹽(397mg，1.24mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液冷卻至-78℃，用異氰酸叔丁酯(250mg，2.5mmol)處理，在室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)混合物真空濃縮，殘余物用HCl水溶液(1M)稀釋，用CH2Cl2萃取。合并的有機(jī)層用HCl水溶液(1M)、飽和NaHCO3和鹽水洗滌。干燥有機(jī)層，過(guò)濾并真空濃縮，殘余物用色譜法(SiO2，丙酮/環(huán)己烷1∶4)提純獲得無(wú)色固體XXIVc。
步驟3 甲酯XXIVc(381mg，1.0mmol)的THF/H2O(1∶1，5mL)溶液用LiOH·H2O(62mg，1.5mmol)處理，在室溫下攪拌3小時(shí)。將反應(yīng)混合物用HCl水溶液酸化，真空濃縮獲得游離酸。
酸(254.9mg，0.69mmol)的DMF/CH2Cl2(1∶1，5.0mL)溶液用胺XXIIIj(159mg，0.763mmol)、EDCl(199mg，1.04mmol)、HOOBt(169.5mg，1.04mmol)和NMM(280mg，2.77mmol)在-20℃處理。將反應(yīng)混合物在-20℃攪拌48小時(shí)，真空濃縮。殘余物用1M HCl水溶液稀釋，用EtOAc萃取，合并的有機(jī)層用NaHCO3水溶液、HCl水溶液、鹽水萃取，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，真空濃縮獲得黃褐色固體XXIVd(470mg)。
步驟4.
酰胺XXIVd(470mg，0.9mmol)的甲苯和DMSO(1∶120mL)溶液在0℃用EDCl(1.72g，9.0mmol)和二氯乙酸(0.37mL，4.5mmol)處理，在0℃攪拌4小時(shí)。將反應(yīng)混合物用CH2Cl2稀釋，然后用飽和NaHCO3和鹽水洗滌。將有機(jī)層干燥(MgSO4)，過(guò)濾，真空濃縮，用色譜法(SiO2，丙酮/己烷3∶7)提純獲得無(wú)色固體XXIV。
實(shí)施例XXV制備式XXV化合物
步驟1.
Fmoc-甘氨酸(Bachem，2.0g，6.87mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液用2-苯基-2-丙醇(Aldrich，3.36g，24.7mmol)、DCC(1M的CH2Cl2溶液，8.24mL)、DMAP(167mg，1.37mmol)處理，在室溫下攪拌24小時(shí)。將反應(yīng)混合物真空濃縮，用Et2O(100mL)稀釋。過(guò)濾除去固體，濾液用飽和NaHCO3洗滌。
將有機(jī)層干燥(MgSO4)，過(guò)濾，真空濃縮，用色譜法(SiO2，乙酸乙酯/環(huán)己烷1∶5)提純獲得無(wú)色粘性液體酯XXVc(1.1g)。
步驟2 XXVc的CH2Cl2(16.0mL)溶液用哌啶(4.0mL)處理，在室溫下攪拌0.5小時(shí)。將反應(yīng)混合物真空濃縮，用色譜法(SiO2，丙酮/己烷1∶10-1∶1)提純獲得無(wú)色液體胺XXVd(420mg)。
步驟3.
甲酯XXIVc(381mg，1.0mmol)的THF/H2O(1∶1，5mL)溶液用LiOH·H2O(62mg，1.5mmol)處理，在室溫下攪拌3小時(shí)。將反應(yīng)混合物用HCl水溶液酸化，真空濃縮獲得游離酸。
酸(2.0g，5.5mmol)的DMF/CH2Cl2(1∶1，40.0ml)溶液在-10℃用胺XXIIIg(1.51g，6.8mmol)、EDCl(1.57g，8.25mmol)、HOOBt(1.41g，8.25mmol)和NMM(2.5g，24.7mmol)處理。反應(yīng)混合物在0℃攪拌48小時(shí)，真空濃縮。殘余物用1M HCl水溶液(100mL)稀釋，用CH2Cl2萃取(3×100mL)。合并的有機(jī)層用NaHCO3水溶液、HCl水溶液、鹽水萃取，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，真空濃縮獲得黃褐色固體XXVe(3.17g)，使用時(shí)無(wú)需任何提純。
步驟4
甲酯XXVe(2.5g，4.66mmol)的THF/H2O/CH3OH(1∶1∶1，60mL)溶液用LiOH·H2O(200mg，4.87mmol)處理，在室溫下攪拌4小時(shí)。反應(yīng)混合物用HCl水溶液酸化，真空濃縮獲得游離酸。
酸(200.0mg，0.38mmol)的DMF/CH2Cl2(1∶1，6.0mL)溶液在-10℃用胺XXVd(78mg，0.4mmol)、EDCl(105mg，0.55mmol)、HOOBt(95mg，0.55mmol)和NMM(150mg，1.48mmol)處理。將反應(yīng)混合物在0℃攪拌48小時(shí)，真空濃縮。殘余物用1M HCl水溶液(30mL)稀釋，用CH2Cl2(3×30mL)萃取。合并的有機(jī)層用NaHCO3水溶液(2×30mL)、HCl水溶液、鹽水(30mL)萃取，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，真空濃縮獲得黃褐色固體XXVf(240mg)。
步驟5.
XXVf(240mg，0.28mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液用Dess-Martin試劑(Omega，242mg，0.56mmol)處理，在室溫下攪拌2小時(shí)。在氧化反應(yīng)完成后(TLC，丙酮/己烷1∶4)，將反應(yīng)混合物用飽和NaHCO3(20mL)和Na2S2O3(10％水溶液，20mL)稀釋。將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，用CH2Cl2(3×30mL)萃取。合并的有機(jī)層用飽和NaHCO3、鹽水萃取，干燥(MgSO4)，過(guò)濾，真空濃縮，用色譜法(SiO2，丙酮/己烷1∶5)提純獲得無(wú)色固體XXV(122mg)。
實(shí)施例XXVI制備式XXVI化合物 步驟1 N-Boc-3，4-脫氫脯氨酸XXVIa(5.0g，23.5mmol)、二碳酸二叔丁酯(7.5g，34.4mmol)和4-N，N-二甲基氨基吡啶(0.40g，3.33mmol)的乙腈(100mL)在室溫、攪拌下加入三乙胺(5.0mL，35.6mmol)。所得溶液本發(fā)明溫度攪拌18小時(shí)，然后將其真空濃縮。深褐色殘余物用快速色譜法提純，洗脫時(shí)用10-25％乙酸乙酯/己烷獲得淺黃色油狀產(chǎn)物XXVIb(5.29g，84％)。
步驟2
脫氫脯氨酸XXVIb(10.1g，37.4mmol)、芐基三乙基氯化銨(1.60g，7.02mmol)的氯仿(120mL)溶液在室溫?cái)嚢柘录尤?0％氫氧化鈉水溶液(120g)。本發(fā)明溫度劇烈攪拌24小時(shí)后，將黑色混合物用CH2Cl2(200mL)和乙醚(600mL)稀釋。分離各層后，水溶液用CH2Cl2/Et2O(1∶2，3×600mL)萃取。將有機(jī)溶液干燥(MgSO4)，濃縮。殘余物用快速柱色譜法(5-20％乙酸乙酯/己烷)提純獲得9.34g(71％)乳白色固體XXVIc。
步驟3 將XXVIc(9.34g，26.5mmol)的CH2Cl2(25mL)和CF3CO2H(50mL)溶液在室溫下攪拌4.5小時(shí)，然后真空濃縮獲得褐色殘余物，它用于步驟4中無(wú)需再提純。
步驟4.
將商品濃鹽酸(4.5mL)加入步驟3殘余物的甲醇(70mL)溶液，所得混合物在油浴中加溫到65℃。在18小時(shí)后，將混合物真空濃縮獲得褐色油XXVIe，它用于步驟5無(wú)需再提純。
步驟5 步驟4的脯氨酸甲酯XXVIe、商品N-Boc-環(huán)己基甘氨酸XXVIf(10.2g，40.0mmol)和[O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽](HATU)(16.0g，42.1mmol)的DMF(200mL)溶液在0℃攪拌下加入二異丙基乙胺(18.0mL，104mmol)。在冰浴過(guò)夜(18h)加溫至室溫，將反應(yīng)混合物用EtOAc(600mL)、5％H3PO4(150mL)和鹽水(150mL)稀釋。有機(jī)溶液用5％H3PO4(150mL)、飽和NaHCO3(2×200mL)洗滌，然后干燥(MgSO4)，過(guò)濾并真空濃縮。殘余物用快速柱色譜法(5-20％乙酸乙酯/己烷)提純獲得3.84g(32％，三步)乳白色固體XXVIg。
步驟6
甲酯XXVIg(5.87g，13.1mmol)和LiOH(1.65g，39.3mmol)的THF/MeOH/H2O(1∶1∶1，90mL)溶液在室溫下攪拌4小時(shí)。減壓除去甲醇和THF。水溶液用1N HCl水溶液(50mL)酸化至pH～2，用固體氯化鈉飽和，然后將其用EtOAc(3×150mL)萃取。將有機(jī)溶液合并，干燥(MgSO4)，過(guò)濾并真空濃縮獲得白色固體XXVIh(5.8g，定量)。
步驟7 所需要的產(chǎn)物XXIIIi按照實(shí)施例XXIII步驟11的方法制備。
步驟8 所需要的產(chǎn)物XXVI按照實(shí)施例XXIII步驟12的方法制備。
實(shí)施例XXVII制備式XXVII化合物 步驟1 所需要的產(chǎn)物XXVIIa按照實(shí)施例XXIII步驟9的方法制備。
步驟2 所需要的產(chǎn)物XXVIIb按照實(shí)施例XXIV步驟2的方法制備。
步驟3 所需要的產(chǎn)物XXVII按照實(shí)施例XXIII步驟12的方法制備。
實(shí)施例XXVIII制備式XXVIII化合物 步驟1 中間體XXVIIIb按照實(shí)施例XXIII步驟3-6的方法制備。
步驟2 實(shí)施例XXIV步驟2的酸(XXVIIIc)(0.7g)與以上步驟1的產(chǎn)物(0.436g)、HATU(0.934g)和DIPEA(1.64mL)按照實(shí)施例IX步驟2a的方法反應(yīng)獲得0.66g所需要的產(chǎn)物XXVIIId。
步驟3 步驟2的產(chǎn)物(0.5g)與Dess-Martin試劑(1g)按照實(shí)施例XX步驟7的方法反應(yīng)。用快速柱色譜法(40％EtOAc，己烷，二氧化硅)提純獲得0.35g產(chǎn)物XXVIIIe。質(zhì)譜(LCMS)522(M+H+)。
步驟4 步驟4產(chǎn)物(0.3g)中加入1/1 H2O/MEOH溶液(20mL)和NaHCO3固體(242mg，5當(dāng)量)。在室溫下攪拌18小時(shí)后，將反應(yīng)物用EtOAc稀釋，將各層分離。水層用1.0N HCl酸化至pH2，用EtOAc萃取。EtOAc層用鹽水洗滌，然后用MgSO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮獲得白色粉末產(chǎn)物XXVIIIf(0.26g)。質(zhì)譜(LCMS)508(M+H+)。
步驟5 將步驟5產(chǎn)物(0.15g)溶于CH2Cl2，使其與HATU(0.137g)、NH4Cl(0.08g，5當(dāng)量)和DIPEA(0.53mL)反應(yīng)。在室溫下2小時(shí)后，反應(yīng)物用EtOAc稀釋，先用10％檸檬酸溶液、再用飽和NaHCO3溶液洗滌。EtOAc層用鹽水洗滌，然后用MgSO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮獲得粗制的混合物。用快速柱色譜法(30％丙酮，己烷，二氧化硅)提純獲得所需要的產(chǎn)物XXVIII(0.096g)。質(zhì)譜(LCMS)507(M+H+)。
實(shí)施例XXIX制備式XXIX化合物 步驟1 初始醛(4.0g)的CH2Cl2(75mL)溶液(0℃)中加入乙酸(2.0當(dāng)量，2.15mL)，接著加入異氰基乙酸甲酯(1.1當(dāng)量，1.9mL)。然后將反應(yīng)物逐漸加溫至室溫。在18小時(shí)(過(guò)夜)后，反應(yīng)物用EtOAc稀釋，然后用飽和NaHCO3溶液洗滌。EtOAc層用鹽水洗滌，然后用MgSO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮獲得粗制混合物。用快速柱色譜法(30-40％EtOAc，己烷，二氧化硅)提純獲得產(chǎn)物XXIXa(4.5g)。
步驟2 XXIXa(4.4g)的THF(100mL)溶液(0℃)中加入26mL(2.2當(dāng)量)的1.0N LiOH溶液。將反應(yīng)物本發(fā)明溫度攪拌2小時(shí)，然后加溫至室溫。在2小時(shí)后，反應(yīng)混合物用1.0N HCl溶液酸化至pH2。加入EtOAc，將各層分離。EtOAc層用鹽水洗滌，然后用MgSO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮獲得產(chǎn)物XXIXb(3.7g)。
步驟3 使酸XXIXb與實(shí)施例XV的胺按照實(shí)施例XXI步驟4介紹的方法反應(yīng)。然后將所得中間體用HCl按照實(shí)施例XXIII步驟9介紹的方法處理獲得產(chǎn)物XXIXc。
步驟4 將酸XXVIIIc(2.43g)溶于CH2Cl2，使其與胺XXIXc(2.47g)、HATU(2.5g)和DIPEA(5.8mL)按照前面實(shí)施例IX步驟2a介紹的方法獲得(用快速柱色譜法(4％MeOH，CH2Cl2，二氧化硅)提純后)所需要的產(chǎn)物XXIXd(4.35g)。質(zhì)譜(LCMS)727(M+H+)。
步驟5 使步驟4產(chǎn)物(4.2g)與Dess-Martin試劑(6.4g)按照制備實(shí)施例XX步驟7介紹的方法反應(yīng)。用快速柱色譜法(100％EtOAc，二氧化硅)提純獲得3g最終產(chǎn)物XXIX。質(zhì)譜(LCMS)725(M+H+)。
實(shí)施例XXX制備式XXX化合物
步驟1 使2-(三氟甲基)丙-2-醇(1.28g)與N，N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(3.84g)和Et3N(4.2mL)的無(wú)水CH3CN(50mL)溶液反應(yīng)18小時(shí)。將混合物用EtOAc(200mL)稀釋，過(guò)濾。將濾液用NaHCO3、鹽水洗滌，然后用MgSO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮獲得粗制的混合物。用快速柱色譜法(50％EtOAc，己烷，二氧化硅)提純獲得所需要的產(chǎn)物XXXa(0.3g)。
步驟2
實(shí)施例XXIX的產(chǎn)物(0.3g)用100mL 4.0N HCl的二氧六環(huán)溶液處理。在1小時(shí)后，加入200mL Et2O，將所得沉淀濾出，真空干燥獲得白色粉末產(chǎn)物XXXb(0.27g)。質(zhì)譜(LCMS)625(M-HCl+H+)。
步驟3 XXXb(0.05g)的CH2Cl2(5mL)室溫溶液中加入DIPEA(0.040mL)、XXXa(1.5當(dāng)量，0.030g)，接著加入1粒DMAP晶體。在30分鐘后，將反應(yīng)物用EtOAc(20mL)稀釋，然后依次用1.5N HCl、NaHCO3、鹽水洗滌。EtOAc層用MgSO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮獲得粗制的混合物。用制備型色譜法(40％丙酮，己烷，二氧化硅)提純獲得所需要的產(chǎn)物XXX(0.044g)。質(zhì)譜(LCMS)779(M+H+)。
實(shí)施例XXXI制備式XXXI化合物 步驟1 XXXb(0.05g)的CH2Cl2(5mL)溶液在室溫下加入DIPEA(0.040mL)和異氰酸叔丁酯(1.2當(dāng)量，0.01mL)。在18小時(shí)后，將反應(yīng)物用EtOAc(20mL)稀釋，然后用1.5N HCl、NaHCO3和鹽水洗滌。EtOAc層用MgSO4干燥，過(guò)濾并真空濃縮獲得粗制的混合物。用制備型色譜法(100％EtOAc，二氧化硅)提純獲得最終產(chǎn)物XXXI(0.021g)。質(zhì)譜(LCMS)724(M+H+)。
實(shí)施例XXXII制備式XXXII化合物 步驟1 實(shí)施例XXVIII的產(chǎn)物按照制備實(shí)施例XXX步驟2中介紹的方法處理獲得產(chǎn)物XXXIIa。質(zhì)譜(LCMS)407(M-HCl+H+)。
步驟2 使胺XXXIIa與XXXa按照制備實(shí)施例XXX步驟3中介紹的方法反應(yīng)獲得所需要的產(chǎn)物XXXII。質(zhì)譜(LCMS)508(MH+)。
實(shí)施例XXXIII制備式XXXIII化合物
步驟1 使胺XXXHa與異氰酸叔丁酯按照實(shí)施例XXXI步驟1中介紹的方法反應(yīng)，獲得產(chǎn)物XXXIII。質(zhì)譜(LCMS)561(M+H+)。
實(shí)施例XXXIV制備式XXXIV化合物
步驟1 酯的混合物(6.0g)和分子篩(5.2g)的無(wú)水二氯甲烷(35mL)中加入吡咯烷(5.7mL，66.36mmoL)。所得褐色漿狀物在N2氣氛、室溫下攪拌24小時(shí)，過(guò)濾，然后用無(wú)水CH3CN洗滌。將合并的濾液濃縮獲得所需要的產(chǎn)物。
步驟2 前一步驟產(chǎn)物的CH3CN(35mL)溶液中加入無(wú)水K2CO3、甲代烯丙基氯(2.77g，30.5mmol)、NaI(1.07g，6.7mmoL)。將所得漿狀物在室溫、N2氣氛下攪拌24小時(shí)。加入50 mL冰水，接著加入2N KHSO4溶液直到pH為1。加入EtOAc(100mL)，攪拌混合物0.75小時(shí)。收集合并的有機(jī)層，然后用鹽水洗滌，用MgSO4干燥，蒸發(fā)獲得所需要的產(chǎn)物。
步驟3 將前一步驟產(chǎn)物(2.7g，8.16mmoL)溶于二氧六環(huán)(20mL)，用新制備的1N LiOH(9mL)處理。反應(yīng)混合物在室溫、N2氣氛下攪拌20小時(shí)。將反應(yīng)混合物溶于EtOAc，然后用H2O洗滌。將合并的水層冷卻至0℃，用1N HCl酸化至pH1.65?；鞚岬幕旌衔镉肊tOAc(2×100mL)萃取。合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，用MgSO4干燥，濃縮獲得所需要的酸(3.40g)。
步驟4 NaBH(OAc)3(3.93g，18.5mmoL)的CH2Cl2(55mL)懸浮液中加入前一步驟產(chǎn)物的無(wú)水CH2Cl2(20mL)和乙酸(2mL)溶液。所得漿狀物在室溫?cái)嚢?0小時(shí)。將冰水(100mL)加入到上述漿狀物中，攪拌半小時(shí)。分出有機(jī)層，過(guò)濾，干燥，蒸發(fā)獲得所需要的產(chǎn)物。
步驟5 前一步驟產(chǎn)物(1.9g)的MeOH(40mL)溶液用過(guò)量的CH2N2/Et2O溶液處理，攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)混合物濃縮至干獲得粗制的殘余物。將殘余物在硅膠上用色譜法提純，洗脫用梯度乙酸乙酯/己烷獲得1.07g純的所需產(chǎn)物。
步驟6 前一步驟的產(chǎn)物(1.36g)的無(wú)水CH2Cl2(40mL)溶液用BF3.Me2O(0.7mL)處理。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20小時(shí)，用飽和NaHCO3(30mL)猝滅，攪拌1/2小時(shí)。分離出有機(jī)層，合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，用MgSO4干燥，濃縮獲得粗制的殘余物。將殘余物在硅膠上用色譜法提純，洗脫用梯度乙酸乙酯/己烷獲得0.88g所需要的化合物。
步驟7 前一步驟產(chǎn)物(0.92g)的MeOH(30mL)溶液在室溫下加入10％Pd/C(0.16g)，在室溫、1atm壓力下氫化。將反應(yīng)混合物攪拌4小時(shí)，濃縮至干獲得所需要的化合物。
步驟8 所需要的產(chǎn)物按照實(shí)施例XXIII步驟10的方法制備。
步驟9 所需要的酸產(chǎn)物按照實(shí)施例XXIV步驟3的方法制備。
步驟10 所需要的產(chǎn)物XXXIV按照實(shí)施例XXIX步驟4-5的方法制備。
實(shí)施例XXXV制備式XXXV化合物 步驟1 膦酸三乙酯(44.8g)的THF(30mL)溶液在0℃用1M二(三甲硅烷基酰胺)鈉的THF溶液(200mL)處理。所得混合物在室溫下攪拌0.5小時(shí)，然后冷卻至0℃。滴加1，4-環(huán)己烷二酮乙二醇縮酮(15.6g)的THF(50mL)溶液，所得溶液在室溫下攪拌18小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，用冷檸檬酸水溶液處理，混合物用EtOAc萃取。萃取液用飽和NaHCO3水溶液洗滌，然后用鹽水洗滌；然后用無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，將濾液蒸發(fā)。殘余物在硅膠上用色譜法提純，洗脫用梯度CH2Cl2/EtOAc，獲得標(biāo)題化合物(21g)，92％收率。質(zhì)譜(FAB)227.3(M+H+)。
步驟2 將前一步驟產(chǎn)物(20g)溶于EtOH(150mL)，在1atm氫氣氛下用10％Pd/C處理3天。過(guò)濾混合物，將濾液蒸發(fā)獲得標(biāo)題化合物(20.3g)，100％收率。質(zhì)譜(FAB)229.2(M+H+)。
步驟3 將前一步驟產(chǎn)物(20g)溶于MeOH(150mL)，用LiOH(3.6g)的水(50mL)溶液處理。將混合物攪拌18小時(shí)，真空濃縮。將殘余物溶于冷水(100mL)，所得溶液用5N HCl酸化至pH2-3，所得混合物用EtOAc萃取。萃取液用無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，將濾液蒸發(fā)獲得標(biāo)題化合物(17.1g)，97％收率。質(zhì)譜(FAB)201.2(M+H+)。步驟4
1.將前一步驟產(chǎn)物(3.0g)溶于Et2O(150mL)，用Et3N(2.1mL)處理，所得溶液冷卻至-78℃。滴加新戊酰氯(1.85mL)，再攪拌0.25小時(shí)后，將反應(yīng)物在0.75小時(shí)內(nèi)加溫至0℃，然后再次冷卻至-78℃獲得用于第二部分反應(yīng)的混合酸酐溶液。
2.將(S)-4-芐基-2-噁唑烷酮(2.66g)的THF(22mL)溶液冷卻至-78℃，滴加1.6M正丁基鋰的己烷溶液(9.38mL)。再本發(fā)明溫度下攪拌0.33小時(shí)后，將溶液通過(guò)套管轉(zhuǎn)移到第一部分的冷溶液中。將混合物在-78℃攪拌，然后加溫至0℃，本發(fā)明溫度攪拌0.5小時(shí)。分出有機(jī)層，水層用Et2O萃取，合并的有機(jī)層用鹽水洗滌，用無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，將濾液蒸發(fā)。殘余物在硅膠上用色譜法提純，洗脫用梯度己烷/乙酸乙酯(9∶1)獲得標(biāo)題化合物(5.0g)，93％收率。質(zhì)譜(FAB)360.4(M+H+)。
步驟5 將前一步驟產(chǎn)物(2.7g)溶于THF(25mL)，冷卻至-78℃，通過(guò)套管轉(zhuǎn)移到-78℃的0.5M二(三甲硅烷基)酰胺鉀/甲苯(16.5mL)的THF(25mL)溶液，所得溶液在-78℃攪拌0.75小時(shí)。此溶液中通過(guò)套管加入預(yù)冷至-78℃的trisyl疊氮化物(3.01g)的THF(25mL)溶液。在1.5分鐘后，反應(yīng)物用乙酸(1.99mL)猝滅，將反應(yīng)物加熱至室溫，然后攪拌16小時(shí)。反應(yīng)物用EtOAc(300mL)稀釋，然后用5％NaCl水溶液洗滌。水相用EtOAc萃取，合并的有機(jī)相用飽和NaHCO3水溶液洗滌，然后用鹽水洗滌；用無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，將濾液蒸發(fā)。殘余物在硅膠上用色譜法提純，洗脫時(shí)用乙酸乙酯/己烷(1∶3)獲得標(biāo)題化合物(2.65g)，88％收率。
步驟6 將前一步驟產(chǎn)物(11.4g)溶于95％甲酸(70mL)，在70℃、攪拌下加熱0.5小時(shí)。真空蒸發(fā)溶液，將殘余物溶于EtOAc。溶液用飽和NaHCO3水溶液洗滌，然后用鹽水洗滌；再用無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，將濾液蒸發(fā)。殘余物在硅膠上用色譜法提純獲得標(biāo)題化合物(8.2g)。
步驟7.
將前一步驟產(chǎn)物(8.2g)溶于CH2Cl2(16mL)，用三氟化二乙氨基硫(diethylaminosulfur trifluoride)(DAST，7.00mL)在室溫處理3小時(shí)。將反應(yīng)物傾入冰/水(200cc)，用CH2Cl2萃取。萃取液用飽和NaHCO3水溶液洗滌，然后用鹽水洗滌；再用無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，將濾液蒸發(fā)。殘余物在硅膠上用色譜法提純，洗脫時(shí)用乙酸乙酯/己烷(15∶85)，獲得標(biāo)題化合物(4.5g)，52％收率。
步驟8 將前一步驟產(chǎn)物(3.7g)溶于混合物THF(150mL)和水(48mL)，冷卻至0℃，依次用30％H2O2(3.95mL)、LiOH·H2O(0.86g)處理。將混合物在0℃攪拌1小時(shí)，然后Na2SO3(5.6g)的水(30mL)溶液猝滅，接著用0.5N NaHCO3(100mL)溶液猝滅。將混合物真空濃縮至1/2體積，用水(至500mL)稀釋，用CH2Cl2(4×200mL)萃取。水相用5N HCl酸化至pH1-2，用EtOAc(4×200mL)萃取。萃取液用鹽水洗滌；然后用無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，將濾液蒸發(fā)獲得標(biāo)題化合物(1.95g)，91％收率，它直接用于下一步驟。
步驟9 將前一實(shí)施例產(chǎn)物(2.6g)溶于Et2O(50mL)，滴加CH2N2的Et2O溶液處理直到溶液保持黃色。將溶液攪拌18小時(shí)，然后真空蒸發(fā)獲得標(biāo)題化合物(2.8)，它直接用于下一步驟。
步驟10 將前一步驟產(chǎn)物(1.95g)溶于MeOH(150mL)，先用甲酸(1.7mL)處理，再在1atm氫氣氛下用10％Pd/C(3.3g，Degussa E101型)處理1.5小時(shí)。將混合物過(guò)濾，蒸發(fā)濾液獲得為甲酸鹽的標(biāo)題化合物(2.1g)，它直接用于下一步驟。
步驟11 將前一步驟產(chǎn)物(2.1g)溶于1，4-二氧六環(huán)(100mL)，加入二碳酸二叔丁酯(1.9g)，接著加入二異丙基乙胺(2.9mL)。將溶液攪拌18小時(shí)，真空濃縮。殘余物用5％KH2PO4水溶液處理，混合物用EtOAc萃取。萃取液用鹽水洗滌；然后用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾，將濾液蒸發(fā)。殘余物在硅膠上用色譜法提純，洗脫用梯度CH2Cl2/Et2O獲得標(biāo)題化合物(2.5g)，99％收率。質(zhì)譜(FAB)307.9(M+H+)。
步驟12 將前一步驟產(chǎn)物(2.5g)溶于1，4-二氧六環(huán)(35mL)，用1M LiOH水溶液(17mL)處理，攪拌2小時(shí)?；旌衔镉帽?水(125cc)猝滅，混合物用3N HCl酸化至pH3-4，用EtOAc萃取。萃取液用無(wú)水MgSO4干燥，過(guò)濾，將濾液蒸發(fā)獲得標(biāo)題化合物(2.3g)，96％收率。質(zhì)譜(FAB)294.0(M+H+)。
步驟13 所需要的產(chǎn)物根據(jù)實(shí)施例XXIII步驟10的方法制備。
步驟14 所需的酸產(chǎn)物按照實(shí)施例XXIV步驟3的方法制備。
步驟15 所需的酸產(chǎn)物按照實(shí)施例XXIX步驟4的方法制備。
實(shí)施例XXXVI.制備式XXXVI和XXXVIII的化合物式XXXVI和XXXVIII的化合物按照以下流程以及利用上述制備實(shí)施例11至15制備。
式XXXVIb化合物用式XXXVIa化合物按照以下的已知方法制備 化合物XXXVIa(6.58g，22mmol)的100mL MeOH溶液中加入10％Pd/C(0.8g)和對(duì)甲苯磺酸(4.2g)。將反應(yīng)混合物在室溫下氫化過(guò)夜。反應(yīng)混合物通過(guò)硅藻土過(guò)濾，然后用過(guò)量MeOH洗滌。將合并的濾液真空濃縮獲得樹(shù)膠狀的標(biāo)題化合物XXXVIb。按照以上流程的路線并根據(jù)制備實(shí)施例11-15將XXXVIb轉(zhuǎn)換成XXXVI和XXXVII。
實(shí)施例XXXVIII.制備式XXXVIII化合物式XXXVIII化合物利用以下的流程并按照上述制備實(shí)施例11至15制備。

實(shí)施例XXXIX.合成式XXXIX化合物 步驟1 磺酰氯XXXIXa溶液(按照H.Mcklwain(J.Chem.Soc 1941，75)的方法制備)在-78℃滴加入1.1.當(dāng)量的叔丁基甲胺和三乙胺的混合物，在室溫下攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物真空濃縮，用色譜法(SiO2，己烷/丙酮4∶1)提純獲得無(wú)色油狀磺胺XXXIXb。
步驟2 將Cbz-保護(hù)的胺XXXIXb溶液溶于甲醇，用5mol％的Pd/C(5％w/w)處理，在60psi氫化。反應(yīng)混合物通過(guò)硅藻土填料過(guò)濾，真空濃縮獲得游離胺XXXIXc，其放置時(shí)固化。
步驟3 羥基磺胺XXXIXd用合成XXVf的同樣方法合成，除了將胺XXVd用XXXIXc替代。粗制的反應(yīng)混合物直接用于下一反應(yīng)。
步驟4 使用Dess Martin試劑，按照合成XXV(步驟5)的方法將羥基酰胺XXXIXd氧化成化合物XXXIX。粗制的混合物用色譜法(SiO2，丙酮/己烷3∶7)提純獲得無(wú)色固體XXXIX。
檢測(cè)HCV蛋白酶抑制活性分光光度分析按照R.Zhang等(Analytical Biochemistry，270(1999)268-275，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中)介紹的方法對(duì)本發(fā)明化合物進(jìn)行HCV絲氨酸蛋白酶的分光光度分析?；诘鞍追纸怙@色酯底物的分析適合連續(xù)監(jiān)測(cè)HCV NS3蛋白酶活性。底物衍生自其C末端羧基被4個(gè)不同發(fā)色醇(3-或4-硝基酚、7-羥基-4-甲基-香豆素或4-苯基偶氮酚)之一酯化的NS5A-NS5B連接序列(Ac-DTEDVVX(Nva)(其中X＝A或P)的P側(cè)。下面介紹這些新的分光光度性酯底物的合成、表征和在高通量篩選中的應(yīng)用，并且詳細(xì)介紹HCV NS蛋白酶抑制劑的動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)。
材料和方法.
材料分析用有關(guān)緩沖液的化學(xué)試劑得自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，Missouri)。肽合成試劑得自Aldrich Chemicals、Novabiochem(San Diego，California)、Applied Biosystems(Foster City，California)和Perseptive Biosystems(Framingham，Massachusetts)。人工合成肽，或者用自動(dòng)ABI 431A型合成儀(Applied Biosystems)合成肽。LAMBDA 12型UV/VIS分光計(jì)得自Perkin Elmer(Norwalk，Connecticut)，96孔UV板得自Corning(Corning，New York)。預(yù)熱均溫塊(prewarming block)得自USA Scientific(Ocala，F(xiàn)lorida)，96孔板渦旋器得自Labline Instruments(Melrose Park，Illinois)。SpectramaxPlus微量滴定板讀數(shù)儀(帶有單色計(jì))得自Molecular Devices(Sunnyvale，California)。
酶制備使用以前公開(kāi)的方法(D。L。Sali等，Biochemistry，37(1998)3392-3401)制備重組HCV NS3/NS4A異源二聚體蛋白酶(菌株1a)。蛋白濃度使用預(yù)先通過(guò)氨基酸分析定量的重組HCV蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)Biorad染料方法測(cè)定。開(kāi)始分析前，采用Biorad Bio-Spin P-6預(yù)填柱使酶貯藏緩沖液(50mM磷酸鈉pH8.0，300mM氯化鈉，10％甘油，0.05％月桂基麥芽糖苷和10mM DTT)交換為檢測(cè)緩沖液(25mMMOPS pH6.5，300mM氯化鈉，10％甘油，0.05％月桂基麥芽糖苷，5μM EDTA和5μM DTT)。
底物合成與純化根據(jù)R.Zhang等(同上)報(bào)道合成底物，合成開(kāi)始時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)方法(K.Barlos等，Int.J.Pept.Protein Res.，37(1991)，513-520)使Fmoc-Nva-OH固定在2-氯三苯甲基氯樹(shù)脂上。隨后利用Fmoc化學(xué)裝配肽，或者人工進(jìn)行或者采用自動(dòng)ABI 431型肽合成儀。N-乙?；彝耆Ｗo(hù)的肽片斷經(jīng)過(guò)10％乙酸(HOAC)和10％三氟乙醇(TFE)的二氯甲烷(DCM)溶液處理30分鐘，或者經(jīng)過(guò)2％三氟乙酸(TFA)的DCM溶液處理10分鐘后與樹(shù)脂斷開(kāi)。共沸蒸發(fā)合并的濾液和DCM洗滌液(或者重復(fù)用碳酸鈉水溶液萃取)，以去裂解時(shí)使用的酸。DCM相用硫酸鈉干燥后蒸發(fā)。
所述酯底物用標(biāo)準(zhǔn)酸-醇偶合方法(K.Holmber等，Acta Chem.Scand.，B33(1979)410-412)裝配。肽片段溶解于無(wú)水吡啶(30-60mg/ml)，其中加入10摩爾當(dāng)量發(fā)色團(tuán)和催化量(0.1eq.)對(duì)甲苯磺酸(pTSA)。加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，3eq.)啟動(dòng)偶合反應(yīng)。用HPLC監(jiān)測(cè)產(chǎn)物形成，在室溫下反應(yīng)12-72小時(shí)后證實(shí)反應(yīng)完畢。吡啶溶劑通過(guò)真空蒸發(fā)除去，進(jìn)一步與甲苯共沸除去。肽酯用95％TFA的DCM溶液去保護(hù)2小時(shí)，用無(wú)水乙醚萃取3次以去除過(guò)量發(fā)色團(tuán)。去保護(hù)底物在C3或C8柱上通過(guò)反相HPLC純化，用30％-60％乙腈梯度洗脫(用6個(gè)柱體積)。HPLC純化后的總收率約20-30％。電噴霧離子化質(zhì)譜證實(shí)分子量。底物以干粉干燥保藏。
底物及產(chǎn)物光譜用pH6.5檢測(cè)緩沖液獲得底物和相應(yīng)的發(fā)色團(tuán)產(chǎn)物的光譜。利用多個(gè)稀釋度以1-cm比色杯于優(yōu)化非高峰波長(zhǎng)(3Np和HMC為340nm，PAP為370nm，4-Np為400nm)檢測(cè)消光系數(shù)。優(yōu)化非高峰波長(zhǎng)的定義為底物和產(chǎn)物之間產(chǎn)生最大吸光度差異((產(chǎn)物OD-底物OD)/底物OD)的波長(zhǎng)。
蛋白酶分析在96孔微量滴定板中用200μl反應(yīng)混合物于30℃進(jìn)行HCV蛋白酶分析。對(duì)NS3/NS4A異源二聚體優(yōu)化檢測(cè)緩沖條件(25mM MOPS pH6.5，300mM NaCl，10％甘油，0.05％月桂基麥芽糖苷，5μM EDTA和5μM DTT)(D.L.Sali等，同上)。通常，將150μl的緩沖劑、底物和抑制劑的混合物加入各孔中(DMSO終濃度為4％v/v)，使其于30℃預(yù)溫育約3分鐘。然后用50μl在檢測(cè)緩沖液中的蛋白酶預(yù)熱溶液(12nM，30CC)啟動(dòng)反應(yīng)(終體積為200μl)。用配備有單色器的Spectromax Plus微量滴定板讀數(shù)儀(采用截止濾光片型板讀數(shù)儀可獲得可接受的結(jié)果)，在合適波長(zhǎng)(3Np和HMC為340nm，PAP為370nm，4-Np為400nm)在檢測(cè)時(shí)間(60分鐘)范圍內(nèi)監(jiān)測(cè)各板的吸光度變化。相對(duì)于用作非酶水解對(duì)照的無(wú)酶空白，在合適波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)Nva和發(fā)色團(tuán)之間的酯鍵的蛋白裂解。在30倍底物濃度范圍內(nèi)(約6-200μM)評(píng)價(jià)底物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。用線性回歸確定初速度，采用非線性回歸分析(Mac Curve Fit 1.1，K.Raner)用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合Michaelis-Menten方程，獲得動(dòng)力學(xué)常數(shù)。計(jì)算酶變率(kcat)，假定酶全部具有活性。
抑制劑和滅活劑的評(píng)價(jià)對(duì)竟?fàn)幮砸种苿〢c-D-(D-Gla)-L-I-(Cha)-C-OH(27)、Ac-DTEDVVA(Nva)-OH和Ac-DTEDVVP(Nva)-OH，實(shí)驗(yàn)測(cè)定固定濃度酶和底物的抑制常數(shù)，根據(jù)用于竟?fàn)幮砸种苿?dòng)力學(xué)的重排Michaelis-Menten方程vo/vi＝1+[1]o/(Ki*(1+[S]o/Km))，其中vo為非抑制初速度，vi為存在任何已知抑制劑濃度([1]o)抑制劑的初速度，[S]o為所使用的底物濃度；用vo/vi對(duì)抑制劑濃度([I]o)作圖。用線性回歸擬合獲得的數(shù)據(jù)，用獲得的斜率1/(Ki*(1+[S]o/Km)計(jì)算Ki*值。
在以上各表中給出了獲得的本發(fā)明不同化合物的Ki*值，其中的化合物按照Ki*范圍順序排列。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，熟練技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明化合物具有良好的NS3-絲氨酸蛋白酶抑制劑作用。
盡管結(jié)合上述具體實(shí)施方案闡明了本發(fā)明，但是本發(fā)明的許多替代、改進(jìn)及其它變化方案對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。所有這樣的替代、改進(jìn)及變化方案均屬于本發(fā)明實(shí)質(zhì)及范疇。
表2



















































表4












表5

















































































































權(quán)利要求
1.一種化合物，包括該化合物的對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體、旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、外消旋體和前體藥物，以及所述化合物或所述前體藥物的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，所述化合物具有式I所示的通用結(jié)構(gòu) 式I其中Y選自以下部分烷基、烷基-芳基、雜烷基、雜芳基、芳基-雜芳基、烷基-雜芳基、環(huán)烷基、烷氧基、烷基-芳氧基、芳氧基、雜芳氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、烷基-芳基氨基、芳基氨基、雜芳基氨基、環(huán)烷基氨基和雜環(huán)烷基氨基，前提是Y可以任選被X11或X12取代；X11為烷基、鏈烯基、鏈炔基、環(huán)烷基、環(huán)烷基-烷基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、雜芳基、烷基雜芳基或雜芳基烷基，前提是X11還可以任選被X12取代；X12為羥基、烷氧基、芳氧基、硫代基、烷硫基、芳硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷基磺酰基、芳基磺?；?、烷基亞磺酰氨基、芳基亞磺酰氨基、羧基、烷氧羰基、酰胺基、烷氧羰基氨基、烷氧羰基氧基、烷基脲基、芳基脲基、鹵素、氰基或硝基，前提是所述烷基、烷氧基和芳基還可以任選被獨(dú)立選自X12的部分取代；R1為COR5或B(OR)2，其中R5為H、OH、OR8、NR9R10、CF3、C2F5、C3F7、CF2R6、R6或COR7，其中R7為H、OH、OR8、CHR9R10或NR9R10，其中R6、R8、R9和R10獨(dú)立選自以下基團(tuán)H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基烷基、雜芳基烷基、[CH(R1’)]pCOOR11、[CH(R1’)]pCONR12R13、[CH(R1’)]pSO2R11、[CH(R1’)]pCOR11、[CH(R1’)]pCH(OH)R11、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)R’、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)COOR11CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)CONR12R13，其中R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R11、R12、R13和R’獨(dú)立選自以下基團(tuán)H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、烷基-芳基、烷基-雜芳基、芳基-烷基和雜芳烷基；Z選自O(shè)、N、CH或CR；W可以存在或者不存在，當(dāng)W存在時(shí)，W選自C＝O、C＝S、C(＝N-CN)或SO2；Q可以存在或者不存在，當(dāng)Q存在時(shí)，Q為CH、N、P、(CH2)p、(CHR)p、(CRR’)p、O、NR、S或SO2；當(dāng)Q不存在時(shí)，M可以存在或不存在；當(dāng)Q和M不存在時(shí)，A直接連結(jié)到L；A為O、CH2、(CHR)p、(CHR-CHR’)p、(CRR’)p、NR、S、SO2或化學(xué)鍵；E為CH、N、CR或朝向A、L或G的雙鍵；G可以存在或不存在，當(dāng)G存在時(shí)，G為(CH2)p、(CHR)p或(CRR’)p；當(dāng)G不存在時(shí)，則J存在并且E直接連結(jié)到G連結(jié)的式I碳原子上；J可以存在或不存在，當(dāng)J存在時(shí)，J為(CH2)p、(CHR)p或(CRR’)p、SO2、NH、NR或O；當(dāng)J不存在時(shí)，則G存在并且E直接連結(jié)到連結(jié)J的式I所示氮原子上；L可以存在或不存在，當(dāng)L存在時(shí)，L為CH、CR、O、S或NR；當(dāng)L不存在時(shí)，則M可以存在或不存在；當(dāng)M存在而L不存在時(shí)，則M直接獨(dú)立連結(jié)到E，并且J直接獨(dú)立連結(jié)到E；M可以存在或不存在，當(dāng)M存在時(shí)，M為O、NR、S、SO2、(CH2)p、(CHR)p(CHR-CHR’)p或(CRR’)p；p為數(shù)字0-6；R、R’、R2、R3和R4獨(dú)立選自以下基團(tuán)H；C1-C10烷基；C2-C10鏈烯基；C3-C8環(huán)烷基；C3-C8雜環(huán)烷基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、鹵素；(環(huán)烷基)烷基和(雜環(huán)烷基)烷基，其中所述環(huán)烷基由3-8個(gè)碳原子和0-6個(gè)氧、氮、硫或磷原子組成，并且所述烷基具有1-6個(gè)碳原子；芳基；雜芳基；烷基-芳基；以及烷基-雜芳基；其中所述烷基、雜烷基、鏈烯基、雜鏈烯基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)烷基部分可任選進(jìn)行化學(xué)上適當(dāng)?shù)娜〈?，所述術(shù)語(yǔ)“取代”指任選并且化學(xué)上適當(dāng)?shù)谋?個(gè)或多個(gè)選自以下的部分取代烷基、鏈烯基、鏈炔基、芳基、芳烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、鹵素、羥基、硫代基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、亞磺酰氨基、亞砜、砜、磺酰脲、酰肼和異羥肟酸酯；進(jìn)一步，其中所述N-C-G-E-L-J-N單元為五元或六元環(huán)結(jié)構(gòu)，前提是當(dāng)所述N-C-G-E-L-J-N單元為五元環(huán)結(jié)構(gòu)，或當(dāng)式I中包括N、C、G、E、L、J、N、A、Q和M的雙環(huán)結(jié)構(gòu)為五元環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，則所述五元環(huán)結(jié)構(gòu)沒(méi)有羰基作為環(huán)的一部分。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為COR5，而R5為H、OH、COOR8或CONR9R10。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中R1為COCONR9R10，而R9為H，R10為H、R14、[CH(R1’)]pCOOR11、[CH(R1’)]pCONR12R13、[CH(R1’)]pSO2R11、[CH(R1’)]pSO2NR12R13、[CH(R1’)]pCOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)，其中R14為H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、烷基-芳基、烷基-雜芳基、芳基-烷基、鏈烯基、鏈炔基或雜芳烷基。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中R10為H、R14、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CH(R1’)SO2R11、CH(R1’)CH(R1’)SO2NR12R13、CH(R1’)CH(R1’)COR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)，其中R1’為H或烷基，R2’為苯基、取代的苯基、雜原子取代的苯基、苯硫基、環(huán)烷基、哌啶基或吡啶基。
5.權(quán)利要求4的化合物，其中R1’為H。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中R11為H、甲基、乙基、烯丙基、叔丁基、芐基、α-甲基芐基、α，α-二甲基芐基、1-甲基環(huán)丙基或1-甲基環(huán)戊基；R’為羥甲基或CH2CONR12R13；R2’獨(dú)立選自以下基團(tuán) 其中U1和U2可以相同或不同，并且選自以下基團(tuán)H、F、CH2COOH、CH2COOMe、CH2CONH2、CH2CONHMe、CH2CONMe2、疊氮基、氨基、羥基、取代的氨基、取代的羥基；U3和U4可以相同或不同，并且選自O(shè)和S；U5選自以下部分烷基磺?；?、芳基磺酰基、雜烷基磺酰基、雜芳基磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、雜烷基羰基、雜芳基羰基、烷氧羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、雜芳基氨基羰基或其組合；NR12R13選自以下基團(tuán) 和 其中U6為H、OH或CH2OH，R14選自以下基團(tuán)H、Me、Et、正丙基、甲氧基、環(huán)丙基、正丁基、1-丁-3-炔基、芐基、α-甲基芐基、苯乙基、烯丙基、1-丁-3-烯基、OMe、環(huán)丙基甲基。
7.權(quán)利要求2的化合物，其中R2選自以下基團(tuán)
8.權(quán)利要求7的化合物，其中R3選自以下基團(tuán) 其中R31＝OH或O-烷基；Y19選自以下部分 Y20選自以下部分
9.權(quán)利要求8的化合物，其中R3選自以下基團(tuán)
10.權(quán)利要求9的化合物，其中Z為N，R4為H。
11.權(quán)利要求10的化合物，其中W為C＝O。
12.權(quán)利要求11的化合物，其中Y選自以下部分 其中Y11選自H、COOH、COOEt、OMe、Ph、OPh、NHMe、NHAc、NHPh、CH(Me)2、1-三唑基、1-咪唑基和NHCH2COOH；Y12選自H、COOH、COOMe、OMe、F、Cl或Br；Y13選自以下部分 Y14選自MeSO2、Ac、Boc、iBoc、Cbz或Alloc；Y15和Y16獨(dú)立選自烷基、芳基、雜烷基和雜芳基；Y17為CF3、NO2、CONH2、OH、COOCH3、OCH3、OC6H5、C6H5、COC6H5、NH2或COOH；Y18為COOCH3、NO2、N(CH3)2、F、OCH3、CH2COOH、COOH、SO2NH2或NHCOCH3。
13.權(quán)利要求12的化合物，其中Y選自以下基團(tuán) 其中Y17＝CF3、NO2、CONH2、OH、NH2或COOH；Y18＝F、COOH。
14.權(quán)利要求13的化合物，其中Y選自以下基團(tuán)
15.權(quán)利要求14的化合物，其中L和M不存在，并且J直接連接到E。
16.權(quán)利要求14的化合物，其中L、J和M不存在，并且E直接連接到N。
17.權(quán)利要求14的化合物，其中G和M不存在。
18.權(quán)利要求14的化合物，其中以下部分 為
19.權(quán)利要求18的化合物，其中結(jié)構(gòu)a選自以下結(jié)構(gòu)
20.權(quán)利要求18的化合物，其中結(jié)構(gòu)a為 其中R20選自以下結(jié)構(gòu)
21.權(quán)利要求18的化合物，其中結(jié)構(gòu)a為 其中R21和R22可以相同或不同，并且獨(dú)立選自以下結(jié)構(gòu)
22.權(quán)利要求18的化合物，其中結(jié)構(gòu)a選自以下結(jié)構(gòu)
23.權(quán)利要求14的化合物，其中 為 其中Q可以存在或不存在，當(dāng)Q不存在時(shí)，M直接連結(jié)到A。
24.權(quán)利要求23的化合物，其中結(jié)構(gòu)b選自以下結(jié)構(gòu)
25.權(quán)利要求14的化合物，其中 為 其中G和J獨(dú)立選自以下基團(tuán)(CH2)p、(CHR)p、(CHR-CHR’)p和(CRR’)p；A和M獨(dú)立選自以下基團(tuán)O、S、SO2、NR、(CH2)p、(CHR)p、(CHR-CHR’)p和(CRR’)p；Q為CH2、CHR、CRR’、NH、NR、O、S、SO2、NR、(CH2)p、(CHR)p和(CRR’)p。
26.權(quán)利要求25的化合物，其中結(jié)構(gòu)c選自以下結(jié)構(gòu)
27.權(quán)利要求14的化合物，其中 選自以下結(jié)構(gòu)
28.權(quán)利要求27的化合物，其中 選自以下結(jié)構(gòu)
29.一種藥用組合物，它包含作為活性成分的權(quán)利要求1化合物。
30.權(quán)利要求29的藥用組合物，它用于治療HCV相關(guān)性疾病。
31.權(quán)利要求29的藥用組合物，它還包含藥學(xué)上可接受的載體。
32.權(quán)利要求31的藥用組合物，它還包含抗病毒藥物。
33.權(quán)利要求32的藥用組合物，它還包含干擾素。
34.權(quán)利要求33的藥用組合物，其中所述抗病毒藥物為利巴韋林，所述干擾素為α-干擾素或聚乙二醇化干擾素。
35.一種治療HCV相關(guān)性疾病的方法，所述方法包含給予需要這種治療的患者一種藥用組合物，該組合物包含治療有效量的權(quán)利要求1化合物。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述給藥為口服或皮下給藥。
37.權(quán)利要求1的化合物在制造藥物中的用途，所述藥物用于治療HCV相關(guān)性疾病。
38.一種制備用于治療HCV相關(guān)性疾病的藥用組合物的方法，所述方法包含使權(quán)利要求1的化合物與藥學(xué)上可接受的載體密切接觸。
39.一種具有HCV蛋白酶抑制活性的化合物，包括該化合物的對(duì)映異構(gòu)體、立體異構(gòu)體、旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、消旋體和前體藥物，以及所述化合物或所述前體藥物的藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，所述化合物選自具有下列結(jié)構(gòu)的化合物 (R＝叔丁基，X＝NH2)(R＝異丁基，X＝NH2)(R＝叔丁基，X＝OH)(R＝三氯乙基，X＝OH) (x=OtBu) (x=OH)(x=OH)(x=OtBu)(x=NH2)(X＝NHMe)(X＝NMe2) (X＝NH2)(X＝NMe2)(X＝NHMe)(X＝OH)(X＝OtBu)(X＝OH)(X＝NH2)(X＝NMe2) (X＝OtBu)(X＝OH)(R＝叔丁基)(X＝NH2) (R＝異丁基)(X＝NMe2)(X＝NMeOMe) (X＝Me，Y＝CH2Me)(X＝OAc，Y＝Me)
40.一種用于治療HCV相關(guān)性疾病的藥用組合物，所述組合物包含治療有效量的一種或多種權(quán)利要求39化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
41.權(quán)利要求40的藥用組合物，它還包含抗病毒藥物。
42.權(quán)利要求41的藥用組合物，它還包含干擾素或聚乙二醇-干擾素α綴合物。
43.權(quán)利要求42的藥用組合物，其中所述抗病毒藥物為利巴韋林，所述干擾素為α-干擾素。
44.一種治療丙型肝炎病毒相關(guān)性疾病的方法，該方法包括給予有效量的一種或多種權(quán)利要求39化合物。
45.一種調(diào)節(jié)丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性的方法，該方法包含使HCV蛋白酶與一種或多種權(quán)利要求39化合物接觸。
46.一種治療、預(yù)防或改善一種或多種丙型肝炎癥狀的方法，該方法包含給予有效量的一種或多種權(quán)利要求39化合物。
47.權(quán)利要求45的方法，其中所述HCV蛋白酶為NS3/NS4a蛋白酶。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述一種或多種化合物抑制HCVNS3/NS4a蛋白酶。
49.一種調(diào)節(jié)丙型肝炎病毒(HCV)多肽加工的方法，該方法包括在加工所述多肽的條件下使包含HCV多肽的組合物與一種或多種權(quán)利要求39化合物接觸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了具有HCV蛋白酶抑制活性的新型化合物以及制備所述化合物的方法。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明公開(kāi)了包含所述化合物的藥用組合物以及將其用于治療HCV蛋白酶相關(guān)性疾病的方法。
文檔編號(hào)C07K5/087GK1498224SQ01813111
公開(kāi)日2004年5月19日 申請(qǐng)日期2001年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月21日
發(fā)明者A·K·薩克塞納, V·M·吉里亞瓦拉班, R·G·洛維, E·E·堯, F·本尼特, J·L·麥克科爾米克, H·王, R·E·皮克, S·L·伯根, 覃天佑, 劉怡宗, 朱昭寧, F·G·恩約羅格, A·阿拉薩潘, T·N·帕雷克, A·K·甘古利, 陳新海, S·文卡特拉曼, H·A·瓦卡羅, P·A·平托, B·桑塔納姆, W·吳, S·亨德拉塔, Y·黃, S·J·坎普, O·E·萊維, M·利姆-維爾比, S·Y·塔穆拉, A K 薩克塞納, ㄌ乩, 伯根, 吉里亞瓦拉班, 呂, 坎普, 塔穆拉, 堯, 崽, 帕雷克, 平托, 恩約羅格, 洛維, 瓦卡羅, 甘古利, 皮克, 維爾比, 萊維, 贍, 麥克科爾米克 申請(qǐng)人:先靈公司, 科瓦斯國(guó)際公司