專(zhuān)利名稱(chēng)：利用丙烯腈清除劑去保護(hù)合成的寡核苷酸的制作方法
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背景技術(shù)：
寡核苷酸習(xí)慣上是利用β-氰基乙基亞磷酰胺化學(xué)在固體載體上合成的，大規(guī)模的用于反義治療劑，小規(guī)模的用于診斷/分子生物學(xué)目的。這種化學(xué)是利用二氧化硅類(lèi)CPG珠粒作為固體載體而開(kāi)發(fā)的，以促進(jìn)去保護(hù)和純化。隨后，這種化學(xué)轉(zhuǎn)而利用剛性聚苯乙烯類(lèi)載體合成寡核苷酸。另外，用于反義及相關(guān)療法的大規(guī)模寡核苷酸合成已經(jīng)變得日益重要，因?yàn)镕DA批準(zhǔn)了寡核苷酸類(lèi)似物用于治療CMV。若干其他寡核苷酸類(lèi)似物當(dāng)前處于臨床試驗(yàn)階段。目前，千克數(shù)量級(jí)的具有磷酸二酯或硫代磷酸二酯鍵的寡核苷酸是利用β-氰基乙基亞磷酰胺化學(xué)合成的，用于臨床試驗(yàn)和其他應(yīng)用。
關(guān)于藥物應(yīng)用，必須將所需的寡核苷酸從基本上全部在合成期間生成的雜質(zhì)中分離出來(lái)。一般通過(guò)反相高效液相色譜法(HPLC)和/或離子交換色譜法除去雜質(zhì)。不過(guò)，結(jié)構(gòu)上與所需產(chǎn)物相似的那些雜質(zhì)是難以除去的，因?yàn)樗鼈兣c所需產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)相似性致使它們具有相似的色譜遷移率。因此，需要改進(jìn)合成工藝，以便不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)與所需產(chǎn)物相似的雜質(zhì)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，在β-氰基乙基磷酸酯保護(hù)基團(tuán)從合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物上裂解期間所釋放的丙烯腈能夠與寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物上的親核基團(tuán)反應(yīng)，生成結(jié)構(gòu)上與所需寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物相似的雜質(zhì)。
本發(fā)明的方法基本上防止了合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物在至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)從寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物上裂解期間的修飾。該方法涉及使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與丙烯腈清除劑在有機(jī)溶劑中的溶液在足以除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的條件(例如足夠高的溫度和足夠長(zhǎng)的時(shí)間)下接觸。叔丁胺是優(yōu)選的丙烯腈清除劑。適合的有機(jī)溶劑包括親核溶劑，例如吡啶；醚，例如四氫呋喃或二噁烷；腈，例如乙腈；鹵代烷烴，例如二氯甲烷；酯，例如乙酸乙酯、丙酸甲酯和丙酸乙酯；醇，例如乙醇或甲醇；和二甲基甲酰胺。一組優(yōu)選的溶劑包括鹵代烷烴、酯、醇和二甲基甲酰胺。另一組優(yōu)選的溶劑包括吡啶和乙腈。
在另一種實(shí)施方式中，該方法涉及使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有至少一種丙烯腈清除劑、例如叔丁胺的堿水溶液接觸。堿溶液優(yōu)選地是氫氧化銨水溶液。寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿水溶液在足以從寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物中除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的條件下接觸。
在另一種實(shí)施方式中，被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物在與含有丙烯腈清除劑的堿水溶液接觸之前先與含有有機(jī)溶劑和至少一種丙烯腈清除劑的溶液接觸。
另外，當(dāng)被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有丙烯腈清除劑的有機(jī)或堿水溶液接觸時(shí)，能夠除去至少一個(gè)核堿保護(hù)基團(tuán)。另外，通過(guò)與含有丙烯腈清除劑的有機(jī)或堿水溶液接觸，寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物能夠同時(shí)從固體載體上裂解。
本發(fā)明還涉及制備寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的方法，其中基本上防止了寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的修飾。在制備寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的方法中，具有至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物通常是利用亞磷酰胺化學(xué)合成的。所合成的被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物然后與至少一種丙烯腈清除劑在有機(jī)溶劑中的溶液在一定溫度下接觸一段時(shí)間，溫度和時(shí)間都足以除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)。在替代的實(shí)施方式中，所合成的被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿水溶液在一定溫度下接觸一段時(shí)間，溫度和時(shí)間都足以除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)。在另一種實(shí)施方式中，所合成的被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物先與至少一種丙烯腈清除劑在有機(jī)溶劑中的溶液、隨后再與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿水溶液在一定溫度下接觸一段時(shí)間，溫度和時(shí)間都足以除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)。
通常，β-氰基乙基磷酸酯保護(hù)基團(tuán)是這樣從合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物上裂解的，將合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物用氫氧化銨水溶液處理。氫氧化銨處理后的粗產(chǎn)物的色譜圖一般顯示除所需寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物以外的峰。這些異常主要見(jiàn)于富含胸腺嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤堿基或者經(jīng)過(guò)修飾已含有脂族胺的寡核苷酸的序列。如本文所述，用氫氧化銨處理后的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物粗產(chǎn)物的MALDITOF質(zhì)譜表明，主要雜質(zhì)的質(zhì)量比所需寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的質(zhì)量多52-54個(gè)單位，說(shuō)明它來(lái)源于所需寡核苷酸用丙烯腈修飾，丙烯腈是β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)裂解的副產(chǎn)物。
無(wú)意拘泥于任何理論的是，據(jù)信本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)丙烯腈與丙烯腈清除劑的反應(yīng)，從堿水溶液中除去在β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的除去期間所產(chǎn)生的丙烯腈。這減少了在裂解與去保護(hù)期間所生成的結(jié)構(gòu)上與所需寡核苷酸產(chǎn)物相似的雜質(zhì)的量，所需產(chǎn)物例如其中一個(gè)或多個(gè)核堿已經(jīng)與丙烯腈反應(yīng)的寡核苷酸和寡核苷酸類(lèi)似物。因此，所需產(chǎn)物的純化是更容易的，所需產(chǎn)物的回收率更高。


圖1A、1B和1C是離子交換HPLC色譜，如下所述。柱子類(lèi)型是DNA PAC PA-100(柱s/n1305)。洗脫劑A是25mM Tris pH8。洗脫劑B是25mM Tris，375mM NaClO4 pH8。系統(tǒng)名稱(chēng)是IEX2。波道說(shuō)明是260nm。梯度是在40min內(nèi)10至60％B，流速1.5ml/min，溫度45℃。
圖1A是具有31個(gè)胸腺嘧啶堿基的磷酸二酯寡核苷酸的離子交換HPLC色譜，該寡核苷酸從聚苯乙烯固體載體上裂解，在50℃下用氫氧化銨處理16小時(shí)進(jìn)行去保護(hù)。
圖1B是來(lái)自與圖1A磷酸二酯相同合成批次的磷酸二酯寡核苷酸的離子交換HPLC色譜，該寡核苷酸從固體載體上裂解，在50℃下用含10％叔丁胺的氫氧化銨處理16小時(shí)進(jìn)行去保護(hù)。
圖1C是來(lái)自與圖1A磷酸二酯相同合成批次的磷酸二酯寡核苷酸的離子交換HPLC色譜，該寡核苷酸從固體載體上裂解，在50℃下用含5％DTT的氫氧化銨處理16小時(shí)進(jìn)行去保護(hù)。
圖2A是圖1A磷酸二酯寡核苷酸的MALDITOF質(zhì)譜。PSI NH4OHTIPPED法是DNA1。模式是線(xiàn)性。加速電壓是25000。柵壓是92.500％。導(dǎo)線(xiàn)電壓是0.150％。平均掃描是156。壓力是3.09e-07。激光在2620。陰離子是OFF。低質(zhì)量門(mén)是500.0。延遲是250 ON。
圖2B是圖1B磷酸二酯寡核苷酸的MALDITOF質(zhì)譜。PSI NH4OH+10％叔丁胺法是DNA1。模式是線(xiàn)性。加速電壓是25000。柵壓是92.500％。導(dǎo)線(xiàn)電壓是0.150％。平均掃描是54。壓力是3.05e-07。激光在2620。陰離子是OFF。低質(zhì)量門(mén)是500.0。延遲是250 ON。
圖2C是圖1C磷酸二酯寡核苷酸的MALDITOF質(zhì)譜。PSI NH4OH+DDT TIPPED法是DNA1。模式是線(xiàn)性。加速電壓是25000。柵壓是92.500％。導(dǎo)線(xiàn)電壓是0.150％。平均掃描是54。壓力是3.05e-07。激光在2620。陰離子是OFF。低質(zhì)量門(mén)是500.0。延遲是250 ON。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)，向用于裂解β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的堿水溶液加入丙烯腈清除劑，能夠改善或基本上防止在β-氰基乙基磷酸酯保護(hù)基團(tuán)裂解期間所生成的丙烯腈對(duì)合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的修飾。作為替代選擇，在有機(jī)溶劑中將被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物用丙烯腈清除劑處理，能夠防止丙烯腈對(duì)合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的修飾。
β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)通常用于在合成期間保護(hù)與寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物磷骨架連接的氧或硫。β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)可以由下列結(jié)構(gòu)式代表 可以通過(guò)堿處理除去β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)。關(guān)于除去β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的條件，參見(jiàn)Sinha等，Nucleic Acids Research(1984)，12(11)4539和Sinha，美國(guó)專(zhuān)利No.4,725,677，全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此作為參考。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“堿水溶液”表示水溶液，或者含有水互溶性有機(jī)溶劑的水溶液，例如醇、四氫呋喃、乙腈和二甲基甲酰胺。當(dāng)水溶液含有有機(jī)溶劑時(shí)，它的濃度通常小于50％。堿通常是氨、取代或未取代的脂族胺、取代或未取代的芳族胺、堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物。含水氫氧化銨是優(yōu)選的堿溶液。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，還通過(guò)含有至少一種丙烯腈清除劑的堿水溶液處理除去核堿保護(hù)基團(tuán)。
當(dāng)通過(guò)堿處理除去β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)時(shí)，例如氫氧化銨，生成丙烯腈(例如參見(jiàn)流程I)。 流程Iβ-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的去保護(hù)流程I中，X1和X2各自獨(dú)立地是氧或硫。在β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的除去期間生成的丙烯腈是一種Michael受體，因此能夠在堿性反應(yīng)條件下與寡核苷酸或核苷酸類(lèi)似物上的環(huán)外或環(huán)內(nèi)親核基團(tuán)反應(yīng)。例如，丙烯腈能夠通過(guò)N3加成與胸腺嘧啶核苷堿基反應(yīng)，如流程II所示。 流程II核堿在氫氧化銨處理期間的氰基乙基化作用在本發(fā)明的方法中，用含有至少一種丙烯腈清除劑的溶液除去β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)，能夠改善或基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的氰基乙基化作用。如果在除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的處理之后不存在分子量比所需寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物高52-53個(gè)質(zhì)量單位的雜質(zhì)，或者這類(lèi)雜質(zhì)的可檢測(cè)量當(dāng)與所需寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物相比時(shí)小于0.5％，那么基本上防止在除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的處理期間丙烯腈對(duì)寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的修飾。
丙烯腈清除劑是能夠與丙烯腈反應(yīng)的化合物，使其對(duì)寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的親核基團(tuán)是無(wú)反應(yīng)性的，例如核堿的那些。優(yōu)選地，丙烯腈清除劑還能夠裂解被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)，生成所需的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物骨架(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、膦酸甲酯等)。丙烯腈清除劑優(yōu)選地是位阻的，以避免與核堿的反應(yīng)。例如，未受阻的伯胺能夠與胞嘧啶和腺苷反應(yīng)，置換胞嘧啶的N4-胺和腺苷的N6-胺(Hsiung等，NucleicAcid Research(1983)，11(10)3227)。因此，主要為脂族伯胺或脂族伯硫醇的丙烯腈清除劑應(yīng)當(dāng)是空間位阻的?？臻g位阻的硫醇或空間位阻的脂族伯胺是與脂族仲或叔碳原子鍵合的硫醇或胺，或者是與伯碳鍵合的硫醇或胺，其條件是該伯碳與仲或叔碳原子或芳族或雜芳族基團(tuán)連接?？梢圆捎玫谋╇媲宄齽┌ㄈ〈蛭慈〈闹辶u基化合物。優(yōu)選的丙烯腈清除劑是取代或未取代的空間位阻脂族硫醇、取代或未取代的芳族硫醇、取代或未取代的芳族羥基化合物(例如酚)、取代或未取代的脂族仲胺、取代或未取代的空間位阻脂族伯胺、或取代或未取代的芳族伯或仲胺。更優(yōu)選地，丙烯腈清除劑是叔丁胺。
由于丙烯腈清除劑優(yōu)選地裂解β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)，因此將被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物用含有丙烯腈清除劑的有機(jī)溶劑在足夠高的溫度下、優(yōu)選約15℃至約30℃處理足夠長(zhǎng)的時(shí)間、優(yōu)選約0.5小時(shí)至約2小時(shí)，以除去至少一個(gè)β-氰基乙基，能夠基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的修飾。丙烯腈清除劑在有機(jī)溶劑中的濃度經(jīng)常約0.5％(vol/vol)至約50％(vol/vol)，優(yōu)選約3％(vol/vol)至約25％(vol/vol)，更優(yōu)選約1％(vol/vol)至約15％(vol/vol)。
在另一種實(shí)施方式中，使具有至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿水溶液在足夠高的溫度下接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以除去至少一個(gè)β-氰基乙基。丙烯腈清除劑在堿水溶液中的濃度經(jīng)常約0.5％(vol/vol)至約50％(vol/vol)，優(yōu)選約3％(vol/vol)至約25％(vol/vol)，更優(yōu)選約1％(vol/vol)至約15％(vol/vol)。
當(dāng)寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的核堿的胺基被堿不穩(wěn)定性保護(hù)基團(tuán)保護(hù)時(shí)，例如生成酰胺保護(hù)基團(tuán)，當(dāng)寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿水溶液接觸時(shí)，能夠除去該保護(hù)基團(tuán)。另外，如果寡核苷酸通過(guò)堿不穩(wěn)定性連接劑、例如琥珀酰胺連接劑或草酰胺連接劑而與固體載體連接，那么通過(guò)與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿水溶液接觸能夠從固體載體上裂解。類(lèi)似地，如果丙烯腈清除劑是一種胺，例如取代或未取代的脂族仲胺或取代或未取代的空間位阻脂族伯胺，那么當(dāng)寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有至少一種丙烯腈清除劑的有機(jī)溶液接觸時(shí)，能夠除去核堿保護(hù)基團(tuán)，寡核苷酸能夠從固體載體上裂解。
在本發(fā)明的方法中，寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物通常與含有丙烯腈清除劑的堿水溶液接觸至多約48小時(shí)。通常，堿水溶液的溫度約20℃至約100℃。寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有丙烯腈清除劑的堿水溶液接觸的時(shí)間長(zhǎng)度和溶液的溫度取決于是否有所要除去的核堿保護(hù)基團(tuán)和所用核堿保護(hù)基團(tuán)的類(lèi)型。例如，當(dāng)腺嘌呤和胞嘧啶的胺基被苯甲酰基保護(hù)基團(tuán)保護(hù)、鳥(niǎo)嘌呤的胺基被異丁酰基保護(hù)基團(tuán)保護(hù)時(shí)，對(duì)寡核苷酸與含有丙烯腈清除劑的堿水溶液接觸來(lái)說(shuō)足夠的時(shí)間和溫度是約6小時(shí)至約16小時(shí)和約45℃至約65℃，優(yōu)選55℃。不過(guò)，當(dāng)使用快速去保護(hù)基團(tuán)時(shí)(用于腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的胺基的苯氧基乙?；糜诎奏さ陌坊漠惗□；?，約2小時(shí)至約4小時(shí)和約室溫足矣。如果沒(méi)有所要除去的核堿保護(hù)基團(tuán)，那么約0.5小時(shí)至約2小時(shí)和20℃至35℃、優(yōu)選25℃一般足以除去β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)，在某些有利的實(shí)施方式中，還足以從固體載體上除去寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物。
如上所述，可以在有機(jī)溶劑中將被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物用丙烯腈清除劑溶液處理，以除去β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)，當(dāng)丙烯腈清除劑是脂族仲胺或空間位阻脂族伯胺、例如叔丁胺時(shí)，還可以除去從寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物除去核堿保護(hù)基團(tuán)，從固體載體裂解寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物。當(dāng)使用含有丙烯腈清除劑的有機(jī)溶液除去核堿保護(hù)基團(tuán)和從固體載體裂解寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物時(shí)，使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與加熱至約35℃至約100℃的有機(jī)溶液接觸約6小時(shí)至約48小時(shí)。優(yōu)選地，使寡核苷酸與有機(jī)溶液接觸約6小時(shí)至約16小時(shí)，有機(jī)溶液優(yōu)選地被加熱至約45℃至約65℃。
在另一種實(shí)施方式中，可以首先使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有丙烯腈清除劑的有機(jī)溶劑在上述用含有丙烯腈清除劑的有機(jī)溶液裂解β-氰基乙基的條件下接觸。然后使寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿水溶液在上述用含有丙烯腈清除劑的堿水溶液裂解β-氰基乙基的條件下接觸。
核堿包括天然存在的核堿，例如腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，和經(jīng)過(guò)修飾的堿，例如7-去氮雜鳥(niǎo)嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜-6-氧代嘌呤、6-氧代嘌呤、3-去氮雜腺苷、2-氧代-5-甲基嘧啶、2-氧代-4-甲硫基-5-甲基嘧啶、2-硫代羰基-4-氧代-5-甲基嘧啶、4-氧代-5-甲基嘧啶、2-氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、8-氨基嘌呤、4-三唑并-5-甲基胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔胞嘧啶、5-丙炔尿嘧啶和4-三唑并-5-甲基尿嘧啶。
被保護(hù)的核堿是其中該堿的反應(yīng)性官能團(tuán)被核堿保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的核堿。通常，核堿具有能夠被胺保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的胺基。胺保護(hù)基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。關(guān)于胺保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例，參見(jiàn)Greene等，Protective Groups in Organic Synthesis(1991)，John Wiley & Sons，Inc.，p.309-405，其內(nèi)容全部結(jié)合在此作為參考。優(yōu)選地，胺被保護(hù)成酰胺。腺嘌呤和胞嘧啶的胺基通常被苯甲?；Ｗo(hù)基團(tuán)保護(hù)，鳥(niǎo)嘌呤的胺基通常被異丁?；Ｗo(hù)基團(tuán)保護(hù)。不過(guò)，也可以利用其他保護(hù)流程。例如，關(guān)于快速去保護(hù)，腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的胺基可以被苯氧基乙?；Ｗo(hù)，胞嘧啶的胺基可以被乙酰基或異丁?；Ｗo(hù)。用于除去核堿保護(hù)基團(tuán)生成原始官能團(tuán)的條件將取決于所使用的保護(hù)基團(tuán)。當(dāng)氨基通過(guò)生成酰胺基而被保護(hù)時(shí)，它通常是這樣除去的，將寡核苷酸用濃氫氧化銨溶液在約20℃至約65℃下處理約2小時(shí)至約48小時(shí)。
合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物是化學(xué)合成的那些，不是從生物材料提取的。本發(fā)明的方法特別可用于富含胸腺嘧啶和/或鳥(niǎo)嘌呤核堿的合成的寡核苷酸和寡核苷酸類(lèi)似物，例如其中至少約5％的核堿是胸腺嘧啶或鳥(niǎo)嘌呤的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物。優(yōu)選地，寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的至少約10％的核堿是鳥(niǎo)嘌呤或胸腺嘧啶。更優(yōu)選地，至少約25％的核堿是鳥(niǎo)嘌呤或胸腺嘧啶。進(jìn)而更優(yōu)選地，至少約50％的核堿是鳥(niǎo)嘌呤或胸腺嘧啶。最優(yōu)選地，所有核堿都是鳥(niǎo)嘌呤或胸腺嘧啶。
用于寡核苷酸合成的固體載體是不溶于用于寡核苷酸合成的試劑的有機(jī)或無(wú)機(jī)聚合物。通常，使用剛性聚苯乙烯或受控多孔(controlled-pore)玻璃硅膠作為寡核苷酸合成中的固體載體。另外，如果需要的話(huà)還可以采用微孔或軟凝膠載體，尤其是聚(丙烯酰胺)載體，例如更常用于肽固相合成的那些。優(yōu)選的聚(丙烯酰胺)載體是胺官能化載體，尤其是從通過(guò)丙烯酰基-肌氨酸甲酯、N，N-二甲基丙烯酰胺與雙-丙烯?；叶返墓簿圩饔盟苽涞妮d體衍生的那些，例如商業(yè)上可得到的(Polymer Laboratories)載體，在銷(xiāo)售時(shí)的目錄名為PL-DMA。載體的制備操作已經(jīng)描述在Atherton，E.和Sheppard，R.C.，SolidPhase Peptide SynthesisA Practical Approach，(1984)IRL Press atOxford University Press，其中的微孔載體結(jié)合在此作為參考。這類(lèi)載體上的官能團(tuán)是甲基酯，最初通過(guò)與烷基二胺、例如乙二胺的反應(yīng)轉(zhuǎn)化為伯胺官能度。
用在本發(fā)明方法中或者由本發(fā)明方法產(chǎn)生的寡核苷酸包括磷酸二酯(例如脫氧核糖核酸和核糖核酸)或寡核苷酸類(lèi)似物。寡核苷酸類(lèi)似物被理解為在本文中表示含有化學(xué)修飾的核苷酸的DNA或RNA寡核苷酸分子。例如，寡核苷酸類(lèi)似物可以具有經(jīng)過(guò)修飾的核堿，例如7-去氮雜鳥(niǎo)嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜-6-氧代嘌呤、6-氧代嘌呤、3-去氮雜腺苷、2-氧代-5-甲基嘧啶、2-氧代-4-甲硫基-5-甲基嘧啶、2-硫代羰基-4-氧代-5-甲基嘧啶、4-氧代-5-甲基嘧啶、2-氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、8-氨基嘌呤、4-三唑并-5-甲基胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔胞嘧啶、5-丙炔尿嘧啶和4-三唑并-5-甲基尿嘧啶。寡核苷酸類(lèi)似物還可以在糖部分被修飾。例如，糖部分的羥基可以通過(guò)加入2’-O-甲基而被修飾，或者糖可以是L-核糖或L-脫氧核糖，代替天然存在的D-核糖或D-脫氧核糖。寡核苷酸類(lèi)似物還包括在磷酸酯骨架被修飾的寡核苷酸。例如，硫代磷酸酯、磷酸甲酯或膦酸甲酯是寡核苷酸類(lèi)似物。寡核苷酸類(lèi)似物可以具有一定比例的非核酸分子，例如PNA(Egholm等，J.Am.Chem.Soc.(1992)，1141895)或嗎啉代反義低聚物(Summerton和Weller，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.(1997)，7187)，其條件是至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)用在寡核苷酸類(lèi)似物的合成中。另外，寡核苷酸類(lèi)似物可以是已在3’-或5’-末端被如下修飾的寡核苷酸熒光染劑，例如熒光素或若丹明；連接劑，例如烷基胺或被保護(hù)的巰基烷基連接劑；嵌入劑，例如吖啶；增加細(xì)胞攝取的基團(tuán)，例如膽固醇；半抗原，例如二硝基酚；或標(biāo)記或報(bào)道基團(tuán)，例如生物素或地高辛配基。
脂族巰基、脂族羥基或脂族胺基是與取代或未取代的脂族基團(tuán)共價(jià)鍵合的巰基、羥基或胺基。脂族伯胺是與一個(gè)脂族基團(tuán)連接的胺(例如叔丁胺)。脂族仲胺是與兩個(gè)脂族基團(tuán)連接的胺(例如二異丙胺、嗎啉或哌嗪)?？臻g位阻脂族伯胺或空間位阻脂族硫醇是與脂族仲或叔碳原子鍵合的胺或硫醇，或與伯碳鍵合的胺或硫醇，其條件是該伯碳與至少一個(gè)仲或叔碳原子或芳族或雜芳族基團(tuán)連接。叔丁胺是與脂族叔碳原子連接的胺的實(shí)例。仲丁胺是與脂族仲碳原子連接的胺的實(shí)例。芐硫醇是與伯碳連接的硫醇的實(shí)例，該伯碳還與芳族基團(tuán)連接。
本文所用的脂族基團(tuán)包括直鏈或支鏈C1-C18烴，它們是完全飽和的或者含有一個(gè)或多個(gè)未共軛雙鍵，或環(huán)狀C3-C18烴，它們是完全飽和的或者含有一個(gè)或多個(gè)未共軛雙鍵，其條件是至少一個(gè)與巰基、羥基或胺基鍵合的碳不是雙鍵的一部分。低級(jí)烷基是完全飽和的直鏈或支鏈C1-C8烴或C3-C8環(huán)烴。若丙烯腈清除劑是空間位阻的脂族硫醇、脂族羥基化合物、脂族仲胺或空間位阻的脂族伯胺，則脂族基團(tuán)優(yōu)選為低級(jí)烷基。
脂族基團(tuán)可以是取代的或未取代的。適合于脂族基團(tuán)的取代基包括取代或未取代的芳族基團(tuán)、取代或未取代的雜芳族基團(tuán)、取代或未取代的雜環(huán)烷基、鹵代芳族基團(tuán)、鹵代低級(jí)烷基(例如三氟甲基和三氯甲基)、-O-(脂族基團(tuán)或取代的脂族基團(tuán))、-O-(芳族基團(tuán)或取代的芳族基團(tuán))、鹵代、氰基、硝基、-S-(脂族基團(tuán)或取代的脂族基團(tuán))和-S-(芳族基團(tuán)或取代的芳族基團(tuán))。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“鹵代烷烴”包括直鏈或支鏈C1-C8烴，它們是完全飽和的，并且含有1至18個(gè)鹵代基團(tuán)。另外，術(shù)語(yǔ)“鹵代烷烴”包括環(huán)狀C3-C8烴，它們是完全飽和的，并且含有1或16個(gè)鹵代基團(tuán)。鹵代基團(tuán)包括氟代、氯代、溴代和碘代基團(tuán)。
芳族基團(tuán)包括碳環(huán)系統(tǒng)(例如苯基)和稠合多環(huán)的碳環(huán)系統(tǒng)(例如萘基、蒽基和1，2，3，4-四氫萘基)。
酯包括由下式代表的基團(tuán) 其中R和R1各自獨(dú)立地是脂族基團(tuán)、芳族基團(tuán)或芳烷基。
醇包括由下式代表的基團(tuán)R2-OH其中R2是脂族基團(tuán)。
本文所用的芳烷基包括通過(guò)優(yōu)選具有一至約六個(gè)碳原子的脂族基團(tuán)與其他部分連接的芳族取代基。
本文所用的雜芳族基團(tuán)包括雜芳基環(huán)系(例如噻吩基、吡啶基、吡唑、異噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、吲唑基、呋喃、吡咯、咪唑、吡唑、三唑、嘧啶、吡嗪、噻唑、異噁唑、異噻唑、四唑或噁二唑)和其中碳環(huán)芳族環(huán)、碳環(huán)非芳族環(huán)或雜芳基環(huán)與一個(gè)或多個(gè)其他雜芳基環(huán)稠合的雜芳基環(huán)系(例如苯并(b)噻吩基、苯并咪唑、吲哚、四氫吲哚、吖吲哚、吲唑、喹啉、咪唑并吡啶、嘌呤、吡咯并[2，3-d]嘧啶和吡唑并[3，4-d]嘧啶)。
本文所用的雜環(huán)烷基是具有5至7個(gè)原子并且包括至少一個(gè)雜原子、例如氮、氧或硫的非芳族環(huán)系。雜環(huán)烷基的實(shí)例包括嗎啉、哌啶和哌嗪。
適合于芳族基團(tuán)、雜芳族基團(tuán)或雜環(huán)烷基的取代基包括鹵代、硝基、氰基、鹵代低級(jí)烷基、低級(jí)烷基醚和低級(jí)烷基硫醚。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方式是制備寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的方法。制備方法涉及下列步驟合成寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物，然后使寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿水溶液在足夠高的溫度下接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)。
寡核苷酸可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意用于合成寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的方法加以合成，包括固相和溶液相的方法，只要所合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物具有至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)。通常，寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物是利用亞磷酰胺化學(xué)合成的(參見(jiàn)Caruthers，M.H.，Science(1985)，230281，其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此作為參考)。其他合成寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的方法包括磷酸二酯與磷酸三酯法(參見(jiàn)Caruthers，M.H.，Acc.Chem.Res.(1980)，13155；Itakura等，Ann.Rev.Biochem.(1984)，53323；Khorana等，J.Molecular Biology(1972)，72209；Khorana等，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.(1966)，3139，其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此作為參考)或H-膦酸酯法(參見(jiàn)Andrus等，Tetrahedron Lett.(1988)，29861；Froehler，B.C.，Tetrahedron Lett.(1986a)，275565；Froehler，B.C.，Tetrahedron Lett.(1986b)，275575；Gregg等，Tetrahedron Lett.(1987)，274051，其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此作為參考)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，一部分寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物可以通過(guò)亞磷酰胺化學(xué)合成，另一部分寡核苷酸可以通過(guò)另一種方法合成，例如磷酸二酯法、磷酸三酯法或H-膦酸酯法。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物是完全利用亞磷酰胺化學(xué)合成的。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1對(duì)比去保護(hù)結(jié)果按照亞磷酰胺化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方案，在DNA合成儀8909 Expedite(Applied Biosystems)上，在剛性聚苯乙烯固體載體上，分兩批合成各自具有31個(gè)胸腺嘧啶核苷堿基的磷酸二酯寡核苷酸和硫代磷酸酯寡核苷酸。在合成周期結(jié)束時(shí)加上5’-二甲氧基三苯甲基保護(hù)基團(tuán)。在鏈延長(zhǎng)結(jié)束時(shí)，將具有完全被保護(hù)的磷酸二酯或硫代磷酸酯寡核苷酸的固體載體分成三份。將每份單獨(dú)在50℃下用下列物質(zhì)處理16小時(shí)(i)濃氫氧化銨，(ii)含10％(vol/vol)叔丁胺的濃氫氧化銨，或(iii)含5％(vol/vol)DTT的濃氫氧化銨。通過(guò)離子交換HPLC和MALDITOF質(zhì)譜分析這些樣本(參見(jiàn)圖1A-1C和2A-2C關(guān)于利用磷酸二酯寡核苷酸所得結(jié)果)。在磷酸二酯和硫代磷酸酯樣本中，HPLC色譜圖都顯示用氫氧化銨處理的樣本顯示在產(chǎn)物峰后附近存在另外的峰。在用氫氧化銨和丙烯腈清除劑處理的其他兩份樣本中，另外的峰是可以忽略的。
用濃氫氧化銨從固體載體上裂解的31聚的聚胸腺嘧啶核苷磷酸二酯的MALDITOF質(zhì)譜(見(jiàn)圖2A)在9368.32顯示一個(gè)峰，代表所需的產(chǎn)物。另外，在9390.56和9409.46的峰分別代表所需產(chǎn)物的鈉鹽和鉀鹽。有大量氰基乙基化的磷酸二酯，質(zhì)量為9423.08。相形之下，在用氫氧化銨與10％(vol/vol)叔丁胺(圖2B)或氫氧化銨與5％(vol/vol)DTT(圖2C)從固體載體上裂解的31聚的聚胸腺嘧啶核苷磷酸二酯中，代表氰基乙基化磷酸二酯的9423.08峰不存在。
實(shí)施例2兩步去保護(hù)法按照亞磷酰胺化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方案，在DNA合成儀8909 Expedite(Applied Biosystems)上，在剛性聚苯乙烯固體載體上，分兩批合成各自具有31個(gè)胸腺嘧啶核苷堿基的磷酸二酯寡核苷酸和硫代磷酸酯寡核苷酸。在合成周期結(jié)束時(shí)加上5’-二甲氧基三苯甲基保護(hù)基團(tuán)。在鏈延長(zhǎng)結(jié)束時(shí)，將具有完全被保護(hù)的磷酸二酯或硫代磷酸酯寡核苷酸的固體載體用含有15％叔丁胺的乙腈溶液處理45分鐘。然后將與磷酸二酯或硫代磷酸酯寡核苷酸鍵合的載體單獨(dú)在50℃下用含10％(vol/vol)叔丁胺的濃氫氧化銨處理16小時(shí)。通過(guò)離子交換HPLC和MALDITOF質(zhì)譜分析這些樣本，得到與圖1B和2B所示關(guān)于磷酸二酯寡核苷酸相似的結(jié)果。
等價(jià)方式盡管已經(jīng)參照優(yōu)選的實(shí)施方式確切地顯示和描述了本發(fā)明，不過(guò)將為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的是，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)上的改變，而不背離由權(quán)利要求書(shū)所涵蓋的發(fā)明范圍。
權(quán)利要求
1.基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物在至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)從寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物上裂解期間的修飾的方法，包含使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與包含至少一種丙烯腈清除劑和選自鹵代烷烴、酯、醇或二甲基甲酰胺的有機(jī)溶劑的溶液在足以除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的條件下接觸的步驟，其條件是當(dāng)該丙烯腈清除劑包含脂族伯胺或脂族伯硫醇時(shí)，該脂族伯胺或脂族伯硫醇是空間位阻的。
2.基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物在至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)從寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物上裂解期間的修飾的方法，包含使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿水溶液在足以除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的條件下接觸的步驟，其條件是當(dāng)該丙烯腈清除劑包含脂族伯胺或脂族伯硫醇時(shí)，該脂族伯胺或脂族伯硫醇是空間位阻的。
3.權(quán)利要求2的方法，進(jìn)一步包含在使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與堿水溶液接觸之前使該寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與包含有機(jī)溶劑和至少一種丙烯腈清除劑的溶液接觸的步驟。
4.權(quán)利要求3的方法，其中該有機(jī)溶劑選自由吡啶、四氫呋喃、乙腈、鹵代烷烴、酯、醇和二甲基甲酰胺組成的組。
5.權(quán)利要求4的方法，其中該丙烯腈清除劑是叔丁胺，該有機(jī)溶劑是吡啶或乙腈。
6.權(quán)利要求2的方法，其中該β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)是從磷酸三酯寡核苷酸上除去的。
7.權(quán)利要求2的方法，其中該β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)是從硫代磷酸酯寡核苷酸類(lèi)似物上除去的。
8.權(quán)利要求2的方法，其中該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物是通過(guò)共價(jià)鍵與固體載體連接的。
9.權(quán)利要求8的方法，其中該固體載體是受控多孔玻璃、聚苯乙烯或聚丙烯酰胺。
10.權(quán)利要求9的方法，其中該寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物是通過(guò)與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿溶液接觸而從固體載體上裂解的。
11.權(quán)利要求2的方法，其中該丙烯腈清除劑是取代或未取代的空間位阻脂族硫醇、取代或未取代的芳族硫醇、取代或未取代的芳族羥基化合物、取代或未取代的脂族仲胺、取代或未取代的空間位阻脂族伯胺、或取代或未取代的芳族伯或仲胺。
12.權(quán)利要求11的方法，其中該丙烯腈清除劑是叔丁胺。
13.權(quán)利要求2的方法，其中該堿溶液包含堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物。
14.權(quán)利要求2的方法，其中該堿溶液是氫氧化銨溶液。
15.權(quán)利要求14的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約20℃至約100℃。
16.權(quán)利要求15的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約20℃至約35℃。
17.權(quán)利要求16的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約25℃。
18.權(quán)利要求14的方法，其中使該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與氫氧化銨溶液接觸約0.5小時(shí)至約48小時(shí)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中使該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與氫氧化銨溶液接觸約0.5小時(shí)至約2小時(shí)。
20.權(quán)利要求2的方法，其中胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核堿在寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物中的總百分率是至少約5％。
21.權(quán)利要求20的方法，其中胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核堿在寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物中的總百分率是至少約25％。
22.權(quán)利要求21的方法，其中胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核堿在寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物中的總百分率是至少約50％。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所有核堿都是胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤。
24.基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物在至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)和至少一個(gè)核堿保護(hù)基團(tuán)從寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物上裂解期間的修飾的方法，包含使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與包含至少一種丙烯腈清除劑和選自鹵代烷烴、酯、醇或二甲基甲酰胺的有機(jī)溶劑的溶液在足以除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)和至少一個(gè)核堿保護(hù)基團(tuán)的條件下接觸的步驟，其條件是當(dāng)該丙烯腈清除劑包含脂族伯胺或脂族伯硫醇時(shí)，該脂族伯胺或脂族伯硫醇是空間位阻的。
25.基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物在至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)和至少一個(gè)核堿保護(hù)基團(tuán)從寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物上裂解期間的修飾的方法，包含使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿水溶液在足以除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)和至少一個(gè)核堿保護(hù)基團(tuán)的條件下接觸的步驟，其條件是當(dāng)該丙烯腈清除劑包含脂族伯胺或脂族伯硫醇時(shí)，該脂族伯胺或脂族伯硫醇是空間位阻的。
26.權(quán)利要求25的方法，進(jìn)一步包含在使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與堿水溶液接觸之前使該寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與包含有機(jī)溶劑和至少一種丙烯腈清除劑的溶液接觸的步驟。
27.權(quán)利要求26的方法，其中該有機(jī)溶劑選自由吡啶、四氫呋喃、乙腈、鹵代烷烴、酯、醇和二甲基甲酰胺組成的組。
28.權(quán)利要求27的方法，其中該丙烯腈清除劑是叔丁胺，該有機(jī)溶劑是吡啶或乙腈。
29.權(quán)利要求25的方法，其中該β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)和核堿保護(hù)基團(tuán)是從磷酸二酯寡核苷酸上除去的。
30.權(quán)利要求25的方法，其中該β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)和核堿保護(hù)基團(tuán)是從硫代磷酸酯寡核苷酸類(lèi)似物上除去的。
31.權(quán)利要求25的方法，其中該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物是通過(guò)共價(jià)鍵與固體載體連接的。
32.權(quán)利要求31的方法，其中該固體載體是受控多孔玻璃、聚苯乙烯或聚(丙烯酰胺)。
33.權(quán)利要求32的方法，其中該寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物是通過(guò)與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿溶液接觸而從固體載體上裂解的。
34.權(quán)利要求25的方法，其中該丙烯腈清除劑是取代或未取代的空間位阻脂族硫醇、取代或未取代的芳族硫醇、取代或未取代的芳族羥基化合物、取代或未取代的脂族仲胺、取代或未取代的空間位阻脂族伯胺、或取代或未取代的芳族伯或仲胺。
35.權(quán)利要求34的方法，其中該丙烯腈清除劑是叔丁胺。
36.權(quán)利要求25的方法，其中該堿溶液包含堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物。
37.權(quán)利要求25的方法，其中該堿溶液是氫氧化銨溶液。
38.權(quán)利要求37的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約20℃至約100℃。
39.權(quán)利要求38的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約45℃至約65℃。
40.權(quán)利要求39的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約55℃。
41.權(quán)利要求37的方法，其中使該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與氫氧化銨溶液接觸約0.5小時(shí)至約48小時(shí)。
42.權(quán)利要求41的方法，其中使該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與氫氧化銨溶液接觸約6小時(shí)至約16小時(shí)。
43.權(quán)利要求25的方法，其中胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核堿在寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物中的總百分率是至少約5％。
44.權(quán)利要求43的方法，其中胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核堿在寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物中的總百分率是至少約25％。
45.權(quán)利要求44的方法，其中胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核堿在寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物中的總百分率是至少約50％。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所有核堿都是胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤。
47.基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物在至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)和至少一個(gè)核堿保護(hù)基團(tuán)從寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物上裂解期間的修飾的方法，包含使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與包含叔丁胺和選自鹵代烷烴、酯、醇或二甲基甲酰胺的有機(jī)溶劑的溶液在足以除去至少一個(gè)核堿保護(hù)基團(tuán)和至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的條件下接觸的步驟。
48.基本上防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物在至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)和至少一個(gè)核堿保護(hù)基團(tuán)從寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物上裂解期間的修飾的方法，包含使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有叔丁胺的氫氧化銨溶液在足以除去至少一個(gè)核堿保護(hù)基團(tuán)和至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的條件下接觸的步驟。
49.權(quán)利要求48的方法，進(jìn)一步包含在使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與堿水溶液接觸之前使該寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與包含有機(jī)溶劑和至少一種丙烯腈清除劑的溶液接觸的步驟。
50.權(quán)利要求49的方法，其中該有機(jī)溶劑選自由吡啶、四氫呋喃、乙腈、鹵代烷烴、酯、醇和二甲基甲酰胺組成的組。
51.權(quán)利要求50的方法，其中該有機(jī)溶劑是吡啶或乙腈。
52.權(quán)利要求48的方法，其中該β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)和核堿保護(hù)基團(tuán)是從磷酸三酯寡核苷酸上除去的。
53.權(quán)利要求48的方法，其中該β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)和核堿保護(hù)基團(tuán)是從硫代磷酸酯寡核苷酸類(lèi)似物上除去的。
54.權(quán)利要求48的方法，其中該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物是通過(guò)共價(jià)鍵與固體載體連接的。
55.權(quán)利要求54的方法，其中該固體載體是受控多孔玻璃、聚苯乙烯或聚(丙烯酰胺)。
56.權(quán)利要求55的方法，其中該寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物是通過(guò)與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿溶液接觸而從固體載體上裂解的。
57.權(quán)利要求48的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約20℃至約100℃。
58.權(quán)利要求57的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約45℃至約65℃。
59.權(quán)利要求58的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約55℃。
60.權(quán)利要求48的方法，其中使該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與氫氧化銨溶液接觸約0.5小時(shí)至約48小時(shí)。
61.權(quán)利要求60的方法，其中使該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與氫氧化銨溶液接觸約6小時(shí)至約16小時(shí)。
62.權(quán)利要求48的方法，其中胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核堿在寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物中的總百分率是至少約5％。
63.權(quán)利要求62的方法，其中胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核堿在寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物中的總百分率是至少約25％。
64.權(quán)利要求63的方法，其中胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核堿在寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物中的總百分率是至少約50％。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所有核堿都是胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤。
66.制備寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的方法，其中基本上防止了寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物在β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)除去期間的修飾，包含下列步驟a)合成具有至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物；和b)使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與包含至少一種丙烯腈清除劑和選自鹵代烷烴、酯、醇或二甲基甲酰胺的有機(jī)溶劑的溶液在足以除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的條件下接觸，其條件是當(dāng)該丙烯腈清除劑包含脂族伯胺或脂族伯硫醇時(shí)，該脂族伯胺或脂族伯硫醇是空間位阻的，由此除去β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)，而基本上沒(méi)有修飾寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物。
67.制備寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的方法，其中基本上防止了寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物在β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)除去期間的修飾，包含下列步驟a)合成具有至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物；和b)使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿水溶液在足以除去至少一個(gè)β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)的條件下接觸，其條件是當(dāng)該丙烯腈清除劑包含脂族伯胺或脂族伯硫醇時(shí)，該脂族伯胺或脂族伯硫醇是空間位阻的，由此除去β-氰基乙基保護(hù)基團(tuán)，而基本上沒(méi)有修飾寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物。
68.權(quán)利要求67的方法，進(jìn)一步包含在使被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與堿水溶液接觸之前使該寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與包含有機(jī)溶劑和至少一種丙烯腈清除劑的溶液接觸的步驟。
69.權(quán)利要求68的方法，其中該有機(jī)溶劑選自由吡啶、四氫呋喃、乙腈、鹵代烷烴、酯、醇和二甲基甲酰胺組成的組。
70.權(quán)利要求69的方法，其中該丙烯腈清除劑是叔丁胺，該有機(jī)溶劑是吡啶或乙腈。
71.權(quán)利要求67的方法，其中該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物是利用亞磷酰胺化學(xué)合成的。
72.權(quán)利要求71的方法，其中當(dāng)該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿水溶液接觸時(shí)，裂解至少一個(gè)核堿保護(hù)基團(tuán)。
73.權(quán)利要求67的方法，其中所制備的寡核苷酸是磷酸二酯寡核苷酸。
74.權(quán)利要求67的方法，其中所制備的寡核苷酸類(lèi)似物是硫代磷酸酯寡核苷酸類(lèi)似物。
75.權(quán)利要求67的方法，其中該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物是通過(guò)共價(jià)鍵與固體載體連接的。
76.權(quán)利要求75的方法，其中該固體載體是受控多孔玻璃、聚苯乙烯或聚(丙烯酰胺)。
77.權(quán)利要求76的方法，其中該寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物是通過(guò)與含有至少一種丙烯腈清除劑的堿溶液接觸而從固體載體上裂解的。
78.權(quán)利要求67的方法，其中該丙烯腈清除劑是取代或未取代的空間位阻脂族硫醇、取代或未取代的芳族硫醇、取代或未取代的芳族羥基化合物、取代或未取代的脂族仲胺、取代或未取代的空間位阻脂族伯胺、或取代或未取代的芳族伯或仲胺。
79.權(quán)利要求78的方法，其中該丙烯腈清除劑是叔丁胺。
80.權(quán)利要求67的方法，其中該堿溶液包含堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物。
81.權(quán)利要求67的方法，其中該堿溶液是氫氧化銨溶液。
82.權(quán)利要求81的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約20℃至約100℃。
83.權(quán)利要求82的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約20℃至約35℃。
84.權(quán)利要求83的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約25℃。
85.權(quán)利要求81的方法，其中使該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與氫氧化銨溶液接觸約0.5小時(shí)至約48小時(shí)。
86.權(quán)利要求85的方法，其中使該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與氫氧化銨溶液接觸約0.5小時(shí)至約2小時(shí)。
87.權(quán)利要求72的方法，其中該堿溶液是氫氧化銨溶液。
88.權(quán)利要求87的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約20℃至約100℃。
89.權(quán)利要求88的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約45℃至約65℃。
90.權(quán)利要求89的方法，其中該氫氧化銨溶液的溫度是約55℃。
91.權(quán)利要求87的方法，其中使該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與氫氧化銨溶液接觸約0.5小時(shí)至約48小時(shí)。
92.權(quán)利要求91的方法，其中使該合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與氫氧化銨溶液接觸約6小時(shí)至約16小時(shí)。
93.權(quán)利要求72的方法，其中胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核堿在寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物中的總百分率是至少約5％。
94.權(quán)利要求93的方法，其中胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核堿在寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物中的總百分率是至少約25％。
95.權(quán)利要求94的方法，其中胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤核堿在寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物中的總百分率是至少約50％。
96.權(quán)利要求95的方法，其中所有核堿都是胸腺嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤。
97.制備寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的方法，包含利用權(quán)利要求1-65任意一項(xiàng)的方法從被β-氰基乙基保護(hù)的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物除去至少一個(gè)β-氰基乙基。
全文摘要
本發(fā)明涉及防止合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物在至少一個(gè)β－氰基乙基保護(hù)基團(tuán)從寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物上除去期間的修飾的方法。該方法涉及使寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物與含有至少一種丙烯腈清除劑、例如叔丁胺的堿溶液接觸，接觸的溫度和時(shí)間足以除去至少一個(gè)β－氰基乙基保護(hù)基團(tuán)。本發(fā)明還涉及制備合成的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物的方法。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1444595SQ01813659
公開(kāi)日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2001年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月12日
發(fā)明者N·D·辛哈 申請(qǐng)人:艾夫西亞生物科技公司