專利名稱：擴(kuò)展的天然化學(xué)連接的制作方法
對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求得益于2000年9月8日登記的美國臨時(shí)申請(qǐng)60/231,339。致謝本發(fā)明部分地受國家衛(wèi)生研究所博士后研究基金GN190402的支持。美國政府可以享有某些權(quán)利。
背景化學(xué)連接涉及在第一種化學(xué)組分和第二種化學(xué)組分之間形成一種選擇性的共價(jià)鍵?？梢允褂么嬖谟诘谝环N組分和第二種組分上的獨(dú)特的相互反應(yīng)的官能團(tuán)來使連接反應(yīng)具有化學(xué)選擇性。例如，肽和多肽的化學(xué)連接涉及帶有相容的獨(dú)特的相互反應(yīng)的C-末端和N-末端的氨基酸殘基的肽或多肽片斷的化學(xué)選擇性反應(yīng)。已經(jīng)有好幾種化學(xué)方法被用于這種目的，其實(shí)例包括天然的化學(xué)連接(Dawson等人，Science(1994)266776-779；Kent等人，WO96/34878；Kent等人，WO98/28434)、形成肟的化學(xué)連接(Rose，等人，J.Amer.Chem.Soc.(1994)，11630-34)、形成硫代酸酯的連接(Schnolzer，等人，Science(1992)256221-225)、形成硫醚的連接(Englebretsen，等人，Tet.Letts.(1995)36(48)8871-8874)、形成腙的連接(Gaertner等人，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338)和形成噻唑烷的連接以及形成噁唑烷的連接(Zhang等人，Proc.Nat1.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189；Tam等人，WO95/00846；US5,589,356)。
在這些方法中，只有天然的化學(xué)連接方法能夠得到在連接位點(diǎn)處具有天然的酰胺鍵(即肽鍵)的連接產(chǎn)物。已經(jīng)證明，最初的天然的化學(xué)連接方法(Dawson等人，supra；和WO96/34878)是一種在連接位點(diǎn)處產(chǎn)生天然的酰胺鍵的強(qiáng)有力的方法。天然的化學(xué)連接涉及具有C-末端α-羧基硫代酸酯部分的第一種肽或多肽片斷與具有N-末端半胱氨酸殘基的第二種肽或多肽之間的化學(xué)選擇性反應(yīng)。硫醇交換反應(yīng)產(chǎn)生了最初的硫代酸酯連接的中間體，該中間體自發(fā)地發(fā)生重排，在連接位點(diǎn)處產(chǎn)生天然的酰胺鍵，同時(shí)把半胱氨酸側(cè)鏈的硫醇再生出來。最初的天然的化學(xué)連接法的缺陷是它需要一個(gè)N-末端半胱氨酸，即它只允許在連接位點(diǎn)處含有半胱氨酸的肽和多肽片斷的連接。
盡管有這種缺陷，但是仍然有含有除半胱氨酸之外的具有N-末端氨基酸的肽的天然化學(xué)連接的報(bào)道(WO98/28434)。在該方法中，使用含有一個(gè)C-末端α-羧基硫代酸酯的第一種肽或多肽片斷與含有一個(gè)N-末端式HS-CH2-CH2-O-NH-[肽]所代表的N-{硫醇取代的輔助基團(tuán)}的第二種肽或多肽片斷進(jìn)行連接。連接后，通過斷裂HS-CH2-CH2-O-輔助基團(tuán)而除去N-{硫醇取代的輔助基團(tuán)}，在連接位點(diǎn)處產(chǎn)生天然的酰胺鍵。該方法的一個(gè)局限是使用巰基乙氧基輔助基團(tuán)能夠成功地只在甘氨酸殘基處形成酰胺鍵。這產(chǎn)生了一種連接產(chǎn)物，該連接產(chǎn)物在斷裂反應(yīng)后，在第二種肽或多肽片斷的N-取代的氨基酸的位置處產(chǎn)生一個(gè)甘氨酸殘基。由于這個(gè)原因，只有當(dāng)希望使反應(yīng)的連接產(chǎn)物在該位置處含有一個(gè)甘氨酸殘基時(shí)，實(shí)施該方法才是合適的，并且在任何情況下，就連接產(chǎn)率、母體的穩(wěn)定性和除去O-連接的輔助基團(tuán)的能力方面都是成問題的。然而可以使用其它輔助基團(tuán)，例如HSCH2CH2NH-[肽]，而不會(huì)把反應(yīng)限制在在甘氨酸殘基處的連接上，這樣的輔助基團(tuán)不能從連接產(chǎn)物上除去。
因此，需要一種能夠把天然的化學(xué)連接擴(kuò)展到很多種不同的氨基酸殘基、肽、多肽、聚合物和其它分子的廣泛適用的和強(qiáng)有力的化學(xué)連接體系，該化學(xué)連接體系利用一種有效的容易除去的含有硫醇的輔助基團(tuán)，而在連接位點(diǎn)處通過天然的酰胺鍵把這種分子連接起來。
連接產(chǎn)物是通過把包含式J1-C(O)SR的羧基硫代酸酯的第一種組分與包含一種下式的酸穩(wěn)定的N-取代的C2或C3鏈氨基烷基或烷基硫醇的第二種組分HS-C2-C1(R1)-HN-J2 III或HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-HN-J2 IV其中J2、R1、R2和R3如前面所定義，連接，然后選擇性地從N-取代的酰胺鍵合的連接產(chǎn)物中除去C2或C3鏈烷基或芳基硫醇的方法來生產(chǎn)的。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過在與肽相容的斷裂條件下在C1處形成一種共振穩(wěn)定的陽離子而方便了這種斷裂。
從N上除去烷基硫醇或芳基硫醇鏈，得到下式的最終的連接產(chǎn)物J1-C(O)-HN-J2 V其中J1、J2、R1、R2和R3如前面所定義。本發(fā)明還針對(duì)用于進(jìn)行這種擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接的組合物和包含它們的藥筒和試劑盒。該組合物包含一種完全受保護(hù)的、部分受保護(hù)的或完全未受保護(hù)的酸穩(wěn)定的N-取代的，優(yōu)選下式的Nα-取代的C2或C3鏈氨基烷基或芳基硫醇SX2-C2-C1(R1)-X1 N-CH(Z2)-C(O)-J2VI或SX2-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-X1N-CH(Z2)-C(O)-J2 VII其中X1是H或氨基保護(hù)基；X2是H或硫醇保護(hù)基；J2、R1、R2和R3如前面所定義；而Z2是與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的任何化合物部分(包括但是不限于一種氨基酸側(cè)鏈)。本發(fā)明還針對(duì)基本上不含外消旋體或非對(duì)映異構(gòu)體的這些化合物的手性形式。
本發(fā)明還針對(duì)生產(chǎn)這種完全受保護(hù)的、部分受保護(hù)的或完全未受保護(hù)的N-取代的C2或C3鏈氨基烷基或芳基硫醇的溶液相和固相的方法。生產(chǎn)這些化合物的方法包括鹵素介導(dǎo)的氨基烷基化、還原性氨基化和與固相肽合成法相容的Nα-保護(hù)的，N-烷基化的，S-保護(hù)的，氨基烷基-或芳基-硫醇氨基酸母體的制備。
羧基硫代酸酯組分的J1部分可以包括與羧基硫代酸酯和用于擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接的反應(yīng)條件相容的任何化合物部分，而本發(fā)明的N-取代的組分可以被單獨(dú)提供或者把它與很寬范圍的化合物部分(包括氨基酸、肽、多肽、核酸或其它化合物部分例如染料、半抗原、糖、脂質(zhì)、固體載體、生物相容性的聚合物或其它聚合物等)連接。本發(fā)明的擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接方法是強(qiáng)有力的，可以在一種水性體系中在接近中性的pH條件下在一定的溫度范圍條件下進(jìn)行。本發(fā)明的生產(chǎn)N-取代的組分的方法也是強(qiáng)有力的，還在于它能以令人驚奇的高而純的產(chǎn)率給這些新化合物提供很寬范圍的合成路線。本發(fā)明的Nα-保護(hù)的，N-烷基化的，S-保護(hù)的，氨基烷基-或芳基-硫醇氨基酸母體特別可用于使用常規(guī)的肽合成和其它有機(jī)合成策略進(jìn)行的快速自動(dòng)合成中。而且本發(fā)明的受保護(hù)的N-取代的組分能把化學(xué)連接的用途擴(kuò)展到多組分連接方案中，例如當(dāng)多肽的生產(chǎn)涉及多種連接策略，例如三種或三種以上的片斷連接方案或匯集連接合成方案時(shí)。例如，本發(fā)明的方法和組合物允許你使用第一對(duì)羧基硫代酸酯和N-取代的組分來合成所要分子的第一部分，使用其它對(duì)羧基硫代酸酯和N-取代的組分來合成分子的其它部分。然后可以把每個(gè)這樣合成的連接產(chǎn)物連接起來(在合適的脫保護(hù)和/或改性之后)，形成所要的分子。
相應(yīng)地，本發(fā)明的方法和組合物極大地?cái)U(kuò)大了天然化學(xué)連接的范圍，并且本發(fā)明的原料、中間體和最終產(chǎn)物找到了廣泛的用途。
硫醇交換發(fā)生在αCOSR硫代酸酯組分和氨基N-{烷基硫醇}組分之間。交換產(chǎn)生一種硫代酸酯鍵合的中間體連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物自發(fā)地發(fā)生重排，經(jīng)過一種5元環(huán)中間體，產(chǎn)生一種在連接位點(diǎn)處含有一個(gè)可除去的Nα取代的C2鏈烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]的式J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-C(O)-J2的第一種連接產(chǎn)物。
在連接位點(diǎn)處的Nα取代的C2鏈烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]易于在與肽相容的條件下除去，產(chǎn)生一種在連接位點(diǎn)處含有天然的酰胺鍵的式J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)CO-J2的最終的連接產(chǎn)物。
圖2通過顯示本發(fā)明的介導(dǎo)擴(kuò)展的天然的肽化學(xué)連接的能力來詳細(xì)說明說明本發(fā)明；可以使用同樣的方案來進(jìn)行任何合適的分子的連接。如圖所示，含有一種式J1-HN-CH(Z1)-αCO-SR的α-羧基硫代酸酯的第一種組分和含有一種式HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-NHαCH(Z2)-C(O)-J2的酸穩(wěn)定的Nα取代的C3鏈烷基或芳基硫醇的第二種組分。組分J1和J2可以是與化學(xué)選擇性的連接反應(yīng)相容的任何化合物部分，例如一種受保護(hù)的或未受保護(hù)的氨基酸、肽、多肽、其它聚合物、染料、連接體等。Z1是與αCO-SR硫代酸酯相容的任何側(cè)鏈基團(tuán)，例如受保護(hù)的或未受保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈。Z2是與Nα-取代的氨基酸相容的任何側(cè)鏈基團(tuán)，例如受保護(hù)的或未受保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈。當(dāng)R1不是H時(shí)，R2和R3是H，而R1是未取代的或在C1的鄰位或?qū)ξ槐灰环N給電子基團(tuán)取代的苯基部分；吡啶甲基(未取代的或在C1的鄰位或?qū)ξ槐涣u基或硫醇取代)；甲基硫醇；或亞硫酰甲基。當(dāng)R2和R3不是H時(shí)，R1是H，而R2和R3形成一個(gè)在C1的鄰位或?qū)ξ槐灰粋€(gè)給電子基團(tuán)取代的芐基；或吡啶甲基(未取代的或在C1的鄰位或?qū)ξ槐涣u基或硫醇取代)。
硫醇交換發(fā)生在COSR硫代酸酯組分和氨基氨基硫醇組分之間。交換產(chǎn)生一種硫代酸酯鍵合的中間體連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物自發(fā)地發(fā)生重排，經(jīng)過一種6元環(huán)中間體，產(chǎn)生一種在連接位點(diǎn)處含有一個(gè)可除去的Nα取代的C3鏈烷基或芳基硫醇[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]的式J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2的第一種連接產(chǎn)物。
在連接位點(diǎn)處的Nα-取代的C3鏈芳基硫醇[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]易于在與肽相容的條件下除去，產(chǎn)生一種在連接位點(diǎn)處具有天然酰胺鍵的式J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最終連接產(chǎn)物。
圖3詳細(xì)說明一種多組分的擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接方案。按照

圖1中所具體描述的那樣，使一種多肽α-羧基硫代酸酯與一種式HS-C2-C1(R1)-Nα(PG1)-CH(Z2)-C(O)-J2的Nα-保擴(kuò)的N-末端多肽Nα-取代的C2鏈烷基或芳基硫醇與一種含有一個(gè)N-末端半胱氨酸殘基的肽反應(yīng)。R1是未取代的或者被一個(gè)給電子基團(tuán)(優(yōu)選在C1的鄰位或?qū)ξ?取代的苯基；或吡啶甲基(未取代的或在C1的鄰位或?qū)ξ槐涣u基或硫醇取代)。保護(hù)基(PG1)可以是任何合適的保護(hù)基，例如一種烷基羰基保護(hù)基(例如芐氧基羰基(Z)、Boc、Bpoc、Fmoc等)、一種三苯基甲基保護(hù)基(Trt)、一種2-硝基苯基亞磺酰基保護(hù)基(Nps)等。在第一步連接反應(yīng)后除去保護(hù)基。
如圖1中所示，第一步天然的化學(xué)連接反應(yīng)在含有式HS-C2-C1(R1)-Nα(PG1)-CH(Z2)-C(O)-J2的Nα-保護(hù)的N-末端多肽Nα-取代的C2鏈烷基或芳基硫醇的多肽α-羧基硫代酸酯與N-末端Cys肽之間進(jìn)行，產(chǎn)生一種式HS-C2-C1(R1)-Nα(PG1)-CH(Z2)C(O)-肽2-肽3的第一步連接產(chǎn)物。然后除去保護(hù)基PG1，得到一種式HS-C2-C1(R1)-Nα(H)-CH(Z2)-C(O)-肽2-肽3的連接產(chǎn)物。然后使該物質(zhì)與含硫代酸酯的第三種組分反應(yīng)。在COSR硫代酸酯組分與氨基N-{烷基硫醇}組分之間發(fā)生硫醇交換。交換產(chǎn)生一種硫酯鍵合的中間體連接產(chǎn)物，后者自發(fā)地發(fā)生重排，經(jīng)過一個(gè)5元環(huán)中間體，產(chǎn)生一種在第二個(gè)連接位點(diǎn)處含有可除去的Nα取代的C2鏈烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]的式 肽1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-C(O)肽2-Cys-肽3的第二步連接產(chǎn)物。在第二個(gè)連接位點(diǎn)處的Nα取代的C2鏈烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]易于在與肽相容的條件下除去而產(chǎn)生一種在第一個(gè)和第二個(gè)連接位點(diǎn)處具有天然的酰胺鍵的式肽1-C(O)-NαH-CH(Z2)-C(O)肽2-Cys-肽3的最終連接產(chǎn)物。
圖4詳細(xì)說明了本發(fā)明的一種使用兩種不同的1-苯基-2-巰基乙基助劑的通用的連接策略。
圖5A和5B顯示實(shí)施例21中描述的使用一種Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙基助劑進(jìn)行的細(xì)胞色素b562的連接反應(yīng)的高效液相色譜(HPLC)分析結(jié)果。圖5A顯示時(shí)間為0時(shí)的連接反應(yīng)狀況。圖5B顯示反應(yīng)過夜后連接的狀況。圖5B中還顯示，觀察到兩種產(chǎn)生于Nα-1-(4-甲氧基苯酚)-2-巰基乙基助劑的C1處的非手性中心的連接產(chǎn)物。
圖6A和6B顯示通過使用擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接和一種Nα-{1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙醇}改性的N-末端片斷形成的連接產(chǎn)物細(xì)胞色素b562殘基1-106的重建的電霧化質(zhì)譜(MS)。把帶有C-末端硫代酸酯的細(xì)胞色素b562殘基1-63與帶有N-末端N α-{1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙醇}甘氨酸的細(xì)胞色素b562殘基的64-106連接起來。圖6A顯示在連接位點(diǎn)處含有一個(gè)可除去的Nα-{1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙醇}基團(tuán)的初始連接產(chǎn)物的質(zhì)譜重建。圖6B顯示在用氟化氫(HF)處理以除去Nα-{1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙醇}基團(tuán)而在連接位點(diǎn)處產(chǎn)生天然的酰胺鍵后，連接產(chǎn)物的質(zhì)譜重建。觀察到的質(zhì)量為11948±1Da(在HF處理之前)和11781±1Da(在HF處理之后)，即損失167±2Da，與除去1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙醇輔助基團(tuán)的期望損失166Da良好地吻合。
圖7A和7B詳細(xì)說明圖6B中所述的線性的細(xì)胞色素b562物質(zhì)的HPLC的典型分析結(jié)果(圖7A)和折疊后該物質(zhì)的離子交換色譜圖(圖7B)。
特定的實(shí)施方式的描述本發(fā)明針對(duì)涉及擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接方法和組合物。一般來說，該方法涉及把包含一種羧基硫代酸酯，更優(yōu)選一種α-羧基硫代酸酯的第一種組分與包含一種酸穩(wěn)定的N-取代的，優(yōu)選Nα-取代的C2或C3鏈氨基烷基或芳基硫醇的第二種組分連接起來。
第一種組分的羧基硫代酸酯與第二種組分的N-取代的C2或C3鏈烷基或芳基硫醇的硫醇之間的化學(xué)選擇性反應(yīng)通過一種硫酯鍵合的中間體進(jìn)行，分解為一種初始連接產(chǎn)物。更具體地，發(fā)生在COSR硫代酸酯組分和氨基烷基硫醇組分之間的硫醇交換產(chǎn)生一種硫酯鍵合的中間體連接產(chǎn)物，該連接產(chǎn)物發(fā)生自動(dòng)重排，經(jīng)過一個(gè)5元或6元環(huán)中間體而產(chǎn)生一種酰胺鍵合的下式的第一步連接產(chǎn)物J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 I或J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 II其中J1、J2、R1、R2和R3如前面所定義。
在連接位點(diǎn)處的N-取代C2或C3鏈烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]或[HS-(C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]易于在與肽相容的條件下除去而不會(huì)對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)生損害，產(chǎn)生一種下式的最終的連接產(chǎn)物J1-C(O)-HN-J2 V其中J1、J2、R1、R2和R3如前面所定義。最終的連接產(chǎn)物在連接位點(diǎn)處含有一個(gè)天然的酰胺鍵。
更具體地，本發(fā)明的擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接方法包括對(duì)下列組分進(jìn)行化學(xué)連接(i)包含式J1-C(O)SR的α-羧基硫代酸酯的第一種組分，和(ii)包含式J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2(I)或J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2(II)的酸穩(wěn)定的N-取代的C2或C3鏈氨基烷基或芳基硫醇的第二種組分，其中J1、J2、R1、R2和R3如前面所定義。
選擇R1、R2和R3基團(tuán)以方便在與肽相容的斷裂條件下斷裂N-C1鍵，例如可以使用給電子基團(tuán)，特別是當(dāng)與C1共軛時(shí)，以在C1處形成便于斷裂的共振穩(wěn)定的陽離子。化學(xué)連接反應(yīng)優(yōu)選包含一種硫醇催化劑作為賦形劑并且在大約中性的pH條件下在水性或有機(jī)-水性的混合條件下進(jìn)行。第一種和第二種組分的化學(xué)連接可以通過一種5元或6元環(huán)進(jìn)行，后者自發(fā)地發(fā)生重排，得到一種N-取代的酰胺鍵合的連接產(chǎn)物。當(dāng)?shù)谝环N和第二種組分是肽或多肽時(shí)，N-取代的酰胺鍵合的連接產(chǎn)物的式為J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-C(O)-J2(VIII)或J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-C(O)-J2(IX)其中J1、J2以及R1、R2、R3和Z2如前面所定義。
N取代的酰胺鍵合的連接產(chǎn)物的共軛的給電子基團(tuán)R1、R2或R3有助于從N-取代的酰胺鍵合的連接產(chǎn)物中斷裂N-C1鍵和除去C2或C3鏈烷基或芳基硫醇。在與肽相容的消去條件下除去N的烷基或芳基硫醇鏈，產(chǎn)生一種在連接位點(diǎn)處含有天然的酰胺鍵的連接產(chǎn)物。如果第一種和第二種組分是肽或多肽，則連接產(chǎn)物將具有下式J1-CONαH-CH(Z2)-C(O)-J2 (X)與以前的化學(xué)連接相比，本發(fā)明的方法具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。其中好幾個(gè)這樣的優(yōu)點(diǎn)涉及本發(fā)明的N-取代的C2或C3鏈烷基或芳基硫醇組分的精細(xì)的協(xié)調(diào)性。首先，沒有連接的N-取代的組分對(duì)酸性條件是穩(wěn)定的，這允許它進(jìn)行強(qiáng)有力的合成和儲(chǔ)藏。其次，它能與羧基硫代酸酯組分發(fā)生選擇性的反應(yīng)而產(chǎn)生一種在連接位點(diǎn)處具有一個(gè)N-取代的酰胺鍵的初始連接產(chǎn)物。第三點(diǎn)，在初始連接產(chǎn)物的連接位點(diǎn)的Nα位處再生的烷基或芳基硫醇部分可以在與未受保護(hù)的、部分受保護(hù)的或完全受保護(hù)的肽、多肽或其它部分完全相容的條件下被選擇性地消去，即可以消去烷基或芳基硫醇部分而不會(huì)損壞所要的連接產(chǎn)物。根據(jù)連接所選擇的特定的N-取代的烷基或芳基硫醇部分的不同，選擇性的斷裂反應(yīng)可以容易地在標(biāo)準(zhǔn)的與肽相容的斷裂條件下，例如在酸性、光解或還原性條件下進(jìn)行。因此，本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是根據(jù)所要的最終用途的不同，位于連接組分的其余部分上的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)如果存在的話，可以是未受保護(hù)的、部分受保護(hù)的或完全受保護(hù)的。而且，已知羧基硫代酸酯和N-取代的C2或C3鏈烷基或芳基硫醇的化學(xué)選擇性和溶解性，連接反應(yīng)可以快速而干凈地進(jìn)行，在pH7左右在水性條件下在室溫左右達(dá)到很高的產(chǎn)物收率。這使得本發(fā)明用于在溫和條件下連接部分或完全未受保護(hù)的肽、多肽或其它聚合物時(shí)具有特別大的靈活性。
對(duì)于包含N-取代的C2鏈烷基或芳基硫醇組分的本發(fā)明的肽組分來說，該化合物具有下式HS-C2-C1(R1)-NHα-CH(Z2)-C(O)-J2 (XI)如下列表1中所示。J2和R2如前面所定義；Z2是與N-取代的氨基酸相容的側(cè)鏈基團(tuán)，例如為一種氨基酸的側(cè)鏈。R1優(yōu)選為在C1的鄰位或?qū)ξ槐灰粋€(gè)給電子基團(tuán)取代的苯基；或吡啶甲基(未取代的或在C1的鄰位或?qū)ξ槐涣u基或硫醇取代)。
表I 為了保持與C1碳的電子共軛以促進(jìn)連接后N-C1鍵的斷裂，把苯基和吡啶甲基的給電子取代基R1′、R3′和R5′定位在鄰位或?qū)ξ皇潜匾摹?br> 優(yōu)選的R1′、R3′和R5′的給電子基團(tuán)包括強(qiáng)給電子基團(tuán)例如甲氧基(-OCH3)、硫羥(-SH)、羥基(-OH)、甲硫基(-SCH3)和中等的電子給體例如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)、丙基(-CH2-CH2-CH3)、異丙基(-CH2(CH3)3)。條件是R1′、R3′和R5′中的任何一個(gè)或全部可以是H。一個(gè)普遍的觀點(diǎn)是強(qiáng)給電子基團(tuán)增強(qiáng)C2鏈烷基或芳基硫醇在連接后發(fā)生斷裂的敏感性。當(dāng)存在單個(gè)的給電子基團(tuán)作為R1′、R3′或R5′取代基時(shí)，連接反應(yīng)可以以更快的速率進(jìn)行，而斷裂則更慢或者需要更加嚴(yán)格的斷裂條件。當(dāng)存在兩個(gè)或兩個(gè)以上的給電子基團(tuán)作為R1′、R3′或R5′取代基時(shí)，連接反應(yīng)將會(huì)更慢，而斷裂則更快或者需要不太嚴(yán)格的斷裂條件。因此，可以相應(yīng)地選擇特定的給電子基團(tuán)。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方式涉及N-取代的C2鏈化合物，它包含一個(gè)硫醇作為R1′和R5′位的R1的取代基。除了作為與C1共軛的給電子基團(tuán)外，在這些位置中的一處或兩處引入一個(gè)硫醇能使化合物經(jīng)過R1基團(tuán)介導(dǎo)而連接到一個(gè)6元環(huán)中(以及通過Nα-C2鏈烷基硫醇連接到一個(gè)5元環(huán)中)。它還增大了用于與α-羧基硫代酸酯反應(yīng)的可利用的硫醇的局部濃度，并且就結(jié)構(gòu)限制來說.提供了其它構(gòu)象，這可以促進(jìn)連接。
說到本發(fā)明的Nα-取代的C3鏈烷基或芳基硫醇組分，該化合物具有式HS-C3(R3)-C2(R2)C1(R1)-NHα-CH(Z2)-C(O)-J2，如下列表II中所示表II 如前面所述，J2可以是與肽的化學(xué)合或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的任何化合物部分，Z2是與N-取代的氨基酸相容的側(cè)鏈基團(tuán)，例如為一種氨基酸的側(cè)鏈。當(dāng)R1不是H時(shí)，則R2和R3都是H，而R1是未取代的或更優(yōu)選地在C1的鄰位或?qū)ξ槐灰粋€(gè)給電子基團(tuán)取代的苯基部分；或吡啶甲基(未取代的或在C1的鄰位或?qū)ξ槐涣u基或硫醇取代)。當(dāng)R2和R3不是H時(shí)，R1是H，而R3和R2形成一個(gè)在C1的鄰位或?qū)ξ槐灰粋€(gè)給電子基團(tuán)取代的芐基；或吡啶甲基(未取代的或在C1的鄰位或?qū)ξ槐涣u基或硫醇取代)。
至于N-取代的C2鏈化合物，為了保持與C1碳的電子共軛以便于在連接后能有力地?cái)嗔袾α-C1鍵，把苯基和吡啶甲基的給電子取代基R1′、R3′和R5′定位在鄰位或?qū)ξ皇潜匾?。然而，?dāng)R2和R3與C2和C3形成一個(gè)芐基時(shí)，至少R1′和R3′中的一個(gè)包含一個(gè)強(qiáng)給電子基團(tuán)，其中R1′或R3′選自甲氧基(OCH3)、硫羥(-SH)、羥基(-OH)和甲硫基(-SCH3)。對(duì)于其中R2和R3都是H的N-取代的C3鏈硫醇，R1包含一個(gè)苯基或吡啶甲基，其中R1′、R3′和R5′包含強(qiáng)或中等的給電子基團(tuán)或其組合。如同N-取代的C2鏈烷基或芳基硫醇的情況一樣，強(qiáng)給電子基團(tuán)能夠增強(qiáng)C3鏈烷基或芳基硫醇在連接后發(fā)生斷裂的敏感性。因此，可以相應(yīng)地選擇特定的給電子基團(tuán)或其組合。
與N-取代的C2鏈化合物相似，當(dāng)硫醇可以用來在令人感興趣的結(jié)構(gòu)中用于取代時(shí)，本發(fā)明的N-取代的C3鏈化合物可以包括一種硫醇作為R1′和R5′位的R1的取代基。同樣，給電子的硫醇基團(tuán)與C1共軛，把它引入到這些位置上使化合物具有兩條能形成6元環(huán)連接的路線。它還增大了用于與α-羧基硫代酸酯反應(yīng)的可利用的硫醇的局部濃度，并且就結(jié)構(gòu)限制來說，提供了其它構(gòu)象，這可以促進(jìn)連接。
本發(fā)明的N-末端的N-取代的C2或C3鏈烷基或芳基硫醇氨基酸的合成可以按照這里所說的方法進(jìn)行，例如按照方案I和方案II、實(shí)施例以及按照本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)的有機(jī)化學(xué)技術(shù)進(jìn)行，參見例如″Advanced Organic Chemistry，Reactions，Mechanisms，andStructure，″4th Edition，J.March(Ed.)，John Wiley & Sons，NewYork，NY，1992；″Comprehensive Organic Transformations，AGuide to Functional Group preparations，″R.Larock(Ed.)，VCHPublishers，New York，NY，1989。它們可以在溶液中、通過聚合物負(fù)載的合成方法或其組合進(jìn)行合成。優(yōu)選的方法使用Nα保護(hù)的N烷基化的S-保護(hù)的氨基烷基-或芳基-硫醇氨基酸母體。合成所用的試劑可以從多個(gè)商業(yè)渠道得到。而且，應(yīng)很好地理解到，可以把原料組分和各種中間體，例如單一的氨基酸衍生物儲(chǔ)存起來以備后用，以試劑盒等提供。
在制備本發(fā)明的N-末端Nα-取代的C2或C3鏈烷基或芳基硫醇氨基酸時(shí)，采用保護(hù)基策略。在各種合成策略中所優(yōu)選使用的保護(hù)基(PG)一般與固相肽合成(″SPPS″)相容。在一些情況下，還有必要使用可以在不同的條件下可被除去的正交保護(hù)基。已知有許多適用于這種目的的保護(hù)基(參見例如″protecting groups in Organic Synthesis″，3rd Edition，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley& Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；″SyntheticPeptides，A User′s Guide，″G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman &Company，New York，NY，1992；″Advanced Chemtech Handbook ofCombinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，″W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；″Principlesof Peptide Synthesis，2nd ed.，″M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；″The Practice of Peptide Synthesis，2nded.，″M.Bodanszky and A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；and ″protecting groups，″P.J.Kocienski，Ed.，GeorgThieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994).實(shí)例包括芐氧基羰基(Z)、Boc、Bpoc、Trt、Nps、FmocCI-Z、Br-Z、NSC、MSC、Dde等。對(duì)于硫部分，合適的保護(hù)基的實(shí)例包括但是不限于芐基、4-甲基芐基、4-甲氧基芐基、三苯甲基、Acm、TACAM、呫噸基、二硫化物衍生物、吡啶甲基和苯甲酰甲基。
更具體地，本發(fā)明的Nα-取代的C2或C3鏈烷基或芳基硫醇可以按照方案I(Nα-取代的母體的固相制備)、方案II(Nα-取代的母體的溶液相制備)制備。在方案I中，使用標(biāo)準(zhǔn)的聚合物-負(fù)載的有機(jī)合成方法把Nα-取代的C2或C3鏈烷基或芳基硫醇直接裝配在固相上，同時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)的偶合方法使方案II的Nα-保護(hù)的，N-烷基化的，S-保護(hù)的氨基烷基或芳基硫醇氨基酸母體與樹脂偶合。在方案I中，X是鹵素，R1和R2如前面所述并且可以作為受保護(hù)的或未受保護(hù)的部分進(jìn)行操作或者精心制作在樹脂上，而J2優(yōu)選與鹵素相連作為X-CH(R)-J2-樹脂的形式，其中R是H或其它側(cè)鏈。應(yīng)當(dāng)明白，J2可以是多種基團(tuán)，例如其中鹵素X和J2-樹脂被一個(gè)以上的碳原子分開，例如在β-或γ-氨基酸或類似分子的合成中。其中使用乙醛酸部分(HC(O)-C(O)J2-樹脂)，得到的側(cè)鏈R是H。在方案II中，X是一種鹵素，R1和R2如前面所述，可以作為受保護(hù)的或未受保護(hù)的部分進(jìn)行操作，或者精心制作在溶液中或樹脂上，其中R是H或其它側(cè)鏈。其中使用乙醛酸部分(HC(O)-C(O)-OH)，產(chǎn)生的側(cè)鏈R為H。如上述所述，你將會(huì)明白，方案I和11可以被用在C3的鏈烷基或芳基硫醇的合成。當(dāng)產(chǎn)生外消旋體或非對(duì)映異構(gòu)體產(chǎn)物時(shí)，可能有必要在用于擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接之前，通過標(biāo)準(zhǔn)方法把這些化合物分離開來。
方案I
方案II 就本發(fā)明的擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接方法中所用的第一種組分的羧基硫代酸酯部分來說，該組分為式J1-CO-SR。更優(yōu)選的羧基硫代酸酯組分包含一種式J1-NH-C(Z1)-CO-SR的α-羧基硫代酸酯氨基酸。基團(tuán)J1可以是與化學(xué)選擇性的連接反應(yīng)相容的任何化合物部分，例如為受保護(hù)的或未受保護(hù)的氨基酸、肽、多肽、其它聚合物、染料、連接體等。Z1是與αCO-SR硫代酸酯相容的任何側(cè)鏈基團(tuán)，例如一種氨基酸的側(cè)鏈。R是與硫代酸酯基團(tuán)相容的任何基團(tuán)，包括但是不限于芳基、芐基和烷基。R的實(shí)例包括3-羧基-4-硝基苯基硫代酸酯、芐基硫代酸酯和巰基丙酸亮氨酸硫代酸酯(參見例如Dawson等人，Science(1994)266776-779；Canne等人，Tetrahedron Lett.(1995)361217-1220；Kent等人，WO96/34878；Kent等人，WO98/28434；Ingenito等人，JACS(1999)121(49)11369-11374；和Hackeng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)961006 8-10073)。其它的實(shí)例包括二硫代蘇糖醇或烷基或芳基硫代酸酯，它們可以通過intein-介導(dǎo)的生物技術(shù)來生產(chǎn)，這樣的生物技術(shù)也是眾所周知的(參見例如Chong等人，Gene(1997)192277-281；Chong等人，Nucl.Acids Res.(1998)265109-5115；Evans等人，Protein Science(1998)72256-2264；和Cotton等人，Chemistry & Biology(1999)6(9)247-256)。
α-羧基硫代酸酯可以通過化學(xué)或生物學(xué)方法按照本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生產(chǎn)，例如這里所述的方法，包括實(shí)施例中所述的方法。對(duì)于化學(xué)合成，可以在溶液中或者從產(chǎn)生硫代酸酯的樹脂合成α-羧基硫代酸酯肽，這些技術(shù)是熟知的(參見例如Dawson等人，supra；Canne等人，supra；Hackeng等人，supra，Hojo H，Aimoto，S.(1991)BullChem Soc Jpn 64111-117)。例如化學(xué)合成的硫代酸酯肽可以從相應(yīng)的肽α-硫代酸制得，而后者又可以在一種硫代酸酯-樹脂上或者在溶液中合成，但是優(yōu)選樹脂方法。可以把肽-α-硫代酸轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的3-羧基-4硝基苯基硫代酸酯、相應(yīng)的芐基酯或多種烷基硫代酸酯中的任何一種。所有這些硫代酸酯都能給連接反應(yīng)提供滿意的離去基團(tuán)，其中3-羧基-4-硝基苯基硫代酸酯所表現(xiàn)的反應(yīng)速率比相應(yīng)的芐基硫代酸酯高一些，而芐基硫代酸酯的反應(yīng)性又比烷基硫代酸酯高。作為另一個(gè)實(shí)例，可以使用能產(chǎn)生三苯甲基締合的巰基丙酸亮氨酸硫代酸酯的樹脂來構(gòu)建C-末端硫代酸酯(Hackeng等人，supra)。還可以使用一種3-羧酸丙磺酰胺安全捕集連接體，通過用重氮甲烷或碘乙腈活化，然后用一種合適的硫醇取代來進(jìn)行C-末端硫代酸酯的合成(Ingenito等人，supra；Shin等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.，121，11684-11689)。
也可以使用生物學(xué)方法來制備肽或多肽C-末端α-羧基硫代酸酯。例如可以使用含有或不含有標(biāo)記物例如親和標(biāo)記物的intein表達(dá)系統(tǒng)，利用″intein″蛋白拼接元件的可誘導(dǎo)的自斷裂活性，在一種合適的硫醇存在下來生產(chǎn)C-末端硫代酸酯肽或多肽片斷。特別是，intein在硫醇例如DTT、β-巰基乙醇、β-巰基乙磺酸或半胱氨酸存在下，發(fā)生特異性的自斷裂，產(chǎn)生一種帶有C-末端硫代酸酯的肽片斷，參見例如Chong等人，(1997)supra；Chong等人，(1998)supra；Evans等人，Supra；和Cotton等人，supra.
把本發(fā)明的N-取代的C2或C3鏈烷基或芳基硫醇組分與第一種羧基硫代酸酯組分連接，產(chǎn)生一種在連接位點(diǎn)處含有N-取代的酰胺鍵的連接產(chǎn)物，如圖1、2和3中所示。選擇反應(yīng)的連接條件以保持硫代酸酯與N-取代的C2或C3鏈烷基或芳基硫醇部分選擇性的反應(yīng)性。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，連接反應(yīng)在一種pH6-8，優(yōu)選的pH范圍為6.5-7.5的緩沖溶液中進(jìn)行。該緩沖溶液可以是水性溶液、有機(jī)溶液或其混合物。連接反應(yīng)還可以包括一種或多種催化劑和/或一種或多種還原劑、脂質(zhì)、去污劑、其它變性劑或增溶劑等。優(yōu)選的催化劑的實(shí)例有硫醇和含膦基團(tuán)，例如硫酚、芐基硫醇、TCEP和烷基膦。變性劑和/或增溶劑的實(shí)例包括胍、脲在水或有機(jī)溶劑例如TFE、HFIP、DMF、NMP中、混有水的乙腈中的溶液、或混有胍和脲的水溶液。還可以利用溫度來調(diào)節(jié)連接反應(yīng)的速率，溫度通常在5℃與55℃之間，優(yōu)選溫度介于15℃和40℃之間。作為一個(gè)實(shí)例，在一個(gè)含有2％硫酚的6M胍的反應(yīng)體系中，在6.8-7.8的pH下，連接反應(yīng)進(jìn)行得很好。
對(duì)于N-取代的C2鏈烷基或芳基硫醇來說，連接產(chǎn)生于發(fā)生在COSR硫代酸酯組分和氨基烷基硫醇組分之間的硫醇交換。交換產(chǎn)生一種硫酯鍵合的中間體連接產(chǎn)物，后者自發(fā)地發(fā)生重排，通過一個(gè)5元環(huán)中間體而產(chǎn)生一種在連接位點(diǎn)處含有可以被除去的N取代的C2鏈烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]的式J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-J2的連接產(chǎn)物，其中取代基如前面所定義。在連接位點(diǎn)處的N取代的C2鏈烷基或芳基硫醇[HS-C2-C1(R1)-]易于在與肽相容的條件下除去而產(chǎn)生一種在連接位點(diǎn)處具有天然的酰胺鍵的式J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最終的連接產(chǎn)物。
對(duì)于N-取代的C3鏈烷基或芳基硫醇來說，COSR硫代酸酯組分和氨基烷基硫醇組分之間的硫醇交換產(chǎn)生一種硫酯鍵合的中間體連接產(chǎn)物，后者自發(fā)地發(fā)生重排，通過一個(gè)6元環(huán)中間體而產(chǎn)生一種在連接位點(diǎn)處含有可以被除去的N取代的C3鏈烷基或芳基硫醇[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]的式J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2的連接產(chǎn)物。在連接位點(diǎn)處的N取代的C3鏈芳基硫醇[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]易于在與肽相容的條件下除去而產(chǎn)生一種在連接位點(diǎn)處具有天然的酰胺鍵的式J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最終的連接產(chǎn)物。
N-取代的烷基或芳基硫醇基團(tuán)的除去優(yōu)選在酸性條件下促進(jìn)斷裂N-C1鍵而進(jìn)行，在連接位點(diǎn)處得到一種穩(wěn)定的未取代的酰胺鍵。″與肽相容的斷裂條件″是指適用于從連接產(chǎn)物中斷裂N-鍵合的烷基或芳基硫醇部分的與肽相容的物理-化學(xué)條件。與肽相容的斷裂條件一般根據(jù)所用的Nα-烷基或芳基硫醇部分來進(jìn)行選擇，它可以容易地從合成路線和熟知的方法演繹出來(參見例如″Protecting Groups in OrganicSynthesis″，3rd Edition，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；″Synthetic Peptides，A User′s Guide，″G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；″Advanced ChemtechHandbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry，″W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；″Principles of Peptide Synthesis，2nd ed.，″M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；″The Practice of Peptide Synthesis，2nded.，″M.Bodanszky and A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；and″Protecting Groups，″P.J.Kocienski，Ed.，GeorgThieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
例如，其中的R1′、R2′或R3′取代基包括甲氧基、羥基、硫羥或甲硫基、甲基等，用于消去的更普遍的方法涉及用于肽合成化學(xué)中的典型的酸性斷裂條件，這包括在強(qiáng)酸性條件下或水-酸條件下，在有或沒有還原劑和/或清除劑體系(例如酸，例如無水的氟化氫(HF)、三氟乙酸(TFA)或三氟甲磺酸(TFMSA)等)的情況下斷裂N-C1鍵。
對(duì)于給定的結(jié)構(gòu)，可以選擇更具特異性的酸性斷裂體系來最優(yōu)化Nα-C1鍵的斷裂，以除去芳基或烷基硫醇部分。這樣的條件是熟知的并且是與保持肽的完整性相容的。另一種斷裂方法涉及包含一種硫醇清除劑，其中色氨酸存在于肽或多肽序列中以避免色氨酸側(cè)鏈與游離的芳基或烷基硫醇部分反應(yīng)。硫醇清除劑的實(shí)例包括乙二醇、半胱氨酸、β-巰基乙醇和甲硫酚。因此，本發(fā)明的另一種實(shí)施方式是在斷裂N-C1鍵而除去芳基或烷基硫醇部分時(shí)加入一種硫醇清除劑。
當(dāng)吡啶甲基作為取代基時(shí)，其它具體的斷裂條件包括光或還原性斷裂條件。作為一個(gè)實(shí)例，當(dāng)R1或R2和R3取代基包含一個(gè)吡啶甲基部分時(shí)，可以使用光解(例如紫外光)、鋅/乙酸或電解還原按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行斷裂。當(dāng)N-取代的C2鏈硫醇的R1在R1處含有一個(gè)甲硫基時(shí)，則可以使用汞(11)或HF進(jìn)行斷裂。還可以使用斷裂體系同時(shí)從固體載體中斷裂并且/或者當(dāng)?shù)谝环N和第二種連接組分包含其它保護(hù)基時(shí)，斷裂體系可作為脫保護(hù)試劑。例如，可以通過把多肽溶于含有活化的鋅(～0.5g/ml)的10％的乙酸/水溶液中來除去N-吡啶甲基。硫代甲基例如2-巰基、1-甲基亞磺酰基乙基(HS-C2-C1(S(O)-CH3)-Nα)可以在連接后通過還原和二價(jià)汞、巰基介導(dǎo)的斷裂而除去。作為一個(gè)實(shí)例，通過把多肽溶于含有N-甲基巰基乙酰胺(MMA)的3％的乙酸水溶液(例如1mg多肽在0.5ml乙酸/水和0.05mlMMA中的溶液)中，還原為硫代甲烷形式，然后在反應(yīng)過夜后冷凍和冷凍干燥該混合物來除去甲基亞磺?；一Ｈ缓罂梢栽谝环N含有乙酸汞(Hg(OAc)2)的3％的乙酸水溶液中除去還原的助劑(例如用0.5ml的乙酸水溶液和10mg Hg(OAc)2處理大約1小時(shí))，然后加入β-巰基乙醇(例如0.2mlβ-巰基乙醇)。然后可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法例如反相HPLC(RPHPLC)來純化產(chǎn)物。
可以理解的是，還可以在斷裂體系中使用一種或多種催化劑和/或賦形劑，例如一種或多種清除劑、去污劑、溶劑、金屬等。一般來說，特定的清除劑的選擇取決于所存在的氨基酸。例如，可以利用清除劑的存在來抑制在斷裂過程中產(chǎn)生的碳鎓離子有可能對(duì)某些氨基酸(例如Met、Cys、Trp和Tyr)產(chǎn)生的損壞作用。還可以使用其它添加劑如去污劑、聚合物、鹽、有機(jī)溶劑等通過調(diào)節(jié)溶解性促進(jìn)斷裂。使用能調(diào)節(jié)氧化還原體系的催化劑或其它化學(xué)試劑也是有利的。還容易明白，可以通過常規(guī)方式調(diào)節(jié)多種其它的物理化學(xué)條件例如緩沖體系、pH和溫度來最優(yōu)化給定的斷裂體系。
本發(fā)明還提供受保護(hù)形式的本發(fā)明的Nα-取代的C2或C3鏈烷基或芳基硫醇。這些化合物特別可用于自動(dòng)的肽合成和正交的以及匯集的連接策略。這些組份包含一種式(PG2)S-C2-C1(R1)-Nα(PG1)-CH(Z2)-C(O)J2或(PG2)S-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-Nα(PG1)-CH(Z2)-C(O)-J2的完全受保護(hù)的、部分受保護(hù)的或完全未受保護(hù)的酸穩(wěn)定的Nα-取代的C2或C3鏈氨基烷基或芳基硫醇，如表III和表IV中所示。尤其是，R1，R2和R3中的一個(gè)或多個(gè)含有與C1共軛的給電子基團(tuán)，它在Nα-取代的氨基烷基或芳基硫醇轉(zhuǎn)變?yōu)镹α-取代的酰胺烷基或芳基硫醇后，能夠在C1處形成一種共振穩(wěn)定的陽離子而便于在與肽相容的斷裂條件下斷裂Nα-C1鍵。PG1和PG2是單獨(dú)或一起存在的保護(hù)基團(tuán)，或者不存在，并且可以相同或不同，其中Z2是與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的任何化合物部分，并且其中J2是與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的任何化合物部分。
PG1(或X1)是一種胺的保護(hù)基。PG2(或X2)是一種硫醇的保護(hù)基。許多這樣的保護(hù)基是已知的并且適用于這種目的(參見例如″Protecting Groups in Organic Synthesis″，3rd Edition，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；″Synthetic Peptides，A User′sGuide，″G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；″Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & SolidPhase Organic Chemistry，″W.D.，Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；″Principles of PeptideSynthesis，2nd ed.，″M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；″The Practice of Peptide Synthesis，2nd ed.，″M.Bodanszky and A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；and″Protecting Groups，″P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
表III
優(yōu)選的PG1和X1保護(hù)基的實(shí)例包括但是不限于[Boc(叔丁基氨基甲酸酯)、Troc(2，2，2，-三氯乙基氨基甲酸酯)、Fmoc(9-芴基甲基氨基甲酸酯)、Br-Z或C1-Z(Br-或C1-芐基氨基甲酸酯)、Dde(4，4，-二甲基-2，6-二氧代環(huán)亞己基)、MsZ(4-甲基亞磺?；S基氨基甲酸酯)、Msc(2-甲基磺基乙基氨基甲酸酯)、Nsc(4-硝基苯基乙基磺?；?乙氧基羰基]。優(yōu)選的PG1和X1保護(hù)基選自″Protective Groups inOrganic Synthesis，″Green and Wuts，Third Edition，Wiley-Interscience，(1999)，其中最優(yōu)選Fmoc和Nsc。優(yōu)選的PG2保護(hù)基的實(shí)例包括但是不限于[Acm(乙酰氨基甲基)、MeOBzl或Mob(對(duì)甲氧基芐基)、MeBzl(對(duì)甲基芐基)、Trt(三苯甲基)、Xan(呫噸基)、tButhio(叔丁基硫基)、Mmt(對(duì)甲氧基三苯甲基)、2或4-吡啶甲基(2或4-吡啶基))、Fm(9-芴基甲基)、tBu(叔丁基)、Tacam(三甲基乙酰氨基甲基)]。優(yōu)選的PG2和X2保護(hù)基選自″Protective Groupsin Organic Synthesis，″Green and Wuts，Third Edition，Wiley-Interscience，(1999)，其中最優(yōu)選Acm、Mob、MeBzl、吡啶甲基。
正交保護(hù)方案涉及能通過不同的化學(xué)機(jī)理被除去因而可以在其它類保護(hù)基存在的情況下以任何順序被除去的兩類或多類或組保護(hù)基。正交方案提供了基本上溫和的總體條件的可能性，因?yàn)榭梢愿鶕?jù)化學(xué)組成和性質(zhì)而不是反應(yīng)速率的不同來達(dá)到選擇性。
表IV 本發(fā)明的Nα-取代的C2或C3鏈烷基或芳基硫醇的受保護(hù)形式可以按照上述方案I和II中所述的方法制備。
本發(fā)明的化合物可以通過包括鹵素介導(dǎo)的氨基烷基化、還原性氨基化在內(nèi)的多種方法中的任何一種以及通過制備與固相或溶液氨基酸或肽合成方法相容的Nα-保護(hù)的，N-烷基化的，S-受保護(hù)的氨基烷基-或芳基-硫醇氨基酸母體來生產(chǎn)。需要時(shí)，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)生產(chǎn)的外消旋體或非對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行拆分而得到具有可以接受的手性純度的化合物。
如上述所，在一些情況下，優(yōu)選具有可以接受的手性純度的Nα-取代的C2或C3鏈烷基或芳基硫醇。如實(shí)施例21和圖5B中所示，把Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙基助劑用于制備細(xì)胞色素b562，得到兩種具有重疊的純化曲線的連接產(chǎn)物(非對(duì)映異構(gòu)體)。盡管除去Nα-助劑只得到一種主要產(chǎn)物，但是在最終的產(chǎn)物中將存在很少百分?jǐn)?shù)的不需要的消去產(chǎn)物和副反應(yīng)產(chǎn)物。例如，在實(shí)施例4-6中所述的用于合成細(xì)胞色素b562的合成中所用的Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙基助劑的還原性氨基化合成路線本質(zhì)上會(huì)在手性中心C1處產(chǎn)生兩種差向異構(gòu)體。如上所述，需要時(shí)，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)產(chǎn)生的外消旋體或非對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行拆分而得到具有可以接受的手性純度的化合物。
用于得到具有可以接受的手性純度的本發(fā)明的Nα-助劑的標(biāo)準(zhǔn)方法是(1)手性色譜(2)手性合成(3)使用共價(jià)鍵合的非對(duì)映異構(gòu)的共軛體和(4)結(jié)晶或其它常規(guī)的分離方法來得到對(duì)映體純的手性助劑(參見例如Ahuja，Satinder.′Chiral separations.Anoverview.′ACS Symp.Ser.(1991)，471(Chiral Sep.Liq.Chromatogr.)，1-26；Collet，Andre.″Separation andPurification of Enantiomers by Crystallization Methods″，InEnantiomer(1999)4157-172；Lopata et al.，J.Chem.Res.Minipprint(1984)102930-2962；Lopata et al.，J.Chem.Res.(1984)102953-2973；Ahuja，Satinder.′Chiral separations andtechnologyan overview.′Chiral Sep.(1997)，1-7；ChiralSeparationsApplications and Technology.Ahuja，Satinder；Editor.USA.(1997)，349pp.Publisher(ACS，Washington，D.C.))。所有這些標(biāo)準(zhǔn)方法都可用于拆分外消旋體或非對(duì)映異構(gòu)體而得到具有可以接受的手性純度的化合物。例如，可以使用結(jié)晶來對(duì)對(duì)映體進(jìn)行旋光拆分。對(duì)于手性色譜，眾所周知，可以通過制備性的色譜使用手性介質(zhì)把外消旋體混合物分離為手性純的對(duì)映體。因此，可以使用在手性Nα-助劑的總合成中所用的還原性氨基化路線所生產(chǎn)的外消旋體混合物來制備每種手性純的對(duì)映體，例如如下所述的氨基酸助劑(例如其中R是氨基酸側(cè)鏈) ～摩爾比大約1∶1每一種對(duì)映體都可以以手性純的形式得到，或兩種對(duì)映體都可以以手性純的形式得到。每一種對(duì)映體都可用于形成手性純的助劑改性的組分，例如肽片斷(即兩種手性純的差向異構(gòu)體)，它們可以是嚴(yán)格純化的，不受其它差向異構(gòu)體和雜質(zhì)的存在的干擾。注意，除非準(zhǔn)備使用兩種對(duì)映體，否則助劑總量中的50％將會(huì)被浪費(fèi)掉。例如，然后可以把這兩種手性純的助劑改性的肽片斷用于分離ENCL的反應(yīng)中，得到手性純的助劑改性的連接產(chǎn)物混合物。在分離純化后，從差向異構(gòu)體連接產(chǎn)物中除去助劑基團(tuán)(單獨(dú)進(jìn)行或者在合并后進(jìn)行)，得到具有同樣的天然結(jié)構(gòu)的連接產(chǎn)物，然后把連接產(chǎn)物純化。
對(duì)于手性合成，優(yōu)選的方法使用一種對(duì)映體純的手性原料，如下所示的對(duì)甲氧基苯基取代的Nα-C2助劑 [PG1＝Boc或Fmoc；PG2＝(4-甲基)芐基或(4-甲氧基)芐基]然后可以使用所得的手性純的母體化合物來制備一種受保護(hù)的(N-取代的)氨基酸，即 或者直接用于“亞單體”肽合成路線，即 在聚合物載體上形成助劑改性的肽。然后脫保護(hù)/斷裂，得到手性純的助劑改性的肽片斷，即 可以從易于得到的已知具有手性的對(duì)位取代的苯基甘氨酸來制備本發(fā)明的手性純的Nα-助劑，因而預(yù)先確定了所得的助劑的手性和手性純度。
另外，另一種優(yōu)選的實(shí)施方式使用具有對(duì)映體選擇性的使用不對(duì)稱還原的合成方法來生產(chǎn)助劑，例如如下所示 R＝-H，或-CH3，或-CH2COOH(或相對(duì)的對(duì)映體)還可以把不對(duì)稱還原用于對(duì)映體選擇性合成中來生產(chǎn)Nα-助劑改性的氨基酸，例如對(duì)于如下所示的甘氨酸，即 (或其它對(duì)映體)雖然以一種合適的方式實(shí)施的不對(duì)稱合成會(huì)產(chǎn)生大大過量的一種對(duì)映體(相對(duì)于另一種)，然而預(yù)期將會(huì)存在一定數(shù)量的其它對(duì)映體?？梢允褂靡环N手性純化步驟來對(duì)付這種情況以得到純粹的主要對(duì)映體。對(duì)映體選擇性的合成路線的主要優(yōu)點(diǎn)是手性色譜分離更加容易，并且不會(huì)扔棄(浪費(fèi))大量的物質(zhì)。
另一種優(yōu)選的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是使用共價(jià)的非對(duì)映異構(gòu)的共軛體進(jìn)行拆分。一般來說，這種方法使用手性的氨基酸(例如Ala)來對(duì)外消旋體助劑混合物進(jìn)行改性，并且通過標(biāo)準(zhǔn)的(非手性的)色譜方法分離所得的非對(duì)映異構(gòu)體，如下所示。例如，通過共價(jià)摻入第二個(gè)手性中心可以把外消旋的助劑1轉(zhuǎn)變?yōu)榉菍?duì)映異構(gòu)體的混合物 對(duì)映體 非對(duì)映異構(gòu)體(外消旋體混合物)在這種情況下，通過使外消旋體混合物與(R)2-Br-丙酸發(fā)生一種SN2親核反應(yīng)(反轉(zhuǎn))，得到圖中所示的一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體。事實(shí)上，我們使用一種N-鍵合的含有硫醇的手性助劑制得了L-Ala。
作為非對(duì)映異構(gòu)體，這兩種化合物在非手性的色譜條件下將典型地具有不同的色譜行為，因而能在實(shí)際的制備條件下分離而得到純粹的不同的差向異構(gòu)體。
在對(duì)Nα部分進(jìn)行合適的保護(hù)后，可以使用每一種化合物來生產(chǎn)含有N-末端Ala殘基的未受保護(hù)或部分受保擴(kuò)的手性純的助劑改性的肽片斷。
本發(fā)明的受保護(hù)的Nα-取代的組分特別可用于采用常規(guī)的肽合成和其它有機(jī)合成策略的快速自動(dòng)合成。它們還把化學(xué)連接的用途擴(kuò)大到多組分連接方案，例如當(dāng)生產(chǎn)一種涉及正交連接策略例如三個(gè)或更多個(gè)片斷連接方案或匯集的連接合成方案的多肽時(shí)。
例如，可以把本發(fā)明的擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接方法和組合物與生產(chǎn)親核性的穩(wěn)定的硫代酸酯的方法和硫代酸酯的安全捕集方法結(jié)合起來使用，例如于2001年8月31日登記的共同未決申請(qǐng)PCT申請(qǐng)?zhí)朳還未指定]和于2000年9月1日登記的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/229,295(在此引入供參考)中所述的原硫醇酯和羧酸酯硫醇。簡單地說，能產(chǎn)生親核性的穩(wěn)定的硫代酸酯的化合物包括一種原硫醇酯或羧酸酯硫醇；這些化合物在有機(jī)合成中具有廣泛的用途，包括生產(chǎn)肽-、多肽-和其它聚合物-硫代酸酯。能產(chǎn)生親核性的穩(wěn)定的硫代酸酯的化合物特別可用于從在使用強(qiáng)親核性物質(zhì)的條件下制備的母體生產(chǎn)活化的硫代酸酯，例如使用Fmoc SPPS以及需要(得益于使用)給感興趣的特異性連接反應(yīng)定向的相容的選擇性保護(hù)方法的多步連接或共軛方案制備的肽或多肽。親核性的穩(wěn)定的原硫醇酯式為X-C(OR′)2-S-R，其中X是選擇性地包含一個(gè)或多個(gè)可斷裂的親核性保護(hù)基的感興趣的目標(biāo)分子，R′是一個(gè)可以在非親核性的斷裂條件下斷裂的親核性的穩(wěn)定的保護(hù)基，而R是與原硫醇酯-C(OR′)-S-相容的任何基團(tuán)。還提供能生產(chǎn)親核體-穩(wěn)定的原硫醇酯硫代酸酯的樹脂，該樹脂式為X-C(OR′)2-S-R-連接體-樹脂或X-C((OR1′-連接體-樹脂)(OR2′))-SR，其中X、R′和R如前面所述，并且其中連接體和樹脂是適用于固相有機(jī)合成的任何親核體-穩(wěn)定的連接體和樹脂，包括隨后能轉(zhuǎn)變?yōu)橛H核體-不穩(wěn)定的用于斷裂的安全捕集連接體?？梢酝ㄟ^多種非親核性的條件例如酸水解條件把親核體-穩(wěn)定的原硫醇酯轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘牧虼狨ァＳH核性穩(wěn)定的羧酸酯硫醇式為X-C(O)-O-CH(R″)-(CH2)η-S-R，其中X是包含一個(gè)或多個(gè)親核體不穩(wěn)定的保護(hù)基的感興趣的目標(biāo)分子，R″是一個(gè)非親核體穩(wěn)定的基團(tuán)，n是1或2，優(yōu)選n＝1，而R″′是H、保護(hù)基或一種與樹脂相連的酸-或還原-不穩(wěn)定的或安全捕集的連接體或可在非親核條件下除去的保護(hù)基團(tuán)。還提供了基于親核體-穩(wěn)定的羧酸酯硫醇的生產(chǎn)硫代酸酯的樹脂，該樹脂式為X-C(O)-O-CH(R″)-CH2η-S-連接體-樹脂或X-C(O)-O-CH(R″-連接體-樹脂)-CH2η-S-R″′，其中X、R″、n和R″′如前面所定義，而其中的連接體和樹脂是任何適用于固相有機(jī)合成的親核體-穩(wěn)定的連接體和樹脂。可以通過加入一種硫醇催化劑例如硫酚把親核體-穩(wěn)定的羧酸酯硫醇轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘牧虼狨?。因此，可以把本發(fā)明的擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接方法和組合物用于多片斷的匯集連接技術(shù)中，其中靶化合物的一個(gè)末端可以帶有本發(fā)明的受保護(hù)的或未受保護(hù)的Nα-C2或C3鏈烷基或芳基硫醇，而另一個(gè)末端帶有一個(gè)原硫醇酯或羧酸酯硫醇部分，用于隨后轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘牧虼狨ズ瓦B接。
還應(yīng)當(dāng)明白，可以把本發(fā)明的Nα-C2或C3鏈烷基或芳基硫醇與其它連接方法結(jié)合使用，例如為天然的化學(xué)連接(Dawson，等人，Science(1994)266776-779；Kent，等人，WO96/34878)、擴(kuò)展的通用化學(xué)連接(Kent，等人，WO98/28434)，形成肟的化學(xué)連接(Rose，等人，J.Amer.Chem.Soc.(1994)11630-33)，形成硫代酸酯的連接(Schnlzer，等人，Science(1992)256221-225)，形成硫醚的連接(Englebretsen，等人，Tet.Letts.(1995)36(48)8871-8874)，形成腙的連接(Gaertner，等人，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338)和形成噻唑烷的連接以及形成惡唑烷的連接(Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189；Tam，等人，WO95/00846)或其它方法(Yan，L.Z.and Dawson，P.E.，″Synthesis of Peptide and Proteins without CysteineResidues by Native Chemical Ligation Combined withDesulfurization，″J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，在此引入供參考；Gieselnan等人.，Org.Lett.20013(9)1331-1334；Saxon，E.等人，″Traceless″Staudinger Ligation for theChemoselective Synthesis of Amide Bonds.Org.Lett.2000，2，2141-2143)。本發(fā)明還考慮用硒取代本發(fā)明的Nα-C2或C3鏈烷基或芳基硫醇中的硫醇硫。
本發(fā)明的方法和組合物有許多用途。本發(fā)明的方法和組合物特別可用于連接肽、多肽和其它聚合物。能夠?qū)Πㄌ烊话被岷头翘烊话被峒捌溲苌镌趦?nèi)的實(shí)際存在的任何氨基酸進(jìn)行天然的化學(xué)連接的能力將天然的化學(xué)連接擴(kuò)大到了缺乏合適的半胱氨酸連接位點(diǎn)的靶分子。除了用于連接肽或多肽片斷外，本發(fā)明還可用于連接聚合物，當(dāng)需要在連接位點(diǎn)處通過一個(gè)含有Nα取代的或全天然的酰胺鍵來連接這樣的部分時(shí)。本發(fā)明還在用于表達(dá)蛋白連接(EPL)的很廣泛的肽標(biāo)記物的生產(chǎn)中找到了用途。例如，可以根據(jù)所要的最終用途的不同，通過一個(gè)Nα-取代的烷基或芳基硫醇的酰胺鍵或全天然的酰胺鍵把生產(chǎn)EPL的硫代酸酯多肽與很廣泛的肽連接起來。還可以利用本發(fā)明來生產(chǎn)在肽和多肽發(fā)生環(huán)化的位點(diǎn)處具有天然的酰胺鍵的多種環(huán)狀的肽和多肽。例如這很重要，因?yàn)榇蠖鄶?shù)環(huán)狀的肽例如按照工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)的抗生素和其它藥物在環(huán)化(即頭-尾相接)的連接位點(diǎn)處不含有可用于形成天然酰胺鍵的半胱氨酸殘基。
在本說明書中提到的所有出版物和專利申請(qǐng)已收入本文供參考，達(dá)到同樣的程度，似乎每個(gè)單個(gè)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)都具體而單獨(dú)地表明是供參考引入的。
實(shí)施例給出下列制備和實(shí)施例為的是讓本領(lǐng)域技術(shù)人員能更清楚地理解和實(shí)施本發(fā)明。不應(yīng)把它們看作是對(duì)本發(fā)明的范圍的限制，而應(yīng)當(dāng)僅僅是說明性的和代表性的。
縮寫Acm 乙酰氨基甲基Aloc 烯丙氧基羰基BOP 苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽Br，ClZ Br，Cl芐基氨基甲酸酯DCM 二氯甲烷DDE 4，4-二甲基-2，6-二氧代環(huán)己-1-亞基DIPCDI N，N-二異丙基碳酰二亞胺DIPEA N，N-二異丙基乙胺DMAP4-二甲基氨基吡啶DMF N，N-二甲基甲酰胺DMSO二甲基亞砜EtOH 乙醇Fmoc 9-芴基甲氧基羰基FM9-芴基甲基HATU (N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑[4，5-b]吡啶基亞甲基]-N-甲基甲銨六氟磷酸鹽N-氧化物)HBTU 前面所命名的N-[(1-H-苯并三唑-1-基)(二甲基胺)亞甲基]-N-甲基甲銨六氟磷酸鹽-N-氧化物的0-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽HF 氫氟酸HMP樹脂 4-羥基甲基苯氧基樹脂；對(duì)烷氧基芐基醇樹脂；或Wang樹脂HOAt 1-羥基-7-氮雜苯并三唑HOBt 1-羥基苯并三唑Mbh 二甲氧基二苯甲基MBHA樹脂 4-甲基二苯甲基胺樹脂Meb 對(duì)-甲基芐基MMA N-甲基巰基乙酰胺Mmt 對(duì)-甲氧基三苯甲基Mob 對(duì)-甲氧基芐基Msc 2-甲基磺基乙基氨基甲酸酯Msz 4-甲基亞磺酰基芐基氨基甲酸酯Mtr 4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；鵑MM N-甲基嗎啉NMP N-甲基吡咯烷酮，N-甲基-2-吡咯烷酮Nsc 4-硝基苯基乙基磺酰基-乙氧基羰基OPfp 五氟苯基酯OtBu 叔丁基酯PAC 肽酸連接體PAL 肽酰胺連接體Pbf 2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；鵓EG-PS聚乙二醇-聚苯乙烯Picolyl 吡啶甲基Pmc 2，2，4，6，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基PyAOP 7-氮雜苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸鹽S-tBu 叔丁基硫基Tacam 三甲基乙酰氨基甲基tBoc 叔丁氧基羰基TBTU 0-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽tBu 叔丁基TFA 三氟乙酸Tis 三異丙基硅烷Tmob 2，4，6-三甲氧基芐基TMOF 三甲基原甲酸酯Troc 2，2，2-三氯乙基氨基甲酸酯Trt 三苯基甲基實(shí)施例1一般原料和方法以逐步的方式，通過SPPS采用用于Boc化學(xué)的原位中和/HBTU活化方法，在PAM樹脂或生產(chǎn)硫酯的樹脂上按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Hackeng等人，supra；Schnolzer等人，(1992)Int.J.Pept.Prot.Res.，40180-193；and Kent，S.B.H.(1988)Ann.Rev.Biochem.57，957-984)在一種改進(jìn)的ABI 430A肽合成器上進(jìn)行肽的合成。在鏈裝配好以后，把肽脫保護(hù)，同時(shí)通過用含有5％對(duì)甲基苯酚的無水氟化氫(HF)處理進(jìn)行斷裂，冷凍干燥，通過制備性的HPLC純化。從PeptidesInternational and Midwest Biotech得到Boc保護(hù)的氨基酸。三氟乙酸(TFA)由Halocarbon得到。其它化學(xué)試劑從Fluka或Aldrich得到。分析和制備性的HPLC在一個(gè)Rainin HPLC體系上進(jìn)行，使用分析或制備性的Vydac C4在214nm處進(jìn)行紫外線檢測。肽和蛋白質(zhì)質(zhì)譜在一臺(tái)Sciex API-I電霧化質(zhì)譜儀上進(jìn)行。實(shí)施例22(4′-甲氧基芐基硫基)芐基溴的制備使10mmol，1.4g的2-羥基甲基硫酚在10ml DMF中與10mmol的4-甲氧基芐基氯和1.75ml DIEA在室溫下反應(yīng)。反應(yīng)在10分鐘之內(nèi)完成，加入50ml pH＝3的水。用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物，在硫酸鈉上干燥。然后使得到的粗油與11mmol四溴化碳(3.64g)和11mmol三苯基膦(2.88g)在20ml THF中反應(yīng)。反應(yīng)過夜后，蒸發(fā)THF。通過硅膠色譜法純化產(chǎn)物，用6/1的己烷/乙酸乙酯作為流動(dòng)相?；厥盏?.8g。實(shí)施例3Nα(2-巰基芐基)甘氨酸-肽的制備向與樹脂結(jié)合的含有N-末端的Boc-保護(hù)的Ala(78mg)的肽中加入純TFA以除去Boc基團(tuán)。使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法把Boc-甘氨酸-O-丁二酰亞胺偶合到樹脂上。偶合完成后，除去Boc基團(tuán)，用10％二異丙基乙胺的DMF溶液洗滌兩次進(jìn)行中和，然后用DMF和DMSO洗滌樹脂。然后加入9mg2-(4′-甲氧基芐基硫基)芐基溴在0.2ml DMSO和0.01ml二異丙基乙胺中的溶液，混合物在室溫下反應(yīng)12小時(shí)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法在HF條件下對(duì)肽進(jìn)行斷裂和脫保護(hù)。校正質(zhì)量為2,079Da的峰大約占所有肽物質(zhì)的12％(通過HPLC測定)。用標(biāo)準(zhǔn)的半制備性的HPLC來純化校正的肽。實(shí)施例44′-甲氧基-2-(4′-甲基芐基硫基)苯乙酮的制備把4mmol，0.542ml的4-甲基芐基硫醇和4mmol，916.3mg的4′-甲氧基-2-溴代苯乙酮溶于4ml DMF中。然后加入4mmol0.7ml的二異丙基乙胺。在室溫下攪拌混合物1小時(shí)。把混合物倒入稀鹽酸中，用乙酸乙酯萃取，在硫酸鈉上干燥。把油狀物溶于乙酸乙酯中，加入石油醚進(jìn)行沉淀，回收到450mg白色固體。實(shí)施例51-氨基-1-(4-甲氧基苯基)-2-(4-甲基芐硫基)乙烷的制備把1.44mmol，411mg的4′-甲氧基-2-(4′-甲基芐硫基)苯乙酮和4.3mmol，941mg的氨氧基乙酸溶于20ml TMOF中，在室溫下加入0.047ml甲磺酸作為催化劑催化劑。48小時(shí)后，蒸去溶劑，在乙酸乙酯中浸取殘留物，用1M硫酸氫鉀洗滌，在硫酸鈉上干燥。用硅膠色譜法純化粗產(chǎn)物，得到200mg肟配合物。把200mg 0.556mmol的這種肟配合物溶于2ml THF中，然后加入1.67ml 1M BH3/THF配合物。27小時(shí)后，沒有留下原料。加入3ml水和1.5ml 10N氫氧化鈉?；亓骰旌衔?小時(shí)。然后用乙酸乙酯萃取(4次)混合物，在硫酸鈉上干燥，然后使用硅膠色譜法純化最終產(chǎn)物(40mg)。實(shí)施例6Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-肽的制備向與樹脂結(jié)合的含有N-末端的Boc-保護(hù)的Ala(78mg)的模板肽中加入純的TFA以除去Boc基團(tuán)。使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)方法使溴乙酸與樹脂偶合。然后向樹脂中加入17mg1-氨基-1-(4甲氧基苯基)-2-(4-甲基芐基硫基)乙烷在0.3ml DMSO和0.010ml二異丙基乙胺中的溶液。反應(yīng)過夜后，洗滌樹脂，使用標(biāo)準(zhǔn)的HF方法對(duì)肽進(jìn)行斷裂和脫保護(hù)。然后使用半制備性的HPLC純化所要的產(chǎn)物。另一種Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-肽的制備使用標(biāo)準(zhǔn)的偶合方法使0.1mmol序列為S-Y-R-F-L-聚合物的模板肽樹脂、溴乙酸偶合。偶合后，用DMSO洗滌樹脂，然后加入32.5mg，0.12mmol 1-氨基-1-(4-甲氧基苯基)-2-(4-甲基芐基硫基)乙烷在0.3ml DMSO和0.025ml二異丙基乙胺中的溶液，讓混合物反應(yīng)過夜。使用標(biāo)準(zhǔn)的HF方法對(duì)肽進(jìn)行斷裂和脫保護(hù)。粗?jǐn)嗔旬a(chǎn)物的HPLC顯示，所要的產(chǎn)物(MW 2，122)占所有產(chǎn)物的60％。發(fā)現(xiàn)正烷基乙硫醇基在HF中97％是穩(wěn)定的。實(shí)施例72′，4′-二甲氧基-2-(4′-甲基芐基硫基)苯乙酮的制備把3.94mmol，0.534ml 4-甲基芐基硫醇和3.86mmol，1g 2′，4′-二甲氧基-2-溴苯乙酮溶于4mL DMF中。然后加入3.94mmol0.688moL二異丙基乙胺。在室溫下攪拌混合物24小時(shí)，把混合物倒入1M硫酸氫鉀溶液中，用乙酸乙酯萃取，在硫酸鈉上干燥。蒸發(fā)后，把殘留的油溶于乙酸乙酯中，通過加入石油醚進(jìn)行沉淀，得到616mg白色固體。實(shí)施例81-氨基-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-(4-甲基芐基硫基)乙烷的制備把0.526mmol，166mg 2′，4′-二甲氧基-2-(4′-甲基芐基硫基)苯乙酮和1.59mmol，345mg氨基氧基乙酸溶于6ml TMOF中，在室溫下加入0.034ml甲磺酸作為催化劑。3小時(shí)后，蒸去溶劑，用乙酸乙酯浸取，用1 M硫酸氫鉀洗滌，在硫酸鈉上干燥。用硅膠色譜法純化粗產(chǎn)物，得到126mg(產(chǎn)率61％)肟配合物。把126mg，0.324mmol這種肟配合物溶于1.5ml THF中，然后加入0.973ml 1M BH3/THF配合物。
54小時(shí)后還能發(fā)現(xiàn)原料，加入0.5ml 1M BH3/THF配合物。再反應(yīng)3天后，總共反應(yīng)6天，加入3ml水和1ml 10N氫氧化鈉。回流混合物1h。然后用乙酸乙酯萃取(4次)混合物，在硫酸鈉上干燥。然后用硅膠色譜法純化最終的產(chǎn)物(43mg)。實(shí)施例9Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-肽的制備使用標(biāo)準(zhǔn)的偶合方法使0.1mmol序列為S-Y-R-F-L-聚合物的與樹脂結(jié)合的肽、溴乙酸偶合。偶合后，用DMSO洗滌樹脂，然后加入36mg，0.12mmol 1-氨基-1-(2’，4’-二甲氧基苯基)-2-(4-甲基芐基硫基)乙烷在0.3ml DMSO和0.025ml二異丙基乙胺中的溶液，讓混合物反應(yīng)過夜。使用標(biāo)準(zhǔn)的HF方法對(duì)肽進(jìn)行斷裂和脫保護(hù)。粗?jǐn)嗔旬a(chǎn)物的HPLC顯示，所要的產(chǎn)物(MW938)占所有產(chǎn)物的42％。發(fā)現(xiàn)正烷基乙硫醇基在HF中92％是穩(wěn)定的。實(shí)施例10C-末端SDF1-丙氨酸-硫代酸酯和N-末端Nα-(2-巰基芐基)甘氨酸-肽的Ala-Gly化學(xué)連接為了進(jìn)行6元重排連接，把1mg SDF1-α的C-末端丙氨酸硫代酸酯片斷(MW4429)和0.6mg SDF1-α的N-末端Nα-(2-巰基芐基)甘氨酸片斷(MW2079)溶于100μl 6M，pH7.0的胍緩沖劑中，加入1μl硫酚。在室溫(大約25℃)下反應(yīng)2天后，通過ES-MS證實(shí)形成了所要的連接產(chǎn)物(MW5472)。然后在40℃下把反應(yīng)混合物再培育24小時(shí)，基于通過HPLC積分而測得的產(chǎn)物和未反應(yīng)的C-末端片斷的比例確定所要的連接產(chǎn)物的產(chǎn)率。觀察到的產(chǎn)率大約為40％。實(shí)施例11C-末端SDF1-丙氨酸-硫代酸酯和N-末端Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-肽的Ala-Gly化學(xué)連接為了進(jìn)行5元重排連接，把1mg SDF1的C-末端丙氨酸硫代酸酯片斷(MW4429)和1mg含有一個(gè)末端甘氨酸的帶有一個(gè)Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2巰基乙烷基團(tuán)的N-末端肽模板(MW2122)溶于100μl6M，pH7.0的胍緩沖劑和1μl硫酚中。在室溫(大約25℃)下培育反應(yīng)混合物，監(jiān)測連接反應(yīng)。8小時(shí)后，通過ES-MS證實(shí)形成了所要的連接產(chǎn)物(MW5515)。3天后，基于產(chǎn)物和未反應(yīng)的C-末端片斷的比例所確定的所要的連接產(chǎn)物的產(chǎn)率大約為45％。在室溫下培育3天后，在40℃下再培育24小時(shí)，產(chǎn)率為65％。在室溫下培育3天后，在40℃下再培育48小時(shí)，產(chǎn)率增加到大約70％。
為了進(jìn)行5元重排連接，把0.5mg SDF1-α的C-末端丙氨酸硫代酸酯片斷(MW4429)和0.5mg含有一個(gè)末端甘氨酸的帶有一個(gè)Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2巰基乙烷基團(tuán)的N-末端肽片斷(MW2122)溶于100μl6M，pH8.2的胍緩沖劑和1μl硫酚中。在室溫(大約25℃)下培育反應(yīng)混合物，6小時(shí)后再加入1μl硫酚，24小時(shí)后，所要產(chǎn)物的產(chǎn)率大約為60％。實(shí)施例12C-末端甘氨酸-硫代酸酯和N-末端Nα-(2-巰基芐基)甘氨酸-肽的Gly-Gly化學(xué)連接為了進(jìn)行6元重排連接，把3.5mg的一種十聚體模板肽的C-末端甘氨酸硫代酸酯片斷(MW1357)和2mg含有三個(gè)HisDnp的一種模板肽的N-末端Nα-(2巰基芐基)甘氨酸片斷(MW2079)溶于200μl6M，pH7.9的胍緩沖劑，加入2μl硫酚。將該混合物在33℃培育60小時(shí)。通過ES-MS證實(shí)形成了所要的連接產(chǎn)物(MW2631)。基于產(chǎn)物和未反應(yīng)的N末端片斷的比例，觀察到產(chǎn)率大約為40％。
C-末端甘氨酸-硫代酸酯肽和Nα-1-(4-甲氧基苯基)2-巰基乙烷甘氨酸-肽的化學(xué)連接為了進(jìn)行5元重排連接，把2mgC-末端甘氨酸硫代酸酯片斷(MW1357)和2.5mg具有3個(gè)HisDnp含有一個(gè)Nα-μl(4-甲氧基苯基)2-巰基乙烷基的模板肽的N-末端片斷(MW2122)溶于100μl含1μl硫酚的6M，pH為7.0的胍緩沖劑中。在室溫(～25℃)下培育反應(yīng)混合物，監(jiān)測連接反應(yīng)。通過ES-MS證實(shí)所要的連接產(chǎn)物的生成(MW2675.9g)。24小時(shí)后，其于產(chǎn)物和未反應(yīng)的N-末端片斷的比例，所要連接產(chǎn)物的產(chǎn)率約為40％.然后通過加入固體碳酸氫鈉把pH升高到8.2，再培育反應(yīng)混合物24小時(shí)，使產(chǎn)率達(dá)到88％。實(shí)施例13Larc-丙氨酸-硫代酸酯與Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-肽的Ala-Gly化學(xué)連接把3mg小鼠Larc1-31的丙氨酸C末端肽硫代酸酯(MW3609)和1mg模板肽Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-S-Y-R-F-L(MW908)溶于0.15ml6M，pH8.2的胍緩沖劑和0.03ml硫酚中，攪拌過夜后，連接完成了81％，在40小時(shí)后，連接完成了92％(根據(jù)肽硫代酸酯的消耗計(jì))。預(yù)期的連接產(chǎn)物的分子量為4312Da，測定值為4312Da.實(shí)施例14Larc1-31-丙氨酸-硫代酸酯與Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸肽的Ala-Gly化學(xué)連接把3mg小鼠Larc1-31的丙氨酸C末端肽硫代酸酯(MW3609)和1mg模板肽Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-S-Y-R-F-L(MW938)溶于0.15ml6M，pH8.2的胍緩沖劑和0.03ml硫酚中，攪拌過夜后，連接完成了73％，在40小時(shí)后，連接完成了85％(根據(jù)肽硫代酸酯的消耗計(jì))。連接產(chǎn)物的分子量的計(jì)算值和試驗(yàn)值都是為4342Da.實(shí)施例15C-末端三肽甘氨酸硫代酸酯和N-末端Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-肽的Gly-Gly化學(xué)連接把0.8mg肽片斷FGG-硫代酸酯和1mg模板肽Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-S-Y-R-F-L(MW938)溶于0.1ml6M，pH8.2的胍緩沖劑和0.02ml硫酚中。攪拌過夜后，反應(yīng)定量地完成。連接產(chǎn)物的分子量的計(jì)算值和試驗(yàn)值分別為1199.4Da和1195.5Da。實(shí)施例16從連接產(chǎn)物中除去1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巰基乙烷1mg實(shí)施例15的純凈連接產(chǎn)物溶于0.95ml TFA和0.025ml水及0.025ml TIS中。1小時(shí)后，蒸去溶劑，加入50％水/乙腈溶液，把混合物冷凍干燥。通過HPLC測得斷裂完成了95％以上。分子量的計(jì)算值和試驗(yàn)值為1003Da。實(shí)施例17C-末端三肽甘氨酸硫代酸酯和N-末端Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-肽的Gly-Gly化學(xué)連接把一種三肽的肽片斷硫代酸酯、1.6mg FGG-硫代酸酯和2mg模板肽Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-S-Y-R-F-L(MW908)溶于0.2ml6M，pH8.2的胍緩沖劑中，加入0.04ml硫酚，攪拌過夜后，反應(yīng)定量地完成。連接產(chǎn)物的分子量的預(yù)期值為1169.4Da，測定值為1169.5Da.實(shí)施例18連接后，1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷基團(tuán)的消去在-2℃下，用含有5％HF的對(duì)甲基苯酚處理實(shí)施例17的純凈連接產(chǎn)物1小時(shí)。蒸去HF后，用乙醚沉淀連接產(chǎn)物。用含有0.1％TFA的50％的水/乙腈浸取粗肽，噴射到HPLC上。主峰＞80％，表明是經(jīng)過斷裂的肽的預(yù)期分子量(預(yù)期質(zhì)量為1003Da，測定值為1003Da)。實(shí)施例19C-末端組氨酸-硫代酸酯和N-末端Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-肽的His-Gly化學(xué)連接把4mg肽片斷TBP-A1-67CαHis硫代酸酯和1mg模板肽Nα-1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-S-Y-R-F-L(MW938)溶于0.1ml6M，pH8.2的胍緩沖劑和0.02ml硫酚中。攪拌過夜后，根據(jù)肽硫代酸酯的消耗計(jì)反應(yīng)完成了87％。連接產(chǎn)物的預(yù)期分子量為9220Da，測定值為9220Da。實(shí)施例20連接后，1-(2，4-二甲氧基苯基)-2-巰基乙烷基團(tuán)的除去把2mg經(jīng)過H-G連接并且純凈的肽片斷溶于0.95ml TFA和0.025ml水及0.025ml TIS中。1小時(shí)后，蒸去溶劑，向殘留物中加入50％的水/乙腈溶液，把混合物冷凍干燥。通過HPLC測得斷裂完成了90％。預(yù)期的分子量為9023Da，測定值為9024Da.實(shí)施例21通過擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接合成細(xì)胞色素把3mg細(xì)胞色素1-63的C-末端硫代酸酯(MW7349，0.4μmol)和1.5mg N-末端Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸細(xì)胞色素b562的殘基64-106(MW4970，0.3μmol)溶于0.1ml含有0.002ml硫酚催化劑的6M，pH7的胍連接緩沖劑中，參見圖5A。24小時(shí)后，向混合物中加入0.025ml2-巰基乙醇，持續(xù)反應(yīng)45分鐘，然后加入15mg TCEP。再攪拌30分鐘后，把連接混合物裝載到半制備性的HPLC中。在把漏出組分洗脫下來并對(duì)混合物脫鹽后，通過把梯度傾斜到65％B來把連接混合物的所有組份都洗脫下來，收集在唯一的一個(gè)瓶子中。對(duì)脫鹽后的物質(zhì)進(jìn)行的HPLC分析表明，根據(jù)C末端肽的消耗計(jì)連接完成了90％以上。HPLC顯示了具有計(jì)算和預(yù)期的分子量11,946Da的兩個(gè)主峰(非對(duì)映異構(gòu)體)，參見圖5B和6A。
細(xì)胞色素b562(1-106)的氨基酸序列如下所示ADLEDNMETL NDNLKVIEKA DNAAQVKDAL TKMRAAALDAQKATPPKLED KSPDSPEMKD FRHGFDILVG QIDDALKLANEGKVKEAQAA AEQLKTTRNA YHQKYR(SEQ ID NO1)分子量的計(jì)算值(平均同位素組成)為11780.3DaN-末端基團(tuán)HC-末端基團(tuán)游離酸MH+單同位素分子量＝11774.0088原子單位HPLC指標(biāo)＝249.80MH+平均分子量＝11781.2781原子單位Bull & Breese值＝1.5360元素組成C508 H830 N147 O168 S3
用戶規(guī)定的氨基酸殘基B-HisDNP實(shí)施例22從連接后的細(xì)胞色素b562的殘基1-106中除去1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷基團(tuán)并且產(chǎn)生天然的蛋白質(zhì)在除去1-(4甲氧基苯基)-2-巰基乙烷基團(tuán)之前，把脫鹽后的溶液冷凍干燥。在-2℃下，用含有5％苯甲醚的95％HF和1mmol半胱氨酸(121mg)對(duì)冷凍干燥的物質(zhì)處理1小時(shí)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法蒸去HF，然后加入100ml50％的緩沖劑B，把混合物冷凍干燥。然后使用半制備性的HPLC純化混合物，得到2mg純化的只有一個(gè)峰的天然的細(xì)胞色素1-106(純化后，產(chǎn)率為56％)，分子量的計(jì)算值和測定值為11,780Da，參見圖6B和7A。
還以同樣的方式合成了野生型的細(xì)胞色素b562的類似物，命名為S1m7 cyt b562。S1m7 cyt b562突變體不同于野生型，它用一種硒代甲硫氨酸(甲硫氨酸的硫被其同族的硒替換)代替了7-位的甲硫氨酸。進(jìn)行了圓二色性測定，表明在遠(yuǎn)緣野生型b562和遠(yuǎn)緣S1m7 b562中α-螺旋的含量都很高(數(shù)據(jù)沒有顯示出來)。ESMS也表明，遠(yuǎn)緣野生型b562和遠(yuǎn)緣S1m7 b562都具有預(yù)期的分子量(數(shù)據(jù)沒有顯示出來)。用血紅素(血紅素pH7 NaPi，過夜，室溫)重建遠(yuǎn)緣蛋白質(zhì)，通過離子交換FPLC(FPLC純化Resource Q，Tris HCL pH8，NaCl梯度)純化所得的蛋白質(zhì)，例如參見圖7B。已發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過血紅素重建后的蛋白質(zhì)的紫外-可見光譜與硫或硒對(duì)Fe的配位一致(數(shù)據(jù)沒有顯示出來)。還以同樣的方式制備了一種含有等位的異量氨酸的非配位的cyt b562變異體。這樣就使用擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接制得了合成的細(xì)胞色素，對(duì)它們的血紅素活性位點(diǎn)進(jìn)行了重建，并且通過生物物理方法完全進(jìn)行了表征。因此，該實(shí)施例進(jìn)一步表明，沒有適用于原始的天然的化學(xué)連接方法的半胱氨酸的肽和蛋白質(zhì)可以通過擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接方法和引入其中的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸制得。例如，已經(jīng)對(duì)許多cyt b562突變體的折疊和反應(yīng)性進(jìn)行了研究，但是遠(yuǎn)緣非天然的軸向配位體還仍然沒有開發(fā)出來。結(jié)合擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接，巨大數(shù)目的可得到的非天然氨基酸應(yīng)當(dāng)允許對(duì)這些蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)的性能進(jìn)行系統(tǒng)性的協(xié)調(diào)。實(shí)施例23MCP1-35-賴氨酸-硫代酸酯與Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-肽的Lys-Gly化學(xué)連接把3mg MCP1-35賴氨酸C末端肽硫代酸酯和1mg模板肽Nα-1-(4-甲氧基苯基)2-巰基乙烷甘氨酸-S-Y-R-F-L(MW908)溶于0.15ml6M，pH7的胍緩沖劑中，通過加入三乙胺和0.03ml硫酚調(diào)節(jié)到pH7.2。攪拌過夜后，連接完成了69％。40小時(shí)后，根據(jù)肽硫代酸酯的消耗計(jì)連接完成了76％。連接產(chǎn)物的預(yù)期分子量為4893Da，測定值為4893Da實(shí)施例24連接后，除去1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷基團(tuán)把冷凍干燥的脫鹽后的實(shí)施例23的粗產(chǎn)物(Lys-Gly連接)溶于1mg TFA、25μl乙二硫醇、50μl TIS中，然后加入150μl溴代三甲基硅烷。在室溫下讓反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)。在真空下蒸去揮發(fā)性組分，用6M，pH7.5的胍緩沖劑浸取殘留的油狀物。用氯仿萃取有機(jī)物質(zhì)，HPLC顯示不再有原料，因此，助劑基團(tuán)已經(jīng)成功地除去了。
天然序列的預(yù)期分子量為4726Da，而測定值為4725Da。實(shí)施例25對(duì)GSYRFL肽的連接進(jìn)行的比較研究對(duì)實(shí)施例13-20和24的GSYRFL肽的5元重排連接進(jìn)行了比較研究，如下列表V中所歸納的。
表V對(duì)GSYRFL肽的連接的研究結(jié)果
注意N-末端助劑I＝Nα-1-(4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-SYRFL，而N-末端助劑II＝Nα-1-(2，4-甲氧基苯基)-2-巰基乙烷甘氨酸-SYRFL實(shí)施例26Boc甘氨酸N-1-(4′-甲氧基苯基)-2-(4′-甲基芐基硫基)乙烷的制備把2mmol，572mg 4′-甲氧基-2-(4′-甲基芐基硫基)苯乙酮和2mmol，139.5mg甘氨酸乙酯鹽酸鹽懸浮于15ml DCM中。緩慢加入6mmol，1g DIEA，在氮?dú)夥障录尤?ml四氯化鈦(1M溶液)。在室溫下持續(xù)反應(yīng)2天。然后加入6mmol，0.4g氰基硼氫化鈉在2.5ml無水甲醇中的溶液。TLC顯示出一個(gè)大約40％的一種新產(chǎn)物的斑點(diǎn)，純化后通過NMR鑒定為N-1-(4-甲氧基苯基)-2-(4-甲基芐基硫基)乙烷甘氨酸乙酯。
然后把1mmol 374mg N-1-(4-甲氧基苯基)-2-(4-甲基芐基硫基)乙烷甘氨酸乙酯溶于2ml THF中，向溶液中加入2mmol，83mg LiOH水合物。攪拌過夜后，該酯已經(jīng)被完全水解。在真空下除去THF，用2ml DMF浸取產(chǎn)物，加入5mmol，1.1g重碳酸二丁酯，最后加入3mmol DIEA，0.45ml。反應(yīng)過夜后，加入稀的鹽酸水溶液，用乙酸乙酯萃取(三次)最終產(chǎn)物。
現(xiàn)在已經(jīng)對(duì)本發(fā)明作了充分的說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)明白，可以在不偏離所附的權(quán)利要求書的精神或保護(hù)范圍的情況下對(duì)本發(fā)明作許多改變和改進(jìn)。
序列表<110>格萊風(fēng)科學(xué)公司Botti，PaoloBradburne，James A.
Kent，Stephen B.H.
Low，Donald W.<120>擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接<130>GRFN035/01 WO 03504.291<140><141><150>60/231,339<151>2000-09-08<160>1<170>專利(版本2.1)<210>1<211>106<212>PRT<213>人類<400>1Ala Asp Leu Glu Asp Asn Met Glu Thr Leu Asn Asp Asn Leu Lys Val15 10 15Ile Glu Lys Ala Asp Asn Ala Ala Gln Val Lys Asp Ala Leu Thr Lys20 25 30Met Arg Ala Ala Ala Leu Asp Ala Gln Lys Ala Thr Pro Pro Lys Leu35 40 45Glu Asp Lys Ser Pro Asp Ser Pro Glu Met Lys Asp Phe Arg His Gly50 55 60Phe Asp Ile Leu Val Gly Gln Ile Asp Asp Ala Leu Lys Leu Ala Asn65 70 75 80Glu Gly Lys Val Lys Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Gln Leu Lys Thr
85 90 95Thr Arg Asn Ala Tyr His Gln Lys Tyr Arg100 10權(quán)利要求
1.下式的N-取代的酰胺化合物J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 I或J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 II其中J1和J2獨(dú)立地為具有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或這樣的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、連接體或可檢測的標(biāo)記物或與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的其它化合物部分；而R1、R2和R3獨(dú)立地為H或一種與C1共軛的給電子基團(tuán)；條件是至少R1、R2和R3中的一個(gè)包含一個(gè)與C1共軛的該給電子基團(tuán)。
2.權(quán)利要求1的N-取代的酰胺化合物，其中所說的化合物具有所說的式I。
3.權(quán)利要求2的N-取代的酰胺化合物，其中C1(R1)選自A、B和C 其中R1′、R3′和R5′包含可以相同或不同的給電子基團(tuán)。
4.權(quán)利要求1的N-取代的酰胺化合物，其中所說的化合物具有所說的式II。
5.權(quán)利要求4的N-取代的酰胺化合物，其中C1(R1)-C2(R2)C3(R3)選自D、E、F、G、H和I 其中R1′、R3′和R5′中的一個(gè)或多個(gè)包含一個(gè)可以相同或不同的給電子基團(tuán)。
6.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中所說的取代的N是一個(gè)Nα-取代的酰胺。
7.權(quán)利要求3或5的N-取代的酰胺化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一個(gè)包含一個(gè)強(qiáng)給電子基團(tuán)。
8.權(quán)利要求7的N-取代的酰胺化合物，其中所說的強(qiáng)給電子基團(tuán)選自甲氧基(-OCH3)、巰基(-SH)、羥基(-OH)和甲硫基(-SCH3)。
9.權(quán)利要求3或5的N-取代的酰胺化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一個(gè)包含一個(gè)中等的給電子基團(tuán)。
10.權(quán)利要求8的N-取代的酰胺化合物，其中所說的中等的給電子基團(tuán)包括甲基(-CH3)、乙基(-CH2-CH3)、丙基(-CH2-CH2-CH3)和異丙基(-CH2(CH3)3)。
11.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J1是具有一個(gè)或多個(gè)選擇性地受保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽，或者是這樣的肽或多肽部分。
12.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一種聚合物。
13.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一種染料。
14.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一種官能化的表面。
15.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一個(gè)連接體或可檢測的標(biāo)記物。
16.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J2是具有一個(gè)或多個(gè)選擇性地受保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽，或者是這樣的肽或多肽部分。
17.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J2是一種聚合物、染料、官能化的表面、連接體或可檢測的標(biāo)記物或與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的其它化合物部分。
18.一種式HS-C2-C1(R1)-HN-J2(III)或式HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-HN-J2(IV)的酸穩(wěn)定的N-取代的C2或C3鏈氨基烷基或芳基硫醇化合物，其中J1和J2獨(dú)立地為含有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保擴(kuò)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或這樣的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、連接體或可檢測的標(biāo)記物或與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的其它化合物部分；而R1、R2和R3獨(dú)立地為H或一種與C1共軛的給電子基團(tuán)；條件是至少R1、R2和R3中的一個(gè)包含一個(gè)與C1共軛的給電子基團(tuán)。
19.權(quán)利要求18的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物，其中所說的化合物具有式III。
20.權(quán)利要求19的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物，其中C1(R1)選自A、B和C 其中R1′、R3′和R5′中的一個(gè)或多個(gè)包含一個(gè)可以相同或不同的給電子基團(tuán)。
21.權(quán)利要求18的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物，其中所說的化合物具有所說的式IV。
22.權(quán)利要求21的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物，其中C3(R3)C2(R2)-C1(R1)選自D、E、F、G、H和I 其中R1′、R3′和R5′中的一個(gè)或多個(gè)包含一個(gè)可以相同或不同的給電子基團(tuán)。
23.權(quán)利要求18-22任一項(xiàng)的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物，其中所說的取代的N是一種Nα-取代的化合物。
24.權(quán)利要求20或22任一項(xiàng)的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物，其中至少R1′，R3′和R5′中的一個(gè)包含一個(gè)強(qiáng)給電子基團(tuán)。
25.權(quán)利要求24的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物，其中所說的強(qiáng)給電子基團(tuán)選自甲氧基(OCH3)、硫羥(-SH)、羥基(-OH)和甲硫基(-SCH3)。
26.權(quán)利要求20或22任一項(xiàng)的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一個(gè)包含一個(gè)中等的給電子基團(tuán)。
27.權(quán)利要求26的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物，其中所說的中等的給電子基團(tuán)包括甲基(-CH3)、乙基(-CH2-CH3)、丙基(-CH2-CH2-CH3)和異丙基(-CH2(CH3)3)。
28.權(quán)利要求18、19或21任一項(xiàng)的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物，其中J2是含有一個(gè)或多個(gè)選擇性地受保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽，或者是這樣的肽或多肽部分。
29.權(quán)利要求18、19或21任一項(xiàng)的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物，其中J2是一種聚合物、染料、官能化的表面、連接體或可檢測的標(biāo)記物或與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的其它化合物部分。
30.一種式J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2(I)或式J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)J2(II)的N-取代的酰胺化合物，其中J1和J2獨(dú)立地為含有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或這樣的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、連接體或可檢測的標(biāo)記物或與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的其它化合物部分；而R1、R2和R3獨(dú)立地為H或一種與C1共軛的給電子基團(tuán)；條件是至少R1、R2和R3中的一個(gè)包含一個(gè)與C1共軛的該給電子基團(tuán)；該酰胺化合物是通過把包含式J1-C(O)SR的α-羧基硫代酸酯的第一種組分與包含一種下式III或IV的酸穩(wěn)定的N-取代的C2或C3鏈氨基烷基或芳基硫醇的第二種組分連接的方法生產(chǎn)的HS-C2-C1(R1)-HN-J2 III或HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-HN-J2 IV其中R1、R2和R3獨(dú)立地為H或一種與C1共軛的給電子基團(tuán)；條件是至少R1、R2和R3中的一個(gè)包含一個(gè)與C1共軛的給電子基團(tuán)。
31.權(quán)利要求30的N-取代的酰胺化合物，其中所說的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物具有式III。
32.權(quán)利要求31的N-取代的酰胺化合物，其中所說的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物的C1(R1)選自A、B和C。 其中R1′、R3′和R5′中的一個(gè)或多個(gè)包含一個(gè)可以相同或不同的給電子基團(tuán)。
33.權(quán)利要求30的N-取代的酰胺化合物，其中所說的化合物具有式IV。
34.權(quán)利要求33的N-取代的酰胺化合物，其中C1(R1)-C2(R2)C3(R3)選自D、E、F、G、H和I 其中R1′、R3′和R5′中的一個(gè)或多個(gè)包含一個(gè)可以相同或不同的給電子基團(tuán)。
35.權(quán)利要求30-34的任意一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中所說的取代的N是一種Nα-取代的化合物。
36.權(quán)利要求32或34的N-取代的酰胺化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一個(gè)包含一個(gè)強(qiáng)給電子基團(tuán)。
37.權(quán)利要求36的N-取代的酰胺化合物，其中強(qiáng)給電子基團(tuán)選自甲氧基(OCH3)、硫羥(-SH)、羥基(-OH)和甲硫基(-SCH3)。
38.權(quán)利要求32或34的N-取代的酰胺化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一個(gè)包含一個(gè)中等的給電子基團(tuán)。
39.權(quán)利要求38的N-取代的酰胺化合物，其中所說的中等的給電子基團(tuán)包括甲基(-CH3)、乙基(-CH2-CH3)、丙基(-CH2-CH2-CH3)和異丙基(-CH2(CH3)3)。
40.權(quán)利要求30、31或33任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一種含有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或這樣的肽或多肽部分。
41.權(quán)利要求30、31或33任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一種聚合物。
42.權(quán)利要求30、31或33任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一種染料。
43.權(quán)利要求30、31或33任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一種官能化的表面。
44.權(quán)利要求30、31或33任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一種連接體或可檢測的標(biāo)記物。
45.權(quán)利要求30、31或33任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一種含有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或這樣的肽或多肽部分。
46.權(quán)利要求30、31或33任一項(xiàng)的N-取代的酰胺化合物，其中J1是一種聚合物、染料、官能化的表面、連接體或可檢測的標(biāo)記物或與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的其它化合物部分。
47.一種式J1-C(O)-HN-J2(V)的化合物，其中J1和J2獨(dú)立地為具有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或這樣的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、連接體或可檢測的標(biāo)記物或與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的其它化合物部分；該化合物是通過下列方法生產(chǎn)的(A)把包含式J1-C(O)SR的羧基硫代酸酯的第一種組分與包含一種下式III的酸穩(wěn)定的N-取代的C2或C3鏈氨基烷基或芳基硫醇的第二種組分連接HS-C2-C1(R1)-HN-J2 III其中R1是一種與C1共軛的給電子基團(tuán)；從而形成一個(gè)下式的N-取代的酰胺鍵合的連接產(chǎn)物J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 (I)，和(B)通過斷裂N-C1鍵而從該N取代的酰胺鍵合的連接產(chǎn)物中除去C2鏈烷基或芳基硫醇。
48.一種式J1-C(O)-HN-J2(V)的化合物，其中J1和J2獨(dú)立地為含有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或這樣的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、連接體或可檢測的標(biāo)記物或與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的其它化合物部分；該化合物是通過下列方法生產(chǎn)的(A)把包含式J1-C(O)SR的羧基硫代酸酯的第一種組分與包含一種下式IV的酸穩(wěn)定的N-取代的C2或C3鏈氨基烷基或芳基硫醇的第二種組分連接HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-HN-J2IV其中R1、R2和R3獨(dú)立地為H或一種與C1共軛的給電子基團(tuán)；條件是至少R1、R2和R3中的一個(gè)包含一個(gè)與C1共軛的給電子基團(tuán)；從而形成一個(gè)下式II的N-取代的酰胺鍵合的連接產(chǎn)物J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2(II)，和(B)通過斷裂N-C1鍵而從所說的N取代的酰胺鍵合的連接產(chǎn)物中除去C3鏈烷基或芳基硫醇。
49.權(quán)利要求47的化合物，其中所說的酸穩(wěn)定的N取代的化合物的C1(R1)選自A、B和C 其中R1′、R3′和R5′中的一個(gè)或多個(gè)包含一個(gè)可以相同或不同的給電子基團(tuán)。
50.權(quán)利要求48的化合物，其中所說的酸穩(wěn)定的N取代的化合物的C3(R3)-C2(R2)C1(R1)選自D、E、F、G、H和I 其中R1′、R3′和R5′中的一個(gè)或多個(gè)包含一個(gè)可以相同或不同的給電子基團(tuán)。
51.權(quán)利要求47-50的任意一項(xiàng)的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物，其中所說的N-取代的化合物是一種Nα-取代的化合物。
52.權(quán)利要求49或50的化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一個(gè)包含一個(gè)強(qiáng)給電子基團(tuán)。
53.權(quán)利要求52的化合物，其中所說的強(qiáng)給電子基團(tuán)選自甲氧基(OCH3)、硫羥(-SH)、羥基(-OH)和甲硫基(-SCH3)。
54.權(quán)利要求49或50的N-取代的酰胺化合物，其中至少R1′、R3′和R5′中的一個(gè)包含一個(gè)中等的給電子基團(tuán)。
55.權(quán)利要求54的化合物，其中所說的中等的給電子基團(tuán)包括甲基(-CH3)、乙基(-CH2-CH3)、丙基(-CH2-CH2-CH3)和異丙基(-CH2(CH3)3)。
56.權(quán)利要求47或48的化合物，其中J1是一種含有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽。
57.權(quán)利要求47或48的化合物，其中J1是一種含有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的多肽。
58.權(quán)利要求47或48的化合物，其中J1是一種聚合物。
59.權(quán)利要求47或48的化合物，其中J1是一種染料。
60.權(quán)利要求47或48的化合物，其中J1是一種官能化的表面。
61，權(quán)利要求47或48的化合物，其中J1是一種連接體或可檢測的標(biāo)記物。
62.權(quán)利要求47或48的化合物，其中J2是一種含有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或這樣的肽或多肽部分。
63.權(quán)利要求47或48的化合物，其中J2是一種聚合物、染料、官能化的表面、連接體或可檢測的標(biāo)記物或與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的其它化合物部分。
64.一種生產(chǎn)式J1-C(O)-HN-J2(V)化合物的方法，其中J1和J2獨(dú)立地為含有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或這樣的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、連接體或可檢測的標(biāo)記物或與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的其它化合物部分；其中所說的方法包括下列步驟(A)把包含式J1-C(O)SR的羧基硫代酯的第一種組分與包含一種下式III的酸穩(wěn)定的N-取代的C2或C3鏈氨基烷基或芳基硫醇的第二種組分連接HS-C2-C1(R1)-HN-J2III其中R1是一種與C1共軛的給電子基團(tuán)從而形成一個(gè)下式的N-取代的酰胺鍵合的連接產(chǎn)物J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2I(B)通過斷裂Nα-C1鍵而從所說的N-取代的酰胺鍵合的連接產(chǎn)物中除去C2鏈烷基或芳基硫醇。
65.一種生產(chǎn)式J1-C(O)-HN-J2(V)化合物的方法，其中J1和J2獨(dú)立地為含有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或這樣的肽或多肽部分、聚合物、染料、官能化的表面、連接體或可檢測的標(biāo)記物或與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的其它化合物部分；其中所說的方法包括下列步驟(A)把包含式J1-C(O)SR的羧基硫代酸酯的第一種組分與包含一種下式IV的酸穩(wěn)定的N-取代的C2或C3鏈氨基烷基或芳基硫醇的第二種組分連接HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-HN-J2 IV其中R1、R2和R3獨(dú)立地為H或一種與C1共軛的給電子基團(tuán)；條件是至少R1、R2和R3中的一個(gè)包含一個(gè)與C1共軛的給電子基團(tuán)；從而形成一個(gè)下式的N-取代的酰胺鍵合的連接產(chǎn)物J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2(II)(B)通過斷裂Nα-C1鍵而從所說的N取代的酰胺鍵合的連接產(chǎn)物中除去C3鏈烷基或芳基硫醇。
66.權(quán)利要求64的方法，其中所說的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物的C1(R1)選自A、B和C 其中R1′、R3′和R5′中的一個(gè)或多個(gè)包含一個(gè)可以相同或不同的給電子基團(tuán)。
67.權(quán)利要求48的方法，其中所說的酸穩(wěn)定的N-取代的化合物的C3(R3)-C2(R2)C1(R1)選自D、E、F、G、H和I 其中R1′、R3′和R5′中的一個(gè)或多個(gè)包含一個(gè)可以相同或不同的給電子基團(tuán)。
68.權(quán)利要求64-67的任意一項(xiàng)的方法，其中所說的N-取代的化合物是一種Nα-取代的化合物。
69.權(quán)利要求66或67的方法，其中至少R1′、R3′和R5′中的一個(gè)包含一個(gè)強(qiáng)給電子基團(tuán)。
70.權(quán)利要求66的方法，其中所說的N-取代的化合物的所說的強(qiáng)給電子基團(tuán)選自甲氧基(OCH3)、硫羥(-SH)、羥基(-OH)和甲硫基(-SCH3)。
71.權(quán)利要求66或67的方法，其中所說的N-取代的化合物的R1′、R3′和R5′中至少一個(gè)包含一個(gè)中等的給電子基團(tuán)。
72.權(quán)利要求71的方法，其中所說的N-取代的化合物的所說的中等的給電子基團(tuán)包括甲基(-CH3)、乙基(-CH2-CH3)、丙基(-CH2-CH2-CH3)和異丙基(-CH2(CH3)3)。
73.權(quán)利要求66或67的方法，其中J1是一種含有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或這樣的肽或多肽的部分。
74.權(quán)利要求66或67的任意一項(xiàng)的方法，其中J1是一種聚合物。
75.權(quán)利要求66或67的方法，其中J1是一種染料。
76.權(quán)利要求66或67的任意一項(xiàng)的方法，其中J1是一種官能化的表面。
77，權(quán)利要求66或67的任意一項(xiàng)的方法，其中J1是一種連接體或可檢測的標(biāo)記物。
78.權(quán)利要求66或67的任意一項(xiàng)的方法，其中J2是一種含有一個(gè)或多個(gè)選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或這樣的肽或多肽部分。
79.權(quán)利要求66或67的任意一項(xiàng)的方法，其中J2是一種聚合物、染料、官化的表面、連接體或可檢測的標(biāo)記物或與肽的化學(xué)合成或擴(kuò)展的天然的化學(xué)連接相容的其它化合物部分。
80.權(quán)利要求66或67的任意一項(xiàng)的方法，其中所說的化合物是在溶液中合成的。
81.權(quán)利要求66或67的任意一項(xiàng)的方法，其中所說的化合物是通過固定到一種固體載體上來合成的。
全文摘要
本發(fā)明針對(duì)用于對(duì)組分進(jìn)行化學(xué)連接，從而得到一種在連接位點(diǎn)處具有N－取代的酰胺鍵的連接產(chǎn)物方法和組合物，其中組分包括含有一個(gè)羧基硫代酸酯。優(yōu)選α－羧基硫代酸酯部分的第一種組分和含有一個(gè)N－取代的，優(yōu)選Nα－取代的C2或C3的鏈烷基或芳基硫醇。本發(fā)明的反應(yīng)物是化學(xué)選擇性的，和烷基和芳基硫醇可以從連接產(chǎn)物中除去。除去烷基或芳基硫醇，在連接位點(diǎn)處產(chǎn)生一種天然的酰胺鍵。本發(fā)明的方法和組合物特別用于連接肽和多肽。本發(fā)明的連接體系可用于很多種分子，因而可用于生產(chǎn)肽、多肽和其它含有氨基酸的在連接位點(diǎn)處具有天然的酰胺鍵的聚合物。
文檔編號(hào)C07K5/087GK1452632SQ01815351
公開日2003年10月29日 申請(qǐng)日期2001年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月8日
發(fā)明者P·博蒂, J·A·布拉德博尼, S·B·H·肯特, D·W·羅 申請(qǐng)人:格萊風(fēng)治療公司