專利名稱：表達(dá)為不溶性聚集體的重組蛋白質(zhì)的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表達(dá)于細(xì)菌宿主細(xì)胞中且以不溶性聚集體形式沉淀(包埋體)的重組蛋白質(zhì)的溶解與純化方法。純化基于將所述包埋體用有機(jī)變性試劑并使用色譜法轉(zhuǎn)化為可溶形式。此處選用無機(jī)的，堿性的，含鹽的洗脫劑，其在純化完成后使重組蛋白質(zhì)在中和后可以成為能夠直接用于醫(yī)藥用途且為生理學(xué)可接受的形式。該方法特別適用于純化過敏原和過敏原片斷。
本發(fā)明方法在制藥(GMP)必需的條件下進(jìn)行。藥物活性成分在溶解后作為胃腸外用藥物制劑而直接使用。用本發(fā)明方法制備的優(yōu)選的重組過敏原或過敏原變體既可用于改善性治療也可用于過敏疾病的診斷。
在用細(xì)菌或原核生物宿主細(xì)胞如，例如大腸菌制備重組蛋白質(zhì)時(shí)通常遇到的問題在于表達(dá)的蛋白質(zhì)通常不具有為完全顯示其生物活性所需的正確的或天然的折疊。不正確的折疊通常產(chǎn)生一系列不溶于表達(dá)介質(zhì)或以聚集體形式沉淀的蛋白質(zhì)，后者在科學(xué)文獻(xiàn)中被稱作“包埋體”?！鞍耋w”的形成對(duì)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)的純化和獲得溶解性有不利影響(Marston等，1986，Biochem J.2401-12)。為了能夠純化沉淀于細(xì)菌中的重組蛋白質(zhì)，通常在色譜洗脫劑中加入變性物質(zhì)如，例如尿素或胍鹽酸鹽。但是，這些添加劑無法與每一個(gè)分離方法如，例如憎水作用色譜法相結(jié)合。而且，產(chǎn)品可能被以不利的方式通過化學(xué)反應(yīng)修飾，例如被氰酸鹽修飾，其可在尿素溶液中形成。變性試劑的脫除及因此可能的復(fù)性通常通過透濾，透析或膠濾完成。這些過程不僅耗時(shí)而且經(jīng)常導(dǎo)致產(chǎn)品的再沉淀。對(duì)于最終產(chǎn)品中上述變性試劑的徹底除去的分析檢測(cè)是困難的。上述問題對(duì)于重組過敏原和過敏原變體的制備和純化特別重要。
近年來1型過敏在全球迅速增加。工業(yè)化國家中人口的20％患上了過敏性鼻炎，結(jié)膜炎或支氣管哮喘，它們由空氣中存在的過敏原引起(氣源性致敏源)，后者具有不同來源如植物花粉，螨蟲，哺乳動(dòng)物(貓，狗，馬)和霉菌真菌。昆蟲如，例如蜜蜂和黃蜂的叮咬也會(huì)引起嚴(yán)重的過敏。
引起1型過敏的物質(zhì)為蛋白質(zhì)，糖蛋白或多肽。在通過黏膜或在叮咬被吸收后，這些過敏原與敏化人體內(nèi)肥大細(xì)胞表面鍵聯(lián)的IgE抗體反應(yīng)。如果兩個(gè)或多個(gè)IgE抗體彼此通過過敏原相聯(lián)，將導(dǎo)致調(diào)節(jié)劑(例如，組胺，前列腺素)的分泌和分裂效應(yīng)細(xì)胞分泌細(xì)胞分裂素并從而引起過敏癥狀。在cDNA序列的幫助下，可以制備可用于過敏的治療及診斷的重組過敏原(Scheiner und Kraft，1995，Allergy 50，384-391)。重組過敏原在診斷方法中與傳統(tǒng)析取相比具有特別的重要性，其可辯識(shí)出個(gè)體的IgE敏化譜。另外，可對(duì)重組過敏原進(jìn)行特定的基因工程修改，從而可以在不改變與調(diào)控T助細(xì)胞反應(yīng)性的前提下減少過敏的可能。(Schramm等，1999，J.Immunol.162(4)2406-2414；Valenta等，1999，Biol.Chem.380815-24；Singh等，1999，Int.Arch.Allergy Immunol.11975-85)。這一類型的過敏原變體可能在未來用于1型過敏的特別的免疫療法。特別地，進(jìn)行了后一種修改的過敏原是本發(fā)明方法的主題。
就此而論，通常使用的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中制備的重組過敏原及過敏變體具有特別的重要性。與真核細(xì)胞系統(tǒng)相比，這些系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于只需短的表達(dá)時(shí)間即可得到高的產(chǎn)品收率。另外，其從藥理學(xué)角度說其基本不存在病毒污染與致癌風(fēng)險(xiǎn)。但是，當(dāng)其在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中重組制備時(shí)，來自不同來源的主過敏原如，例如1族(Vrtala等，1996，J.Allergy Clin.Immunol.97781-7)和13族(Suck等，2000，Clin.Exp.Allergy 30324-332)花粉過敏原，Der f2螨蟲過敏原(Iwamoto等，1996，Int.Arch.Allergy Immunol.109356-61)和磷脂酶A2與透明質(zhì)酸酶昆蟲毒素過敏原(Soldatova等，1998，J.Allergy Clin.Immunol.101691-8；Kuchler等，1989，Eur.J.Biochem.184249-254)，以包埋體的形式沉淀于宿主細(xì)胞中。過敏原變體如，例如主樺花粉過敏原Bet v1的片斷或多聚體(片斷A，片斷B，Bet v1三聚體)的行為方式與之相同，盡管未修改的重組Bet v1過敏原為基本可溶的(Hoffmann-Sommergruber等，1997，Prot.Expr.Purific.9233-39；van Hage-Hamsten等，1999，J.Allergy Clin.Immunol.104969-7)。
因此本發(fā)明目的是提供可純化“包埋體”形式的重組蛋白質(zhì)，特別是過敏原，或具有過敏活性的蛋白質(zhì)的方法，其以簡(jiǎn)單而有效的方式避免了上述先有技術(shù)方法的上述不足之處。而且，目的是以這樣的方式分離出該蛋白質(zhì)即這一分離使蛋白質(zhì)在純化過程中特別是在純化結(jié)束時(shí)的形式可使其能夠直接且不需進(jìn)一步處理即可用于醫(yī)藥或診斷用途。
本發(fā)明為生化純化方法，其通過有效的一至多步，優(yōu)選一至三步純化方法，使用基本非緩沖的堿性洗脫液將表達(dá)后以包埋體形式存在的重組蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為純態(tài)蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還是這樣一種方法，其中重組蛋白質(zhì)在最終純化步驟后通過快速中和最終留在溶液中。同時(shí)，由此生成一生理學(xué)介質(zhì)。
本方法特別優(yōu)選用于制備重組過敏原和過敏原變體。本方法代表了這些初級(jí)表達(dá)產(chǎn)品通常的應(yīng)用。來自其他來源的初級(jí)表達(dá)為包埋體的過敏原和過敏原變體可通過本方法得以純化，復(fù)性并復(fù)配。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語過敏原變體指原始過敏原或其片斷/聚集體的片斷，聚集體如，例如二聚體或三聚體及修改物。為了本發(fā)明的目的，后者可插入，刪除或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
優(yōu)選使用非天然存在且無IgE活性或IgE活性降低了的，但保存了T細(xì)胞活性的重組過敏原變體。本方法特別適用于分離主樺花粉過敏原Bet v1的過敏原變體，即重組片斷A(氨基酸1-74)和B(氨基酸75-164)，及重組體三聚體。本方法制備的重組過敏原和過敏原變體極其適用于特定的過敏疾病的免疫治療和診斷。
因此本發(fā)明涉及純化的重組蛋白質(zhì)的制備方法，該蛋白質(zhì)是可溶解的生物活性物的形式且可作為生理學(xué)介質(zhì)直接用于醫(yī)療用途，該制備源于細(xì)菌表達(dá)后的蛋白質(zhì)聚集體(“包埋體”)，后者不溶于表達(dá)介質(zhì)，該方法可由以下步驟描述(i)將分離出的不溶性蛋白質(zhì)聚集體攝取入有機(jī)變性試劑中。
(ii)將(i)所得溶液使用基本無機(jī)非緩沖的堿性含鹽洗脫液通過至少一個(gè)色譜步驟進(jìn)行純化。
(iii)將得自最終純化步驟的含有不溶的，復(fù)性的且有生物活性的蛋白質(zhì)的堿性溶液中和。
對(duì)于純化，起初形成的不溶性聚集體首先在本身已知的變性試劑中溶解并變性。優(yōu)選使用尿素，特別是5-10M的尿素，優(yōu)選8M尿素。另外，可使用其他試劑如，例如相對(duì)高濃度的氫氧化鈉或鉀溶液(0.2M-1M)或上文所述胍鹽酸鹽。
在其后的步驟中，溶解的變性蛋白質(zhì)與適當(dāng)?shù)纳V物質(zhì)結(jié)合。此處主要適用的是離子交換劑，優(yōu)選陰離子交換劑。
根據(jù)本發(fā)明的色譜洗脫劑為基本無機(jī)非緩沖的堿性含鹽溶液。適合的洗脫劑為例如NaOH或KOH與NaCl或KCl的溶液。如果需要及在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可將碳酸氫鈉或碳酸氫鉀加入洗脫劑中以降低pH值。優(yōu)選的洗脫劑含有NaOH，NaCl，或NaOH，NaCl及NaHCO3。根據(jù)本發(fā)明，堿性水溶液中NaOH或KOH的含量為5-50mM(mol/l)，優(yōu)選15-25mM，特別是20mM。鹽濃度(如NaCl)在開始時(shí)相對(duì)較低，以便于蛋白質(zhì)牢固地與離子交換劑物質(zhì)相鍵聯(lián)。本發(fā)明初始鹽濃度為5-50mM，優(yōu)選15-30mM，特別是20mM。這除去了與色譜物質(zhì)未鍵聯(lián)或鍵聯(lián)強(qiáng)度不夠的變性試劑及雜質(zhì)。如果加入NaHCO3，其濃度為5-15mM，優(yōu)選11mM。
因此，本發(fā)明涉及一種相應(yīng)的方法，其中通過將不溶重組蛋白質(zhì)鍵聯(lián)至色譜物質(zhì)并用基本無機(jī)非緩沖的堿性洗脫劑(其鹽含量可保證蛋白質(zhì)與所述交換劑材料的鍵聯(lián))對(duì)變性溶液進(jìn)行交換將變性試劑從變性溶液中除去。
為洗脫鍵聯(lián)的重組蛋白質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明方法以一定梯度提供持續(xù)增加的鹽的濃度(NaCl或KCl)，同時(shí)其他條件相同。優(yōu)選使用的線性梯度介于20mM NaCl(KCl)(初始值)與0.5M NaCl(終止值)之間。由此，不僅所需的蛋白質(zhì)得到回收，且其與雜質(zhì)(例如其他蛋白質(zhì))分離。
本發(fā)明因此涉及一種相應(yīng)的方法，其特點(diǎn)在于方法中鍵聯(lián)的重組蛋白質(zhì)通過提高鹽濃度得以洗脫并不含有雜質(zhì)，而鹽濃度的增加優(yōu)選以梯度的方式完成。
某些情況下，此后不再進(jìn)行另外的純化步驟也已足夠，因?yàn)楦鶕?jù)需要洗脫的蛋白質(zhì)已足夠純。在此情況下，繼之以下文更加詳細(xì)地描述的中和步驟以得到備用且活性的蛋白質(zhì)。
否則，根據(jù)本方法進(jìn)行另外的色譜步驟。此處可使用所有已知的色譜方法。具體地，這取決于待純化的特定蛋白質(zhì)的化學(xué)/物理性質(zhì)。優(yōu)選，特別地對(duì)于Bet v1型過敏原及過敏原變體，進(jìn)一步的純化通過憎水作用色譜進(jìn)行。另外，也可以進(jìn)行凝膠過濾來代替。
本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案為一種三步方法，其包括離子交換色譜法，憎水性作用色譜法及凝膠過濾，優(yōu)選以一定的序列進(jìn)行。但是，這不意味著對(duì)于本發(fā)明方法的限制。
因此，本發(fā)明由此進(jìn)一步涉及一種相應(yīng)的方法，其具有至少一個(gè)另外的色譜步驟，優(yōu)選憎水作用色譜和/或凝膠過濾。
對(duì)于本發(fā)明所有這些純化步驟的基本點(diǎn)是其洗脫劑定性的與定量的組成與上文所詳細(xì)描述的相同NaOH，NaCl及優(yōu)選的NaHCO3，或相應(yīng)的鉀添加物。只有氯化鈉組份的濃度可在不同步驟中安排為變動(dòng)的方式。因此，例如在憎水作用色譜中，使用了高(1-3M，優(yōu)選2M)至低(30-10mM，優(yōu)選20mM)濃度的NaCl(KCl)梯度。此處的最終濃度基本上取決于最終純化步驟后希望的鹽濃度。該濃度根據(jù)本發(fā)明為生理學(xué)可耐受的濃度。如果，例如，凝膠過濾是優(yōu)選的三步純化方法的最終純化步驟，則使用約150mM的NaCl。最后，最終步驟后所希望的終了鹽濃度還可通過稀釋或加入鹽進(jìn)行控制，這又取決于色譜的目標(biāo)蛋白質(zhì)的量。
最終純化步驟后，在本方法的優(yōu)選實(shí)施方案中其為凝膠過濾，通過加入稀酸，將溶液中和或?qū)⒌鞍踪|(zhì)復(fù)性，優(yōu)選鹽酸，其pH被調(diào)節(jié)為6.5-8.0。含有活性重組蛋白質(zhì)的溶液此時(shí)可以，根據(jù)需要在隨后對(duì)鹽濃度(如Na+)和蛋白質(zhì)含量進(jìn)行調(diào)節(jié)后，以制劑的形式直接使用。
本發(fā)明因此涉及一相應(yīng)的方法，其特點(diǎn)在于中和在純化完成后在pH6.5-8.0的范圍中進(jìn)行，優(yōu)選使用稀酸，特別是稀HCl。
在下文中使用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行更詳細(xì)的敘述，該例為主樺花粉過敏原Bet v1過敏原變體，即重組片斷A(氨基酸1-74)和B(氨基酸75-164)，及重組體三聚體的分離對(duì)于純化，初級(jí)不溶聚集體被變性，優(yōu)選用8M尿素。另外，也可使用其他試劑，如0.2M氫氧化鈉溶液。
第一色譜純化步驟通過陰離子交換色譜進(jìn)行，如在Source Q上進(jìn)行。其中，多數(shù)過敏原與過敏原變體與載體鍵聯(lián)并被初始變性溶液轉(zhuǎn)移至洗脫液中。堿性洗脫液使蛋白質(zhì)保留在溶液中。NaCl梯度洗脫使細(xì)菌雜質(zhì)與活性成份片斷部分除去。
在另外兩個(gè)純化步驟，即憎水作用色譜和凝膠過濾中，預(yù)純化且平衡的過敏原或過敏原變體基本與仍然保留的細(xì)菌雜質(zhì)分離。其后，基本仍使用同一洗脫物質(zhì)，含有低分子量堿和不同比例的無機(jī)鹽。
本發(fā)明因而涉及一特定的洗脫系統(tǒng)，其中待純化重組蛋白質(zhì)在純化過程中保留在溫和條件下的溶液中，并且其產(chǎn)生有效純化。
在最終色譜步驟后，根據(jù)本發(fā)明純化的重組蛋白質(zhì)可以溶液形式分離或通過使用相應(yīng)酸簡(jiǎn)單中和洗脫液中的堿而復(fù)性。如果選擇了適當(dāng)?shù)南疵撘禾砑觿┑臐舛葎t可形成適于胃腸外用制劑的生理學(xué)溶液。純化的重組過敏原或過敏原變體通過其已知的物理，化學(xué)，免疫學(xué)或生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行鑒識(shí)，特別是通過等電子聚焦，SDS-PAGE和過敏癥患者的特定單克隆抗體及IgE抗體之類方法。溶劑的測(cè)試是通過測(cè)量pH、Na+和Cl-以及如果希望，CO3-濃度的定量完成。這些方法是公知且描述過的。根據(jù)本發(fā)明純化且溶解的重組過敏原或過敏原變體的收率基于初始蛋白質(zhì)為75-95％。
該方法制備的過敏原組份可用于體內(nèi)和體外診斷，其可作為患者特定的過敏譜的過敏原組份分辨識(shí)別及特定的過敏癥免疫治療的一部分。另外，以長(zhǎng)效制劑形式制備的藥物制劑可通過純化的重組蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換完成。
本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案以圖表形式(表1)示于下文表1包埋體的離析在例如8M尿素中的變性陰離子交換色譜，如Source Q溶液A20mM NaOH，20mM NaCl，11mM NaHCO3溶液B20mM NaOH，0.5M NaCl，1lmM NaHCO3(任選)憎水作用色譜，如Source pHE溶液A20mM NaOH，2M NaCl，11mM NaHCO3溶液B20mM NaOH(任選)凝膠過濾，如Superdex 75溶液A10mM NaOH，11mM NaHCO3
148.4mM NaCl復(fù)性/復(fù)配目標(biāo)蛋白質(zhì)在10mM NaOH，148.4mM NaCl，11mM NaHCO3中+加入100mM HCl至10mM＝在0.154M Na+溶液中的可溶目標(biāo)蛋白質(zhì)總之，可觀察到以下現(xiàn)象通過實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，其通過特別的色譜洗脫劑的組合物，色譜介質(zhì)的選擇及特別設(shè)定的pH及由此產(chǎn)生的鹽含量，本發(fā)明因此能夠?qū)崿F(xiàn)一個(gè)在技術(shù)上及藥理學(xué)上可以實(shí)現(xiàn)的離析出高純度，可溶性重組過敏原和過敏原變體的生產(chǎn)方法，產(chǎn)品主要以不溶性聚集體的形式制得，該方法省力省時(shí)。由于與已知方法相比重組蛋白質(zhì)進(jìn)行純化和復(fù)性或溶解的條件溫和且在藥物上適合，其活性成分可用于過敏疾病的診斷和胃腸外治療。
實(shí)施例Bet v1可溶性過敏原變體的離析(治療有效的重組Bet v1的過敏原變體，片斷A和B及Bet v1三聚體)通過標(biāo)準(zhǔn)方法純化的過敏原變體的包埋體優(yōu)選在8M尿素，20mMtris/HCl中變性。完全變性后，進(jìn)行過濾，優(yōu)選0.22-0.45μm，或離心，優(yōu)選在10,000-20,000xg下5-15分鐘。清液用Source15Q(Pharmacia)進(jìn)行離子交換色譜，固定相用堿溶液平衡，優(yōu)選使用20mM NaOH，11mM NaHCO3和20mM NaCl。固定相在pH高至12.0時(shí)仍穩(wěn)定。初始溶液相對(duì)較高的pH實(shí)際上使所有目標(biāo)蛋白質(zhì)與陰離子交換劑鍵聯(lián)。例外的是特別稀有的等電點(diǎn)高于11.0的蛋白質(zhì)。用初始溶液對(duì)固化的蛋白質(zhì)進(jìn)行淋洗可有效地去除變性溶液(如8M尿素)和藥物中不希望出現(xiàn)的緩沖物質(zhì)(如tris)。該方法保證在保持重組蛋白質(zhì)溶解性的情況下為便于隨后的分離步驟而改變?nèi)軇?。其后的洗脫通過增加NaCl梯度進(jìn)行，如從20mM NaOH，11mM NaHCO3，20mM NaCl到20mM NaOH，11mM NaHCO3，0.5M NaCl，且實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)(宿主細(xì)胞蛋白質(zhì))和活性組分片斷的分離。
其后，色譜步驟為憎水作用色譜(僅對(duì)于片斷)。為此目的，步驟1的洗出液用高摩爾濃度的鹽溶液，如5M NaCl和20mM NaOH，11mMNaHCO3調(diào)節(jié)，由此使目標(biāo)蛋白質(zhì)鍵合。鍵聯(lián)的目標(biāo)蛋白質(zhì)的洗脫通過低鹽或無鹽堿溶液如20mM NaOH進(jìn)行。用于憎水作用色譜的固定相也必須在堿性至pH12時(shí)穩(wěn)定，如，例如Source pHE。
第三步，凝膠過濾，如Superdex 75，在堿性條件下進(jìn)行。色譜溶液的選擇使得對(duì)加入洗脫液中的堿的中和的結(jié)果是得到希望的最終配比如，例如為10mM NaOH，11mM NaHCO3和148.4mM NaCl。
最后將凝膠過濾所得的洗出液用與所用堿相對(duì)應(yīng)的酸進(jìn)行中和，由此一方面形成中性的pH且使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換為可溶的形式或復(fù)性，而另一方面通過中和形成所希望的鹽濃度。因此，例如，含有10mM NaOH，11mM NaHCO3和148.4mM NaCl的凝膠過濾溶液通過加入1/10(v/v)100mM HCl被轉(zhuǎn)換為生理鹽溶液。通過簡(jiǎn)單測(cè)量pH及對(duì)Na+定量來測(cè)試溶劑。根據(jù)本發(fā)明，本方法因而涉及最少的樣品處理，短的樣品等待時(shí)間，使用專用的藥理學(xué)相容性物質(zhì)，與不同分理原理兼容的單一溶劑，及避免了拖延和在某些情況下無法使用的方法如透析等。另外，氫氧化鈉溶液，一種已知的有效的細(xì)菌抑制劑，避免了存在于其中的蛋白質(zhì)被降解或被微生物污染。內(nèi)毒素，其可在細(xì)菌表達(dá)過程中造成麻煩，同樣被有效地去除或降解。上述色譜步驟的順序和數(shù)量可根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)特殊的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行改變。表2示出了溶液的總結(jié)。
凝膠過濾后的中和/溶解-緩慢加入1/10體積(基于初始混合物)的100mM HCl。例如在100ml初始溶液中含有10mM NaOH，148.4mM NaCl和11mM NaHCO3中和后110ml11mM NaHCO3*10/11＝10 NaHCO310mM NaOH/HCl(NaCl)*10/11＝9.1mM NaCl148.4mM NaCl*10/11＝134.9mM NaCl由此最終溶液含有154mM NaCl，144mM Cl-和10mM CO3-。
表2用于色譜分離Bet v1變體的溶液
所有溶液和餾份保存于室溫。(CV＝柱體積)。
權(quán)利要求
1.純化的重組蛋白質(zhì)的制備方法，該蛋白質(zhì)是可溶解的生物活性物的形式且可作為生理學(xué)介質(zhì)直接用于醫(yī)療用途，該制備源于細(xì)菌表達(dá)后的蛋白質(zhì)聚集體(“包埋體”)，后者不溶于表達(dá)介質(zhì)，該方法特點(diǎn)在于進(jìn)行了以下步驟(i)將分離出的不溶性蛋白質(zhì)聚集體攝取入有機(jī)變性試劑中，(ii)將(i)所得溶液使用基本無機(jī)非緩沖的堿性含鹽洗脫液通過至少一個(gè)色譜步驟進(jìn)行純化，和(iii)將得自最終純化步驟的含有不溶的，復(fù)性的且有生物活性的蛋白質(zhì)的堿性溶液中和。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，特點(diǎn)在于所用變性試劑是尿素或胍鹽酸鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，特點(diǎn)在于變性試劑通過將不溶的重組蛋白質(zhì)鍵聯(lián)至色譜物質(zhì)上，并用基本無機(jī)非緩沖堿性洗脫劑，其鹽濃度可使蛋白質(zhì)鍵聯(lián)至所述交換物質(zhì)上，進(jìn)行交換而從變性溶液中脫除。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，特點(diǎn)在于在該過程中，鍵聯(lián)的重組蛋白質(zhì)通過提高鹽濃度被洗脫且不含有雜質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，特點(diǎn)在于鹽濃度的提高以梯度的方式完成。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5之一的方法，特點(diǎn)在于所用色譜物質(zhì)是陰離子交換劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至7之一的方法，特點(diǎn)在于至少進(jìn)行一個(gè)另外的色譜純化步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，特點(diǎn)在于所進(jìn)行的另外的色譜步驟是憎水作用色譜和/或凝膠過濾。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8之一的方法，特點(diǎn)在于所用色譜洗脫劑主要為NaOH，NaHCO3及NaCl。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9之一的方法，特點(diǎn)在于純化完成之后的中和步驟在pH6.5至8.0之間的范圍內(nèi)進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，特點(diǎn)在于使用HCl進(jìn)行中和。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至10之一的方法，特點(diǎn)在于所用重組蛋白質(zhì)為過敏原，過敏原變體或過敏原或過敏原變體的片斷。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，特點(diǎn)在于選用Bet v1過敏原的重組過敏原變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及表達(dá)于細(xì)菌宿主細(xì)胞中且以不溶性聚集體形式沉淀(包埋體)的重組蛋白質(zhì)的溶解與純化方法。純化基于將所述包埋體用有機(jī)變性試劑并使用色譜法轉(zhuǎn)化為可溶形式。此處選用無機(jī)的，堿性的，含鹽的洗脫劑，其在純化完成后使重組蛋白質(zhì)在中和后可以成為能夠直接用于醫(yī)藥用途且為生理學(xué)可接受的形式。該方法特別適用于純化過敏原和過敏原片斷。
文檔編號(hào)C07K1/36GK1468255SQ01815355
公開日2004年1月14日 申請(qǐng)日期2001年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月8日
發(fā)明者R·蘇克, O·克羅姆維爾, H·費(fèi)比, R 蘇克, 弈肺 申請(qǐng)人:默克專利股份公司