專利名稱：促紅細胞生成性合成蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及以特定方式聚合物修飾的促紅細胞生成性合成蛋白，及其產(chǎn)生方法和應用。
參照相關申請在某種程度上，該申請是美國專利申請系列60/231,330(2000年9月8日提交)和60/236,377(2000年9月29日提交)的延續(xù)，其內容均在此完整引入作為參考。
背景技術：
紅細胞生成是指產(chǎn)生紅細胞的過程，該過程可以調節(jié)紅細胞的更新和損耗。促紅細胞生成素(EPO)是一種能夠刺激紅細胞生成的蛋白激素，天然的人EPO是一種含有165個氨基酸的糖蛋白，該蛋白最初在腎臟中產(chǎn)生，然后被分泌進入血流，繼而在骨髓中刺激前體細胞產(chǎn)生紅細胞。人EPO編碼基因的預測產(chǎn)物是一種含有166個氨基酸殘基的分子，但是在成熟形式的人EPO中，C端的精氨酸在翻譯后修飾過程中被去除。
糖基化人EPO在第24、38和83位上帶有3個N-聯(lián)糖鏈。在第126位上還帶有一個O-聯(lián)糖鏈。糖基化的影響十分復雜。非糖基化EPO在體外具有活性。但研究表明，糖基化是EPO在體內具有全部活性所必需的。研究還表明，不同的糖基化模式可表現(xiàn)出不同的影響。例如，去唾液酸化EPO在體外的活性增強，但在體內的活性減弱，該結果歸因于暴露的半乳糖殘基被肝細胞識別、結合并清除。此外，完全唾液酸化EPO的分支模式可導致生物活性的差異。主要呈四角分支模式的EPO可表現(xiàn)出與“標準”EPO相同的活性，而主要呈二角分支模式的EPO可在體外具有高出三倍的活性，但在體內僅為正?；钚缘?5％。此外，有多項研究表明，對EPO功能具有重要作用的只有N-聯(lián)糖，而不包括O-聯(lián)糖。
目前有幾種藥品可以使用，這些藥品含有重組產(chǎn)生的糖基化EPO。但目前可用的EPO藥品在血漿中的半衰期較短，并且易于被蛋白酶降解，因而其使用受到限制。由于各N-聯(lián)糖基化位點及位點之間的分支情況和唾液酸含量高度不均一，所以這些藥品還含有糖基化形式不同的復合混合物。這些缺點都會阻礙其產(chǎn)生最大的臨床效力。
有人將PEG(聚乙二醇)等水溶性聚合物聯(lián)接于這些EPO蛋白，以改善其循環(huán)半衰期和其他特性，但由于很難將其以受控方式和自定精確方式進行連接，所以獲得的是混合產(chǎn)物。例如，已有多種方法被用來將PEG等聚合物基團和相關聚合物聯(lián)接于蛋白上的活性基團(參考美國專利4,179,337(Davis et al.)和美國專利4,002,531(Royer))。有關綜述，可參考”酶類藥物”(J.S.Holcerberg andJ.Robert，eds.pp.367-383(1981)中的Abuchowski et al.以及Zalipsky，S.(Bioconjugate Chemistry(1995)6150-165)。關于利用PEG和其他聚合物來修飾蛋白的論述，還可參考Cheng，T.-L.et al.，Bioconjugate Chem.(1999)10520-528；Belcheva，N.etal.，Bioconjugate Chem.(1999)10932-937；Bettinger，T.etal.，Bioconjugate Chem.(1998)9842-846；Huang，S.-Y.et al.，Bioconjugate Chem.(1998)9612-617；Xu，B.et al.Langmuir(1997)132447-2456；Schwarz，J.B.et al.，J.Amer.Chem.Soc.(1999)1212662-2673；Reuter，J.D.et al.，BioconjugateChem.(1999)10271-278；Chan，T.-H.et al.，J.Org.Chem.(1997)623500-3504)。蛋白上的典型連接位點包括伯氨基，如賴氨酸殘基上或N末端的伯氨基，伯巰基，如半胱氨酸側鏈的伯巰基，以及伯羧基，如谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基上或C末端的伯羧基。最常見的連接位點是糖蛋白的糖殘基、半胱氨酸，或靶蛋白的N末端和賴氨酸。
目前已描述過多種將聚合物聯(lián)接于EPO的不同方法，但聯(lián)接的過程無不趨于復雜。必須注意的是減少由結合反應導致的生物活性損失。例如，通?？衫谜郫B蛋白或重折疊蛋白來盡量減少結合位點的數(shù)量。但是，若靶蛋白或靶多肽上結合了過多的活性聚合物，其生物活性會嚴重降低或喪失。同樣，若使用錯誤的連接體來聯(lián)接聚合物和蛋白，或聯(lián)接于靶蛋白的聚合物量不足，就會使所得結合物的治療價值受到限制，并可能無法由循環(huán)壽命的延長來充分彌補生物活性的損失。修飾聚合物對蛋白活性位點的封閉也會帶來一些問題。由于聚合物與蛋白的結合通常是在基于溶液的反應體系中進行，因而這種問題很難避免。有人建議用磷酸吡哆醛等物質對活性位點進行預封閉，但產(chǎn)生的結果并不一致(參考美國專利4,179,337(Davis et al.))。對通常帶有少量與生物活性無關的結合位點的低分子量蛋白和肽而言，這些問題顯得尤為尖銳。
舉例來說，常見的一種技術是將水溶性聚合物聯(lián)接于靶蛋白的伯氨基(如N末端氨基和賴氨酸的ε-氨基)。還有使用巰基反應性聚合物結合體將聚合物聯(lián)接于半胱氨酸的巰基側鏈。這兩種方法都具有明顯的問題，因為大多數(shù)蛋白都含有遍布于多肽骨架不同區(qū)域的多個上述活性基團，這些活性基團在確定蛋白的活性、折疊、再折疊和穩(wěn)定性方面具有重要的作用。因此，盡管這些方法被普遍使用，但或多或少都會使蛋白的生物活性出現(xiàn)一定的或不必要的降低，并且通常會產(chǎn)生難以分離和鑒定的復合混合物(Delgada et al.，PharmaceuticalSciences(1997)359-66)。
為了減少隨機結合，有人嘗試制備了一些將天然賴氨酸去除并在特定聚合物結合位點添加賴氨酸的蛋白(美國專利4,904,584)。例如，有人用這種方式對G-CSF和IL-2進行了修飾。為了避免隨機結合，還有人嘗試制備了一些將天然半胱氨酸去除并在特定聚合物結合位點添加半胱氨酸的蛋白，或不將存在的天然半胱氨酸去除而只添加半胱氨酸的蛋白(EP0668353)。例如，有人制備出這樣的EPO。盡管這些半胱氨酸或賴氨酸變異體理論上能夠用于聚合物的位點特異性結合，但仍不能保證對所有選定位點進行受控修飾。
有一些蛋白包含多個帶有相同或相似活性功能基團的側鏈的氨基酸，在無法對這些蛋白進行位點特異性修飾的情況下，目前的工作集中在對蛋白的氨基或羧基末端進行修飾。氨基或羧基末端的修飾依賴于一些能夠對這些位點進行單一修飾的化學結合技術(WO90/02136和WO90/02135)。例如，有人用該技術將PEG鏈與G-CSF和趨化因子IL-8的N-端殘基相結合(Gaertner et al.，Bioconjug.Chem.(1996)7(1)38-44；和WO96/41813)。但N-端或C-端修飾通常會降低蛋白的活性(可參考，例如，美國專利5,985,265中關于將PEG聯(lián)接于G-CSF的N-端和賴氨酸側鏈的論述)。盡管用水溶性聚合物對蛋白進行修飾的方法存在一些缺陷，但是將蛋白聚乙二醇化以及與其他水溶性聚合物聯(lián)接的研究仍在繼續(xù)。例如，還有人描述了將PEG聯(lián)接于促紅細胞生成素(EPO)的糖鏈和賴氨酸等內部氨基酸的方法(EP0605963和WO00/32772)，以及聯(lián)接于N-末端的方法(美國專利6,077,939和WO00/32772)。遺憾的是，產(chǎn)生的這些聚乙二醇化EPOs是難以分離和鑒定的復合混合物。
另一個問題是上述聚合物具有高度非均一性，從而難以對聚合物修飾蛋白的混合物進行分析鑒定和純化(Delgada et al.，Pharmaceutical Sciences(1997)359-66)。舉例來說，用于制備PEG鏈或PEG型鏈的技術都涉及一個難以控制的聚合步驟，甚至分子量為3400等相對較低的值時也是如此，該步驟會使制備產(chǎn)物的鏈長分散在某一平均值附近；也就是說，這些技術涉及制備出(CH2CH2O)n的聚合物，其中的n不是一個離散值，而是在平均值附近的一個范圍。衍生蛋白的這種不均一性通常會使其具有不易鑒定的一系列特性，更不用說將其分離。
但遺憾的是，目前用于治療性應用的所有EPO蛋白都是由DNA重組技術獲得，這使鑒定并采用適當聚合物的難題更加嚴重。DNA重組技術的使用嚴重限制了性能促進性基團與重組產(chǎn)生的EPO蛋白之間形成聯(lián)接的類型和特異性。其原因首先是適用于聯(lián)接的功能基團數(shù)量非常有限，其次是在被修飾的蛋白中通常含有若干個活性功能基團，從而使修飾不可能具有任何的特異性。例如，已有研究表明，當超氧化物歧化酶與PEG非選擇性聯(lián)接時，被修飾的酶的一些組分完全失活(P.McGoff et al.，Chem.Pharm.Bull.(1988)363079-3091)。此外，若隨機聯(lián)接了不同數(shù)量的這些基團，就會無法精確預測這種治療性蛋白的藥代動力學，從而使定量給藥成為一個很大的難題。無法對連接進行控制還會導致(a)效能降低、(b)需要用煩瑣的純化方法來分離大量的混合衍生物，以及(c)修飾基團的聯(lián)接可能不穩(wěn)定。此外，一些該領域已知的聯(lián)接還具有免疫原性，如基于tresylchloride的聯(lián)接。
因此，可以將PEG等水溶性聚合物聯(lián)接于由生物學方法產(chǎn)生的蛋白，以延長這些蛋白的循環(huán)半衰期，并降低其蛋白水解作用和免疫原性，同時改善這些蛋白的其他特性，但由于很難將其以受控方式和自定精確方式進行連接，所以獲得的是混合產(chǎn)物。并且在自定的精確位點進行聚合物聯(lián)接的成果有限，因而對普遍適用于蛋白聯(lián)接的優(yōu)選位點的了解還十分缺乏。此外，由于聯(lián)接的隨機性以及PEG和普遍用于聯(lián)接的其他水溶性聚合物的異向擴散性，目前還難以對PEG-蛋白結合物進行純化和分析鑒定。因此，難以對可重復性聯(lián)接進行控制以及聚合物不均一性的問題都是聚合物修飾蛋白被例行批準為治療劑的嚴重障礙(19世紀70年代早期即出現(xiàn)，但迄今只有少數(shù)被批準用于治療性應用)。
因此，人們需要一些方法來形成生物活性促紅細胞生成蛋白，這些方法要不同于修飾天然EPO和重組EPO的DNA重組技術和聚合物技術。此外還需要一些臨床特性被改進的促紅細胞生成蛋白。本發(fā)明即可滿足這些需要以及其他需要。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及促紅細胞生成性合成蛋白及其產(chǎn)生方法和應用。具體地說，本發(fā)明涉及聯(lián)接有一種或多種水溶性聚合物的促紅細胞生成性合成蛋白。此外還提供含有本發(fā)明所述促紅細胞生成性合成蛋白的藥用組合物。
本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白對哺乳動物進行治療的方法。在一項實施方案中，本發(fā)明提供一種方法，用于提高哺乳動物體內的紅細胞產(chǎn)量。另一實施方案則涉及一種方法，用于提高哺乳動物體內的血紅素。還有一項實施方案涉及一種方法，用于提高哺乳動物體內的網(wǎng)織紅細胞數(shù)。這些方法包括將本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白以有效的劑量給藥于該哺乳動物，以獲得所需的效果。
此外還提供一些方法，用于產(chǎn)生本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白及其中間體，其中包括優(yōu)選的聚合物修飾形式。該方法包括，將含有促紅細胞生成性合成蛋白的非重疊性多肽鏈氨基酸序列的一些肽段進行化學連接，從而產(chǎn)生一種含有促紅細胞生成性合成蛋白的多肽鏈。
附圖簡述

圖1A-1E顯示本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白的制備方法示意圖。
圖2A-2C顯示本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白的制備方法示意圖。
圖3A-3B顯示多片段連接方法的示意圖，該方法涉及將3種或3種以上的非重疊肽段進行化學連接，即相對于全長連接終產(chǎn)物而言，至少有一個肽段為中間片段。
圖4A-4C說明所得側鏈巰基的天然化學連接和化學修飾方法。
圖5A-5B描述一種固相方法，用于產(chǎn)生本發(fā)明所述水溶性聚合物U-B-Polymer-J*的分支核心(B)和單一化學選擇性功能基團(U)。
圖6A-6D描述一種固相方法，用于產(chǎn)生本發(fā)明優(yōu)選的基本不具有抗原性的水溶性聚酰胺Polymer-J*組分，該組分可隨后用于聯(lián)接U-B核心。
圖7描述一種方法，用于使U-B組分與Polymer-J*組分結合，以產(chǎn)生本發(fā)明優(yōu)選的具有通式U-B-Polymer-J*的聚合物合成構成體。
圖8描述一種替代方法，用于將水溶性聚合物精確聯(lián)接于一種肽段，該肽段可用于連接并產(chǎn)生本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白。
圖9顯示本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白的整個制備過程。
圖10顯示優(yōu)選的促紅細胞生成性合成蛋白的基本結構。pPEG＝“精確型PEG”圖11顯示循環(huán)置換型SEP類似物的總體結構，該類似物帶有重新定位的氨基端和羧基端。
圖12顯示優(yōu)選的水溶性聚合物的結構及其不同的線性結構和分支結構。
圖13顯示支鏈pPEG聚合物的形成示意圖。
圖14顯示合成細胞因子SEP1-L30的合成方法，該細胞因子是按實施例2所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖15顯示合成的細胞因子SEP1-L30，該細胞因子是按實施例2所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖16顯示合成的細胞因子SEP1-L26，該細胞因子是按實施例3所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖17顯示用于聯(lián)接合成細胞因子SEP1-B50的優(yōu)選支鏈水溶性聚合物的形成示意圖，該細胞因子是按實施例4所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖18顯示合成的細胞因子SEP1-B50，該細胞因子是按實施例4所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖19顯示合成細胞因子SEP3-L42的合成方法，該細胞因子是按實施例5所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖20顯示合成的細胞因子SEP3-L42，該細胞因子是按實施例5所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖21顯示用于聯(lián)接合成細胞因子SEP1-B51的優(yōu)選水溶性聚合物的合成方法，該細胞因子是按實施例7所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖22顯示合成的細胞因子SEP1-B51，該細胞因子是按實施例7所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖23顯示用于聯(lián)接合成細胞因子SEP1-B52的優(yōu)選水溶性聚合物的合成方法，該細胞因子是按實施例8所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖24顯示合成的細胞因子SEP1-B52，該細胞因子是按實施例8所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖25顯示按實施例2-5和7-8所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物的典型分析數(shù)據(jù)。如圖所示，典型的等電聚焦凝膠(IEF)結果和非還原性SDS-PAGE凝膠結果說明，折疊的純化SEP1-B51具有相當于單體的分子量。
圖26顯示SEP化合物SEP0、SEP1-L26、SEP1-L30、SEP1-B50、SEP1-B51和SEP3-L42在因子依賴性細胞系中的體外活性。
圖27顯示SEP1-L42和SEP1-B50的血漿濃度對時間的典型藥代動力學曲線，濃度單位為納克每毫升(ng/ml)，時間單位為小時。
圖28顯示在缺氧大鼠模型中根據(jù)72小時紅細胞(RBC)-59Fe攝取量(劑量百分率)測定的SEP1-B51以及CHO細胞產(chǎn)生的糖基化重組人促紅細胞生成素(“rhEPO”)的體內活性的線性回歸分析結果。
圖29顯示以5μg/kg劑量用SEP1-B51和rhEPO對大鼠進行單次靜脈內給藥后，大鼠體內每種化合物的血漿濃度對時間的典型藥代動力學清除率曲線。
圖30顯示一種循環(huán)置換型聚合物修飾SEP構建體。
優(yōu)選實施方案描述本發(fā)明涉及促紅細胞生成性合成蛋白及其產(chǎn)生方法和應用。
I.本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白在一項優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及帶有一種或多種與其聯(lián)接的水溶性聚合物的促紅細胞生成性合成蛋白?！按偌t細胞生成蛋白”是指具有在體外促進促紅細胞生成素依賴性細胞系生長的生物活性的蛋白。在一項優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白具有在體內促進紅細胞增殖的生物活性。蛋白的促紅細胞生成活性可通過多種方法中的任一種方法來檢測，例如在體內給藥之后進行紅細胞生成跟蹤測定，檢測該蛋白對EPO一依賴性細胞系增殖的介導能力，等等。
“水溶性聚合物”是指可溶于水的基本不具有抗原性的聚合物。
按照文中的描述，若一種蛋白的某些，最優(yōu)選的是全部，氨基酸殘基是通過非重組技術來實現(xiàn)聚合，則該蛋白被稱為“合成”蛋白。術語“非重組技術”是指涉及有機化學方法和其他合成聚合方法的技術，從而將這些技術與涉及RNA在體內或體外翻譯成蛋白的技術區(qū)別開來。合成蛋白包括完全合成蛋白和半合成蛋白。完全合成蛋白的所有連接成分都是通過化學合成方法，即不依賴于核糖體的合成方法，人工產(chǎn)生的。半合成蛋白至少有部分連接成分是生物合成的，即利用細胞或無細胞翻譯系統(tǒng)中的核糖體合成的，而其他部分是化學合成的。
在一項優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白包含一段具有核糖體特定促紅細胞生成素氨基酸序列的多肽鏈，以及通過一種或多種化學連接位點共價結合的一種或多種非重疊肽段。特別優(yōu)選的促紅細胞生成素是哺乳動物的促紅細胞生成素，更優(yōu)選的是人促紅細胞生成素或其衍生物。舉例來說，有多種促紅細胞生成素的氨基酸序列為已知，并且已制備出多種人促紅細胞生成素的活性變異體(可參考，例如，美國專利5,856,298；5,955.422；8,888,772；5,858,347；5,614,184；5,457,098和6,077,939,以及WO0/32772)，因此，本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白可以包含已知具有上述氨基酸序列的多肽。
在一項優(yōu)選實施方案中，核糖體特定促紅細胞生成素含有一個或多個糖基化位點，而水溶性聚合物是通過與核糖體特定促紅細胞生成素的一個或多個糖基化位點相對應的一個或多個位點聯(lián)接于促紅細胞生成性合成蛋白的多肽鏈。在一項更優(yōu)選的實施方案中，水溶性聚合物只通過與一個或多個上述糖基化位點相對應的一個或多個位點聯(lián)接于多肽鏈。本發(fā)明的該方面包括一些促紅細胞生成性合成蛋白，其中的核糖體特定促紅細胞生成素是通過重組方法產(chǎn)生的。因此，核糖體特定促紅細胞生成素可以是天然的促紅細胞生成素，也可以是非天然的促紅細胞生成素，其中，非天然促紅細胞生成素還可包含一個或多個非天然的糖基化位點。
“糖基化位點”是指一種蛋白氨基酸序列，該序列可編碼寡糖(糖)鏈與該蛋白氨基酸序列上一種氨基酸殘基側鏈的酶促連接；例如N-聯(lián)和O-聯(lián)糖基化位點。應該了解的是，經(jīng)突變而去除了一個或多個上述糖基化位點的促紅細胞生成素也包含在該“糖基化位點”的定義中，因為聚合物修飾殘基位點與其位置相同?！疤烊惶腔稽c”是指自然界中存在的促紅細胞生成素糖蛋白上的糖基化位點?！胺翘烊惶腔稽c”是指經(jīng)過改造而引入促紅細胞生成素的糖基化位點。例如，目前已利用這種方式對重組人EPO進行了改造(可參考，例如，美國專利5,856,298)在某種程度上，本發(fā)明所述實施方案的基礎是，當利用水溶性聚合物，如上文描述的聚合物，在一個或多個糖基化位點上對含有人促紅細胞生成素多肽鏈的促紅細胞生成性合成蛋白進行修飾時，該水溶性聚合物可用來實現(xiàn)通常存在于相應天然促紅細胞生成素糖蛋白的同一位置上的糖鏈的一種或多種生物學效應。這些生物學效應包括調節(jié)抗蛋白酶能力、免疫原性、受體特異性、比活、效力和藥代動力學。而去除存在的糖鏈并將其替換成本發(fā)明優(yōu)選的水溶性聚合物的方法會帶來明顯的好處，其中包括，避免了在去除糖鏈的懸垂唾液酸殘基等情況下可能導致的酶促降解和清除，并且解決了不穩(wěn)定性、循環(huán)半衰期有限、分布、難以處理性等問題。此外，值得注意的是，本發(fā)明的這些聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白與未修飾的對應合成蛋白相比，能夠在基本不喪失生物活性的條件下保持這些有利的生物學特性，其中包括生物活性增強，甚至在合成蛋白的單體分子量大于25kDa時也是如此。
因此，在另一項實施方案中，本發(fā)明涉及一種促紅細胞生成性合成蛋白，該蛋白包含一段具有核糖體特定促紅細胞生成素氨基酸序列的多肽鏈，其中，該多肽鏈聯(lián)接有一種或多種水溶性聚合物，并且其單體分子量大于25kDa，同時，這種促紅細胞生成性合成蛋白與所含多肽鏈不帶有上述水溶性聚合物的對應合成蛋白相比具有相同或更高的生物活性。該生物活性可以是體外生物活性，也可以是體內生物活性，還可以是二者兼?zhèn)?。在一項?yōu)選實施方案中，該生物活性為體內生物活性。在另一項優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一種促紅細胞生成性合成蛋白，該蛋白包含一段具有核糖體特定促紅細胞生成素氨基酸序列的多肽鏈，其中，該多肽鏈聯(lián)接有一種或多種水溶性聚合物，并且其單體分子量大于25kDa，同時，這種促紅細胞生成性合成蛋白與所述核糖體特定促紅細胞生成素相比具有相同或更高的生物活性。同樣，該生物活性可以是體外生物活性，也可以是體內生物活性，還可以是二者兼?zhèn)?。在一項?yōu)選實施方案中，該生物活性為體內生物活性。最優(yōu)選的是，這些聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白應聯(lián)接有離散數(shù)量的水溶性聚合物。
“化學連接位點”是指第一種肽或多肽的N-端氨基酸和第二種肽或多肽的C-端氨基酸，這兩種氨基酸之間通過化學連接會形成或能夠形成不可逆的共價鍵。文中使用的“化學連接”是指一種化學選擇性反應，其中包括兩種化學基團的共價連接，每種化學基團帶有一種可彼此反應并形成特定不可逆共價鍵的功能基團。化學連接包括(1)具有特定的C-端反應性基團的第一種肽或多肽與(2)具有特定的N-端反應性基團的第二種肽或多肽的共價連接，其中，該C-端反應性基團和N-端反應性基團之間會形成不可逆的共價鍵。具體地說，化學連接包括任何可用于連接未保護肽段的化學選擇性反應。
就水溶性聚合物而言，優(yōu)選的水溶性聚合物可表示為通式Un-s1-B-s2-Polymer-s3-J*U是一種具有與促紅細胞生成性合成蛋白多肽鏈共價結合的特定功能基團的殘基。具體地說，U基團結合于促紅細胞生成性合成蛋白內一種或多種非重疊肽段的一個或多個氨基酸側鏈n上可彼此特定反應的功能基團，其中，n是1-6的離散整數(shù)。更優(yōu)選的是側鏈n為1-4的離散整數(shù)，最優(yōu)選的是為1-2的離散整數(shù)。文中使用的術語“氨基酸”包括20種遺傳編碼氨基酸、自然界中存在的稀有氨基酸或非常見氨基酸，以及任何非天然氨基酸，如不規(guī)則氨基酸；當用于肽、多肽或蛋白質的描述中時，是指氨基酸殘基。U和側鏈n的優(yōu)選實施方案是由彼此能夠特定反應的基團形成共價鍵，其中，這些鍵選自肟、酰胺、胺、氨基甲酸乙酯、醚、硫醚、酯、酰肼、惡唑烷、噻唑烷、硫醚、醚和酯。U和n的最優(yōu)選連接是，U通過化學連接形成的一種選自酰胺、肟、硫醚、酰肼、噻唑烷和惡唑烷的鍵而與側鏈n共價結合。
B是一種具有三個或更多個相同或不同臂的分支核心，該核心可以存在，也可以缺失。最優(yōu)選的是B存在，并且含有三個或更多個臂，再更優(yōu)選的是含有四個或更多個臂。具體地說，B的一個臂與U聯(lián)接(可選擇性地通過間隔物或連接物s1聯(lián)接)，B的第二個臂與Polymer聯(lián)接(可選擇性地通過間隔物或連接物s2聯(lián)接)。優(yōu)選的是，聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白中的B基團上至少有一個分支臂含有選自肟、酰胺、胺、氨基甲酸乙酯、硫醚、酯、酰肼、惡唑烷和噻唑烷的殘基鍵。本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白的優(yōu)選B分支基團可包含一種選自氨基、羧酸酯和混合氨基-羧酸酯的分支核心。優(yōu)選的氨基分支核心包括賴氨酸或其衍生物，優(yōu)選的羧酸酯分支核心包括谷氨酸或天冬氨酸或其衍生物，而優(yōu)選的混合氨基-羧酸酯分支核心包括γ-谷氨酸或其衍生物。
Polymer組分是一種基本不具有抗原性的水溶性聚合物，當B存在時，該聚合物可以相同，也可以不同?！八苄跃酆衔铩笔侵缚扇苡谒囊环N基本不具有抗原性的聚合物，其原子分子量大于約1,000道爾頓。優(yōu)選的是Polymer的有效水力分子量大于約10,000Da，更優(yōu)選的是約為20,000-500,000Da，最優(yōu)選的是約為40,000-300,000Da?！坝行Ψ肿恿俊笔侵咐盟猿叽缗抛鑼游龇?SEC)測定的聚合物鏈的有效水溶化尺寸。當水溶性聚合物包含的聚合物鏈中帶有環(huán)氧乙烷重復單元等聚環(huán)氧烷重復單元時，優(yōu)選的是每條鏈的原子分子量約為200-80,000Da，更優(yōu)選的是約為1,500-42,000Da，最優(yōu)選的是約為2,000-20,000Da。在沒有特別提及的情況下，分子量均指原子分子量。
Polymer組分可具有很寬的分子量范圍以及不同的聚合物亞基。這些亞基可包括生物學聚合物、合成聚合物，或其組合。這些水溶性聚合物的實例包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，其中包括磷酸葡聚糖、P-氨基交聯(lián)糊精和羧甲基糊精，纖維素和纖維素衍生物，其中包括甲基纖維素和羧甲基纖維素，淀粉和糊精，以及淀粉的衍生物和羥基化物，聚二醇及其衍生物，其中包括聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、聚乙二醇同聚物、聚丙二醇同聚物、乙二醇與丙二醇的共聚物，其中，所述同聚物和共聚物的一端可以被或不被烷基取代，肝素和肝素片段、聚乙烯醇和聚乙烯乙醚、聚乙烯吡咯烷酮、天冬酰胺，和聚氧乙烯多元醇酯，以及葡聚糖和葡聚糖衍生物、糊精和糊精衍生物。應該了解的是，所列水溶性聚合物的各種衍生物也包括在內。
水溶性聚合物，如上述水溶性聚合物，已眾所周知，特別是聚乙二醇“PEG”等聚環(huán)氧烷型聚合物(參見例如＂Poly(ethylene glycol)ChemistryBiotechnical and Biomedical Applications＂，J.M.Harris，Ed.，Plenum Press，New York，NY(1992)；and＂Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications＂，J.M.Harris and S.Zalipsky，Eds.，ACS(1997)；and InternationalPatent ApplicationsWO90/13540，WO92/00748，WO92/16555，WO94/04193，WO94/14758，WO94/17039，WO94/18247，WO94/28937，WO95/11924，WO96/00080，WO96/23794，WO98/07713，WO98/41562，WO98/48837，WO99/30727，WO99/32134，WO99/33483，WO99/53951，WO01/26692，WO95/13312，WO96/21469，WO97/03106，WO99/45964，and US Patents Nos.4,179,337；5；075,046；5,089,261；5,100,992；5,134,192；5,166,309；5,171,264；5,213,891；5,219,564；5,275,838；5,281,698；5,298,643；5,312,808；5,321,095；5,324,844；5,349,001；5,352,756；5,405,877；5,455027；5,446,090；5,470,829；5,478,805；5,567,422；5,605,976；5,612,460；5,614549；5,618,528；5,672,662；5,637,749；5,643,575；5,650,388；5,681,567；5,686,110；5,730,990；5,739,208；5,756,593；5,808,096；5,824,778；5,824,784；5,840,900；5,874,500；5,880,131；5,900,461；5,902,588；5,919,442；5,919,455；5,932,462；5,965,119；5,965,566；5,985,263；5,990,237；6,011,042；6,013,283；6,077,939；6,113,906；6,127355；6,177,087；6,180,095；6,194,580；6,214,966)。
更優(yōu)選的Polymer組分包括聚環(huán)氧烷、聚酰胺環(huán)氧烷，或其衍生物。更優(yōu)選的聚環(huán)氧烷和聚酰胺環(huán)氧烷包括通式-(CH2-CH2-O)-的環(huán)氧乙烷重復單元。還更優(yōu)選的Polymer組分是具有通式-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的分子量大于約1,000Da的聚酰胺，其中，X和Y為相同或不同的分支型或線型二價基團，n是2-100的離散整數(shù)，更優(yōu)選的是2-50的離散整數(shù)，并且X和Y之一或二者都含有一種線型或分支型水溶性重復單元，該重復單元具有生物相容性，并且基本不具有抗原性。最優(yōu)選的水溶性重復單元包括通式-(CH2-CH2-O)-或-(CH2-CH2-O)-的環(huán)氧乙烷。這些水溶性重復單元的數(shù)量可以有很大不同，但這些重復單元的更優(yōu)選數(shù)量為2-500、2-400、2-300、2-200、2-100，最優(yōu)選的為2-50。更優(yōu)選的實施方案的實例為，其中的X和Y之一或二者都選自-((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)nl-)-或-((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)，其中，n1為1-6、1-5、1-4，最優(yōu)選的是1-3，n2為2-50、2-25、2-15、2-10、2-8，最優(yōu)選的是2-5。高度優(yōu)選的實施方案的實例為，其中的X為-(CH2-CH2)-，而Y為-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-。
Polymer組分或一種或多種間隔物或連接物，如果存在，可帶有一些生物穩(wěn)定的或可生物降解的聚合物鏈或單元。例如，帶有重復結合鍵的Polymer在生理條件下會根據(jù)鍵的不穩(wěn)定性而具有不同的穩(wěn)定程度。根據(jù)低分子量類似物的已知水解速率，可按照帶有這些鍵的Polymer在生理條件下的相對水解速率對其進行分類，例如，穩(wěn)定性從低到高為聚碳酸酯(-O-C(O)-O-)＞聚酯(-C(O)-O-)＞聚氨基甲酸酯(-NH-C(O)-O-)＞聚原酸酯(-O-C((OR)(R’))-O-)＞聚酰胺(-C(O)-NH-)。與此類似，將水溶性聚合物聯(lián)接于靶分子的鍵系統(tǒng)可以是生物穩(wěn)定的或可生物降解的，例如，穩(wěn)定性從低到高為碳酸酯(-O-C(O)-O-)＞酯(-C(O)-O-)＞氨基甲酸乙酯(-NH-C(O)-O-)＞原酸酯(-O-C((OR)(R’))-O-)＞酰胺(-C(O)-NH-)。這些鍵只作為實例，而不是要限制能夠在本發(fā)明所述水溶性聚合物的聚合物鏈或鍵系統(tǒng)中使用的鍵的類型。
組分J*是一種含有懸垂基團的殘基，該基團在生理條件下的凈電荷選自負值、正值和中性值。該殘基包括取代或未取代的烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、烷芳基、?；?、烷氧基、烯基、炔基、酰胺基、氨基、羰基等等，及其鹽類。優(yōu)選的中性基團為烷基或烷氧基，其中可包括，但不局限于，帶有1-18個碳原子的線型或分支型基團。J*被作為帶電基團提供時可含有一種可電離的功能基團。功能基團的實例包括，但不局限于，羧酸、酯、酰胺、腈、巰基和羥基。J*基團可以是氨基酸、核酸、脂肪酸、糖類及其衍生物的一種成分，也可以是殼多糖、殼聚糖、肝素、磷酸乙酰肝素、軟骨素、磷酸軟骨素、皮膚素和磷酸皮膚素、環(huán)糊精、葡聚糖、透明質酸、磷脂、唾液酸等基團。優(yōu)選的是，J*含有一種選自羧基、氨基、巰基、羥基、磷?；㈦?、咪唑及其鹽類的可電離的基團。最優(yōu)選的是，J*含有一種可電離的羧酸酯基團，并且在生理條件下的凈電荷為負值。例如，本發(fā)明優(yōu)選的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白具有3-7的等電點，因而可利用帶負電荷的J*基團對pI進行精確調節(jié)。
組分s1、s2和s3是相同或不同的間隔物或連接物，這些組分可以分別存在或缺失。優(yōu)選的間隔物或連接物包括，含有一種或多種用于水溶性聚合物的重復單元、二元胺和(或)二元酸單元、天然或非天然氨基酸或其衍生物的線型或分支型基團，以及脂肪族基團，其中包括烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、烷氧基等，優(yōu)選的是這些基團含有多達18個碳原子，甚至含有額外的聚合物鏈。最優(yōu)選的是間隔物或連接物含有一種聚合物鏈。
作為選擇，還可以將上述通式Un-s1-B-s2-Polymer-s3-J*表示為“Un-B-Polymer-J*”，其中，s1、s2和s3基團可以存在，也可以不存在。
更優(yōu)選的Polymer組分是，其中的水溶性聚合物Un-s1-B-s2-Polymer-s3-J*完全是由逐級合成方法產(chǎn)生。這樣可以構建出具有精確分子量和特定結構的聚合物。相比之下，常見的聚合物合成是采用聚合方法，該方法產(chǎn)生的是一種鏈長不同的混合物，其分子量和大小呈分散狀態(tài)，因而其分離即使可能，也非常困難。對分子純度的控制能力是一種優(yōu)勢，因為這樣可構建出聯(lián)接有水溶性聚合物并且呈單分散狀態(tài)的合成蛋白。這種控制能力可作為一個明顯的優(yōu)點，因為這樣可避免由異類化合物帶來的多種特性，同時可以較容易地只制備和分離那些帶有最優(yōu)選特性的化合物。
在另一項優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白含有一種或多種不規(guī)則氨基酸。文中使用的“不規(guī)則氨基酸”是指具有非遺傳編碼側鏈、非遺傳編碼骨架、非遺傳編碼Nα或αC(O)取代基團或其組合的氨基酸，也就是與利用核糖體組裝的20種遺傳編碼氨基酸不同的氨基酸。優(yōu)選的不規(guī)則氨基酸的實例包括，側鏈上帶有一種與遺傳編碼的功能基團不同的特定功能基團的氨基酸，以及假氨基酸和多種氨基酸衍生物。為此，本發(fā)明在促紅細胞生成性合成蛋白的設計和(或)構建方面允許有很寬的選擇性和靈活性。可根據(jù)本發(fā)明使用的非核糖體組裝氨基酸的實例包括，但不局限于D-氨基酸、β-氨基酸、假谷氨酸、γ-氨基丁酸、鳥氨酸、高半胱氨酸、N-取代氨基酸(R.Simon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1992)899367-71；WO91/19735(Bartlett et al.)，美國專利5,646,285(Baindur))、α-氨基亞甲氧乙酸(一種氨基酸-Gly二肽等排體)，和α-氨基含氧酸，以及具有非遺傳編碼側鏈功能基團的其他氨基酸衍生物，等等。也可以使用含有硫酰胺、乙烯酰胺、肼基、甲叉氧、甲叉硫、磷酰胺、羥酰胺、羥乙烯、還原酰胺和取代還原酰胺等排體，以及β-磺酰胺的肽類似物?！凹侔被帷笔侵腹羌芙Y構和側鏈基團與遺傳編碼氨基酸相同，但側鏈原子的原子成分不同的氨基酸。
在一項優(yōu)選實施方案中，提供的促紅細胞生成性合成蛋白在其多肽鏈的不規(guī)則氨基酸上聯(lián)接有水溶性聚合物。更優(yōu)選的是，用于聯(lián)接水溶性聚合物的不規(guī)則氨基酸帶有化學選擇性連接基團，這些基團在遺傳編碼功能基團存在的情況下不會與其發(fā)生反應。
如上所述，完全由逐級組裝方法產(chǎn)生的水溶性聚合物可以呈單分散狀態(tài)，如本發(fā)明優(yōu)選的聚酰胺乙撐氧。因此，另一項優(yōu)選實施方案是，其中的水溶性聚合物呈單分散狀態(tài)(即分子成分是含有特定結構的單一所需分子的均一狀態(tài))。此外，由于可完全利用化學合成方法來制備促紅細胞生成性合成蛋白，因而也可以制備單分散狀態(tài)的這些蛋白。這些化合物的優(yōu)勢是純度高，并且可避免因使用非均向分散聚合物而帶來的純化和分析鑒定問題。這些化合物在可重復性定量給藥等方面也具有優(yōu)勢(例如，與糖蛋白和聚乙二醇化重組蛋白的典型混合物狀態(tài)不同的是含有單一種類的分子)。
如上所述，本發(fā)明的促紅細胞生成生合成蛋白的單體分子量在25kDa以上。就本發(fā)明而言，這些分子量的測定是采用變性SDS聚丙烯酰胺電泳法。術語“單體分子量”是指不同于可能具有多個蛋白或多肽拷貝的合成蛋白的單體合成蛋白的分子量。更優(yōu)選的是，本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白的單體分子量在40kDa以上，更優(yōu)選的是50kDa或更高，最優(yōu)選的是在60-70kDa以上。例如，本發(fā)明優(yōu)選的促紅細胞生成性合成蛋白SEP1-B51的單體分子量約為73kDa。但分子量更高的構建體也將處在本發(fā)明的范圍之內。
在另一項實施方案中，本發(fā)明涉及一種促紅細胞生成性合成蛋白，該蛋白在其連接位點含有一種假氨基酸，并且可選擇性地聯(lián)接有一種水溶性聚合物。這些化合物的產(chǎn)生方法是，使具有半胱氨酸等包含化學選擇性活性功能基團的N-端氨基酸的第一種肽段或多肽段與具有α-羧基硫酯等化學連接相容性C-端功能基團的第二種肽段或多肽段相連接，從而形成一種在連接位點上帶有未保護側鏈功能基團的連接產(chǎn)物，再利用化學方法將連接位點上的未保護側鏈功能基團轉變成假氨基酸，例如將半胱氨酸巰基側鏈羧甲基化成假谷氨酸。由天然化學連接位點的半胱氨酸轉變而成的假氨基酸在文中被稱為“假天然化學連接”，下文將對此進行詳細描述。
此外還提供一種促紅細胞生成性合成蛋白，該蛋白在其連接位點的氨基酸側鏈上聯(lián)接有水溶性聚合物。這些化合物的產(chǎn)生方法是，使具有半胱氨酸等包含化學選擇性活性功能基團的N-端氨基酸的第一種肽段或多肽段與具有α-羧基硫酯等連接相容性C-端功能基團的第二種肽段或多肽段相連接，從而形成一種在連接位點上帶有未保護側鏈功能基團的連接產(chǎn)物，再使水溶性聚合物與連接位點上的未保護側鏈功能基團相聯(lián)接。
利用本發(fā)明的假氨基酸化學連接法和化學連接位點聚合物修飾法會帶來一些優(yōu)于先有技術的優(yōu)勢，其中包括，有效合成不含適當連接位點的一系列不同的促紅細胞生成性合成蛋白，擴展那些可用于通過節(jié)約成本的常規(guī)方式進行位點特異性聚合物修飾的位點(和聯(lián)接性質)，以及合成具有相當分子量的促紅細胞生成性合成蛋白，等等。這些方法還特別適用于高通量模擬對所需生物學特性的精確調節(jié)，其中包括搜索用于聯(lián)接水溶性聚合物的單個或多個位點。
如上所述，通過對聚合物聯(lián)接位點和化學鍵性質的精確調節(jié)，以及對水溶性聚合物的分子量、聚合物成分、結構(如線型與分支型的比例，或其混合物)和懸垂基團(如帶電與不帶電基團的比例，或其混合物)的精確調節(jié)，可以改變本發(fā)明所述聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白的生物學特性。具體地說，促紅細胞生成性合成蛋白上聯(lián)接的水溶性聚合物可以增加蛋白的分子量以延長其半衰期，并使蛋白呈分支結構，等等，此外還可以使蛋白帶有精確的電荷，從而使促紅細胞生成性合成蛋白的等電點約等于帶有該蛋白氨基酸序列的生物產(chǎn)生的相應蛋白。其優(yōu)勢在于可模擬相應核糖體特定蛋白的天然電荷情況。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及一些具有上述組合特性的促紅細胞生成性合成蛋白，以及所使用的水溶性聚合物，特別是能夠在預定位置進行聯(lián)接的具有特定結構的加合聚合物。
具體地說，本發(fā)明優(yōu)選的促紅細胞生成性合成蛋白(“SEPs”)是人尿EPO的聚合物修飾合成類似物。在一項優(yōu)選實施方案中，這些蛋白含有一種或多種通過硫醚鍵、肟鍵、酰胺鍵或其他鍵聯(lián)接于一個或多個肽殘基的水溶性聚合物。在一項高度優(yōu)選的實施方案中，這些連接鍵位于人尿EPO的一個或多個天然糖基化位點上(即第24、38、83和126位)。最優(yōu)選的是，SEP分子在兩個或更多個這些位點上聯(lián)接有聚合物基團。在一項替代實施方案中，還可以有其他蛋白殘基被聚合物基團修飾。本發(fā)明所述促紅細胞生成性合成蛋白的修飾位點包括無規(guī)卷曲中的殘基、蛋白區(qū)域或結構域中的殘基，或潛在蛋白酶剪切位點上或位點附近的殘基。例如，可以在EPO的第9、69和(或)125位中的一個或多個位點上引入聚合物修飾。此外，若有一個或多個剩余的天然糖基化位點未被聚合物修飾，則可以在需要的情況下將這些區(qū)域內的一種或多種氨基酸轉換成其他殘基，例如，需要帶正電荷時可轉換成賴氨酸，或需要帶負電荷時可轉換成天冬氨酸或谷氨酸，或轉換成丙氨酸，等等。本發(fā)明所述SEP分子的總分子量約為25-150kDa，更優(yōu)選的是約為30-80kDa。通過增加或減少用于修飾給定類似物的水溶性聚合物的數(shù)量和結構可以實現(xiàn)對分子量的控制。
舉例來說，聚合物肟聯(lián)SEP類似物的優(yōu)選構建方法是，將氨氧基、酮基或醛基功能化水溶性聚合物與SEP蛋白上具有側鏈氨氧基、酮基或醛基功能的非天然編碼氨基酸相聯(lián)接。例如，SEP-0和1的第89和117位含有假谷氨酸(帶有通式為-CHα-CH2-S-COOH的側鏈(與谷氨酸側鏈-CHα-CH2-CH2-COOH相比)的非天然編碼氨基酸)。利用硫醚鍵構建SEP類似物的優(yōu)選方法是，通過帶有含巰基側鏈的半胱氨酸或非天然氨基酸使其具有巰基功能性。圖10顯示一種優(yōu)選促紅細胞生成性合成蛋白的基本結構。
在一項可選實施方案中，本發(fā)明的SEP分子可包括已將EPO的天然氨基和羧基端重新定位的“循環(huán)置換型”EPO類似物。最優(yōu)選的是通過這種重新定位將氨基和羧基端移至的結構限制性較低的位置，如移至無規(guī)卷曲，等等。這種重新定位位點的實例是第125和126位(相對于天然EPO的殘基編號體系)附近的無規(guī)卷曲。最優(yōu)選的是這些SEPs不含有二硫鍵，并且可通過化學修飾而在選定殘基上帶有聚合物基團。
作為選擇，還可以將SEP分子的氨基和羧基端重新定位于天然的糖基化位點，或重新定位于可被糖基化的其他位點，如第126和125位。SEP分子還含有氨基和羧基端的修飾，以去除或改變電荷(如羧基端酰胺化，等等)。在這些循環(huán)置換型分子的一個優(yōu)選實例中，新N-端和C-端分別位于第126和125位。優(yōu)選的是將可形成二硫鍵的第7、29、33和161位天然半胱氨酸替換成不能形成二硫鍵的非天然編碼氨基酸L-α-N-丁酸。為了提高產(chǎn)量，優(yōu)選的是將殘基R166、E37和V82替換成丙氨酸。此外，優(yōu)選的是在相對于天然EPO編號方案的第1和166位之間插入一個額外的半胱氨酸，下文將其編號為“0”。所得分子含有4個半胱氨酸(在第126、0、38和83位(按N-端至C-端的方向顯示))，這些半胱氨酸可作為(1)連接位點和(2)形成硫醚的pPEG聯(lián)接位點。還可以選擇性地將A125替換成半胱氨酸，以產(chǎn)生一個額外的pPEG聯(lián)接位點。
本發(fā)明的這些SEP分子的總分子量可約為25-150kDa，更優(yōu)選的是約為30-80kDa。通過增加或減少用于修飾給定類似物的水溶性聚合物(如pPEG)的數(shù)量和結構可以實現(xiàn)對分子量的控制。較大構建體在pPEG介導下的水力MW可大于100kDa?？蛇x的pPEG聯(lián)接位點位于第125、9和24位(按N-端至C-端的方向顯示)。其他SEP類似物設計方案是在無規(guī)卷曲中具有替代的N-和C-末端，以及(或)從新N-末端和(或)C-末端位置帶有截短的殘基。圖11顯示優(yōu)選循環(huán)置換型分子的基本結構。圖12顯示優(yōu)選水溶性聚合物的結構，以及不同的線型和分支型構建體。
例如，除本文實施例中描述的特定SEP構建體之外，還通過對天然人EPO序列的循環(huán)置換設計出一種序列，其方式如下利用額外的Cys殘基使天然的N-端Ala1與C-端Arg166相聯(lián)接，從而產(chǎn)生一種含有167個氨基酸的多肽；創(chuàng)建新N-端和C-端的方法是使多肽鏈在天然序列的第125-126位殘基處斷裂；將所有天然Cys殘基替換成L-α氨基-n-丁酸殘基；并進行如下取代Glu37Ala；Asn38Cys；Val82Ala；Asn83Cys；Ser126Cys；Arg166Ala(所有殘基編號都是基于天然人EPO序列)。這些設計要素的共同結果是產(chǎn)生所示的SEP-5氨基酸序列。通過Michael加成反應，用馬來酰亞胺修飾的線型(TTD-Succ)6羧基酯聚合物構建體對SEP-5-L28蛋白的第126、0、24、38和83位Cys殘基(基于人EPO序列的編號方式)進行聚合物修飾。這些變化可用于改善SEP-5-L28蛋白的合成和操作。用4種各含有N-端Cys殘基的肽段制備出所設計的序列。化學連接位點為Cys0、Cys38、Cys83。合成這些肽，其中C-端肽是一種α-羧基酯；另3種肽是α-硫酯，因而N-端Cys殘基的側鏈被Acm保護。Cys24的側鏈未被保護。從C-端的兩種肽段開始，利用天然化學連接依次使這些肽段相聯(lián)接。然后通過Michael加成反應使連接位點的游離Cys側鏈與馬來酰亞胺修飾的線型(TTD-Succ)6羧基酯聚合物構建體反應，再將Cys側鏈上的Acm保護基團去除，并以類似方式進行下一種肽段的連接和聚合物修飾。在去除Acm基團并連接下一種(第4種)肽段之后，以類似方法去除最終的Acm基團并進行聚合物修飾，從而產(chǎn)生圖30所示的上述循環(huán)置換型聚合物修飾SEP構建體。
II.本發(fā)明所述促紅細胞生成性合成蛋白的產(chǎn)生盡管聚合物修飾促紅細胞生成蛋白在此前已有相關的描述，但本發(fā)明與這些早期成果有明顯的不同。例如，本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白是完全或部分通過化學方法合成的。而且本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白上有一個或多個特定的、自選的和自定的位點被水溶性聚合物修飾。
此外，本發(fā)明的促紅細胞生成蛋白的合成產(chǎn)生方法能夠確保制劑中每個分子的每個自選位點和自定位點上都帶有這些修飾。這種合成的一致性和可控性使本發(fā)明與先有技術中實現(xiàn)隨機修飾的方法有顯著的區(qū)別。值得注意的是，本發(fā)明允許設計一種促紅細胞生成性合成蛋白，該蛋白的任何非關鍵殘基都可以通過衍化而包含一種加合聚合物。此外，用戶可以明確規(guī)定所有這些自選位點和自定位點上用于使所述加合物結合于多肽或蛋白骨架的連接鍵(酰胺鍵、硫酯鍵、硫醚鍵、肟鍵，等等)。而且還可以改變和控制希望在特定位點上出現(xiàn)的特定加合聚合物，從而使終產(chǎn)物中的每種蛋白或多肽都在完全相同的衍化位點上精確含有相同的衍化加合物。因此，本發(fā)明能夠產(chǎn)生均一的聚合物修飾促紅細胞生成多肽和蛋白制劑。
本發(fā)明不但提供一種方法，用于改變與水溶性聚合物結合的聯(lián)接位點的位置和數(shù)量，而且還允許改變結合聚合物的性質。在任何特定的自選位點和自定位點上引入的加合聚合物可以是任意規(guī)定的長度。與本發(fā)明所述方法相同的是，還可以在不同的位點使用不同長度的聚合物。因此，在一項實施方案中，本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白可以被水溶性加合聚合物單重修飾，也可以被多重修飾。當在特定多肽或蛋白中引入一種以上的加合聚合物時，使用的聚合物可以是“單類的”、“復類的”、“均一類的”或“不同類的”。文中使用的術語“單類的”是指多肽或蛋白被單一種類的聚合物修飾。相比之下，術語“復類的”是指多肽或蛋白被一種以上的單一聚合物修飾。如果復類多肽或蛋白的每個修飾位點上存在單一種類的相同聚合物，則可認為這些多肽或蛋白是“均一類的”。相比之下，如果復類多肽或蛋白的修飾位點被不同類型的聚合物修飾，則可認為這些多肽或蛋白是“不同類的”。
此外還可以改變每個自選位點和自定位點上的加合聚合物的線性程度或分支程度。因此，加合聚合物可以是線型的、分支型的或均一分支型的。術語“均一分支型”是指特定位點上的聚合物的所有分支具有相同的結構和長度。正如我們所了解的，本發(fā)明可以獨立地改變任何單一分支的長度，以及出現(xiàn)在該分支點上的聚合物的結構。
總而言之，本發(fā)明可以規(guī)定多肽或蛋白骨架中被聚合物修飾的自選位點和自定位點的(1)位置和(2)頻率，并可以控制所有這些位點上出現(xiàn)的分支的(3)長度、(4)種類和(5)程度。此外，對帶有多種聚合物修飾的多肽和蛋白而言，本發(fā)明可以獨立地規(guī)定每個位點的上述所有5種變量。此外，對帶有分支型聚合物修飾的促紅細胞生成性合成多肽和蛋白而言，本發(fā)明可以獨立地規(guī)定每個分支點的上述所有5種變量。這樣就可以合成聚合物精確修飾的促紅細胞生成性合成蛋白的均一組合物，這些蛋白帶有多個拷貝的任一種或所有20種不含多余聚合物聯(lián)接的遺傳編碼氨基酸側鏈。
因此，本發(fā)明在聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白的設計、合成和應用方面提供了很大的靈活性。例如，本發(fā)明所述促紅細胞生成性合成蛋白的氨基酸序列與對應的遺傳編碼蛋白的氨基酸序列相比可含有一個或多個缺失、插入或取代。該氨基酸序列可以用一種或多種不規(guī)則氨基酸進行取代，例如假氨基酸和(或)帶有非天然側鏈的其他氨基酸，如經(jīng)過修飾而帶有用于聯(lián)接水溶性加合聚合物的單一化學選擇性功能基團的氨基酸，等等。因此，水溶性聚合物的聯(lián)接可以通過不規(guī)則氨基酸來實現(xiàn)，也可以通過遺傳編碼的氨基酸來實現(xiàn)。該水溶性聚合物可以是線型或分支型的，并且可帶有一種含羧酸、脂肪鏈、酰胺或胺等化學基的末端基團。此外，該水溶性聚合物可以呈單分散狀態(tài)，即含有單一種類的具有明確規(guī)定的結構和成分的分子。因而可以設計該水溶性聚合物的性質，用于精確調節(jié)其修飾的靶蛋白的半衰期、免疫原性、效力、保存穩(wěn)定性、劑量、供應能力，等等。
具體地說，本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白的產(chǎn)生方法可能包括以下步驟設計、肽合成、肽連接、使全長連接產(chǎn)物折疊以產(chǎn)生蛋白，以及評定該蛋白的生物活性。我們發(fā)現(xiàn)，聚合物修飾可以在肽合成、肽連接或產(chǎn)物折疊步驟的一個或多個步驟中實現(xiàn)。但優(yōu)選的是在折疊之前將聚合物聯(lián)接于肽或連接產(chǎn)物。在利用該方法產(chǎn)生的蛋白中篩選具有所需生物活性的蛋白，這些蛋白即可作為本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白。
在一種優(yōu)選方法中，含有促紅細胞生成性合成蛋白的多肽鏈的制備方法是，將含有促紅細胞生成性合成蛋白的非重疊性多肽鏈氨基酸序列的肽段進行化學連接。具體地說，本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白分子的制備方法是將含有所需促紅細胞生成性合成蛋白的非重疊性多肽鏈氨基酸序列的肽段進行化學連接，其中，用于連接的一種或多種肽段在自定位點和預定位點上聯(lián)接有水溶性聚合物。然后使聚合物修飾的多肽鏈折疊，以產(chǎn)生本發(fā)明的一種聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白。
用于產(chǎn)生本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白的另一種優(yōu)選方法包括，將含有本發(fā)明所述聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白的非重疊性多肽鏈氨基酸序列的肽段進行化學連接，并在一種或多種化學連接位點的氨基酸側鏈上聯(lián)接一種或多種水溶性聚合物。然后使聚合物修飾的多肽鏈折疊，以產(chǎn)生本發(fā)明的一種聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白。
盡管優(yōu)選程度較低，但促紅細胞生成性合成蛋白的制備方法還可以是，(1)將含有促紅細胞生成性合成蛋白的非重疊性多肽鏈氨基酸序列的肽段進行化學連接，以產(chǎn)生與促紅細胞生成性合成蛋白相一致的全長多肽鏈，其中至少有一種肽段含有一個不規(guī)則氨基酸，該氨基酸帶有第一種化學選擇性功能基團，(2)使多肽鏈折疊，并且(3)使其與含有第二種化學選擇性基團的水溶性聚合物相聯(lián)接，第二種化學選擇性基團能夠與第一種化學選擇性基團彼此特定地反應。
具體地說，本發(fā)明包括的以及實施例中例舉的這些用于合成促紅細胞生成性合成蛋白的不同方法可以按附圖所示加以說明。例如，圖1A-1E顯示在連接前或在連接后使水溶性聚合物(文中定義的U-B-Polymer*)聯(lián)接于部分未保護肽段或完全未保護肽段( )的連接方法，或其組合方法。在圖1A-1D中，Yaa表示第一肽段上帶有特定化學選擇性基團的C端氨基酸(如帶有α-羧基硫酯的氨基酸)，該化學選擇性基團可用于與第二肽段的化學連接，第二肽段上帶有一種能夠與Yaa產(chǎn)生化學選擇性化學連接的可彼此反應的特定N端氨基酸Xaa(如氨基末端半胱氨酸)基團。Yaa與Xaa的化學選擇性反應可在彼此之間產(chǎn)生一種共價鍵(如酰胺鍵)。因此，Yaa與Xaa可形成一種化學選擇性配對連接。圖中的Un-表示另一種被精確摻入到自定位點的氨基酸側鏈上的特定化學選擇性基團，該基團對水溶性聚合物U-B-Polymer-J*上的U基團具有化學選擇性，并且可彼此反應。例如，當Un是一種經(jīng)過修飾而帶有酮基的側鏈時，水溶性聚合物U-Polymer-J*上的U-可以是一種能夠與酮基產(chǎn)生化學選擇性反應的基團，例如與酮基產(chǎn)生肟鍵的氨氧基。Un-的下標“n”表示用于攜帶化學選擇性基團U的氨基酸或其側鏈的數(shù)量，例如，當有兩個自定的具體位點要被聚合物修飾時，n＝2，此時也可以表示為U2或Un-2。n始終是一個正整數(shù)，通過設計可以精確地控制n的大小。因此，Un和U表示另一種與化學選擇性基團Xaa和Yaa不反應并且相容的化學選擇性配對連接。圖1A和1B說明兩種不同的可能反應。在描述的第一種反應中，帶有Un功能性的多肽鏈與另一種多肽相連接，然后與U-B-Polymer-J*基團反應，以產(chǎn)生聚合物修飾的多肽。在描述的第二種反應中，帶有Un功能性的多肽鏈與U-B-Polymer-J*基團反應，以產(chǎn)生聚合物修飾的多肽，然后再與另一種多肽連接，以產(chǎn)生更長的聚合物修飾多肽。這兩個圖的區(qū)別在于，圖1A中是帶有Xaa殘基的多肽被聚合物修飾，而圖1B中是帶有Yaa殘基的多肽被聚合物修飾。圖1C說明本發(fā)明能夠在連接成較長多肽之前或在連接之后對多種多肽進行修飾。在圖1D中，PG和PG’代表保護基團，其中PG’表示一種正交保護基團，即PG和PG’能夠在不同的條件下被去除，從而可用于不同的水溶性聚合物通過相同的化學鍵聯(lián)接于Un基團的情況，或Un基團是不希望被聚合物修飾的側鏈功能基團(例如，在水溶性聚合物的U基團被設計成專門與伯氨基或側鏈巰基反應的條件下，帶有活性-NH2或-SH的側鏈)的情況。圖1D顯示，可以用保護基團來保護按本發(fā)明所述方法進行連接的多肽中的特定側鏈。
圖1E說明一些基團的差異，這些基團可以在用于圖1A-1D所示連接方法和聚合物修飾方法的肽段中存在，也可以不存在。
圖2A-2C顯示本發(fā)明所述促紅細胞生成性合成蛋白的其他制備方法的示意圖。具體地說，圖2A-2B描述連接的方法，該方法涉及將水溶性聚合物U-B-Polymer-J*聯(lián)接于氨基末端Xaa基團側鏈上的連接位點(如半胱氨酸的側鏈巰基)。圖2C說明一些基團的差異，這些基團可以在用于圖2A-2B所示連接方法和聚合物修飾方法的肽段中存在，也可以不存在。
圖3A-3B顯示用于實現(xiàn)多片段連接的其他方法的示意圖，該方法涉及將3種或3種以上的非重疊肽段進行化學連接，即相對于全長連接終產(chǎn)物而言，至少有一個肽段為中間片段。由這種方式制備的肽可用于產(chǎn)生在另一連接反應中使用的肽段，例如圖1A-1E、圖2A-2C和圖4A-4C所示的連接反應。一般而言，根據(jù)所用的化學連接方法，用于多片段連接的中間片段帶有被保護的Xaa基團或被保護的Yaa基團，以避免肽發(fā)生環(huán)化或形成多聯(lián)體。在順序連接或連續(xù)連接反應中，中間片段的Xaa基團被保護(例如，Cys(Acm))，而其Yaa基團則無保護(例如，Yaa-COSR，其中-COSR是α-羧基硫酯)。這里的Yaa基團可隨意地與帶有無保護的Xaa基團的第二種肽反應，其中第二種肽沒有游離的Yaa基團。連接完成后，去除保護基團以再生出用于下一連接反應的Xaa基團。該過程可根據(jù)需要繼續(xù)進行，從而產(chǎn)生延伸的多肽鏈。保護Yaa基團對匯聚化學連接尤為有用，包括產(chǎn)生由四種或更多種片段構成的連接終產(chǎn)物。舉例來說，對一種由四片段連接(即進行三次連接)而定向產(chǎn)生的蛋白而言，可以將對應于蛋白一個末端的兩種片段以及對應于蛋白另一末端的兩種片段并行連接，而不是順序連接，然后通過最終連接反應使兩個末端結合。這種匯聚型化學連接方案也可以采用正交連接的化學物。圖1E、2C和4C再次說明了肽段中存在或不存在的一些基團的差異。
圖4A-4C說明如何按照本發(fā)明的原理來實現(xiàn)所得側鏈巰基的天然化學連接和化學修飾。具體地說，圖4A-4B描述的是利用連接位點上所得半胱氨酸側鏈巰基的天然化學連接和化學修飾方法，通過巰烷基化并產(chǎn)生含有硫酯鍵的化學修飾側鏈(用ψ表示)來形成一種“假氨基酸”(用ψXaa表示)。在一項未描述的可選實施方案中，可以通過脫硫反應將該側鏈巰基轉變成丙氨酸(Liang et al，J.Amer.Chem.Soc.(2001)123(4)526-533)。這兩種反應的一個重要方面是，任何不希望被轉變或修飾的其他側鏈巰基都應當用一種適當保護基團(PG)加以保護，或在多片段連接中用正交保護基團(PG’)加以保護，其中帶有羧基末端Yaa基團的片段包含一種被保護的氨基末端Xaa基團，即PG-Xaa-肽，通過圖4B中的例子提供說明。圖4C說明根據(jù)圖4A-4B以及圖1A-1E、圖2A-2C和圖3A-3B，在用于連接和聚合物修飾中的肽段上可能存在或缺失的各種不同基團。
結合設計，構建用于合成多肽骨架的肽或多肽片段。其中包括根據(jù)選用于組裝各種多肽骨架片段的連接化學反應來選擇適當?shù)倪B接位點、為指定靶蛋白選擇聚合物結合化學反應，以及選擇特殊的聚合物結合位點。當使用天然化學連接時，通過在靶多肽骨架氨基酸序列中搜索適當?shù)奶烊话腚装彼釟埢鶃泶_定半胱氨酸連接位點。當使用“擴展的天然化學連接”時，如文中所述，則可以通過在靶多肽骨架氨基酸序列中搜索允許堅固連接的適當?shù)奶烊贿B接位點結合處來選擇連接位點，如Xaa-Gly位點。由于擴展的天然化學連接不局限于在半胱氨酸殘基處連接，任何氨基酸殘基都可以作為連接位點結合處。在某些情況下，結合天然化學連接和擴展的天然化學連接可能是設計的一部分。
在一項優(yōu)選實施方案中，可利用天然化學連接來產(chǎn)生部分或所有全長多肽鏈。在與促紅細胞生成性合成蛋白對應的天然蛋白中存在的半胱氨酸可被用作化學連接位點。但是當優(yōu)選連接點上沒有適當?shù)陌腚装彼釙r，可以將該位點上的非半胱氨酸氨基酸替換成半胱氨酸，以使該位點能夠發(fā)生天然化學連接。如果需要，還可以按照文中的描述將新引入的半胱氨酸轉變成與該位點的伯氨基酸相對應的假氨基酸殘基。作為選擇，當在某個位點上引入用于聚合物修飾的半胱氨酸時，可利用其側鏈巰基來聯(lián)接巰基反應性水溶性聚合物構建體，條件是靶多肽上不希望被修飾的其他所有半胱氨酸都已被保護。
在另一項優(yōu)選實施方案中，可利用文中描述的擴展的天然化學連接方法來產(chǎn)生部分或所有全長多肽。該方法是使用N-末端的Nα-取代2或3碳鏈的烷基或芳基巰基氨基酸。根據(jù)文中描述的擴展的天然化學連接方法，可以有利地使用這些殘基(當存在于用于連接的肽段或多肽段的N-端時)將這種多肽連接于一種帶有C-端α-羧基硫酯基團的多肽。
用于合成肽類的常用方法是，用標準的自動化肽合成儀進行標準的Boc和(或)Fmoc逐級固相肽合成，或按照標準方法進行手動合成，也可以從供應商處定制和購買。(“合成肽，用戶指南”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“肽合成原理，第二版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；“肽合成準則，第二版”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；以及“保護基團”，P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994；“Fmoc固相肽合成，實用方法”，Eds.，W.C.Chan和P.D.White，Oxford UniversityPress，2000)。用于硫酯介導型連接連接的肽類，如用于天然化學連接的肽類，也可以用標準方法制備。(可參考，例如，Dawson et al.，Science(1994)266776-779；Canne et al.，Tetrahedron Lett.(1995)361217-1220；Kent，et al.，WO96/34878；Kent，et al.，WO98/28434；Ingenito et al.，JACS(1999)121(49)11369-11374；and Hackeng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)9610068-10073；Amiato et al.，同上)
在水溶性聚合物的連接和位點特異性聯(lián)接過程中，肽的合成采用的是化學正交策略(參考，例如，圖1-4和實施例)，以便能避免造成不必要聯(lián)接的副反應。舉例來說，根據(jù)連接方案和聚合物聯(lián)接方法，可以采用不同的正交合成策略。具體地說，應該考慮的因素有，用于聯(lián)接的水溶性聚合物的性質，特別是其與多肽結合的功能基團，例如下文針對本發(fā)明優(yōu)選的擬糖聚合物進行的論述。
具體地說，制成的上述水溶性聚合物包含一種特有的功能基團U，該基團能選擇性地與用于連接的靶肽、全長物質、甚至折疊多肽上的一種特有的功能基團反應。由于使用了化學合成方法，所以制成的肽在精確自定位點含有一種可彼此反應的化學選擇性基團。本發(fā)明的該方面包括肽合成原理(保護基團策略)和化學連接(部分保護或無保護基團策略)。在保護基團策略中，除了水溶性聚合物上所需的功能基團外，靶分子上所有可能的反應性功能基團及其可彼此反應的功能基團都用適當?shù)谋Ｗo基團封閉。已知的許多保護基團都適合用于該目的(可參考，例如，“有機合成中的保護基團”，第三版，T.W.Greeneand P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochemCatalog 2000；“合成肽，用戶指南”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman& Company，New York，NY，1992；“Advanced Chemtech組合有機化學與固相有機化學手冊”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhoded，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；“肽合成原理，第二版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Yerlag，1993；“肽合成準則，第二版”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Yerlag，1994；以及“保護基團”，P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
因此，制成的水溶性聚合物可具有各種功能基團，例如上文描述的那些功能基團。在部分保護或無保護基團策略中，所使用的聚合物上的功能基團及其可彼此反應的存在于靶肽或靶多肽上的功能基團是一種化學選擇性反應對，反應系統(tǒng)中即使存在其他功能基團也不會發(fā)生反應。其中包括可用于胺捕獲策略(例如通過半胺形成、亞胺形成和Michael加成反應而連接)、巰基捕獲策略(例如通過硫醇鹽形成、二硫化物交換而連接)、天然化學連接策略(例如通過硫酯交換，其中包括側鏈含有半胱氨酸或巰基的氨基酸衍生物)，以及正交連接耦聯(lián)策略(例如通過噻唑烷形成、硫酯交換、硫酯形成、二硫化物交換和胺形成而連接)的基團(可參考，例如，Coltart，DM.，Tetrahedron(2000)563449-3491)。
該實施方案中優(yōu)選的化學選擇性U基團應包含一種帶有特異功能基團的殘基，該功能基團可用于水兼容性化學連接，如天然化學連接(Dawson，et al.，Science(1994)266776-779；Kent，et al.，WO96/34878)、擴展的常規(guī)化學連接(Kent，et al.，WO98/28434)、肟型化學連接(Rose，et al.，J.Amer.Chem.Soc.J.Amer.Chem.Soc.(1994)11630-33)、硫酯型連接(Schnlzer，et al.，Science(1992)256221-225)、巰醚型連接(Englebretsen，et al.，Tet.Letts.(1995)36(48)8871-8874)、腙型連接(Gaertner，et al.，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338)，以及噻唑烷型連接和惡唑烷型連接(Zhang，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189；Tam，et al.，WO95/00846)或其他方法(Yan，L.Z.andDawson，P.E.，“利用天然化學連接與脫硫的組合方法來合成不含半胱氨酸殘基的肽和蛋白質”，J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，在此引入作為參考；Gieselnan et al.，Org.Lett.20013(9)1331-1334；Saxon，E.et al.，“Traceless”staudingerLigation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds，Org.Lett.2000，2，2141-2143)。
根據(jù)上文描述的多種聯(lián)接化學性質，在水溶性聚合物與靶肽或靶多肽之間形成的鍵可選自羧酸酯鍵、酯鍵、尿烷鍵、原酯鍵、酰胺鍵、胺鍵、肟鍵、酰亞胺鍵、脲鍵、硫脲鍵、硫醚鍵、硫尿烷鍵、硫酯鍵、醚鍵、噻唑烷鍵、腙鍵、惡唑烷鍵，等等。最優(yōu)選的鍵是肟鍵和酰胺鍵。
上述肽連接反應步驟，如圖1-4所示，可以使用固相或液相連接策略。圖8描述了另一種用于將水溶性聚合物與一種肽段精確聯(lián)接的方法，該肽段可用于連接產(chǎn)生本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白。第一步使用了固相肽合成(“SPPS”)(例如Fmoc或Boc SPPS)，其中與聚合物定向連接的氨基酸側鏈被一種正交保護基團所保護(例如，如果用Fmoc SPPS，可使用Boc基團來保護聚合物結合位點，或者，如果用Boc SPPS，則可以使用Fmoc基團作為正交保護基團)。在肽合成之后，上述正交保護基團被選擇性地去除，而其余的肽仍被保護。這樣就為下一步固相聚合物合成提供了單一結合位點。一旦正交保護基團被去除，聚合物鏈就作為一種前體被結合。更優(yōu)選的是用圖6A-6D中描述的方法逐輪的合成該聚合物鏈。盡管只顯示了一種單一聚合物結合位點，但是可提供的多于一種。圖9顯示整個反應的流程圖。
如上所述，化學連接涉及在第一種化學成分和第二種化學成分之間形成一種選擇性共價鍵的過程。使用第一種和第二種成分上存在的可彼此反應的特異功能基團可以使連接反應具有化學選擇性。舉例來說，肽和多肽的化學連接涉及帶有相容的可彼此反應的C-端和N-端特異氨基酸殘基的肽或多肽片段的化學選擇性?？衫枚喾N不同的化學反應來實現(xiàn)該目的，其實例包括天然化學連接(Dawson，et al.，Science(1994)266776-779；Kent，et al.，WO96/34878)、肟型化學連接(Rose，et al.，J.Amer.Chem.Soc.J.Amer.Chem.Soc.(1994)11630-33)、硫酯型連接(Schnlzer，et al.，Science(1992)256221-225)、巰醚型連接(Englebretsen，et al.，Tet.Letts.(1995)36(48)8871-8874)、腙型連接(Gaertner，et al.，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338)，以及噻唑烷型連接和惡唑烷型連接(Zhang，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189；Tam，et al.，WO95/00846；美國專利5,589.356)；Gieselman et al.，Selenocysteine介導的天然化學連接(Org.Lett.(2001)3(9)1331-1334))；以及Staudinger酰胺型化學連接(Saxon et al.，Org.Lett.(2000)22141-2143)。因此，可以理解，能用于聯(lián)接未保護肽段的任何化學選擇性反應化學都適用于該目的。
選擇給定的連接化學反應條件是為了維持連接反應中使用的肽或多肽的所需的相互作用。例如，pH和溫度、連接反應標記物在水中的溶解度、第一種片段與第二種片段的比率、水含量以及反應混合物的成分，都可以被改變以優(yōu)化連接。利用添加或去除能使連接片段以不同程度溶解的試劑可進一步控制所需連接反應的特異性和速率，即通過操縱肽或多肽片段的溶解度來控制反應基團的暴露程度和提供量。通過對所需的化學選擇性反應產(chǎn)物與一種或多種內部對照和(或)外部對照的比較結果進行分析，可以容易地確定反應條件。
當連接涉及接合具有N-末端半胱氨酸殘基的多肽時，優(yōu)選使用天然化學連接方法(Dawson，et al.，Science(1994)266776-779；Kent，et al.，WO96/34878)。該方法被證實是一種用以在連接位點產(chǎn)生天然酰胺鍵的可靠方法。天然化學連接涉及在具有C-末端α-羧基硫酯基團的第一種肽或多肽片段和具有N-末端半胱氨酸殘基的第二種肽或多肽之間發(fā)生的一種化學選擇性反應。巰基交換反應產(chǎn)生了一種初始硫酯-聯(lián)中間體，其自發(fā)地重排以在連接位點上形成一種天然酰胺鍵，同時再生出半胱氨酸側鏈巰基。在許多情況下，天然蛋白的序列會包含位置適當?shù)陌腚装彼幔瑥亩梢院铣删哂蠳-末端半胱氨酸殘基的多肽片段，并將其用于天然化學連接。在另外的一些情況下，可以引導肽合成，以便在多肽中引入半胱氨酸殘基以實現(xiàn)該目的。例如在其標準形式，天然化學連接涉及在靶多肽序列的半胱氨酸殘基上發(fā)生的硫酯-介導的化學選擇性反應；在連接位點上形成了一種肽鍵，并且再生出天然形式的Cys的側鏈。
作為選擇，通過使用“假天然化學連接”或“擴展的天然化學連接”可以合成出本發(fā)明的蛋白。假天然化學連接涉及使用在用于蛋白合成的肽類中的預選位置上的非天然的假氨基酸殘基(例如，見圖4)。該假氨基酸的結構既模擬了半胱氨酸的結構，又模擬了在合成蛋白的這種預選位置上發(fā)現(xiàn)的天然氨基酸的結構。因此，假天然化學連接涉及由天然化學連接在連接位點產(chǎn)生的半胱氨酸的側鏈的硫烷化。一個優(yōu)選方面是，在發(fā)生半胱氨酸硫烷化的連接位點處，至少有一種肽含有一個具有經(jīng)一種適當保護基團保護的巰基的天然半胱氨酸。
在本發(fā)明的一項優(yōu)選實施方案中，半胱氨酸基團的巰基部分被修飾成為一種預期的側鏈，例如，一種核糖體特異性氨基酸及其類似物的側鏈，，或一種非核糖體特異性氨基酸的側鏈。文中所用的核糖體特異性氨基酸是指，在蛋白翻譯過程中可被核糖體識別并摻入到核糖體所產(chǎn)生的蛋白中的氨基酸。大量已發(fā)表的文獻中都有關于對半胱氨酸側鏈巰基進行化學修飾的描述(可參考，例如，”蛋白科學中的通用方法”，由John E.Coligan et al.，John Wiley & Sons主編，NY(2000))。Kaiser，E.T.對轉變半胱氨酸的側鏈以模擬天然氨基酸側鏈的特性進行了描述(參考，例如，Kaiser，E.T.et al.，“酶活性位點的化學改變”，Science.1984 Nov 2；226(4674)505-11)。此外，也描述了使用半胱氨酸側鏈來將一種標記物引入肽或蛋白的方法。關于半胱氨酸側鏈修飾的綜述可參考“蛋白接合和交聯(lián)化學”，S.S.Wong，(1991，CRC Press)；“蛋白質的化學修飾”，Gary E.Means et al.，(1971，Holden-day)，“蛋白質的化學修飾精選方法和分析過程”，Glazer，A.N.et al.，(1975，Elsevier)；“用于蛋白修飾的化學試劑”，RL Lundblad(1991，CRC Press)。Tam et al.(Biopolymers(1998)46319-327)公開了將同型半胱氨酸用于非-Cys天然化學連接，然后用對-硝基苯磺酸鹽(甲基化試劑)將同型半胱氨酸側鏈通過硫烷化而轉變?yōu)樘烊患琢虬彼岬膫孺?-CH2-CH2-S-CH3)的方法。此外，本發(fā)明也可被用于將同型半胱氨酸轉變?yōu)榧侔被?，即轉變?yōu)槌琢虬彼嵬獾钠渌被?。但是，根?jù)本發(fā)明，對至少含有一個不希望被轉變的天然半胱氨酸的肽而言，在配對形成二硫化物的過程中必須使用保護基團來避免其天然半胱氨酸被破壞，這與文中描述的半胱氨酸轉變方法相同。適當?shù)谋Ｗo基團將在下文描述。
雖然假天然化學連接方法無助于模擬某些核糖體特異性氨基酸的側鏈(如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸及脯氨酸的側鏈)(但丙氨酸側鏈可以通過脫硫反應來形成(Liang，Z.Y.and Dawson，P.E.，“利用天然化學連接與脫硫的組合方法來合成不含半胱氨酸殘基的肽和蛋白質”，J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，在此引入作為參考))，但是可用于形成與多種核糖體特異性氨基酸或非編碼氨基酸類似的側鏈。按照本發(fā)明的假天然化學連接方法產(chǎn)生的氨基酸將含有巰醚鍵，而且不具有β-分支(因為它們的β位上都是甲基，即aa-CH2-S-)。因此，β-分支型氨基酸、異亮氨酸和蘇氨酸的假氨基酸形式可以具有懸垂側鏈結構，而沒有β幾何結構和相應的幾何約束。
值得注意的是，本發(fā)明的上述方法可用于形成與核糖體特異性氨基酸側鏈的長度相同或更長或更短的氨基酸側鏈。利用側鏈長度的這種變化可以使三維構象穩(wěn)定(或不穩(wěn)定)，以增加蛋白的穩(wěn)定性(或增強蛋白改變自身構象的能力，從而能接受與天然蛋白的底物、抑制劑、受體、配體等不同的底物、抑制劑、受體、配體)。例如，cys-CH2-SH+Br-CH2-COOH得到Cys-CH2-S-CH2-COOH(這種“假谷氨酸”具有一個額外的側鏈原子，即-S-基；作為選擇，如果在上述位置中使用天冬氨酸，所得產(chǎn)物會具有兩個額外的側鏈原子，即-S-CH2-基)。其他側鏈也具有相同數(shù)量的側鏈原子，但不同的是摻入了巰醚鍵(-S-)。例如，Cys-CH2-SH+Br-CH2-NH-PG，在去除PG后得到Cys-CH2-S-CH2-NH2。所得結構的側鏈中沒有額外原子，但是一個-CH2-基團被-S-所代替。本文的另一個實例是甲硫氨酸，Cys-CH2-SH+I-CH2-CH3得到Cys-CH2-S-CH2-CH3(與天然甲硫氨酸的結構對比Met-CH2-CH2-S-CH3)；從而巰醚被重定位了。精氨酸也是如此Cys-CH2-SH+Br-CH2-NH-CH((-NH2)(＝NH2+))得到Cys-CH2-S-CH2-NH-CH((-NH2)(＝NH2+))。優(yōu)選的是將反應性氨基保護起來，具體地說，在構建假賴氨酸過程中使用該方法可避免不必要的副反應。一旦硫烷化反應完成，即可去除保護基團。
總的來說，當需要盡可能地模擬天然蛋白時，最優(yōu)選的是使用與蛋白在該位置正常出現(xiàn)的核糖體特異性氨基酸的側鏈長度相同的假氨基酸分子；優(yōu)選程度較低的是使用比核糖體特異性氨基酸的側鏈長一個原子的假氨基酸分子，優(yōu)選程度更低的是使用比核糖體特異性氨基酸的側鏈長兩個原子的假氨基酸分子。此外，在選擇半胱氨酸連接位點時，優(yōu)選的是不會發(fā)生遺傳突變而破壞其功能的位點，或該位置上的氨基酸是相關蛋白中的保守氨基酸的位點。利用丙氨酸掃描、同源性模擬以及其他方法可以確定這些位點。
與天然化學連接相同，假天然化學連接也是將含有氨基末端半胱氨酸殘基的肽與含有羧基末端硫酯的肽相連接。然后使半胱氨酸的巰基側鏈與通式為Raa-X的一種化合物反應，其中，X是一種有用的保留基團，而Raa是一種基團，其結構模擬了核糖體特異性氨基酸或合成氨基酸的側鏈末端部分。
值得注意的是，用于假天然化學連接的半胱氨酸側鏈可以是天然的L一型，也可以是D-型。使用D-型可以在連接位點引入蛋白酶抗性，因此，當需要增加蛋白酶解穩(wěn)定性時，可能需要使用D-型半胱氨酸。但使用D-型半胱氨酸時，該位點的骨架結構會發(fā)生改變。除蛋白酶抗性外，這種變化還可用于改變生物活性。但是，為了盡可能減小對生物活性的影響，優(yōu)選的是將D-型半胱氨酸定位于無序區(qū)等具有高度柔性的位點，例如所得折疊分子表面的無規(guī)卷曲部位，或分子的無序末端。理想的是通過假天然化學連接將帶電的大側鏈(如Lys、Arg、Asp或Glu的側鏈)置于合成分子的表面。
合適的有用保留基團X的實例包括鹵素，特別是碘和溴。Raa基團的實例包括PO4、COOH、COO、CONH2、胍鹽、胺、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、咪唑、烷化咪唑、吲哚或烷化吲哚基團。
選擇使用何種Raa取決于需要在特定位置上呈現(xiàn)的氨基酸側鏈。因此，以具有如下氨基酸序列的一種預期多肽或蛋白為例 其中Q和W分別表示可以存在或缺失的額外氨基酸殘基，aax和aay表示內部相鄰殘基(分別具有側鏈x和y)，而aaNH2和aaCOOH分別表示多肽或蛋白的氨基(N-)末端殘基和羧基(C-)末端殘基，該多肽或蛋白的合成方法是制備兩種肽段 和Cys-W-aaCOOH其中Cys表示用半胱氨酸替換aay，并且R是與硫酯基團相容的任何基團，其中包括，但不局限于，芳基、芐基和烷基。R的實例包括3-羧基-4-硝苯基硫酯、芐酯和巰基丙酸亮氨酸酯(參考，例如，Dawsonet al.，Science(1994)266776-779；Canne et al.，TetrahedronLett.(1995)361217-1220Kent，et al.，WO96/34878；Kent，et al.，WO98/28434；Ingenito et al.，JACS(1999)121(49)11369-11374以及Hackeng et al.，Proc．Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)9610068-10073)。其他實例包括二硫蘇糖醇、烷基或芳基巰基酯，它們可以通過眾所周知的intein-介導的生物學技術而產(chǎn)生(參考，例如，Chong et al.，Gene(1997)192277-281；Chong et al.，Nucl.Acids Res.，(1998)265109-5115；Evanset al.，Protein Science(1998)72256-2264；and Cotton et al.，Chemistry & Biology(1999)6(9)247-256)；然后使上述片段相連接，以形成
再使連接片段與Ry-X反應，其中，Ry是一種能夠模擬y側鏈結構的側鏈基團。該反應是在足以使半胱氨酸的巰基轉變?yōu)椤凹?y”側鏈的條件下進行的。舉例來說，如果所選的Raa是CH2-COOH或(CH2)2-COOH，那么該反應會形成一種能夠模擬天冬氨酸或谷氨酸結構和功能的氨基酸殘基(“假-Asp”或“假-Glu”)。如上所述可知，也可以使用兩種以上的肽段來進行更復雜的合成反應。
該方法的一個重要特征是對反應片段中不希望被修飾的半胱氨酸殘基進行側鏈保護，以避免連接位點以外的Cys殘基被化學修飾，或防止反應片段中計劃通過連接反應后化學修飾來形成相同“假氨基酸”的其他任何Cys殘基被化學修飾。
文中所用的符號表示芐基；IM表示咪唑基團，而IN表示吲哚基團；PG表示保護基團。下文總結了可用以合成含有根據(jù)本發(fā)明的假氨基酸殘基的Raa側部基團(其中X是鹵素(I、Br、Cl和F)，并且最優(yōu)選的是I和Br，而F優(yōu)選用于與連接)堿性氨基酸Lys(無額外原子)-CH2-SH+X-CH2-CH2-NH-PG，然后去保護形成-CH2-S-CH2-CH2-NH2Arg(無額外原子)-CH2-SH+X-CH2-NH-C((NH2)(＝NH2+))形成-CH2-S-CH2-NH-C((NH2)(＝NH2+))His(2個額外原子)-CH2-SH+X-CH2-IM形成-CH2-S-CH2-IM酸性氨基酸Asp(2個額外原子)-CH2-SH+X-CH2-COOH形成-CH2-S-CH2-COOH
Glu(1個額外原子)-CH2-SH+X-CH2-COOH形成-CH2-S-CH2-COOH不帶電荷的極性氨基酸Tyr(無或1個額外原子)-CH2-SH+F--pOH形成-CH2-S--pOH)(無額外原子，相同的幾何結構)-CH2-SH+Br/l-CH2--pOH形成-CH2-S-CH2--pOH(1個額外原子)Gln(1個額外原子)-CH2-SH+X-CH2-C(O)(NH2)形成-CH2-S-CH2-C(O)(NH2)Asn(2個額外原子)-CH2-SH+X-CH2-C(O)(NH2)形成-CH2-S-CH2-C(O)(NH2)Ser(2個或3個額外原子)-CH2-SH+X-CH2OH)形成-CH2-S-CH2OH(2個額外原子)-CH2-SH+X-CH2-CH2OH)形成-CH2-S-CH2-CH2OH(3個額外原子)Thr(2個或3個額外原子，喪失β分支)-CH2-SH+X-CH((CH3)(O-PG))然后去除PGgives-CH2-S-CH((CH3)(OH))(2個額外原子)-CH2-SH+X-CH2-CH((CH3)(O-PG))然后去除PGgives-CH2-S-CH2-CH((CH3)(OH))(3個額外原子)非極性氨基酸Leu(1個或2個額外原子)-CH2-SH+X-CH((CH3)(CH3))形成-CH2-S-CH((CH3)(CH3))(1個額外原子)
-CH2-SH+X-CH2-CH((CH3)(CH3))形成-CH2-S-CH2-CH((CH3)(CH3))(2個額外原子)Ile(2個或3個額外原子，喪失β分支)-CH2-SH+X-CH(CH3)-CH2-CH3形成-CH2-S-CH(CH3)-CH2-CH3(2個額外原子)-CH2-SH+X-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3形成-CH2-S-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3(3(3個額外原子)Phe(1個或2個額外原子)-CH2-SH+F-形成-CH2-S-(1個額外原子)-CH2-SH+Br/l-CH2-形成-CH2-S-CH2-(2個額外原子)Met(無額外原子)-CH2-SH+l-CH2-CH3形成-CH2-S-CH2-CH3Trp(1個額外原子)-CH2-SH+F-IN形成-CH2-S-IN但是，在不便于或不希望對蛋白序列進行修飾以在多肽的特定N-端引入用于連接的半胱氨酸或高半胱氨酸殘基或在連接位點使用假氨基酸的情況下，可以將天然化學連接方法加以擴展，即使用N-端被修飾成含有N-取代的，優(yōu)選的是Nα-取代的，2或3碳鏈的烷基或芳基巰基氨基酸的多肽，從而可以將天然化學連接的原理應用于不含半胱氨酸殘基的多肽(參考美國專利申請系列60/231,339，在此引入作為參考)。
“擴展的天然化學連接”方法涉及將含有羧基硫酯的，更優(yōu)選的是α-羧基硫酯的，第一種成分與含有N-取代的，優(yōu)選的是Nα-取代的，2或3碳鏈的烷基或芳基巰基氨基酸的第二種成分相連接。第一種成分中的羧基硫酯與第二種成分中N-取代2或3碳鏈的烷基或芳基巰基上的巰基之間可通過硫酯鍵連接的中間體發(fā)生化學選擇性反應，并形成最初的連接產(chǎn)物。更具體地說，COSR硫酯成分與氨基烷基硫成分之間的巰基交換可產(chǎn)生一種硫酯鍵連接的中間連接產(chǎn)物，該產(chǎn)物在自發(fā)重排之后可經(jīng)過一種5元或6元環(huán)中間體而產(chǎn)生酰胺鍵連接的第一連接產(chǎn)物，中間體的形式取決于氨基烷基硫成分的通式分別為I還是II
J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 IJ1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2II其中J1是含有一種或多種可選擇性地被保護的氨基酸側鏈的肽或多肽或其部分、一種聚合物、一種染料、一種適當功能化的表面、一種連接物或可檢測標記，或適用于化學肽合成或擴展的天然化學連接的其他任何化學基團；R1、R2和R3各自是與C1結合的H或供電子基團；條件是R1、R2和R3中的至少一種含有與C1結合的供電子基團；J2是含有一種或多種可選擇性地被保護的氨基酸側鏈的肽或多肽或其部分、一種聚合物、一種染料、一種適當功能化的表面、一種連接物或可檢測標記，或適用于化學肽合成或擴展的天然化學連接的其他任何化學基團。
連接位點上的N-取代2或3碳鏈的烷基或芳基巰基[HS-C2-C1(R1)-]或[HS-(C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-)可以在不破壞產(chǎn)物的肽相容條件下被去除，從而在連接位點上產(chǎn)生具有天然酰胺鍵的通式III的最終連接產(chǎn)物J1-C(O)-HN-J2 III其中J1、J2、R1、R2和R3的定義如上文所述。
選擇的R1、R2和R3基團有助于在肽相容裂解條件下將N-C1鍵裂解。例如，可利用供電子基團，特別是與C1結合的供電子基團，在C1處形成一種能夠促進裂解的共振穩(wěn)定性陽離子。優(yōu)選的是，化學連接反應包含一種作為賦形劑的巰基催化劑，并且該反應是在pH值約為中性的條件下在水相或有機-水混合相環(huán)境中進行。第一種成分與第二種成分可以通過一種能夠自發(fā)重排而形成N-取代酰胺鍵連接產(chǎn)物的5元或6元環(huán)來實現(xiàn)化學連接。當?shù)谝环N成分和第二種成分均為肽或多肽時，N-取代酰胺鍵連接產(chǎn)物具有通式IV或VJ1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 IVJ1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 V文中J1、J2、R1、R2、R3和Z2的定義如上文所述。
在N-取代酰胺鍵連接產(chǎn)物上結合的供電子基團R1、R2或R3可促進N-C1鍵的裂解，并有助于將2或3碳鏈烷基或芳基巰基從N-取代酰胺鍵連接產(chǎn)物上去除。在肽相容性裂解條件下將N端烷基或芳基巰基鏈去除后，可產(chǎn)生一種在連接位點上具有天然酰胺鍵的連接產(chǎn)物。當?shù)谝环N成分和第二種成分均為肽或多肽時，N-取代酰胺鍵連接產(chǎn)物具有通式J1-CONαH-CH(Z2)-C(O)-J2 X通式I中的典型的R1取代基顯示在表1中。
表1
通式II中的典型的R1、R2和R3取代基顯示在表2中 與N-取代2碳鏈化合物的情況相同，為了保持與C1碳的電共軛，芐基和吡啶甲基供電子取代基R1’、R3’和R5’必需定位于鄰位或對位上，以加強連接后的Nα-C1鍵裂解。但是當R2和R3是與C2和C3形成芐基時，R1’和R3’中的至少一種應含有強供電子基團，其中R1’或R3’選自甲氧基(-OCH3)、巰基(-SH)、羥基(-OH)，以及甲硫基(-SCH3)。當N-取代3碳硫代鏈中的R2和R3為氫時，R1可含有一種芐基或吡啶甲基，其中的R1’、R3’和R5’含有強供電子基團或中等供電子基團，或其組合。與N-取代2碳鏈烷基或芳基巰基的情況相同，強供電子基團可加強3碳鏈烷基或芳基巰基對連接后裂解的靈敏度。因而可相應地選擇特定的供電子基團或其組合。
與N-取代2碳鏈化合物的情況相似，本發(fā)明的N-取代3碳鏈化合物可以將目的構建體R1’和R5’位置上能夠用于取代的R1取代成巰基。在此，該供電子巰基也是與C1結合，而將其引入這些部位使得化合物能夠通過兩種途徑來實現(xiàn)6元環(huán)形成性連接。此外還可以提高可用于與α-羧基硫酯反應的巰基的局部濃度，并且在結構局限性方面提供了可促進連接的額外構象。
本發(fā)明的N-端N-取代2或3碳鏈烷基或芳基硫代氨基酸可以按照，例如，方案I和方案II的描述并根據(jù)該領域已知的標準有機化學技術來加以合成。可參考，例如，“高等有機化學、反應、機制和結構”，第4版，J.March(Ed.)，John Wiley & Sons，New York，NY，1992；“有機轉換詳解功能基團制備指南”，R.Larock(Ed.)，VCH Publishers，New York，NY，1989。其合成可以采用溶液合成法、聚合物支持合成法，或其組合。優(yōu)選的方法是采用Nα保護的、N-烷基化的、S-保護的氨基烷基或芳基硫代氨基酸前體。合成所使用的試劑可以從任意的公司購買。此外，應該充分了解的是，以試劑盒等形式提供的起始成分和多種中間體，如各種氨基酸衍生物，均可以保存以備后用。
在制備本發(fā)明的N-端Nα-取代2或3碳鏈烷基或芳基硫代氨基酸時，使用的是保護基團策略。一般而言，用于多種合成策略的優(yōu)選保護基團(PG)均適用于固相肽合成(“SPPS”)方法。在某些情況下還必須使用能夠在不同條件下被去除的正交保護基團。這些保護基團中有很多已為該領域所了解，并且可用于該目的(可參考，例如，“有機合成中的保護基團”，第3版，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；Nova Biochem Catalog 2000；“合成肽使用手冊”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，NewYork，NY，1992；“Advanced Chemtech組合有機化學與固相有機化學手冊”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，AdvancedChemtech，1998；“肽合成原理，第2版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Yerlag，1993；“肽合成準則，第2版”，M.Bodanszky andA.Bodanszky，Ed.，Springer-Yerlag，1994；以及“保護基團”，P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。實例包括芐氧基羰基(Z)、Boc、Bpoc、Trt、Nps、FmocCl-Z、Br-Z；NSC、MSC、Dde，等等。適用于硫基的保護基團的實例包括，但不局限于，芐基、4-甲芐基、4-甲氧芐基、三苯甲基、ACM、TACAM、氧蒽基、二硫化衍生物、吡啶甲基，和苯甲酰甲基。
更具體地說，可以按照方案I(固相制備Nα-取代前體)、方案II(液相制備Nα-取代前體)來制備Nα-取代2或3碳鏈烷基或芳基硫。方案I是利用標準的聚合物支持有機合成方法，直接將Nα-取代2或3碳鏈烷基或芳基硫組裝在固相上，而方案II是利用標準的結合方法將Nα-保護的、N-烷基化的、S-保護的氨基烷基或芳基硫代氨基酸前體結合在樹脂上。當產(chǎn)生外消旋產(chǎn)物或非對映體產(chǎn)物時，可能先要利用標準方法進行分離，然后再用于擴展的天然化學連接。
方案IECL輔助衍生分子的固相合成 X＝鹵素方案II α-羧基硫酯的產(chǎn)生可以按照該領域已知的標準技術用化學或生物學方法來實現(xiàn)，例如文中描述的方法，其中包括實施例中描述的方法。在化學合成方法中，α-羧基硫酯肽可以在溶液中合成，也可以在硫酯-生成樹脂上合成，這些技術是眾所周知的(可參考，例如，Dawson etal.，Science(1994)266776-779；Canne et al.，Tetrahedron Lett.(1995)361217-1220；Kent，et al.，WO96/34878；Kent，et al.，WO98/28434；Ingenito et al.，JACS(1999)121(49)11369-11374；and Hackeng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)9610068-10073；Amiato et al.，同上)。舉例來說，化學合成的硫酯肽可以用相應的α-硫代酸肽來制備，而α-硫代酸肽可以在硫酯-樹脂上或在溶液中合成，但是優(yōu)選的是樹脂方法。肽-α-硫代酸可以被轉變?yōu)閷?-羧基-4-硝苯基硫酯、對應的芐酯，或任何一種烷基硫酯。所有這些硫酯都提供適用于連接的保留基團，使用3-羧基-4-硝苯基硫酯比使用相應的芐酯的反應速率略快，而芐酯的反應性又比烷基硫酯更強。另一個例子，可以用三苯甲基交聯(lián)的巰基丙酸亮氨酸硫酯-生成樹脂來合成C-末端硫酯(Hackeng et al.，同上)。此外，還可以用3-羧基丙磺胺保險栓連接物來實現(xiàn)C-末端硫酯的合成，其方法是，通過用重氮甲烷或碘甲基氰活化，然后用一種適當巰基取代(Ingenito et al.，同上；Bertozzi et al.)。
此外，C-末端α-羧基硫酯肽也可以用生物學方法制備，如intein-介導的生物學技術(可參考，例如，Chong et al.，Gene(1997)192277-281；Chong et al.，Nucl.Acids Res.，(1998)265109-5115；Evans et al.，Protein Science(1998)72256-2264；and Cotton et al.，Chemistry & Biology(1999)6(9)247-256)。舉例來說，可利用帶有或不帶有諸如親合標簽等標記物的intein表達系統(tǒng)，使用其蛋白-剪接元件的可誘導的自裂解活性來產(chǎn)生C-末端二硫蘇糖醇(DTT)酯肽或多肽片段。具體地說，在DTT、β-巰基乙醇或半胱氨酸等巰醇存在條件下，intein可經(jīng)過特殊的自裂解過程，該過程產(chǎn)生一種帶有C-末端硫酯的肽段?？蓞⒖迹?，chong et al.，(1997)同上；chong et al.，(1998)同上；Evans et al.，同上；and Cotton et al.，同上。但是，當使用一種重組產(chǎn)生的片段時，最終構建體的化學合成部分通常會含有其加入的聚合物修飾。
將本發(fā)明的N-取代的2或3碳鏈烷基或芳基巰基成分與第一種羧基硫酯成分相連接，可產(chǎn)生一種在連接位點具有N-取代酰胺鍵的連接產(chǎn)物。選擇連接反應的條件是為了維持硫酯與N-取代的2或3碳鏈烷基或芳基巰基部分的選擇反應性。在一項優(yōu)選實施方案中，上述連接反應是在一種pH值為6-8的緩沖溶液中進行的，并且其優(yōu)選的pH值范圍是6.5-7.5。該緩沖溶液可以是水性的、有機的或其混合物。此外，上述連接反應還可以含有一種或多種催化劑和(或)一種或多種還原劑、脂類、洗滌劑、其他變性劑或增溶劑，等等。優(yōu)選的催化劑的實例是含有巰基和膦的基團，如苯硫酚、芐基硫醇、TCEP和烷基膦。變性劑和(或)增溶劑的實例包括溶于水或TFE、HFIP、DMF、NMP等有機溶劑的胍鹽、尿素，混有水的乙腈，或含有胍鹽和尿素的水。此外，還可以用溫度來調節(jié)連接反應的速率，常用溫度為5-55℃，并且優(yōu)選使用的溫度在15℃和40℃之間。舉例來說，在pH為6.8-7.8時，在含有6M胍鹽和2％苯硫酚的反應體系中可以很好地進行連接。
對N-取代的2碳鏈烷基或芳基巰基而言，連接事件是由COSR硫酯成分和氨基烷基巰基成分之間的巰基交換引起的。這種交換產(chǎn)生一種硫酯連接的中間連接產(chǎn)物，該產(chǎn)物在自發(fā)重排后通過一種5元環(huán)中間體而產(chǎn)生通式為J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-J2的第一連接產(chǎn)物，該第一連接產(chǎn)物在連接位點上具有一種可去除的N-取代的2碳鏈烷基或芳基巰基[HS-C2-C1(R1)-]，其中的取代基如上文所定義。連接位點上的N-取代的2碳鏈烷基或芳基巰基[HS-C2-C1(R1)-]可以在肽相容條件下被去除，從而在連接位點上產(chǎn)生具有天然酰胺鍵的通式為J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最終連接產(chǎn)物。
對N-取代的3碳鏈烷基或芳基巰基而言，在COSR硫酯成分和氨基烷基巰基成分之間的巰基可產(chǎn)生一種硫酯連接的中間連接產(chǎn)物，該產(chǎn)物在自發(fā)重排后通過一種6元環(huán)中間體而產(chǎn)生通式為J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2的第一連接產(chǎn)物，該第一連接產(chǎn)物在連接位點上具有一種可去除的N-取代的3碳鏈烷基或芳基巰基[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]。連接位點上的N-取代的3碳鏈烷基或芳基巰基[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)]可以在肽相容條件下被去除，從而在連接位點上產(chǎn)生具有天然酰胺鍵的通式為J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最終連接產(chǎn)物。
優(yōu)選在酸性條件下進行N-取代的烷基或芳基巰基的去除，以便促進N-C1鍵的裂解，并在連接位點上形成一種穩(wěn)定的未取代的酰胺鍵?！半南嗳萘呀鈼l件”是指適合肽類的物理-化學條件，并且適于將烷基或芳基巰基部分從連接產(chǎn)物中去除的條件?？偟膩碚f，根據(jù)所使用的α-取代化合物來選擇肽相容裂解條件，該條件可以通過常規(guī)的和眾所周知的方法容易地被推斷出(可參考，例如，“有機合成中的保護基團”，第三版，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley& Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；“合成肽，用戶指南”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“Advanced Chemtech組合有機化學與固相有機化學手冊”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhoded，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；“肽合成原理，第二版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Yerlag，1993；“肽合成準則，第二版”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Yerlag，1994；以及“保護基團”，P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
舉例來說，當上述R1、R2或R3取代基含有一個甲氧基、羥基、巰基或甲硫基、甲基等基團時，更普遍的去除方法涉及肽合成化學典型的酸裂解條件。該方法包括在含有或不含有還原劑和(或)清除劑系統(tǒng)(例如，諸如氟化氫(HF)、三氟乙酸(TFA)、三甲基磺酰氟乙酸(TMSFA)等酸)的強酸性或含水酸的條件下，進行N-C1鍵的裂解?？梢赃x擇更有效的酸裂解系統(tǒng)來優(yōu)化Nα-C1鍵的裂解，以去除給定構建體上的烷基或芳基巰基部分。這些條件是眾所周知的，并有利于維持肽的完整性。此外，還可以加入巰基清除劑，特別是當肽或多肽序列中存在色氨酸時，可以避免色氨酸側鏈與被釋放的芳基或烷基巰基部分發(fā)生反應。巰基清除劑的實例包括乙二醇、半胱氨酸。B-巰基乙醇和硫代甲酚。
當吡啶甲基基團作為取代基時，其他專門的裂解條件包括光或還原性裂解條件。舉例來說，當上述R1、R2或R3取代基含有一個吡啶甲基時，可以按照標準的方法，利用光分解作用(例如，紫外光)、鋅/乙酸或電解還原作用來進行裂解。當N-取代的2碳鏈巰基的R1含有一個硫代甲烷基團時，就可以利用汞或HF裂解作用。此外，當?shù)谝环N或第二種連接成分含有其他保護基團時，還可以使用上述裂解系統(tǒng)來進行固相支持物上的同時裂解，并且(或)可用作為一種去保護劑。
在本發(fā)明的一項實施方案中，在肽合成步驟中(特別是在自動肽合成和正交連接策略及匯聚連接策略中)使用Nα-取代的2碳或3碳烷基或芳基巰基來正確地形成N-末端衍生的多肽，該多肽可被用作為擴展的化學連接的底物以產(chǎn)生促紅細胞生成性合成蛋白。中性化合物包含一種全保護的、部分保護的或全未保護的酸穩(wěn)定性Nα-取代的2碳或3碳烷基或芳基巰基，其通式為(PG1)S-C2-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2或(PG1)S-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2，顯示在表III和表IV中。具體地說，在Nα-取代的氨基烷基或芳基巰基轉變?yōu)镹α-取代的酰胺烷基或芳基巰基后，R1、R2和R3中的一個或多個含有一種與C1結合的供電子基團，該基團能在C1上形成一種在肽相容裂解條件下可以促進Nα-C1鍵裂解的共振穩(wěn)定性陽離子。PG1和PG2是可以單獨或共同存在的或者缺失的保護基團，并且也可以相同或不同，其中的Z2是與化學肽合成或擴展的天然化學連接相適合的任何化學基團，并且其中的J2也是與化學肽合成或擴展的天然化學連接相適合的任何化學基團。PG1(或X1)是一種用以保護胺的基團。PG2(或X2)是一種用以保護巰基的基團。許多這類保護基團都被了解并適用于該目的(可參考，例如，“有機合成中的保護基團”，第三版，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley& Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；“合成肽，用戶指南”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“Advanced Chemtech組合有機化學與固相有機化學手冊”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhoded，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；“肽合成原理，第二版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；“肽合成準則，第二版”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；以及“保護基團”，P.J.Kocienski，Ed.，Geerg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
表III 優(yōu)選的PG1和X1保護基團的實例包括，但不局限于，Boc(t-丁基氨基甲酸酯)、Troc(2，2，2-三氯乙基氨基甲酸酯)、Fmoc(9-芴甲基氨基甲酸酯)、溴-Z或氯-Z(溴-或氯-芐基甲酸酯)、Dde(4，4-二甲基-2，6-dioxocycloexl-ylidene)、MsZ(4-甲基亞磺酰基-甲酸酯)、Msc(2-甲基硫乙基甲酸酯)、Nsc(4-硝基苯基磺?；?乙氧甲酸酯)。優(yōu)選的PG1和X1保護基團選自“有機合成中的保護基團”，Greene and Wuts，第三版，Wiley-Interscience，(1999)，而最優(yōu)選的是Fmoc和Nsc。優(yōu)選的PG2保護基團包括，但不局限于，Acm(乙酰氨基甲基)、MeoBzl或Mob(對-甲氧基芐基)、Meb(對-甲基芐基)、Trt(三苯甲基)、Xan(噸基)、tButhio(s-t-丁基)、Mmt(對-甲氧三苯甲基)、2或4吡啶甲基(2或4吡啶基)、Fm(9-芴甲基)、tbut(t-丁基)、Tacam(三甲基乙酰氨基甲基)。優(yōu)選的PC2和X2保護基團選自“有機合成中的保護基團”，Greene and Wuts，第三版，Wiley-Interscience，(1999)，，并且最優(yōu)選的是Acm、Mob、MeB、Picolyl。
表IV 可以按照上文的方案I和方案II來制備本發(fā)明的Nα-取代的2碳或3碳鏈烷基或芳基巰基的保護形式。
本發(fā)明所述化合物的產(chǎn)生可采用多種不同的方法，其中包括鹵素介導的氨基烷化作用、還原性氨化作用，并且還可以通過制備與固相氨基酸合成方法相適應的Nα-保護的、N-烷化的、S-保護的、氨基烷基或芳基硫代氨基酸前體來產(chǎn)生。如果需要，還可利用標準方法對外消旋產(chǎn)物或非對映體產(chǎn)物進行分離，以使化合物的手性純度達到可接受的程度。
III.本發(fā)明優(yōu)選的水溶性聚合物的合成和產(chǎn)生文中所用的術語“分子異質性”是指蛋白制劑中的每一種蛋白所聯(lián)接的聚合物分子數(shù)量不同。術語“分子多樣性”是指(a)被聚合物修飾的蛋白位點不同，(b)蛋白制劑中相同蛋白的不同位點上或不同蛋白的相同位點上的加合聚合物的長度不同，或者(c)蛋白制劑中相同蛋白的不同位點上或不同蛋白的相同位點上的加合聚合物的所有分支程度和(或)性質不同。文中所用的術語“分子均一性”是指蛋白制劑中的所有蛋白分子在相同位置上含有相同的氨基酸序列和相同的聚合物修飾。兩種或多種“分子均一性”蛋白制劑的混合物在文中被稱為“分子性明確的”制劑。
根據(jù)本發(fā)明的這個方面，上述聚合物異質性、多樣性和不適應性問題的解決方法涉及產(chǎn)生一類新的生物相容性聚合物，該聚合物結合了多肽(長度明確、便于合成)和“pPEG”(“精確型PEG”，一種具有柔性、兩親性并且無免疫原性的不易受蛋白酶作用的聚合物)的優(yōu)勢，Rose，K.et al.(美國專利申請系列09/379,297，在此引入作為參考)。這種新型生物相容性聚合物的通式為-[CO-X-CO-NH-Y-NH]n-n為一個整數(shù)，優(yōu)選的是1-100的整數(shù)，更優(yōu)選的是2-100的整數(shù)，其中的X和Y是通過酰胺鍵相連接的具有明確結構的生物相容性重復元件。優(yōu)選的是X和Y均為不含活性功能基團的二價有機基，或是二者均缺失，X和Y可以相同或不同，并且各自的重復單元(n)可以獨立變化。優(yōu)選的是，當n＝2時，X和Y中的至少一種選自取代的、未取代的、分支型和線型的脂肪族基團和芳香族基團。更優(yōu)選的是，X和Y之一選自苯基、C1-C10烯基、C1-C10烷基、含有雜原子的苯基、含有雜原子的C1-C10烯基、含有雜原子的C1-C10烷基，及其組合。
特別優(yōu)選的pPEG基團具有如下通式-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}n-
其中，優(yōu)選的是n為1-100，更優(yōu)選的為2-100；-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-}n-，其中，優(yōu)選的是n為1-50，更優(yōu)選的為2-50。
上述pPEG基團可通過多種方法中的任一種來合成。但這些基團的優(yōu)選產(chǎn)生方法是多單元固相逐級鏈組裝法，而不是聚合方法。利用這種組裝方法可以使制劑的基團具有明確而均一的結構，例如其長度、X和Y取代基的性質、分支點位置(如果存在)，以及所有分支的長度、X和Y取代基和位置。
優(yōu)選的是通過如下步驟來合成該基團(a)用一種摩爾數(shù)過量的通式為HOOC-X-COOH的二價酸衍生物將通式為Z-Q-支持物的化合物的氨基或羥基酰化，其中Z是H2N-或HO-；Q是一種連接物或一種靶分子；支持物是一種固相基質或表面；(b)活化步驟(a)的產(chǎn)物上的自由羧基；(c)用一種摩爾數(shù)過量的通式為NH2-Y-NH2的二元胺將步驟(b)的產(chǎn)物氨化；以及(d)用HOOC-X-COOH和NH2-Y-NH2選擇性地重復步驟(a)-(c)，其中該X和Y是缺失的，或是相同或不同的二價有機基，并且其變化與每個上述選擇性重復單元無關，并且可以與前面的酰化和氨化步驟中所用的取代基X和Y相同或不同。
在一項優(yōu)選實施方案中，使用的是6個、12個、18個和32個上述重復單元。如果需要，也可以將重復單元與，例如，賴氨酸的氨基協(xié)同使用，從而形成分支型pPEG結構?？梢杂枚喾N化學物將pPEG聯(lián)接于本發(fā)明的合成蛋白，其中包括形成硫醚鍵、肟鍵和酰胺鍵。
在一項實施方案中，多個單元的逐級固相鏈組裝方法包括第1步使保護的或未保護的二元酸與樹脂上的氨基結合，從而在連接位點產(chǎn)生酰胺鍵(其中PG是一種保護基團，該基團可以存在或不存在，這取決于所用的二元酸)PG-OOC-X-COOH+NH2-Y-NH-樹脂第2步如果保護基團(PG)存在，則去除樹脂上的保護基團HOOC-X-CO-NH-Y-NH-樹脂第3步使保護的或未保護的二元胺與樹脂上的羧基結合，從而在連接位點產(chǎn)生酰胺鍵(其中PG可以存在或不存在，這取決于所使用的二元胺)PG-NH-Y-NH+HOOC-X-CO-NH-Y-NH-樹脂第4步如果保護基團(PG)存在，則去除樹脂上的保護基團-NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-樹脂第5步將步驟1-4重復“n”次，以添加“n”個單元，然后從樹脂上裂解-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-如上所述，用于與本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白相聯(lián)接的優(yōu)選水溶性聚合物為線型和分支型pPEG構建體。使用的pPEG可含有懸垂基團，這些基團在生理條件下可帶有電荷或呈中性，并且可根據(jù)所用pPEG的結構而具有不同的化學聯(lián)接性質、長度、分支和溶解度。如上所述，本發(fā)明的優(yōu)選pPEGs包括一種含有-CO-X-CO-NH-Y-NH-重復單元的水溶性聚酰胺，其中，X與Y之一或二者都含有水溶性重復單元，最優(yōu)選的是“PEG”型重復單元。原則上還可以用簡單的兩步固相法來獲得寡聚脲，以氨基樹脂NH2-樹脂，和對稱型二胺NH2-Y-NH2為例的方法如下所示用羰基二咪唑進行活化→im-CO-NH-樹脂用二胺NH2-Y-NH2進行氨解→NH2-Y-NH-CO-NH-樹脂其中，這兩個步驟可以重復多次，以產(chǎn)生具有-NH-Y-NH-CO-重復單元的寡聚脲，但該方法的優(yōu)選程度較低。原因是上述步驟在室溫下的產(chǎn)量不確定，甚至使用高度過量的試劑和很長的反應時間也是如此。因此，優(yōu)選的是用三步固相法來懸垂聚酰胺，以氨基樹脂NH2-樹脂為例的方法如下所示。為避免產(chǎn)生同質異構產(chǎn)物，試劑HO2C-X-CO2H和NH2-Y-NH2應該對稱。
用二元酸HO2C-X-CO2H進行?；鶫O-CO-X-CO-NH-樹脂羰基二咪唑進行活化→im-CO-OCO-X-CO-NH-樹脂用二胺NH2-Y-NH2進行氨解→NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-樹脂這三個步驟可按順序重復多次，以產(chǎn)生具有-NH-Y-NH-CO-X-CO-重復單元的聚酰胺。該聚合物可含有精確數(shù)量的單體單元，每一步的X和Y可各自不同，并且末端基團可任意選擇。例如，在酰化步驟中使用琥珀酸酐(“Succ”)并在氨解步驟中使用4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺可以產(chǎn)生X為-CH2CH2-、Y為-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH-、重復單元為-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH-COCH2CH2CO-的“PEG”型聚酰胺。盡管該方法涉及不含保護基團的二價試劑，但除了如下所示的用分支型Lys核心制備分支型構建體的情況之外，使用標準的商品化肽合成樹脂不會產(chǎn)生交聯(lián)的問題(Rose et al.，(美國專利申請系列09/379,297)；和Rose et al.，J.Am.Chem.Soc.(1999)1217034)。
舉例來說，分支型pPEG構建體的制備方法與Rose et al.，(美國專利系列09/379,297)和Rose，K.and Vizzavona，J.(J.Am.Chem.Soc.(1999)1217034)中描述的“化學體”構建體的制備方法類似。因此，可以將分支型pPEG構建體制備成含有一種分支核心，如賴氨酸分支核心，該核心通過肟鍵與-(COCH2CH2CO-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH)n-等優(yōu)選水溶性聚酰胺相結合。例如，在聚酰胺另一末端的Lys側鏈上的氨氧乙酰基可以很容易地與四聚核心(O＝CHCO)4Lys2Lys-等賴氨酸核心上的乙醛?；纬呻挎I。因此，每個賴氨酸分支點的肟鍵都可以具有-Lys(COCH2ON＝CHCO-)酰胺-的結構。備選結構是在聚酰胺與聚酰胺游離懸垂基團之間形成肟鍵，優(yōu)選的是使用單保護二氨，并在聚酰胺結合后進行去保護，從而產(chǎn)生如下所示的四價分支結構[O＝CHCO-(NH-CH2CH2CH2-[OCH2CH2]3-CH2-NH-COGH2CH2CO-)n]4Lys2Lys-肟類化學物可用于制備二聚和四聚分支構建體，而且還適用于八聚分支構建體的組裝(Rose，K.，J.Am.Chem.Soc.(1994)11630；Rose，K.et al.，Bioconj.Chem.(1996)7552)。當使用上述pPEG聚酰胺時，當然也可以將其他的化學反應用于該目的(可參考，例如，圖13)。此外，可以將聚酰胺形成結合到用于肽合成的合成方案中，該方案包括Boc或Fmoc化學，但是，當執(zhí)行該方案時，應牢記氨解步驟會去除Fmoc基團，并且如果使用Boc化學物，還將會去除吲哚的甲酰基保護。
因此，上述pPEGs可具有不同的分支核心(如賴氨酸分支核心等)，這些分支核心可通過選定的鍵(如酰胺鍵、硫酯鍵、肟鍵，等等)與線型水溶性聚酰胺(如-(Succ-TTD)n-等)相連接，其中，每個線型水溶性聚酰胺的每個游離末端上都可以添加特定的懸垂基團(如羧酸酯、氨基、酰胺等)以提供所需的電荷。此外，本發(fā)明的線型和分支型pPEGs還可含有一種特異的功能基團，用于與帶有一個或多個可彼此反應的特異功能基團的合成蛋白相聯(lián)接，而優(yōu)選的是，pPEGs的懸垂基團不具有抗原性(可參考，例如，圖13)。
在一項特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白是被分子組成均一的擬糖水溶性聚合物所修飾，該聚合物具有通式U-s1-B-s2-Polymer-s3-J*其中，U是一種具有特定功能基團的殘基，B是一種具有三個或三個以上相同或不同臂的分支核心，該核心可以存在，也可以不存在，Polymer是一種分子量大于約5,000Da的具有通式-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的聚酰胺，其中的X和Y為相同或不同的分支型或線型二價基團，n是2-50的離散整數(shù)，并且X和Y之一或二者都含有一種基本不具有抗原性的線型或分支型水溶性重復單元，J*是一種含有懸垂基團的殘基，其中的懸垂基團基本不具有抗原性，并且在生理條件下的凈電荷選自負值、正值和中性值，而s1、s2和s3是相同或不同的間隔物或連接物，這些間隔物或連接物可以分別存在或缺失。上述聚合物包括美國專利申請系列60/236,377中的聚合物，其內容在此完整引入作為參考。通式U-s1-B-s2-Polymer-s3-J*也可表示為U-B-Polymer-J*，其中的間隔基團或連接基團s1、s2、s3可以存在，也可以不存在。
本發(fā)明優(yōu)選的擬糖聚合物的優(yōu)選形成方法如圖5-7所示。圖5A-5B描述一種固相方法，用于產(chǎn)生本發(fā)明所述水溶性聚合物U-B-Polymer-J*的分支核心(B)和單一化學選擇性功能基團(U)。該方法可以在溶液中進行，但優(yōu)選的是如圖所示的固相法。具體地說，圖5A顯示帶有活性基團( )的被正交保護的U-B前體，該構建體的基本幾何結構用鍵連接的圓點來表示( )，這種基本幾何結構并不是要限制所用化學鍵或基團的類型，而只用于說明組合結構的幾何關系，以及適合于產(chǎn)生本發(fā)明所述U-B基團的化學細節(jié)。將一種含有適當?shù)目闪呀膺B接物和互反應性基團( )的聚合體支持物/樹脂活化，使其能夠與U-B前體共價連接，然后使其與正交保護的U-B前體相結合 該系統(tǒng)采用了聚合體支持物有機化學的原理。結合之后，按照圖示對分支核心進行處理(只顯示了一個分支點，其他分支點可以存在，也可以不存在)，使其適于隨后聯(lián)接所需的Polymer組分，如基本不具有抗原性的水溶性線型聚合物。此外還對U基團進行了說明，U基團可作為被正交保護的U-B前體的一部分在合成開始時提供，也可以在分支核心B的處理過程中或之后再產(chǎn)生。盡管Polymer組分的聯(lián)接可以在樹脂上進行，也就是在裂解之前進行，但優(yōu)選的方法是將U-B部分從聚合體支持物/樹脂上裂解，以產(chǎn)生U-B核心，然后將其純化，并隨后用于Polymer組分的聯(lián)接。
如圖所示，核心基團B的懸垂分支點上可含有相同或不同的功能基團(Func)，這些基團可以被可逆地保護(PG、PG’或PG”)，也可以不保護。在所有情況下，最終的Polymer組分聯(lián)接步驟都涉及在懸垂分支點上產(chǎn)生一種功能基團(Func)，并產(chǎn)生U基團(參考圖7)。圖5B描述了一種替代方法，該方法是將被保護的U-B前體與一種帶有連接物的聚合體支持物結合使用，當連接物被裂解，即可產(chǎn)生所需的被保護或未保護的U-基團。圖5B還描述了組裝前分支核心B與聚合體支持物的聯(lián)接方法，以及利用可產(chǎn)生U-基團的樹脂來制備U-B基團的方法，該U-B基團可隨后用于聯(lián)接Polymer組分。
圖6A-6D描述一種固相方法，用于產(chǎn)生本發(fā)明優(yōu)選的基本不具有抗原性的水溶性聚酰胺Polymer-J*組分，該組分可隨后用于聯(lián)接U-B核心。盡管圖中描述的固相法是優(yōu)選的方法，但也可以采用液相法來獲得相同的最終結果。在圖6A和6B中，利用固相有機化學原理使二元酸與二元胺單元相結合。還可以選擇性地引入被保護的氨基-X’-酸和(或)氨基-Y’-酸單元，用于為具有符合通式-[NH-Y-NHCO-X-CO]-的聚酰胺結構的最終裂解產(chǎn)物中的X和Y基團提供額外的變化。圖6A描述N-端至C-端方向的合成方法，圖6B則描述C-端至N-端方向的合成方法。在圖6C和6D中，利用固相有機化學原理使氨基-X’-酸和(或)氨基-Y’-酸單元相結合。圖6C描述N-端至C-端方向的合成方法，圖6D則描述C-端至N-端方向的合成方法。由圖6A-6D可知，可以根據(jù)合成反應的循環(huán)次數(shù)來精確地控制聚酰胺終產(chǎn)物的性質。此外，懸垂基團J*的構建幾乎可以按任何自定標準來進行。在使用單分散性重復單元X、Y、X’和Y’的條件下，聚酰胺終產(chǎn)物的準確分子量可以被精確地控制。
圖7描述一種優(yōu)選的方法，用于使U-B組分與Polymer-J*組分結合，以產(chǎn)生本發(fā)明優(yōu)選的具有通式U-B-Polymer-J*的聚合物合成構成體。如圖所示，提供的保護基團可以多種多樣，并且可根據(jù)特定構建體的最終預期用途來任意選擇不同的保護基團。此外還描述了用于產(chǎn)生所需U-B-Polymer-J*構建體的不同途徑，其中包括固相法和液相法。
如上所述，優(yōu)選的水溶性重復單元包括聚環(huán)氧烷、聚酰胺環(huán)氧烷，或其衍生物。最優(yōu)選的水溶性重復單元包括通式-(CH2-CH2-O)-或-(CH2-CH2-O)-的環(huán)氧乙烷。這些水溶性重復單元的數(shù)量可以有很大不同，但更優(yōu)選的數(shù)量為2-500、2-400、2-300、2-200、2-100、2-50，更優(yōu)選的是2-32，最優(yōu)選的是3-8。更優(yōu)選的實施方案的實例為，其中的X和Y之一或二者都選自-((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)n1-)-或-((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)，其中，n1為1-6、1-5、1-4，最優(yōu)選的是1-3，而n2為2-50、2-25、2-15、2-10、2-8，最優(yōu)選的是2-5。高度優(yōu)選的實施方案的實例為，其中的X為-(CH2-CH2)-，而Y為-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-。再更優(yōu)選的是單分散性組合物，其中的每個n均為離散整數(shù)。在一項高度優(yōu)選的實施方案中，X為-(CH2-CH2)-，Y為-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)n-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-n，其中的n為12-36。
具體地說，當水溶性聚合物包含的聚合物鏈中帶有環(huán)氧乙烷重復單元等聚環(huán)氧烷重復單元時，優(yōu)選的是Polymer的每條鏈的原子分子量都約為1,500-42,000Da，最優(yōu)選的則約為2,000-20,000Da。
優(yōu)選的U基團含有一種能夠進行化學連接的部分。優(yōu)選的聚合物是分支型聚合物，其中的基團B含有三個或三個以上的臂。優(yōu)選的組分J*含有一種在生理條件下可電離的基團，最優(yōu)選的是帶有負電荷。U和J之一或二者都可含有一種保護基團，該基團能夠在不破壞構建體完整性的情況下被去除。
優(yōu)選的間隔物或連接物包括含有一種或多種用于水溶性聚合物的重復單元、二元胺和(或)二元酸單元、天然或非天然氨基酸或其衍生物的線型或分支型基團，以及脂肪族基團，其中包括烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、烷氧基等，優(yōu)選的是這些基團含有多達18個碳原子，甚至含有額外的聚合物鏈。
如上所述，組分U是含有一種功能基團的殘基，該功能基團能夠與靶分子或被靶分子結合，如肽或多肽或其他所需表面。當U是含有一種用于連接靶分子的功能基團的殘基時，U可含有一種親核基團或親電子基團，而靶分子可相應地含有一種可彼此反應的親電子基團或親核基團。
已知有多種可彼此反應的上述功能基團能夠與肽和多肽的常見側鏈功能基團或衍生的側鏈功能基團相聯(lián)接(Zalipsky et al.，Bioconjugate Chemistry(1995)6150-165；“生物共軛化學展望”，C.F.Meares，Ed.，ACS，1933；“蛋白接合與交聯(lián)化學”，S.S.Wong，Ed.，CRC Press，Inc.(1993))。功能基團的實例包括能夠與氨基反應的基團，如(a)羧酸酯，如對-硝基苯基，或琥珀酰亞胺；(b)羰基咪唑；(c)吖內酯；(d)環(huán)酰亞胺硫酮；以及(e)異氰酸酯或異硫氰酸酯。能夠與羧酸基團和活性羧基反應的功能基團的實例包括(a)伯胺；或(b)肼和酰肼功能基團，如?；ｋ?、肼基甲酸酯、半氨基甲酸酯、硫代肼基甲酸酯、氨氧基，等等。能夠與巰基或硫氫基反應的功能基團包括苯乙二醛、馬來酰亞胺和鹵素。能與諸如(羧)酸等羥基反應的功能基團或能夠與親電子中心反應的其他親核基團的實例包括羥基、氨基、羧基、巰基、活性次甲基，等等。
舉例來說，上述聚合物可以帶有組分U，該組分U作為與靶分子連接的功能基團，其中的功能基團是丙烯酸酯、醛、酮、氨氧基、胺、羧酸、酯、硫酯、鹵素、巰基、氰乙酸酯、二棕櫚?；?、磷酯酰乙醇胺、二硬酯酰磷酯酰乙醇胺、環(huán)氧化物、酰肼、疊氮化物、異氰酸酯、馬來酰亞胺、甲基丙烯酸酯、硝基苯羧酸酯、正二硫吡啶、硅烷、巰基、乙烯砜、琥珀酰亞胺戊二酸、琥珀酰亞胺琥珀酸酯、琥珀酸、tresylate，等等。此外，還可以提供可活化形式的U，例如，可以將羧酸轉變?yōu)槟芘c胺等親核試劑反應的活性酯。
在一項優(yōu)選實施方案中，U是一種具有能與靶分子上特異功能基團選擇性地反應的特異功能基團的殘基。本發(fā)明的該方面包括如上文第II節(jié)中描述的肽合成的原理(保護基團策略)和化學連接(部分保護或無保護基團策略)。因此，U可以代表各種保護基團，如上文描述的那些內容。優(yōu)選的U基團應適用于胺捕獲策略(例如，通過半胺形成、亞胺形成和Michael加成反應而連接)、巰基捕獲策略(例如通過硫醇鹽形成、二硫化物交換而連接)、天然化學連接策略(例如通過硫酯交換，其中包括側鏈含有半胱氨酸或巰基的氨基酸衍生物)，以及正交連接耦聯(lián)策略(例如通過噻唑烷形成、硫酯交換、硫酯形成、二硫化物交換和胺形成而連接)(可參考，例如，Coltart，DM.，Tetrahedron(2000)563449-3491)。特別優(yōu)選的U含有一種具有特異功能基團的殘基，該功能基團可用于如上文第II節(jié)中描述的水相容性化學連接化學反應中。因此，U可以是一種能形成鍵的功能基團，這些鍵選自羧酸酯、酯、尿烷、硫酯、醚、噻唑烷、腙、惡唑烷等。最優(yōu)選的鍵是肟鍵和酰胺鍵。
如上所述，B是一種具有三個或三個以上臂的分支核心部分，并且既可以存在也可以缺失。當B存在時，其一個臂與U連接，或通過間隔物或連接物與U相連，并且其他的所有臂都與Polymer連接，或通過間隔物或連接物與Polymer連接。分支核心B的實例包括，但不局限于，氨基、酰胺、羧基及其組合。其中包括由賴氨酸等形成的寡酰胺，或由烷二胺和丙烯酸形成的寡聚物(“聚氨基胺”)，后者在分支核心中提供凈正電荷。(可參考，例如，Zeng et al.，J.Pept.Sci.(1996)266-72；Rose et al.，Bioconjugate Chem.，(1996)7(5)552-556；NovoBiochem目錄和肽合成手冊，Laufelfingen，2001；Wells et al.，Biopolymers(1998)47381-396；Mahajan etal.，(1999)404909-4912；Judson et al.(1998)391299-1302；Swali et al.，(1997)624902-4903；美國專利5,932,462、5,919,455、5,643,575、5,681,567)。也可以使用其他多種不同的適用于該目的的分支核心，其中包括取代二胺、取代二元酸、諸如甘油等烷酸，以及具有三個或三個以上功能基團或可活化基團的其他部分，這些基團包括多價烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、烷氧基，等等，以及寡聚糖(如Nierengarten et al.，Tetrahedron Lett.(1999)405681-5684；Matthews et al.，Prog.Polym.Sci.(1998)1-56；Suner et al.，Macromolecules(2000)33253；Fischer et al.，Angew.Chem.Int.Ed.(1999)38884；Sunder et al.，Adv.Mater.(2000)12235；Mulders et al.，Tetrahedron Lett.(1997)38631-634；Mulders et al.，Tetrahedron Lett.(1997)3830-3088；和Turnbull et al.，Chembiocehm(2000)1(1)70-74)。最優(yōu)選的是分支核心通過酰胺鍵與Polymer組分相連接。
優(yōu)選的分支核心選自氨基官能團、羧基官能團或氨基與羧基組合的官能團。優(yōu)選分支核心的實例分別為賴氨酸氨基核心、天冬氨酸或谷氨酸分支核心，以及γ-谷氨酸分支核心。此外，優(yōu)選的分支型聚合物構建體的分支選自寡聚酰胺或聚氨基胺核心等單一分支核心。但也可以使用其他類型的分支型構建體，如蠕蟲樣結構，其分支選自沿聚合物骨架分布的多分支核心序列(Schlüter et al.，Chem.Int.Ed.(2000)39864)。根據(jù)聚合物骨架和重復單元的化學組成和(或)體積，可以將蠕蟲樣結構設計成水溶性或傾向于誘導液晶結構(Oualiet al.，Macromolucules(2000)336185)，從而有利于其遞送應用性、穩(wěn)定性和作用持久性。與本發(fā)明的其他分支型聚合物構建體相同，蠕蟲樣構建體可包含一種懸垂的含有U的功能基團。
如上文第I節(jié)所述，Polymer組分或一種或多種間隔物或連接物可帶有一些生物穩(wěn)定的或可生物降解的聚合物鏈或中間連接物或鍵。此外，如上文第I節(jié)所述，組分J*是一種含有懸垂基團的殘基，該基團在生理條件下的凈電荷選自負值、正值和中性值。最優(yōu)選的是，J*含有一種可電離的羧酸酯基團，并且在生理條件下的凈電荷為負值。如第I節(jié)所述，組分s1、s2和s3是相同或不同的間隔物或連接物，這些組分可以分別存在或缺失。最優(yōu)選的間隔物或連接物包括一種聚合物鏈，其中的間隔物或連接物含有一個或多個具有通式-[CO-X-CO-NH-Y-NH]n-的重復單元。
IV.藥劑學本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白可以作為藥學制劑使用，以實現(xiàn)治療疾病和病情的目的。因此，在另一項實施方案中，本發(fā)明提供藥用組合物，包括一種本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白或其藥學容許性鹽類。這種藥用組合物可以包含一種或多種賦形劑。優(yōu)選的賦形劑選自緩沖液、載體蛋白、氨基酸、去污劑、脂質體、水溶性聚合物和防腐劑。此外，除了促紅細胞生成性合成蛋白之外，該藥用制劑還可包含一種或多種額外的藥用活性成分，例如一種或多種額外的生物活性劑(例如，有機小分子、其他蛋白治療劑，等等)。這種藥用組合物可在本發(fā)明的優(yōu)選方法中使用。這些方法包括，提高哺乳動物的紅細胞產(chǎn)量、紅細胞比容、血紅蛋白和網(wǎng)織紅細胞數(shù)的方法。這些方法的步驟包括，將本發(fā)明的促紅細胞生成性合成蛋白以有效的劑量給藥于哺乳動物，以觀測所需療效。
當給藥于需要治療的病人或個體時，最優(yōu)選的是用藥物遞送系統(tǒng)將該促紅細胞生成性合成多肽和(或)蛋白進行給藥。利用該系統(tǒng)可以將藥物提供給患者，其提供方式可以使藥物被患者接受，并且可提高所需生物活性的效力。就本發(fā)明而言，優(yōu)選的藥物遞送系統(tǒng)包括可通過口、鼻、或吸入途徑、或經(jīng)肌肉、皮下、皮膚、靜脈內、尿管內或眼內給藥的所有系統(tǒng)。
這些藥物遞送系統(tǒng)包括可提供位點特異性釋放的制劑，或能夠加強小腸粘膜保護作用的制劑。合適的制劑包括干粉劑、病毒顆粒包裹遞送、脂質體包裹、皮膚貼劑、電輔助傳送(電穿孔治療)和聚合物/煙腙結合物。
在一項優(yōu)選實施方案中，這種藥物遞送裝置會對生物環(huán)境的變做出反應，并且基于這些變化進行藥物的遞送(或停止遞送)。多種物質已被用于控制藥物和其他活性制劑的釋放聚尿烷、聚硅氧烷、聚甲基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇，用于親水性和強度、聚乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-羥基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚甲基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、乙二醇二乙酸酯與乙酸乙烯酯的共聚物、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸，等等。在另一項優(yōu)選實施方案中，可生物降解的聚合物被用以促進藥物的遞送。這類聚合物包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、丙交酯與乙交酯的共聚物(PLGA)、聚酸酐和聚原酸酯。在美國專利6,072,041；6,041,253；6,018,678；6,017,318；6,002,961；5,879,712；5,849,331；5,792,451；5,783,212；5,766,633；5,759,566；5,690,945；5,681,811；5,654,000；5,438,040；4,810,499和4,659,558中描述了藥物遞送裝置及其使用方法因此，本發(fā)明的另一方面涉及一些藥用組合物和方法，用于通過將治療有效劑量的含有本發(fā)明所述聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白的化合物或其藥學容許的鹽類給藥來治療那些需要治療的哺乳動物?！八帉W容許的鹽類”是指一種能保持本發(fā)明的多肽的生物學效力和特性的鹽，并且該鹽不是生物學或其他方面不合要求的。鹽類可以來自酸或堿。酸加成性鹽來自無機酸，如鹽酸、氫溴酸、硫酸(得到硫酸鹽和硫酸氫鹽)、硝酸、磷酸等，也可以來自有機酸，如醋酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、水楊酸、p-甲苯磺酸等。堿加成性鹽可以來自無機堿，包括鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽，等等。來自有機堿的鹽類包括那些由一級胺、二級胺、三級胺、包括天然取代胺在內的取代胺，以及環(huán)胺所形成的鹽，包括異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、氨丁三醇、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡堿、普魯卡因、哈胺、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶，等等。優(yōu)選的有機堿是異丙胺、二乙胺、乙醇胺、哌啶、氨丁三醇和膽堿。
在此使用的術語“治療”包括任何對哺乳動物尤其是對人的疾病和病情所進行的治療，包括(i)預防在可能受疾病感染的但未被診斷出患病的主體中的疾病或病情的發(fā)生；(ii)抑制疾病或病情，即阻止疾病的發(fā)展；以及(iii)緩解疾病或病情，即促使癥狀的復原或改善。
在此使用的術語“通過用促紅細胞生成蛋白進行治療來預防或緩解哺乳動物的疾病狀態(tài)”應包括所有被該領域普遍承認的可有效地用促紅細胞生成蛋白大體上進行治療的疾病狀態(tài)，以及那些被發(fā)現(xiàn)通過用本發(fā)明的特定化合物進行治療而被有效預防或緩解的疾病狀態(tài)。這些疾病狀態(tài)包括，作為說明而不是限制，貧血、β地中海貧血、惡性貧血、鐮狀細胞病、慢性細菌性心內膜炎、骨髓炎、幼年風濕性關節(jié)炎、風濕熱、Crohn’s病、潰瘍性結腸炎，等等。
在此使用的術語“治療有效劑量”是指，當將給藥于需要治療的哺乳動物時，聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白的使用量足以實現(xiàn)治療(按照上文的定義)的目的，例如，作為紅細胞增殖的誘導劑的抗貧血劑，等等。根據(jù)蛋白衍生物、病情或疾病及其嚴重程度、以及待治療的哺乳動物及其體重、年齡等的不同，構成“治療有效劑量”的劑量也在變化，但是該領域的一般技術人員可以運用當前的知識和該公開內容常規(guī)地測定出劑量。文中使用的術語“q.s.”是指添加量足以實現(xiàn)規(guī)定的功能，例如，足以使溶液達到所需體積(如100ml)。
如上所述，可以將本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白及其藥學容許的鹽類，即活性成分，以治療有效劑量進行給藥，也就是給藥于需要治療的哺乳動物的劑量足以實現(xiàn)治療目的。在此，促紅細胞生成性合成蛋白的給藥可以通過具有類似應用的制劑所普遍使用的任何一種給藥方式來實現(xiàn)。文中使用的術語“本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白”、“本發(fā)明所述多肽的[藥學容許的鹽類]”以及“活性成分”可以互換使用。
制劑中的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白水平可以在該領域技術人員使用的整個范圍內變化，例如，整個制劑中可含有重量百分比(％w)約為0.01-99.99％的蛋白拮抗劑或顯效劑和約0.01-99.99％w的賦形劑。更典型的是，聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白的含量約為0.5-80％w。
盡管本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白的人用劑量還需要優(yōu)化，但總的來說，化合物的給藥劑量顯然取決于主體和需要預防或緩解的疾病狀態(tài)、病痛的性質或嚴重程度、給藥方式和方案，以及醫(yī)師在開藥時的判斷。該領域的普通技術人員都能夠很好地對其使用進行優(yōu)化。
可以經(jīng)由任何可接受的全身途徑或局部途徑來進行給藥，例如，經(jīng)胃腸外、經(jīng)口(特別是幼兒制劑)、經(jīng)靜脈內、經(jīng)鼻、經(jīng)支氣管吸入(即氣霧劑)、經(jīng)皮膚或局部途徑，其用藥形式可以是固體、半固體或液體或氣霧劑，例如，藥片、藥丸、膠囊、粉末、液體、溶液、乳劑、血管注射劑、懸浮液、栓劑、氣霧劑，等等。此外，本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白還能夠以緩釋形式或受控釋放形式進行給藥，其中包括長效注射劑、滲透泵、藥丸、皮膚貼劑(包括電遷移)，等等，從而以預定比率將該多肽進行持續(xù)給藥，并且優(yōu)選的是以適于能以精確劑量單次給藥的單位劑量形式給藥。該組合物包括常規(guī)的優(yōu)選載體或賦形劑，以及本發(fā)明蛋白的拮抗劑或顯效劑，此外，還可以包括其他醫(yī)學制劑、藥學制劑、載劑、佐藥等。載體可選自各種油類，其中包括石油、來自動物的、植物的或人造的油，例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等、優(yōu)選的流體載劑是水、生理鹽水、水性葡聚糖和乙二醇，特別優(yōu)選的是注射用溶液。合適的藥用載劑包括淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、氯化鈉、干脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。E.W.Martin在“Remington’s藥物科學”中對其他合適的藥用載劑及其制劑進行了描述。
此外，如果需要，上述藥用組合物還可以含有少量無毒的輔助物質，如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑等，例如醋酸鈉、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺，等等。
盡管可能需要更多的活性成分，但是可以利用方便的每日用藥方案，用口服給藥來遞送本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白，并且該方案可以根據(jù)需要抑制的程度或病痛緩解的情況而加以調整。為了進行這種口服給藥，通過摻入任何常用的賦形劑以形成一種藥學容許性的無毒的組合物，這些賦形劑如藥用級別的甘露醇、乳糖、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸鎂、糖精、滑石、纖維素、交聯(lián)羥甲纖維素鈉、葡萄糖、明膠、蔗糖、碳酸鎂，等等。該組合物可以采用的形式包括溶液、懸浮液、可分散性藥片、藥丸、膠囊、粉末、緩釋制劑等。口服制劑尤其適于治療胃腸道疾病。通過使用能促進體循環(huán)攝取的賦形劑可調整全身用途的藥物的口服生物藥效率，如含有乙?；被岬闹苿？蓞⒖?，例如，US5,935,601和US5,629,020。
上述組合物可以采用膠囊、藥丸或藥片的形式，并且該組合物因而可一并含有活性成分和一種稀釋劑，如乳糖、蔗糖、磷酸氫鈣等；一種分解質，如交聯(lián)羥甲纖維素鈉、淀粉或其衍生物；一種潤滑劑，如硬脂酸鎂等；以及一種粘合劑，如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯樹膠、明膠、纖維素及其衍生物，等等。
在藥學上能夠給藥的流體組合物的制備方法是，例如，使本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白(約0.5-20％)以及任選的藥用佐劑在水、生理鹽水、水性葡聚糖、甘油、乙二醇、乙醇、防腐劑等載劑中溶解、分散，等等，以形成一種溶液或懸浮液。此外，如果需要，用于給藥的藥用組合物還可含有少量無毒的輔助物質，如濕潤劑、懸浮劑、乳化劑或增溶劑、pH緩沖劑等，例如醋酸鈉、檸檬酸鈉、環(huán)糊精衍生物、聚氧乙烯、脫水山梨醇單月桂酸酯或硬脂酸酯，等等。該領域的技術人員已了解或將會了解這些劑型的實際制備方法；可參考，例如，“Remington’s藥物科學”，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。用于給藥的組合物或制劑不論在任何情況下都應含有一定量的活性成分，其劑量能夠有效地預防或緩解被治療主體的癥狀。當用于向幼兒口服給藥時，優(yōu)選的是流體制劑(如糖漿或懸浮液)。
對含有流體的固體劑型而言，優(yōu)選的是將溶解在，例如，碳酸丙烯、植物油或甘油三酯中的溶液或懸浮液包裹在明膠膠囊中。對流體劑型而言，可以用足夠量的藥學容許的流體載劑，例如水，將溶解在諸如聚乙烯中的溶液稀釋，以便于在給藥時進行測量。
作為選擇，制備流體制劑或半固體口服制劑的方法也可以是，將活性成分溶解或分散于植物油、乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯(如碳酸丙烯)，等等，并將這些溶液或懸浮液包裹在硬的或軟的明膠膠囊殼中。
在運用本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白治療上述病情時，優(yōu)選的是將文中描述的活性成分經(jīng)胃腸外給藥。一般而言，胃腸外給藥的特征是進行注射，可以是皮下注射、肌內注射或靜脈內注射，也可包括真皮內注射或腹膜內注射，以及胸骨內注射或輸液技術?？梢越?jīng)血管注射劑制備成常規(guī)的形式，即流體溶液或懸浮液，固體形式適宜在注射前配制在流體、乳劑或生物相容性的基于聚合物的微球體(例如，脂質體、聚乙二醇衍生物、聚(D，C)丙交酯等)中形成溶液或懸浮液。適合的賦形劑是，例如，水、生理鹽水、葡聚糖、甘油、乙醇，等等。此外，如果需要，被給藥的上述藥用組合物還可以含有還可以含有少量無毒的輔助物質，如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑、增溶劑、蛋白載體等，例如醋酸鈉、聚氧乙烯、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、環(huán)糊精、血清白蛋白，等等。
本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白可以經(jīng)胃腸外給藥，其方法是，例如，將上述化合物溶解在一種適當?shù)娜軇?如水或生理鹽水)中或摻入到一種脂質的制劑中，然后將其分散在一種容許性輸入液中。本發(fā)明的多肽的每日劑量通常是通過一次輸液或通過間隔一定時間的多次輸液來進行給藥的。水溶性形式的活性成分的水性溶液尤其適合用于胃腸外給藥，水溶性形式有水溶性鹽，或水性注射懸浮液，其中含有增粘物質，如羧甲纖維素鈉、山梨醇和(或)葡聚糖，以及，如果需要，還可以含有穩(wěn)定劑。此外，該活性成分還可以是凍干產(chǎn)物的形式，并且在胃腸外給藥前，通過添加適當?shù)娜軇┒渲瞥梢环N溶液。
最近設計出一種用于胃腸外給藥的方法，該方法是植入一種緩釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)，從而使劑量維持在恒定水平?？蓞⒖?，例如，US3,710,795、US5,714,166和US5,041,292，其內容在此引入作為參考。
用于胃腸外給藥的這些組合物中包含的活性成分百分比在很大程度上取決于該活性成分的特定性質，以及多肽的活性和主體的需要量。但是，溶液中的活性成分百分比可以是0.01-10％，若組合物為固體，該百分比可以更高，但隨后需要稀釋至上述百分比。優(yōu)選的是，溶液中的組合物含有0.02-8％的活性成分。
本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白的另一種給藥方法是同時利用快速注射和連續(xù)輸液。
氣霧劑給藥是一種用以將本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白直接遞送到呼吸道的有效方法。該方法的一些優(yōu)勢是1)該方法能防止發(fā)生酶促降解作用、胃腸道的弱吸收，以及防止由于肝臟的首次排泄作用而引起治療劑的損失；2)該方法能將活性成分給藥至其呼吸道中的靶位點，而使用其他方法則可能由于活性成分的分子大小、電荷或與肺外位點的親合力而不能實現(xiàn)上述目的；3)該方法可以使藥物經(jīng)肺泡快速地吸收到身體中；以及4)該方法避免了其他器官系統(tǒng)與活性成分接觸，這一點對可能由于接觸引起不良副作用的器官來說很重要。由于這些原因，氣霧劑給藥特別有利于治療哮喘、局部肺感染，以及其他疾病或肺和呼吸道病情。
藥學吸入裝置現(xiàn)有的三種類型是噴霧器吸入器、配量-劑量吸入器和干粉吸入器。噴霧器裝置能產(chǎn)生一股高速氣流，該氣流能使蛋白衍生物(已經(jīng)配置成流體形式)以霧的形式被攜帶噴灑到患者的呼吸道中。典型的配量-劑量吸入器將制劑與一種壓縮氣體共同密封，并且在啟動時，在壓縮氣體的作用下釋放出標準量的多肽，因此提供了一種將制劑以規(guī)定量給藥的可靠方法。干粉吸入器將多肽以自由流動的粉末形式給藥，利用該裝置可以將粉末在呼吸過程中分散在患者的氣流中。為了形成一種自由流動的粉末，將蛋白衍生物與一種賦形劑一起配制，如乳糖。將標準量的蛋白衍生物以膠囊的形式貯存，并通過每次啟動來給藥于患者。上述所有方法都可以用于將本發(fā)明給藥。
此外，基于脂質體的藥學制劑也適合于同本發(fā)明的聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白一起使用?？蓞⒖迹?，美國專利Nos.5,631,018、5,723,147和5,766,627。使用脂質體的好處被認為與由于脂質體對藥物的包載所產(chǎn)生的組織分布和藥代動力學參數(shù)的有利變化有關，因而該領域的技術人員可以被其應用于本發(fā)明的多肽。此外，還可以將受控釋放型液態(tài)脂質體藥劑用于注射或口服。
用于以栓劑形式進行全身給藥的傳統(tǒng)粘合劑和載劑包括，例如，聚乙二醇或甘油三酯，如PEG1000(96％)和PEG4000(4％)。上述栓劑可以由混合物制成，該混合物可含有約0.5-10w/w％的活性成分；優(yōu)選的是含有約1-2w/w％的活性成分。
該說明書中提到的所有出版物和專利申請在此均以同等程度引入作為參考，如同每個出版物或專利申請都被單獨地明確指出要引入作為參考。盡管已對本發(fā)明進行了全面描述，但參考下文的實施例會更容易地理解本發(fā)明，除非特別指出，這些實施例只作為說明，而不是要限制本發(fā)明。
實施例縮寫Acm＝乙酰氨基甲基巰基保護基團[即-CH2NHCOCH3]AoA＝氨基氧乙酰基Arg(Tos)＝L-精氨酸(側鏈被NG甲苯磺?；Ｗo)ART＝絕對網(wǎng)織紅細胞數(shù)Asp(cHex)＝L-天冬氨酸(側鏈被環(huán)己基酯保護)AUC＝曲線下面積Boc＝叔丁氧羰基CD＝圓二色性
CDI＝羰基二咪唑CHO＝中國倉鼠卵巢CL＝清除率(mL/hr/kg)Cmax＝最大濃度Cys(4MeBzl)＝L-半胱氨酸(側鏈經(jīng)(4-甲基)芐基保護)Cys(Acm)＝L-半胱氨酸(側鏈被乙酰氨基甲基[即-CH2NHCOCH3]保護)DCM＝二氯甲烷DIC＝二異丙基碳二亞胺DIEA＝二異丙基乙胺DMF＝二甲基甲酰胺DMSO＝二甲亞砜DPC＝十二烷基磷酸膽堿Dpr＝L-1，2二氨基丙酸ED50＝要求達到最大效果的50％的有效劑量EDA＝(4，7，10)-三氧十三烷-1，13-二胺ELISA＝酶聯(lián)免疫測定EPO＝促紅細胞生成素ES-MS＝電噴射電離質譜FBS＝胎牛血清Glu(cHex)＝L-谷氨酸(側鏈被環(huán)己基酯保護)GM-CSF＝粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子HATU＝O-(7-氮苯三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲銨六氟磷酸鹽HCT＝紅細胞比容HGB＝血紅蛋白His(Dnp)＝L-組氨酸(側鏈被N1m二硝基苯酚保護)HOBT＝N-羥苯三唑HPLC＝高壓液相色譜IMDM＝Iscove’s改良型Dulbecco’s培養(yǎng)基IPA＝異丙醇Lev＝乙酰丙酸Lys(CIZ)＝L-賴氨酸(側鏈被2-氯苯氧羰基保護)
MBHA＝4-甲基二苯甲胺MRT＝平均滯留時間MTT＝4-甲基三苯甲基MTT＝噻唑藍NHS＝N-羥基琥珀酰亞胺-OCH2-Pam-樹脂＝-O-CH2-Bz-CH2CONHCH2(共聚苯乙烯-二乙烯基苯)-樹脂Pbo＝4-(CH3S(O)-)芐基PBS＝磷酸鹽緩沖液PCV＝壓縮的細胞體積RBC＝紅細胞RET＝＝網(wǎng)織紅細胞rhEPO＝重組人EPORSA＝鼠血清白蛋白SDS＝十二烷基磺酸鈉SDS-PAGE＝SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SEP＝促紅細胞生成性合成蛋白Ser(Bzl)＝L-絲氨酸(側鏈被芐基保護)實施例1促紅細胞生成性合成蛋白SEP-0的合成進行促紅細胞生成性合成蛋白SEP的合成。全長的合成蛋白(命名為“SEP-0(1-166)”)的序列為APPRLICDSRVLERYLLEAK EAEKITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAISPPDAASAAPLRTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO1)其中ψ特指含有巰基經(jīng)羧甲基化的半胱氨酸的非天然氨基酸殘基。該SEP-0蛋白是由四種多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-01(GRFN1711；包括SEQ ID NO1的第1-32位殘基)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-硫酯片段SEP-02(GRFN1712；包括SEQ ID NO1的第33-88位殘基)CSLNEKITVP DTKVNFYAWK RMEVGQQAVE VWQGLALLSEAVLRGQALLV KSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保護)片段SEP-03(GRFN1713；包括SEQ ID NO1的第89-116位殘基)CPLQLHVDKA VSGLRSLTTL LRALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保護)片段SEP-04(GRFN1714；包括SEQ ID NO1的第117-166位殘基)CAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中的C-末端半胱氨酸(Cys161)帶有一個吡啶甲基(pico)保護基團)采用Boc(叔丁氧羰基)化學的原位中和方法在硫酯生成樹脂上合成肽SEP-01、SEP-02和SEP-03，并且在ABI1433A自動肽合成器或手動鏈組裝裝置上用已確立的SPPS、側鏈保護和硫酯樹脂策略(Hacieng，et al.，PNAS(1996)9610068-10073；and Schnolzer，et al.，Int.J.Pept.Prot.Res.，(1992)40180-193)來逐步進行固相肽合成(SPPS)，也可以從供應商處訂購和得到。例如，使用一組標準的Boc SPPS保護基團，即Arg(Tos)；Asp(cHex)；Cys(4MeBzl) & Cys(Acm)；Glu(cHex)；His(DNP)；Lys(CIZ)；Ser(Bzl)；Thr(Bzl)；Trp(甲酰)；Tyr(BrZ)；側鏈未被保護的Met、Asn和Gln。類似地，在-OCH2-Pam-樹脂上合成片段SEP-04。根據(jù)標準的Boc化學流程將肽類去保護，并且同時用HF/對甲酚將其從樹脂支持物上裂解下來；然而，對那些在HF/對甲酚中含有未去除保護基團的肽類來說，仍然保留有保護基團。用制備型C4反相高壓液相色譜(HPLC)進行肽類的純化。用ES-MS(電噴射電離質譜)對含有純凈肽的組分進行鑒定，將各組分合并，并且凍干以利于隨后的連接。
步驟1連接#1將片段SEP-04和SEP-03以15mM的濃度溶解在TFE中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的飽和磷酸緩沖液(pH7.9)，則得到一種含有肽段的澄清溶液。連接反應完成后，將連接混合物加入到2ml TFE(三氟乙醇)、6ml 6M氯酸胍和含有25％β-巰基乙醇的100mM磷酸鹽的溶液中，并孵育20分鐘。用含有15mg/mlTCEP(三(2-羧乙基)膦)的冰醋酸酸化上述溶液，并裝入制備型C4反相HPLC柱上(直徑為1英寸)。然后用制備型梯度反相HPLC進行肽類的純化。利用ES-MS對含有所需連接產(chǎn)物SEP-0Acm+SEP-03+SEP-04的組分進行鑒定，并將各組分合并。
步驟2去除Acm#1去除Acm的方法是，用HPLC級水將含有SEP-0Acm+SEP-03+SEP-04合并組分的水性乙腈溶液稀釋1倍，并加入固體脲，使其終濃度為2摩爾。加入摩爾數(shù)三倍過量(相對于預計的總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液攪拌1小時。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，裝入半制備型反相HPLC柱上，并利用逐級梯度進行純化。用ES-MS對含有所需產(chǎn)物SEP-03+SEP-04的組分進行鑒定，并凍干過夜。
步驟3連接#2將等量的SEP-03+SEP-04和SEP-02以15mM的濃度共同溶解在純TFE中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的250mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，則得到一種含有肽段的澄清溶液。在經(jīng)過1天的連接反應之后，將連接混合物加入到pH4的10ml TFE(三氟乙醇)、10mlβ-巰基乙醇、10ml哌啶和20ml 6M氯酸胍的溶液中，并孵育20分鐘以去除所有殘余的保護基團。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液使上述溶液酸化，并裝入制備型C4反相HPLC柱上(直徑為1英寸)，然后用線性梯度進行純化。用ES-MS對含有所需連接產(chǎn)物SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04的組分進行鑒定，并凍干過夜。
步驟4羧甲基化將SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04以15mM的濃度溶解在TFE中。加入兩倍過量(v/v)的含有6M氯酸胍的濃度為200mM的磷酸鹽緩沖液(pH7.9)，則得到一種含有肽段的澄清溶液。加入溶解在盡可能少量甲醇中的25倍過量的溴代乙酸，并且使上述溶液反應2小時。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液使上述溶液酸化，并裝入制備型反相HPLC柱上(直徑為1英寸)，然后用逐級梯度進行純化。用ES-MS對含有所需羧甲基化產(chǎn)物SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04的組分進行鑒定，并將各組分合并。
步驟5去除吡啶甲基在2M HCl中活化鋅粉30分鐘。將肽SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et以約10mmg/ml的濃度溶解在純TFE中。用6M氯酸胍、含有(臨用前加入)35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸(即N-十二烷基肌氨酸鈉)的pH為4的100mM的醋酸鹽溶液將上述溶液稀釋4倍(v/v相對于TFE)。再向溶液中加入活化的鋅粉。每間隔1小時監(jiān)控一次反應，并且在5小時后停止反應。在反應結束后，將上清移去，并用含有20％TFE的6M氯酸胍及含有35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸的pH為4的100mM的醋酸鹽溶液將殘余鋅粉清洗2次共5分鐘，以及用含有20％β-巰基乙醇的相同溶液清洗1次。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液使上述混合產(chǎn)物酸化，并裝入制備型反相HPLC柱上，然后用逐級梯度進行純化。用ES-MS對含有所需的修飾產(chǎn)物SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et-Pico的組分進行鑒定，并將各組分合并。
步驟6去除Acm#2用HPLC級水將合并的SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et-Pico的溶液稀釋4倍，并加入終濃度為2摩爾的固體脲。加入摩爾數(shù)3倍過量(相對于預計的總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液攪拌1小時。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，裝入半制備型反相HPLC柱上，并利用逐級梯度進行純化。用ES-MS對含有所需產(chǎn)物SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et-Pico的組分進行鑒定，再用含有2x(w/w相對于肽的質量)DPC(十二烷基膽堿磷酸)的水將其稀釋2倍(v/v)并凍干過夜。
步驟7連接#3將等量的SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et-Pico和SEP-01以15mM的濃度共同溶解在純TFE中，并加入含有6M氯酸胍的250mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)。再向溶液中加入1％苯硫酚。經(jīng)過1天的連接反應之后，將連接混合物加入到10ml TFE(三氟乙醇)、10mlβ-巰基乙醇、10ml哌啶和20ml氯酸胍pH為4的溶液中，并孵育20分鐘以去除所有殘余的保護基團。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液使上述溶液酸化，并裝入制備型反相HPLC柱上(直徑為1英寸)，然后用線性梯度進行純化。用電噴射質譜對含有所需連接產(chǎn)物SEP-0(1-166)(SEQ ID NO1)的組分進行鑒定，再用含有2x(w/w相對于肽的質量)十二烷基肌氨酸的水將其稀釋2倍(v/v)并凍干過夜。
步驟8折疊將全長的連接產(chǎn)物SEP-0(1-166)溶解在含有6M氯酸胍和20％TFE以及摩爾數(shù)十倍過量(相對于蛋白中的Cys殘基)的半胱氨酸的濃度為250mM的Tris緩沖液(pH8.7)中。該溶液在含有3M氯酸胍的濃度為200mM的Tris緩沖液(pH8.7)中室溫透析過夜。再將該溶液在含有1M氯酸胍的濃度為200mM的Tris緩沖液(pH8.7)中4℃透析4小時，最后將該溶液在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中4℃透析4小時，從而得到最終的折疊產(chǎn)物。用電噴射ES-MS和CD(圓二色性)光譜測定法來證實折疊。
步驟9純化用Centricon濃縮管將上述折疊多肽濃縮5倍，并裝入經(jīng)pH7.0的10mM磷酸鹽緩沖液平衡的Resource S陽離子交換柱上。用至500mM NaCl的線性鹽梯度將折疊蛋白在10分鐘內洗脫下來。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對含有所需折疊產(chǎn)物SEP-0(1-166)的組分進行鑒定，并于-80℃冷凍貯存。分析性反相HPLC色譜、折疊蛋白產(chǎn)物的ES-MS譜和CD光譜都證明折疊蛋白的存在。
實施例2促紅細胞生成性合成蛋白SEP-1-L30的合成進行在SEP-0的第24和126位上含有肟型基團的第二種促紅細胞生成性合成蛋白(命名為SEP-1-L30)的合成。然后利用這些基團形成SEP-1-L30，其中蛋白骨架上連接了線性的(EDA-Succ-)18羧酸鹽(EDA＝(4，7，10)-三氧十三烷-1，13二胺，也被稱為TTD；Succ＝-CO-CH2CH2CO-)聚合物。全長的SEP-1(1-166)的序列為
APPRLICDSRVLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ特指含有經(jīng)羧甲基化的巰基的半胱氨酸的非天然氨基酸殘基，其中KOX特指其ε-氨基經(jīng)化學修飾連接了以肟鍵結合指定的水溶性聚合物的肟連接基團的非天然賴氨酸。此外，圖15還顯示SEP-1-L30的結構。
圖14中顯示了下文化學合成SEP-1-L30的圖示說明。簡單地說，圖14(A)和圖14(B)中，水溶性聚合物GRFN32(GP32)通過肟鍵形成化學連接反應與肽SEP-11和SEP-14相連接。如圖所示，肽SEP-11的第32位帶有一種C-末端Yaa基團，該基團包括一種用以隨后的天然化學連接的組氨酸α-羧基硫酯，以及第24位(天然人EPO的糖基化位點)帶有一種非天然的賴氨酸殘基，該殘基的側鏈經(jīng)化學修飾而帶有一種包括氨氧?；腢n＝1基團。顯示對應于最終全長產(chǎn)物第1位的N-末端丙氨酸以作為參考。肽SEP-14的第117位帶有一種未保護的N-末端Xaa基團，該基團包括半胱氨酸，第126位(天然人EPO的糖基化位點)帶有一種含有氨氧?；揎椀馁嚢彼岬腢n＝1基團，以及第161位帶有半胱氨酸(二硫化物型半胱氨酸，該半胱氨酸的側鏈硫醇經(jīng)吡啶甲基基團保護。保護Cys161以避免在隨后的被引入作為天然化學連接位點的半胱氨酸的轉換過程發(fā)生硫烷化(見圖14(D))；此外還可以使用吡啶甲基保護基團，因為其去除條件與去除第一次天然化學連接反應中保護半胱氨酸的Acm(乙酰氨基甲基)的條件互不干擾(見圖14(C))。通過肟型化學連接實現(xiàn)在GP32聚合物的第24和126位構建位點專一性和唯一連接，從而產(chǎn)生精確的聚合物修飾的肽SEP-11+GP32和SEP-14+GP32。圖14(C)顯示SEP-14+GP32和一種中肽片段SEP-13的天然化學連接，以及產(chǎn)生SEP-13+SEP-14+GP32的流程，其中的連接位點是在Lys1116和Cys117。如圖所示，肽SEP-13包括一種在第89位的含有被保護的半胱氨酸的N-末端Xaa基團，以及在第116位的含有組氨酸α-羧基硫酯的C-末端Yaa基團。在天然化學連接之后，去除Acm保護基團以使該連接產(chǎn)物準備用于下一步的連接。圖14(D)顯示SEP-13-SEP-14+GP32和一種中肽片段SEP-12的天然化學連接，以及產(chǎn)生SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP32的流程，其中的連接位點是在Try88和Cys89。如圖所示，肽SEP-12包括一種在第33位的含有Acm半胱氨酸的N-末端Xaa基團，以及在第89位的含有色氨酸α-羧基硫酯的C-末端Yaa基團。在天然化學連接之后，將連接產(chǎn)物暴露于溴醋酸中，以使第89和117位半胱氨酸的側鏈硫醇發(fā)生羧甲基化，從而將其轉換為假谷氨酸。在羧甲基化之后，去除Acm和吡啶甲基保護基團以使該未保護的聚合物修飾的連接產(chǎn)物準備用于下一步的連接。圖14(E)顯示SEP-13-SEP-14+GP32和一種肽片段SEP-11+GP32(對應于全長產(chǎn)物的N-末端片段)的天然化學連接，以及產(chǎn)生全長SEP-1-L30產(chǎn)物SEP-11+GP32+SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP32的流程，其中最后的連接位點是在His32和Cys33。如圖所示，全長的SEP-1-L30產(chǎn)物包括兩種只與自定義位點相連的水溶性聚合物(GP32)，其中自定義位點即對應于天然人EPO的第24和126位的糖基化位點。詳細的合成過程將在下文描述。
A.GRFN1776和GRFN1711與GRFNP32的肟化作用使帶有氨氧乙?；鶊F的水溶性聚合物與帶有酮羰基團的肽相連接，從而形成肟鍵。為此而合成以下肽段片段SEP-14(GRFN1776；包括SEQ ID NO2的第117-166位殘基)CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中的Lys126的ε-氨基經(jīng)乙酰丙酸殘基修飾，并且其中的Cys1117被Acm所保護)片段SEP-11(GRFN1711；包括SEQ ID NO2的第1-32位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-硫酯(其中的Lys24經(jīng)乙酰丙酸殘基修飾)按照實施例1所述，在硫酯生成樹脂上合成片段SEP-11(GRFN1711)，并且在-OCH2-Pam-樹脂上合成片段SEP-14(GRFN1776)。首先用Fmoc基團將這兩種肽段的第24和126位的賴氨酸的ε-氨基保護起來。在鏈組裝完成后，再按照標準的Fmoc去保護方法將攜帶Fmoc的氨基去保護，并且通過將每個肽樹脂與乙酰丙酸相連而加以修飾。然后，按照實施例1所述，將上述肽類去保護，并且同時將其從樹脂支持物上裂解下來。利用制備型C4反相HPLC進行肽類的純化。用ES-MS鑒定含有純凈肽的組分，合并并凍干以便于隨后的連接。按照標準方法(Rose，K.et al.，美國專利申請系列09/379,297；Rose，et al.，J Am Chem Soc.(1999)1217034)在Sasrin羧基生成樹脂上進行GRFNP32[-(EDA-Succ)18羧酸酯]的合成。通過結合五倍過量的活化的Boc-氨氧乙酸而將氨氧乙酰(AOA)基團與聚合物的N-末端氨基相連。利用經(jīng)典的Fmoc-化學方法將聚合物鏈從樹脂支持物上裂解下來。利用制備型C4反相HPLC進行聚合物鏈的純化。用ES-MS鑒定含有純凈聚合物的組分，合并并凍干以便于隨后的連接。
以等摩爾比將片段SEP-14和GRFNP32共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后將該溶液凍干。將干粉溶解，并且利用制備型梯度C4反相HPLC將聚合物修飾的肽與未修飾肽及未反應聚合物分離。用ES-MS鑒定含有所需肟化產(chǎn)物SEP-14+GP32的組分，合并并凍干。
以等摩爾比將片段SEP-11和GRFNP32共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后將該溶液凍干。將干粉溶解，并且利用制備型梯度C4反相HPLC將聚合物修飾的肽與未反應聚合物分離。用ES-MS鑒定含有所需肟化產(chǎn)物SEP-11+GP32的組分，合并并凍干。
B.促紅細胞生成性合成蛋白SEP-1-L30的合成SEP-1-L30是由四種多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-11+GP32(GRFN1711+GRFNP32，對應于SEQ ID NO2的第1-32位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGcA EH-硫酯(其中Lys24的ε-氨基經(jīng)通過乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟鍵與GRFNP32結合的乙?；窟B接基團修飾，表示為KOX)片段SEP-12(GRFN1712，對應于SEQ ID NO2的第33-88位殘基)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保護)片段SEP-13(GRFN1713，對應于SEQ ID NO2的第89-116位殘基)CPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保護)片段SEP-14+GP32(GRFN1716+GRFNP32，對應于SEQ ID)NO2的第117-166位殘基)CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中Lys126的ε-氨基經(jīng)通過乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟鍵與GRFNP32結合的乙酰基肟連接基團修飾，表示為KOX，并且其中的C-末端半胱氨酸帶有一個吡啶甲基(pico)保護基團)按照實施例1中的描述來完成附加肽的合成、連接、羧甲基化、保護基團去除、折疊以及純化，以產(chǎn)生全長的折疊的SEP-1-L30。分析性反相HPLC色譜、折疊蛋白產(chǎn)物的ES-MS譜和CD光譜都證明折疊蛋白的存在。
實施例3促紅細胞生成性合成蛋白SEP-1-L26的合成進行在SEP-0的第24和126位上含有肟型基團的第三種促紅細胞生成性合成蛋白(命名為SEP-1-L26)的合成。然后利用這些基團形成SEP-1-L26，其中線型聚合物(EDA-Succ)18羧酸鹽和(EDA-Succ)6-酰胺通過第24和126位的肟鍵而結合到蛋白骨架上。全長的SEP-1(1-166)的序列為APPRLICDSRVLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ特指含有經(jīng)羧甲基化的巰基的半胱氨酸的非天然氨基酸殘基，其中KOX特指其ε-氨基經(jīng)化學修飾連接了以肟鍵結合指定的水溶性聚合物的肟連接基團的非天然賴氨酸。此外，圖15還給出了SEP-1-L30的結構。
與SEP-1-L30相比，SEP-1-L26被設計成在第126位上帶有一種更小的和不帶電荷的水溶性聚合物。連接在第24位的聚合物與SEP-1-L30中的相同。全長產(chǎn)物的合成與實施例2中的描述相同。圖16顯示了SEP-1-L26的結構。
A.GRFN1776與GRFNP6以及GRFN1711與GRFNP32的肟化作用使帶有氨氧乙?；鶊F的水溶性聚合物與帶有酮羰基團的肽相連接，從而形成肟鍵。為此而合成以下肽段片段SEP-14(GRFN1776；包括SEQ ID NO2的第117-166位殘基)CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中的Lys126的ε-氨基經(jīng)乙酰丙酸殘基修飾，并且其中的Cys117被Acm所保護)片段SEP-11(GRFN1711；包括SEQ ID NO2的第1-32位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-硫酯(其中的Lys24經(jīng)乙酰丙酸殘基修飾)按照實施例1所述，在硫酯生成樹脂上合成片段SEP-11(GRFN1711)，并且在-OCH2-Pam-樹脂上合成片段SEP-14(GRFN1776)。首先用Fmoc基團將這兩種肽段的第24和126位的賴氨酸的ε-氨基保護起來。在鏈組裝完成后，再按照標準的Fmoc去保護方法將攜帶Fmoc的氨基去保護，并且按照標準的耦聯(lián)方法通過將每個肽樹脂與乙酰丙酸相連而加以修飾。然后，按照實施例1所述，根據(jù)標準的Boc-化學方法將上述肽類去保護，并且同時將其從樹脂支持物上裂解下來。利用制備型C4反相HPLC進行肽類的純化。對每種肽而言，用ES-MS鑒定含有純凈肽的組分，合并并凍干以便于隨后的連接。
按照標準方法(Rose，K.et a1.，美國專利申請系列09/379,297；Rose，et al.，J Am Chem Soc.(1999)1217034)在Sasrin羧基生成樹脂上進行水溶性聚合物(EDA-Succ)18羧酸酯(GRFNP32)的合成。按照標準方法(Rose，K.et al.，美國專利申請系列09/379,297；Rose，et al.，J.Am.Chem.Soc.(1999)1217034)在Sieber酰胺生成樹脂上進行水溶性聚合物(EDA-Succ)6-酰胺(GRFNP6)的合成。通過結合五倍過量的活化的Boc-氨氧乙酸而將氨氧乙酰(AOA)基團與每個樹脂結合性聚合物的N-末端氨基相連。利用經(jīng)典的Fmoc-化學方法將兩種聚合物鏈分別從各自的樹脂支持物上裂解下來。利用制備型C4反相HPLC進行每種聚合物鏈的純化。對每種聚合物而言，用ES-MS鑒定含有純凈聚合物的組分，合并并凍干以便于隨后的連接。
以等摩爾比將片段SEP-14和GRFNP6共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后將該溶液凍干。將干粉溶解，并且利用制備型梯度C4反相HPLC將聚合物修飾的肽與未修飾肽及未反應聚合物分離。用ES-MS鑒定含有所需肟化產(chǎn)物SEP-14+GP6的組分，合并并凍干。
以等摩爾比將片段SEP-11和GRFNP32共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后將該溶液凍干。將干粉溶解，并且利用制備型梯度C4反相HPLC將聚合物修飾的肽與未反應聚合物分離。用ES-MS鑒定含有所需肟化產(chǎn)物SEP-11+GP32的組分，合并并凍干。
B.促紅細胞生成性合成蛋白SEP-1-L26的合成SEP-1-L26是由四種多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-11+GP 32(GRFN1711+GRFNP32，對應于SEQ ID NO2的第1-32位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24的ε-氨基經(jīng)通過乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟鍵與GRFNP32結合的乙?；窟B接基團修飾，表示為KOX)片段SEP-12(GRFN1712，對應于SEQ ID NO2的第33-88位殘基)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保護)片段SEP-13(GRFN1713，對應于SEQ ID NO2的第89-116位殘基)CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保護)片段SEP-14+GP6(GRFN1716+GRFNP6，對應于SEQ ID NO2的第117-166位殘基)CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中Lys126的ε-氨基經(jīng)通過乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟鍵與GRFNP6結合的乙?；窟B接基團修飾，表示為KOX，并且其中的C-末端半胱氨酸[即Cys161]帶有一個吡啶甲基(pico)保護基團)按照實施例1和2中的描述來完成附加肽的合成、連接、羧甲基化、保護基團去除、折疊以及純化，以產(chǎn)生全長的折疊的SEP-1-L26。分析性反相HPLC色譜、折疊蛋白產(chǎn)物的ES-MS譜和CD光譜都證明折疊蛋白的存在。
實施例4促紅細胞生成性合成蛋白SEP-1-B50的合成進行第四種促紅細胞生成性合成蛋白(命名為SEP-1-B50)的合成。全長的SEP-1-B50的氨基酸序列與SEP-1-L30的氨基酸序列相同APPRLICDSRVLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ特指含有經(jīng)羧甲基化的巰基的半胱氨酸的非天然氨基酸殘基，其中KOX特指其ε-氨基經(jīng)化學修飾連接了以肟鍵結合指定的水溶性聚合物的肟連接基團的非天然賴氨酸。
但是，該蛋白是由具有四種線性(Succ-EDA)12基團的分支型聚合物構建體衍生得到的，而不是由SEP-1-L30的線型(Succ-EDA)18聚合物衍生得到的。衍生可以通過肟鍵而實現(xiàn)。
圖17是分支型水溶性聚合物GRFNP29(GP29)化學合成的圖解，該GP29通過肟型連接而結合到SEP-1-B50上，下文將對此進行詳細描述。如圖17所示，一種呈直角保護的賴氨酸U-B前體被用于產(chǎn)生U-B組分GRFN17(GP17)，該組分的U基團為氨氧?；⑶揖哂?X賴氨酸分支核心B，該核心帶有四個懸垂巰基，用于隨后通過硫醚鍵與帶有琥珀酸殘基提供的懸垂羧酸酯的線型水溶性聚酰胺環(huán)氧乙烷構建體GP29相結合。全長產(chǎn)物的組裝是按照實施例2所述進行的。SEP-1-B50的結構如圖18所示。
A.攜帶巰基的模板GRFNP17的合成以0.4mmol數(shù)量級在酰胺生成(4-甲基)二苯甲胺(MBHA)-樹脂上手動合成模板GRFNP17。用標準的耦聯(lián)方法(Schnlzer，M.，Int JPept Protein Res.(1992)40180-93)結合上Fmoc-Lys(Boc)-OH。使用了3.8ml含有2.1mmol氨基酸和10％DIEA的0.5M的HBTU；即5倍過量的氨基酸。在去除Fmoc保護基團之后，用標準的氨基酸耦聯(lián)方法(3.8ml含有2.1mmol氨基酸和10％DIEA的0.5M的HBTU；即5倍過量的氨基酸)結合上Fmoc-Lys(Fmoc)-OH。在第二次去除Fmoc步驟之后，用標準的氨基酸耦聯(lián)方法(7.6ml含有4.2mmol氨基酸和10％DIEA的0.5M的HBTU；即相對于自由氨基5倍過量的氨基酸)結合上Fmoc-Lys(Fmoc)-OH。在最后的Fmoc去保護步驟之后，溶于DMF的5倍過量(相對于自由氨基)的S-乙酰巰基乙酸五氟苯酯(SAMA-oPfp)被結合30分鐘。去除C-末端賴氨酰殘基的側鏈Boc保護基團，其方法是用含有10％DIEA的DMF清洗以中和樹脂，然后用純凈TFA分批清洗兩次各1分。將2mmol Boc-氨氧乙酸和2mmol N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解在3m1的DMF中。在加入2mmol DIC(二異丙基碳二亞胺)之后，活化上述酸30-60分鐘。將所得溶液加入中性樹脂中，并結合1小時。最后，用溶于DMF的20％的哌啶去除S-聯(lián)乙?；?。在作為自由醛清除劑的半胱氨酸存在條件下，根據(jù)標準的Boc-化學方法(Schnlzer，M.，Int J Pept Protein Res.(1992)40180-93)，將該模板去保護并同時將其從樹脂支持物上裂解下來。將回收的溶于50％B[即含有0.1％TFA的50％的水性乙腈](不含醛)的聚酰胺冷凍并凍干。純化過程中，將模板粗產(chǎn)物溶于2ml 50％B，并加入100％A[即含有0.1％TFA的水]以稀釋樣品(因為必然要添加醛，所以應避免加入氯酸胍或醋酸鹽)。將該模板裝入在T＝40℃條件下用3％B平衡的C4制備型反相HPLC柱中。將鹽等度洗脫，再用線性梯度純化出所需的模板GRFNP17。用ES-MS對含有所需產(chǎn)物的組分進行鑒定，然后合并，凍干。
B.分支型水溶性聚合物GRFNP29的合成合成分子量為15kDa的分支型(EDA-Succ)12聚合物GRFNP29，其方法是，將純化的含有巰基的模板GRFNP17與一種線型聚合物GRFNP31，即Br-乙?；?(EDA-Succ)12羧酸酯，通過硫醚鍵形成連接，其中GRFNP31是按照標準方法(Rose，K.et al.，美國專利申請系列09/379,297；Rose，et al.，J Am Chem Soc.(1999)1217034)在Sasrin羧基生成樹脂上合成的。
將摩爾數(shù)1.3倍過量(對于總巰基)的純化的GRFNP31，即Br-乙酰化(EDA-Succ)12，和純化的含有巰基的模板GRFNP17以～10mM的濃度共同溶解在0.1M Tris-HCl/6M氯酸胍中，pH8.7。溶解后，用pH8.7的0.1M Tris-HCl緩沖液將上述溶液稀釋3倍(v/v)。在室溫下攪拌該連接混合物，并用反相HPLC和ES/MS對該反應進行監(jiān)測。根據(jù)需要添加額外的GRFNP31反應物，直到所需反應產(chǎn)物成為主要產(chǎn)物。為了激發(fā)反應，添加3x(與連接混合物的體積比)0.1M醋酸鹽/6M氯酸胍中，pH4，然后將該溶液裝入制備型C4反相HPLC柱中，再用線性梯度進行純化。用ES-MS對含有純凈GRFNP29構建體的組分進行鑒定，然后合并，凍干。
C.GRFN1776和GRFN1711與GRFNP29的肟化作用按照實施例2中的描述合成片段SEP14和片段SEP-11。以等摩爾比將片段SEP-14和GRFNP29共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后將該溶液凍干。將干粉裝入制備型反相HPLC柱(直徑為1英寸)中。利用制備型梯度C4反相HPLC將聚合物修飾的肽與未修飾肽及未反應聚合物分離。用ES-MS鑒定含有所需肟化產(chǎn)物SEP-14+GP32的組分，并將各組分合并。
以等摩爾比將片段SEP-11和GRFNP29共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后將該溶液冷凍并凍干。將干粉溶解含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并裝入制備型GPC(凝膠滲透層析)柱(直徑為1英寸)中。利用等度洗脫將聚合物修飾的肽與未修飾肽及未反應聚合物分離。用ES-MS鑒定含有所需肟化產(chǎn)物SEP-11+GP29的組分，并將各組分合并。
D.促紅細胞生成性合成蛋白SEP-1-B50的合成SEP-1-B50(SEQ ID NO2)是由四種多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-11+GP29(GRFN1711+GRFNP29，對應于SEQ ID NO2的第1-32位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24的ε-氨基經(jīng)通過乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟鍵與GRFNP32結合的乙酰基肟連接基團修飾，表示為KOX)片段SEP-12(GRFN1712，對應于SEQ ID NO2的第33-88位殘基)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保護)片段SEP-13(GRFN1713，對應于SEQ ID NO2的第89-116位殘基)CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保護)片段SEP-14+GP29(GRFN1716+GRFNP29，對應于SEQ ID NO2的第117-166位殘基)CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中Lys126的ε-氨基經(jīng)通過乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟鍵與GRFNP6結合的乙?；窟B接基團修飾，表示為KOX，并且其中的C-末端半胱氨酸帶有一個吡啶甲基(pico)保護基團)除純化是在Resource Q柱中完成外，按照實施例1和2中的描述來完成附加肽的合成、連接、羧甲基化、保護基團去除、折疊以及純化，以產(chǎn)生全長的折疊的SEP-1-B50(SEQ ID NO2)。分析性反相HPLC色譜、折疊蛋白產(chǎn)物SEP-1-B50的ES-MS譜和CD光譜都證明折疊蛋白的存在。
實施例5促紅細胞生成性合成蛋白SEP-3-L42的合成進行第五種促紅細胞生成性合成蛋白(命名為SEP-3-L42)的合成。全長的SEP-3蛋白的氨基酸序列為APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNECITVPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQALLACSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAISPPDAACAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO3)用馬來酰亞胺-功能化的(EDA-Succ)18(GRFNP32)聚合物單位(通過Michael加成反應)對第24、38、83和126位的半胱氨酸殘基進行修飾，以形成SEP-3-L42。圖20顯示了SEP-3-L42的結構。
圖19顯示了下文描述的化學合成SEP-3-L42的圖示說明。簡單地說，圖19(A)和圖19(B)顯示了從SEP-31到SEP-34的四種SEP-3-L42的肽段的天然化學連接，從而在對應于人EPO的所有四種天然糖基化位點的連接位點上產(chǎn)生了半胱氨酸。具體地說，圖19(B)顯示了具有所有被保護的二硫化物型半胱氨酸的全長多肽，可通過Michael加成反應使四種帶電的線型水溶性聚合物(命名為GRFN32-馬來酰亞胺(GP32-馬來酰亞胺))在半胱氨酸連接位點發(fā)生位點特異性的聯(lián)接。此外，圖19(B)還顯示了二硫化物型半胱氨酸的最終去保護步驟，從而產(chǎn)生全長的聚合物修飾的產(chǎn)物。
詳細地說，SEP-3是由四種多肽片段在溶液中合成的片段SEP-31(GRFN1747，對應于SEQ ID NO3的第1-37位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNE-硫酯(其中Cys7、Cys29、和Cys33被Acm所保護)片段SEP-32(GRFN1774，對應于SEQ ID NO3的第38-82位殘基)CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LA-硫酯(其中Cys38的側鏈被Acm所保護)片段SEP-33(GRFN1749，對應于SEQ ID NO3的第83-125位殘基)CSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAISPPDAA-硫酯(其中Cys83的側鏈被Acm基團所保護)片段SEP-34(GRFN1750，對應于SEQ ID NO3的第126-166位殘基)CAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中的Cys161被Pob[即4-(CH3S(O)-)芐基-]所保護)肽的合成按照實施例1所述，利用確立的側鏈保護策略，用Boc化學SPPS的原位中和方法在硫酯生成樹脂上合成肽SEP-31、SEP-32和SEP-33，按照在上文中指出的特定肽來改變保護基團策略。類似地，在-OCH2-Pam-樹脂上合成片段SEP-34。按照實施例1所述，將肽類去保護并同時將其從樹脂支持物上裂解下來。用制備型RF-HPLC進行所得的上述肽類的純化。用ES-MS對含有純凈肽的組分進行鑒定，合并并并且凍干以利于隨后的連接。
步驟1連接#1將片段SEP-34和SEP-33以15mM的濃度溶解在TFE中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的飽和磷酸緩沖液(pH7.5)，則得到一種含有肽段的澄清溶液。連接反應完成后，將連接混合物(定義為1體積)加入到2體積的{2ml TFE、6ml 6M氯酸胍和含有25％β-巰基乙醇的100mM磷酸鹽}的溶液中，并孵育20分鐘。用含有15mg/ml TCEP的冰醋酸酸化上述溶液，并裝入制備型C4反相HPLC柱上中，然后用線性梯度進行純化。利用ES-MS對含有所需連接產(chǎn)物SEP-3Acm+SEP-33+SEP-34的組分進行鑒定，并合并。
步驟2去除Acm#1去除Acm的方法是，用HPLC級水將含有SEP-3Acm+SEP-33+SE-34合并組分的水性乙腈溶液稀釋1倍，并加入固體脲，使其終濃度為2摩爾。加入摩爾數(shù)三倍過量(相對于預計的總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液攪拌1小時。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，裝入半制備型C4反相HPLC柱中，并利用逐級梯度進行純化。用ES-MS對含有所需產(chǎn)物SEP-33+SEP-34的組分進行鑒定，并凍干過夜。
步驟3連接#2將等量的SEP-33+SEP-34和SEP-32以15mM的濃度共同溶解在純TFE(三氟乙醇)中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的250mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，則得到一種含有肽段的澄清溶液。在經(jīng)過1天的連接反應之后，將連接混合物(定義為1體積)加入到2體積pH4的10ml TFE、10mlβ-巰基乙醇、10ml哌啶和20ml 6M氯酸胍的溶液中，并孵育20分鐘以去除所有殘余的保護基團。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液酸化上述溶液，并裝入制備型C4反相HPLC柱中，然后用線性梯度進行純化。用ES-MS對含有所需連接產(chǎn)物SEP-3Acm+SEP-32+SEP-33+SEP-34的組分進行鑒定，并凍干過夜。
步驟4去除Acm去除Acm的方法是，用HPLC級水將含有SEP-3Acm+SEP-32+SEP-33+SEP-34合并組分的水性乙腈溶液稀釋1倍，并加入固體脲，使其終濃度為2摩爾。加入摩爾數(shù)三倍過量(相對于預計的總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液攪拌1小時。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，裝入C4半制備型反相HPLC柱中，并利用逐級梯度進行純化。用ES-MS對含有所需產(chǎn)物SEP-32+SEP-33+SEP-34的組分進行鑒定，并凍干過夜。
步驟5連接#3將等量的SEP-32+SEP-33+SEP-34和SEP-31以15mM的濃度共同溶解在純TFE中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的250mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，則得到一種含有肽段的澄清溶液。在經(jīng)過1天的連接反應之后，將連接混合物(定義為1體積)加入到2體積pH4的10ml TFE、10mlβ-巰基乙醇、10ml哌啶和20ml6M氯酸胍的溶液中，并孵育20分鐘以去除所有殘余的保護基團。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液酸化上述溶液，并裝入制備型C4反相HPLC柱中，然后用線性梯度進行純化。用ES-MS對含有所需連接產(chǎn)物SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34的組分進行鑒定，并凍干過夜。
步驟6與聚合物GRFNP32連接按照制造商提供的方法，通過用BMPS(3-馬來酰胺丙酸NHS酯，Pierce，USA)將GRFNP32功能化來制備馬來酰亞胺-功能化的線型(EDA-Succ)18聚合物，該聚合物被稱為GRFNP32-馬來酰亞胺，則形成一種馬來酰亞胺-功能化的(EDA-Succ)18聚合物[即馬來酰亞胺-(EDA-Succ)18]。用盡可能少量的必須的TFE溶解SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34。將三倍過量的GRFNP32-馬來酰亞胺溶解在pH7.5的6M氯酸胍、10mM的磷酸鹽中，并加入到TFE溶液中。用分析型反相HPLC對Michael加成反應的進程進行監(jiān)控。反應結束后，將上述溶液裝入C4制備型反相HPLC柱中，然后用線性梯度進行純化。用ES-MS對含有所需聚合物修飾的產(chǎn)物SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+pPEG[即連接的全長為166個殘基的多肽鏈，該多肽鏈帶有與Cys24、Cys38、Cys83和Cys126的側鏈巰基相連的四拷貝的GRFNP32，因此也被稱為SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+GP32]的組分進行鑒定，并凍于過夜。
步驟7去除Pbo去除Pbo的方法是，將SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+GP32的凍干粉末溶解在含有5％乙二硫醇的純TFA中。然后，通過添加10％苯甲硫醚和15％溴代三甲基硅烷30分鐘來裂解Pbo基團。將上述溶液在旋轉蒸發(fā)器中干燥，并溶解在含有1％TFA的水性乙腈中。將所得溶液裝入半制備型反相HPLC柱中，并利用逐級梯度進行純化。用ES-MS對含有所需Cys161-去保護的產(chǎn)物SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+GP32-Pbo的組分進行鑒定，并凍干過夜。
步驟8去除Acm將Acm從Cys7、Cys29和Cys33側鏈最終去除的方法是，用HPLC級水將含有SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+GP32-Pbo合并組分的水性乙腈溶液稀釋1倍，并加入固體脲，使其終濃度為2摩爾。加入摩爾數(shù)三倍過量(相對于預計的總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液攪拌1小時。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，裝入半制備型C4反相HPLC柱中，并利用逐級梯度進行純化。用ES-MS對含有所需聚合物修飾修飾產(chǎn)物SEP-3(1-166)的組分進行鑒定，并凍干過夜。
步驟9折疊將全長的連接產(chǎn)物SEP-3(1-166)溶解在含有6M氯酸胍和20％TFE以及摩爾數(shù)十倍過量(相對于蛋白中的Cys殘基)的半胱氨酸的200mM的Tris緩沖液(pH8.7)中。該溶液在含有3M氯酸胍的濃度為200mM的Tris緩沖液(pH8.7)中室溫透析過夜。再將該溶液在含有1M氯酸胍的濃度為200mM的Tris緩沖液(pH8.7)中4℃透析4小時，最后將該溶液在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中4℃透析4小時，從而得到最終的折疊產(chǎn)物。用電噴射ES-MS和CD光譜測定法來證實折疊。
步驟10純化用Centricon濃縮管將上述折疊多肽濃縮5倍，并裝入經(jīng)pH7.0的10mM磷酸鹽緩沖液平衡的Resource S陽離子交換柱中。用至500mM NaCl的線性鹽梯度將折疊蛋白在10分鐘內洗脫下來。用SDS-PAGE對含有所需折疊產(chǎn)物SEP-3-L42的組分進行鑒定，并于-80℃冷凍貯存。
實施例6促紅細胞生成性合成蛋白的生物活性測定用UT/7和32D 103197細胞系來進行折疊的促紅細胞生成性合成蛋白、SEP-0、SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50和SEP-3-L42的生物活性的檢測，在因子-依賴性細胞系增殖測試中使用商品化的重組促紅細胞生成素作為對照標準。UT-7是人巨核母細胞白血病細胞系，該細胞系在生長和存活方面對白介素-3、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)或促紅細胞生成素(EPO)中之一具有絕對的依賴性(MiuraY，et al.，Acta Haematol(1998)99180-184；Komatsu N，et al.，Cancer Res.(1991)51341-8)。32D 103197是鼠造血細胞系(Metcalf，D.Int J Cell Clining(1992)10116-25)。
在Iscove’s改良型Dulbecco’s培養(yǎng)基(IMDM)、10％FBS(胎牛血清)、谷氨酰胺和Penstrep中配制SEP構建體的儲液，并且將這些儲液的2x稀釋液順次地加入到多孔板中，多孔板中已添加了濃度為5000個細胞/的人UT/7 EPO細胞。在5％CO2存在條件下，37℃培養(yǎng)這些多孔板，并每天監(jiān)測細胞的生長情況。四天后，在多孔板中添加20μl溶于PBS(磷酸鹽緩沖液)的2.5mg/ml的MTT(甲基噻唑四唑)并孵育4小時。加入150μl的IPA，并在562nm下，讀出每個孔的光吸收值。測定SEP化合物的ED50(達到最大效果的50％的有效劑量)值，并將其與CHO(中國倉鼠卵巢)-細胞產(chǎn)生的rhEPO(重組人促紅細胞生成素)的ED50值比較。這些實驗的結果都證明所有的促紅細胞生成性合成蛋白均顯示出生物活性。表VI中給出了SEP-0、SEP-1-L26、SEP-1-L30和SEP-1-B50的ED50測定結果。
表VI

當僅用通過聚合物修飾的SEP-1-L30的吸光度來計算蛋白濃度的消光系數(shù)使肽含量標準化時，表VII和圖26給出了這些實驗中、SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50、SEP-3-L42和SEP-1-B51(下文實施例7中描述了SEP-1-B51化合物的合成)的其他結果?？偟膩碚f，這些體外測試證明了聚合物結構和結合位點的不同會對體外的生物活性造成不同的影響，其中這些化合物的效力具有如下相對次序(1)當測試人EPO受體活性時為(從最強到最弱)SEP-1-L26≈SEP-1-L30＞SEP-1-B50≈SEP-1-B51＞SEP-3-L42＞SEP-0；以及(2)當測試鼠EPO受體活性時為(從最強到最弱)SEP-1-L26＞SEP-1-L30＞SEP-0＞SEP-3-L42＞SEP-1-B50≈SEP-1-B51。
表VII

此外，表VII和圖26中的結果還表明，與未被聚合物修飾的構建體SEP-0相比，聚合物修飾的SEP構建體在受體選擇上有顯著的差異。具體地說，SEP-1-L26被不同的線型聚合物修飾，這些聚合物連接在對應于人EPO糖基化位點的第24位上(該位點結合了具有懸垂負電荷的5.5kDa的線型聚合物)；該構建體對人和鼠受體的活性較小。在對應于人EPO糖基化位點的第24和126位上，SEP-1-L30被具有懸垂負電荷的5.5kDa的線型聚合物修飾；該構建體對人受體的活性比對鼠受體的活性高出約5倍。在對應于人EPO糖基化位點的第24、38、83和126位上，SEP-3-L42被具有懸垂負電荷的5.5kDa的線型聚合物修飾，該構建體對人受體的活性比對鼠受體的活性高出約10倍。發(fā)現(xiàn)差異最大的是SEP-1-B50和SEP-1-B51，它們都被分支的、電負性15kDa的聚合物修飾，這些聚合物連接在對應于人EPO糖基化位點的第24和126位上，并且具有大約5的p1(與人EPO近似)；這兩種構建體對人受體的活性比對鼠受體的活性高出～60倍。
由于鼠EPO缺失了對應于人EPO第126位的糖基化位點(鼠EPO具有非糖基化的脯氨酸，而不具有在人EPO中發(fā)現(xiàn)的O-糖基化的絲氨酸)，該變化的受體活性可能部分歸因于這種差異，并且因此鼠受體優(yōu)先選擇在對應于第126位上缺失了O-聯(lián)糖基化的EPO。該結果同SEP-1-L26與SEP-1-L30和SEP-1-B50與SEP-1-B52的比較結果一致。例如，SEP-1-L26的第126位具有一種1.8kDa的電負性聚合物，而SEP-1-L30的第126位具有一種5.5kDa的電負性聚合物。盡管對人EPO受體有相同的活性，但是發(fā)現(xiàn)對鼠EPO受體則存在4倍的差異。發(fā)現(xiàn)差異最大的是SEP-1-B50和SEP-1-B51構建體，在對應于人EPO糖基化位點的第126位上連接了電負性15kDa的聚合物。如同SEP-3-L42，在對應于人EPO的所有四種天然糖基化位點即24、38、83和126上加入了5.5kDa的電負性聚合物，使對鼠受體的選擇性更大程度地降低，但這種降低程度比SEP-1-B50和SEP-1-B51構建體小。這些結果證明，可以通過對相應于生物產(chǎn)生的糖基化蛋白中糖基化位點的位點進行精確修飾來調節(jié)受體特異性，也可以通過調整聚合物的大小、分支的性質以及電荷來調節(jié)受體特異性。
實施例7促紅細胞生成性合成蛋白SEP-1-B51的合成A.SEP-1-B51的組成。合成了第六種促紅細胞生成性合成蛋白(命名為SEP-1-B51)。全長SEP-1-B51的氨基酸序列與SEP-1-B50相同APPRLICDSRVLERYLLEAKEAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ特指含有經(jīng)羧甲基化的巰基的半胱氨酸的非天然氨基酸殘基，其中KOX特指其ε-氨基經(jīng)化學修飾連接了以肟鍵結合指定的水溶性聚合物的肟連接基團的非天然賴氨酸。
但是，與SEP-1-B50相比，該蛋白是由具有四種線型(Succ-TTD)12-Succ-丙胺酸-OH[即(Succ-TTD)12-Succ-Ala-OH，或(Succ-TTD)12Succ-Ala]聚合物的分支型聚合物構建體衍生得到的，這四種線型聚合物通過酰胺鍵接合到賴氨酸的分支核心上。設計將線型聚合物通過酰胺鍵耦聯(lián)到分支核心上是為了提高穩(wěn)定性。此外，上述四種聚合物還被設計攜帶丙氨酸基團和懸垂的負電荷，帶有負電荷是為了模擬唾液酸，而帶有丙氨酸則是為了具有與糖鏈的懸垂糖基相似的疏水性質。此外，分支型聚合物還被設計具有一種位于分支核心和蛋白骨架連接位點間的水溶性間隔物，以提高分支核心模板的合成和操作特性，并且也模擬了在天然糖鏈中發(fā)現(xiàn)的位于糖與蛋白骨架連接位點和糖鏈第一個分支點之間的間隔物。
圖21是分支型水溶性聚合物GRFNP41(GP41)化學合成的圖解，該GP41通過肟型連接而結合到SEP-1-B51上，下文將對此進行詳細描述。全長產(chǎn)物的組裝是按照實施例2所述進行的。SEP-1-B51的結構如圖22所示。
B.用以與分支模板(GRFNP40)結合的(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的合成以0.5mmol數(shù)量級在Sasrin酸流動型羧酸-生成樹脂上合成線型聚合物(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)。將0.5mmole(～0.5克)的Sasrin酸流動型羧酸-生成聚苯乙烯樹脂(羥基取代1.02mmole/g)在DMF中溶脹15分鐘，然后排干液體。將溶于8ml含有500μl(3.9mmole)DIEA(二異丙基乙胺)的DMF的450mg(4.5mmole)琥珀酐和488mg(4mmole)4-二甲氨基嘧啶加入到羥基-功能化樹脂中，并劇烈攪拌使反應進行30分鐘，然后排干液體。重復連接反應，并通過使用DMF(～50ml)攪拌流動清洗1分鐘來去除過量的反應物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體?；罨疕OOC-CH2CH2CO-O-樹脂(0.5mmole)，其方法是添加8ml新制的溶于DMF的1.0M(8mmole)CDI(羰基二咪唑)溶液，并使其反應40分鐘，然后排干液體。通過使用DMF(～50ml)攪拌流動清洗1分鐘來去除過量的反應物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。再加入溶解在4ml的溶于DMF的0.5M(2mmole)HOBT溶液的4ml(4克，1 8.2mmole)(4，7，10)-三氧十三烷-1，13二胺(TTD)，并劇烈攪拌使反應進行30分鐘，然后排干液體。通過使用DMF(～50ml)攪拌流動清洗1分鐘來去除過量的反應物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。在樹脂中添加溶解于8ml含有500μl(3.9mmole)DIEA(二異丙基乙胺)的HOBT(N-羥苯三唑)的琥珀酐(450mg，4.5mmole)，并劇烈攪拌使反應進行15分鐘，然后排干液體。將上述三個步驟(CDI活化；TTD耦聯(lián)；琥珀酐反應)重復11次[即總共進行12次]。通過使用DMF(～50ml)攪拌流動清洗1分鐘來去除過量的反應物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。用8ml新制的溶于DMF的1.0M(8mmole)CDI溶液活化HOOC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-樹脂(0.5mmole)，并使其反應40分鐘，然后排干液體。通過使用DMF(～50ml)攪拌流動清洗1分鐘來去除過量的反應物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。將2.5mmole H-AlaOtBu.HCl溶解于4.75ml含有150μl(111mg，0.825mmole)DIEA的溶于DMF中的0.5M(2.375mmole)HOBT中，并劇烈攪拌以使其與CDI-活化的HOOC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-樹脂(0.5mmole)反應1小時，然后排干液體。用DCM(二氯甲烷)徹底清洗產(chǎn)物tertBuOOC-CH(CH3)-NH-OC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-樹脂，排干液體，然后在真空中將樹脂干燥至恒重。產(chǎn)物-樹脂通常重約2克。
根據(jù)標準的Fmoc-化學方法，用溶于DCM的4％的TFA將線型(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu聚合物從樹脂支持物上裂解下來。將沉淀粗產(chǎn)物溶解于含有1％TFA的50％的水性乙腈中，并凍干。少量含有1％TFA的50％的水性乙腈溶解凍干聚合物并稀釋，使有機物的濃度低于1％。將該粗產(chǎn)物裝入在T＝40℃條件下用3％B平衡的C4制備型反相柱中。將鹽等度洗脫，再用20-35％的Buffer B(含有1％TFA的50％的水性乙腈)對0.1％水性TFA的線性梯度以超過60分鐘的時間進行所需的模板的純化。用ES-MS對含有所需物質(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的組分進行鑒定，冷凍并凍干。
C.攜帶了用以形成分支的多個氨基和用以(后續(xù))與蛋白連接的被保護的氨氧基的模板的合成(GRFNP40)以0.4mmol數(shù)量級在Sieber酰胺生成樹脂上手動合成模板GRFNP40。在每一步連接、去保護和活化步驟之間都進行一次1分鐘的流動-清洗步驟。將2mmol Nα-Fmoc-Nβ(Boc-氨氧乙?；?-L-二氨基丙酸結合到樹脂上1小時，其中使用的是經(jīng)溶于DCM/DMF(二甲基甲酰胺)的2mmol DIC和2mmol NHS預活化NHS-酯30分鐘的樹脂。在去除Fmoc保護基團(2×3分鐘，溶于DMF中的20％的哌啶)和清洗之后，在樹脂中添加溶解于8ml含有2.2mmol DIEA的HOBT(N-羥苯三唑)中的琥珀酐4mmol。該步驟后，用8ml溶于DMF中的新制的0.5M(4mmole)的CDI活化羧基。在4ml溶于DMF中的0.5M的HOBT中添加4ml(18.2mmole)TTD，并結合30分鐘。
將Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(2mmol)結合到所得的氨基-TTD-Succ-Dpr(BocAoA)-樹脂上，其中使用的是經(jīng)溶于DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS預活化30分鐘的樹脂，并結合14小時。將該結合反應重復一次。在去除Fmoc步驟(2×3分鐘，溶于DMF中的20％的哌啶)后，如上所述將4mmol Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(2mmol)結合到樹脂上，包括重結合。在最后一次Fmoc保護步驟(2×3分鐘，溶于DMF中的20％的哌啶)后，根據(jù)標準的Fmoc-化學方法，用溶于DCM中的4％的TFA將模板從樹脂支持物上裂解下來，并凍干。將沉淀粗產(chǎn)物溶解于含有1％TFA的50％的水性乙腈中，并凍干。用少量的含有1％TFA的50％的水性乙腈溶解凍干聚合物并稀釋，使有機物的濃度低于1％。將該模板裝入在T＝40℃條件下用3％B(含有1％TFA的乙腈)平衡的C4制備型反相HPLC柱中。將鹽和其他非酰胺物質等度洗脫，再用5-12％的BufferB(含有1％TFA的乙腈)對0.1％水性TFA的線性梯度以超過60分鐘的時間進行所需的模板的純化。用ES-MS對含有所需Lys-Lys(Lys)-TTD-Succ Dpr(BocAoA)酰胺物質(GRFNP40)的組分進行鑒定，冷凍并凍干。
D.酰胺-耦聯(lián)的分支型聚合物(GRFNP41)的組裝和去保護合成分子量為16kDa的分支型(TTD-Succ)49聚合物GRFNP41，其方法是，將GRFNP39[(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu]與純化的模板GRFNP40耦聯(lián)。在存在20倍(摩爾)過量的DIEA的條件下，用以10mg/ml的濃度溶解在DMSO中的0.95mole的HATU{0-(7-氮苯三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲銨六氟磷酸鹽}活化純化的(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)(1.0mmole)，其中的GRFNP39在60℃條件下，以20mg/ml的濃度溶解在DMSO(二甲基亞砜)中。立即加入以3.9mg/ml的濃度溶解在DMSO中的純化的模板GRFNP40(0.24mmole)。用C4分析型反相HPLC和ES-MS對反應進程進行監(jiān)控。通常，連接反應在數(shù)分鐘內就能完成。為了激發(fā)反應，添加4倍體積(相對于連接混合物的體積)pH4的0.1M醋酸鹽/6M氯酸胍，然后將該溶液裝入制備型(C4)反相HPLC柱中，將鹽和其他不含有酰胺的物質等度洗脫，再用25-30％的Buffer B(含有1％TFA的乙腈)對0.1％水性TFA的線性梯度在80分鐘內完成所需分支型聚合物的純化。用ES-MS對含有所需物質的組分進行鑒定，冷凍并凍干。
將所得的純化聚合物以1mg/ml的濃度溶解在純TFA中1小時，以使Boc基團從氨氧乙?；鶊F上去除，并且也使叔丁基酯基團從-Ala-OtBu基團上去除。在旋轉蒸發(fā)器中將上述溶液旋轉干燥，再將干燥的聚合物溶解在50％的Buffer B(含有1％TFA的乙腈)中。添加氨氧乙酸(a.k.a.‘羧甲氧胺’)，并使其終濃度為0.5M，以清除絡合形成的雜質。20分鐘后，用3.3體積的Buffer A(溶于水中的0.1％的TFA)稀釋上述溶液，并裝入制備型C4反相HPLC柱中，用泵抽吸10％的Buffer B，直到去除所有的氨氧乙酸，然后用15-45％的Buffer B對0.1％水性TFA的逐級梯度以超過80分鐘的完成聚合物的純化。將含有所需分支型聚合物(GRFNP41)的合并組分冷凍并凍干。
E.肽段GRFN1776和GRFN1711與分支型聚合物GRFNP41的肟型連接(肟化作用)按照上文實施例1所述，用Boc化學SPPS的標準原位中和方法合成片段SEP-14(GRFN1776；包括SEQ ID NO2的第117-166位殘基)和片段SEP-11(GRFN1711；包括SEQ ID NO2的第1-32位殘基)。按照上文描述的標準方法，在-OCH2-Pam-樹脂上合成肽GRFN1776。按照上文描述的標準方法，在硫酯生成樹脂上合成肽GRFN1711。以等摩爾比將在Lys126上含有乙酰基丙?；鶊F的片段GRFN1776和含有AoA的片段GRFNP41共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。將該溶液凍干。將干粉粗產(chǎn)物重溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并裝入制備型反相(C4)HPLC柱中。利用制備型梯度反相HPLC將聚合物修飾的肽與未修飾肽及未反應聚合物分離。用ES-MS對含有所需肟鍵合(肟化)的產(chǎn)物SEP-14+GP41的組分進行鑒定，并且合并，凍干。
以等摩爾比將在Lys24上含有乙?；；鶊F的片段GRFN1711和含有AoA的片段GRFNP41共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。將該溶液冷凍并凍干。將干粉溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并裝入C4制備型反相HPLC柱中。利用制備型梯度洗脫C4反相HPLC將聚合物修飾的肽與未修飾肽及未反應聚合物分離。用ES-MS對含有所需肟鍵合(肟化)的產(chǎn)物SEP-11+GP41的組分進行鑒定，并且合并，凍干。
F.促紅細胞生成性合成蛋白SEP-1-B51的合成SEP-1-B51(SEQ ID NO2)是由四種多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-11+GP41(GRFN1711+GRFNP41，對應于SEQ ID NO2的第1-32位殘基)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24的乙?；；鶓掖够鶊F以肟鍵與分支型聚合物GRFNP41結合，表示為KOX；并且其中的His32被Dnp所保護)片段SEP-12(GRFN1712，對應于SEQ ID NO2的第33-88位殘基)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保護；并且其中的三個Trp殘基被甲酸基所保護)片段SEP-13(GRFN1713，對應于SEQ ID NO2的第89-116位殘基)CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保護；并且其中的His94被Dnp所保護)片段SEP-14+GP41(GRFN1716+GRFNP41，對應于SEQ ID NO2的第117-166位殘基)CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLRGKLKLYTGEA CRTGDR-羧酸酯(其中的C-末端半胱氨酸(即Cys161)帶有一個吡啶甲基(pico)保護基團；并且其中Lys126的乙?；；鶓掖够鶊F以肟鍵與分支型聚合物GRFNP41結合，表示為KOX)除了以下調整外，均按照實施例1-4中的描述來完成附加肽的合成、連接、羧甲基化、保護基團去除、折疊以及純化，以產(chǎn)生全長的折疊的SEP-1-B51(SEQ ID NO2)。
步驟1連接#1將片段SEP-14+GP41以3mM的濃度溶解在TFE中(1體積)。將片段SEP-13以2.25mM的濃度溶解在2體積含有6M氯酸胍的濃度為300mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.9)中。將上述兩種溶液混合，使片段SEP-14+GP41的終濃度為1mM，SEP-13的終濃度為1.5mM，然后加入1％苯硫酚，則得到一種pH為6.8-7.2的肽段溶液(‘3體積’)。在室溫條件下使反應過夜進行。連接反應完成后，在連接混合物中添加β-巰基乙醇(3體積)，再添加3體積pH為7.9的含有6M氯酸胍的濃度為300mM的磷酸鈉緩沖液和TCEP(肽段總重量的0.25倍)，并攪拌溶液20分鐘。用0.6體積的冰醋酸使上述溶液酸化至pH為4.0+/-0.1，從而得到一種澄清溶液，在該溶液中添加了30體積的pH為4.0的含有6M氯酸胍的濃度為100mM的醋酸鈉稀釋緩沖液。將所得溶液用泵抽入制備型反相(C4)HPLC柱中，然后用25-45％的Buffer B梯度以超過80分鐘的時間進行連接產(chǎn)物的純化。利用電噴射質譜對含有所需連接產(chǎn)物(Cys89(Acm)){SEP-13+SEP-14+GP41}的組分進行鑒定，并將各組分合并。
步驟2去除Acm#1去除Acm的方法是，用HPLC級水將含有(Cys89(Acm)){SEP-13+SE-14+GP41}合并組分的水性乙腈溶液稀釋1倍，并加入固體脲，使其終濃度為2摩爾。加入摩爾數(shù)三倍過量(相對于預計的總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液攪拌1小時。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，裝入半制備型反相HPLC柱上，并用泵抽吸25％的Buffer B，直到洗脫所有的非肽物質，然后利用50％Buffer B的逐級梯度對產(chǎn)物進行純化。利用電噴射質譜對含有所需連接產(chǎn)物{SEP-13+SEP-14+GP41}的組分進行鑒定，并將各組分合并。用ES-MS對所需產(chǎn)物SEP-03+SP.-04進行鑒定，并合并，凍干。
步驟3連接#2將步驟2得到的{SEP-13+SEP-14+GP41}產(chǎn)物[即1713-1776-GP41]以3mM的濃度溶解在TFE中(1體積)。將片段SEP-12(GRFN1712)以2.25mM的濃度溶解在2體積含有6M氯酸胍的濃度為300mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.9)中。將上述兩種溶液混合，使片段{SEP-13+SEP-14+GP41}的終濃度為1mM，而SEP-12的終濃度為1.5mM，然后加入1％苯硫酚，則得到一種pH為6.8-7.2的肽段溶液(‘3體積’)。在室溫條件下使反應過夜進行。然后在連接混合物中添加3體積的稀釋緩沖液(即相對于前面所用TFE的體積)pH為4.0的含有6M氯酸胍的濃度為100mM的醋酸鈉，然后將其加入到冷卻至4℃的含有3體積TFE、3體積β-巰基乙醇、3體積哌啶和6體積pH為4.0的含有6M氯酸胍的濃度為100mM的醋酸鈉溶液中，室溫攪拌20分鐘以去除所有的殘余保護基團。用1.8體積冷凍的冰醋酸使上述溶液酸化，其中添加了TCEP(肽段總重量的0.25倍)，從而得到一種澄清溶液，將該溶液孵育20分鐘。然后在該溶液中添加30體積的pH為4.0的含有6M氯酸胍的濃度為100mM的醋酸鈉稀釋緩沖液，混合該溶液。將所得溶液用泵抽入制備型反相(C4)HPLC柱中。然后抽吸30％C(Buffer C溶于60％異丙醇/30％乙腈/10％水的0.1％的TFA)緩沖液，直到所有的非肽物質都從柱中洗脫，然后利用37-57％Buffer C的梯度以超過80分鐘的時間進行連接產(chǎn)物的純化。用ES-MS對含有所需連接產(chǎn)物(Cys33(Acm)){SEp-12+SEP-13+SEP-14+GP41}的組分進行鑒定，并合并，凍干。
步驟4Cys89和Cys117殘基的羧甲基化將(Cys33(Acm)){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41}[即(Cys33(Acm))-1712-1713-1776-GP41]以1mM的濃度溶解在TFE中。添加10體積含有6M氯酸胍的濃度為300mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.9)。加入25倍過量(相對于巰基)的以75mg/ml濃度溶解在甲醇中的溴代乙酸，并在攪拌條件下，使上述溶液室溫反應2小時。然后用11體積的含有6M氯酸胍的濃度為100mM的醋酸鈉稀釋反應混合物，并裝入制備型反相HPLC柱中，然后抽吸20％Buffer C，直到所有非肽成分被洗脫，然后再用至55％Buffer C的逐級梯度進行純化。用ES-MS對含有所需修飾產(chǎn)物(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41}的組分進行鑒定，并合并，凍干。
步驟5去除吡啶甲基在2M HCl中活化鋅粉(每毫克肽71毫克鋅粉)5分鐘，并重復一次活化反應，然后用6M氯酸胍、含有(臨用前加入)35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸鈉的pH為2.2的50mM甘氨酸以及10％v/vTFE清洗鋅10分鐘以去除過量的酸。重復一次清洗。將含有Cys161(Pico)的肽(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41}以30mg/ml的濃度溶解在純TFE中。用4體積(相當于TFE)的6M氯酸胍、含有(臨用前加入)35mg/mlL-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸鈉的pH為2.2的50mM甘氨酸以及10％v/vTFE將上述溶液稀釋。再向溶液中加入活化的鋅粉，并室溫攪拌50分鐘。通過樣品(經(jīng)等體積的β-巰基乙醇和幾格令的TCEP處理，然后用2體積的6M氯酸胍和100mM醋酸鈉稀釋后再用于分析)的分析型C4反相HPLC每間隔～1小時對反應進行監(jiān)控，并且在2-5小時后結束反應。在完成吡啶甲基的去除后，可通過對分析型HPLC峰的ES-MS分析來指示(即分子量減小91Da)，用過濾法去除上清，并且用6M氯酸胍，pH4、含有35mg/ml L-甲硫氨酸的100mM醋酸鹽和含有20％TFE的35mg/ml十二烷基肌氨酸清洗殘余鋅粉3次。在混合的上清中添加BioRad SM-2微珠(約為溶液體積的1/3)，清洗并室溫攪拌30分鐘，然后過濾。以10％v/v的濃度添加β-巰基乙醇，再加入0.25x(混合的肽重量)的TCEP，室溫攪拌5分鐘。用等體積的pH4.0的100mM的醋酸鈉、6M氯酸胍按1∶1稀釋上述溶液，并裝入制備型(C4)反相HPLC柱中，用泵抽吸35％的Buffer C，直到洗脫所有的非肽物質，再用55％Buffer C的逐級梯度進行所需產(chǎn)物的純化。用電噴射質譜對含有所需Cys161-去保護產(chǎn)物(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}的組分進行鑒定，并合并。
步驟6去除Acm#2用HPLC級水將含有(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}[即(Cys33(Acm)；ψ89，117)-1712-1713-1776-GP41]的合并組分稀釋3倍，并加入固體脲，使其終濃度為2摩爾。加入摩爾數(shù)三倍過量(相對于總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液室溫攪拌1小時。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，并裝入半制備型(C4)反相HPLC柱中。用泵抽吸Buffer C(20％)，直到洗脫所有的非肽物質，然后利用55％Buffer C的逐級梯度對所需產(chǎn)物進行純化。利用電噴射質譜對含有所需產(chǎn)物(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}的組分進行鑒定，再用含有2x(w/w相對于肽的質量)DPC(十二烷基膽堿磷酸)的水將其稀釋2倍(v/v)，并凍干過夜。
步驟7連接#3將(Cys33(Acm)；ψ89，117) {SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}[即(Cys33(Acm)；ψ89，117)-1712-1713-1776-GP41]以3mM的濃度溶解在純TFE中(1體積)。將SEP-11[即1711-GP41]溶解在2體積含有6M氯酸胍的300mM磷酸鹽緩沖液(pH7.9)中，并加入1％苯硫酚。室溫條件下，將連接混合物攪拌過夜。在上述溶液中添加3體積(相對于前面所用TFE的體積)的β-巰基乙醇和9體積的連接緩沖液(含有6M氯酸胍的pH7.9的300mM的磷酸鹽緩沖液)。在溶液中添加0.25x(混合的肽重量)TCEP，然后將該溶液室溫攪拌20分鐘。加入冰醋酸(0.6體積)將溶液酸化至pH4.0，然后加入30體積的含有6M氯酸胍的pH4.0的100mM的醋酸鈉，并裝入制備型(C4)反相HPLC柱中。用泵抽吸Buffer C(25％)，直到洗脫所有的非肽物質，然后利用35-55％Buffer C的線性梯度以超過80分鐘的時間進行所需連接產(chǎn)物的純化。利用電噴射質譜對含有所需連接產(chǎn)物SEP-1(1-166)(ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}(SE1 ID NO2)的組分進行鑒定，并合并。
步驟8折疊在含有全長連接的肽SEP-1(1-166)(ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}[即1711(GP41)-1712-1713-1776-GP41]合并組分中加入固體氯酸胍、1M的Tris緩沖液(pH8.7)和蒸餾水，使終溶液含有0.1mg/ml的連接肽SEP-1(1-166)、6M的氯酸胍和100mM的Tris。將該連接肽(“蛋白”)溶液裝在15ml透析盒中，并在含有3M氯酸胍、5mM半胱氨酸和2mM胱氨酸的濃度為100mM的Tris緩沖液(pH8.5)中4℃透析過夜。然后再將該蛋白溶液在含有1M氨酸胍的濃度為100mM的Tris緩沖液(pH8.5)中4℃透析8小時，最后將該溶液在10mM的Tris緩沖液(pH7.0)中4℃透析14小時，從而得到最終的折疊產(chǎn)物。將來自透析盒的含有折疊蛋白的溶液合并。用ES-MS、分析型RP-HPLC和CD光譜測定法來證實折疊。
步驟9純化將含有折疊蛋白的溶液裝入經(jīng)pH7.0的10mM的Tris緩沖液平衡的Q-Sepharaose來自交換柱中。利用125mM NaCl的線性鹽梯度洗脫該折疊蛋白。用非還原SDS-PAGE對含有所需折疊產(chǎn)物SEP-1-B51的組分進行鑒定，并合并。用超濾管將上述合并組分濃縮至2mg/ml，然后將蛋白溶液裝入2.6×100cm的S-300凝膠過濾柱中。用pH7.0的10mM的Tris、137mM的NaCl將純化的SEP-1-B51洗脫下來。用非還原SDS-PAGE對含有高純度SEP-1-B51的組分進行鑒定，并合并，并于-80℃冷凍貯存。最后，用分析型(C4)反相HPLC、ES-MS、非還原SDS-PAGE以及CD光譜測定法對折疊蛋白SEP-1-B51的性質進行描述。圖25顯示了典型的等電點聚焦凝膠(IEF)和非還原SDS-PAGE凝膠，其顯示折疊的純化SEP-1-B51的相對分子量。為了比較，在同一塊膠上加入了分子量標準。如圖所示，利用非還原SDS-PAGE所確定的SEP-1-B51的相對分子量約為73kDa。相對pI約為5.0。此外，還顯示了折疊的純化SEP-1-B51產(chǎn)物的典型的RP-HPLC色譜圖。這說明了本發(fā)明的聚合物精確修飾的蛋白的純度和增加的相對分子量。
實施例8促紅細胞生成性合成蛋白SEP-1-B52的合成A.SEP-1-B52的組成。合成了第七種促紅細胞生成性合成蛋白(命名為SEP-1-B52)。全長SEP-1-B52的氨基酸序列與SEP-1-B51相同
APPRLICDSRVLERYLLEAKEAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ特指含有經(jīng)羧甲基化的巰基的半胱氨酸的非天然氨基酸殘基，并且其中KOX特指其ε-氨基經(jīng)化學修飾連接了以肟鍵結合指定的水溶性聚合物的肟連接基團的非天然賴氨酸。
SEP-1-B52蛋白是第24和126位殘基經(jīng)一種與SEP-1-B51類似的分支型(Succ-TTD)12-Succ-Ala聚合物構建體衍生得到的，但是，對該類似體而言，聚合物是通過丙酮酸與氨氧乙酸之間的肟鍵相連的。此外，第24和126位的賴氨酸殘基的ε-氨基被修飾以帶有一個氨氧乙?；δ芑鶊F，而不是乙?；；鶊F，并且該分支型(Succ-TTD)12-Succ-Ala聚合物構建體被制成帶有一個懸垂的丙酮酸?；鶊F。設計這些變化是為了促進合成和操作，并且進一步增加肟鍵的穩(wěn)定性。
圖23是分支型水溶性聚合物GRFNP43(GP43)化學合成的圖解，該GP43通過肟型連接而結合到SEP-1-B51上，下文將對此進行詳細描述。全長產(chǎn)物的組裝是按照實施例2所述進行的。SEP-1-B52的結構如圖24所示。
B.用以與分支模板(GRFNP42)結合的(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的合成以0.5mmol數(shù)量級合成(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)。將0.5mmole(～0.5克)的Sasrin酸流動型羧酸-生成聚苯乙烯樹脂(羥基取代1.02mmole/g)在DMF中溶脹15分鐘，然后排干液體。將溶于8ml含有500μl(3.9mmole)DIEA(二異丙基乙胺)的DMF的450mg(4.5mmole)琥珀酐和488mg(4mmole)4-二甲氨基嘧啶加入到羥基-功能化樹脂中，并劇烈攪拌使反應進行30分鐘，然后排干液體。重復連接反應，并通過使用DMF(～50ml)攪拌流動清洗1分鐘來去除過量的反應物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體?；罨疕OOC-CH2CH2CO-O-樹脂(0.5mmole)，其方法是添加8ml新制的溶于DMF的1.0M(8mmole)CDI(羰基二咪唑)溶液，并使其反應40分鐘，然后排干液體。通過使用DMF(～50ml)攪拌流動清洗1分鐘來去除過量的反應物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。再加入溶解在4ml的溶于DMF的0.5M(2mmole)HOBT溶液的4ml(4g，18.2mmole)TTD，并劇烈攪拌使反應進行30分鐘，然后排干液體。通過使用DMF(～50ml)攪拌流動清洗1分鐘來去除過量的反應物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。在樹脂中添加溶解于8ml含有500μl(3.9mmole)DIEA(二異丙基乙胺)的HOBT(N-羥苯三唑)的琥珀酐(450mmg，4.5mmole)，并劇烈攪拌使反應進行15分鐘，然后排干液體。將上述三個步驟(CDI活化；TTD耦聯(lián)；琥珀酐反應)重復11次[即總共進行12次]。通過使用DMF(～50ml)攪拌流動清洗1分鐘來去除過量的反應物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。用8ml新制的溶于DMF的1.0M(8mmole)CDI溶液活化HOOC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-樹脂(0.5mmole)，并使其反應40分鐘，然后排干液體。通過使用DMF(～50ml)攪拌流動清洗1分鐘來去除過量的反應物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。將2.5mmoleH-AlaOtBu.HCl溶解于4.75ml含有150μl(111mg，0.825mmole)DIEA的溶于DMF中的0.5M(2.375mmole)HOBT中，并劇烈攪拌以使其與CDI-活化的HOOC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-樹脂(0.5mmole)反應1小時，然后排干液體。用DCM(二氯甲烷)徹底清洗產(chǎn)物tertBuOOC-CH(CH3)-NH-OC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-樹脂，排干液體，然后在真空中將樹脂干燥至恒重。產(chǎn)物-樹脂通常重約2克。
根據(jù)標準的Fmoc-化學方法，用溶于DCM的4％的TFA將(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu線型聚合物從樹脂支持物上裂解下來。將沉淀粗產(chǎn)物溶解于含有1％TFA的50％的水性乙腈中，并凍干。少量含有1％TFA的50％的水性乙腈溶解凍干聚合物并稀釋，使有機物的濃度低于1％。將該粗產(chǎn)物裝入在T＝40℃條件下用3％B平衡的C4制備型反相柱中。將鹽等度洗脫，再用20-35％的Buffer B(含有1％TFA的50％的水性乙腈)對0.1％水性TFA的線性梯度以超過60分鐘的時間進行所需的模板的純化。用ES-MS對含有所需物質(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的組分進行鑒定，冷凍并凍干。
C.攜帶了用以形成分支的多個氨基和用以(后續(xù))與蛋白連接的被保護的氨氧基的模板的合成(GRFNP40)
以0.4mmol數(shù)量級在Boc-Leu-OCH2-Pam樹脂上手動合成模板。在每一步連接、去保護和活化步驟之間都用DMF進行一次1分鐘的流動-清洗步驟。通過用純(即100％)TFA處理來去除Boc基團。在用DMF清洗后，將經(jīng)過溶解在3.8ml的含有1ml DIEA的1.8mmol HBTU活化的樹脂與2mmol的Fmoc-(Rink-linker)-OH耦聯(lián)。去除Fmoc保護基團(2×3分鐘，溶于DMF中的20％的哌啶)后，通過用溶解在DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS使NHS-酯活化來將2mmol Fmoc-Lys(MTT)-OH[MTT＝4-甲基三苯甲基]耦聯(lián)到樹脂上。去除Fmoc保護基團(2×1分鐘，溶于DMF中的0.5％的DBU)后，將樹脂與溶解于8ml含有2.2mmol DIEA的HOBT中的4mmol琥珀酐耦聯(lián)。該步驟后，用8ml溶于DMF中的新制的0.5M CDI活化羧基。在4ml 0.5M的HOBT溶液中添加4mlTTD，并結合30分鐘。
通過用溶解在DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS使NHS-酯活化來將2mmol Fmoc-Lys(Fmoc)-OH耦聯(lián)到樹脂上。去除Fmoc(2×1分鐘，溶于DMF中的0.5％的DBU)后，將4mmol Boc-Lys(Boc)-NHS結合到3ml的DMF中。
用溶于DCM中的2％的TFA多次清洗來去除MTT保護基團。當上清不再是黃色時，去保護反應就完成了。用溶于DMF中的10％的DIEA中和樹脂10分鐘。通過用溶解在DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS使NHS-酯活化40分鐘來將2mmol丙酮酸耦聯(lián)到樹脂上。其中使用的是經(jīng)溶于DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS預活化30分鐘的樹脂。用含有5％水的純TFA將模板去保護并將其從樹脂支持物上裂解下來。將裂解溶液在旋轉蒸發(fā)器中揮發(fā)干燥并凍干。將殘余物溶解在含有1％TFA的50％的水性乙腈中，并凍干。少量含有1％TFA的50％的水性乙腈溶解凍干的模板并稀釋，使有機物的濃度低于1％。將該含有丙酮酸的模板裝入在T＝40℃條件下用0％B[即100％Buffer A＝溶解在水中的0.1％的TFA]平衡的C4 Prep柱中。將鹽等度洗脫，再用5-12％的Buffer B對0.1％水性TFA的線性梯度以60分鐘的時間進行所需的模板的純化。用ESI-MS對含有所需物質(GRFNP42)的組分進行鑒定，冷凍并凍干。
D.酰胺-耦聯(lián)的分支型聚合物(GRFNP43)的組裝和去保護合成分子量為16kDa的分支型(TTD-Succ)49聚合物GRFNP43，其方法是，將GRFNP39與純化的模板GRFNP42耦聯(lián)。在存在20倍(摩爾)過量的DIEA的條件下，用以10mg/ml的濃度溶解在DMSO中的0.95mole的HATU活化純化的(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)(1.0mmole)，其中的GRFNP39在60℃條件下，以20mg/ml的濃度溶解在DMSO中。立即加入以3.9mg/ml的濃度溶解在DMSO中的純化的模板GRFNP42(0.24mmole)。用C4分析型反相HPLC和ES-MS對反應進程進行監(jiān)控。通常，連接反應在數(shù)分鐘內就能完成。為了激發(fā)反應，添加4倍體積(相對于連接混合物的體積)pH4的0.1M醋酸鹽/6M氯酸胍，然后將該溶液裝入制備型(C4)反相HPLC柱中，將鹽和其他不含有酰胺的物質等度洗脫，再用20-35％的Buffer B(含有1％TFA的乙腈)對0.1％水性TFA的線性梯度以超過80分鐘的時間進行所需分支型聚合物的純化。用ES-MS對含有所需物質的組分進行鑒定，冷凍并凍干。
將所得的純化聚合物以1mg/ml的濃度溶解在純TFA中1小時，以去除Ala-OtBu叔丁基酯的保護。在旋轉蒸發(fā)器中將上述溶液揮發(fā)干燥，再將干燥的聚合物溶解在50％的Buffer B(含有1％TFA的乙腈)中。在制備型反相HPLC柱中，用15-45％的Buffer B對0.1％水性TFA的逐級梯度以80分鐘的時間進行聚合物的脫鹽。將含有所需分支型聚合物(GRFNP43)的合并組分冷凍并凍干，并且用該凍干的粉末以進行肟化連接步驟。
E.肽段GRFN1776和GRFN1711與分支型聚合物GRFNP43的肟型連接(肟化作用)按照上文實施例2、3、4和7所述，用標準的耦聯(lián)方法合成片段SEP-14和片段SEP-11，只是添加在各自肽段中的Lys24和Lys126上的不是乙酰丙酸，而是氨氧乙?；鶊F(AoA)。由此，在肽-樹脂組裝后，將每個肽-樹脂上的側鏈Fmoc基團去除，并且通過用溶解在DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS使NHS-酯活化來將2mmol Boc-氨氧乙酸添加到樹脂中。用HF將這兩種肽去保護，并將其從樹脂上裂解下來，然后用C4反相HPLC進行純化。采用適當?shù)念A防措施以避免與羰基化合物接觸。以等摩爾比將片段SEP-14和GRFNP43共同溶解在含有0.1％TFA(三氟乙酸)的50％的水性乙腈中。將該溶液凍干。將干粉重溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并裝入制備型C4反相HPLC柱中。利用制備型梯度反相HPLC將聚合物修飾肽與未修飾肽及未反應聚合物分離。用ES-MS對含有所需肟化產(chǎn)物SEP-14+GP43的組分進行鑒定，并合并。
以等摩爾比將片段SEP-11和GRFNP43共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。將該溶液冷凍并凍干。將干粉溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并裝入制備型梯度C4反相HPLC柱中。利用制備型反相梯度洗脫將聚合物修飾肽與未修飾肽及未反應聚合物分離。用ES-MS對含有所需肟化產(chǎn)物SEP-11+GP43的組分進行鑒定，并合并。
F.促紅細胞生成性合成蛋白SEP-1-B52的合成SEP-1-B52(SEQ ID NO2)是由四種多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-11+GP43(GRFN1711+GRFNP43，對應于SEQ ID NO2的第1-32位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24的乙酰基丙?；鶓掖够鶊F以肟鍵與分支型聚合物GRFNP41結合，表示為KOX；并且其中的His32被Dnp所保護)片段SEP-12(GRFN1712，對應于SEQ ID NO2的第33-88位殘基)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保護；并且其中的三個Trp殘基被甲酸基所保護)片段SEP-13(GRFN1713，對應于SEQ ID NO2的第89-116位殘基)CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保護；并且其中的His94被Dnp所保護)片段SEP-14+GP43(GRFN1716+GRFNP43，對應于SEQ ID NO2的第117-166位殘基)CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLRGKLKLYTGEA CRTGDR-羧酸酯(其中的C-末端半胱氨酸(即Cys161)帶有一個吡啶甲基(pico)保護基團，并且其中Lys126的AoA懸垂基團以肟鍵與分支型聚合物GRFNP43結合，表示為KOX)按照實施例1、2、3、4和7中的描述來完成附加肽的合成、連接、羧甲基化、保護基團去除、折疊以及純化，以產(chǎn)生全長的折疊的SEP-1-B52(SEQ ID NO2)，用分析性(C4)反相HPLC、ES-MS和非還原SDS-PAGE對該蛋白的性質進行描述。按照其他SEP構建體的描述來完成生物檢測。
實施例9SEP-3-L42的功效研究將SEP-1-L30重新配制到添加了0.25％大鼠血清白蛋白(RSA)的Citrate Buffer(20mM檸檬酸+100mM氯化鈉)中，并且在第1、3和6天，將其以0、1、5或10μg/kg，tiw的劑量靜脈內給藥于正常雄性大鼠(每組5只大鼠)。在最后一次注射(第9天)后4天，收集血液樣品，并分析其血液學參數(shù)。當與對照組的數(shù)據(jù)比較時，在用SEP-3-L42以這些劑量進行最后一次注射后4天，紅細胞(RGB)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞比容(HCT)和網(wǎng)織紅細胞數(shù)(RET)值沒有統(tǒng)計學意義的顯著差異。
實施例10SEP-3-L42的藥代動力學研究將SEP-3-L42重新配制到添加了0.25％RSA的pH為6.9的CitrateBuffer(20mM檸檬酸+100mM氯化鈉)中，并且將其以5μg/kg的單一劑量靜脈內給藥于正常雄性大鼠。在給藥后0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144和168小時收集血液樣品。用ELISA試劑盒(R&DSystems，Human Erythropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit#DEP00)，根據(jù)制造商的說明書來測定血漿中SEP-3-L42的濃度。該結果顯示在圖27中。
如圖17所示，與SEP-3-L42相比，SEP-1-B50的清除率略微減慢。在劑量測試中，無論其循環(huán)半衰期如何，SEP-3-L42在促進紅細胞增殖方面沒有表現(xiàn)出統(tǒng)計學上的顯著差異。與之相反，SEP-1-B50能以相同劑量刺激紅細胞增殖。該結果說明可以利用聚合物結構來調節(jié)體內的生物學特性，包括藥代動力學行為和潛能。
實施例11SEP-1-L30的功效研究將SEP-1-L30重配制到添加了0.25％RSA的Citrate Buffer(20mM檸檬酸+100mM氯化鈉)中，并且在第1、3和5天，將其以0、1、5、25或50μg/kg，tiw的劑量靜脈內給藥于正常雄性大鼠(每組5只大鼠)。在最后一次注射(第9和第13天)后4天和8天，收集血液樣品，并分析其血液學參數(shù)。在用SEP-1-L30處理后的任何間期，與對照組比較，RBC值、HGB值和HCT值都沒有統(tǒng)計學上的顯著差異。用25和50μg/kg SEP-1-L30處理的大鼠在最后一次注射(第9天)后4天，其網(wǎng)織紅細胞數(shù)增高(與對照組的那些數(shù)據(jù)比較，具有統(tǒng)計學上的顯著差異)。在第9或第13天，所有用SEP-1-L30處理的動物中都沒有發(fā)現(xiàn)血液學參數(shù)的其他差異。[未提供數(shù)據(jù)]實施例12SEP-1-L30的藥代動力學研究將SEP-1-L30重配制到添加了0.25％RSA的pH為6.9的CitrateBuffer(20mM檸檬酸+100mM氯化鈉)中，并且將其以5或25μg/kg的單一劑量靜脈內給藥于正常雄性大鼠。在給藥后0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144和168小時收集血液樣品。用ELISA試劑盒(R&D Systems，Human Erythropoietin Quantikine IVDImmunoassay Kit #DEP00)，根據(jù)制造商的說明書來測定血漿中SEP-1-L30的濃度。在給藥后的所有特定時間點，都沒有檢測到SEP-1-L30。
實施例13SEP-1-B50的功效研究將SEP-1-B50重配制到添加了0.25％RSA的無菌PBS(磷酸鹽緩沖液)中，并且在第1、3和6天，將其以0、1、5、25或125μg/kg，tiw的劑量靜脈內給藥于正常雄性大鼠(每組5只大鼠)。在最后一次注射(第10、15和20天)后4、9和14天，收集血液樣品，并分析其血液學參數(shù)。數(shù)據(jù)顯示在下面的表VIII中。在最后一次注射(第10天)后4天，在接受了5、25和125μg/kg SEP-1-B50處理的動物中發(fā)現(xiàn)，增加的RBC、HGB、HCT和RET具有劑量相關效應(與對照組的那些數(shù)據(jù)比較，具有統(tǒng)計學上的顯著差異)。在第15天時，這些動物的RBC、HGB和HCT保持著比對照值高的水平，并且在以125μg/kgSEP-1-B50處理的動物中，直到第20天(最后一次注射后14天)，RBC、HGB和HCT仍然顯著地比對照值高。
表VIIISEP-1-B50多次給藥后的血液學測定結果


*與對照有顯著差異p＜0.05**與對照有顯著差異p＜0.01
實施例14SEP-1-B50的藥代動力學研究將SEP-1-B50重配制到添加了0.25％RSA的pH為6.9的CitrateBuffer(20mM檸檬酸+100mM氯化鈉)中，并且以5或25μg/kg的單一劑量水平將其靜脈內給藥于正常雄性大鼠。在給藥后0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144和168小時收集血液樣品。用ELISA試劑盒(R&D Systems，Human Erythropoietin Quantikine IVDImmunoassay Kit #DEP00)，根據(jù)制造商的說明書來測定血漿中SEP-1-B50的濃度。分別對以5和25μg/kg劑量處理后9.7小時和9.9小時的清除半衰期進行測定。對5和25μg/kg劑量的觀測MRT(平均滯留時間)分別為13.9小時和14.4小時。圖27中顯示了SEP-1-B50的典型的藥代動力學概圖。
實施例15SEP-1-B51的功效研究通過兩次實驗，將SEP-1-B51靜脈內給藥于正常雄性大鼠。
實驗1將SEP-1-B51重新配制在添加了0.25％RSA的CitrateBuffer(20mM檸檬酸鈉+100mM氯化鈉)中，然后在第1、3和6天將其以0、1、5或25μg/kg，tiw的劑量靜脈內給藥于雄性大鼠(每組5只大鼠)，并在最后一次注射的4、9和14天后(第10、15和20天)收集血液樣品，用于血液學參數(shù)分析。數(shù)據(jù)顯示于下文表IX。與對照組相比，在第3次和最后一次SEP-1-B51靜脈內注射的4天后(第10天)，接受25μg/kg SEP-1-B51的動物體內的RBC、HGB、HCT和絕對網(wǎng)織紅細胞數(shù)(ART)出現(xiàn)了具有統(tǒng)計學意義的顯著增加。在第15天時，這些動物的RBC值仍高于對照值，并且在第20天時仍與對照值具有可比性。第10天后，網(wǎng)織紅細胞的產(chǎn)量有所降低，第15天時，在接受5和25μg/kg的動物體內觀測到網(wǎng)織紅細胞數(shù)的明顯降低。
表IX多次SEP-1-B51給藥后的血液學檢測結果


**與對照有顯著差異p＜0.01*與對照有顯著差異p＜0.05實驗2將SEP-1-B51重新配制在添加了0.25％人血清白蛋白的Citrate Buffer(20mM檸檬酸鈉+100mM氯化鈉)中，然后在第1、3和5天將其以0、1、5或25μg/kg，tiw的劑量靜脈內給藥于雄性大鼠(每組5只大鼠)，并在最后一次注射的2、4和6天后(第7、9和11天)收集血液樣品，用于血液學參數(shù)分析。此外還在其余的研究日(第2、3、4、5、6、8、10、12和13天)每天收集只用于紅細胞比容測定〔按壓縮的細胞體積(PCV)〕的血液樣品。數(shù)據(jù)顯示于下文表X。從第一次注射的2天(第3天)后開始，接受劑量為5和25μg/kg的動物體內的HCT(PCV或計算)值明顯增加，并一直持續(xù)到第3次和最后一次注射的6天(第11天)后。在接受劑量為5和25μg/kg的動物體內，測定的(最后一次給藥的2、4和6天后；第7、9和11天)RBC和HGB值也明顯增加。在25μg/kg組，ART的明顯增加只出現(xiàn)在最后一次注射后2和4天(第7和9天)。
表X多次SEP-1-B51給藥σ后的血液學檢測結果

*與對照有顯著差異p＜0.05**與對照有顯著差異p＜0.01注釋第7天(第三次給藥后兩天)；第9天(第三次給藥后四天)第11天(第三次給藥后六天)用25μg/kg單一劑量的SEP-1-B51經(jīng)靜脈內處理其他組的大鼠，并且在注射后48小時收集血液樣品以用于分析其血液學參數(shù)。此外還僅在注射(第1、2、4和8天)后8、24和72小時以及7天后，收集用于紅細胞比容測定〔按壓縮的細胞體積〕的血液樣品。在第3天(注射后2天)，接受SEP-1-B51靜脈內處理的大鼠的HCT、HGB和ART值比對照值高，并且在第4天，這些動物的HCT仍然顯著增加。
實施例16在紅細胞增多和缺氧模型中SEP-1-B51的功效研究將以10只正常小鼠為一組的數(shù)組小鼠(賦形劑對照，以4種劑量水平的在CHO-細胞(“rhEPO”)中重組產(chǎn)生的糖基化的人促紅細胞生成素，以及以4種劑量水平0.32、1、5、25μg/kg/假定100mU/ng的SEP-1-B51)每天暴露在壓強維持在506.5mb的大氣中18小時，持續(xù)20天。將配制在添加了0.25％人血清白蛋白的Citrate Buffer中的rhEPO或SEP-1-B51以200μl-量經(jīng)靜脈內(IV)注射到經(jīng)歷缺氧狀態(tài)4天后的小鼠中。2天后，用0.2μCi的59Fe經(jīng)腹腔(i.p.)注射每只小鼠。3天后，通過測定用心臟穿刺術取得的500μl血液中的放射量來估計RBC-放射鐵攝取量。
SEP-1-B51和rhEPO的72-小時RBC-59Fe攝取量(劑量百分比)結果顯示，隨劑量向5μg/kg增加，59Fe攝取量的增加具有明顯的劑量相關效應，當劑量大于5μg/kg時(25μg/kg)，該反應處于平臺期。因此，使用三種最低劑量水平來計算線性回歸。圖28顯示了SEP-1-B51和rhEPO的線性回歸分析結果。SEP-1-B51和rhEPO的效應基本上一致。SEP-1-B51與rhEPO的“效能比”是1.0035(0.6947-1.4498的95％可信區(qū)間)，該分析中確定的SEP-1-B51的效能為100mU/ng(69-145的95％可信區(qū)間)。
在體內SEP-1-B51表現(xiàn)出與rhEPO相似的活性，并且以劑量依賴性方式發(fā)揮作用，包括在較高劑量時形成的反應平臺，其原因是該模型中誘導了常見于rhEPO的負反饋機制。這說明在SEP-1-B51分子的自定糖基化位點上精確連接的聚合物結構可以模擬rhEP0糖鏈所具有的體內活性。
實施例17SEP-1-B51的藥代動力學研究將以5ug/kg單一劑量的重新配制在添加了0.25％人血清白蛋白的Citrate Buffer中的SEP-1-B51或rhEPO(相當于500U/kg)經(jīng)靜脈內給藥于幾組正常雄性大鼠，并且在給藥后5、30、60分鐘和24小時以及第2、3、4、5、6和7天放血。用R&D Systems抗EPO ELISA試劑盒(R&D Systems，Human Erythropoietin Quantikine IVDImmunoassay Kit #DEP00)，根據(jù)制造商的說明書通過ELISA試驗來確定血漿樣品中SEP-1-B51或rhEPO的濃度。
進行濃度的對數(shù)的最小平方分析，得到的藥代動力學參數(shù)列在下面的表XI中。在接受以5ug/kg單一劑量的SEP-1-B51經(jīng)靜脈內給藥的雄性大鼠中，其血漿濃度隨時間的變化可以用一種單指數(shù)藥代動力學分布函數(shù)來描述，其半衰期為10.5±0.5小時。SEP-1-B51的中心象限的分布容積(Vc)為32.5±2.0ml/kg。清除率(CL)為2.15ml/hr/kg，其平均滯留時間(MRT)為15.1±0.7小時。相比之下，在接受以5ug/kg劑量的rhEPO經(jīng)靜脈內給藥的雄性大鼠中，其血漿濃度的變化可以用雙指數(shù)藥代動力學分布函數(shù)來描述，其α半衰期為1.24±0.22小時，其β半衰期為5.51±0.40小時。rhEPO的Vc為57.0±3.2ml/kg。CL為16.0±0.5ml/hr/kg，約比SEP-1-B51的CL大8倍。rhEPO的平均滯留時間(MRT)為5.73±0.17小時，約比SEP-1-B51的MRT短3倍。
表XISEP-1-B51與rhEPO的藥代動力學參數(shù)的比較

圖29以圖形表示了SEP-1-B51和rhEPO的血漿清除率。這些數(shù)據(jù)說明SEP-1-B51的循環(huán)半衰期比糖基化的重組人EPO的循環(huán)半衰期明顯地增加，這種增加是由分子中精確連接在自定位點上的聚合物引起的。
本發(fā)明是結合其特定實施方案來加以描述的，但應該了解的是，可以對本發(fā)明做進一步改進，而該申請書應包括任何變化、應用或修改，這些變化、應用或修改可以符合本發(fā)明的一般原理，也可以偏離本發(fā)明的公開內容，但是處于本發(fā)明所屬領域已知或慣用準則的范圍內，并且適用于上文闡述的本質特征。
序列表序列表<110>格萊風科學公司(Gryphon Sciences)<120>促紅細胞生成性合成蛋白<130>03504.265<140><141><150>60/231,339<151>2000-09-08<150>60/236,377<151>2000-09-29<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Lys Ser Ser Gln Pro Trp Cys Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Cys Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr lle Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>2<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Lys lle Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Lys Ser Ser Gln Pro Trp Cys Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Cys Ala lle Ser Pro Pro Asp Ala Ala Lys Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>3<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Ala Pro Pro Arg Leu lle Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Cys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Cys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Ala Cys Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Cys Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg16權利要求
1.一種促紅細胞生成性合成蛋白，該蛋白聯(lián)接有一種或多種水溶性聚合物。
2.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，該蛋白在體內具有提高紅細胞產(chǎn)量的生物活性。
3.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，該蛋白包含一段具有核糖體特定促紅細胞生成素氨基酸序列的多肽鏈，以及通過一種或多種化學連接位點共價結合的一種或多種非重疊肽段。
4.權利要求3的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，一種或多種所述水溶性聚合物是通過與所述核糖體特定促紅細胞生成素的糖基化位點相對應的一個位點聯(lián)接于所述多肽鏈。
5.權利要求3的促紅細胞生成性合成蛋白，其中的核糖體特定促紅細胞生成素來源于人。
6.權利要求3的促紅細胞生成性合成蛋白，其中的核糖體特定促紅細胞生成素糖蛋白是非天然蛋白。
7.權利要求6的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述非天然的核糖體特定促紅細胞生成素具有一個或多個非天然的糖基化位點。
8.權利要求2的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述水溶性聚合物只通過與所述核糖體特定促紅細胞生成素的糖基化位點相對應的一個或多個位點聯(lián)接于所述多肽鏈。
9.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，一種或多種所述水溶性聚合物包含一種重復單元，該重復單元包括聚環(huán)氧烷、聚酰胺環(huán)氧烷，或其衍生物。
10.權利要求9的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述聚環(huán)氧烷和聚酰胺環(huán)氧烷包含一種通式為-(CH2-CH2-O)-的環(huán)氧乙烷重復單元。
11.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，一種或多種所述水溶性聚合物呈分支型。
12.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，一種或多種所述水溶性聚合物帶有一種在生理條件下為負值的凈電荷。
13.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白的等電點為3-7。
14.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述水溶性聚合物呈單分散狀態(tài)。
15.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白呈單分散狀態(tài)。
16.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于25kDa的單體。
17.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于40kDa的單體。
18.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于50kDa的單體。
19.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于60kDa的單體。
20.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于70kDa的單體。
21.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述多肽鏈含有一種或多種不規(guī)則氨基酸。
22.權利要求21的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述不規(guī)則氨基酸具有一種非天然的側鏈。
23.權利要求21的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述不規(guī)則氨基酸包括一種假氨基酸。
24.權利要求23的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述假氨基酸是假谷氨酸酯。
25.權利要求22的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述非天然側鏈與一種水溶性聚合物共價結合。
26.權利要求25的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述水溶性聚合物通過一種由化學連接形成的鍵與所述側鏈共價結合。
27.權利要求26的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述由化學連接形成的鍵選自酰胺鍵、肟鍵、腙鍵、噻唑烷鍵、惡唑烷鍵和硫酯鍵。
28.權利要求3的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，一種或多種所述化學連接位點包含一種酰胺鍵。
29.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述水溶性聚合物是通過所述多肽鏈的化學連接位點上的一種氨基酸側鏈與該多肽鏈相聯(lián)接。
30.權利要求1的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，該蛋白含有一種選自SEP-1和SEP-3的促紅細胞生成性合成蛋白的氨基酸序列。
31.一種促紅細胞生成性合成蛋白，該蛋白選自SEP-0、SEP-1、SEP-3，及其類似物。
32.權利要求31的促紅細胞生成性合成蛋白，其中，所述類似物選自SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50、SEP-1-B51和SEP-1-B52。
33.一種藥用組合物，該組合物含有權利要求1的一種促紅細胞生成性合成蛋白，或其藥學容許的鹽類。
34.權利要求33的藥用組合物，該組合物含有一種或多種選自緩沖液、載體蛋白、氨基酸、洗滌劑、脂類、水溶性聚合物和防腐劑的賦形劑。
35.權利要求33的藥用組合物，該組合物除所述促紅細胞生成性合成蛋白之外還含有一種或多種額外的生物活性劑。
36.一種提高哺乳動物紅細胞比容的方法，該方法包括將權利要求1的一種促紅細胞生成性合成蛋白以有效的劑量給藥于所述哺乳動物，從而使所述哺乳動物體內的紅細胞比容提高。
37.一種提高哺乳動物體內紅細胞產(chǎn)量的方法，該方法包括將權利要求1的一種聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白以有效的劑量給藥于所述哺乳動物，從而使所述哺乳動物體內的紅細胞產(chǎn)量提高。
38.一種提高哺乳動物體內血紅蛋白產(chǎn)量的方法，該方法包括將權利要求1的一種聚合物修飾促紅細胞生成性合成蛋白以有效的劑量給藥于所述哺乳動物，從而使所述哺乳動物體內的血紅蛋白產(chǎn)量提高。
39.一種提高哺乳動物體內網(wǎng)織紅細胞數(shù)的方法，該方法包括將權利要求1的一種促紅細胞生成性合成蛋白以有效的劑量給藥于所述哺乳動物，從而使所述哺乳動物體內的網(wǎng)織紅細胞數(shù)提高。
40.一種產(chǎn)生含有促紅細胞生成性合成蛋白多肽鏈的方法，該方法包括，將含有所述促紅細胞生成性合成蛋白的非重疊性多肽鏈氨基酸序列的一些肽段進行化學連接，從而產(chǎn)生一種含有所述促紅細胞生成性合成蛋白的多肽鏈。
41.權利要求40的方法，該方法進一步包括使所述多肽鏈折疊，從而產(chǎn)生一種具有生物活性的促紅細胞生成性合成蛋白。
42.權利要求40的方法，其中，一種或多種所述肽段被部分保護。
43.權利要求40的方法，其中，一種或多種所述肽段未被保護。
44.權利要求40的方法，其中，一種或多種所述肽段聯(lián)接有一種水溶性聚合物。
45.權利要求40的方法，其中，所述化學連接包括一種選自天然化學連接、擴展的天然化學連接、假天然化學連接、肟鍵形成化學連接、腙鍵形成化學連接、惡唑烷鍵形成化學連接、噻唑烷鍵形成化學連接和硫酯鍵形成化學連接的化學選擇性連接。
46.權利要求40的方法，其中，所述多肽鏈聯(lián)接有一種或多種水溶性聚合物。
47.權利要求40的方法，其中，所述多肽鏈含有一種核糖體特定促紅細胞生成素氨基酸序列。
48.權利要求46的方法，其中，一種或多種所述水溶性聚合物是通過與所述核糖體特定促紅細胞生成素的糖基化位點相對應的一個位點聯(lián)接于所述多肽鏈。
49.權利要求48的方法，其中，所述核糖體特定促紅細胞生成素糖蛋白是利用重組方法產(chǎn)生的。
50.權利要求48的方法，其中，所述核糖體特定促紅細胞生成素糖蛋白是非天然的。
51.權利要求50的方法，其中，所述非天然核糖體特定促紅細胞生成素糖蛋白具有一個或多個非天然的糖基化位點。
52.權利要求47的方法，其中，所述核糖體特定促紅細胞生成素來源于人。
53.權利要求48的方法，其中，所述水溶性聚合物只通過與所述核糖體特定促紅細胞生成素的糖基化位點相對應的一個位點聯(lián)接于所述多肽鏈。
54.權利要求46的方法，其中，一種或多種所述水溶性聚合物包含一種重復單元，該重復單元包括聚環(huán)氧烷、聚酰胺環(huán)氧烷，或其衍生物。
55.權利要求54的方法，其中，所述聚環(huán)氧烷和聚酰胺環(huán)氧烷包含一種通式為-(CH2-CH2-O)-的環(huán)氧乙烷重復單元。
56.權利要求46的方法，其中，一種或多種所述水溶性聚合物呈分支型。
57.權利要求46的方法，其中，一種或多種所述水溶性聚合物帶有一種在生理條件下為負值的凈電荷。
58.權利要求41的方法，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白的等電點為3-7。
59.權利要求46的方法，其中，所述水溶性聚合物呈單分散狀態(tài)。
60.權利要求40的方法，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白呈單分散狀態(tài)。
61.權利要求46的方法，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于25kDa的單體。
62.權利要求46的方法，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于40kDa的單體。
63.權利要求46的方法，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于50kDa的單體。
64.權利要求46的方法，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于60kDa的單體。
65.權利要求46的方法，其中，所述促紅細胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于70kDa的單體。
66.權利要求40的方法，其中，所述多肽鏈含有一種或多種不規(guī)則氨基酸。
67.權利要求66的方法，其中，所述不規(guī)則氨基酸具有一種非天然的側鏈。
68.權利要求67的方法，其中，所述不規(guī)則氨基酸包括一種假氨基酸。
69.權利要求40的方法，其中，所述多肽鏈含有一種化學連接位點，該位點具有一種選自酰胺、肟、腙、噻唑烷、惡唑烷和硫酯的鍵。
70.權利要求46的方法，其中，所述水溶性聚合物與具有非天然側鏈的所述多肽鏈的一種氨基酸相聯(lián)接。
71.權利要求46的方法，其中，所述水溶性聚合物通過一種由化學連接形成的鍵與所述側鏈共價結合。
72.權利要求71的方法，其中，所述由化學連接形成的鍵選自酰胺鍵、肟鍵、腙鍵、噻唑烷鍵、惡唑烷鍵和硫酯鍵。
73.權利要求46的方法，其中，所述水溶性聚合物是通過所述多肽鏈的化學連接位點上的一種氨基酸側鏈與該多肽鏈相聯(lián)接。
74.權利要求41的方法，其中，所述具有生物活性的促紅細胞生成性合成蛋白在體內具有提高紅細胞產(chǎn)量的生物活性。
75.權利要求40的方法，其中，所述多肽鏈含有一種選自SEP-1和SEP-3的促紅細胞生成性合成蛋白的氨基酸序列。
76.權利要求40的方法，其中的促紅細胞生成性合成蛋白選自SEP-0、SEP-1、SEP-3，及其類似物。
77.權利要求76的方法，其中，所述類似物選自SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50、SEP-1-B51和SEP-1-B52。
全文摘要
本發(fā)明提供一些促紅細胞生成性合成蛋白。還提供用于合成這些蛋白的方法。本發(fā)明還涉及這些促紅細胞生成性合成蛋白以特定方式聚合物修飾的衍生物。此外還提供與這些蛋白及其衍生蛋白有關的方法和應用。
文檔編號C07K19/00GK1458846SQ01815382
公開日2003年11月26日 申請日期2001年7月12日 優(yōu)先權日2000年9月8日
發(fā)明者G·科亨德菲爾, P·博蒂, J·A·布拉德博尼, S·－Y·陳, S·克雷斯曼, C·L·亨特, S·B·H·肯特, D·W·羅 申請人:格萊風治療公司