專利名稱：用于改變b細胞介導(dǎo)病理的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來講涉及免疫學(xué)和免疫治療領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及用于改變B細胞介導(dǎo)病理例如B細胞惡性腫瘤和/或自身免疫病的方法和組合物。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)既產(chǎn)生抗體介導(dǎo)的應(yīng)答，也產(chǎn)生細胞介導(dǎo)的應(yīng)答。每種類型的免疫應(yīng)答由淋巴細胞B細胞(對于抗體介導(dǎo)應(yīng)答而言)和T細胞(對于細胞介導(dǎo)應(yīng)答而言)中的一種類型來調(diào)控。B細胞最初在抗原結(jié)合到B細胞表面的IgM和IgD分子上時識別所述抗原。每種B細胞克隆由于該克隆的單一獨特型，僅識別特定的抗原。當(dāng)識別所述抗原后，B細胞將所述抗原內(nèi)化并且加以加工，以供通過MHC II類分子呈遞。B細胞因此可以作為給T細胞的抗原呈遞細胞(“APC”)起作用。當(dāng)外源性蛋白質(zhì)(抗原)的部分與主要組織相容性復(fù)合體分子(“MHC”)結(jié)合(通常在APC上)時(所述抗原在APC中被消化為片段，與自身MHC結(jié)合呈遞到所述APC表面)，T細胞與所述蛋白的部分結(jié)合。
幾種類型的癌起源于循環(huán)系統(tǒng)。在主要類型中有白血病，一種骨髓和血液腫瘤；骨髓瘤，一種B細胞癌；和淋巴瘤，一類起源于淋巴系統(tǒng)的癌。淋巴瘤可以進一步分為幾類；其中一類是非霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤，后者又構(gòu)成一類多樣化的癌。三大類的這些淋巴瘤依照用于腫瘤分類的the International Working Formulation被確定為低級、中級和高級，它們在其可治愈性和攻擊性方面有所不同(Cheson等，“Report of an International Workshop to Standardize Response Criteriafor Non-Hodgkin’s Lymphomas，”J.Clin Oncol.17(4)1244，1999)?？偟膩碇v，在美國這些淋巴瘤總起來說在癌癥發(fā)生率和死亡率方面排第五，每年診斷出大約50,000個新病例。
在最近檢查高級非霍奇金淋巴瘤(NHL)的51個病例分離物的一項研究中，表明43個分離物來源于B細胞，而8個分離物顯示了來源于T細胞(Brown等，Histopathology 14621-27，1989)。因此，特異性針對病理B細胞的治療在非霍奇金淋巴瘤和骨髓瘤治療方面可能是有價值的。
最初在開發(fā)針對由惡性B細胞獨特產(chǎn)生的抗原的、基于免疫學(xué)的療法領(lǐng)域的嘗試，涉及工作量大的直接從病理B細胞中分離和純化獨特型(Id)蛋白。這種純化的蛋白首先被用于治療所述相關(guān)淋巴瘤的模型系統(tǒng)中。證明了這種針對分離蛋白上獨特型決定簇的主動免疫，在小鼠模型系統(tǒng)中可以產(chǎn)對腫瘤生長的抗性(Daley等，J.Immunol.120(5)1620-24，1978；Sakato等，Microbiol.Immunol.23(9)927-31，1979)。這種抗腫瘤生長的現(xiàn)象后來在許多其它實驗?zāi)[瘤模型中得到重現(xiàn)(Stevenson等，J.Immunol.130(2)970-03，1983；George等，J.Immunol.141(6)2168-74，1988；Kwak等，Blood76(11)2411-17，1990)。
在將這種理念和技術(shù)帶進臨床的最初的嘗試中，工作量非常大，并且利用針對在活組織檢查后從患者的單個淋巴瘤中分離的蛋白產(chǎn)生的小鼠單克隆抗體。Meeker及其同事產(chǎn)生了小鼠抗獨特型單克隆抗體，用于治療其中大多數(shù)已經(jīng)經(jīng)歷了常規(guī)的淋巴瘤治療的11位患者(Meeker等，Blood651349-63，1985)。在大約一半的患者中獲得陽性結(jié)果，其中一個病例明顯緩解。然而，在某些患者中，所述淋巴瘤細胞通過轉(zhuǎn)換細胞表面表達的抗體的類別而產(chǎn)生對所述抗體的抗性(Meeker等，N Engl J Med.3121658-65，1985)。
B細胞淋巴瘤克隆產(chǎn)生對抗獨特型抗體的抗性的另一種途徑，是通過CDR2區(qū)中的體細胞突變(Cleary等，Cell 4497-106，1986)，從而避免被識別。盡管這種被動免疫療法的優(yōu)點是它僅需要從患者體內(nèi)分離和純化相對少量的獨特型蛋白，以供在小鼠中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但用針對獨特型的單克隆抗體治療淋巴瘤的實用性有限。然而，在缺乏堅定而方便的方法產(chǎn)生大量的獨特型蛋白時，這可能證明是利用免疫系統(tǒng)直接攻擊所述獨特型B細胞淋巴瘤的能力的唯一實用的方法。
Kwak等采取一種不同的方法，嘗試用從患者自身的獨特淋巴瘤純化的蛋白主動免疫所述患者，盡管在邏輯上需要分離大量的獨特型蛋白(Kwak等，N.Engl.J. Med.3271209-15，1992)。在化療后有很少疾病或無病的患者通過接種自體獨特型蛋白來治療。為了獲得足量的獨特型蛋白進行接種，將通過活檢獲得的淋巴瘤細胞與已建立的細胞系融合，以促進它們在組織培養(yǎng)物中生長，然后通過色譜純化所述分泌的獨特型蛋白。由于需要極大的工作量、技術(shù)障礙和過高的費用，阻礙了這種免疫法的大規(guī)模應(yīng)用。另外，最近引起了對于與用哺乳動物細胞生產(chǎn)蛋白相關(guān)的病毒負載的關(guān)注。
在以下的論文中，Hsu等報道了上述利用接種與匙孔血藍蛋白(KLH)綴合的所述獨特型來治療B細胞淋巴瘤I/II期臨床試驗(Hsu等，Blood 893129-35，1997)。在標(biāo)準(zhǔn)化療后，給患有頑固性非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤的41位患者接種腫瘤特異性獨特型。依照Kwak等(1992)所述(參見上文)，通過色譜純化用患者的雜交瘤產(chǎn)生的蛋白，獲得所述腫瘤特異性獨特型抗原。因此，這些蛋白由得自患者淋巴瘤的患者自身免疫球蛋白的完整可變區(qū)和恒定區(qū)構(gòu)成。結(jié)果顯示，抗獨特型應(yīng)答的產(chǎn)生與改善的臨床結(jié)果相關(guān)。與沒有建立免疫應(yīng)答的那些患者相比，建立抗獨特型細胞免疫應(yīng)答的所有患者的無疾病發(fā)展的持續(xù)時間和總體存活時間顯著延長。這項研究證明，B細胞淋巴瘤患者可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生針對腫瘤獨特型(Id)蛋白的特異性免疫應(yīng)答。此外，產(chǎn)生抗獨特型免疫應(yīng)答的能力與更加有利的臨床結(jié)果相關(guān)。然而，為了治療每位患者，必需將通過活檢獲得的淋巴瘤細胞與已建立的細胞系融合，以便允許生產(chǎn)足夠的蛋白來接種一位典型的患者。這種方法對于商業(yè)規(guī)模的應(yīng)用而言可能是困難的，或者是不切實際的。
最近，Bendandi等證明在濾泡性淋巴瘤患者中患者特異性獨特型接種誘發(fā)的緩解(Bendandi等，Nat.Med. 51171-77，1999)。在標(biāo)準(zhǔn)化療后，表現(xiàn)出完全臨床緩解的20位患者用患者特異性獨特型蛋白以及粒細胞-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF；參見下文)接種。在化療之前、臨床緩解時和接種治療之后，進行這種淋巴瘤特征性轉(zhuǎn)移的分子分析。發(fā)現(xiàn)在化療誘導(dǎo)的緩解后可檢測轉(zhuǎn)移的11位患者中的8位，在這一接種后經(jīng)歷完全的分子緩解。在20位患者中的19位中，發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性細胞毒性CD8+和CD4+T細胞。也檢測出腫瘤特異性抗體，但發(fā)現(xiàn)不是緩解所需的。再者，這項研究使用由發(fā)現(xiàn)與患者淋巴瘤相關(guān)并且通過異種雜交瘤融合產(chǎn)生的免疫球蛋白的完整可變區(qū)和恒定區(qū)構(gòu)成的獨特型蛋白。
因此，將免疫應(yīng)答靶向獨特型的細胞是一種有前景的方法，但是上述技術(shù)由于要求生產(chǎn)足量的得自每位患者淋巴瘤細胞的獨特型蛋白而受到限制。
針對B細胞腫瘤的抗獨特型免疫的概念也已經(jīng)應(yīng)用于多發(fā)性骨髓瘤的病例。Kwak及其同事報道了關(guān)于通過用從患者分離的骨髓瘤IgG預(yù)免疫供者，增強同種骨髓移植物的特異性功效方面的應(yīng)用結(jié)果(Kwak等，Lancet 345(8956)1016-20，1995)。此外，Massaia及其同事為高劑量化療后緩解的患者進行了接種，然后進行外周血干細胞移植(Massaia等，Blood 94673-83，1999)。
以上在Bendandi等的研究中所使用的粒細胞-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種造血生長因子，它刺激造血祖細胞增殖和分化。這種細胞因子通過增加T細胞增殖(Santoli等，J.Immunol.141(2)519-26，1988)、增加粒細胞和單核細胞上粘著分子的表達(Young等，J.Immunol.145(2)607-15，1990；Grabstein等，Science 232(4749)506-08，1986)以及增加抗原呈遞(Morrissey等，J.Immunol.139(4)1113-9，1987；Heufler等，J.Exp.Med.167(2)700-05，1988；Smith等，J.Immunol.144(5)1777-82，1990)，也在使細胞免疫定型方面起作用。
已經(jīng)表明，經(jīng)過遺傳工程改造以產(chǎn)生GM-CSF的基于細胞的疫苗在臨床前模型中誘導(dǎo)能夠消除系統(tǒng)性淋巴瘤的細胞免疫應(yīng)答。這一效應(yīng)僅通過激活免疫系統(tǒng)的細胞分支來介導(dǎo)(Levitsky等，J.Immuno.156(10)3858-65，1996)。同樣，已經(jīng)表明低劑量的游離GM-CSF增強由獨特型蛋白-KLH免疫誘發(fā)的保護性抗腫瘤免疫，因為它能夠通過對CD8細胞的作用而增強免疫(Kwak等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(20)10972-77，1996)。在一項研究中，表明GM-CSF在模型系統(tǒng)中測試的免疫調(diào)節(jié)劑中是產(chǎn)生抗腫瘤免疫的最佳免疫調(diào)節(jié)劑(Dranoff，G.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(8)3539-43，1993.)。
GM-CSF也已經(jīng)用作在模型系統(tǒng)中用來產(chǎn)生免疫應(yīng)答的嵌合蛋白的一部分。Chen和Levy(Chen和Levy，J.Immunol.154(7)3105-17，1995；美國專利第6,099,846號)對用嵌合蛋白生產(chǎn)小鼠單克隆抗體進行了研究，所述嵌合蛋白含有GM-CSF的一部分加上感興趣抗原的一部分(即得自鼠B細胞腫瘤38C13的獨特型區(qū))，這兩個部分都與人免疫球蛋白鏈的部分融合。Chen及其同事也研究了其中所述GM-CSF部分被IL-2或IL-4的部分取代的融合蛋白(Chen等，J.Immunol.153(10)4775-87，1994)。關(guān)于需要包括所述GM-CSF部分(或白介素部分)的一種解釋是增強了哺乳動物細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)的低水平嵌合蛋白的效應(yīng)。然而，尚未證明應(yīng)用與嵌合蛋白共同給予的純化GM-CSF可增強疫苗接種的免疫應(yīng)答。
隨著重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)，現(xiàn)在可以利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，從雜交瘤或者從組合文庫中克隆重鏈和輕鏈cDNA分子。這種重組DNA技術(shù)使研究人員可以控制效應(yīng)子功能或所選單克隆抗體的結(jié)合功能。另外，通過克隆大量的VL和VH基因，將其隨機分類，產(chǎn)生具有不同結(jié)合特異性的文庫，使其在大腸桿菌中表達，然后篩選所述隨機文庫中具有所需結(jié)合親和性的克隆，可以產(chǎn)生免疫球蛋白的組合文庫(Huse等，Science 246(4935)1275-81，1989)。應(yīng)用這種重組方法，從在大腸桿菌中表達的隨機組合文庫中克隆了對破傷風(fēng)類毒素具有高親和性和特異性的人抗體(Mullinax等，Proc.Natl.Acad.Sci.87(20)8095-99，1990)。用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和特異性引物，將所述免疫球蛋白基因從活化B細胞克隆到噬菌體載體中。將H鏈和L鏈隨機組合，然后在大腸桿菌中共表達，構(gòu)成一個有107成員的文庫。用125I-破傷風(fēng)類毒素篩選這種組合文庫，0.2％的克隆表現(xiàn)出結(jié)合活性(Mullinax等，參見上文)。另外，用相似的方法也鑒定出鼠單克隆抗體(Huse等，參見上文；Caton等，Proc.Natl.Acad.Sci.87(16)6450-54，1990)。Winter及其同事用質(zhì)粒載體通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)克隆了多個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，以供在細菌中表達用(Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.86(10)3833-37，1989)。
新開發(fā)的大腸桿菌抗體克隆系統(tǒng)對于鑒定編碼所需結(jié)合特異性的基因是非常有用的。然而，用大腸桿菌生產(chǎn)的抗體一般不可用于治療應(yīng)用。通常，在細菌中僅可以以分泌型產(chǎn)物生產(chǎn)抗體的抗原結(jié)合片段-Fab或Fv。在用大腸桿菌生產(chǎn)完整鏈的四聚體IgG時，在極少情況下，CH2結(jié)構(gòu)域不被糖基化。非糖基化抗體缺乏抗體引導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)和補體激活的溶細胞活性，而這些使被動免疫治療如此有功效。哺乳動物表達系統(tǒng)產(chǎn)生糖基化抗體，因此繞過細菌系統(tǒng)的這種限制。然而，最近FDA CBER部門的“Points to Consider”的修改明確地表明他們對與用哺乳動物細胞生產(chǎn)的單克隆抗體相關(guān)的病毒負載的擔(dān)心。此外，預(yù)期用哺乳動物表達系統(tǒng)生產(chǎn)的任何工程抗體都將是相當(dāng)昂貴的(每劑$1500-$5000)。因而非常需要繞過當(dāng)前哺乳動物系統(tǒng)和細菌系統(tǒng)所遇到的難題的替代的表達系統(tǒng)。
桿狀病毒表達系統(tǒng)是用大腸桿菌和哺乳動物細胞生產(chǎn)抗體的一種有吸引力的替代方法。用桿狀病毒系統(tǒng)表達重組蛋白在過去數(shù)年中已經(jīng)得到證明，并且已經(jīng)作為在真核細胞中高產(chǎn)地生產(chǎn)(1-100mg/L)生物活性蛋白的良好選擇。桿狀病毒/昆蟲細胞系統(tǒng)也繞過了當(dāng)重組蛋白在原核生物中過量表達時通常遇到的溶解性問題。另外，昆蟲細胞含有在原核生物中不存在的負責(zé)正確折疊、二硫鍵形成、糖基化、β-羥基化、脂肪酸?；愇煜┗?、磷酸化和酰胺化的真核翻譯后修飾機器。最近證明了用桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)識別人結(jié)腸直腸癌細胞的功能性糖基化單克隆抗體(Nesbit，J.Immunol.Methods 151201-208，1992)。另外，在桿狀病毒細胞中也證明了重組IgA的表達，這種IgA被正確裝配為重鏈/輕鏈異二聚體，被N-糖基化并且是分泌型的(Carayannopoulos等，Proc.Natl.Acad.Sci.918348-52，1994，PCT公布號WO98/30577，美國專利第6,063,905號)。然而，尚未證明應(yīng)用桿狀病毒表達用作免疫治療藥來改變B細胞病理(例如B細胞惡性腫瘤和自身免疫病)的嵌合獨特型蛋白。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種改變患者的B細胞介導(dǎo)病理的方法。該方法包括給予一種含有至少一種嵌合蛋白的組合物，所述嵌合蛋白具有免疫球蛋白可變區(qū)VH或VL區(qū)的至少一部分和免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在該組合物中使用的VH或VL區(qū)與來自具有B細胞介導(dǎo)病理的患者的B細胞所產(chǎn)生的特定免疫球蛋白相關(guān)。在將這樣的組合物給予患者后，該患者的B細胞介導(dǎo)病理得到改變。
本發(fā)明也提供通過給予含有兩種不同嵌合蛋白的組合物來改變患者的B細胞介導(dǎo)病理的方法。每種嵌合蛋白具有與免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分連接的免疫球蛋白鏈VH和/或VL區(qū)的至少一部分。作為所述嵌合蛋白部分的VH和/或VL區(qū)與來自具有B細胞介導(dǎo)病理的患者的B細胞的特定免疫球蛋白相關(guān)。
含有患者來源的特有VH和/或VL鏈的特異性免疫球蛋白鏈可以被開發(fā)成為治療組合物。它們對于患有各種各樣的B細胞惡性腫瘤或自身免疫病的患者將具有治療價值。在可以治療的主要類型的癌癥中有白血病、骨髓瘤和淋巴瘤；在所述淋巴瘤中有非霍奇金淋巴瘤。作為本發(fā)明治療價值的一個實例，已經(jīng)用來源于B細胞淋巴瘤的抗原治療患者。
可以用可疑的自身抗原來親和純化參與自身免疫病的B細胞，所述自身免疫病例如多發(fā)性硬化(MS)(Warren和Catz，Mult.Scler.6(5)300-11，2000)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)(Zhang，J.等，J.Immunol.166(1)6-10，2001；Odendahl，M.等，J.Immunol.165(10)5970-79，2000)、抗Hu相關(guān)性副腫瘤性神經(jīng)病綜合征(Rauer，S.和Kaiser，R.，J.Neuroimmunol.111(1-2)241-44，2000)；和自身免疫性肝炎(AIH)(Ogawa，S.等，J.Gastroenterol.Hepatol(1)69-75，2000)?？赡苌婕癇細胞的其它自身免疫病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、重癥肌無力(MG)、自身免疫性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)、自身免疫性眼色素層視網(wǎng)膜炎(uveoretinitis)、多肌炎、硬皮病和某些類型的糖尿病。在純化少量致病性B細胞后，可以采用本發(fā)明中所述方法，通過PCR克隆由這些細胞表達的免疫球蛋白的可變區(qū)部分。一旦克隆出所述部分，則可以用具體參與所述B細胞病理的免疫球蛋白鏈的VH和/或VL部分，來制備可以在本文所述的桿狀病毒系統(tǒng)中表達的嵌合蛋白。
用于上述組合物和嵌合蛋白中的免疫球蛋白恒定區(qū)可以來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重鏈以及κ或λ輕鏈或其部分。在某些實施方案中，所述嵌合蛋白僅含有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域VH和/或VL區(qū)中的任一個和免疫球蛋白恒定區(qū)。嵌合蛋白的實例包括VH-IgGγ1、VL-κ和VL-λ。在另一實施方案中，所述組合物含有兩種嵌合蛋白，每種嵌合蛋白分別含有一個VH和VL區(qū)與一個免疫球蛋白恒定區(qū)。實例包括VH-IgGγ1和VL-κ、以及VH-IgGγ1和VL-λ。
本發(fā)明也提供一種用重組DNA技術(shù)和一種表達系統(tǒng)生產(chǎn)嵌合蛋白的方法。該方法包括以下步驟(a)從具有B細胞介導(dǎo)病理的患者的B細胞中分離出編碼免疫球蛋白鏈的VH或VL區(qū)的基因，(b)將編碼所述免疫球蛋白鏈VH或VL區(qū)的所述分離的基因和編碼所述免疫球蛋白恒定區(qū)的基因插入到表達載體中，以允許嵌合蛋白表達，(c)通過將所述表達載體導(dǎo)入昆蟲細胞系中并讓其表達，生產(chǎn)所述嵌合蛋白，并且(d)分離所述嵌合蛋白。所述生產(chǎn)嵌合蛋白的方法還包括下述步驟將編碼免疫球蛋白鏈VH和/或VL區(qū)中任一個的基因和編碼第二種免疫球蛋白恒定區(qū)的基因插入到所述表達載體中，以允許所述第二種嵌合蛋白表達。
本發(fā)明還提供一種用于改變患者的B細胞介導(dǎo)病理的組合物。該組合物含有至少一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白具有免疫球蛋白鏈VH和/或VL區(qū)的至少一部分和免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在優(yōu)選實施方案中，所述嵌合蛋白可以包含免疫球蛋白鏈VH區(qū)的至少一部分和免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。作為所述嵌合蛋白部分的VH或VL區(qū)與來自具有B細胞介導(dǎo)病理的患者的B細胞的特定免疫球蛋白鏈相關(guān)。所述組合物還含有第二種嵌合蛋白，所述第二種嵌合蛋白具有免疫球蛋白鏈VH和/或VL區(qū)的至少一部分和第二種免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在其它優(yōu)選實施方案中，所述第二種嵌合蛋白可以包含免疫球蛋白鏈VH或VL區(qū)的至少一部分和免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。作為所述嵌合蛋白部分的VH或VL區(qū)與來自具有B細胞介導(dǎo)病理的患者的B細胞的特定免疫球蛋白鏈相關(guān)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述組合物包含兩種嵌合蛋白。所述第一種嵌合蛋白包含完整的VH區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)IgGγ1(VH-IgGγ1)，而第二種嵌合包含完整的VL和人κ或λ恒定區(qū)(VL-Cκ或VL-Cλ)。在其它優(yōu)選實施方案中，所述嵌合蛋白中的任一種或兩種可以包含免疫球蛋白鏈VH和/或VL區(qū)的至少一部分、加上一個接頭區(qū)和免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述組合物含有一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白含有來自患者B細胞特定免疫球蛋白鏈的VH和/或VL區(qū)中的任一個和免疫球蛋白恒定區(qū)。實例包括嵌合蛋白VH-IgGγ1、VL-κ、VL-λ、VL-IgGγ1、VH-κ和VH-λ。
在本發(fā)明的一個實施方案中，用來表達所述嵌合蛋白的表達載體是一種桿狀病毒載體。所述載體最好含有兩個表達盒，每個表達盒分別具有啟動子、分泌信號序列和嵌合蛋白。一個表達盒含有與蜜蜂蜂毒肽分泌信號序列連接的桿狀病毒AcNPVp10啟動子。另一表達盒具有與人胎盤堿性磷酸酶分泌信號序列連接的多角體蛋白啟動子。除所列的啟動子和信號序列之外，還可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它啟動子和信號序列。在某些優(yōu)選實施方案中，所述信號序列是與從患者分離的VH和VL基因相關(guān)的內(nèi)源信號序列、或參與抗體產(chǎn)生的其它信號序列。將編碼所述免疫球蛋白鏈VH或VL部分的基因和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的基因分別地和/或一起插入到所述桿狀病毒載體的上述表達盒中，讓一種或兩種嵌合蛋白表達。在一個優(yōu)選實施方案中，免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)例如IgGγ1與或者VH區(qū)或者VL區(qū)一起，由多角體蛋白啟動子來控制。
所產(chǎn)生的嵌合蛋白用具有抗免疫球蛋白的抗體或Ig結(jié)合蛋白和/或與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的任何其它蛋白的親和柱來純化，所述Ig結(jié)合蛋白例如用于免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的A蛋白和用于κ輕鏈的L蛋白。
本發(fā)明也考慮了將所述嵌合蛋白與載體蛋白例如匙孔血藍蛋白(KLH)共價偶聯(lián)。本發(fā)明的組合物也可以與細胞因子例如粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)或趨化因子例如單核細胞趨化蛋白3(MCP3)一起給予患者。因為含有嵌合蛋白的本發(fā)明組合物與來自具有B細胞介導(dǎo)病理的患者B細胞的特定免疫球蛋白特異性相關(guān)，所以給予這種組合物誘發(fā)針對涉及特定VH或VL區(qū)段的疾病特異性獨特型的免疫應(yīng)答。同樣，針對涉及使用免疫球蛋白V區(qū)區(qū)段(例如VH或VL區(qū)段)有限組成部分的B細胞的自身免疫病相關(guān)B細胞的應(yīng)答，可以誘導(dǎo)治療結(jié)果。因此，給予本發(fā)明組合物改變患者的B細胞介導(dǎo)病理和/或自身免疫病。本發(fā)明組合物的給藥途徑包括但不限于口服給藥、吸入給藥、注射給藥、經(jīng)皮給藥等。
本文提及的所有美國專利和申請；外國專利和申請；科學(xué)論文；書籍；和出版物，包括任何附圖和圖表，都通過引用全部結(jié)合到本文中，如同全文敘述一樣。
附圖簡述

圖1用于生產(chǎn)組合物的總流程，所述組合物包含來自具有B細胞介導(dǎo)病理的患者B細胞的特定免疫球蛋白VH或VL區(qū)的嵌合蛋白。
圖2具有多克隆位點的桿狀病毒表達載體p2Bac的質(zhì)粒圖譜。
圖3桿狀病毒表達載體p2Bac的DNA序列(SEQ ID NO5)。該序列從5’至3’描述。p2Bac載體含有AcNPV多角體蛋白基因啟動子(GenBank登記號X06637的核苷酸1-120(SEQ ID NO92))和AcMNPVp10啟動子(GenBank登記號A28889的核苷酸8-237(SEQ ID NO93))。
圖4質(zhì)粒pTRABac/9F12的DNA序列。該質(zhì)粒含有由穩(wěn)定的人細胞系9F12表達的重鏈和輕鏈(κ)的基因。該細胞系產(chǎn)生對破傷風(fēng)類毒素特異性的人IgG1/κ抗體(SEQ ID NO89)。下劃線區(qū)分別代表編碼成熟9F12 IgG1(TTTACCC....)和κ(ATCGACA...)鏈的序列。該序列從5’至3’描述。
圖5a具有IgGγ1恒定區(qū)的重組桿狀病毒表達載體pTRABacHuLCκHCγ1的質(zhì)粒圖譜。
圖5b具有IgGγ1恒定區(qū)的重組桿狀病毒表達載體pTRABacHuLCλHCγ1的質(zhì)粒圖譜。
圖6ApTRABacHuLCκHCγ1的DNA序列(SEQ ID NO6)。該序列從5’至3’描述。
圖6BpTRABacHuLCλHCγ1的DNA序列(SEQ ID NO7)。該序列從5’至3’描述。
圖6C利用κstuff引物修飾后的pTRABacHuLCκHCγ1的DNA序列(SEQ ID NO90)。該序列從5’至3’描述。
圖6D利用λstuff引物修飾后的pTRABacHuLCλHCγ1的DNA序列(SEQ ID NO91)。該序列從5’至3’描述。
優(yōu)選實施方案的詳細描述誘發(fā)將識別并消除腫瘤細胞同時不損傷正常組織的免疫應(yīng)答的可能性，代表一種令人興奮的治療癌癥的方法。通過鑒定特有的腫瘤抗原，有助于誘發(fā)這樣的免疫應(yīng)答。B細胞惡性腫瘤在其表面上表達一種特有的抗原-免疫球蛋白獨特型(Id)。這種抗原含有來自免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)(VH和VL)的蛋白序列。每種B細胞帶有一種用于產(chǎn)生所述免疫球蛋白獨特型的特有遺傳序列。因此，因為大多數(shù)B細胞惡性腫瘤來自一個B細胞的克隆擴充，所以構(gòu)成一種B細胞惡性腫瘤的所有細胞都表達一種特有的Id蛋白。因而，獨特型蛋白應(yīng)該用作任何B細胞惡性腫瘤(例如淋巴瘤或白血病)的基于免疫的治療的理想的靶。被動免疫治療早期的免疫治療策略集中于應(yīng)用抗腫瘤特異性獨特型的單克隆抗體(抗Id MoAb)。這種方法在一些非霍奇金淋巴瘤患者中引起腫瘤消退和長期持續(xù)的緩解。然而，許多患者經(jīng)歷了最終復(fù)發(fā)(Miller等，N.Engl.J.Med.306(9)517-22，1982；Maloney等，Blood 80(6)1502-10，1992；Brown等，Blood 73(3)651-61，1989；Brown等，Semin.Oncol.16(3)199-210，1989；Meeker等，Blood 65(6)1349-63，1985。
在上述研究中出現(xiàn)的一個難題是惡性B細胞或T細胞淋巴瘤的細胞可能改變其獨特型免疫球蛋白或T細胞受體的表達。在以上所列的幾篇論文中描述了這一問題的兩個例子(Cleary等，1986，和Meeker等，1985)。此外表明T細胞白血病細胞可能通過減少其表面T細胞受體的表達而逃避抗獨特型抗體(Maecker等，J.Immunol.1412994-3002，1985)，就B細胞白血病而言這在動模模型中得到了證實(Stevenson等，J.Immunol.130(2)970-3，l983)。其它研究證明，甚至在特定的人B細胞淋巴瘤中也有獨特型的變異(Berinstein等，J.Immunol.144(2)752-8，1990；Levy S等，J.Exp.Med.168(2)475-89，1988；)。這類突變看來造成在規(guī)定時間內(nèi)所述抗Id MoAb的效力降低(Berinstein等，參見上文；Tao等，Nature 362(6422)755-8，1993；Chen等，J.Immunol.153(10)4775-87，1994)。
避開這一問題的一種途徑是通過產(chǎn)生并應(yīng)用抗所述獨特型蛋白的多克隆抗血清。Caspar及其同事在小鼠模型系統(tǒng)中研究了基于多克隆抗體的治療的潛力(Caspar等，Blood 903699-706，1997)。這些作者用得自在成功的單克隆抗體治療后復(fù)發(fā)的非霍奇金白血病患者的獨特型蛋白接種小鼠。所產(chǎn)生的多克隆抗體識別來自原始腫瘤以及所有變異體的獨特型蛋白。因此，產(chǎn)生對一種B細胞淋巴瘤或白血病獨特型特異性的多克隆抗體應(yīng)答，可能代表對單克隆抗體治療的改進。產(chǎn)生足量的蛋白以供接種來產(chǎn)生多克隆抗體，是這一方法的相當(dāng)大的負擔(dān)。主動免疫治療主動免疫治療可以避免用被動免疫策略觀察到的突變逃避現(xiàn)象。這種治療具有產(chǎn)生更廣譜免疫應(yīng)答并且因此識別可以在一定時間內(nèi)出現(xiàn)的不均一腫瘤細胞群體的潛力。主動免疫治療的困難在于使患者的免疫系統(tǒng)覺悟，以便與所述腫瘤所表達的、感知的“自身抗原”反應(yīng)。正如獨特型蛋白的情況一樣，腫瘤所表達的許多抗原是弱免疫原。
在本發(fā)明中，改變了免疫系統(tǒng)的獨特特異性，來治療B細胞惡性腫瘤。在本發(fā)明中，用來源于免疫球蛋白輕鏈和重鏈每個獨特亞家族5’端的引物和恒定區(qū)引物，克隆了編碼獨特型免疫球蛋白可變區(qū)的DNA序列。通常，這種方法采用幾種合適的克隆技術(shù)之一，例如PCR。作為產(chǎn)生包含可變區(qū)和恒定區(qū)的嵌合蛋白的第一步，可以用這些恒定區(qū)引物并結(jié)合一種VH區(qū)的引物和一種VL區(qū)的引物，克隆所述可變區(qū)。另一方面，可以使用例如5’RACE的技術(shù)。就下文所述的一位患者而言，用5’RACE克隆免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區(qū)，以便產(chǎn)生嵌合蛋白。嵌合蛋白的實例包括VL/Cκ、VL/Cλ、VL/IgGγ1、VH/IgGγ1、VH/Cκ和VH/Cλ。這些嵌合蛋白用桿狀病毒載體在昆蟲細胞中生產(chǎn)。所述嵌合蛋白因此包含來自患者免疫球蛋白分子的可變區(qū)的一個部分，并且也包含來自非所述患者的來源的恒定區(qū)的一個部分。在優(yōu)選實施方案中，所述重鏈和輕鏈恒定區(qū)來源于9F12細胞。然而，可以使用免疫球蛋白恒定區(qū)基因的其它來源。預(yù)測這些嵌合蛋白在生產(chǎn)獨特型蛋白方面比使用現(xiàn)有系統(tǒng)更為有效地進行生產(chǎn)，將是可供用于疫苗接種方案用的良好的免疫原。
本發(fā)明滿足了對B細胞介導(dǎo)病理和自身免疫病的有效療法的迫切要求。本發(fā)明利用參與B細胞病理的B細胞表面存在的特有細胞表面抗原，并且以患者特異性方式進行制備。這類疫苗提供根據(jù)在特定患者中發(fā)現(xiàn)的致病性B細胞所特有的標(biāo)記而定制的敏銳的選擇性。
所述新型桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)已經(jīng)證明對于從任何給定患者有效生產(chǎn)供免疫治療用的功能性抗體是有效的。設(shè)計這種桿狀病毒表達載體，使得僅需要兩種定制的基因特異性引物來擴增任何一對抗體可變區(qū)，以便容易地亞克隆并作為人κ輕鏈和IgGγ1重鏈表達。加入將重鏈和輕鏈引向分泌途徑的異源分泌信號序列，以便從昆蟲細胞表達大量活性免疫球蛋白。這種載體應(yīng)該可用于表達與人κ恒定區(qū)符合讀框并且通過人胎盤堿性磷酸酶分泌信號序列分泌的任何κ輕鏈可變區(qū)(VL)；和與人IgGγ1恒定區(qū)符合讀框并且由蜜蜂蜂毒肽分泌信號序列引導(dǎo)的任何重鏈可變區(qū)(VH)。在其它系統(tǒng)中，用λ輕鏈恒定區(qū)取代κ恒定區(qū)。然后表達嵌合蛋白，所述嵌合蛋白具有與人λ恒定區(qū)符合讀框并且通過人胎盤堿性磷酸酶分泌信號序列分泌的VL區(qū)；和與人IgGγ1恒定區(qū)符合讀框并由蜜蜂蜂毒肽分泌信號序列引導(dǎo)的任何重鏈可變區(qū)(VH)。得自單克隆細胞系、或者通過噬菌體展示克隆鑒定的任何小鼠或人單克隆抗體，在兩個簡單的亞克隆步驟后，可以容易地作為完整人IgGγ1/κ或IgGγ1/λ在該載體中表達。另外，包括IgGγ2、IgGγ3、IgGγ4、IgA、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重鏈或其區(qū)段在內(nèi)的不同的免疫球蛋白類型，可以用來取代IgGγ1。此外，除上文所述的那些信號序列之外，本發(fā)明還可以使用其它分泌信號序列，例如與來源于特定患者的免疫球蛋白基因相連接的內(nèi)源分泌序列。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇若干可以同等用于該系統(tǒng)以產(chǎn)生同等結(jié)果的不同的引物，來擴增任何一對抗體可變區(qū)，以便于亞克隆。
在某些情況下，應(yīng)用所述桿狀病毒系統(tǒng)表達生物活性蛋白由于不能在不過度蛋白酶降解的情況下有效地溶解重組蛋白而受到阻礙。為了繞開在昆蟲細胞中表達重組蛋白所遇到的溶解性和蛋白水解的問題，開發(fā)了可供有效分泌生物活性蛋白的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體。通過將功能性分泌前導(dǎo)序列插入到多角體蛋白啟動子的下游，構(gòu)建了這些促進重組蛋白從宿主昆蟲細胞中分泌的載體。cDNA序列符合讀框的插入，導(dǎo)致合成含有將重組蛋白引向所述分泌途徑的異源信號序列的蛋白。測試了人和昆蟲的前導(dǎo)序列，以使得異源蛋白從昆蟲細胞的分泌最大化。證明人胎盤堿性磷酸酶信號序列(SEQ ID NO1MLGPCMLLLLLLLGLRLQLSLG；DNA序列為SEQ ID NO2ATGGTG GGA CCC TGC ATG CTG CTG CTG CTG CTG CTG CTA GGCCTG AGG CTA CAG CTC TCC CTG GGC)和蜜蜂蜂毒肽信號序列(SEQ ID NO3MKFLVNVALVFMVVYISYIYA；DNA序列為SEQ IDNO4ATG AAA TTC TTA GTC AAC GTT GCA CTA GTT TTT ATGGTC GTG TAC ATT TCT TAC ATC TAT GCG)對于許多細菌蛋白和人蛋白的分泌都是有效的(Mroczkowski等，J.Biol.Chem.26913522-28，1994和Tessier等，Gene 98177-83，1991)。
為了使本發(fā)明適合于特定的患者，首先需要鑒定和分離編碼所述特有抗原的基因，然后需要生產(chǎn)那些抗原的方法。這可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的多種不同方式來完成。例如，適合于本發(fā)明需要的一種新開發(fā)的方法，利用一種新型桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)，并且最近開發(fā)用于有效地生產(chǎn)供免疫治療用的功能性抗體(參見美國臨時申請順序號60/244,722，題為“Expression Vectors for Production ofRecombinant Immunoglobulin”)。
使用所述桿狀病毒系統(tǒng)表達重組蛋白，允許生產(chǎn)大量的生物活性蛋白，而沒有與在細菌中制備的蛋白相關(guān)的許多缺點，也避免了使用哺乳動物細胞的復(fù)雜情況。例如，穩(wěn)定的人細胞系9F12(ATCC#HB8177)產(chǎn)生對于破傷風(fēng)類毒素特異性的人IgG1/κ抗體，將得自該細胞系的免疫球蛋白基因克隆到桿狀病毒雙重啟動子表達轉(zhuǎn)移載體中。在昆蟲細胞中生產(chǎn)完整的IgG1/κ免疫球蛋白，該免疫球蛋白在SDS-PAGE分析和蛋白質(zhì)印跡中的表現(xiàn)類似于哺乳動物抗體。由昆蟲細胞生產(chǎn)的抗體是糖基化的。純化Mab9F12和桿狀病毒表達的純化抗體的結(jié)合親和性經(jīng)測定是相同的，測定生產(chǎn)水平大約為5-10μg/ml。
含有特定可變區(qū)的特異性表位的可溶性人免疫球蛋白片段，可以通過基因工程在昆蟲宿主細胞中生產(chǎn)。含有患者來源的特定VH和/或VL區(qū)的這些可溶性重組免疫球蛋白可以作為治療組合物使用。當(dāng)給予所述患者時，它將在體內(nèi)特異性地誘發(fā)細胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，以改變所述B細胞介導(dǎo)的病理。
這種技術(shù)也已經(jīng)應(yīng)用于快速鑒定和克隆由T細胞淋巴瘤表達的患者特異性Vα和Vβ基因，然后將這些基因作為重組κ/Vα或IgGγ1/Vβ分子在昆蟲細胞中表達(參見美國臨時申請順序號60/266,133，題為“Methodand Composition for Altering a T Cell Mediated Pathology”)。可以配制并使用以這種方法生產(chǎn)的分子以患者特異性方式誘發(fā)針對淋巴瘤的抗獨特型細胞介導(dǎo)的免疫。
術(shù)語“改變”是指本發(fā)明的化合物或組合物調(diào)節(jié)B細胞介導(dǎo)病理的能力。改變B細胞病理的化合物可以通過多種可能的機制做到這一點，包括產(chǎn)生針對所述化合物的抗體，所述抗體進而破壞所述B細胞病理的細胞，包括誘導(dǎo)參與所述病理的B細胞凋亡、抑制所述B細胞病理的細胞進一步生長和分裂、誘發(fā)針對所述B細胞病理的細胞的細胞介導(dǎo)免疫或者抑制病理性B細胞的活性。引起所述改變的實際機制尚有待確定，但是由于添加本發(fā)明的分子或組合物，通過某種機制發(fā)生所述B細胞介導(dǎo)病理的改變。
術(shù)語“B細胞介導(dǎo)病理”或“B細胞病理”是指由于B細胞的不當(dāng)復(fù)制或活性而引起的那些疾病和病癥。在優(yōu)選實施方案中，所述B細胞介導(dǎo)病理是由于B細胞的不當(dāng)復(fù)制引起的B細胞淋巴瘤。B細胞淋巴瘤用目前可利用的醫(yī)學(xué)方法難以有效地治療。涉及B細胞不當(dāng)復(fù)制的其它類型的B細胞病理包括慢性和急性B細胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤和某些非霍奇金淋巴瘤。其它優(yōu)選實施方案包括越來越多的被分類為自身免疫病的人類疾病，在自身免疫病中宿主自身的免疫系統(tǒng)攻擊宿主自身組織，例如多發(fā)性硬化(MS)(Warren和Catz，Mult.Scler.6(5)300-11，2000)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)(Zhang，J.等，J.Immunol.166(1)6-10，2001；Odendahl，M.等，J.Immunol.165(10)5970-79，2000)、抗Hu相關(guān)性副腫瘤性神經(jīng)病綜合征(Rauer，S.和Kaiser，R.，J.Neuroimmunol.111(1-2)241-44，2000)；自身免疫性肝炎(AIH)(Ogawa，S.等，J.Gastroenterol.Hepatol(1)69-75，2000)?？捎帽景l(fā)明治療的其它候選自身免疫病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、重癥肌無力(MG)、自身免疫性甲狀腺炎(橋本甲狀腺炎)、Graves病、炎性腸病、自身免疫性眼色素層視網(wǎng)膜炎、多肌炎、硬皮病和某些類型的糖尿病。本發(fā)明對于這些自身免疫病的治療不是治愈所述疾病，而是僅緩解癥狀。
術(shù)語“B細胞”是指生物體免疫系統(tǒng)中參與生物體正常功能中的體液免疫的細胞(即沒有經(jīng)歷B細胞介導(dǎo)病理的B細胞)。B細胞是從骨髓發(fā)育的白細胞，產(chǎn)生抗體；它們也被稱為B淋巴細胞。一般而言，B細胞是參與生物體中抗體產(chǎn)生的細胞。
術(shù)語“病理”是指被醫(yī)學(xué)會會員認(rèn)為異常的生物體(例如人類)的一種狀態(tài)。在本發(fā)明中被治療的病理的特征為B細胞功能異常。
術(shù)語“患者”是指需要治療病理、或更具體地講治療B細胞病理的生物體。該術(shù)語是指在臨床水平上表現(xiàn)出一種或多種特定癥狀、表明需要用治療藥治療的活的受治療者。所述治療可以或者被醫(yī)學(xué)會普遍接受，或者可能是實驗性的。在優(yōu)選實施方案中，所述患者是一種哺乳動物，包括諸如狗、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠和小鼠的動物。在其它優(yōu)選實施方案中，所述患者是人類?；颊叩脑\斷可能在疾病發(fā)展過程中自發(fā)改變，或者在治療方案或治療過程中改變。
“生物體”可以是單細胞生物體或者是多細胞生物體。該術(shù)語包括哺乳動物，最優(yōu)選是人類。優(yōu)選的生物體包括小鼠，因為治療或診斷小鼠的能力通常預(yù)示著在其它生物體例如人類中發(fā)揮作用的能力。其它優(yōu)選生物體包括靈長類，因為治療或診斷靈長類的能力通常預(yù)示著在其它生物體例如人類中發(fā)揮作用的能力。
術(shù)語“嵌合蛋白”是指包含含有來源于至少兩種不同蛋白的區(qū)段的單一多肽鏈的蛋白。嵌合蛋白的區(qū)段一定來源于異種蛋白，亦即嵌合多肽的所有區(qū)段不是來自同一種蛋白。本發(fā)明的嵌合蛋白包括含有免疫球蛋白鏈VH或VL區(qū)的部分、但不包含在所述VH或VL區(qū)所來源的B細胞克隆中發(fā)現(xiàn)的那些鏈完整C區(qū)的蛋白。此外，所述VH或VL區(qū)可以不包括完整的可變區(qū)，而是包括足以引起免疫應(yīng)答的部分。本發(fā)明的嵌合蛋白也可以包括其中天然存在的蛋白區(qū)段用等同的天然或非天然存在的區(qū)段取代的蛋白。這包括用來自不同來源的IgG1恒定區(qū)取代來源于患者的IgG1恒定區(qū)，還將包括其中用部分或完全人工制備的接頭、區(qū)段或結(jié)構(gòu)域取代所述蛋白的區(qū)段的免疫球蛋白恒定區(qū)。然而，在所有情況下，本發(fā)明的嵌合蛋白的基因都將與所述患者中天然存在的免疫球蛋白的基因不同。所述嵌合蛋白的基因由于下述原因之一可與天然存在的蛋白區(qū)別(1)它不是來自所述患者的全長免疫球蛋白基因或cDNA，(2)它將是與從患者中分離的亞型不同的亞型，或(3)編碼患者的IgG1恒定區(qū)的核酸序列將不同于在所述表達載體中所用的IgG1基因。
術(shù)語“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可互換使用。
術(shù)語“天然的”是指從自然界分離出的蛋白。因此，天然存在的蛋白可以指在自然界中發(fā)現(xiàn)的、尚未利用重組技術(shù)修飾的基因編碼的蛋白。天然蛋白可以指可能在自然界中存在或合成的蛋白。這些術(shù)語也適用于由生物系統(tǒng)(例如本發(fā)明的桿狀病毒系統(tǒng))或者由來源于患者的細胞培養(yǎng)物所生產(chǎn)的蛋白。另一方面，天然蛋白可以指未經(jīng)變性的分離的蛋白。術(shù)語“天然”也可以指單獨的或者與其它多肽結(jié)合的多肽或蛋白折疊、使得它類似自然界中存在的相似蛋白的方式，或者它在翻譯后經(jīng)修飾(“翻譯后修飾”)而使得它類似自然界中存在的相似蛋白的方式。天然存在的蛋白可能僅見于得自一位患者的病理B細胞，然而，這可以被認(rèn)為是天然存在的蛋白。
術(shù)語“區(qū)段”或“部分”用來指來源于所述嵌合蛋白所用蛋白的氨基酸序列、其長度小于其所來源的全長多肽的一種多肽。人們會理解，這類區(qū)段可能保留天然多肽的一個或多個特征性部分。這類保留的特征的實例包括與對天然多肽或其表位特異性的抗體結(jié)合。
術(shù)語“VH”和“VL”是指免疫球蛋白分子多肽鏈的可變區(qū)或者編碼這類多肽鏈的核酸的可變區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解這些術(shù)語的含義。可變區(qū)的實際序列不可預(yù)測，必須通過分離出所述序列來測定。在本發(fā)明中使用從特定患者分離的VH和VL區(qū)。κ輕鏈或λ輕鏈的實際序列通過輕鏈基因座的V區(qū)、J區(qū)和恒定區(qū)的克隆重排來測定。(κ和λ基因座是隔開的并且是不同的)。重鏈的實際序列通過重鏈基因座的V區(qū)、D區(qū)、J區(qū)和恒定區(qū)的克隆重排來測定?？勺儏^(qū)中的額外序列變異是由于重組方法過程中不精確引起的，也通過在重組方法結(jié)束之后的體細胞突變來產(chǎn)生。術(shù)語“VH”和“VL”也指VH和VL區(qū)的部分或區(qū)段。VH和VL區(qū)的區(qū)段也可以包括全部或基本上全部的所述V區(qū)。術(shù)語“基本上全部”是指完整可變區(qū)的大約90％，或者完整可變區(qū)的大約80％。存在的VH和VL區(qū)的部分必須足以使所述嵌合分子能夠在本發(fā)明中起作用。術(shù)語“VH”和“VL”也指如下所述的這類多肽區(qū)的功能衍生物。
術(shù)語“免疫球蛋白恒定區(qū)”是指免疫球蛋白分子中不由免疫球蛋白可變區(qū)編碼的所有部分或其一部分。術(shù)語“免疫球蛋白恒定區(qū)”也可以指編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA序列。免疫球蛋白恒定區(qū)包括區(qū)段CL、CH1、CH2、CH3和鉸鏈區(qū)。免疫球蛋白的類型包括IgGγ1、IgGγ2、IgGγ3、IgGγ4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE重鏈以及κ或λ輕鏈或者它們的區(qū)段。任何免疫球蛋白恒定區(qū)的區(qū)段都可以用于本發(fā)明中，條件是所述區(qū)段使得免疫球蛋白恒定區(qū)對于本發(fā)明的目的而言可以起作用，例如，允許通過與G蛋白、A蛋白、L蛋白或合適的抗體結(jié)合來親和純化所述嵌合分子。也可以使用如下所述的免疫球蛋白恒定區(qū)區(qū)段的功能衍生物。
術(shù)語“免疫球蛋白折疊”或“免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域”是指免疫球蛋白超家族的一種結(jié)構(gòu)元件。免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域是分別大約110個氨基酸的保守的重復(fù)結(jié)構(gòu)域。
免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域存在于許多蛋白分子中，包括抗體、T細胞抗原受體、細胞因子受體(例如具有5個Ig結(jié)構(gòu)域的血小板衍生生長因子受體)、細胞粘著分子(例如ICAM-1/CD54)和許多其它蛋白分子。在各種TCR中發(fā)現(xiàn)兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域；一個在可變區(qū)中，一個在恒定區(qū)中。在抗體輕鏈中發(fā)現(xiàn)兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，而在IgG重鏈中發(fā)現(xiàn)4個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明考慮了用來自一種不同分子(例如一種免疫球蛋白分子)的結(jié)構(gòu)域取代恒定區(qū)的一個或兩個結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生具有不同特性(例如與其它分子結(jié)合)的經(jīng)修飾(嵌合)的恒定區(qū)。
術(shù)語“IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE”是指人免疫球蛋白的類別和亞類。所述術(shù)語可以指所述蛋白的DNA序列或者氨基酸序列。免疫球蛋白分子的類別和亞類由其重鏈決定。IgG和IgD是不同類別的免疫球蛋白；IgG1和IgG2是不同亞類的免疫球蛋白分子。術(shù)語“IgA”可以指任何亞類的IgA分子。在優(yōu)選實施方案中，它是指IgA1分子。在其它優(yōu)選實施方案中，它是指IgA2分子。在某些實施方案中，所用的免疫球蛋白重鏈可以是含有來自第二種蛋白的氨基酸的嵌合蛋白。
術(shù)語“IgGγ1”是指與IgG1類免疫球蛋白相關(guān)的重鏈。IgG1代表大約66％的人IgG免疫球蛋白(Roitt等，Immunology，Mosby，St.Louis，第4.2頁，1993)。
術(shù)語“kappa恒定區(qū)”、“l(fā)amda恒定區(qū)”、“κ恒定區(qū)”和“λ恒定區(qū)”是指在免疫系統(tǒng)發(fā)育期間保持恒定的kappa(κ)和lambda(λ)輕鏈的恒定區(qū)。所述術(shù)語可以指所述蛋白的DNA序列或氨基酸序列。在某些實施方案中，免疫球蛋白輕鏈的部分可以包含在含有來自一種或多種其它蛋白的氨基酸的嵌合蛋白中。
術(shù)語“給予”涉及使化合物與生物體的細胞或組織接觸的方法。所述B細胞介導(dǎo)病理可以在所述生物體的細胞或組織存在于所述生物體內(nèi)或生物體外時得到預(yù)防或治療。存在于生物體之外的細胞可以在細胞培養(yǎng)皿中保持或生長。對于在生物體體內(nèi)含有的細胞，本領(lǐng)域中有許多技術(shù)可給予化合物，包括(但不限于)口服、胃腸外給藥、皮膚應(yīng)用、注射和氣霧劑應(yīng)用。
通過將本發(fā)明的化合物或者針對本發(fā)明化合物產(chǎn)生的抗體給予表現(xiàn)出病理特征的B細胞，也可以預(yù)防或治療B細胞介導(dǎo)病理。然后可以監(jiān)測給予化合物對生物體功能的效應(yīng)。所述生物體最好是小鼠、大鼠、兔、豚鼠或山羊，更優(yōu)選是猴或猿猴，最優(yōu)選是人類。
術(shù)語“組合物”是指含有感興趣蛋白的混合物。在優(yōu)選實施方案中，所述組合物可以含有額外的組分，例如佐劑、穩(wěn)定劑、賦形劑等。
涉及可變區(qū)與B細胞克隆相關(guān)時的術(shù)語“與…相關(guān)”，是指在由特定B細胞克隆所產(chǎn)生的免疫球蛋白上發(fā)現(xiàn)的可變區(qū)。
術(shù)語“B細胞克隆”是指單個B細胞的克隆后代。B細胞的克隆后代在所產(chǎn)生的抗體中表達與親代細胞相同的獨特型。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，一個B細胞的克隆后代可能經(jīng)歷了免疫球蛋白基因可變區(qū)內(nèi)的體細胞突變，但仍保留所述B細胞克隆的部分。
術(shù)語“分離”是指將天然存在的核酸序列從其正常細胞環(huán)境中取出。因此，所述序列可以在無細胞溶液中，或者被置于不同的細胞環(huán)境中。該術(shù)語不是暗示所述序列是存在的唯一核苷酸鏈，而是它基本上無(純度至少為大約90-95％)與其天然相連的非核苷酸物質(zhì)，因此不同于分離的染色體。此外，在提及核酸時利用術(shù)語“分離”是指特定的DNA或RNA序列在感興趣的溶液中存在的總DNA或RNA中所占的比率被增加至顯著高于(2-5倍)在從中取出所述序列的細胞中所占的比率。人們可以通過優(yōu)先降低所存在的其它DNA或RNA的量，或者通過優(yōu)先增加所述特定DNA或RNA序列的量，或者通過這兩種方法的組合，做到這一點。然而，應(yīng)該注意到，富集的不是暗示不存在其它DNA或RNA序列，而僅僅是感興趣序列的相對量被顯著增加了。術(shù)語“顯著的”用來指對于制造這種增加的人而言，增加的水平是有效的，一般是指相對于其它核酸而言增加至大約至少2倍，更優(yōu)選至少5-10倍或甚至更高。該術(shù)語也不是暗示沒有來自其它來源的DNA或RNA。來自其它來源的DNA可能例如包含來自酵母或細菌基因組的DNA，或者克隆載體例如pUC19。該術(shù)語不同于天然發(fā)生的事件，例如病毒感染或腫瘤型生長，在后兩者中，一種mRNA的水平可能相對于其它種類的mRNA被自然地增加。也就是說，該術(shù)語是指僅包括人類干涉從提高所需核酸比例的那些情況。
分離的DNA序列比自然環(huán)境中相對更純(該水平應(yīng)該至少2-5倍于天然水平，例如以mg/ml計)。通過PCR獲得的各種序列可以被純化至電泳均一性。通過這種PCR反應(yīng)獲得的DNA分子可以得自總DNA或者得自總RNA。這些DNA序列不是天然存在的，而是優(yōu)選通過對部分純化的天然存在的物質(zhì)(例如信使RNA(mRNA))的操作而獲得的。例如，從mRNA構(gòu)建cDNA文庫涉及構(gòu)建合成物質(zhì)(cDNA)，可以通過從攜帶所述cDNA文庫的細胞中克隆選擇，可以從所述合成文庫中分離出單個純cDNA克隆。包括從mRNA構(gòu)建cDNA文庫和分離不同的cDNA克隆的該方法，導(dǎo)致天然信息的大約106倍純化。因而，特別考慮了至少一個數(shù)量級、優(yōu)選兩個或三個數(shù)量級、更優(yōu)選四個或五個數(shù)量級的純化。
術(shù)語“編碼…的基因”是指編碼感興趣蛋白或多肽的核酸序列。所述核酸序列可以或者是DNA分子或者是RNA分子。在優(yōu)選實施方案中，所述分子是一種DNA分子。在其它優(yōu)選實施方案中，所述分子是一種RNA分子。當(dāng)作為RNA分子存在時，它將包括指導(dǎo)宿主細胞的核糖體開始翻譯(例如起始密碼子ATG)和指導(dǎo)核糖體結(jié)束翻譯(例如終止密碼子)的序列。在起始密碼子和終止密碼子之間是一個可讀框(ORF)。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉這些術(shù)語的含義。
術(shù)語“昆蟲細胞系”是指來源于昆蟲并且對桿狀病毒感染敏感的細胞系。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這類細胞系和利用所述細胞系所需的技術(shù)。昆蟲細胞系的代表性實例包括草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(sf9)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)(Hi-5)細胞系。
術(shù)語“粉紋夜蛾(High-5)細胞”和“草地貪夜蛾(sf9)細胞”是指與桿狀病毒表達載體結(jié)合使用的昆蟲細胞系。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些細胞系和獲得它們的方法。
術(shù)語“插入”是指通過利用限制性酶和連接酶對DNA序列進行操作，從而通過用合適的限制性酶消化這兩種分子產(chǎn)生匹配的突出端，然后用連接酶將所述分子連接在一起，可以將感興趣的DNA序列(通常編碼感興趣的基因)加入到另一種核酸分子中。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉這類操作，實例可以在Sambrook等(Sambrook，F(xiàn)ritsch，和Maniatis，″Molecular CloningA Laboratory Manual″，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，1989)中找到，所述文獻通過引用全部(包括任何附圖和圖表)結(jié)合到本文中。
術(shù)語“佐劑”是指當(dāng)人們試圖在動物體內(nèi)產(chǎn)生對所選抗原或免疫原(例如需要免疫應(yīng)答針對的蛋白或多肽)的免疫應(yīng)答時，與所選抗原或免疫原一起提供、以增強所述免疫應(yīng)答的物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉合適佐劑的選擇和使用。批準(zhǔn)用于人類的佐劑包括鋁鹽和MF59(Singh和O’Hagan，Nature Biotech 171075-81，1999)。其它佐劑正在開發(fā)之中(出處同上)，可以結(jié)合本發(fā)明使用。
術(shù)語“匙孔血藍蛋白”或“KLH”是指從匙孔(keyhole limpet)分離的、在免疫方法中通常用作載體蛋白的一種蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉術(shù)語匙孔血藍蛋白的含義。
術(shù)語“細胞因子”是指主要從白細胞中分泌的生長因子家族，通常是可溶性(糖)蛋白。細胞因子刺激體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答以及激活吞噬細胞。細胞因子不僅由免疫系統(tǒng)內(nèi)的各種細胞類型合成、貯存和轉(zhuǎn)運(淋巴因子、白介素、單核因子、腫瘤壞死因子、干擾素)，而且也由與血液學(xué)(集落刺激因子)、腫瘤學(xué)(轉(zhuǎn)化生長因子)和細胞生物學(xué)(肽類生長因子、熱激蛋白和其它應(yīng)激蛋白)研究相關(guān)的其它細胞合成、貯存和轉(zhuǎn)運。
從淋巴細胞分泌的細胞因子被稱為淋巴因子，而由單核細胞或巨噬細胞分泌的細胞因子被稱為單核因子。許多淋巴因子也被稱為白介素(IL)，因為它們不僅由白細胞分泌，而且它們也能夠影響白細胞的細胞應(yīng)答。具體地說，白介素是靶向造血來源細胞的生長因子。
術(shù)語“生長因子”是指結(jié)合細胞表面上的受體并且隨后激活細胞增殖和/或分化的蛋白質(zhì)。許多生長因子是相當(dāng)通用的，可以用來刺激各種各樣細胞類型進行細胞分裂，而其它生長因子對特定的細胞類型是特異性的。
術(shù)語“趨化因子”是指一類小的促炎細胞因子，它們作為白細胞的化學(xué)引誘劑和激活物起作用，代表一個超過30種趨化細胞因子的超家族。它們使來自血液或骨髓的免疫系統(tǒng)細胞活化和遷移至感染部位和受傷組織協(xié)調(diào)進行(orchestrate)。趨化因子在骨髓中存在并且進而發(fā)育為成熟免疫細胞的原始干細胞的生長和增殖中也起重要作用。趨化因子參與各種各樣的急性和炎性疾病，并且通過與七跨膜螺旋類受體結(jié)合而發(fā)揮其作用。
趨化因子的分子量通常在8-11kDa之間變動，在1-100ng/ml的濃度范圍內(nèi)有活性，由各種各樣的細胞類型產(chǎn)生。趨化因子的產(chǎn)生通常由外源性刺激物和內(nèi)源性介質(zhì)例如IL-1、TNF-α和PDGF誘導(dǎo)。趨化因子與特定的細胞表面受體結(jié)合，可以被認(rèn)為是看來不如一級促炎細胞因子多效的二級細胞因子，因為它們不是其它細胞因子的有效誘導(dǎo)物，并且在炎癥和修復(fù)方面表現(xiàn)出更加?；墓δ?。
術(shù)語“粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子”或“GM-CSF”是指小的(小于20kDa)的分泌型蛋白。它與特定的細胞表面受體結(jié)合，起骨髓細胞的種特異性刺激物的作用。它刺激若干造血細胞譜系(包括樹突細胞、粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和紅細胞)的生長和分化。特別是，這種細胞因子也通過增加T細胞增殖(Santoli等，J.Immunol.141(2)519-26，1988)、增加粒細胞和單核細胞上粘著分子的表達(Young等，J.Immunol.145(2)607-15，1990；Grabstein等，Science 232(4749)506-08，1986)和增強抗原呈遞(Morrissey等，J.Immunol 139(4)1113-9，1986；Heufler等，J.Exp.Med.167(2)700-05，1988；Smith等，J.Immunol.144(5)1777-82，1990)，在使細胞免疫定型方面起作用。
術(shù)語“單核細胞趨化蛋白-3”或“MCP-3”是指一種主要由單核細胞產(chǎn)生的趨化因子。MCP-3具有廣譜的趨化活性，吸引單核細胞、樹突細胞、淋巴細胞、自然殺傷細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和嗜中性粒細胞。Minty等，Eur Cytokine Netw 4(2)99-110，1993以及Opdenakker等，Biochem Biophys Res Commun.，191(2)535-42，1993于1993年克隆了所述cDNA。最近Proost等，J.Leukoc Biol. 59(1)67-74，1996綜述了其特性。
術(shù)語“表達載體”是指一種設(shè)計用來在表達載體中正確插入所選感興趣基因時表達所述基因(通常為一種蛋白質(zhì))的重組DNA構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解該術(shù)語。表達載體通常在插入感興趣基因的位點的5’端包括一個啟動子，而在所述位點的3’端包括一個終止子區(qū)。通常，利用所選的限制性酶切位點將感興趣的基因插入適當(dāng)?shù)奈稽c。術(shù)語“表達載體”也指已經(jīng)插入了編碼感興趣產(chǎn)物的感興趣基因的諸如上述的DNA構(gòu)建體。
術(shù)語“桿狀病毒表達載體”是指在用于所述桿狀病毒系統(tǒng)時設(shè)計用來表達所選基因的DNA構(gòu)建體。設(shè)計在所述桿狀病毒系統(tǒng)中發(fā)揮作用的任何潛在的桿狀病毒或表達載體都可以用于本發(fā)明。同樣，術(shù)語“表達載體”是一類包括桿狀病毒表達載體具體實施方案的表達載體，但“表達載體”可以除了可以在昆蟲細胞系中起作用外，還可以在昆蟲細胞系之外的細胞和細胞系中起作用。
術(shù)語“允許…表達”是指將表達載體置于所述感興趣基因?qū)⒃谄渲斜磉_的環(huán)境中。這通常是指將所述表達載體插入到合適的細胞類型中，其中宿主細胞組分將識別所述啟動子和基因表達所必需的其它區(qū)，并且將引起感興趣基因的表達。所述表達通常包括兩個步驟轉(zhuǎn)錄和翻譯。表達也可以用得自細胞的組分而在體外進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些技術(shù)，這些技術(shù)在Sambrook等(Sambrook，F(xiàn)ritsch，和Maniatis，″Molecular CloningA Laboratory Manual″，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，1989)中有敘述。在優(yōu)選實施方案中，表達產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)或多肽。在其它優(yōu)選實施方案中，表達產(chǎn)物是VH/IgGγ1、VL/Cκ，VL/Cλ或VI/IgGγ1。
術(shù)語“分泌信號序列”是指一種肽序列。當(dāng)該序列被符合讀框地翻譯為與所選多肽的氨基末端連接的肽時，所述分泌信號序列將通過與宿主細胞的機器相互作用，而引起所選多肽被分泌。作為分泌過程的一部分，這種分泌信號序列將被切除，在被輸出后僅留下感興趣的多肽。在優(yōu)選實施方案中，使用蜜蜂蜂毒肽分泌信號序列。在其它優(yōu)選實施方案中，使用人胎盤堿性磷酸酶分泌信號序列。本發(fā)明不受這些分泌信號序列的限制，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它分泌信號序列取代這些分泌信號序列，或除此之外可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它分泌信號序列。術(shù)語“分泌信號序列”也指編碼所述分泌肽的核酸序列。
術(shù)語“ELISA”是指“酶聯(lián)免疫吸附測定”，其中通過使蛋白與ELISA板的塑料孔結(jié)合、然后用該蛋白特異性的抗體檢測進行蛋白定量或檢測，來確定蛋白的存在或濃度。
術(shù)語“啟動子控制”是指表達載體中DNA的布置，其中啟動子被置于感興趣基因的5’，使得從所述DNA序列轉(zhuǎn)錄出mRNA分子。這種mRNA分子然后由宿主細胞機器進行翻譯。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟悉這一術(shù)語的含義。
術(shù)語“A蛋白”、“G蛋白”和“L蛋白”是指能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白分子而不與抗原結(jié)合位點相互作用的特定細菌蛋白。A蛋白是一種從金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中分離的、結(jié)合免疫球蛋白分子Fc區(qū)的多肽。G蛋白是一種從人G組鏈球菌菌株(G148)中分離的對免疫球蛋白G(IgG)具有親和性的細菌細胞壁蛋白。L蛋白是一種由厭氧細菌種大消化鏈球菌(Peptostreptococcus magnus)的某些菌株表達的免疫球蛋白輕鏈結(jié)合蛋白。
術(shù)語“B細胞淋巴瘤”是指在淋巴系統(tǒng)中來自B細胞的細胞中產(chǎn)生的癌癥。B細胞是從骨髓發(fā)育并且產(chǎn)生抗體的白細胞。它們也被稱為B淋巴細胞。
術(shù)語“頑固性低級B細胞淋巴瘤”是指對治療無反應(yīng)的低級B細胞淋巴瘤。術(shù)語“低級B細胞淋巴瘤”是指往往緩慢生長和擴散的淋巴瘤，包括濾泡性小裂開細胞淋巴瘤(follicular small cleaved celllymphoma)。由于其生長緩慢，也被稱為無痛淋巴瘤。
術(shù)語“濾泡性B細胞淋巴瘤”是指一種類型的非霍奇金淋巴瘤。它是一種無痛(生長緩慢)類型的淋巴瘤。
低級淋巴瘤的進一步的定義和表征可以在因特網(wǎng)的http//rituxan.com/professional/clinical_information/class/index.html上找到。
術(shù)語“分離”當(dāng)指蛋白或多肽時，是指將天然存在的多肽或蛋白質(zhì)從其正常細胞環(huán)境中取出，或者是指將在表達系統(tǒng)(例如本文所述的桿狀病毒系統(tǒng))中合成的多肽或蛋白質(zhì)從所述表達系統(tǒng)的其它組分中取出。因此，所述多肽序列可以在無細胞溶液中，或者被置于不同的細胞環(huán)境中。該術(shù)語不是暗示所述多肽序列是存在的唯一氨基酸鏈，而是它基本上無(純度至少大約90-95％)與其天然相連的基于非氨基酸的物質(zhì)。
當(dāng)提及多肽時，利用術(shù)語“富集的”意指所述特定的氨基酸序列在感興趣的細胞或溶液中，在所存在的總氨基酸序列中所占的比率比在正常細胞或患病細胞或者在所述序列從中取出的細胞中所占的比率大得多(2-5倍)。人們可以通過優(yōu)先降低所存在的其它氨基酸序列的量，或者通過優(yōu)先增加所述特定感興趣氨基酸序列的量，或者通過這兩種方法的組合，做到這一點。然而，應(yīng)該注意到，富集的不是暗示不存在其它氨基酸序列，而僅僅是感興趣序列的相對量被顯著增加了。術(shù)語顯著的在此用來指對于制造這種增加的人而言，增加的水平是有效的，一般是指相對于其它氨基酸序列而言增加至大約至少2倍，更優(yōu)選至少5-10倍或甚至更高。該術(shù)語也不是暗示沒有來自其它來源的氨基酸序列。其它來源的氨基酸序列可能例如包含由酵母或細菌基因組、或者克隆載體例如pUC19編碼的氨基酸序列。在優(yōu)選實施方案中，所述氨基酸序列是一種上述嵌合蛋白。該術(shù)語意指僅包括人類干涉以增加所需氨基酸序列比例的那些情況。
對于某些目的而言，氨基酸序列為純化形式也是有利的。術(shù)語“純化的”當(dāng)涉及多肽時，并不需要絕對純(例如均一的制劑)；而是表明所述序列與在天然環(huán)境中相比相對的純。與天然水平相比，該水平應(yīng)該至少為2-5倍(例如以mg/ml計)。特別考慮了至少一個數(shù)量級、優(yōu)選兩個或三個數(shù)量級、更優(yōu)選四個或五個數(shù)量級的純化。所述物質(zhì)最好無功能上顯著水平的污染，例如純度為90％、95％或99％。
術(shù)語“在操作上連接的”是指這樣的DNA布置，其中控制區(qū)(例如啟動子或增強子)與相連的感興趣DNA基因連接，以便引起其轉(zhuǎn)錄，并因此允許其翻譯。術(shù)語“在操作上連接的”也可以指編碼加工信號的DNA序列(例如分泌信號序列)與編碼多肽的基因相連，形成一個可讀框。在轉(zhuǎn)錄和翻譯后，分泌信號序列具有使已翻譯的多肽輸出的潛力。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉該術(shù)語的含義。有用嵌合蛋白的功能衍生物本文也提供本發(fā)明多肽或核酸的功能衍生物。所謂“功能衍生物”是指本發(fā)明多肽或核酸的“化學(xué)衍生物”、“片段”或“變異體”，下面有這些術(shù)語的定義。功能衍生物保留了所述蛋白的至少一部分功能，例如與所述蛋白特異性的抗體的反應(yīng)性或通過非催化結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的結(jié)合活性，這使其可按照本發(fā)明應(yīng)用。在本領(lǐng)域中眾所周知，由于遺傳密碼的簡并性，許多不同的核酸序列可以編碼同一種氨基酸序列。同樣，在本領(lǐng)域中也眾所周知，可以進行氨基酸的保守改變，以得到保留原始功能性的蛋白或多肽。在這兩種情況下，所有的變換都計劃包括在本說明書中。
本發(fā)明范圍內(nèi)包括本文所述分離的核酸分子的功能等同物。遺傳密碼的簡并性允許某些密碼子被決定同一氨基酸的其它密碼子所取代，并且因此可以得到同一種蛋白質(zhì)。所述核酸序列可以有相當(dāng)大的改變，因為除甲硫氨酸和色氨酸之外，已知的氨基酸都可以由不止一種密碼子編碼。因此，可以合成本發(fā)明基因的部分或全部，得到與自然界中發(fā)現(xiàn)的序列顯著不同的核酸序列。然而，其所編碼的氨基酸序列卻將得以保存。
所述復(fù)合體的“化學(xué)衍生物”含有不是所述蛋白正常部分的額外的化學(xué)部分。所述蛋白或肽的共價修飾包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。如下所述，這類修飾可以通過使所述肽的靶氨基酸殘基與能夠與所選側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)的有機衍生化劑反應(yīng)，而被引入到所述分子中。除本發(fā)明的桿狀病毒表達系統(tǒng)所連接的正常糖類之外，它也可以包括使糖類連接到所述蛋白上。
最常使半胱氨酰殘基與α-鹵代乙酸(和相應(yīng)的胺)例如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)，得到羧甲基或羧酰氨基甲基衍生物。也通過與溴代三氟丙酮、氯乙酰磷酸(chloroacetyl phosphate)、N-烷基馬來酰亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫、甲基·2-吡啶基二硫、對氯汞苯甲酸、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯代-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑反應(yīng)，使半胱氨酰殘基衍生化。
組氨酰殘基通過與焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下反應(yīng)而衍生化，因為這種試劑對組氨酰側(cè)鏈具有相對特異性。對溴苯甲酰甲基溴也是有用的；該反應(yīng)最好在0.1M二甲基胂酸鈉中于pH6.0下進行。
使賴氨酰殘基和氨基末端殘基與琥珀酸酐或其它羧酸酐反應(yīng)。用這些試劑衍生化有逆轉(zhuǎn)賴氨酰殘基電荷的作用。用于使含伯胺殘基衍生化的其它合適試劑包括亞氨酸酯，例如吡啶甲亞胺酸甲酯(methylpicolinimidate)；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代硼氰化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2，4-戊二酮；和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸的反應(yīng)。
精氨酰殘基通過與一種或幾種常規(guī)試劑反應(yīng)而加以修飾，所述常規(guī)試劑中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生化要求反應(yīng)在堿性條件下進行，因為胍官能團的pKa值高。此外，這些試劑可以與賴氨酸的基團以及與精氨酸的α-氨基反應(yīng)。
酪氨酰殘基是用于通過與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應(yīng)而引入波譜標(biāo)記的眾所周知的修飾的靶。最常見的是，用N-乙酰咪唑(imidizol)和四硝基甲烷來分別生成O-乙酰酪氨酰種類和3-硝基衍生物。
羧基側(cè)鏈(天冬氨酰或谷氨酰)通過與碳二亞胺(R’-N-C-N-R’)例如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基(4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺反應(yīng)而被選擇性修飾。此外，通過與銨離子反應(yīng)，使天冬氨酰殘基和谷氨酰殘基轉(zhuǎn)變?yōu)樘於０孵埢凸劝滨０孵埢?br> 通常將谷氨酰胺酰殘基和天冬酰胺酰殘基分別脫酰胺為相應(yīng)的谷氨酰殘基和天冬氨酰殘基?；蛘撸跍睾偷乃嵝詶l件下將這些殘基脫酰胺。任一種形式的這些殘基都落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
其它修飾包括多肽或蛋白質(zhì)的體外糖基化。
用雙官能試劑衍生化是有用的，例如可用于使所述蛋白的組分肽相互交聯(lián)，或者與復(fù)合體中的其它蛋白交聯(lián)、與水不溶性支持基質(zhì)或者與其它大分子載體交聯(lián)。常用的交聯(lián)劑包括例如1，1-雙(重氮乙酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯(N-hydroxysuccinimide esters)例如與4-疊氮水楊酸形成的酯、同雙官能亞氨酸酯包括二琥珀酰亞胺基酯例如3，3’-二硫代雙(丙酸琥珀酰亞胺基酯)和雙官能馬來酰亞胺例如雙-N-馬來酰亞氨基-1，8-辛烷。衍生化試劑例如甲基-3-[對疊氮苯基]二硫醇丙亞氨酸酯產(chǎn)生能夠在光存在時形成交聯(lián)的光敏中間體?；蛘?，用美國專利第3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537和4,330,440號中所述的反應(yīng)性水不溶性基質(zhì)例如溴化氰活化的糖類和反應(yīng)性基質(zhì)進行蛋白質(zhì)的固定化。
其它修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化；絲氨酰殘基或蘇氨酰殘基的羥基的磷酸化；賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈α-氨基的甲基化(Creighton，T.E.，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，第79-86頁，1983)；N末端胺的乙?；约霸谀承┣闆r下C末端羧基的酰胺化。
這類衍生化部分可以改進穩(wěn)定性、溶解性、吸收、生物半壽期等。另一方面，所述部分可以消除或減弱所述蛋白復(fù)合體的任何不想要的副作用等。能夠介導(dǎo)這類效應(yīng)的部分公開于例如Remington’sPharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)。
氨基酸殘基有缺失、插入和/或取代的蛋白質(zhì)的功能衍生物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備。例如，所述功能衍生物的經(jīng)修飾組分可以用定點誘變技術(shù)(如Adelman等，DNA 2183，1983所例舉的)來產(chǎn)生，其中采用例如如上所述的技術(shù)，對所述DNA編碼序列中的核苷酸進行修飾，使得經(jīng)修飾的編碼序列被修飾，此后在原核或真核宿主細胞中表達這種重組DNA?；蛘撸帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法，通過直接化學(xué)合成，可以常規(guī)制備氨基酸有缺失、插入和/或取代的蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)的功能衍生物通常表現(xiàn)出與天然蛋白質(zhì)相同性質(zhì)的生物活性。本發(fā)明嵌合蛋白的應(yīng)用本發(fā)明的其它方面涉及本發(fā)明嵌合蛋白的應(yīng)用。優(yōu)選的應(yīng)用包括藥物應(yīng)用和獸醫(yī)應(yīng)用，其中將有效量的按照本發(fā)明的嵌合蛋白(最好以按照本發(fā)明的組合物)給予患者。這樣，所述嵌合蛋白接觸患者的細胞，所述接觸此后誘發(fā)所需的生物應(yīng)答。使用本發(fā)明嵌合蛋白的方法包括在生物體內(nèi)誘發(fā)免疫應(yīng)答的方法、在生物體內(nèi)產(chǎn)生抗體(B細胞免疫應(yīng)答)的方法、誘導(dǎo)生物體的T細胞免疫應(yīng)答的方法以及治療B細胞病理的方法。本發(fā)明也包括通過給予本發(fā)明的嵌合蛋白治療受治療者以便增強能夠改變B細胞病理的免疫應(yīng)答的方法。
通常，這些方法通過給予所述生物體有效量的按照本發(fā)明的嵌合蛋白來完成?！坝行Я俊笔侵笇?dǎo)致誘發(fā)所需生物應(yīng)答的量。這種量的構(gòu)成將所有變化，并且取決于各種各樣的因素，包括具體的嵌合蛋白、待誘發(fā)的所需生物應(yīng)答、嵌合蛋白的制劑、待治療生物體的年齡、體重、性別和健康狀況、給藥方案、待治療或預(yù)防的病癥或疾病等?？梢越o予本發(fā)明嵌合蛋白和組合物的生物體包括哺乳動物，最好是選自牛、犬、馬、貓、羊、豬和靈長類動物的哺乳動物。特別優(yōu)選的生物體是人類。
可以將本文所述的化合物本身給予人類患者，或者所述化合物可以以其中與其它有效成分混合的藥用組合物給予人類患者，或者以聯(lián)合療法或者在合適的載體或賦形劑中給予人類患者。用于配制和給予本申請化合物的技術(shù)可以在″Remington’s Pharmaceutical Sciences，″Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版中找到。1.給藥途徑合適的給藥途徑可以例如包括口服、直腸、經(jīng)粘膜或腸溶給藥；胃腸外給藥，包括肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接室內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解可以作出使組合物適合于具體給藥途徑的各種改變。
另一方面，人們可以以局部方式而非系統(tǒng)性方式給予所述化合物，例如通過將所述化合物通常以緩釋制劑的形式直接注射到實體瘤中。2.組合物/制劑本發(fā)明的藥用組合物可以以本身已知的方法生產(chǎn)，例如借助常規(guī)混合、溶解、制粒、制糖錠、研磨、乳化、包囊、包藏或凍干法生產(chǎn)。
因此，按照本發(fā)明使用的藥用組合物可以以常規(guī)方式，采用一種或多種生理上可接受的載體包括賦形劑和有助于將所述活性化合物加工為可以藥用的制劑的輔料來配制。合適的制劑取決于所選的給藥途徑。
對于注射而言，本發(fā)明的藥物可以配制到水溶液中，最好是配制在生理上相容的緩沖液例如Hank氏溶液、Ringer氏溶液或者生理鹽水緩沖液中。對于經(jīng)粘膜給藥而言，在制劑中使用適于穿透所述屏障的滲透劑。這類滲透劑是本領(lǐng)域眾所周知的。
對于口服給藥，可以通過將所述活性化合物與本領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受的載體混合，可以容易地配制所述化合物。這類載體使本發(fā)明的化合物能夠配制為可供待治療患者口服攝入的片劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液體、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、混懸劑等。合適的載體包括賦形劑，例如填充劑，諸如糖包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑，例如玉米淀粉、小麥淀粉、水稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽例如藻酸鈉。
給糖錠核心提供合適的包衣。為此，可以使用濃縮糖溶液，它可以任選地含有阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波泊爾膠(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物?？梢约尤肴玖匣蛏刂疗瑒┗蛱清V包衣中，以供標(biāo)識或鑒定活性化合物劑量的不同組合。
可以口服使用的藥用制劑包括用明膠制備的鎖口型膠囊以及用明膠和增塑劑例如甘油或山梨醇制備的軟密封膠囊。鎖口型膠囊可以含有與以下物質(zhì)混合的所述有效成分填充劑例如乳糖、粘合劑例如淀粉、和/或潤滑劑例如滑石粉或硬脂酸鎂、和任選的穩(wěn)定劑。在軟膠囊中，可以將所述活性化合物溶于或懸浮于合適的液體例如脂肪油、液體石蠟或液態(tài)聚乙二醇中。另外，可以加入穩(wěn)定劑。用于口服給藥的所有制劑都應(yīng)該為適合于這類給藥的劑量形式。
對于口腔含化給藥，所述組合物可以采用以常規(guī)方式制備的片劑或錠劑形式。
對于吸入給藥，按照本發(fā)明使用的化合物可以以借助于合適的推進劑(例如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適氣體)，從加壓包裝或霧化器供給的氣霧劑噴霧形式方便地給藥。就加壓氣霧劑而言，可以通過提供一個閥以給予一個計量量，來確定劑量單位?？梢耘渲坪兴龌衔锖秃线m粉劑基質(zhì)(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物、供吸入器或吹入器用的例如明膠膠囊和藥筒。
所述化合物可以配制用于通過注射胃腸外給藥，例如通過大劑量注射或連續(xù)輸注給藥。注射用制劑可以以單位劑型存在，例如在安瓿或多劑量容器中，并且加入防腐劑。所述組合物可以采用諸如油性或水性溶媒中的混懸劑、溶液劑或乳劑的形式，并且可以含有配制劑(formulatory agent)，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
用于胃腸外給藥的藥用制劑包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，所述活性化合物的混懸劑可以配制為適當(dāng)?shù)挠托宰⑸溆没鞈覄?。合適的親脂性溶劑或溶媒包括脂肪油例如芝麻油、或合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯、或者脂質(zhì)體。含水注射用混懸劑可以含有提高混懸劑粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖?；鞈覄┮部梢匀芜x地含有合適的穩(wěn)定劑或提高所述化合物溶解度以允許配制高濃縮溶液的藥劑。
或者，所述有效成分可以為粉劑形式，以供在使用前用合適的溶媒例如無菌無熱原水重建。
除前述制劑外，所述化合物也可以配制為緩釋制劑。這類長效制劑可以通過植入(皮下植入或肌內(nèi)植入)或者通過肌內(nèi)注射給藥。因此，例如所述化合物可以用合適的聚合材料或疏水性材料(例如可接受的油中的乳劑)或離子交換樹脂或者作為微溶性衍生物(例如作為微溶性鹽)來配制。
本發(fā)明疏水性化合物的藥用載體是一種包含苯甲醇、非極性表面活性劑、水混溶性有機聚合物和水相的助溶劑體系。所述助溶劑體系可以是VPD助溶劑體系。VPD是一種3％w/v苯甲醇、8％w/v非極性表面活性劑polysorbate 80和65％w/v聚乙二醇300、用無水乙醇定容的溶液。VPD助溶劑體系(VPDD5W)包含用5％葡萄糖水溶液以1∶1稀釋的VPD。這種助溶劑體系很好地溶解疏水性化合物，其自身在系統(tǒng)給藥時產(chǎn)生的毒性低。自然，助溶劑體系的比率在不破壞其溶解性和毒性特征的情況下，可以有相當(dāng)大的變化。此外，所述助溶劑組分的身份可以改變例如，可以使用其它低毒性非極性表面活性劑來代替polysorbate 80；聚乙二醇的比率大小可以改變；其它生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；以及可以用其它糖或多糖替代葡萄糖。
另一方面，可以使用組合物的其它給藥系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是眾所周知用于疏水性藥物的給藥溶媒或載體的實例。某些有機溶劑例如二甲基亞砜也可以使用，盡管通常以更大的毒性為代價。另外，所述化合物可以用緩釋系統(tǒng)來給藥，例如含有所述治療藥的固態(tài)疏水性聚合物的半透性基質(zhì)。各種緩釋材料已經(jīng)很好地確立，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。緩釋膠囊可以根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)，在數(shù)周至100天內(nèi)釋放所述化合物。根據(jù)所述治療藥的化學(xué)性質(zhì)和生物穩(wěn)定劑，可以使用用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的其它策略。
所述藥用組合物也可以包含合適的固相或凝膠相載體或賦形劑。這類載體或賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物例如聚乙二醇。
本發(fā)明的許多化合物可以作為具有藥學(xué)上相容的相反離子的鹽來提供。藥學(xué)上相容的鹽可以用許多酸來形成，所述酸包括但不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。鹽在相應(yīng)的游離堿形式的水性溶劑或其它質(zhì)子溶劑中往往更易溶解。3.有效量適用于本發(fā)明的藥用組合物包括其中包含足以達到其計劃目的量的有效成分的組合物。更具體地講，治療有效量是指化合物有效預(yù)防、減輕或緩解病癥或延長所治療的受治療者的生存的量。治療有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，尤其是根據(jù)本文提供的詳細公開內(nèi)容。
本文所述化合物的毒性和療效可以用標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法用細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游飦泶_定，例如確定LD50(使群體的50％致死的劑量)和ED50(在群體的50％中治療有效的劑量)。毒性和療效的劑量比是治療指數(shù)，它可以以LD50和ED50之比來表示。優(yōu)選表現(xiàn)出高治療指數(shù)的化合物。根據(jù)這些細胞培養(yǎng)物測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用來制訂人用的劑量范圍。這類化合物的劑量最好在包括ED50但具有很低毒性或無毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。所述劑量可以在該范圍內(nèi)變動，這取決于所用的劑型和使用的給藥途徑。實際的制劑、給藥途徑和劑量可以由各個醫(yī)師根據(jù)患者的病癥來選擇(參見例如Fingl等，″ThePharmacological Basis of Therapeutics，″第1章第1頁，1975)。
給藥量和給藥間隔可以單獨進行調(diào)整，以提供足以保持所需效應(yīng)或提供最低有效濃度(MEC)的所述活性部分的血漿水平。MEC對于每種化合物而言會有所變化。達到MEC所必需的劑量將取決于各個特征和給藥途徑。然而，可以用HPLC測定或生物測定來測量血漿濃度。
給藥間隔也可以用MEC值來確定。應(yīng)該采用維持血漿水平在所述時間的10-90％、優(yōu)選30-90％、更優(yōu)選50-90％內(nèi)高于MEC的給藥方案，來給予化合物。
就局部給藥或選擇性吸收而言，所述藥物的有效局部濃度可能與血漿濃度不相關(guān)。
當(dāng)然，組合物的給藥量將取決于所治療的受治療者、受治療者的體重、疾患的嚴(yán)重程度、給藥方式和主治醫(yī)師的判斷。4.包裝如果需要，所述組合物可以在可以含有一個或多個單位劑型的包裝或分配裝置中提供，所述單位劑型含有所述有效成分。所述包裝可以例如包含金屬箔或塑料箔，例如泡罩片。所述包裝或分配裝置可以附有給藥說明。所述包裝或分配器也可以附帶與容器相連的、由管理藥物生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)規(guī)定形式的、反映出該機構(gòu)批準(zhǔn)所述形式的多核苷酸給予人類或動物的通知。這類通知例如可以是美國食品與藥品管理局批準(zhǔn)的處方藥的標(biāo)簽，或者是批準(zhǔn)的產(chǎn)品說明書。也可以制備包含在相容藥用載體中配制的本發(fā)明化合物的組合物，將其置于合適的容器中，并且配有有關(guān)治療所指明病癥的標(biāo)簽。標(biāo)簽上指明的合適病癥可以包括治療腫瘤、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、治療糖尿病等。
實施例在以下描述中，將參考免疫學(xué)、細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法。敘述所參考的這類已知方法的出版物和其它材料通過引用全部結(jié)合到本文中，如同全文敘述一樣。1.組織加工，以便進行非霍奇金淋巴瘤獨特型(ID)的鑒定和克隆在無菌條件下按照臨床指定的方法，對得自外周淋巴結(jié)的腫瘤樣品進行活組織檢查，用所述樣品產(chǎn)生患者獨特型特異性嵌合免疫球蛋白重組蛋白。將剩余的淋巴結(jié)活檢材料在液氮中貯存于組織細胞庫中，以備將來使用。
a.細胞分離通過迫使患者活檢淋巴瘤組織通過一次性0.38mm鋼篩網(wǎng)并且同時浸入無菌PBS中，獲得患者淋巴結(jié)活檢樣本的單細胞懸浮液。分散的細胞用PBS洗滌2次，然后重新懸浮和計數(shù)。加工10％比率的所述細胞，以進行總RNA提取，剩余的細胞在重新懸浮于含有30％(v/v)胎牛血清和10％(v/v)DMSO的RPMI1640組織培養(yǎng)基中之后，在液氮中保存。所有臨床樣品的加工都在生物安全櫥中進行。
b.總RNA制備用RNeasy Kit(Oiagen)，按照生產(chǎn)商的說明，分離得自勻漿淋巴結(jié)細胞的總RNA?？俁NA通過分光光度法定量。
c.cDNA合成用大約2.0μg總RNA作為模板，用SuperScriptPreamplification System(GIBCO BRL)，按照生產(chǎn)商的建議，進行第一鏈cDNA的合成。用試劑盒中所提供的oligo(dT)來引發(fā)所述cDNA。
d.編碼淋巴瘤重鏈和輕鏈的基因的PCR擴增如下鑒定得自淋巴瘤特異性免疫球蛋白的重鏈和輕鏈。將等份的單鏈淋巴瘤cNDA與代表表1中所列的與IgM、IgG、IgA或Igκ和Igλ恒定區(qū)特異性反義引物配對的所有已知VH、Vκ和Vλ亞家族的一系列VH和VL前導(dǎo)序列特異性寡核苷酸有義引物混合。然后這些樣品通過PCR擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析。
用從患者外周血淋巴細胞制備的cDNA，進行平行反應(yīng)。用來源于含有正常PBL cDNA或淋巴結(jié)活檢樣品cDNA的樣品的每對引物所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的比較，將導(dǎo)致鑒定出在所述淋巴瘤中過量表達的(overrepresented)候選的腫瘤特異性VH和Vκ或Vλ亞家族以及所述重鏈和輕鏈的同種型。然后切下候選的腫瘤V區(qū)基因產(chǎn)物，測定其核酸序列以評價克隆性。對于每位患者，從起始細胞部分進行兩個獨立的分析。
在50μl體積中，用HotStarTaq Master Mix Kit(Qiagen)對1微升所述cDNA反應(yīng)物(代表5％的總cDNA反應(yīng)體積)進行35個循環(huán)的擴增。循環(huán)條件95℃ 15min，65℃ 4min，72℃ 1min，后接94℃ 1min、61℃ 30sec、72C 1min的34個循環(huán)；和72℃ 7min的一個最后延伸步驟。10μl等份的每個反應(yīng)物通過在含有溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上電泳進行分析。

e.PCR產(chǎn)物的克隆和測序按照生產(chǎn)商的建議，將得自多個反應(yīng)、經(jīng)測定含有重鏈和輕鏈的腫瘤特異性可變區(qū)序列的PCR產(chǎn)物，直接克隆到質(zhì)粒pCR2.1-TOPO中，然后導(dǎo)入到Top10感受態(tài)大腸桿菌(E.coli)細胞(Invitrogen)中。用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)，從羧芐青霉素抗性菌落制備24種小量制備的DNA質(zhì)粒，并通過分光光度法定量。用Cy5/Cy5.5染料引物循環(huán)測序試劑盒(Dye Primer CycleSequencing Kit)(Visible Genetics)，對200ng的每種質(zhì)粒進行測序。在測序反應(yīng)完成后，樣品在OpenGene DNA自動測序系統(tǒng)(AutomatedDNA Sequencing System)上電泳，數(shù)據(jù)用GeneObjects軟件包(VisibleGenetics)加工。用SEQUENCHER Version4.1.2DNA分析軟件(GENECodes Corp.)，進行另外的分析，包括序列比對。如果一種V區(qū)衍生序列在75％的所述樣品中存在，例如當(dāng)用上述軟件利用缺省參數(shù)分析時，所述24種中的18種或更多種形成一個共有序列組，則可以認(rèn)為所述V區(qū)衍生序列是腫瘤特異性的。當(dāng)可得到時，比較兩個獨立的活檢樣品。
f.cDNA合成和5’RACE產(chǎn)物的產(chǎn)生由于在VH和VL序列中存在突變，所以有時不可能鑒定出腫瘤特異性免疫球蛋白重排。作為上述序列特異性PCR策略的一種替代方法，人們可以利用5’RACE PCR策略來鑒定腫瘤特異性免疫球蛋白(Ig)重排。合成第一鏈cDNA以產(chǎn)生Ig特異性PCR產(chǎn)物的所有步驟，按照生產(chǎn)商的指示(用于快速擴增cDNA末端的5’RACE系統(tǒng)，version2.0，Gibco BRL)并略加修改進行。用大約2.5μg總RNA作為模板，在與感興趣的B細胞群體所用的免疫球蛋白重鏈和輕鏈恒定區(qū)互補的特異性反義引物(對于IgG為SEQID NO69，對于IgM為SEQ ID NO70，對于Cκ為SEQ ID NO71，而對于Cλ為SEQ ID NO72)存在下，分別合成第一鏈cDNA。在GlassMAX離心柱(spin cartridges)上純化所述cDNA反應(yīng)物，分別產(chǎn)生50μl的終體積。在25μl體積中，用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給10μl等份的每種純化cDNA加上oligo(dC)尾，產(chǎn)生后續(xù)PCR反應(yīng)所用的模板。建立的PCR利用生產(chǎn)商提供含有poly(G)序列段的上游引物和用于cDNA第一鏈合成內(nèi)部的Ig特異性反義引物(對于IgG為SEQ ID NO73，對于IgM為SEQ ID NO74，對于Cκ為SEQ ID NO75，而對于Cλ為SEQ IDNO76)。5μl模板在50μl體積中如下進行擴增95℃15min，55℃4min，72℃1min，然后94℃1min，55℃30sec，72℃1min進行34個循環(huán)，和于72℃7min的一個最后延伸步驟。所述PCR終產(chǎn)物通過在含有溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上電泳而進行分離，分離出合適大小(～500-600bp)的條帶，如上文1e中所述，將其克隆到pCR2.1-TOPO質(zhì)粒中。2.桿狀病毒表達載體pTRABacHuLCκHCγ1和pTRABacHuLCλHCγ1的構(gòu)建a.將分泌信號序列克隆到p2Bac中pTRABacHuLCκHCγ1和pTRABacHuLCλHCγ1構(gòu)建體的基礎(chǔ)載體是p2Bac(圖2，SEQ ID NO5，Invitrogen，Carlsbad，CA)。將兩種分泌信號序列克隆到該基礎(chǔ)載體中，構(gòu)建第一種中間桿狀病毒表達載體p2BacM。概括地說，首先利用編碼定位以置于桿狀病毒AcNPV P10啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的蜜蜂蜂毒肽分泌信號序列氨基末端結(jié)構(gòu)域的互補寡核苷酸，修飾載體p2Bac。對于蜂毒肽序列的克隆，2μgp2Bac用Not I和Spe I于37℃消化4小時。所述線性載體在通過1％瓊脂糖凝膠電泳后用Qiaex II樹脂(Qiagen，Chatsworth，CA)純化。然后，經(jīng)純化的DNA用50μl水洗脫，并測定DNA濃度。將引物MelS/N(SEQ ID NO15)和MelN/S(SEQ ID NO16)各1μg與10μl消化緩沖液M(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)混合，加熱至70℃達5分鐘，然后冷卻至室溫，以使互補引物退火。10％的退火引物用Not I和Spe I于37℃，在20μl反應(yīng)物中消化4小時，經(jīng)消化的引物在通過15％聚丙烯酰胺凝膠電泳后用Qiaex H樹脂純化，然后測定退火引物的DNA濃度。p2Bac載體和退火蜂毒肽片段的DNA以1∶10的載體與插入片段比進行連接。用感受態(tài)XL1-Blue大腸桿菌(Stratagene，San Diego，CA)，用連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，然后平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長過夜。采用標(biāo)準(zhǔn)方案制備小量制備菌落，對質(zhì)粒進行測序以檢查所述構(gòu)建。所得的載體p2BacM含有所述蜂毒肽分泌信號序列。
類似地對p2BacM載體進行進一步修飾，以編碼AcNPV多角體啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的人胎盤堿性磷酸酶分泌信號序列的氨基末端結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建第二種中間桿狀病毒表達載體p2BacMA。用來導(dǎo)入、克隆所述堿性磷酸酶序列方法一般如下所述用Bam HI和Eco RI消化2μgp2BacM質(zhì)粒，線性載體通過瓊脂糖凝膠和Qiaex II樹脂進行凝膠純化，并用50μl水洗脫。測定所述載體的DNA濃度。將引物APB/E(SEQID NO17)和APE/B(SEQ ID NO18)各1μg在10μl消化緩沖液M中混合，加熱至70℃達5分鐘，然后冷卻至室溫，以使互補引物退火。10％的退火引物用Bam HI和Eco RI于37℃在20μl反應(yīng)物中消化4小時。然后經(jīng)消化的引物通過15％聚丙烯酰胺凝膠和Qiaex II樹脂純化。也測定經(jīng)消化引物的DNA濃度。然后，使線性p2BacM載體和堿性磷酸酶片段以1∶10的載體與插入片段比進行連接，用感受態(tài)XL1-Blue大腸桿菌，用連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，然后平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長過夜。制備小量制備菌落，對質(zhì)粒進行測序以檢查所述構(gòu)建。所得的中間載體p2BacMA將含有人胎盤堿性磷酸酶的分泌信號序列。再將p2BacMA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到缺乏dcm甲基化酶活性的SCS-110大腸桿菌菌株(Stratagene)中，以供隨后將κ恒定區(qū)克隆到甲基敏感性Stu I位點中。
b.IgGγ1和輕鏈恒定區(qū)的擴增和克隆從自人細胞系9F12(ATCC#HB8177)中提取的RNA，經(jīng)PCR擴增人單克隆抗體9F12的人κ恒定區(qū)和人IgGγ1恒定區(qū)。將κ恒定區(qū)克隆到所述堿性磷酸酶信號序列之后。將IgGγ1恒定區(qū)插入到所述蜂毒肽分泌信號序列的下游，從而構(gòu)建載體(pTRABacHuLCκHCγ1，圖5a)。通過用λ輕鏈恒定區(qū)取代κ輕鏈恒定區(qū)，產(chǎn)生含有人λ輕鏈恒定區(qū)的載體(pTRABacHuLCλHCγ1，圖5b)。從慢性淋巴細胞白血病的細胞RNA制劑中，通過RT-PCR分離出所述輕鏈?？寺〕绦虻脑敿毭枋鋈缦?。
c.9F12κ恒定區(qū)片段和IgGγ1恒定區(qū)片段的擴增用RNeasyKit(Qiagen)，按照生產(chǎn)商的說明，從9FI2細胞(ATCC#HB8177)提取總RNA。用SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO BRL，Rockville，MD)和oligo(dT)引物，合成單鏈cDNA。用1/20的合成單鏈cDNA，在具有Expand HighFidelity Taq(Roche)的100μl PCR反應(yīng)物中，使用κ和IgGγ1特異性寡核苷酸(分別為SEQ ID NO21加上SEQ ID NO22和SEQ ID NO19加上SEQ ID NO20)進行擴增。來自擴增9FI2免疫球蛋白的片段通過1.5％SeaKem瓊脂糖和Qiaex II樹脂純化，并用50μl水洗脫。測定所述片段的DNA濃度。將純化的9F12免疫球蛋白片段分別連接到TA-II(Invitrogen)PCR克隆載體中。用感受態(tài)XLI-Blue大腸桿菌，用所述連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，然后平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長過夜。制備小量制備的菌落，并對質(zhì)粒DNA進行測序。
d.將9F12κ恒定區(qū)插入到所述表達載體中對于κ恒定區(qū)，用Stu I和Hind III消化5μg含有κ恒定區(qū)的質(zhì)粒DNA和2μg從SCS110大腸桿菌中純化的載體p2BacMA的DNA。含有κ恒定區(qū)的320bp片段和含有p2BacMA載體的7.1kb片段用Quiex II凝膠純化，然后用50μl水洗脫。測定這兩種片段的DNA濃度。然后用Rapid Ligation Kit(Roche)連接純化的片段。用感受態(tài)XL1-Blue大腸桿菌，用所述連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，然后平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長過夜。制備小量制備的細菌菌落，并對所述重組DNA進行測序，以證實κ恒定區(qū)的正確插入。所得的質(zhì)粒載體為pTRABacLCκ。
e.將IgGγ1恒定區(qū)加入到所述載體中通過首先用Spe I和XbaI消化5μg含有IgGγ1恒定區(qū)的質(zhì)粒DNA和2μg載體pTRABacLCκ的質(zhì)粒DNA，將IgGγ1恒定區(qū)加入到所述載體中。用瓊脂糖填料(agarose plugs)和Quiex II凝膠純化IgGγ1恒定區(qū)的1kb片段和pTRABacLCκ載體的7.4kb片段，并用50μl水洗脫。測定這兩種片段的DNA濃度。然后用Rapid Ligation Kit(Roche)連接純化的片段。用感受態(tài)XL1-Blue大腸桿菌，用所述連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，然后平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長過夜。制備小量制備的菌落，通過限制性分析和對限制位點測序，確定連接和IgGγ1插入的方向。所得的重組載體為pTRABacHuLCκHCγ1。
進一步精修該質(zhì)粒-pTRABacHuLCκHCγ1，以便分別在所述蜂毒肽分泌序列和Cγ1區(qū)序列之間以及在所述堿性磷酸酶分泌序列和Cκ區(qū)序列之間加入翻譯終止密碼子。為了完成這些修飾，采用Spe I+Apa I消化，使pTRABacHuLCκHCγ1載體線性化。然后將所述線性化載體與退火的互補引物γ1-stuff1(SEQ ID NO82)和γ1-stuff 1’(SEQ ID NO83)連接，以引入符合讀框的終止密碼子。隨后采用以Stu I(AGGCCT)+Dra III(CACnnnGTG)消化，使通過這種修飾得到的載體線性化，然后與退火的互補引物κ-Stuff 1(SEQ ID No.84)和κ-stuff1’(SEQ ID NO81)連接，以引入符合讀框的終止密碼子。這些修飾的凈效應(yīng)分別在圖6C和6D中所示的序列中指出。(加入的序列以雙下劃線和粗體突出。)f.將λ恒定區(qū)加入到所述載體中用RNeasy試劑盒(Qiagen)，從得自表現(xiàn)出λ輕鏈獨特型的慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者的純化外周血淋巴細胞(PBL)中獲得總RNA。
用大約2.0μg總RNA作為模板，采用SuperScript PreamplificationSystem(Gibco BRL)，按照生產(chǎn)商的建議，進行第一鏈cDNA合成。用Oligo(dT)進行引發(fā)。用1/20的所述合成單鏈cDNA，用與Vλ信號序列的一部分相同的上游引物(SEQ ID NO54)和與λ恒定區(qū)的最后幾個密碼子以及3’非翻譯區(qū)的一部分互補的下游引物(SEQ ID NO77)，在PCR反應(yīng)中進行擴增。將PCR產(chǎn)物克隆到pCRII載體(Invitrogen)中，測序以證實身份。選擇含有正確λ恒定區(qū)序列的質(zhì)粒作為第二PCR的模板。在該反應(yīng)中，利用一種含有工程Dra III限制位點、對應(yīng)于λ恒定區(qū)中緊接Jλ下游的序列的有義寡核苷酸Cλ-5’(SEQ ID NO78)、和一種跨越緊接λ恒定區(qū)的終止密碼子的含Hind III反義寡核苷酸引物Cλ-3’(SEQ ID NO79)。將所得的PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1-TOPO載體中并測序。用Hind III限制時，從所述質(zhì)粒的某些質(zhì)粒中釋放出含所述λ恒定區(qū)序列的片段，這取決于所述插入片段的取向。凝膠分離這一限制性片段，在用Hind III消化線性化后，將其克隆到pTRABacHuLCκHCγ1(圖5A)中，產(chǎn)生一種含有λ恒定區(qū)和κ恒定區(qū)的中間質(zhì)粒。用Stu I和Dra III限制這種質(zhì)粒，導(dǎo)致除去所述κ序列。然后將這種線性化質(zhì)粒與退火的互補引物λ-stuff1(SEQ ID NO80)和λ-stuff1’連接，產(chǎn)生最終形式的pTRABacHuLCλHCγ1(圖5B)。3.將患者來源的獨特型VH和/或VL區(qū)的基因插入到表達載體中采用或者pTRABacHuLCκHCγ1或pTRABacHuLCλHCγ1，有可能將含有單一克隆序列Stu I和Dra III的任何VL區(qū)的基因插入到所述堿性磷酸酶信號序列和κ或λ恒定區(qū)之間，以及將含有單一克隆序列Spe I和Apa I的任何VH區(qū)的基因插入到所述蜂毒肽分泌信號序列和IgGγ1恒定區(qū)之間(參見圖5A和圖5B)。然后用所得的表達載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)到草地貪夜蛾(Sf-9)昆蟲細胞中，產(chǎn)生出芽的重組桿狀病毒。然后將所述重組的桿狀病毒在Sf-9細胞中連續(xù)擴增，產(chǎn)生高滴度的重組桿狀病毒原液。然后用這種高滴度的重組桿狀病毒原液感染粉紋夜蛾(High-5)細胞，以供隨后生產(chǎn)IgG嵌合蛋白。可以在表2中找到用于構(gòu)建pTRABacHuLCκHCγ1或pTRABacHuLCλHCγ1的所有寡核苷酸引物的一覽表。
在如上所述分離VH和/或VL區(qū)的腫瘤衍生序列之后，制備包括所述蜂毒肽前導(dǎo)肽的末端40個核苷酸的寡核苷酸引物(對于Ig重鏈克隆而言)(SEQ ID NO8-CAGATCACTA GTTTTTATGG TCGTGTACATTTCTTACATC TATGCG]、包括所述堿性磷酸酶前導(dǎo)肽的末端28個核苷酸的寡核苷酸引物(對于Ig輕鏈克隆而言)(SEQ ID NO9-CTGAGTAGGC CTGAGGCTAC AGCTCTCCCT GGGC)和包括相應(yīng)的VH或VL區(qū)蛋白的前21-24個核苷酸的寡核苷酸引物。使用來自重鏈或輕鏈恒定區(qū)的反向寡核苷酸引物(IgGSEQ ID NO10-GGAAGTAGTC CTTGACCAGG CAG；IgMSEQ ID NO11-GGGAAAAGGG TTGGGCCCGA TGCAC；IgκSEQ ID NO12-GATGAAGACA CTTGGTGCAG CCACAG；IgλSEQ ID NO13GGAACAGAGT GACACTGGGT GCAGCCTTGG GCTG)。如前所述鑒定為具有克隆VH或VL序列的重組質(zhì)粒用作第二輪PCR的模板。循環(huán)條件如上所述。
將質(zhì)粒模板與分別互補于編碼氨基酸141-149、115-123、108-119和109-117的密碼子的IgCγ1、IgM、Igλ或Igκ恒定區(qū)引物和合適的前導(dǎo)序列/V區(qū)融合引物混合。例如，對于一位患者而言，所用的引物是用于VH3的SEQ ID NO67和用于Vκ3的SEQ ID NO68(SEQ ID NO67CAGATCACTA GTTTTTATGG TCGTGTACAT TTCTTACATCTATGCGGAGA TGAAATTGGT GGAGTCTGGG；SEQ ID NO68CTGAGTAGGC CTGAGGCTAC AGCTCTCCCT GGGCGAAGTTGTGTTGACTC AGTCTCC)。循環(huán)條件如上所述。
a.將輕鏈可變區(qū)插入到表達載體中用Stu I和Dra III消化PCR衍生VL產(chǎn)物和2μg對應(yīng)的pTRABacHuLCκHCγ1或pTRABacHuLCλHCγ1盒載體。用瓊脂糖凝膠填料(plug)和Qiaex II樹脂純化來自患者來源的VL區(qū)的350bp DNA片段和線性pTRABacHuLCκHCγ1或pTRABacHuLCλHCγ1載體的8.4kb片段，并用50μl水洗脫。測定這兩種片段的DNA濃度，然后用Rapid Ligation試劑盒(Roche)連接所述片段。用所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)XL1-Blue大腸桿菌，隨后將其平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長過夜。制備小量制備的菌落，通過限制性分析和測序，證實所述重組DNA質(zhì)粒。所得的載體命名為pTRABac(NHL-VL)LCκHCγ1或pTRABac(NHL-VL)LCλHCγ1。
b.將重鏈可變區(qū)插入到表達載體中用Spe I和Apa I消化PCR衍生VH產(chǎn)物和2μg pTRABac(NHL-VL)LCκHCγ1或pTRABac(NHL-VL)LCλHCγ1盒載體。用瓊脂糖凝膠填料和Qiaex II樹脂純化來自患者來源的VH區(qū)的350bp DNA片段和線性pTRABac(NHL-VL)LCκHCγ1或pTRABac(NHL-VL)LCλHCγ1載體的8.8kb片段，并用50μl水洗脫。測定這兩種片段的DNA濃度，然后用Rapid Ligation試劑盒(Roche)連接所述片段。用所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)XL1-Blue大腸桿菌，隨后將其平板接種到LB-羧芐青霉素瓊脂平板上，于37℃生長過夜。制備小量制備的菌落，通過限制性分析和測序，證實所述重組DNA質(zhì)粒。所得的載體命名為pTRABac(NHL-VL)LCκ(NHL-VH)HCγ1、pTRABac(NHL-VL)LCλ(NHL-VH)HCγ1，并且指定一個對應(yīng)于一位患者的參考號，例如FV8786-001。
4.用含可變區(qū)的表達載體轉(zhuǎn)染昆蟲細胞系和產(chǎn)生重組嵌合蛋白a.昆蟲細胞的生長用經(jīng)修飾的桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染兩個已建立的昆蟲細胞系(Sf9和High-5)，以產(chǎn)生重組VH/免疫球蛋白和/或VL/免疫球蛋白嵌合蛋白。所有的昆蟲細胞都于28℃在140-150rpm下、在一次性無菌通氣(vented)搖瓶(Coming)內(nèi)含有50μg/L慶大霉素的ESF-921無血清昆蟲培養(yǎng)基(表達系統(tǒng)LLP)中生長，液體的體積不超過50％。每2-3天將細胞傳代。將來自每批產(chǎn)物工作細胞庫的或每6周的工作細胞庫的冷凍細胞解凍(低溫保藏培養(yǎng)基10％DMSO，40％ESF-921培養(yǎng)基，50％High-5條件培養(yǎng)基)，以確保有不因桿狀病毒感染而取消(retractile to)的連續(xù)的對數(shù)生長期細胞原液。
b.Sf9細胞轉(zhuǎn)染和重組測定用BacVector-3000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen)，將含有VH和/或VL區(qū)的基因和編碼免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)的基因的經(jīng)修飾桿狀病毒表達載體，共轉(zhuǎn)染到Sf9細胞中。從瓊脂糖上層中挑出10個單獨的噬斑。來自分離的噬斑的病毒用來感染T-25燒瓶內(nèi)5ml ESF-921培養(yǎng)基中接種的50％融合的Sf9細胞。用兩種引物(SEQ ID NO36-TTTACTGTTT TCGTAACAGTTTTG)和(SEQ ID NO37-GGTCGTTAAC AATGGGGAAG CTG)，通過PCR測試在T-25燒瓶中擴增的克隆病毒分離物，以確保分離的噬斑的克隆性和沒有野生型病毒污染。概括地說，按照Bac Vector手冊(Novagen)中所述，用供應(yīng)的Eufctin脂質(zhì)試劑，將200ng重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與三重切割的Bac-Vector-3000一起共轉(zhuǎn)染。將該轉(zhuǎn)染混合物連續(xù)5倍稀釋。將100微升等份樣品接種到含有2.5×106Sf9貼壁細胞的60mm組織培養(yǎng)皿中。1小時后，在細胞上鋪上4ml ESF-921培養(yǎng)基中的1％瓊脂糖溶液。在t＝轉(zhuǎn)染后144小時用中性紅(Sigma，St.Louis，MO)使活細胞染色后，從在瓊脂糖上層中生長的轉(zhuǎn)染細胞中挑出10個單獨的克隆。將病毒從噬斑塞狀物(plu)中過夜洗脫到1ml ESF-921培養(yǎng)基中。在T-25燒瓶中，接種5ml ESF-921培養(yǎng)基中50％融合的Sf-9細胞，用0.5ml洗脫的克隆病毒感染。感染后96小時，從T-25燒瓶中取出0.5ml培養(yǎng)基；離心除去細胞，通過硝化纖維素上的斑點印跡分析，分析上清液中的免疫球蛋白活性。如下所述，也通過PCR檢驗出不存在野生型病毒。
將含有重組桿狀病毒的感染性上清液(10μl)加入到90μl含有6μg蛋白酶K的裂解緩沖液中，所述裂解緩沖液含有10mM Tris pH8.3、50mM KCl、0.1mg/ml明膠、0.45％ Nonidet P-40和0.45％ Tween-20。將混合物于60℃加熱1小時，通過于95℃保溫10分鐘使蛋白酶K變性。取出25μl經(jīng)加熱的混合物，在冷卻后加入到新PCR管中，然后加入另外25μl混合物，所述混合物含有10mM Tris pH8.3、50mMKCl、0.1mg/ml明膠、0.45％NP-40、0.45％Tween-20、每種dNTP各400μM、5mM MgCl2、每種PCR引物各50pM(終濃度)和2.5U Taq聚合酶(Roche)。將病毒DNA擴增40個循環(huán)92℃1min，然后58℃1min和72℃1min。用重組桿狀病毒引物PH正向引物(SEQ ID NO36)和PH反向引物(SEQ ID NO37)，擴增表達所述輕鏈基因的多角體基因座。采用瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產(chǎn)物。用這些引物組，重組桿狀病毒將擴增一種1300bp的片段，而野生型桿狀病毒將產(chǎn)生一種大約800bp的片段。污染野生型病毒的重組病毒將擴增出這兩種大小的片段。
c.在Sf9昆蟲細胞中制備高滴度病毒原液將得自T-25原代培養(yǎng)物的2ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到T-75燒瓶內(nèi)含有50％融合的Sf9細胞的10ml ESF-921培養(yǎng)基中，讓細胞于28℃生長120小時。將5ml第二代T-75培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)移到含有50ml 2×106細胞/ml的Sf9細胞的150ml搖瓶中，讓細胞于28℃生長120小時。將來自150ml搖瓶的25ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1升搖瓶中的500ml 2×106細胞/ml的Sf9細胞中，于28℃生長。當(dāng)通過錐蟲藍染色(感染后大約120-144小時)確定培養(yǎng)物達到20％活細胞時，以3000×g離心收獲病毒培養(yǎng)物，將其分配到50ml無菌管中，將一半管貯存于4℃，而其余管貯存于-80℃。然后，用這種所收獲的500ml高滴度(＞1×108pfu/ml)病毒原液感染High-5昆蟲細胞，以供免疫球蛋白生產(chǎn)用。用Baculovirus Rapid Titer Kit(桿狀病毒快速滴度試劑盒)(Clontech，Palo Alto，CA)測定病毒滴度(pfu/ml)。
d.High-5昆蟲細胞中Id的生產(chǎn)與Sf9細胞相比，High-5昆蟲細胞(BTI-TN-5B1-4)分泌更高水平(2-20×)的重組免疫球蛋白，選擇High-5昆蟲細胞用于嵌合蛋白生產(chǎn)。將對數(shù)早期的High-5細胞(1.0-2.0×106細胞/ml)以5×105細胞/ml接種到具有通氣封口(vented closure)的1升一次性培養(yǎng)瓶中的ESF921培養(yǎng)基(Expression Systems LLP)中。培養(yǎng)瓶于28℃以140-150rpm振搖，在規(guī)定時間內(nèi)調(diào)節(jié)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的體積，使其不超過500ml。當(dāng)細胞密度在500ml培養(yǎng)基中達到1.5-2.5細胞/ml時，用高滴度重組桿狀病毒原液，以大約0.5∶1(pfu細胞)的感染復(fù)數(shù)(MOI)感染培養(yǎng)瓶中細胞。然后將培養(yǎng)瓶于28℃以140-150rpm振搖；感染后96小時收獲培養(yǎng)物。5.包含VH免疫球蛋白和VL免疫球蛋白的嵌合蛋白的純化通過以大約5,000×g離心60分鐘，然后通過0.2μPES無菌過濾裝置過濾，除去細胞和碎片。通過用A蛋白High-Trap柱(AmershamPharmacia，Piscataway，NJ)親和色譜，從澄清的組織培養(yǎng)基中純化嵌合蛋白，然后利用FPLC技術(shù)(Amersham Pharmacia)進行離子交換色譜。純化的嵌合蛋白經(jīng)過大小分離，然后通過FPLC色譜法以交換到緩沖液PBS中。蛋白純化所用的所有試劑都是USP生物技術(shù)級(GenAr，Mallinckrot Baker，Parris，KY)，內(nèi)毒素由生產(chǎn)商檢驗。用無菌USP級水制備所有緩沖液和其它溶液。緩沖液和其它溶液在生物安全櫥中制備，并且通過0.2μm PES過濾裝置過濾除菌。
a.嵌合蛋白的A蛋白Sepharose親和純化從生長中的培養(yǎng)瓶中取出組織培養(yǎng)基，以5,000×g離心60分鐘以沉淀細胞和碎片。用0.2μPES過濾裝置，將上清液過濾除菌。加入Tris緩沖液(1M，pH7.4)至經(jīng)過濾的含有VH和/或VL-免疫球蛋白嵌合蛋白的培養(yǎng)基中至終濃度為20mM。將緩沖的組織培養(yǎng)上清液上樣至帶有一個P1蠕動泵的5ml HighTrap重組A蛋白Sepharose親和柱(Amersham Pharmacia)，流速為1-5ml/min，在干凈的燒瓶中收集流通液(flow-through)。柱子用25mlPBS(pH7.4)以5ml/min洗滌。逆轉(zhuǎn)流向，柱子用另外25mlPBS洗滌。用0.05M檸檬酸(pH3.5)以1ml/min反向洗脫柱子，收集各1ml的流分?？梢砸韵嗤绞绞褂冒ǖ幌抻贕蛋白、L蛋白或能夠與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的任何蛋白的其它蛋白柱。
b.離子交換色譜5ml High Trap SP Sepharose陽離子交換柱用50ml 25mM檸檬酸(pH3.5)和20mM NaCl平衡。用蠕動泵將A蛋白洗脫的VH和/或VL-IgG嵌合蛋白直接上樣至平衡的High Trap SPSepharose柱上，流速為1ml/min。該柱用25ml50mM檸檬酸(pH3.5)和20mM NaCl(緩沖液A)以2ml/min洗滌。該柱用線性梯度(0％緩沖液B至100％緩沖液B)以1ml/min洗脫，收集各1ml的流分。(緩沖液B＝100mM碳酸鈉(pH10.0)和1M NaCl)。所述離子交換洗脫的含有VH和/或VL-IgG嵌合蛋白的流分通過分光光度法根據(jù)其OD280進行分析。合并峰流分。
c.大小排阻色譜然后將得自SP離子交換的混合Ig流分上樣至Hi Prep Sephacryl 26/60 S200 Hi Resolution column(高分辨柱)(Pharmacia)上，該柱已經(jīng)在用100ml無菌水中預(yù)洗滌后，用5倍體積PBS(pH7.2)平衡。將嵌合Ig蛋白以0.5ml/min的流速洗脫到PBS中，以1ml的流分收集。Ig主峰是，合并，通過0.2μ濾器過濾除菌。6.獨特型蛋白和匙孔血藍蛋白(KLH)綴合在純化所述獨特型蛋白后，將其通過戊二醛交聯(lián)與GMP級KLH(VACMUNE，Biosyn Corporation)綴合。將如上所述的至少5mg純化的無菌獨特型蛋白與等量的KLH在15ml無菌圓錐形管中混合，用PBS將終體積調(diào)至9ml。滴加1ml 1％戊二醛(25％1級水溶液，Sigma)至終濃度為0.1％。然后于室溫下將管緩慢搖動4小時。綴合物在無菌DispoDialyzers(Spectrum Labs)中對2升無菌PBS透析，在至少24小時內(nèi)在生物安全通風(fēng)櫥中更換3次緩沖液。從透析室中無菌取出PBS中的最終IgG/KLH綴合物，將其轉(zhuǎn)移至一個無菌管中，混合，然后等份分裝到管形瓶中。給終產(chǎn)物的每個管形瓶標(biāo)上批號、患者標(biāo)識號、瓶號和裝瓶日期。用最后一批管形瓶中的10％檢驗無菌情況，測試管形瓶中內(nèi)毒素的存在。保留一個管形瓶以用于存檔。7.產(chǎn)品檢驗a.含桿狀病毒DNA序列的生產(chǎn)批料上清液收獲1ml等份的被感染昆蟲細胞生產(chǎn)培養(yǎng)物上清液樣品，通過在臺式離心機中以3000rpm離心5分鐘除去細胞碎片。將至少0.1ml這種含有桿狀病毒顆粒的澄清上清液以1∶9的體積比與裂解緩沖液(10mM Tris pH8.3，50mM KCl，0.1mg/ml明膠，0.45％ Nonidet P-40和0.45％ Tween-20)混合，用蛋白酶K(終濃度60μg/ml)于60℃蛋白水解1小時，然后于95℃15分鐘使蛋白酶K變性。然后將25μl這種裂解液與另外25μl含有每種dNTP各400μM、5mM MgCl2、25pmol正向和反向寡核苷酸引物(參見表3；對于VH鑒定為SEQ ID NO34和SEQ ID NO31，而對于VL鑒定為SEQ ID NO35和SEQ ID NO36)和2.5U Taq聚合酶(Roche)的上述裂解緩沖液混合。VLPCR的循環(huán)條件是最初于92℃變性2分鐘，然后是92℃、58℃和72℃各1分鐘的40個循環(huán)，以及于72℃7分鐘的最后延伸。對于VHPCR而言，循環(huán)條件相同，只是退火溫度為64℃。對PCR產(chǎn)物根據(jù)預(yù)期大小進行評價，并通過瓊脂糖凝膠電泳進行定量。隨后，用兩種或更多種嵌套引物對PCR產(chǎn)物直接測序。(參見表3；對于VH鑒定為SEQ ID NO30和SEQ ID NO34，對于Vκ鑒定為SEQ ID NO28和SEQ ID NO35，而對于Vλ鑒定為SEQ ID NO88和SEQ ID NO35。)用OpenGene Automated DNA Sequencing System(自動DNA測序系統(tǒng))(Visible Genetics)和序列分析軟件，如上所述測定完整的VH和VL核苷酸序列，并且與pTRABac(NHL-FV-8786-XXX)載體中對應(yīng)于患者獨特型的V基因序列進行比較。
b.Superose6凝膠過濾色譜法進行純化Id的凝膠過濾色譜，以評價蛋白純度。用Superose6 HR 10/30 FPLC柱(AmershamPharmacia)，用PBS作為液相，進行凝膠過濾色譜法。用FPLC軟件對20個最大的峰進行峰積分，采用以下標(biāo)準(zhǔn)從面積評價中排除所包括的高度小于0.1Au、寬度小于0.05ml、面積小于0.01Au/ml的峰。收集分次柱洗脫的流分，通過捕獲ELISA評價其人免疫球蛋白比活，將其與OD280色譜圖進行比較。
c.免疫球蛋白測定；抗人IgG ELISA微量滴定板的各孔用100μl3μg/ml山羊抗人IgG重鏈特異性抗體(Roche)在碳酸鹽緩沖液中的稀釋液于4℃包被過夜，用100μl TBS(50mM Tris，150mM NaCl，pH7.5)洗滌2次。各孔用200μl TBSB(TBS+1％BSA)于22℃封閉1小時。
測試TBSB中對應(yīng)于人峰的每個色譜圖部分。將100μl稀釋的樣品以2倍連續(xù)稀釋液以雙份重復(fù)加入到各孔中，于22℃保溫1小時。用純化的人IgG1/κ或IgG1/λ標(biāo)準(zhǔn)(Sigma，St.Louis，MO)重復(fù)所述測定。各孔用200μl TBST(TBS+0.1％Tween20)洗滌4次。檢測抗體在TSBS中以1∶2000稀釋(山羊抗人κ或λ-HRP(Fischer，Pittsburgh，PA))，加入100μl至各孔中并于22℃保溫1小時。各孔用200μl TBST洗滌6次。加入100μl底物(TMB 1組分，KPL Inc.，Gaithersburg，MD)至各孔中，顯色30分鐘，然后于OD620分析。
d.獨特型蛋白釋放標(biāo)準(zhǔn)(1)來自生產(chǎn)上清液的桿狀病毒中獨特型可變區(qū)基因的DNA序列必需與所述生產(chǎn)載體中的所述DNA序列相同。(2)所述獨特型蛋白的濃度基于OD280高于0.5mg/ml。(3)在Superose6分析型色譜法中，主峰面積大于所評價峰面積的90％。(4)色譜圖主峰對應(yīng)于人IgGκ(或λ)ELISA活性峰。
通過動態(tài)濁度小平板測定或者鱟變形細胞溶解物(LAL)測定，測試最終疫苗制品Id-KLH的內(nèi)毒素水平，其水平低于350內(nèi)毒素單位(EU)/ml。用一個14天試驗，測試該批的10％制品的無菌情況，試驗為陰性，否則將其棄去。
表3顯示了用于確立終產(chǎn)物身份的引物序列的概述。
8.應(yīng)用本發(fā)明嵌合蛋白治療非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤從一位非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤患者獲得VH和VL區(qū)。用上述5’RACE法，克隆編碼這些區(qū)的基因，按本發(fā)明的方法將其插入到所述表達載體中并使其表達。表5有所述表達載體所用的Vh和Vl區(qū)的DNA序列。用于克隆的Apa I和Dra III位點以下劃線表示。表5得自一位患者的可變區(qū)序列。VH A/07GACATGTTGTTGGTGGAATCGGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCGGGGGAGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTGGCCTCTAGATTCACCTTTAGAACGTTTTGGATGACCTGGGTCCGCCAACTTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAATATAAATCAAGATGGCAGTCAGACGTATCATGCGGACTCTGTAAAGGGCCGATTTACCATCTCCAGAGACAACGGCAGGAACTCCCTATTTTTACAAATGACAAGTCTGAGAGTCGCGGACACGGCTATATATTACTGTGCGACTAATGAAACGTCCAGTGGCCTGGACTGCTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACTGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCSEQ ID NO86VK A/L6GAAATCGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTCGTCTCCAGGAGACAGAGTCGCCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTAAGAAGTTACTTAAGTTGGTATCAACAGAAGGCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCCATAATGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCGCCCAGATTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGTCGCCTAGAGACTGAAGATGCTGCAGTTTATTACTGTCAGCAACTTTATTTCTGGCCTCCGATATTATTTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGAATATCACACGAACTGTGGCTGCACCAAGTGSEQ ID NO87將根據(jù)以上詳述的遺傳信息產(chǎn)生的該患者的分離重組的免疫球蛋白嵌合蛋白與KLH綴合，并且如上所述在6個月期間與GM-CSF一起給予5次。在給予該治療之前和9個月之后，對該患者的頸部和骨盆區(qū)域進行CT掃描。6個腫瘤塊直徑總和的比較表明，在治療開始后9個月降低60％。(請注意，這些圖未調(diào)整以使其適合該疾病診斷之前的淋巴結(jié)大小(參見Cheson等，J.Clin.Oncol.，17(4)1244，1999.)表6治療后淋巴結(jié)大小的減小。
權(quán)利要求
1.一種改變患者的B細胞介導(dǎo)病理的方法，所述方法包括給予一種包含嵌合蛋白的組合物；所述嵌合蛋白包含VH區(qū)或VL區(qū)的至少一部分和免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分；其中所述VH區(qū)或VL區(qū)與來自具有所述B細胞介導(dǎo)病理的所述患者的B細胞克隆相關(guān)；并且所述組合物的所述給予改變所述患者的所述B細胞介導(dǎo)病理。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物還包含第二種嵌合蛋白，所述第二種嵌合蛋白包含VH區(qū)或VL區(qū)的至少一部分和第二種免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)包含人IgGγ1恒定區(qū)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述VH區(qū)或VL區(qū)是VH區(qū)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述VH區(qū)或VL區(qū)是VL區(qū)。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述第一種嵌合蛋白的所述VH區(qū)或VL區(qū)包含VH區(qū)，而所述第二種嵌合蛋白包含VL區(qū)。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所述第二種免疫球蛋白恒定區(qū)包含人κ或λ恒定區(qū)。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述VH區(qū)或VL區(qū)是完整的可變區(qū)。
9.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述VL區(qū)是完整的可變區(qū)。
10.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述第一種或第二種免疫球蛋白的恒定區(qū)選自人IgGγ1恒定區(qū)、人IgGγ2恒定區(qū)、人IgGγ3恒定區(qū)、人IgGγ4恒定區(qū)、人IgA1恒定區(qū)、人IgA2恒定區(qū)、人IgM恒定區(qū)、人IgD恒定區(qū)、人IgE恒定區(qū)、人κ鏈恒定區(qū)和人λ鏈恒定區(qū)。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述嵌合蛋白通過包括下述步驟的方法生產(chǎn)從具有所述B細胞介導(dǎo)病理的所述患者的B細胞中分離出編碼VH區(qū)或VL區(qū)的至少一部分的基因；將編碼所述VH區(qū)或VL區(qū)的所述基因和編碼所述免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分的基因插入到表達載體中，以允許所述第一種嵌合蛋白表達；通過將所述表達載體導(dǎo)入昆蟲細胞系中，生產(chǎn)所述嵌合蛋白；并且分離所述嵌合蛋白。
12.權(quán)利要求11的方法，所述方法還包括下述步驟將編碼VH區(qū)或VL區(qū)的至少一部分的基因和編碼第二種免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分的基因插入到所述表達載體中，以允許所述第二種嵌合蛋白表達。
13.權(quán)利要求11或12的方法，所述方法還包括將所述嵌合蛋白與載體蛋白綴合的步驟。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述載體蛋白是匙孔血藍蛋白(KLH)。
15.權(quán)利要求1的方法，其中還將所述組合物與細胞因子或趨化因子一起共同給予。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述細胞因子是粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述趨化因子是單核細胞趨化蛋白3(MCR3)。
18.權(quán)利要求11的方法，其中所述表達載體是一種桿狀病毒表達載體。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述桿狀病毒表達載體包含蜜蜂蜂毒肽分泌信號序列和人胎盤堿性磷酸酶分泌信號序列。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述桿狀病毒表達載體還包含桿狀病毒AcNPV p10啟動子和AcNPV多角體蛋白啟動子，其中所述p10啟動子控制蜜蜂蜂毒肽分泌信號序列，并且其中所述多角體蛋白啟動子控制人胎盤堿性磷酸酶分泌信號序列。
21.權(quán)利要求20的方法，其中包含VH區(qū)和第一種免疫球蛋白恒定區(qū)的嵌合蛋白的編碼基因在所述桿狀病毒表達載體中受所述p10啟動子控制，包含VL區(qū)和第二種免疫球蛋白恒定區(qū)的嵌合蛋白的編碼基因在所述桿狀病毒表達載體中受多角體蛋白啟動子控制。
22.權(quán)利要求20的方法，其中包含所述VH區(qū)或VL區(qū)的所述基因和編碼所述免疫球蛋白恒定區(qū)的所述基因，在所述桿狀病毒表達載體中或者受所述p10啟動子的控制，或者受所述多角體蛋白啟動子控制。
23.權(quán)利要求11的方法，其中編碼所述免疫球蛋白恒定區(qū)的所述基因是人IgGγ1基因。
24.權(quán)利要求12的方法，其中編碼所述第二種免疫球蛋白恒定區(qū)的所述基因是編碼人κ或λ恒定區(qū)的基因。
25.權(quán)利要求11或12的方法，其中編碼所述免疫球蛋白恒定區(qū)的所述基因選自人IgGγ1恒定區(qū)、人IgGγ2恒定區(qū)、人IgGγ3恒定區(qū)、人IgGγ4恒定區(qū)、人IgA1恒定區(qū)、人IgA2恒定區(qū)、人IgM恒定區(qū)、人IgD恒定區(qū)、人IgE恒定區(qū)、人κ鏈恒定區(qū)和人λ鏈恒定區(qū)。
26.權(quán)利要求11的方法，其中所述嵌合蛋白選自包含所述VH區(qū)和人IgGγ1恒定區(qū)的蛋白；包含所述VL區(qū)和人κ鏈恒定區(qū)的蛋白；和包含所述VL區(qū)和人λ鏈恒定區(qū)的蛋白。
27.權(quán)利要求12的方法，其中所述第一種和第二種嵌合蛋白包括包含所述VH區(qū)和人IgGγ1恒定區(qū)的蛋白；和包含所述VL區(qū)和人κ或λ鏈恒定區(qū)的蛋白。
28.權(quán)利要求11的方法，其中所述昆蟲細胞系是粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)(Hi-5)或草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(sf9)細胞系。
29.權(quán)利要求11或12的方法，其中通過ELISA分析所述嵌合蛋白的表達。
30.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述嵌合蛋白用選自A蛋白、G蛋白、L蛋白和能夠與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的其它蛋白的蛋白來分離。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述能夠結(jié)合免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的其它蛋白是一種抗免疫球蛋白抗體。
32.權(quán)利要求1的方法，其中所述B細胞介導(dǎo)病理是一種B細胞淋巴瘤。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述B細胞淋巴瘤是頑固性低級淋巴瘤或濾泡性B細胞淋巴瘤。
34.一種用于改變患者的B細胞介導(dǎo)病理的組合物，所述組合物包含嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含與免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分連接的VH區(qū)或VL區(qū)的至少一部分，其中所述VH區(qū)或VL區(qū)與來自具有所述B細胞介導(dǎo)病理的所述患者的B細胞克隆相關(guān)。
35.一種權(quán)利要求34的組合物，所述組合物還包含第二種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含VH區(qū)或VL區(qū)可變區(qū)的至少一部分和第二種免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分，其中所述可變區(qū)與來自具有所述B細胞介導(dǎo)病理的所述患者的B細胞克隆相關(guān)。
36.權(quán)利要求34或35的組合物，其中所述嵌合蛋白按照權(quán)利要求13或14生產(chǎn)。
37.權(quán)利要求34或35的組合物，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)選自人IgGγ1恒定區(qū)、人IgGγ2恒定區(qū)、人IgGγ3恒定區(qū)、人IgGγ4恒定區(qū)、人IgA1恒定區(qū)、人IgA2恒定區(qū)、人IgM恒定區(qū)、人IgD恒定區(qū)、人IgE恒定區(qū)、人κ鏈恒定區(qū)和人λ鏈恒定區(qū)。
38.權(quán)利要求34的組合物，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)是與所述VH區(qū)在操作上連接的人IgGγ1恒定區(qū)。
39.權(quán)利要求34的組合物，其中所述免疫球蛋白恒定區(qū)是與所述VL區(qū)在操作上連接的人κ或λ恒定區(qū)。
40.權(quán)利要求35的組合物，其中所述第一種和第二種嵌合蛋白是與人IgGγ1恒定區(qū)在操作上連接的所述VH區(qū)和與人κ或λ恒定區(qū)在操作上連接的所述VL區(qū)。
41.權(quán)利要求34或35的組合物，所述組合物還包含一種載體蛋白。
42.權(quán)利要求41的組合物，其中所述載體蛋白是匙孔血藍蛋白(KLH)。
43.權(quán)利要求34或35的組合物，還將所述組合物與細胞因子或趨化因子一起共同給予。
44.權(quán)利要求43的組合物，其中所述細胞因子是粒細胞-巨噬細胞-CSF。
45.權(quán)利要求43的組合物，其中所述趨化因子是單核細胞趨化蛋白3(MCP3)。
46.權(quán)利要求34或35的組合物，其中所述組合物是一種疫苗。
47.權(quán)利要求34的組合物，其中所述B細胞介導(dǎo)病理是一種B細胞淋巴瘤。
48.權(quán)利要求47的組合物，其中所述B細胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤。
49.權(quán)利要求47的組合物，其中所述B細胞淋巴瘤是頑固性低級B細胞淋巴瘤或濾泡性B細胞淋巴瘤。
50.權(quán)利要求34的組合物，所述組合物還通過注射、吸入、口服或經(jīng)皮給藥來給予。
51.權(quán)利要求34的組合物，其中所述B細胞介導(dǎo)病理是選自以下的自身免疫病多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、抗Hu相關(guān)性副腫瘤性神經(jīng)病綜合征、自身免疫性肝炎、I型糖尿病、自身免疫性甲狀腺炎和硬皮病。
52.一種表達載體，所述表達載體包含(a)編碼VL區(qū)一部分和κ輕鏈編碼基因一部分的嵌合基因，所述VL區(qū)一部分和κ輕鏈編碼基因一部分都與人胎盤堿性磷酸酶分泌信號序列和多角體蛋白啟動子在操作上連接，和(b)編碼VH區(qū)一部分和IgG1重鏈一部分的嵌合基因，所述VH區(qū)一部分和IgG1重鏈一部分都與蜜蜂蜂毒肽分泌信號序列和P10啟動子在操作上連接。
53.一種桿狀病毒表達載體，所述桿狀病毒表達載體包含(a)編碼VL區(qū)一部分和κ輕鏈編碼基因一部分的嵌合基因，所述VL區(qū)一部分和κ輕鏈編碼基因一部分都與人胎盤堿性磷酸酶分泌信號序列和多角體蛋白啟動子在操作上連接，和(b)編碼VH區(qū)一部分和IgG1重鏈一部分的嵌合基因，所述VH區(qū)一部分和IgG1重鏈一部分都與蜜蜂蜂毒肽分泌信號序列和P10啟動子在操作上連接。
54.一種表達載體，所述表達載體包含(a)與人胎盤堿性磷酸酶分泌信號序列和多角體蛋白啟動子在操作上連接的κ輕鏈恒定區(qū)編碼基因的一部分，(b)與蜜蜂蜂毒肽分泌信號序列和P10啟動子在操作上連接的IgG1重鏈恒定區(qū)編碼基因的一部分。
55.一種表達載體，所述表達載體包含(a)與人胎盤堿性磷酸酶分泌信號序列和多角體蛋白啟動子在操作上連接的λ輕鏈恒定區(qū)編碼基因的一部分，(b)與蜜蜂蜂毒肽分泌信號序列和P10啟動子在操作上連接的IgG1重鏈恒定區(qū)編碼基因的一部分。
56.一種載體，所述載體包含SEQ ID NO6中所述的核酸序列。
57.一種載體，所述載體包含SEQ ID NO7中所述的核酸序列。
58.一種載體，所述載體包含SEQ ID NO89中所述的核酸序列。
59.一種載體，所述載體包含SEQ ID NO90中所述的核酸序列。
60.一種載體，所述載體包含SEQ ID NO91中所述的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于改變患者的B細胞介導(dǎo)病理的方法。該方法包括給予包含至少一種和/或兩種嵌合蛋白質(zhì)的組合物。每種嵌合蛋白質(zhì)包含得自具有B細胞介導(dǎo)病理的患者的特定B細胞的免疫球蛋白分子的或者V
文檔編號C07K19/00GK1468123SQ01817065
公開日2004年1月14日 申請日期2001年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月11日
發(fā)明者D·P·戈德, R·J·肖佩斯, D P 戈德, 肖佩斯 申請人:法弗里爾公司