專利名稱：蛋白質(zhì)純化及回收方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)工程領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種改進的生物化學(xué)回收方法，通過該方法可以使重組干擾素β以相當(dāng)高的純度和單體形式重折疊和回收。該組分可用于藥物制劑。
背景技術(shù)：
天然產(chǎn)生的干擾素是種屬特異性的蛋白質(zhì)，通過病毒、雙鏈RNA、其他多核苷酸、抗原及促分裂原的誘導(dǎo)后各種細胞可以產(chǎn)生干擾素。干擾素具有多種生物活性，包括抗病毒、抗增殖、免疫調(diào)節(jié)以及抗細胞活性。通過對這些活性的研究至少可以鑒定出三種不同類型的人源干擾素，文獻報道，這三類干擾素是由性質(zhì)不同的結(jié)構(gòu)基因編碼的不同蛋白質(zhì)。干擾素多為糖蛋白，最初是根據(jù)其細胞來源進行分類的，后來重新分類為α、β和γ。
干擾素β(“IFN-β”)由成纖維細胞和上皮細胞產(chǎn)生。天然的干擾素β是通過多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸誘導(dǎo)培養(yǎng)人成纖維細胞產(chǎn)生的，再經(jīng)過色譜及電泳技術(shù)進行分離和純化。用這種方法純化的干擾素價格昂貴而且困難，因而阻礙了對其治療效果進行廣泛的臨床實驗和評價。從天然來源中分離干擾素仍是相當(dāng)困難和昂貴的。
最近用重組DNA(“rDNA”)技術(shù)克隆了幾種人源干擾素基因，并且在大腸桿菌中表達(Nagola等(1980)Nature 284316；oeddel等(1980)Nature 287411；Yelverton等(1981)Nucleic Acids Res.9731；Streuli等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782848)。具有天然干擾素β樣性質(zhì)的蛋白質(zhì)或多肽也可以利用重組DNA技術(shù)通過如下步驟制備，首先從病毒誘導(dǎo)的人源細胞中提取富含聚腺苷酸的12S的信使RNA，然后以信使RNA為模板合成雙鏈cDNA，將cDNA引入合適的克隆載體，用載體轉(zhuǎn)化合適的微生物，收獲微生物并從中提取干擾素β。例如歐洲專利申請28033號(1981年5月6日出版)、32134號(1981年7月15日出版)和34307號(1981年8月26日出版)描述了多種利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)干擾素β的方法。從重組DNA克隆中表達的蛋白質(zhì)或多肽已經(jīng)純化和檢測，發(fā)現(xiàn)具有和天然干擾素相似的性質(zhì)。因而細菌產(chǎn)生的干擾素具有潛在的抗病毒和抗腫瘤藥物的治療用途。通過這種細菌發(fā)酵可以以相對低的成本制備大量的干擾素，因此使干擾素可以有更廣泛的應(yīng)用，比如臨床研究。
用于臨床研究的干擾素β必須具有相當(dāng)高的純度，不被有毒的宿主細胞成分、細胞碎片以及其他在提取和純化步驟引入的外源性化學(xué)物質(zhì)所污染。目前有幾種方法用于制備、回收和純化干擾素β。
美國專利4,462,940和5,702,699號所公開的純化和回收干擾素β的方法及其他相似的方法可以制備純態(tài)的干擾素β，這種干擾素β在沒有強溶解劑如十二烷基磺酸鈉(“SDS”)存在的條件下趨向于形成凝聚體。另外，上述方法是將蛋白質(zhì)暴露于高pH值條件下，這種條件(1)有可能對蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生不制影響，(2)導(dǎo)致組合物中含有在純化過程中用于溶解蛋白質(zhì)的殘留量的SDS。
因此，需要改進回收和純化過程以避免IFN-β處于高堿性狀態(tài)下，制劑不含有或基本不含有SDS，蛋白質(zhì)在適合腸外給藥的pH下溶解。本發(fā)明的目的在于提供藥學(xué)上可接受的IFN-β樣品，它具有相當(dāng)高的純度并且在純化和回收過程中易于重折疊。
發(fā)明概要本發(fā)明提供可用于制備IFN-β藥物制劑的改進方法。此方法可提供含有IFN-β的單體的、液體的藥物組合物。此方法包括增強蛋白質(zhì)在回收過程中重折疊的條件。
為了達到上述及其他目標以及與在此廣泛描述的本發(fā)明的目的相適應(yīng)，本發(fā)明提供了一種改進的方法用于純化和回收IFN-β。其實施例之一是，改進的方法包括制備一種含有IFN-β的溶液，從這種溶液中分離出大體上純化的IFN-β庫，用酒精將純化的IFN-β從庫中沉淀下來，將沉淀的IFN-β溶解到鹽酸胍中形成含有再增溶變性的IFN-β的溶液。然后將含有再增溶變性的IFN-β的溶液稀釋到合適的第一緩沖液中，得到含有再增溶變性的IFN-β的溶液；然后所得到的溶液滲濾或透析到藥學(xué)上可接受的緩沖液中。這最后一步除去殘存的鹽酸胍，得到含有實質(zhì)為單體的IFN-β的、適合腸外給藥的藥物制劑。
在另一個實施例中，純化和回收IFN-β的改進方法包括獲得大體上純化的IFN-β樣品，并將此樣品與鹽酸胍混合得到含有增溶變性的IFN-β的溶液，然后將此含有增溶變性的IFN-β的溶液稀釋到合適的第一緩沖液中，獲得含增溶復(fù)性的IFN-β的溶液。然后將得到的增溶復(fù)性的IFN-β溶液滲濾或透析到藥學(xué)上可接受的緩沖液中。如上所述，這最后一步除去殘存的鹽酸胍，得到含有實質(zhì)為單體的IFN-β的、適合腸外給藥的藥物制劑。
本發(fā)明的另一方面涉及改善微生物產(chǎn)生IFN-β的回收過程。利用本發(fā)明的方法，有可能制備不含或?qū)嵸|(zhì)不含SDS(＜10微克SDS/每毫克IFN-β)的IFN-β藥物制劑。本發(fā)明的另一方面是利用本發(fā)明所描述的方法不需要某些物質(zhì)如人血清白蛋白(HAS)來穩(wěn)定IFN-β的制備。大體上為單體形式的IFN-β可以稀釋到水相緩沖液中用藥物制劑。因此，本方法可用于制備本發(fā)明的藥物組合物。
附圖簡要說明
圖1顯示在鹽酸胍增溶步驟IFN-β稀釋到不同緩沖液中后收集的HPLC色譜數(shù)據(jù)。
圖2顯示鹽濃度及pH值對從4M鹽酸胍、10mM磷酸鈉、pH7.0的緩沖液中回收IFN-β的影響。
圖3顯示Tween80對根據(jù)本發(fā)明所述方法制備的復(fù)性IFN-β凝聚的影響。
發(fā)明的詳細描述本發(fā)明涉及一種新的制備實質(zhì)單體形式的IFN-β的方法。所謂“實質(zhì)單體”是指存在于制備物或組合物中的大多數(shù)IFN-β(重量計)是單體的而不是凝聚的?！澳邸笔侵付嚯姆肿又g通過物理相互作用而形成非共價多聚物，這些多聚物可能是可溶性的，也可能從溶液中沉淀出來。在實質(zhì)單體組合物或制劑中單體態(tài)IFN-β所占的百分比(重量百分比)可以51％不等或更大。本發(fā)明所提供的制備含有實質(zhì)單體IFN-β組合物的方法不使用傳統(tǒng)的穩(wěn)定劑HSA，所得到的組合物不含或基本不含增溶劑十二烷基磺酸鈉(SDS)(即含＜10微克SDS/每毫克IFN-β)。因而，這些含有實質(zhì)單體IFN-β的組合物適合用于制備藥物或治療制劑。IFN-β多肽的單體形式仍是可溶的，因此據(jù)說“可溶于”本發(fā)明的藥物組合物中。綜上所述，本發(fā)明提供了不含HSA、不含SDS的IFN-β藥物組合物，該組合物包括至少約51％的單體形式IFN-β，而不是其凝聚形式，優(yōu)選至少約55％、60％、65％、70％、80％、85％單體形式IFN-β的組合物，更優(yōu)選至少約90％或更高單體形式IFN-β的組合物。
在本發(fā)明的一個實施例中，含有實質(zhì)單體IFN-β的組合物由如下方法制備從溶液中沉淀基本上純化的IFN-β，經(jīng)過鹽酸胍溶解將沉淀重懸浮，過濾除去IFN-β初樣品中殘存的SDS，然后將得到的鹽酸胍-IFN-β溶液用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋使IFN-β復(fù)性?！皩嵸|(zhì)純化”是指原材料中的IFN-β大體上或基本上不含有某些組分，這些組分在天然存在環(huán)境即生產(chǎn)重組IFN-β所用的天然細胞或宿主細胞中通常與蛋白質(zhì)伴隨或相互作用。大體上不含細胞組分的IFN-β多肽包括制備的蛋白質(zhì)中雜蛋白的比例少于約30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％(干重)。當(dāng)IFN-β多肽或其他生物活性變體通過重組技術(shù)制備后，優(yōu)選的是培養(yǎng)基中化學(xué)前體或感興趣的非蛋白化學(xué)物質(zhì)所占比例少于約30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％(干重)。因此，本發(fā)明所述方法中所用的“基本上純化的IFN-β”是指通過SDS/PAGE分析至少有約70％純度，優(yōu)選是至少75％、80％、85％純度，更優(yōu)選是至少90％或更高的純度。
在另外一個實施例中，含實質(zhì)單體IFN-β的組合物的制備不需要上述的沉淀步驟。這種方法是將含有基本上純化的IFN-β的樣品與鹽酸胍混合得到含有增溶變性的IFN-β的溶液，然后將得到的鹽酸胍-IFN-β溶液用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋使IFN-β復(fù)性。這些制備步驟的衍生結(jié)果是含有實質(zhì)單體IFN-β的組合物的基礎(chǔ)，也是制備含有實質(zhì)單體IFN-β的可注射制劑方法的基礎(chǔ)，這種制劑可用于IFN-β反應(yīng)性疾病的IFN-β治療。
這里所用的術(shù)語“IFN-beta”或“IFN-β”是指干擾素β及其變體，有時是指干擾素β樣多肽。例如，人IFN-β變體可以指天然產(chǎn)生的(即IFN-β位點上的等位基因變體)或重組制備的蛋白質(zhì)，具有與成熟的天然的人IFN-β相同類似或?qū)嵸|(zhì)類似的氨基酸序列。保留其活性的IFN-β片段或IFN-β的截短形式也被稱作“IFN-beta”或“IFN-β”。這些具有生物活性的IFN-β片段或截短形式是通過本領(lǐng)域已知的重組βNA技術(shù)除去全長IFN-β氨基酸序列上的氨基酸殘基而得到的。IFN-β多肽可以是糖基化的(IFN-β-1a)，也可以是非糖基化的(IFN-β-1b)。文獻報道糖基化和非糖基化的IFN-β具有相同的特異活性，因而與糖基部分無關(guān)，且不影響IFN-β的生物活性。
這里所指的IFN-β變體包括天然成熟IFN-β序列的各種突變蛋白質(zhì)(例如美國專利號5,814,485，參考文獻已列出)，其中一個或多個對生物活性不是必需的半胱氨酸殘基已被故意刪除或被其他氨基酸替代以除去分子間交聯(lián)或形成錯誤的分子間二硫鍵的位點。這種類型的IFN-β變體包括那些用甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸替代成熟天然IFN-β氨基酸序列上的17位半胱氨酸的IFN-β。絲氨酸和蘇氨酸是較佳的替代氨基酸，因為其化學(xué)結(jié)構(gòu)與半胱氨酸相似，而絲氨酸取代是最佳的。例如，有一個IFN-β變體就是用絲氨酸替代成熟天然IFN-β氨基酸序列上的17位半胱氨酸的(美國專利5,814,485號)。17位半胱氨酸也可以采用本領(lǐng)域的已知方法刪除(例如美國專利5,814,485號，參考文獻已列出)，得到一個比天然成熟IFN-β短一個氨基酸的成熟IFN-β。另見美國專利4,530,787和4,572,798以及4,588,585號。因此，本發(fā)明也包括具有一個或多個突變的并且有助于提高其藥物用途的IFN-β變體。
熟練的技術(shù)人員將知道通過突變編碼IFN-β的核苷酸序列可引入額外的變化，從而導(dǎo)致IFN-β氨基酸序列的改變，不改變干擾素的生物學(xué)活性。通過從編碼天然IFN-β的相應(yīng)核酸序列上引入一個或多個核苷酸取代、添加或缺失可以得到與天然IFN-β氨基酸序列不同的編碼IFN-β變體的分離的核酸分子，這樣一個或多個氨基酸取代、添加或缺失引入編碼的IFN-β中。突變可以通過標準技術(shù)如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變來實現(xiàn)。這種IFN-β變體也包括在本發(fā)明中。
例如，保守氨基酸的取代可以在一個或多個預(yù)測的非必需氨基酸殘基上進行。這里所說的“非必需氨基酸”殘基是指在這個殘基上對野生型IFN-β序列進行改變不會改變其生物活性，而必需氨基酸殘基則是生物活性所必需的?！氨Ｊ匕被崛〈笔侵赣镁哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基來替代原來的氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族已在本領(lǐng)域中定義。這些家族包括具有以下側(cè)鏈的氨基酸堿性側(cè)鏈(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天冬氨酸、組氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)非極性側(cè)鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝側(cè)鏈(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香族側(cè)鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。這些取代無法在保守氨基酸殘基上進行，或者在保守基序內(nèi)無法存在氨基酸殘基。
另外，IFN-β核苷酸序列也可以通過在全長或部分IFN-β編碼序列上隨機突變獲得，如飽和誘變，所得到的突變體通過IFN-β生物活性篩選以鑒別保留生物活性的突變體。誘變后，所編碼的蛋白質(zhì)可以通過重組技術(shù)進行表達，蛋白活性則通過本發(fā)明所描述的標準分析技術(shù)測定。
具有生物學(xué)活性的IFN-β變體與參照IFN-β分子如天然人IFN-β相比一般至少是80％，更優(yōu)先是約90％到95％或更高，最優(yōu)選是約99％的氨基酸序列同一性，這里天然人IFN-β作為比較的基礎(chǔ)。這里所說的“序列同一性”是指當(dāng)變體的氨基酸序列的指定的相鄰區(qū)段與參照分子的氨基酸序列放在一起對比時，變體多肽與作為參照的多肽分子內(nèi)發(fā)現(xiàn)的相同氨基酸殘基。
為了達到兩個序列最佳排列以確定序列同一性的目的，變體的氨基酸序列的鄰近區(qū)段相對于參照分子的氨基酸序列來說可以含有額外的或刪除的氨基酸殘基。用于與參照氨基酸序列比較的相鄰區(qū)段至少有20個鄰近氨基酸殘基。通過分配間隙罰分方法來提高與變體氨基酸序列間隙相關(guān)的序列同一性的校正值。這種序列排列方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。
因此，可以利用數(shù)學(xué)算法則來確定任何兩個序列之間的百分比同一性。一種用于序列比較的優(yōu)選的、非限制性的數(shù)學(xué)算則是Myers/Millers算法(Comput.Appl.Biosci.411-7)。這種算法運用在ALIGN程序(2.0版本)中，它是GCG排列軟件包的一部分。在比較氨基酸序列時，PAM120重量殘基表、12間隙長度罰分以及間隙罰分或4可以和ALIGN程序一起使用。另外一種用于序列比較的優(yōu)選的非限制性數(shù)學(xué)算法是Karlin/Altschul算法(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877)，后來作者對運算法則作了改進(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877)，這種算法被運用到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中(1990，J.Mol.Biol.215403-410)。BLAST氨基酸序列搜索可以和XBLAST程序(分數(shù)＝50，字長＝3)一起進行得到與感興趣的多肽相似的氨基酸序列。為了獲得有間隙的排列以達到比較的目的，可以利用有間隙的BLAST(Altschul等1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)。另外，PSI-BLAST可用于進行整體搜索以檢測分子之間的遠緣關(guān)系。見Altschul等(1997)同上述。在運行BLAST、有間隙的T或PSI-BLAST程序時，可以使用默認參數(shù)，見網(wǎng)站ncbi.nlm.nih.gov。也可以參見LIGN程序(Dayhoff(1978)《蛋白質(zhì)序列與結(jié)構(gòu)圖集5附錄3》，醫(yī)藥研究基金，華盛頓特區(qū))以及Wisconsin序列分析程序包中的程序，第8版(從Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin得到)，例如GAP程序，其程序的默認參數(shù)已被利用。
在考慮氨基酸序列同一性百分比時，有些氨基酸殘基可能因為保守氨基酸取代而位置有差異，但這并不影響蛋白質(zhì)的功能特性。在這些情況下，序列同一性百分比可能要上調(diào)以適應(yīng)保守的取代氨基酸的相似性。這種調(diào)整在本領(lǐng)域是眾所周知的。如Myers和Miller(1988)Comput.Appl.Biosci.411-7。
本發(fā)明所涉及的生物活性的IFN-β變體應(yīng)保留IFN-β活性，特別是其與IFN-β受體結(jié)合的能力。IFN-β變體的生物活性可以通過已知的任何方法測定。這種分析方法的例子見于以下文獻報道Fellous等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA793082-3086；Czerniecki等(1984)J.Virol.49(2)490-496；Mark等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815662-5666；Branca等(1981)Nature 277221-223；Williams等(1979)Nature 282582-586；Herberman等(1979)Nature 277221-223以及Anderson等(1982)J.Biol.Chem.257(19)11301-11304。
本發(fā)明所涉及的IFN-β多肽以及IFN-β變體多肽的非限制性例子在以下文獻中有描述Nagata等(1980)Nature 284316-320；Goeddel等(1980)Nature287411-416；Yelverton等(1981)Nucleic Acids Res.9731-741；Streuli等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782848-2852；EP028033B1以及EP109748B1。也見于美國專利4,518,584；4,569,908；4,588,585；4,738,844；4,753,795；4,769,233；4,793,995；4,914,033；4,959,314；5,545,723以及5,814,485號。這些描述本文已納入作為參考。這些引用的文獻在IFN-β多肽的殘基和區(qū)域改變后不會喪失生物活性方面也為我們提供了指導(dǎo)。
這里所說的“重組制備的IFN-β”是指IFN-β具有和天然IFN-β類似的生物活性并且是通過重組DNA技術(shù)制備的。用含有編碼IFN-β多肽的核苷酸序列的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，然后培養(yǎng)這些細胞可以制備IFN-β。宿主細胞可以轉(zhuǎn)錄核苷酸序列并產(chǎn)生所需的蛋白，可以是原核細胞(如大腸桿菌)，也可以是真核細胞(如酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞)。重組生產(chǎn)IFN-β的例子見于以下文獻Mantei等(1982)Nature 297128；Ohno等(1982)Nucleic Acads Res.10967；Smith等(1983)Mol.Cell.Biol.32156以及美國專利號4,462,940；5,702,699和5,814,485；本文已納入作為參考。另外，美國專利號5,795,799描述的IFN-β-1a是在中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)中重組產(chǎn)生的；本文已納入作為參考。已采用重組DNA(rDNA)技術(shù)克隆了人源干擾素基因，并且在大腸桿菌中表達(Nagola等(1980)Nature 284316；Goeddel等(1980)Nature 287411；Yelverton等(1981)Nucleic Acids Res.9731；Streuli等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782848)。另外，IFN-β也可以通過轉(zhuǎn)基因動物或植物產(chǎn)生，即通過基因工程技術(shù)改造動物或植物使其表達感興趣的IFN-β蛋白，這些方法在本領(lǐng)域是已知的。
具有天然干擾素β樣性質(zhì)的蛋白質(zhì)或多肽也可以利用重組DNA技術(shù)通過以下步驟制備首先從病毒誘導(dǎo)的人源細胞中提取富含多聚腺苷酸的12S信使RNA，然后以信使RNA為模板合成雙鏈cDNA，將cDNA引入合適的克隆載體，用載體轉(zhuǎn)化合適的微生物，收獲微生物并從中提取干擾素β。例如歐洲專利申請28033號(1981年5月6日出版)、32134號(1981年7月15日出版)和34307號(1981年8月26日出版)描述了各種利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)干擾素β的方法。
另外，IFN-β也可以通過任何已知的肽合成技術(shù)進行化學(xué)合成。合成方法見如下例子Li等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802216-2220；Steward andYoung(1984)《固相肽合成》(SolidPhase Peptide Synthesis)，Pierce ChemicalCompany，Rochford，Illinois)；Baraney and Merrifield(1980)《肽分析、合成、生物學(xué)》(The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology，Gross andMeinhofer編，卷2(Academic Press，New York，1980)，3-254，討論固相肽合成技術(shù)；和Bodansky(1984)《肽合成的原理》(Prnciples of Peptide)Synthesis(Springer-Verlag，Berlin)以及Gross and Meinhofer編，(1980)《肽分析、合成、生物學(xué)》(The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology)，卷1(AcademicPress，New York)，討論經(jīng)典的溶液合成。也可利用同步多肽合成方法化學(xué)制備IFN-β，例子見Houghten(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825131-5135以及美國專利號4,631,211。
這里所描述的含有實質(zhì)單體IFN-β的組合物的制備優(yōu)先是按照本發(fā)明所提供的兩個改進純化方法之一進行。第一種純化方法包括以下三個基本步驟(1)IFN-β從含有基本上純化的IFN-β的溶液中沉淀；(2)IFN-β沉淀物溶解于鹽酸胍中以獲得IFN-β的再增溶；(3)IFN-β的復(fù)性，較佳是采用合適的緩沖液通過稀釋或透析來完成。通過這種純化方法所產(chǎn)生的IFN-β是可溶的、穩(wěn)定的并且大體上以單體形式存在。所得到的組合物經(jīng)合適的藥用緩沖液進一步滲濾或透析就可以作為藥物組合物。最后一步是從含有復(fù)性IFN-β的溶液中除去殘留的鹽酸胍，提供具有適合腸外給藥的pH值的制劑。
根據(jù)本發(fā)明所提供的純化方法，首先通過從溶液沖沉淀基本上純化的IFN-β制備IFN-β沉淀物。沉淀是降低IFN-β的溶解度完成的。IFN-β溶解度的下降和IFN-β的沉淀也可以通過酒精的使用如脂肪族酒精，(如乙醇)而取得。對于一些蛋白質(zhì)來說，通過變性和/或凝集反應(yīng)而產(chǎn)生的沉淀是不可逆的，從而導(dǎo)致蛋白失活，但是在本發(fā)明的沉淀的IFN-β例子中，沉淀反應(yīng)是可逆的。因此，在此純化方法的后來步驟中回收的可溶性IFN-β保持其生物活性。
得到的沉淀物溶解于鹽酸胍得到包含增溶變性的IFN-β和鹽酸胍的溶液。在以SDS為增溶劑進行初步純化而得到基本上純化的IFN-β的實例中，經(jīng)鹽酸胍溶解后SDS仍作為沉淀物存在。這些沉淀的SDS可以用已知的標準過濾方法除去，較佳是在進行此改進純化方法的下一步之前就進行過濾。與IFN-β沉淀物混合的鹽酸胍的量要足以溶解所得到的鹽酸胍-IFN-β溶液中沉淀的IFN-β，即在鹽酸胍-IFN-β溶液中鹽酸胍的濃度是約6-10M，較佳是約6-9M，更佳是的6-8M。盡管是增溶的，但此溶液中的IFN-β還是變性的。復(fù)性IFN-β需要將鹽酸胍-IFN-β溶液稀釋到緩沖液中，從而得到含有再增溶復(fù)性的IFN-β和殘留鹽酸胍的溶液。此溶液中的IFN-β大體上是單體的，即經(jīng)HPLC檢測至少約51％的IFN-β以單體形式存在，較佳是至少約70％、75％、80％、85％，更佳是至少約90％或更高。
在再增溶和復(fù)性步驟中，鹽酸胍是作為增溶劑以增加IFN-β的溶解度。“增加IFN-β的溶解度”是指與在相同pH、相同組分但不含有鹽酸胍的溶液中可溶解IFN-β的量相比時，IFN-β在pH約3.0-9.0、含有鹽酸胍的溶液中可溶解IFN-β的量增加了。鹽酸胍增強IFN-β溶解度的能力可以用本領(lǐng)域已知的方法確定，包括本發(fā)明所描述的方法。
本發(fā)明所提供的純化方法中稀釋步驟可以用任何合適的緩沖液以獲得IFN-β的復(fù)性。合適的緩沖液包括以下種類醋酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽以及Tris-HCl。具體選擇哪種要根據(jù)稀釋后所需要的溶液pH值而定。如果純化方法包括沉淀步驟，較佳用于稀釋的緩沖液pH值約為4.0-8.0，包括的4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，更佳是的5.0-7.0。經(jīng)過此稀釋步驟后，再增溶復(fù)性的IFN-β溶液中殘留的鹽酸胍的濃度較佳約為1.6M或更低，更佳約為0.8M或更低。
所得到的再增溶復(fù)性的IFN-β溶液含有大體上以單體形式存在的IFN-β(即單體IFN-β比例大于約51％)。此外，再增溶復(fù)性的IFN-β溶液含有殘留量的鹽酸胍。這種組合物可用于制備適合腸外給藥的藥物制劑。如此，作為增強溶解度的殘留鹽酸胍可以通過將再增溶復(fù)性的IFN-β溶液透析或滲濾到合適的藥用緩沖液中加以除去?！俺埩酐}酸胍”是指含有純化步驟所得到的實質(zhì)單體IFN-β的藥物制劑中所含有的鹽酸胍濃度為10mM或更低，較佳是5mM或更低。任何合適的藥用緩沖液都可以制備上述藥物制劑，只要IFN-β仍增溶，并大體上以單體形式存在。在一個實施例中，合適的藥用緩沖液含有的精氨酸或氯化鈉濃度與不含精氨酸或氯化鈉的緩沖液相比足以增加單體IFN-β的產(chǎn)量。對于精氨酸來說，足以增加單體IFN-β產(chǎn)量的濃度是約0.2-1.0M，較佳是約0.4-0.8M，包括0.4M、0.5M、0.6M、0.7M和0.8M。在一個實施例中，合適的藥用緩沖液中含有的精氨酸濃度約為0.5M。對于氯化鈉來說，足以增加單體IFN-β產(chǎn)量的濃度是約0.2-1.2M，較佳是0.2-1.0M，更佳是0.5-1.0M。在一個實施例中，合適的藥用緩沖液中含有的氯化鈉濃度約為1.0M。
第二種制備含有實質(zhì)單體IFN-β的組合物的純化方法與第一種方法相似，但提供了一種不需要沉淀步驟的組合物制備方法。第二種純化方法包括以下兩個基本步驟(1)將含有基本上純化的IFN-β的樣品與鹽酸胍混合從而獲得含有增溶變性的IFN-β的溶液；(2)IFN-β的復(fù)性，較佳是通過適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋。如前所述，鹽酸胍是作為溶解度增強劑使用的，其使用量與上述第一種純化方法相似。因此，第一步后，含有增溶變性的IFN-β的溶液中鹽酸胍的濃度大約為6-10M，較佳約為6-9M，更佳約為6-8M。如上所述，初始的基本上純化的IFN-β溶液中含有SDS，經(jīng)過此步驟SDS會沉淀，這些沉淀的SDS可以用本領(lǐng)域已知的標準過濾方法從溶液中濾掉。
與第一種純化方法一樣，鹽酸胍-IFN-β溶液中IFN-β是變性的。IFN-β的復(fù)性可以通過任何適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋來完成，緩沖液的pH值范圍約為3.0-5.0，較佳約為3.0-4.0，更佳約為3.0。在此稀釋步驟中完成復(fù)性IFN-β的合適緩沖液包括甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及琥珀酸、醋酸、磷酸、甲酸鹽和檸檬酸，也可以是上述任何的鹽類。經(jīng)過此步稀釋后，留在增溶復(fù)性的IFN-β的溶液中殘留鹽酸胍的濃度大約為1.6M或更低，較佳約為0.8M或更低，更佳約為0.1M或更低。復(fù)性后，得到的組合物含有實質(zhì)單體的IFN-β，即至少有51％的IFN-β是單體的，較佳至少約70％是單體的，測定方法為HPLC，較好的檢測方法為分析超離心(見Liu and Shire(1999)J.Pharm.Sci.881237-1241，本文已納入作為參考)。這種復(fù)性的IFN-β溶液中殘留的鹽酸胍可以通過如第一種方法所述的制備含實質(zhì)單體IFN-β的藥物制劑的方式除去。任何適當(dāng)?shù)乃幱镁彌_液都可以使用，就象本發(fā)明其他地方所描述的那樣，只要IFN-β仍是增溶的并且大體上以單體形式存在。在一個實施例中，合適的藥用緩沖液從如下種類中選擇甘氨酸、天冬氨酸和琥珀酸鈉，較佳是甘氨酸。這樣藥物制劑的pH值約為3.0-5.0，較好約為3.0-4.0，最好約為3.0。
如本發(fā)明所描述的那樣，由本發(fā)明所提供的純化方法制備的大體上為單體形式的IFN-β有幾種用途。例如，這種單形式的IFN-β可以直接用于配制適合腸外給藥的藥物組合物。經(jīng)過合適的藥用緩沖液滲濾或透析步驟除去殘留的鹽酸胍后，所得到的藥物組合物加入穩(wěn)定劑可以防止變性和喪失生物活性，穩(wěn)定劑包括但不僅僅限于蛋白質(zhì)和碳水化合物，較佳選擇來自以下種類甘露醇、山梨醇、甘油、葡萄糖、蔗糖和海藻糖以及它們的混合物。作為本發(fā)明的另一方面，經(jīng)過滲濾(或透析)以及穩(wěn)定步驟所得到的IFN-β制備物可以凍干并在惰性、無毒、生理相容性載體介質(zhì)中復(fù)原用于治療和臨床應(yīng)用。
本發(fā)明的藥物組合物是用已知濃度的實質(zhì)單體形式的IFN-β配制的，因此給與特定劑量會促進所需的治療反應(yīng)，此反應(yīng)相對于正在進行治療中的一種特定的IFN-β反應(yīng)性狀態(tài)。“所需的治療反應(yīng)”是指身體狀態(tài)或與身體狀態(tài)相關(guān)的癥狀的改善。
含有IFN-β的藥物組合物在針對IFN-β反應(yīng)性狀態(tài)的治療上是有用的?！爸委煛笔侵竿ㄟ^IFN-β的治療可以增強現(xiàn)有的正常狀態(tài)、治療對IFN-β起反應(yīng)的異常狀態(tài)以及通過采取IFN-β處理的預(yù)防性措施以阻止或減輕異常狀態(tài)發(fā)生的嚴重程度。“IFN-β反應(yīng)性狀態(tài)”是指能對IFN-β反應(yīng)產(chǎn)生積極或消極的任何狀態(tài)。這種IFN-β反應(yīng)性狀態(tài)可能是正常狀態(tài)。例如，哺乳動物經(jīng)過IFN-β治療增強了免疫反應(yīng)的敏感性和/或能力。這種治療也包括IFN-β處理以保護機體免受病毒感染或降低病毒感染的嚴重程度，例如登革熱病毒或新德比斯病毒。反之，IFN-β反應(yīng)性狀態(tài)也可以是異常狀態(tài)如惡性黑素瘤。這種異常狀態(tài)可以是慢性的，即其發(fā)生有或長或短的持續(xù)性，也可以是急性的。IFN-β反應(yīng)性狀態(tài)也可能稱為慢性和急性狀態(tài)，如緩解-復(fù)發(fā)的多發(fā)性硬化。任何IFN-β反應(yīng)性疾病都可能得益于本發(fā)明所提供的IFN-β藥物組合物。對IFN-β產(chǎn)生反應(yīng)的狀態(tài)也包括免疫失調(diào)，如免疫缺陷，其中包括由于疾病、感染或由環(huán)境以及其他因素如化療、化學(xué)物質(zhì)中毒造成的免疫系統(tǒng)損傷而引起免疫耐受降低。
下面實施例是以舉例說明而非限定的方式提供的。
實施例實施例1IFN-β的制備本實驗中所用的IFN-β是在大腸桿菌中制備的，純化的前幾步在美國專利號4,462,940和/或4,816,400中已有基本描述。即轉(zhuǎn)化的細菌用于生產(chǎn)IFN-β；宿主細胞濃縮后破碎細胞壁。然后在制備純化的IFN-β庫后按照本發(fā)明提供的方法制備IFN-β。
基本過程如下
1、用乙醇從純化的IFN-β庫中沉淀IFN-β。六份純化的IFN-β庫用四份乙醇。此步驟后干擾素產(chǎn)率大于80％，離心后成一小球。
2、把小球溶于8M的鹽酸胍中形成約為10mg/ml的蛋白質(zhì)溶液。小球的溶解是快速的；存在的少量SDS不溶解可以通過過濾除去。
3、然后得到的鹽酸胍溶液稀釋到10mM的緩沖液中。
實施例2鹽酸胍處理步驟的稀釋參數(shù)先進行初步實驗以確定鹽酸胍處理步驟中最佳的稀釋參數(shù)。測定相對產(chǎn)率的小規(guī)模實驗數(shù)據(jù)如表1中所列出的；最好的結(jié)果出現(xiàn)在稀釋后pH大于4.0、鹽酸胍的濃度低于0.8M條件下。干擾素β單體的濃度用HPLC確定，所用緩沖液為pH＝3.0、400mM的甘氨酸。表2的結(jié)果和圖1中的典型色譜圖顯示，盡管在較低pH得到非共價多聚物，但pH在5.0或更高時得到單體的IFN-β。
表1HPLC檢測鹽酸胍(8M)IFN(∽10mg/ml)溶液稀釋后的相對產(chǎn)率
表2HPLC檢測鹽酸胍(8M)IFN(約10mg/ml)溶液稀釋后凝聚體的百分比
實施例3鹽酸胍稀釋步驟的產(chǎn)率將實驗規(guī)模放大以評估鹽酸胍稀釋步驟的產(chǎn)率。結(jié)果如表3所示以pH為6-8的緩沖液40倍稀釋后可以得到41％-57％的產(chǎn)率，蛋白終濃度約為0.15mg/ml。檢測樣品中SDS的濃度為每毫克IFN低于10微克。
表3IFN從8M鹽酸胍(40倍稀釋)中重折疊回收
實施例4透析除去稀釋后殘留的鹽酸胍通過透析除去稀釋后殘留的鹽酸胍。在pH為5、不添加NaCl的條件下可以得到的最高產(chǎn)率為83％；如圖2所示，在pH為7.0、1000mM NaCl存在的條件下可以得到的最高產(chǎn)率為70％。在所有的例子中，透析后都有沉淀產(chǎn)生，但采用HPLC分析表明可溶性組分是單體的。
實施例5攪拌對鹽酸胍-復(fù)性IFN-β物質(zhì)的影響取少量IFN-β溶解在含10mM磷酸(pH＝7.0)、100mM NaCl的緩沖液中，加入試管置于復(fù)式搖床。大約3小時后50％左右的IFN-β沉淀出來。這說明合適的表面活性劑如Tween 80可以增強穩(wěn)定性。Tween 80的加入穩(wěn)定了干擾素因而能增加透析步驟的產(chǎn)量。然而，Tween 80也可以如圖3所示的那樣以濃度依賴的方式誘導(dǎo)凝集。這些凝聚體是可溶性的。其它的表面活性劑可能效果更好。
實施例6使用階乘設(shè)計方法優(yōu)化蛋白質(zhì)的復(fù)性和制劑用一系列實驗來評價下列階段IFN-β的回收量(1)在8M鹽酸胍溶液中IFN-β變性階段；(2)用緩沖液快速稀釋使IFN-β重折疊階段；(3)在精氨酸存在及不存在的條件下透析除去殘留鹽酸胍以得到終制劑階段。利用半階乘設(shè)計實驗優(yōu)化制劑的組分及上述1-3個階段的條件?？刹捎玫囊蛩匕ǖ鞍诐舛?、鹽酸胍濃度、pH、溫度以及精氨酸濃度。
實驗結(jié)果表明，pH、IFN-β濃度、稀釋后的鹽酸胍濃度和精氨酸濃度是有意義的模式條件，其中對模式影響最大的是IFN-β濃度和精氨酸濃度。精氨酸與pH之間的相互作用起重要的作用。使用含10mM NaPO4(pH＝7.0)和精氨酸的緩沖液可以得到最佳結(jié)果，階段1-2的總產(chǎn)率達到80-100％，階段3的產(chǎn)率達到70-80％。
實施例7不用乙醇沉淀純化方法中SDS的除去及IFN-β組合物的制備純化的IFN-β-1b(1升，濃度為1.91mg/ml，溶于0.4％SDS、50mM乙酸鹽緩沖液中、pH＝5.5)5℃儲存。在儲存期間有一些SDS沉淀。將250ml IFN-β-lb(477.5mg)與229g鹽酸胍(6M、總體積為400ml)混合，用磁力攪拌器在室溫下攪拌15分鐘。然后將6M的鹽酸胍/蛋白質(zhì)溶液通過SartobranP Capsule(0.45μm孔徑)過濾除去沉淀的SDS。紫外分光光度計以280nm波長測量蛋白質(zhì)濃度為1.02mg/ml。蛋白產(chǎn)量為406mg或85％。
將400ml鹽酸胍處理的溶液用MilliporeLabscaleTFF(Millipore，Inc.)滲濾系統(tǒng)濃縮。所使用的濾膜為雙層PelliconXL Biomax0.1cm210kD聚砜膜(Millipore，Inc.)。濃縮后體積為37ml，蛋白濃度為10.3mg/ml，濃縮后產(chǎn)量為381mg或93％。
用移液管將10ml(103mg)濃縮的鹽酸胍/蛋白質(zhì)溶液緩緩加入到590ml的5mM、pH為3.2的甘氨酸溶液中。用磁力攪拌器快速攪拌緩沖液；然后將蛋白溶液直接加到緩沖液的旋渦中。此步驟將6M的鹽酸胍/蛋白質(zhì)溶液稀釋了60倍，得到濃度為0.17mg/ml的0.1M鹽酸胍/蛋白質(zhì)溶液。將此600ml溶液轉(zhuǎn)移到裝有兩層PelliconII 10kD 0.1cm2聚砜膜的容量為500ml的滲濾器中，先被濃縮成蛋白濃度為0.23mg/ml的約400ml溶液，然后用9倍體積(3.6L)、pH為3.2的5mM甘氨酸緩沖液過濾。最后的滲濾液(402ml)用紫外分光光度計以280nm波長測量，蛋白質(zhì)終濃度為0.23mg/ml，產(chǎn)量為92.46mg或95％。經(jīng)過整個純化過程可溶性蛋白總產(chǎn)率為72％。
說明書中提到的所有出版物和專利申請是表示適合此發(fā)明的本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的水平。本文納入的所有出版物和專利申請在相同程度上作為參考，似乎各出版物或?qū)＠暾埗际蔷唧w地和單獨地納入作為參考。說明書中列出副標題只是為了更容易地評述文件，并不打算以任何方式對文獻的內(nèi)容進行限定。
盡管上述發(fā)明已經(jīng)以說明和實施例方式在某些細節(jié)上作了描述以便達到清楚理解本發(fā)明的目的，但顯然在實際操作過程中可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)作某些改變和調(diào)整。
權(quán)利要求
1.一種制備可注射的干擾素β(IFN-β)的制劑的方法，它包括a)制備含IFN-β的第一溶液，從此溶液中分離純化的IFN-β庫，并用酒精將所述IFN-β從庫中沉淀出來以形成沉淀物；b)將所述沉淀物溶解于鹽酸胍以形成含有增溶變性的IFN-β和鹽酸胍的第二溶液；c)將所述第二溶液稀釋到第一緩沖液以獲得含有增溶復(fù)性的IFN-β和殘留鹽酸胍的第三溶液；以及d)將所述第三溶液滲濾或透析到藥學(xué)上可接受的第二緩沖液中以從所述第三溶液中的除去殘留鹽酸胍，因而制得上述可注射的IFN-β制劑。
2.含有用如權(quán)利要求1所述方法制造的基本上為單體IFN-β的藥物組合物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的第二緩沖液含有精氨酸或氯化鈉。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的第一緩沖液的pH約為5.0-8.0，且其中所述殘留的鹽酸胍以1.6M或更低的濃度存在于所述第三緩沖液中。
5.一種制備可注射的干擾素β(IFN-β)的制劑的方法，其特征在于，所述方法包括用鹽酸(HCl)胍變性IFN-β，然后用第一緩沖液稀釋使IFN-β復(fù)性以得到含有殘留的鹽酸胍的復(fù)性的IFN-β溶液，并將上述復(fù)性的IFN-β溶液滲濾或透析到藥學(xué)上可接受的第二緩沖液中以從所述復(fù)性的IFN-β溶液中除去所述殘留的鹽酸胍，因而制得所述可注射的IFN-β制劑。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述第一緩沖液的pH約為3.0-5.0，且其中所述殘留的鹽酸胍以1.6M或更低的濃度存在于所述復(fù)性的IFN-β溶液中。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述第一緩沖液的pH約為3.0-4.0，且其中所述殘留的鹽酸胍以0.2M或更低的濃度存在于所述復(fù)性的IFN-β溶液中。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述第一緩沖液的pH約為3.0，且其中所述殘留的鹽酸胍以0.1M或更低的濃度存在于所述復(fù)性的IFN-β溶液中。
9.含有用如權(quán)利要求5所述方法制造的基本上為單體IFN-β的藥物組合物。
10.一種制備含有基本上為單體干擾素β(IFN-β)的組合物的方法，所述方法包括a)制備基本純化的IFN-β的沉淀物；b)將所述沉淀物溶解于鹽酸(HCl)胍以得到含有增溶變性的IFN-β的第一溶液；以及c)用緩沖液稀釋所述第一溶液以復(fù)性所述IFN-β。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述緩沖液的pH約為5.0-8.0。
12.含有用如權(quán)利要求10所述方法制造的基本上為單體IFN-β的藥物組合物。
13.一種制備可注射的干擾素β(IFN-β)的制劑的方法，所述方法包括a)獲得含基本上純化的IFN-β的樣品；b)將所述樣品與鹽酸(HCl)胍混合以得到含有增溶變性的IFN-β的第一溶液；c)將所述第一溶液稀釋到第一緩沖液中以得到含有增溶復(fù)性的IFN-β和殘留鹽酸胍的第二溶液；以及d)將所述第二溶液滲濾或透析到藥學(xué)上可接受的第二緩沖液中以從所述第二溶液中除去殘留的鹽酸胍，因而制得所述可注射的IFN-β制劑。
14.含有用如權(quán)利要求13所述方法制造的基本上為單體IFN-β的藥物組合物。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述第一緩沖液的pH約為3.0-5.0，所述殘留的鹽酸胍以1.6M或更低的濃度存在于所述的第二溶液中。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述第一緩沖液的pH約為3.0-4.0，所述殘留的鹽酸胍以0.2M或更低的濃度存在于所述的第二溶液中。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述第一緩沖液的pH約為3.0，所述殘留的鹽酸胍以0.1M或更低的濃度存在于所述復(fù)性的IFN-β溶液中。
18.一種制備含有基本上為單體干擾素β(IFN-β)的組合物的方法，所述方法包括a)制備含有基本上純化的IFN-β的樣品；b)將所述樣品與鹽酸(HCl)胍混合得到含增溶變性的IFN-β的第一溶液；以及c)用緩沖液稀釋所述第一溶液以復(fù)性所述IFN-β。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述緩沖液的pH約為3.0-5.0。
20.含有用如權(quán)利要求18所述方法制造的基本上為單體IFN-β的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及干擾素β(IFN－β)的純化及回收的改進方法以及含實質(zhì)為單體IFN－β的組合物。其中一種純化方法是，將基本上純化的IFN－β或其變體沉淀，然后溶解到鹽酸胍溶液中。用合適的緩沖液稀釋使蛋白復(fù)性。本發(fā)明還提供了一種無沉淀步驟的相似的純化方法。IFN－β復(fù)性后滲濾或透析到適當(dāng)?shù)乃幱玫木彌_液中以除去殘留鹽酸胍，從而制得含實質(zhì)為單體IFN－β的藥物組合物。
文檔編號C07K14/435GK1479627SQ01819983
公開日2004年3月3日 申請日期2001年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月27日
發(fā)明者S·沃爾夫, I·葉西科夫, S·巴布卡, B·A·雷莉, D·福德姆, S 沃爾夫, 伎, 履, 雷莉, 骺品 申請人:希龍公司