專利名稱：利用轉基因生菜生產人胰島素的方法
技術領域：
本發(fā)明是利用生菜做為一種植物生物反應器來制造人胰島素。這種人胰島素可以通過生食生菜，做為一種口服制劑通過消化道上皮粘膜進入體內，改善糖尿病病人的自體免疫狀況。同時也可以從這種生菜提取高表達量的人胰島素，而獲得注射用人胰島素。
本發(fā)明的主要創(chuàng)新之點在于(1)選用植物偏愛的密碼子，人工合成人胰島素基因；(2)在合成人胰島素的C端加上了KDEL內質網滯留序列，避免了胰島素在植物細胞中的降解。
在植物生物反應器研究中利用馬鈴薯塊莖生產乙肝疫苗的研究已受到廣泛的重視。生菜做為可生食的蔬菜或果品，用它來生產口服的多肽類藥物具有很大的應用潛力。人胰島素對于胰島素依賴的尿病患者的治療是十分重要的。某些糖尿病患者的代謝調節(jié)與自體免疫功能相關?？诜葝u素已被證明對某些類型的尿病治療是有效的〔Reddy S et at，Pancreas2000，20(1)55-60；Ploix C et at，Diabetes 1999，48(1)2150-6；Ramiya VK，Maclaren NK，Horm Res 1997，48 suppl 467-70〕。
本項發(fā)明的技術要點之一是胰島素基因的人工合成。之所以不采用天然人胰島素的DNA序列，是因為我們采用植物偏愛的密碼子可提高該基因在植物中的表達量。我們所用的人胰島素基因編碼了天然胰島素A鏈和B鏈的氨基酸順序，但DNA順序與天然人胰島素基因的DNA順序并不相同。
本項發(fā)明的要點之二是植物表達載體pCAM35S-InsK的構建。將人工合成的人胰島素基因InsK連接到p11Z載體上并測序，然后從pBI221載體上切下CaMV 35S啟動子，置于胰島素基因的上游。將CaMV 35S-InsK切下后置于植物表達載體pCAMBIA1390的nos終止子之前，經酶切和PCR鑒定證明載體構建正確。
本項發(fā)明的要點之三是在人胰島素基因的C端加上了KDEL的內質網滯留序列。研究證明在蛋白質的C端加上KDEL的四個氨基酸序列，能夠使該蛋白質滯留于內質網中，從而避免被大量降解。
本項發(fā)明的要點之四是農桿菌介導的生菜轉化。將植物表達載體pCAM35S-InsK凍融法轉入農桿菌LBA4404。農桿菌在含鏈霉素的YEB培養(yǎng)基中繁殖后與生菜葉片共培養(yǎng)，共培養(yǎng)的葉片在含Cb和潮霉素的篩選培養(yǎng)基上放置一段時間后出現愈傷組織，然后愈傷組織分化長出小苗，將小苗分別移入不同瓶中，經PCR鑒定陽性植株，并進一步Southern blotting和ELISA鑒定。
在本發(fā)明的一個實施方案中，關于人胰島素基因的合成，選用植物偏愛的密碼子。為此在人胰島素A鏈63個堿基中更換了13個堿基。在B鏈90個堿基中更換了18個堿基，另外在3’端加上了12個堿基編碼內質網滯留序列KDEL。在A鏈與B鏈之間我們設計了6個氨基酸的連接片段。此連接片段的氨基酸種類及順序的設計原則是保持人胰島素天然的三維結構特征。我們將人工合成的包含人胰島素A鏈與B鏈及中間小段連接順序克隆于pGEM-11Z載體中的EcoRI和BamHI位點，并經質粒酶切圖譜的分析及序列分析加以確定，該質粒命名為p11Z-InsK。在這一實施方案中，人胰島素基因片段可以通過PCR擴增得到，擴增時，使用的引物如下InsK 5’5’-GAT CCA TGT TCG TTA ACC AAC ACC-3’InsK 3’5’-CTC GTC CTT GTT GCA GTA GTT CTC-3’。
在本發(fā)明的一個實施方案中，人胰島素基因置于組成型表達啟動子CaMV35S啟動子的調控之下，再轉入中間載體中。再進一步轉入雙元表達載體，完成一個植物表達載體的構建(見

圖1、人工合成的人胰島素基因的克隆及植物表達載體的構建流程圖。其中人胰島素基因處于組成型啟動子CaMV35S的控制下)。
此專利涉及的菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，單位地址中國北京中關村，該微生物分類名稱為大腸埃希氏菌(Ecoli.)，保藏代號為p11Z-InsK，保藏編號為CGMCC NO.0723，保藏日期為2002年3月8日。一、合成人胰島素基因InsK序列1 GATCCATGTT CGTTAACCAA CACCTTTGCG GATCTCACCT TGTTGAGGCT CTTTACCTTG61TTTGCGGAGA GAGGGGATTC TTCTACACCC CAAAGACCGG AGGACCATCT GGAGGAGGAA121 TCGTTGAGCA ATGCTGCACC TCTATCTGCT CTCTTTACCA ACTTGAGAAC TACTGCAACA181 AGGACGAGCT TTAAG
權利要求
1.利用轉基因生菜生產重組人胰島素的方法。其中用于轉化的基因還包括經過改造的胰島素基因及其部分序列，受體除生菜外還包括黃瓜、胡蘿卜、煙草等其它植物。
2.根據權利要求1的方法。所用的基因除了經過植物偏愛性密碼字改造過的胰島素基因外，還包括未經過改造及部分改造的胰島素基因。
3.根據權利要求1的方法。所用的基因除了3’端附加了KDEL序列的胰島素基因外，還包括3’端未附加KDEL序列的基因以及附加了其它類似元件的基因。
4.根據權利要求1的方法。所用的基因除了采用6個氨基酸將胰島素A、B兩條鏈連接的方法外，還包括采用其它氨基酸連接的方法。
5.根據權利要求1的方法。胰島素基因采用的啟動子除了CaMV 35S啟動子外，還包括其它可在植物中表達的啟動子。
6.根據權利要求1的方法。受體除生菜外還包括黃瓜、胡蘿卜、煙草等其它植物。
全文摘要
本發(fā)明利用轉基因生菜做為一種生物反應器生產人胰島素。所用的人胰島素基因是依據植物偏愛密碼子的原則來設計所含的密碼子,通過人工合成若干DNA片段,拼接而成,并且在C端加上KDEL的內質網滯留序列,避免胰島素在植物細胞中的降解。將該基因置于CaMV 35S啟動子的驅動之下通過農桿菌介導的方法轉入生菜,在生菜葉片和莖中表達人胰島素。這種能制造人胰島素的生菜不僅可以方便地成為一種口服產品,用于防治某些胰島素依賴的和自體免疫障礙的糖尿病,而且可以從中提純出人胰島素做成注射用的劑型。
文檔編號C07K14/435GK1382734SQ0210417
公開日2002年12月4日 申請日期2002年3月15日 優(yōu)先權日2002年3月15日
發(fā)明者林忠平, 倪挺, 胡鳶雷, 高音 申請人:林忠平