專利名稱：爬山虎屬及近緣屬中白藜蘆醇芪合酶基因及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明克隆了川鄂爬山虎(Parthenocissus henryana)、五葉爬山虎(Parthenocissus quinquefolia L.Planch)及菱葉粉藤(Cissus rhombifoliaPlanch)的三個(gè)長(zhǎng)度均為1.2kb的白藜蘆醇芪合酶基因(STS)全序列。三個(gè)基因的同源性甚高，達(dá)97.8％。該基因編碼產(chǎn)物芪合酶(Stilbene synthase)催化底物丙二酰-CoA和苯丙酰-CoA合成白藜蘆醇。白藜蘆醇具有很多的醫(yī)療保健作用，如防止血小板凝聚、防止人體低密度脂蛋白氧化、清除自由基、消炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤等，因此在各國(guó)引起高度重視。由于白藜蘆醇的這些保健功能，它的含量高低已經(jīng)成為葡糖酒質(zhì)量好壞評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇在葡萄屬及另外的一些物種中存在。實(shí)驗(yàn)證明可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因的途徑使一些不含白藜蘆醇的物種也具備合成白藜蘆醇的能力，從而提高這些物種的營(yíng)養(yǎng)保健功能。也可以通過(guò)控制植物次生代謝途徑的生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)白藜蘆醇。上述三個(gè)克隆的基因，經(jīng)在GenBank上檢索，證實(shí)為新的基因序列。
本發(fā)明的主要?jiǎng)?chuàng)新之點(diǎn)在于(1)首次從爬山虎屬及近緣白粉藤屬中克隆白藜蘆醇芪合酶基因；(2)構(gòu)建了白藜蘆醇芪合酶基因的植物表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的途徑使一些不含白藜蘆醇的物種也具備合成白藜蘆醇的能力，從而提高這些物種的營(yíng)養(yǎng)保健功能；(3)可通過(guò)強(qiáng)啟動(dòng)子的使用，提高芪合酶的表達(dá)量，促進(jìn)白藜蘆醇的生物合成。
白藜蘆醇是植物的次生代謝產(chǎn)物，由芪合酶催化底物合成。天然含有芪合酶基因的植物只有在遭受環(huán)境壓或病原菌攻擊時(shí)，才能激發(fā)該基因的轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯為芪合酶，進(jìn)而瞬時(shí)合成白藜蘆醇。遺憾的是，絕大多數(shù)植物缺少STS基因，卻含有芪合酶作用的底物。同時(shí)，白藜蘆醇僅存在于少數(shù)可食食物中，且含量甚低。因此，可以通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建含STS基因的植物表達(dá)載體，再把此基因轉(zhuǎn)入到不含STS的植物，或者含STS但表達(dá)量不高的植物當(dāng)中去，將有可能在這些植物中獲得含量較高的白藜蘆醇。
本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn)之一是從爬山虎屬及近緣白粉藤屬中克隆白藜蘆醇芪合酶基因。從已發(fā)表的Vitis vinifera，Vitis labrusca以及Vitis ripuria的芪和酶(STS)基因序列的比較中可以看出，STS基因主要由兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子組成。這三個(gè)序列在轉(zhuǎn)錄開(kāi)始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)附近的的堿基序列相對(duì)較為保守，同時(shí)三個(gè)序列外顯子的同源性極高。根據(jù)STS基因轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)附近堿基很高的保守性，我們?cè)O(shè)計(jì)了兩條引物(P1、P2)，將STS全長(zhǎng)序列從爬山虎屬及近緣白粉藤屬cDNA文庫(kù)中克隆出來(lái)。
本項(xiàng)發(fā)明的要點(diǎn)之二是白藜蘆醇芪合酶基因的植物表達(dá)載體pM3T1ΩBM3的構(gòu)建。將2a12啟動(dòng)子置于STS基因上游，得到中間載體p7Z-T1-2a12。然后將增強(qiáng)型啟動(dòng)子35SΩ置換掉2a12啟動(dòng)子，得到中間載體p7Z-T1Ω。將35SΩ-T1通過(guò)ApaI+SacI雙酶切放入植物表達(dá)載體p3300T1M3中，然后在插入MAR3元件，構(gòu)建成植物表達(dá)載體pM3T1ΩBM3。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，我們?cè)O(shè)計(jì)了兩條引物(P1、P2)，將STS全長(zhǎng)序列從爬山虎屬及近緣白粉藤屬cDNA文庫(kù)中克隆出來(lái)。引物序列如下P15’-CGG GAT CCG CCA TGG CTT CAG TTG AGG AAT TTA G-3’P25’-GTG AGC TCG AAG GGT AAA CCA TTC TCT TTT AT-3’在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，STS基因置于改造的組成型表達(dá)啟動(dòng)子CaMV35SΩ啟動(dòng)子的調(diào)控之下，得到中間載體p7Z-T1Ω。將35SΩ-T1通過(guò)ApaI+SacI雙酶切放入植物表達(dá)載體p3300T1M3中，然后在插入MAR3元件，構(gòu)建成植物表達(dá)載體pM3T1ΩBM3(見(jiàn)圖一、爬山虎屬及近緣白粉藤屬中白藜蘆醇芪合酶基因植物表達(dá)載體pM3T1ΩBM3的構(gòu)建流程圖)。
此專利涉及的菌種已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，單位地址中國(guó)北京中關(guān)村，該微生物分類名稱為大腸埃希氏菌(Ecoli.)，保藏代號(hào)為pM3T1ΩBM3，保藏編號(hào)為CGMCC NO.0722，保藏日期為2002年3月8日。
序列表一、川鄂爬山虎STS基因序列1 CGGGATCCGC CATGGCTTCA GTTGAGGAAT TTAGAAACGC TCAACGTGCC AAGGGTCCGG61 CCACCATCCT AGCCATTGGC ACAGCTACTC CCGACCAGTG TGTCTACCAG TCTGATTATG121 CTGATTACTA TTTTAGGGTC ACTAAGAGCG AGCACATGAC TGAGTTGAAG AAGAAGTTCA181 ATCGCATATG TGAAAAATCA ATGATCAAGA AGCGTTATAT TCATTTGACT GAAAAGATGC241 TTGAGGAGCA CCCAAACATT GGTGCTTATA TGGCTCCATC TCTTAACATA CGCCAAGAGA301 TTATCACTGC CGAGGTACCC AAGCTTGGTA AAGAAGCAGC ATTGAAGGCT CTTAAAGAGT361 GGGGTCAACC CAAATCCAAG ATTACCCATC TTGTATTTTG TACCACCTCT GGTGTAGAAA421 TGCCTGGTGC CGACTATAAA CTCGCTAATC TCTTAGGCCT CGAAACATCT GTTAGAAGAG481 TGATGTTGTA TCATCAAGGT TGCTATGCAG GTGGAACTGT CCTTCGAACT GCTAAGGATC541 TTGCAGAGAA TAATGCAGGA GCACGAGTTC TTGTGGTGTG CTCTGAGATC ACTGTTGTCA601 CATTCCGTGG ACCTTCCGAA ACTGCTTTGG ACTCTTTAGT TGGCCAAGCC CTTTTTGGTG661 ATGGGTCTGC AGCTGTGATC GTTGGATCAG ATCCAGATAT CTCGATTGAA CAACCACTTT721 TTCAACTCGT CTCAGCAGCC CAAACATTTA TTCCTAATTC AGCAGGTGCC ATTGCCGGGA781 ACTTACGTGA GGTGGGACTC ACATTTCATT TGTGGCCCAA TGTGCCAACT TTAATTTCTG841 AGAACATAGA GAAATGCTTG ACTCAGGCTT TTGACCCACT TGGTATTAGC GATTGGAACT901 CGTTATTTTG GATTGCTCAC CCAGGTGGCC CTGCAATTCT TGATGCGGTT GAAGCAAAAC961 TCAATTTAGA CAAAAAGAAA CTTGAAGCAA CGAGGCATGT GTTAAGTGAG TATGGCAACA1021TGTCAAGTGC ATGTGTGTTG TTTATTTTGG ATGAGATGAG AAAGAAATCA CTTAAGGGGG1081AGAAGGCCAC CACAGGTGAA GGATTGGATT GGGGAGTATT ATTTGGCTTT GGATCAGGCT1141TGACTATTGA GACTGTTGTG TTGCATAGCA TTCCTATGGT TACAAATTAA ATAAAAGAGA1201ATGGTTTACC CTTCGAGCTC ACAATCAC二、菱葉粉藤STS基因序列1 CGGGATCCGC CATGGCTTCA GTTGAGGAAT TTAGAAACGC TCAACGTGCC AAGGGTCCAG61 CTACCATCCT AGCCATTGGC ACAGCTACTC CCGATCAGTG TGTCTACCAG TCTGATTATG121 CTGATTACTA TTTCCGGGTC ACTAAGAGCG AGCACATGAC TGAGTTGAAG AAGAAGTTCA181 ATCGCATATG TGAGAAATCA ATGATCAAGA AGCGTTACAG TCATTTGACC GAAGAAATGC241 TCGAGGAGCA CCCAAACATT GGTGCTTATA TGGCTCCATC TCTTAACATA CGCCAAGAGA301 TTATCACTGC TGAGGTACCT AAGCTTGGTA AGGAAGCAGC ATTGAAGGCT CTAAAAGAGT361 GGGGCCAGCC AAAGTCCAAG ATCACCCATC TTGTATTTTG TACAACCTCC GGTGTAGAAA421 TGCCTGGTGC AGATTACAAA CTCGCTAATC TCTTAGGGCT TGAAACATCG GTCAGAAGAG481 TGATGTTGTA CCATCAAGGG TGCTATGCAG GTGGAACTGT CCTCCGAACT GCTAAGGATC541 TTGCAGAGAA TAATGCAGGA GCACGAGTTC TTGTGGTGTG CTCTGAAATC ACTGTTGTTA601 CATTCCGTGG GCCTTCTGAA ACCGCTTTGG ACTCTTTAGT TGGTCAAGCC CTTTTTGGTG661 ATGGGTCTGC AGCTGTGATC GTTGGATCAG ATCCAGATAT CTTGATTGAA CGACCGCTCT721 TCCAACTCGT CTCAGCAGCC CAAACATTTA TTCCTAATTC AGCAGGTGCC ATTGCCGGGA781 ACTTACGTGA GGTGGGACTC ACCTTCCATT TGTGGCCCAA TGTGCCTACT TTAATTTCTG841 AGAACATAGA GAAATGCTTG ACTCAGGCTT TTGACCCACT TGGTATTAGC GATTGGAACT901 CGTTATTTTG GATTGCTCAC CCAGGTGGTC CAGCTATTCT TGACGCGGTT GAAGCAAAAC961 TCAGTTTAGA TAAACAAAAA CTCGAAGCAA CGAGGCATGT GCTAAGTGAG TATGGCAACA1021TGTCAAGTGC ATGTGTGTTG TTTATTTTGG ATGAGATGAG AAAAAAATCC CTTAAGGGGG1081AGAAGGCCAC CACAGGTGAA GGATTGGATT GGGGAGTATT ATTCGGTTTT GGCCCAGGTT1141TGACTATTGA GACTGTTGTG TTGCATAGCA TTCCTATGGT TACAAATTAA GTGAAATAAA1201AGAGAATGGT TTACCCTTCG AGCTCACAAT CAC三、五葉爬山虎STS基因序列1 TGGGATCCGC CATGGCTTCA GTTGAGGAAT TTAGAAACGC TCAACGTGCA AAGGGTCCAG61 CCACCATCCT AGCCATTGGC ACAGCTACTC CCGACAACTG TGTCTATCAG TCAGATTATG121 CTGATTTCTA CTTCAGGGTC ACTAAGAGCG AGCACATGAC TGAGTTGAAG AAGAAGTTCA181 ATCGCATATG TGAGAAATCA ATGATCAAGA AGCGTTACAG TCATTTGACC GAAGAAATGC241 TCGAGGAGCA CCCAAACATT GGTGCTTATA TGGCTCCATC TCTTAACATA CGCCAAGAGA301 TTATCACTGC TGAGGTACCT AAGCTTGGTA AGGAAGCAGC ATTGAAGGCT CTAAAAGAGT361 GGGGCCAGCC AAAGTCCAAG ATCACCCATC TTGTATTTTG TACAACCTCC GGTGTAGAAA421 TGCCTGGTGC AGATTACAAA CTCGCTAATC TCTTAGGGCT TGAAACATCG GTCAGAAGAG481 TGATGTTGTA CCATCAAGGG TGCTATGCAG GTGGAACTGT CCTCCGAACT GCTAAGGATC541 TTGCAGAGAA TAATGCAGGA GCACGAGTTC TTGTGGTGTG CTCTGTAATC ACTGTTGTTA601 CATTCCGTGG GCCTTCTGAA ACCGCTTTGG ACTCTTTAGT TGGTCAAGCC CTTTTTGGTG661 ATGGGTCTGC AGCTGTGATC GTTGGATCAG ATCCAGATAT CTTGATTGAA CGACCGCTCT721 TCCAACTCGT CTCAGCAGCC CAAACATTTA TTCCTAATTC AGCAGGTGCC ATTGCCGGGA781 ACTTACGTGA GGTGGGACTC ACCTTCCATT TGTGGCCCAA TGTGCCTACT TTAATTTCTG841 AGAACGTAGA GAAATGCTTG ACTCAGGCTT TTGACCCACT TGGTATTAGC GATTGGAACT901 CGTTATTTTG GATTGCTCAC CCAGGTGGTC CAGCTATTCT TGACGCGGTT GAAGCAAAAC961 TCAGTTTAGA TAAACAAAAA CTCGAAGCAA CGAGGCATGT GCTAAGTGAG TATGGCAACA1021TGTCAAGTGC ATGTGTGTTG TTTATTTTGG ATGAGATGAG AAAAAAATCC CTTAAGGGGG1081AGAAGGCCAC CACAGGTGAA GGATTGGATA GGGGAGTATT ATTCGGTTTT GGCCCAGGTT1141TGACTATTGA GACTGTTGTG TTGCATAGCA TTCCTATGGT TACAAATTAA GTGAAATAAA1201AGAGAATGGT TTACCCTTCG AGCTCACAAT CAC
權(quán)利要求
1.川鄂爬山虎(Parthenocissus henryana)1.2kb的白藜蘆醇芪合酶基因(STS)全序列。包括該基因的全部序列及部分序列均在權(quán)利要求之內(nèi)。
2.五葉爬山虎(Parthenocissus quinquefolia L.Planch)1.2kb的白藜蘆醇芪合酶基因(STS)全序列。包括該基因的全部序列及部分序列均在權(quán)利要求之內(nèi)。
3.菱葉粉藤(Cissus rhombifolia Planch)1.2kb的白藜蘆醇芪合酶基因(STS)全序列。包括該基因的全部序列及部分序列均在權(quán)利要求之內(nèi)。
4.爬山虎屬及近緣白粉藤屬中白藜蘆醇芪合酶基因(STS)的應(yīng)用。包括利用此基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，使植物產(chǎn)生白藜蘆醇或增強(qiáng)白藜蘆醇的含量，也包括利用此基因構(gòu)建原核表達(dá)載體表達(dá)該編碼蛋白及其應(yīng)用，包括利用此基因構(gòu)建的各種融合基因及其應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1。將STS基因作適當(dāng)改造之后的序列構(gòu)建植物表達(dá)載體，以產(chǎn)生白藜蘆醇，亦在本專利權(quán)要求之內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4。STS基因所用的啟動(dòng)子除了CaMV 35SΩ外，利用其它啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)STS基因表達(dá)在本專利權(quán)要求之內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明克隆了川鄂爬山虎(Parthenocissushenryana)、五葉爬山虎(Parthenocissus quinquefolia L.Planch)及菱葉粉藤(Cissus rhombifolia Planch)的三個(gè)長(zhǎng)度均為1.2kb的白藜蘆醇芪合酶同源基因(STS)全序列。該基因編碼產(chǎn)物芪合酶(Stilbene synthase)催化底物丙二酰－CoA和苯丙酰－CoA合成白藜蘆醇。天然產(chǎn)物白藜蘆醇有很多的醫(yī)療保健作用,如防止血小板凝聚、防止人體低密度脂蛋白氧化、清除自由基、消炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤等。實(shí)驗(yàn)證明可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因的途徑使一些不含白藜蘆醇的物種也具備合成白藜蘆醇的能力,從而提高這些物種的營(yíng)養(yǎng)保健功能。也可以通過(guò)增強(qiáng)芪合酶表達(dá)的植物生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)白藜蘆醇。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1382693SQ0210417
公開(kāi)日2002年12月4日 申請(qǐng)日期2002年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月15日
發(fā)明者林忠平, 鐘瑾, 倪挺, 胡鳶雷, 高音 申請(qǐng)人:林忠平