專利名稱：一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純大環(huán)內(nèi)酯類化合物的方法，具體地說涉及一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的方法。
埃博霉素較紫杉醇簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)、良好的水溶性和極大的藥用潛力，使得人們投入了巨大的熱情進(jìn)行研究，以期更快的將其開發(fā)成為抗腫瘤藥物?；瘜W(xué)家們把很多的精力投入到埃博霉素及其類似物的合成和分離上，但是，對(duì)于從發(fā)酵液中分離提純埃博霉素，目前一直采用哥特(Gerth)等人的方法。該方法包括樹脂吸附，硅膠柱梯度分離，分子篩層析和高效液相分離四個(gè)步驟。我們的研究表明，該方法存在著一定的缺陷和不足，尤其是無(wú)法達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的各種要求。主要表現(xiàn)在步驟過于繁瑣，使得操作的效率較低而過程費(fèi)用很高；產(chǎn)物的得率較低，不超過30％，過程損失高達(dá)70％；樹脂吸附時(shí)，使用安伯萊特(Amberlite)XAD-16樹脂，成本很高，而且國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)同型號(hào)的樹脂替代品；要使埃博霉素A和B達(dá)到用藥純度(大于90％)，必須經(jīng)過高效液相分離，這在工業(yè)生產(chǎn)中是難以實(shí)現(xiàn)的。經(jīng)過文獻(xiàn)和專利的檢索，國(guó)內(nèi)外在此方向并沒有較大的進(jìn)展和相關(guān)的專利。

發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述缺陷，本發(fā)明的主要目的在于提供一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的方法。它可有效地克服現(xiàn)有流程的弊段，達(dá)到高效而經(jīng)濟(jì)的從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的目的，從而實(shí)現(xiàn)提取流程的工業(yè)化。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，具體步驟順序如下(1)混合樹脂的配制將CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六種樹脂按重量比0.8～1.2∶0.8～1.2∶1.8～2.2∶0.8～1.2∶2.8～3.2∶1.8～2.2混合，懸溶于等體積的蒸餾水中，制備成混合樹脂溶液；(2)混合樹脂吸附在進(jìn)行粘細(xì)菌發(fā)酵時(shí)，向液體培養(yǎng)基中添加0.1％-5％(體積/體積)的上述混合樹脂進(jìn)行吸附，吸附劑存在于整個(gè)發(fā)酵流程之中，發(fā)酵結(jié)束后，過濾制得沉淀的吸附樹脂混合物，備用；(3)固液分步萃?、偈褂?0-20倍體積的甲醇對(duì)步驟(2)獲得的樹脂混合物進(jìn)行萃取，保溫30-50℃，24-48小時(shí)，離心除去樹脂，獲得第一部分萃取物；②將第一部分萃取物中的甲醇40℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10-20倍體積的二氯甲烷進(jìn)行第二步萃取，保溫20-30℃，24-48小時(shí)，離心除去沉淀，獲得第二部分萃取物，③將第二部分萃取物中的二氯甲烷30℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10-20倍體積的正己烷進(jìn)行第三步萃取，保溫20-30℃，24-48小時(shí)，離心收集沉淀，使用10％體積比的正己烷沖洗沉淀，獲得第三部分萃取物；(4)分子篩層析將上述第三部分萃取物重溶于2倍體積甲醇，以2-5％柱床體積的加樣量進(jìn)行葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)分子篩柱層析分離；流動(dòng)相為甲醇或二氯甲烷，流速為0.5柱床體積/小時(shí)，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，埃博霉素的洗脫體積為1.5-2.5倍柱體積；(5)結(jié)晶將步驟(4)的收集樣品制備成酮類過飽和溶液，利用結(jié)晶器制備和收集結(jié)晶；方法是將恒溫槽加熱至45-60℃，將樣品放入結(jié)晶皿中，保溫15-30分鐘，至樣品全部溶解，然后開始梯度降溫，速率為0.5～3℃/30分鐘，降溫至35-40℃后，改用溶劑蒸發(fā)法，恒溫濃縮液體體積至原始體積的十分之一，在結(jié)晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素A和B的混合物；(6)高效液相分離若獲得完全純化的埃博霉素A或B，可采用高效液相進(jìn)行埃博霉素A和B混合物分離，使用反相半制備柱(Hypersil ODS2 C18)，規(guī)格為250×8mm，填料粒徑10μm，流速為2ml/min，249nm檢測(cè)，柱溫24℃，進(jìn)樣量100μl，檢測(cè)時(shí)間30min，流動(dòng)相為65％甲醇和35％水；埃博霉素A的滯留時(shí)間為9.6分鐘，埃博霉素B的滯留時(shí)間為11.1分鐘；收集后即可獲得純化的埃博霉素A或B。
其中步驟(1)所述的CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六種樹脂混合的重量比是1∶1∶2∶1∶3∶2。
其中步驟(2)所述的進(jìn)行吸附用混合樹脂添加量為液體培養(yǎng)基體積比的0.5％-2％。
其中步驟(3)所述的①中，最適宜的萃取溫度為35-40℃。
其中步驟(3)所述的②中，最適宜的萃取溫度為22-25℃。
其中步驟(3)所述的③中，最適宜的萃取溫度為25-28℃。
其中步驟(4)所述的最適加樣量為2.5-3.8％柱床體積。
其中步驟(4)所述的埃博霉素的洗脫體積，在使用甲醇為流動(dòng)相時(shí)，洗脫體積為1.8-2.3倍柱體積；在使用二氯甲烷為流動(dòng)相時(shí)，洗脫體積為1.5-2.1倍柱體積。
其中步驟(5)所述的酮類過飽和溶液是2-丁酮或者丙酮中的一種或兩種。
其中步驟(5)所述的梯度降溫的最適速率為0.5～1℃/30分鐘。
對(duì)于分離提純制備得到的埃博霉素A和B，分別測(cè)定了質(zhì)譜(見附圖
4)，紫外譜圖(見附圖5)，紅外譜圖(見附圖6)和核磁共振譜圖(見附圖7和附圖8)，確認(rèn)了結(jié)構(gòu)(見附圖3)。并且，測(cè)定了它們的抗腫瘤活性(見附件1)和微管聚合促進(jìn)活性(見附件2)。
在本發(fā)明的方法中，混合樹脂對(duì)于埃博霉素的吸附率為95-100％，完成結(jié)晶步驟時(shí)埃博霉素的提取率為85-90％，純度為95-97％，完成高效液相分離后，埃博霉素A和B的提取率為82-89％，純度為99.9-99.99％。
本發(fā)明的創(chuàng)造性在于，研制了低成本、高效的混合吸附樹脂，其吸附率高達(dá)95-100％，替代了昂貴的進(jìn)口吸附樹脂；開發(fā)了分步固液萃取技術(shù)，替代原步驟中的硅膠柱梯度洗脫分離，大大提高了最終的提取得率，降低了成本；開發(fā)了結(jié)晶工藝，并研制了專用結(jié)晶器，創(chuàng)造性的通過結(jié)晶對(duì)埃博霉素進(jìn)行了提純，使得完成結(jié)晶步驟時(shí)埃博霉素A和B的提取率為85-90％，純度高達(dá)95-97％，完全達(dá)到了制備成為藥物的要求。而在原始提取流程中，進(jìn)行高效液相分離前，埃博霉素的純度不足70％，無(wú)法直接制備成為藥物。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是通過分步固液萃取和結(jié)晶等工藝，使得抗腫瘤化合物埃博霉素的提取得率達(dá)到了80％以上，由于使用了廉價(jià)的混合樹脂進(jìn)行吸附，大大降低了成本，提高了效率?？紤]到工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，埃博霉素A和B的藥效和毒性大致相當(dāng)，可以混合制藥，所以完成結(jié)晶部分即可形成產(chǎn)品，大大提高了工業(yè)化生產(chǎn)的可行性和可放大性。這一發(fā)明，開創(chuàng)了高效而經(jīng)濟(jì)的分離提純抗腫瘤化合物埃博霉素的創(chuàng)新技術(shù)，具備工業(yè)化生產(chǎn)的可行性和可放大性，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用前景。
圖9.變溫紫外分光光度法檢測(cè)結(jié)果圖。附件1提純后的埃博霉素A和B的體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)報(bào)告結(jié)論表明提純后的埃博霉素A在濃度大于50ng/ml時(shí)，可以殺死兩種腫瘤細(xì)胞；提純后的埃博霉素B在濃度大于10ng/ml時(shí)，可以殺死兩種腫瘤細(xì)胞。兩樣品均具有明顯的體外抗腫瘤活性，并且與文獻(xiàn)值一致。附件2提純后的埃博霉素A和B的促微管聚合活性實(shí)驗(yàn)報(bào)告結(jié)論表明提純后的埃博霉素A和B均能在不存在GTP的情況下，明顯的促進(jìn)微管再體外的聚合作用，而且B的活性高于A，與文獻(xiàn)結(jié)論一致。
在本發(fā)明的方法中，混合樹脂對(duì)于埃博霉素的吸附率為100％，完成結(jié)晶步驟時(shí)，埃博霉素的提取率為90％，純度為97％，完成高效液相分離后，埃博霉素A和B的提取率為89％，純度為99.99％。實(shí)施例2本發(fā)明利用混合樹脂吸附、固液分步萃取、分子篩層析、結(jié)晶和高效液相分離等技術(shù)手段，從一種粘細(xì)菌纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素，具體步驟順序如下(1)混合樹脂的配制將CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六種樹脂按重量比0.8∶0.8∶1.8∶0.8∶2.8∶1.8混合，懸溶于等體積的蒸餾水中制備成混合樹脂溶液。(2)混合樹脂吸附在進(jìn)行纖維堆囊菌發(fā)酵時(shí)，向1000ml液體培養(yǎng)基中添加1％(體積/體積)的混合樹脂進(jìn)行吸附，吸附劑存在于整個(gè)發(fā)酵流程之中，發(fā)酵結(jié)束后，過濾制得沉淀的吸附樹脂混合物，備用。(3)固液分步萃?、偈褂?0倍體積的甲醇對(duì)步驟(2)獲得的樹脂混合物進(jìn)行萃取，保溫31℃，46小時(shí)，離心除去樹脂，獲得第一部分萃取物；②將第一部分萃取物中的甲醇40℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10倍體積的二氯甲烷進(jìn)行第二步萃取，保溫20℃，46小時(shí)，離心除去沉淀，獲得第二部分萃取物；③將第二部分萃取物中的二氯甲烷30℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10倍體積的正己烷進(jìn)行第三步萃取，保溫21℃，46小時(shí)，離心收集沉淀，使用10％體積比的正己烷沖洗沉淀，獲得第三部分萃取物；(4)分子篩層析將上述第三部分萃取物重溶于2倍體積甲醇，以2％柱床體積的加樣量進(jìn)行葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)分子篩柱層析分離；流動(dòng)相為二氯甲烷，流速為0.5柱床體積/小時(shí)，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，埃博霉素的洗脫體積為1.9倍柱體積；(5)結(jié)晶將步驟(4)的收集樣品制備成丙酮的過飽和溶液，利用結(jié)晶器(結(jié)晶器構(gòu)造見附圖2)制備和收集結(jié)晶；方法是將恒溫槽加熱至45℃，將樣品放入結(jié)晶皿中，保溫30分鐘，至樣品全部溶解，然后開始梯度降溫，速率為0.5℃/30分鐘，降溫至36℃后，改用溶劑蒸發(fā)法，恒溫濃縮液體體積至原始體積的十分之一，在結(jié)晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素A和B的混合物；(6)高效液相分離若獲得完全純化的埃博霉素A或B，可采用高效液相進(jìn)行埃博霉素A和B混合物分離，使用反相半制備柱(Hypersil ODS2 C18)，規(guī)格為250×8mm，填料粒徑10μm，流速為2ml/min，249nm檢測(cè)，柱溫24℃，進(jìn)樣量100μl，檢測(cè)時(shí)間30min，流動(dòng)相為65％甲醇和35％水；埃博霉素A的滯留時(shí)間為9.6分鐘，埃博霉素B的滯留時(shí)間為11.1分鐘；收集后即可獲得純化的埃博霉素A或B。
在本發(fā)明的方法中，混合樹脂對(duì)于埃博霉素的吸附率為95％，完成結(jié)晶步驟時(shí)，埃博霉素的提取率為90％，純度為95％，完成高效液相分離后，埃博霉素A和B的提取率為82％，純度為99.91％。實(shí)施例3本發(fā)明利用混合樹脂吸附、固液分步萃取、分子篩層析、結(jié)晶和高效液相分離等技術(shù)手段，從一種粘細(xì)菌纖維堆囊菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素，具體步驟順序如下(1)混合樹脂的配制將CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六種樹脂按重量比1.2∶1.2∶2.3∶1.2∶3.2∶2.3混合，懸溶于等體積的蒸餾水中制備成混合樹脂溶液。(2)混合樹脂吸附在進(jìn)行纖維堆囊菌發(fā)酵時(shí)，向5000ml液體培養(yǎng)基中添加1％(體積/體積)的混合樹脂進(jìn)行吸附，吸附劑存在于整個(gè)發(fā)酵流程之中，發(fā)酵結(jié)束后，過濾制得沉淀的吸附樹脂混合物，備用。(3)固液分步萃?、偈褂?0倍體積的甲醇對(duì)步驟(2)獲得的樹脂混合物進(jìn)行萃取，保溫50℃，28小時(shí)，離心除去樹脂，獲得第一部分萃取物；②將第一部分萃取物中的甲醇40℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用20倍體積的二氯甲烷進(jìn)行第二步萃取，保溫30℃，26小時(shí)，離心除去沉淀，獲得第二部分萃取物；③將第二部分萃取物中的二氯甲烷30℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用20倍體積的正己烷進(jìn)行第三步萃取，保溫30℃，28小時(shí)，離心收集沉淀，使用10％體積比的正己烷沖洗沉淀，獲得第三部分萃取物；(4)分子篩層析將上述第三部分萃取物重溶于2倍體積甲醇，以5％柱床體積的加樣量進(jìn)行葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)分子篩柱層析分離；流動(dòng)相為二氯甲烷，流速為0.5柱床體積/小時(shí)，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，埃博霉素的洗脫體積為2.1倍柱體積；(5)結(jié)晶將步驟(4)的收集樣品制備成丙酮與2-丁酮等體積混合的過飽和溶液，利用結(jié)晶器(結(jié)晶器構(gòu)造見附圖2)制備和收集結(jié)晶；方法是將恒溫槽加熱至60℃，將樣品放入結(jié)晶皿中，保溫15分鐘，至樣品全部溶解，然后開始梯度降溫，速率為1.5℃/30分鐘，降溫至40℃后，改用溶劑蒸發(fā)法，恒溫濃縮液體體積至原始體積的十分之一，在結(jié)晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素A和B的混合物；(6)高效液相分離若獲得完全純化的埃博霉素A或B，可采用高效液相進(jìn)行埃博霉素A和B混合物分離，使用反相半制備柱(Hypersil ODS2 C18)，規(guī)格為250×8mm，填料粒徑10μm，流速為2ml/min，249nm檢測(cè)，柱溫24℃，進(jìn)樣量100μl，檢測(cè)時(shí)間30min，流動(dòng)相為65％甲醇和35％水；埃博霉素A的滯留時(shí)間為9.6分鐘，埃博霉素B的滯留時(shí)間為11.1分鐘；收集后即可獲得純化的埃博霉素A或B。
在本發(fā)明的方法中，混合樹脂對(duì)于埃博霉素的吸附率為99.5％，完成結(jié)晶步驟時(shí)，埃博霉素的提取率為90％，純度為97％，完成高效液相分離后，埃博霉素A和B的提取率為89％，純度為99.97％。附件1提純后的埃博霉素A和B的體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)報(bào)告檢測(cè)報(bào)告書樣品名稱提純后的埃博霉素(Epothilone)A和B送檢單位山東大學(xué)生命學(xué)院位生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室送檢人李越中檢測(cè)目的檢測(cè)兩樣品是否能夠在體外殺死腫瘤細(xì)胞Hela和Bel-7402收樣日期2001.5.29 報(bào)告日期2001.6.8樣品(1)緩沖液對(duì)照樣；(2)埃博霉素A；(3)埃博霉素B。檢測(cè)方法MTT法檢測(cè)結(jié)果報(bào)告如下測(cè)試細(xì)胞株Hela
測(cè)試細(xì)胞株Bel-7402
結(jié)論(2)號(hào)樣品在濃度大于50ng/ml時(shí)，可以殺死兩種腫瘤細(xì)胞；(3)號(hào)樣品在濃度大于10ng/ml時(shí)，可以殺死兩種腫瘤細(xì)胞。兩樣品均具有明顯的體外抗腫瘤活性。附件2提純后的埃博霉素A和B的促微管聚合活性實(shí)驗(yàn)報(bào)告檢測(cè)報(bào)告書樣品名稱提純后的埃博霉素(Epothilone)A和B送檢單位山東大學(xué)生命學(xué)院位生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室送檢人李越中檢測(cè)目的檢測(cè)兩樣品是否能夠在無(wú)GTP條件下促進(jìn)微管的體外聚合收樣日期2001.6.2報(bào)告日期2001.6.16樣品(1)緩沖液對(duì)照樣；(2)埃博霉素A；(3)埃博霉素B。檢測(cè)方法變溫紫外分光光度法檢測(cè)結(jié)果報(bào)告如圖9所示。結(jié)論(2)號(hào)和(3)號(hào)樣品均能在不存在GTP的情況下，明顯的促進(jìn)微管再體外的聚合作用，而且(3)號(hào)樣品的活性高于(2)號(hào)樣品。
權(quán)利要求
1.一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的方法，該方法具體步驟順序如下(1)混合樹脂的配制將CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六種樹脂按重量比0.8～1.2∶0.8～1.2∶1.8～2.2∶0.8～1.2∶2.8～3.2∶1.8～2.2混合，懸溶于等體積的蒸餾水中，制備成混合樹脂溶液；(2)混合樹脂吸附在進(jìn)行粘細(xì)菌發(fā)酵時(shí)，向液體培養(yǎng)基中添加0.1％-5％(體積/體積)的上述混合樹脂進(jìn)行吸附，吸附劑存在于整個(gè)發(fā)酵流程之中，發(fā)酵結(jié)束后，過濾制得沉淀的吸附樹脂混合物，備用；(3)固液分步萃取①使用10-20倍體積的甲醇對(duì)步驟(2)獲得的樹脂混合物進(jìn)行萃取，保溫30-50℃，24-48小時(shí)，離心除去樹脂，獲得第一部分萃取物；②將第一部分萃取物中的甲醇40℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10-20倍體積的二氯甲烷進(jìn)行第二步萃取，保溫20-30℃，24-48小時(shí)，離心除去沉淀，獲得第二部分萃取物，③將第二部分萃取物中的二氯甲烷30℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10-20倍體積的正己烷進(jìn)行第三步萃取，保溫20-30℃，24-48小時(shí)，離心收集沉淀，使用10％體積比的正己烷沖洗沉淀，獲得第三部分萃取物；(4)分子篩層析將上述第三部分萃取物重溶于2倍體積甲醇，以2-5％柱床體積的加樣量進(jìn)行葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20)分子篩柱層析分離；流動(dòng)相為甲醇或二氯甲烷，流速為0.5柱床體積/小時(shí)，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，埃博霉素的洗脫體積為1.5-2.5倍柱體積；(5)結(jié)晶將步驟(4)的收集樣品制備成酮類的過飽和溶液，利用結(jié)晶器制備和收集結(jié)晶；方法是將恒溫槽加熱至45-60℃，將樣品放入結(jié)晶皿中，保溫15-30分鐘，至樣品全部溶解，然后開始梯度降溫，速率為0.5～3℃/30分鐘，降溫至35-40℃后，改用溶劑蒸發(fā)法，恒溫濃縮液體體積至原始體積的十分之一，在結(jié)晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結(jié)晶，即為埃博霉素A和B的混合物；(6)高效液相分離若獲得完全純化的埃博霉素A或B，可采用高效液相進(jìn)行埃博霉素A和B混合物分離，使用反相半制備柱(Hypersil ODS2 C18)，規(guī)格為250×8mm，填料粒徑10μm，流速為2ml/min，249nm檢測(cè)，柱溫24℃，進(jìn)樣量100μl，檢測(cè)時(shí)間30min，流動(dòng)相為65％甲醇和35％水；埃博霉素A的滯留時(shí)間為9.6分鐘，埃博霉素B的滯留時(shí)間為11.1分鐘；收集后即可獲得純化的埃博霉素A或B。
2.如權(quán)利要求1所述的一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的方法，其特征在于，步驟(1)所述的CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六種樹脂混合的重量比是1∶1∶2∶1∶3∶2。
3.如權(quán)利要求1所述的一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的方法，其特征在于，步驟(2)所述的進(jìn)行吸附用混合樹脂添加量為液體培養(yǎng)基體積比的0.5％-2％。
4.如權(quán)利要求1所述的一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的方法，其特征在于，步驟(3)所述的①中，最適宜的萃取溫度為35-40℃。
5.如權(quán)利要求1所述的一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的方法，其特征在于，步驟(3)所述的②中，最適宜的萃取溫度為22-25℃。
6.如權(quán)利要求1所述的一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的方法，其特征在于，步驟(3)所述的③中，最適宜的萃取溫度為25-28℃。
7.如權(quán)利要求1所述的一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的方法，其特征在于，步驟(4)所述的最適加樣量為2.5-3.8％柱床體積。
8.如權(quán)利要求1所述的一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的方法，其特征在于，步驟(4)所述的埃博霉素的洗脫體積，在使用甲醇為流動(dòng)相時(shí)，洗脫體積為1.8-2.3倍柱體積；在使用二氯甲烷為流動(dòng)相時(shí)，洗脫體積為1.5-2.1倍柱體積。
9.如權(quán)利要求1所述的一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的方法，其特征在于，步驟(5)所述酮類的過飽和溶液是2-丁酮或者丙酮中的一種或兩種。
10.如權(quán)利要求1所述的一種從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提純埃博霉素的方法，其特征在于，步驟(5)所述的梯度降溫的最適速率為0.5～1℃/30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從發(fā)酵液中分離提取埃博霉素(Epothilone)的方法,它是利用混合樹脂吸附、固液分步萃取、分子篩層析、結(jié)晶和高效液相分離等技術(shù)手段,從粘細(xì)菌發(fā)酵液中分離提取埃博霉素,獲得高純度的抗腫瘤化合物。并且,埃博霉素A和B的提取得率達(dá)到了80%以上,降低了成本,提高了效率,大大提高了工業(yè)化生產(chǎn)的可行性和可放大性,具有很好的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C07D305/00GK1369484SQ0211006
公開日2002年9月18日 申請(qǐng)日期2002年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月7日
發(fā)明者胡瑋, 李越中, 劉新利, 韓冠君 申請(qǐng)人:山東大學(xué)