專利名稱：4－胍基苯甲酰胺類抗生育化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，是一類具有抑制人精子頂體酶活性的4-胍基苯甲酰胺類抗生育化合物。
背景技術：
實行計劃生育，控制人口增長是全球性的工作，也是我國的基本國策。目前臨床上常用的避孕方法主要有外科手術，永久或可逆性地阻斷輸卵管或輸精管，這種方法對一對夫婦只生一個孩子后顧之憂甚大，難為大眾接受；避孕工具，如使用安全套，宮頸帽，節(jié)育環(huán)等阻止精子運動，這些方法亦存在諸多問題，如避孕套的異物感、刺激性，宮內節(jié)育器的脫環(huán)、帶環(huán)妊娠、出血等問題；避孕藥物，多年來應用最多的是激素類避孕藥，這類藥物干擾正常人的生理機能，副作用大，應用受到限制。另外，外用避孕藥臨床也有應用，由于這類藥物避孕效果不夠理想，加之其它副反應，臨床上未能推廣應用。當今，尋找高效、低毒尤其是避孕機理獨特的男性避孕藥，成為各國研究人員研究的新熱點。
眾多的研究表明，人精子頂體部分的頂體酶是受精過程中精卵結合必不可少的蛋白水解酶，抑制頂體酶可阻止受精，達到避孕目的。各國研究人員相繼開展了尋找人精子頂體酶抑制劑工作，這方面主要研究有從天然動植物和微生物中尋找蛋白酶抑制劑。Schill等利用明膠薄層技術研究蛋白酶抑制劑對精子頂體膜的穿透作用，結果表明以上兩類蛋白酶抑制劑抑制效果均很差，不能作為避孕藥進一步開發(fā)。Joyce C等發(fā)現對甲苯磺酰賴氨酰氯甲基酮(TLCK)對頂體酶有較好抑制作用，遺憾的是TLCK具極強的致癌性。Kaminsk等用酚取代對-硝基酚合成了一系列芳香族4-胍基苯甲酸酯鹽，經體外及動物體內抗生育試驗表明具有低毒、高效抗生育作用(J.Med.Chem.1986，29514～519)，但由于該類化合物具有酚酯結構，化學性質不穩(wěn)定。但研究表明，4-胍基苯甲酸是頂體酶抑制劑的必需結構。

發(fā)明內容
眾所周知，酯鍵與酰胺鍵是電子等排體，酰胺鍵比酯鍵穩(wěn)定，因此本發(fā)明將4-胍基苯甲酸制備成4-胍基苯甲酸酰胺類化合物。該類化合物化學性質穩(wěn)定，具有顯著的抑制人精子頂體酶活性，是一類高效、低毒的新型抗生育化合物。本發(fā)明化合物的結構式通式為 其中R基團表示-CH2CH2CH3-(CH2)7CH3-[(CH2)4CH3]2-C(CH3)3-COCH＝CH2 本發(fā)明化合物的合成路線分兩步敘述一、制備關鍵中間體4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽，合成路線如下
具體操作過程為1.取對氨基苯甲酸于水溶液中，在鹽酸存在下與硫氰酸銨作用，生成異硫脲基苯甲酸鹽酸鹽；2.異硫脲基苯甲酸鹽酸鹽在乙醇溶液中與碘甲烷反應，生成4-{[(氨基-甲硫基)甲基]氨基}苯甲酸氫碘酸鹽；3.4-{[(氨基-甲硫基)甲基]氨基}苯甲酸氫碘酸鹽與過量氨水反應生成4-胍基苯甲酸；4.4-胍基苯甲酸與過量氯化亞砜作用生成4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽。
二、合成目標化合物，合成路線如下 操作過程為將胺類化合物溶于四氫呋喃，在三乙胺作用下與新鮮制備的4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽反應，得4-胍基苯甲酰胺類化合物。
具體實施例方式試劑與材料試劑與材料規(guī)格 購買公司對氨基苯甲酸 CP 中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司鹽酸 CP 中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司硫氰酸銨 CP 中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司無水乙醇 CP 中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司碘甲烷 CP 中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司氨水 CP 中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司丙胺 CP 中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司特丁基胺 CP 中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司4-氟苯胺 CP 中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司2，4-二氯苯胺 CP 中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司4-硝基苯胺 CP 中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司4-甲基苯胺 CP 中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司2-氨基吡啶 CP 中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司三乙胺 CP 中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司四氫呋喃 CP 中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司一)、制備中間體實施例1中間體4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽的制備(1)合成異硫脲基苯甲酸鹽酸鹽對氨基苯甲酸0.5mole，水1500ml，濃鹽酸0.5mole，硫氰酸銨0.55mole，水浴60～70℃，攪拌反應，得異硫脲基苯甲酸鹽酸鹽白色固體粗制品，再將此固體傾入10％NaOH400ml溶液中，活性炭脫色，濾液以20％鹽酸中和至pH2～3，得異硫脲基苯甲酸鹽酸鹽白色固體101g，產率86.8％。
(2)合成4-{[(氨基-甲硫基)甲基]氨基}苯甲酸氫碘酸鹽異硫脲基苯甲酸鹽酸鹽0.5mole，無水乙醇650ml，碘甲烷1mole，于90℃水浴，攪拌回流2小時，得4-{[(氨基-甲硫基)甲基]氨基}苯甲酸氫碘酸鹽固體141g，產率83.1％。
(3)合成4-胍基苯甲酸4-{[(氨基-甲硫基)甲基]氨基}苯甲酸氫碘酸鹽0.5mole，氨水2.5mole，40～50℃攪拌反應2小時，得白色固體，過濾，水洗，乙醇重結晶后得對4-基苯甲酸78g，產率87.7％(元素分析實側值C 53.61％；H 5.07％；N 23.42％)。
(4)合成4-對-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽4-胍基苯甲酸0.1mole，氯化亞砜1mole，攪拌回流1小時，放冷，固體過濾，石油醚洗滌固體，得4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽19g，產率81.2％。
二)、制備具有不同R基的4-胍基苯甲酰胺類化合物實施例2N-丙基-4-胍基苯甲酰胺的制備(R基為CH2CH2CH3)取丙胺0.02mole，四氫呋喃30ml，三乙胺3ml，攪拌，加4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽0.04mole(新鮮制)，室溫攪拌反應2小時，得N-丙基-4-胍基苯甲酰胺粗品，粗品經柱層析純化，得N-丙基-4-胍基苯甲酰胺白色固體3.5g。
實施例3N-(4-氟-苯基)-4-胍基苯甲酰胺的制備(R基為4-氟苯基)取4-氟苯胺0.01mole，四氫呋喃15ml，三乙胺3ml，于攪拌下加入4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽0.015mole，0℃反應1個半小時后，室溫反應6小時，得N-(4-氟-苯基)-4-胍基苯甲酰胺粗品，粗品經柱層析純化，得N-(4-氟-苯基)-4-胍基苯甲酰胺精品3.1g。
實施例4N-(4-氨基磺酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺的制備(R基為4-氨基磺酰苯基)4-氨基苯磺酰胺0.01mole，四氫呋喃15ml，三乙胺3ml，氮氮二甲基甲酰胺(DMF)5ml，攪拌溶解，于15℃，加入4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽0.01mole，加畢，65℃反應12小時，得N-(4-氨基磺酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺粗品，粗品經柱層析純化，得N-(4-氨基磺酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺精品2.8g。
實施例5N-(4-乙氧甲酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺的制備(R基為4-乙氧甲酰苯基)對氨基苯甲酸乙酯0.01mole，四氫呋喃15ml，三乙胺2.5ml，攪溶，冰浴下加入4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽0.01mole，攪拌3小時，生成黃色沉淀，過濾得N-(4-乙氧甲酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺粗品，粗品以甲醇精制，得N-(4-乙氧甲酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺2.9g。
實施例6N-(2-吡啶基)-4-胍基苯甲酰胺的制備取2-氨基吡啶0.01mole，四氫呋喃20ml，三乙胺3ml，室溫下加入4-胍基苯甲酰氯鹽酸鹽0.02mole，55℃攪拌反應6小時，得N-(2-吡啶基)-4-胍基苯甲酰胺粗品，粗品經柱層析純化，得N-(2-吡啶基)-4-胍基苯甲酰胺純品1.9g。
對于R基分別為-(CH2)7CH3-[(CH2)4CH3]2-C(CH3)3-COCH＝CH2的4-胍基苯甲酰胺類化合物，制備方法同實施例2。R基分別為 的4-胍基苯甲酰胺類化合物，制備方法同實施例3。R基分別為 的4-胍基苯甲酰胺類化合物，制備方法同實施例4。R基為 的N-(4-甲氧甲酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺，制備方法同實施例5。
所有4-胍基苯甲酰胺類化合物均可制成鹽酸鹽、硫酸鹽、甲烷磺酸鹽。
現已合成的化合物見表1，其中部分4-胍基苯甲酰胺類化合物的核磁氫譜見表2。表1 4-胍基苯甲酰胺類化合物的結構、分子式結構通式 化合物編號 R 基團 分子式1 -CH2CH2CH3C11H17ClN4O2 -(CH2)7CH3C16H27ClN4O3 -[(CH2)4CH3]2C18H31ClN4O4 -C(CH3)3C12H19ClN4O5 C11H13ClN4O26C14H15ClN4O7 C14H14ClN4F8 C14H14ClN4I9 C14H13Cl3ON410 C14H14ClO3N511 C14H13ClO5N612 C14H18ClO3N5S13 C15H14ClON4F314 C15H17ClON415 C16H19ClON4化合物編號 R 基團 分子式16 C16H19ClON417 C16H17ClO2N418C17H19ClN4O319 C13H14ClN5O20C11H12N6ClO21 C13H14N5ClO22 C12H13N6ClO23C11H12N5ClOS24C11H12N5ClO2
表2部分4-胍基苯甲酰胺類化合物核磁H譜結構通式 化合物編號 R 基團HNMR DMSO-D60.85(t，3H)1.4～1.6(m，2H)3.1～3.3(m，2H)7.25(d，J＝8.50Hz，2H)7.737(s，3H)1 -CH2CH2CH37.95(d，J＝8.50Hz，2H)8.5～8.6(m，1H)10.40(s，1H)0.85(m，5H)1.1～1.6(m，10H)3.1～3.3(m，2H)7.25(d，J＝8.50Hz，2H)7.74(s，3H)2 -(CH2)7CH37.90(d，J＝8.5Hz，2H)8.04(s，1H)8.55(t，1H)10.41(s，1H)7.15(d，J＝8.6Hz，2H)7.35(d，J＝8.4Hz，2H)7.65(d，J＝8.4Hz，2H)8.05(d，J＝8.6Hz6 ，2H)10.44(s，1H)7.08(m，1H)10.45(s，1H)6.95(d，J＝8.5Hz，2H)7.8(s，3H)7.35(d，J＝8.6Hz，2H)7.95(d，J＝8.5Hz，2H)8.05(8 d，J＝8.6Hz，2H)10.44(s，1H)10.48(s，1H)7.35(d，J＝8.6Hz，2H)7.8～7.9(m，4H)735(d，J＝8.5Hz，2H)7.77(s，3H)9 10.42(s，1H)2.16(s，3H)2.27(s，3H)6.9～7.2(m，3H)7.35(d，J＝8.5Hz，2H)7.77(s，3H)15 8.05(d，J＝8.5Hz，2H)9.90(s，1H)10.44(s，1H)2.15(s，3H)2.27(s，3H)6.95(m，3H)7.15(d，J＝8.50Hz，2H)7.35(d，J＝8.40Hz，2H)16 7.72(s，3H)8.05(d，J＝8.5Hz，2H)9.89(s，1H)10.34(s，1H)
藥理試驗精子頂體蛋白酶是一種類胰蛋白酶，具有溶解明膠的特性。精子在超薄明膠膜上孵育，先是頂體破潰解聚，導致頂體酶釋放，繼而于明膠基質上溶解形成一個圍繞精子頭部可見的暈輪，通過顯微鏡可觀察精子暈輪的陽性反應率和暈輪直徑，前者反應了有受精能力精子的百分比，后者則反應了單個精子頂體酶活性的強弱。本實驗采用明膠底物膜法，觀察了十九個化合物對人精子頂體酶活性抑制的情況，測定了人精子頂體酶對明膠反應陽性率及平均暈輪直徑。結果見表3、表4、表5。
檢測方法如下1、明膠膜的制作將408mg干明膠放入12ml蒸餾水中浸泡15分鐘，于40℃水浴中使其溶解。再將明膠溶液升溫至50℃，然后準確量取0.1ml明膠溶液，滴在潔凈的載玻片上，制成45×20mm2薄膜。隨即放于4℃冰箱內3～5分鐘，置室溫下干燥18小時。將已干燥的明膠膜用0.05％的戊二醛固定再用巴比妥醋酸緩沖液調整膜的pH為7.0±0.05，0.5％的臺盼藍滴染。
2、精子的處理用0.1mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌精子二次，并調整精子濃度為50×106個/ml，向不同濃度的4-胍基苯甲酰胺化合物1ml液中各加入0.2ml的精子懸液，室溫下孵育5分鐘取一滴(約50μl)上述精子混和液滴于明膠膜上，用另一干凈玻片將精子懸液涂均勻，然后放入37℃恒溫箱內孵育3小時，取出，空氣干燥，中性樹膠封固。
3、測定光鏡觀察，凡精子頭部周圍出現白色亮區(qū)者為陽性反應。平均暈輪陽性率(mean halorate mHR)(％)數各視野中100個精子，計數其中有陽性反應的精子數目。
平均暈輪直徑(mean halo diameter，mHD)(微米)，用顯微鏡測微尺測量暈輪直徑。當暈輪不是圓形而呈半月形時，取其長短之和的一半作為暈輪直徑。測50個精子暈輪直徑，取平均值。
4、結果本實驗分實驗組、空白對照組及陽性對照組(TLCK組)。結果表明，實驗組所有化合物均有不同程度抑制精子頂體蛋白酶的作用。其中表4中的第18號化合物抑制頂體酶活性最強。表3脂肪胺類化合物對人精子頂體酶活性抑制的檢測結果 化合物編號 管號R 基團陽性率 反應暈輪直徑X±SD藥物濃度(mg/ml)1′ 0％01×10-32′ 45％ 22.91±0.46 1×10-51 -CH2CH2CH33′ 48％ 22.94±0.48 1×10-74′ 56％ 23.27±0.49 1×10-91′ 0％01×10-32′ 38％ 12.30±0.33 1×10-52 -(CH2)7CH33′ 43％ 19.93±0.50 1×10-74′ 56％ 21.95±0.30 1×10-91′ 16％ 7.42±0.46 1×10-32′ 40％ 9.31±0.30 1×10-53 -[(CH2)4CH3]23′ 53％ 16.96±0.53 1×10-74′ 60％ 25.94±0.56 1×10-91′ 10％ 5.87±0.73 1×10-32′ 38％ 8.64±0.85 1×10-54 -C(CH3)33′ 51％ 19.93±0.38 1×10-74′ 68％ 25.97±4.26 1×10-91′ 0％01×10-32′ 15％ 8.98±0.25 1×10-553′ 31％ 10.97±0.37 1×10-74 52％ 23.27±0.26 1×10-9對照 68％ 26.27±0.47 8％DMSO表4取代苯胺類化合物對人精子頂體酶活性抑制的檢測結果 反應暈輪直徑藥物濃度化合物編號 管號R基團 陽性率X±SD(mg/ml)1′ 12％ 6.60±0.19 1×10-32′40％ 14.25±0.39 1×10-56 3′ 45％ 17.29±0.48 1×10-74′ 61％ 26.93±0.51 1×10-91′ 21％ 14.96±0.35 1×10-32′38％ 21.61±0.52 1×10-57 3′ 40％ 25.27±0.20 1×10-74′ 45％ 25.93±0.27 1×10-91′ 0％0 1×10-32′ 40％ 15.44±0.47 1×10-58 3′ 58％ 21.66±1.16 1×10-74′ 66％ 22.86±0.77 1×10-91′ 0％0 1×10-32′ 10％ 19.28±0.47 1×10-59 3′ 21％ 22.61±0.48 1×10-74′ 60％ 25.92±0.35 1×10-91′ 0％0 1×10-32′ 10％ 14.63±0.48 1×10-5103′21％ 20.58±0.55 1×10-74′43％ 26.60±0.47 1×10-91′0％0 1×10-32′10％ 13.60±0.84 1×10-5113′21％ 18.14±0.66 1×10-74′43％ 19.89±0.33 1×10-91′0％ 0 1×10-32′6％ 5.72±0.56 1×10-5123′ p 20％ 15.37±0.47 1×10-74′33％ 16.01±0.57 1×10-9
反應暈輪直徑 藥物濃度化合物編號管號R 基團陽性率 X±SD (mg/ml)1′ 0％ 0 1×10-32′10％ 8.55±0.45 1×10-513 3′ 38％ 19.66±0.44 1×10-74′ 44％ 21.11±0.67 1×10-91′ 0％0 1×10-32′ 30％ 9.64±0.28 1×10-514 3′ 45％ 17.30±0.31 1×10-74′ 54％ 20.89±0.43 1×10-91′ 4％ 5.38±0.41 1×10-32′ 38％ 14.29±0.39 1×10-515 3′ 58％ 25.60±0.36 1×10-74′ 66％ 25.97±0.30 1×10-91′ 13％ 7.21±0.28 1×10-32′ 40％ 17.34±0.84 1×10-516 3′ 48％ 21.61±0.38 1×10-74′ 61％ 27.90±0.40 1×10-91′ 0％0 1×10-32′ 30％ 11.84±0.41 1×10-517 3′ 58％ 18.32±0.40 1×10-74′ 66％ 19.99±0.71 1×10-91′ 0％0 1×10-32′ 3％ 4.25±0.29 1×10-518 3′ 16％ 9.32±0.45 1×10-74′ 25％ 14.18±0.36 1×10-9對照 70％ 22.86±0.75 8％DMSO表5 雜環(huán)芳胺類化合物和TLCK對人精子頂體酶活性抑制的檢測結果 反應暈輪直徑 藥物濃度化合物編號管號R基團 陽性率 X±SD (mg/ml)1′0％ 0 1×10-32′18％ 9.64±0.471×10-519 3′33％ 11.32±0.37 1×10-74′50％ 22.61±1.16 1×10-9對照 80％ 29.59±0.37 8％DMSO0％0 5.012.8％6.59±1.58 4.028.9％8.95±1.68 3.036.0％10.57±1.462.5性對 TLCK42.8％11.67±1.792.0照 58.6％12.75±2.001.0組63.50％ 15.82±2.160.570.70％ 19.49±1.820.2577.10％ 21.51±3.410.12權利要求
1.4-胍基苯甲酰胺類化合物，其結構通式為 其中R基團表示-CH2CH2CH3-(CH2)7CH3-[(CH2)4CH3]2-C(CH3)3-COCH＝CH2
2.權利要求1所述4-胍基苯甲酰胺類化合物用于制備抗生育藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，是一類具有抑制人精子頂體酶活性的4－胍基苯甲酰胺類抗生育化合物。該類化合物的結構通式為Ⅰ式，其中R基團表示－CH
文檔編號C07D233/88GK1401634SQ0211234
公開日2003年3月12日 申請日期2002年7月2日 優(yōu)先權日2002年7月2日
發(fā)明者呂加國, 朱駒, 周有駿, 張萬年, 季海濤, 余建鑫, 宋云龍, 盛春泉, 姚建忠, 朱杰 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學