專利名稱：人腦組織特異性分子標(biāo)志物lrrc4的制作方法
專利說(shuō)明人腦組織特異性分子標(biāo)志物L(fēng)RRC4 本發(fā)明涉及人腦瘤基因診斷及基因治療的分子標(biāo)志物。腦瘤是一種嚴(yán)重危害人類生命健康和生活質(zhì)量的腫瘤，近年來(lái)，腦瘤在我國(guó)的發(fā)病率以每年1.5-4.5％的速度逐年上升，對(duì)于腦瘤的早期診斷和治療，因?yàn)槟X的位置特殊，目前還沒(méi)有特別有效的方法。對(duì)于其它腫瘤有效的治療方案如手術(shù)治療在腦瘤的治療中效果不理想，而大多數(shù)腦瘤對(duì)其它療法如放療和化療等不敏感，因而急待開(kāi)發(fā)用于腦瘤治療的新型手段。盡管有研究表明腦瘤的發(fā)生與一些基因的異常有關(guān)，然而至今尚未開(kāi)發(fā)出用于腦瘤分子診斷和治療的生物標(biāo)志。本發(fā)明的目的在于提供一種新型的腦瘤分子診斷試劑盒及治療腦瘤的藥物。
本發(fā)明采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法克隆LRRC4全長(zhǎng)編碼區(qū)蛋白和LRRC4不同結(jié)構(gòu)域蛋白編碼序列，構(gòu)建LRRC4基因片段的融合表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)其在大腸桿菌中的表達(dá)，SDS-PAGE電泳，Western blot鑒定。運(yùn)用谷胱甘肽親和樹(shù)脂純化法獲得純化的LRRC4蛋白。用反相HPLC對(duì)純化蛋白的純度進(jìn)行鑒定。用包涵體沉淀免疫新西蘭兔獲得針對(duì)LRRC4的高效價(jià)的多克隆抗體。用于人腦瘤早期診斷的試劑盒和新的腦瘤治療藥物。
本發(fā)明所述腦特異性新基因LRRC4Genbank登錄號(hào)為AF196976，鼠同源基因mLRRC4Genbank登錄號(hào)為AF290542。
技術(shù)方案為(1)LRRC4基因在腦瘤組織的表達(dá)抽提正常成人腦挫裂傷腦組織和手術(shù)切除腦瘤標(biāo)本總RNA，經(jīng)DNase-I處理后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)LRRC4基因編碼區(qū)靠近3’引物，RT-PCR檢測(cè)LRRC4在正常腦組織和腦瘤標(biāo)本的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LRRC4在人100％(7/7)的正常腦組織表達(dá)強(qiáng)，而在80％以上(61/72)的原發(fā)性腦瘤組織表達(dá)明顯下調(diào)和缺失。圖2顯示了部分腦瘤的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。
(2)LRRC4融合蛋白的原核表達(dá)①據(jù)原核表達(dá)載體pEGX-4T-2的GST閱讀框架設(shè)計(jì)引物，使LRRC4基因的編碼區(qū)閱讀框、去LRR結(jié)構(gòu)和N端疏水區(qū)的截短型LRRC4突變體、去LRR結(jié)構(gòu)、去N端和C端疏水區(qū)的LRRC4突變體與GST的閱讀框架一致。引物序列5’端帶EcoRI酶切位點(diǎn)，3’端引物帶BamHI酶切位點(diǎn)。②以成人腦cDNA文庫(kù)為模板，PCR分別擴(kuò)增LRRC4基因全長(zhǎng)編碼區(qū)、去LRR結(jié)構(gòu)和N端疏水區(qū)的截短型LRRC4突變體、只包含IgC2的LRRC4突變體。用EcoR I和BamH I酶切PCR回收產(chǎn)物及pEGX-4T-2載體，產(chǎn)生匹配的粘末端。③將pEGX-4T-2載體分別與LRRC4閱讀框及其截短型閱讀框連接，構(gòu)建成符合讀框的融合基因。用含融合基因的pEGX-4T-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，小量制備質(zhì)粒DNA，EcoR I和BamH I酶切鑒定是否含插入片段，含插入片段的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒DNA純化后用DNA自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。④挑單個(gè)陽(yáng)性菌落接種入含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)液中，37℃，過(guò)夜培養(yǎng)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，在培養(yǎng)的不同時(shí)刻(0.5、1、2、3、4和5小時(shí))各取1ml菌液，離心后去上清；將沉淀重懸于25μl TE中，再加25μl 2×SDS凝膠加樣緩沖液(100mmol/L，Tris·HCl pH6.8，4％SDS，5％β-巰基已醇，0.002％溴酚藍(lán)，20％甘油)中，混勻菌液，20kHz超聲破碎后離心收集上清液；在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。80-120V室溫電泳8h?？捡R斯亮藍(lán)染色。成功地觀察到各種LRRC4融合蛋白的表達(dá)。
(3)LRRC4蛋白的純化GST/LRRC4全長(zhǎng)編碼區(qū)蛋白和GST/去LRR結(jié)構(gòu)的截短型LRRC4蛋白表達(dá)量不大，純化困難，因此只對(duì)僅包含IgC2結(jié)構(gòu)域的LRRC4融合蛋白進(jìn)行純化。溶解后的包涵體用谷胱甘肽親和樹(shù)脂純化向包涵體溶解液中加入400μl 50％谷胱甘肽珠懸液，室溫輕輕混勻20min，離心，500×g1min，加入2ml冰預(yù)冷的PBS，洗滌3次，最后一次離心棄上清后加入200μl洗脫液(含50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L還原谷胱甘肽)，混勻15min，離心500g 1min，收集上清，上SDS-PAGE電泳檢測(cè)。同時(shí)使用反相HPLC進(jìn)行純化的融合蛋白純度測(cè)定平衡柱子20分鐘；開(kāi)始梯度，但不進(jìn)樣，目的是為了測(cè)試柱的純凈度；若運(yùn)行過(guò)程基線穩(wěn)定，開(kāi)始進(jìn)樣；將10μl樣品進(jìn)樣；將二極管矩陣檢測(cè)器設(shè)在220nm，按流速1mL/min，運(yùn)行梯度為等體積流動(dòng)相，分離多肽、蛋白，通過(guò)Waters 990數(shù)據(jù)處理站獲取分離圖譜。發(fā)現(xiàn)LRRC4結(jié)構(gòu)域蛋白純度高達(dá)98％(220nm)。
(4)多抗和單抗的制備和檢測(cè)純化蛋白加入等體積的福氏完全佐劑混勻，乳化后備用。多抗的免疫程序兔右足后趾注射30mg卡介苗。兩周后，注射抗原，采取背部多點(diǎn)注射。一周后加強(qiáng)一次，重復(fù)2-3次后采血?？寡逍r(jià)和純度的測(cè)定取Agar 1g，溶于100ml生理鹽水中，加熱溶解，澆板，使之自然凝固，厚約1mm。用打孔器按梅花型打孔，每?jī)煽组g隔距離約1cm。加樣將1mg/ml抗原稀釋，加入中央孔，抗體則依次倍比稀釋成1∶2，1∶4......1∶64，按順序加入外周各孔。待孔內(nèi)液體滲入后，置濕盒內(nèi)，37℃擴(kuò)散16～18小時(shí)，觀察結(jié)果。以出現(xiàn)沉淀線的抗體最高稀釋度為其效價(jià)，若出現(xiàn)一條細(xì)的清晰沉淀線，表明該抗體純度較高。當(dāng)效價(jià)達(dá)到要求后，處死動(dòng)物，收集血清。單抗的免疫程序免疫小鼠后收集腹腔巨噬細(xì)胞及小鼠的脾細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選陽(yáng)性克隆，大量培養(yǎng)，可收集抗體，也可接種小鼠后，收集其血清或腹水。用Western blotting檢測(cè)抗體通過(guò)聚丙烯酰胺電泳分離蛋白樣本和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。按如下操作進(jìn)行將蛋白樣本轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用封閉蛋白干粉1g，加0.02M PBST 100ml，37℃封閉1小時(shí)。用0.02M PBST洗滌硝酸纖維膜5分鐘/1次，抗體稀釋液按1∶200比例稀釋相應(yīng)的一抗，37℃孵育2小時(shí)。0.02M PBST洗滌硝酸纖維膜2次，0.02M PBST按1∶200比例稀釋相應(yīng)的酶標(biāo)二抗，37℃孵育30分鐘。0.02M PBST洗滌硝酸纖維膜4次，每次5分鐘；DAB顯色，觀察。
LRRC4在腦組織特異表達(dá)，在80％以上的原發(fā)性腦瘤中表達(dá)明顯下調(diào)或缺失，基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明其具有抑瘤功能。表明LRRC4具有作為腦瘤的分子標(biāo)志物用于腦瘤的基因診斷及基因治療的潛能。采用谷胱甘肽親和層析系統(tǒng)，可以得到LRRC4結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體，其高效價(jià)的抗體的制備和相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和研究將為人腦瘤的基因診斷和治療提供新的手段。通過(guò)對(duì)LRRC4的克隆，以獲得用于人腦瘤早期診斷的試劑盒和新的腦瘤治療藥物。

圖1RT-PCR檢測(cè)LRRC4在正常腦組織和原發(fā)性腦瘤中的表達(dá)，其中，圖1-A膠質(zhì)瘤，圖1-B腦膜瘤，圖1-C垂體瘤為主的其它腦瘤。
圖2.LRRC4融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，其中圖2-AGST/LRRC4全長(zhǎng)編碼區(qū)蛋白；圖2-BGST/去LRR結(jié)構(gòu)的截短型LRRC4蛋白；圖2-CGST/LRRC4的IgC2結(jié)構(gòu)域蛋白。
圖3.包涵體處理純化的GST-IgC2融合蛋白；其中1蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2包涵體裂解液的沉淀；3包涵體裂解液的上清；4純化的GST-IgC2融合蛋白。
圖4.反相HPLC檢測(cè)純化后的GST-IgC2融合蛋白(220nm)。
權(quán)利要求
1.一種人腦組織特異性分子標(biāo)志物，其特征在于本發(fā)明采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即PCR方法克隆LRRC4全長(zhǎng)編碼區(qū)蛋白和LRRC4不同結(jié)構(gòu)域蛋白編碼序列，構(gòu)建LRRC4基因片段的融合表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)其在大腸桿菌中的表達(dá)，SDS-PAGE電泳，Western blot鑒定，運(yùn)用谷胱甘肽親和樹(shù)脂純化法獲得純化的LRRC4蛋白，用包涵體沉淀免疫獲得針對(duì)LRRC4的高效價(jià)的多克隆抗體，用于人腦瘤早期診斷的試劑盒和新的腦瘤治療藥物。
全文摘要
一種人腦組織特異性分子標(biāo)志物。本發(fā)明運(yùn)用PCR方法克隆全長(zhǎng)和不同結(jié)構(gòu)域的LRRC4編碼蛋白序列，構(gòu)建相應(yīng)的LRRC4融合表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)LRRC4融合蛋白，并運(yùn)用谷胱甘肽親和樹(shù)脂純化法獲得純化的LRRC4蛋白，進(jìn)一步采用多點(diǎn)法制備兔多抗，骨髓瘤細(xì)胞融合法制備小鼠來(lái)源的抗LRRC4單抗。LRRC4的抗體的制備和相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和研究將為人腦瘤的基因診斷和治療提供新的手段，這些結(jié)果表明LRRC4具有作為腦瘤的分子標(biāo)志物用于腦瘤的基因診斷及基因治療的潛能。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1464068SQ0211420
公開(kāi)日2003年12月31日 申請(qǐng)日期2002年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月17日
發(fā)明者李桂源, 王潔如, 董利, 李小玲, 沈守榮, 周潔, 范松清 申請(qǐng)人:中南大學(xué)