專(zhuān)利名稱(chēng)：一種鋅指蛋白質(zhì)及其抗體的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)及其抗體；具體地說(shuō)，涉及一種與人的造血系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的蛋白質(zhì)及其抗體。
背景技術(shù)：
遺傳信息的實(shí)現(xiàn)過(guò)程離不開(kāi)基因表達(dá)的調(diào)控，至今為止發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子中有很多含有鋅指模體(zinc-finger motif)結(jié)構(gòu)。鋅指蛋白質(zhì)是指含有通過(guò)結(jié)合Zn2+穩(wěn)定的短的可以自我折疊形成“手指”結(jié)構(gòu)的一類(lèi)蛋白質(zhì)。由于其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以選擇性地結(jié)合特異的靶結(jié)構(gòu)，使鋅指蛋白質(zhì)在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生命過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。
根據(jù)鋅指模體序列特點(diǎn)，可以將鋅指蛋白質(zhì)分為6個(gè)類(lèi)別①C2H2型，②(C2)2型，③C4型，④C6型，⑤指環(huán)型，⑥LIM型。C2H2型鋅指蛋白質(zhì)含有最為典型的鋅指模體結(jié)構(gòu)，一般由28-30個(gè)氨基酸構(gòu)成，其基本序列為CX2-4CX3FX5LX2HX3-5H(其中X為任意氨基酸)，相鄰的鋅指模體間的序列往往都是保守的CH連接肽(H/C link)TGEKPYK。不同的鋅指蛋白質(zhì)中所含有的鋅指模體的數(shù)目相差很大，從1個(gè)到37個(gè)不等。
C2H2型鋅指蛋白質(zhì)中的鋅指模體以線性重復(fù)的排列方式存在于蛋白質(zhì)的C末端；然而除了鋅指模體外，1/3的C2H2型鋅指蛋白質(zhì)的N末端有75個(gè)氨基酸高度保守，被命名為krüppel相關(guān)性保守盒(krüppel-associated-boxes)，簡(jiǎn)稱(chēng)KRAB。KRAB往往含有兩個(gè)相連的保守區(qū)KRAB-A和KRAB-B，但也有鋅指蛋白質(zhì)僅含有KRAB-A，沒(méi)有KRAB-B。目前的研究表明，KRAB，特別是KRAB-A具有和其他的因子相互作用而介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制的功能。
鋅指蛋白質(zhì)家族是一類(lèi)非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，起著調(diào)控基因的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的作用。Krüppel型C2H2鋅指蛋白質(zhì)是鋅指蛋白質(zhì)家族最大的亞家族之一，到目前為止，已經(jīng)有數(shù)以百計(jì)的krüppel型C2H2鋅指蛋白質(zhì)被分離出來(lái)，并被發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化過(guò)程中起著重要的決定性作用。
一般而言，基因通過(guò)表達(dá)成蛋白質(zhì)而發(fā)揮其功能；對(duì)一個(gè)基因的研究最終是在蛋白質(zhì)水平上的研究。而蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)及鑒定等，都離不開(kāi)針對(duì)某一蛋白質(zhì)的特異的抗體。一個(gè)蛋白質(zhì)可以通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒óa(chǎn)生特異性的抗體，而這個(gè)抗體也僅能識(shí)別該蛋白質(zhì)。一個(gè)蛋白質(zhì)與其抗體是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系；在蛋白質(zhì)的研究中，其抗體是不可缺少的。
目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和分離出了許多與人的造血系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的蛋白質(zhì)，但是在本申請(qǐng)之前，沒(méi)有人公開(kāi)或發(fā)表過(guò)本發(fā)明的人krüppel型C2H2鋅指蛋白質(zhì)ZNF268及其抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種新的與人的造血系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的鋅指蛋白質(zhì)及其制備和應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種抗所述蛋白質(zhì)的抗體及其制備和應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的1、ZNF268蛋白質(zhì)本發(fā)明提供的一種新的與人的造血系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的蛋白質(zhì)，命名為ZNF268蛋白質(zhì)。ZNF268蛋白質(zhì)是一個(gè)典型的krüppel型C2H2鋅指蛋白質(zhì)，它含有948個(gè)氨基酸，其C端含有連續(xù)的24個(gè)保守的鋅指模體，N端有保守的KRAB區(qū)。ZNF268蛋白質(zhì)包括具有其氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽，或其活性片斷，或其活性衍生物。ZNF268蛋白質(zhì)對(duì)人的造血系統(tǒng)發(fā)育起關(guān)鍵性的作用，并與造血系統(tǒng)某些疾病的發(fā)病相關(guān)。
本ZNF268蛋白質(zhì)的序列為Met Ala Thr Arg Val Arg Thr Ala Ser Ile 10Trp Val Pro Pro Leu Gln Glu Arg Asn Ser 20Ser Trp Asp Arg Ile Arg Lys Leu Gln Gly 30Gln Glu Ser Ile Leu Gly Gln Gly Thr Pro 40Gly Leu Gln Pro Leu Pro Gly Thr Pro Arg 50Gln Lys Gln Lys Ser Arg Arg Ile Glu Lys 60Val Leu Glu Trp Leu Phe Ile Ser Gln Glu 70Gln Pro Lys Ile Thr Lys Ser Trp Gly Pro 80Leu Ser Phe Met Asp Val Phe Val Asp Phe 90Thr Trp Glu Glu Trp Gln Leu Leu Asp Pro 100Ala Gln Lys Cys Leu Tyr Arg Ser Val Met 110Leu Glu Asn Tyr Ser Asn Leu Val Ser Leu 120Gly Tyr Gln His Thr Lys Pro Asp Ile Ile 130Phe Lys Leu Glu Gln Gly Glu Glu Leu Cys 140Met Val Gln Ala Gln Val Pro Asn Gln Thr 150Ser Gly Asp Thr Val Trp Lys Ile Asp Asp 160Leu Met Asp Trp His Gln Glu Asn Lys Asp 170Lys Leu Gly Ser Thr Ala Lys Ser Phe Glu 180Cys Thr Thr Phe Gly Lys Leu Cys Leu Leu 190Ser Thr Lys Tyr Leu Ser Arg Gln Lys Pro 200His Lys Cys Gly Thr His Gly Lys Ser Leu 210Lys Tyr Ile Asp Phe Thr Ser Asp Tyr Ala 220Arg Asn Asn Pro Asn Gly Phe Gln Val His 230Gly Lys Ser Phe Phe His Ser Lys His Glu 240Gln Thr Val Ile Gly Ile Lys Tyr Cys Glu 250Ser Ile Glu Ser Gly Lys Thr Val Asn Lys 260Lys Ser Gln Leu Met Cys Gln Gln Met Tyr 270Met Gly Glu Lys Pro Phe Gly Cys Ser Cys 280Cys Glu Lys Ala Phe Ser Ser Lys Ser Tyr 290Leu Leu Val His Gln Gln Thr His Ala Glu 300Glu Lys Pro Tyr Gly Cys Asn Glu Cys Gly 310Lys Asp Phe Ser Ser Lys Ser Tyr Leu Ile 320Val His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys 330Leu His Glu Cys Ser Glu Cys Arg Lys Thr 340Phe Ser Phe His Ser Gln Leu Val Ile His 350Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Asn Pro Tyr 360Glu Cys Cys Glu Cys Gly Lys Val Phe Ser 370Arg Lys Asp Gln Leu Val Ser His Gln Lys 380Thr His Ser Gly Gln Lys Pro Tyr Val Cys 390Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Gly Leu Lys 400Ser Gln Leu Ile Ile His Glu Arg Ile His 410Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Asn Glu 420Cys Gln Lys Ala Phe Asn Thr Lys Ser Asn 430Leu Met Val His Gln Arg Thr His Thr Gly 440Glu Lys Pro Tyr Val Cys Ser Asp Cys Gly 450Lys Ala Phe Thr Phe Lys Ser Gln Leu Ile 460Val His Gln Gly Ile His Thr Gly Val Lys 470Pro Tyr Gly Cys Ile Gln Cys Gly Lys Gly 480Phe Ser Leu Lys Ser Gln Leu Ile Val His 490Gln Arg Ser His Thr Gly Met Lys Pro Tyr 500Val Cys Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Arg 510Ser Lys Ser Tyr Leu Ile Ile His Thr Arg 520Thr His Thr Gly Glu Lys Leu His Glu Cys 530Asn Asn Cys Gly Lys Ala Phe Ser Phe Lys 540Ser Gln Leu Ile Ile His Gln Arg Ile His 550Thr Gly Glu Asn Pro Tyr Glu Cys His Glu 560Cys Gly Lys Ala Phe Ser Arg Lys Tyr Gln 570Leu Ile Ser His Gln Arg Thr His Ala Gly 580Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Thr Asp Cys Gly 590Lys Ala Phe Gly Leu Lys Ser Gln Leu Ile 600Ile His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys 610Pro Phe Glu Cys Ser Glu Cys Gln Lys Ala 620Phe Asn Thr Lys Ser Asn Leu Ile Val His 630Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr 640Ser Cys Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Thr 650Phe Lys Ser Gln Leu Ile Val His Lys Gly 660Val His Thr Gly Val Lys Pro Tyr Gly Cys 670Ser Gln Cys Ala Lys Thr Phe Ser Leu Lys 680Ser Gln Leu Ile Val His Gln Arg Ser His 690Thr Gly Val Lys Pro Tyr Gly Cys Ser Glu 700Cys Gly Lys Ala Phe Arg Ser Lys Ser Tyr 710Leu Ile Ile His Met Arg Thr His Thr Gly 720Glu Lys Pro His Glu Cys Arg Glu Cys Gly 730Glu Lys Pro His Glu Cys Arg Glu Cys Gly 730Lys Ser Phe Ser Phe Asn Ser Gln Leu Ile 740Val His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Asn 750Pro Tyr Glu Cys Ser Glu Cys Gly Lys Ala 760Phe Asn Arg Lys Asp Gln Leu Ile Ser His 770Gln Arg Thr His Ala Gly Glu Lys Pro Tyr 780Gly Cys Ser Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser 790Ser Lys Ser Tyr Leu Ile Ile His Met Arg 800Thr His Ser Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys 810Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ile Trp Lys 820Ser Leu Leu Ile Val His Glu Arg Thr His 830Ala Gly Val Asn Pro Tyr Lys Cys Ser Gln 840
Cys Glu Lys Ser Phe Ser Gly Lys Leu Arg 850Leu Leu Val His Gln Arg Met His Thr Arg 860Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Ser Glu Cys Gly 870Lys Ala Phe Ile Arg Asn Ser Gln Leu Ile 880Val His Gln Arg Thr His Ser Gly Glu Lys 890Pro Tyr Gly Cys Asn Glu Cys Gly Lys Thr 900Phe Ser Gln Lys Ser Ile Leu Ser Ala His 910Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Cys 920Lys Cys Thr Glu Cys Gly Lys Ala Phe Cys 930Trp Lys Ser Gln Leu Ile Met His Gln Arg 940Thr His Val Asp Asp Lys His *** 9482、ZNF268蛋白質(zhì)的制備ZNF268蛋白質(zhì)的制備包括下列步驟①將編碼ZNF268蛋白質(zhì)的多聚核苷酸序列連結(jié)于可表達(dá)的調(diào)控序列上，形成ZNF268蛋白質(zhì)的表達(dá)載體；②將步驟①的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入或轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞，形成重組宿主細(xì)胞；③在適合表達(dá)ZNF268蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)步驟②中的重組宿主細(xì)胞，并誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)；④分離純化具有生物學(xué)活性的ZNF268蛋白質(zhì)。
3、ZNF268蛋白質(zhì)的應(yīng)用重組產(chǎn)生的ZNF268蛋白質(zhì)有多方面的應(yīng)用。這些用途包括直接做為藥物治療因ZNF268功能低下或喪失所致的疾病，或者用于篩選促進(jìn)或抗ZNF268蛋白質(zhì)的抗體，這些抗體可用于刺激或抑制ZNF268的功能。用表達(dá)的重組ZNF268蛋白質(zhì)可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或激活ZNF268功能的蛋白質(zhì)分子?？傊?，ZNF268蛋白質(zhì)可用于診斷或治療因該蛋白質(zhì)異常而引起的疾病。
4、ZNF268蛋白質(zhì)的抗體本發(fā)明提供了一種能特異性地與ZNF268蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體?？筞NF268抗體的關(guān)鍵特征在于它可以特異結(jié)合ZNF268蛋白質(zhì)，而不識(shí)別其它任一蛋白質(zhì)?？筞NF268抗體和ZNF268蛋白質(zhì)是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。抗ZNF268抗體包括但不限于多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，單鏈抗體，F(xiàn)ab片斷和Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片斷。多克隆抗體的生產(chǎn)可用ZNF268蛋白質(zhì)或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等動(dòng)物；多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，提高抗體效價(jià)，這些佐劑包括但不限于弗氏佐劑等。單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)。這種單克隆抗體技術(shù)可用現(xiàn)有的技術(shù)生產(chǎn)(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497；Morrison etal.PNAS，1985，816851；U.S.Pat No.4946778)。
5、ZNF268蛋白質(zhì)抗體的制備ZNF268蛋白質(zhì)抗體的制備包括下列步驟①將得到的具有生物活性的ZNF268蛋白質(zhì)與佐劑混合；②用混合物免疫家兔；③分離免疫家兔的血液，純化抗體。
6、ZNF268蛋白質(zhì)抗體的應(yīng)用抗ZNF268蛋白質(zhì)的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活體標(biāo)本中的ZNF268蛋白質(zhì)表達(dá)；或進(jìn)行放射性標(biāo)記后注入體內(nèi)跟蹤體內(nèi)ZNF268蛋白質(zhì)的表達(dá)位置與分布狀況。這種無(wú)危險(xiǎn)性的放射性標(biāo)記抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于造血系統(tǒng)疾病。本發(fā)明的抗體可用于診斷、治療或預(yù)防與ZNF268蛋白質(zhì)的異常表達(dá)相關(guān)的疾病。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“ZNF268蛋白質(zhì)”是指具有所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。還包括具有與ZNF268蛋白質(zhì)相同功能的，所示氨基酸序列蛋白質(zhì)的變異形式。這些變異形式包括但不限于若干個(gè)氨基酸的缺失，插入或取代；較佳的缺失，插入或取代1-30個(gè)氨基酸，更佳的1-10個(gè)氨基酸；以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)通常為10個(gè)以內(nèi)的氨基酸，較佳的為5個(gè)以內(nèi)的氨基酸。以及用性能相近或相似的氨基酸取代而形成的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果①本發(fā)明報(bào)道的是一個(gè)新的人krüppel型C2H2鋅指蛋白質(zhì)ZNF268及其制備方法，它與人的造血系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)；②ZNF268蛋白質(zhì)可以直接作為藥物治療因ZNF268功能低下或喪失所致的疾??；或者用于篩選有治療價(jià)值的能抑制或激活ZNF268功能的蛋白質(zhì)分子；總之，ZNF268蛋白質(zhì)可用于診斷或治療因該蛋白質(zhì)異常而引起的疾病。
③本發(fā)明還報(bào)道了抗ZNF268抗體及其制備方法，它可以特異性的結(jié)合ZNF268蛋白質(zhì)；④抗ZNF268抗體可用于免疫雜交、免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)ZNF268蛋白質(zhì)表達(dá)；或放射性標(biāo)記后進(jìn)行體內(nèi)示蹤，作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于造血系統(tǒng)疾病。總之，抗ZNF268抗體可用于診斷、治療或預(yù)防與ZNF268蛋白質(zhì)的異常表達(dá)相關(guān)的疾病。


圖1-ZNF268蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達(dá)及純化。其中M-蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1.1-誘導(dǎo)后的表達(dá)帶，1.2-未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照，1.3-純化后的蛋白質(zhì)。
圖2-ZNF268抗體的鑒定。其中2.1-誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物與抗體特異性結(jié)合，2.2-沒(méi)有誘導(dǎo)時(shí)，抗體沒(méi)有特異的作用對(duì)象。
圖3-蛋白質(zhì)雜交分析ZNF268在4月齡胚胎中的表達(dá)。其中3.1-胎肝，3.2-胎腎，3.3-胎腦，3.4-胎肺，3.5-胎心。
圖4-免疫組織化學(xué)分析ZNF268在胚胎肝臟中的表達(dá)。其中4.A-5周齡全胚失狀切，肝區(qū)有明顯陽(yáng)性信號(hào)，4.B-肝區(qū)放大圖，4.C-陰性對(duì)照，4.D-4月齡胎肝中有明顯陽(yáng)性信號(hào)，4.E-6月齡胎肝中很弱的信號(hào)，4.F-7月齡胎肝幾乎無(wú)信號(hào)。
圖5-免疫組織化學(xué)分析ZNF268在血細(xì)胞中的表達(dá)。其中5.A-ZNF268在3周齡人胚卵黃囊壁血島細(xì)胞中的表達(dá)，5.D-ZNF268在5周齡人胚心腔游離細(xì)胞中的表達(dá)，5.G-ZNF268在5周齡人胚肝血竇游離細(xì)胞中的表達(dá)，5.B、5.E、5.H、三個(gè)不同位置的細(xì)胞的細(xì)胞膜上均檢測(cè)到CD34的表達(dá)，5.C、5.F、5.I、三個(gè)不同位置的細(xì)胞的細(xì)胞膜上均檢測(cè)不到CD38的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)或彭秀玲等人的《基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(科學(xué)技術(shù)出版社)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 ZNF268蛋白質(zhì)的制備及抗ZNF268抗體的制備將ZNF268的653bp片段插入原核表達(dá)載體pRSET-B構(gòu)建重組的原核表達(dá)載體pRSET-BH2，它編碼一個(gè)在N末端融合6His的ZNF268蛋白質(zhì)。pRSET-BH2轉(zhuǎn)化的E.coli BL21(DE3)培養(yǎng)至A600為0.8時(shí)加入0.4mM IPTG于42℃誘導(dǎo)3小時(shí)，裂解細(xì)菌細(xì)胞獲得含可溶性6his-ZNF268融合蛋白質(zhì)的細(xì)胞粗提物，用XpressTM純化系統(tǒng)純化后，加入弗氏佐劑，用標(biāo)準(zhǔn)方法免疫兔子獲得抗ZNF268抗體。圖1表明，ZNF268蛋白質(zhì)在本實(shí)驗(yàn)條件下，高效表達(dá)。圖2中顯示，抗ZNF268抗體可以與表達(dá)的ZNF268蛋白質(zhì)特異性的結(jié)合。
實(shí)施例2 ZNF268蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)雜交分析4個(gè)月流產(chǎn)人胚的不同組織，用裂解緩沖液提取總蛋白質(zhì)，8％SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用含10％脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉此膜60分鐘，再用含1∶640稀釋的抗ZNF268抗體的TBST孵育1小時(shí)，TBST洗膜。然后此膜在含適當(dāng)羊抗兔IgG抗體的TBST孵育30分鐘，TBST洗脫后，用DAB進(jìn)行顯色反應(yīng)。圖3表明ZNF268在胎肝及胎腸中有顯著的表達(dá)，但在胎心、腎、腦、脾中不表達(dá)。
實(shí)施例3 ZNF268蛋白質(zhì)在造血系統(tǒng)中的免疫組織化學(xué)分析不同的組織材料用Bouin’s溶液固定，梯度酒精脫水后，二甲苯透明，石蠟包埋。材料進(jìn)行常規(guī)切片，然后鋪片于預(yù)先用多聚L-賴(lài)氨酸處理的玻片上。玻片用正常羊血清封閉，然后與抗ZNF268抗體反應(yīng)。生物素偶聯(lián)的抗兔IgG作為二抗，辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉卵白素作為三抗，用DAB進(jìn)行顯色反應(yīng)。最后用蘇木精進(jìn)行復(fù)染。為了鑒定細(xì)胞型，單克隆抗體anti-CD34，anti-CD38作為一抗，相應(yīng)的生物素偶聯(lián)的抗鼠IgG作為二抗。用PBS溶液代替一抗作為實(shí)驗(yàn)的非特異性染色的對(duì)照。
圖4顯示，在5周齡人胚中，ZNF268蛋白質(zhì)在胚肝細(xì)胞中高水平表達(dá)。在4個(gè)月胎肝中，ZNF268蛋白質(zhì)同樣在胚肝細(xì)胞中高水平表達(dá)。在6個(gè)月的胎肝中表達(dá)量下降，在7個(gè)月胎肝中幾乎檢測(cè)不到表達(dá)。所有的陽(yáng)性信號(hào)均顯著定位于胚肝細(xì)胞的胞質(zhì)中。這些結(jié)果表明ZNF268蛋白質(zhì)在胚肝細(xì)胞中的表達(dá)隨胚肝發(fā)育而變化，提示ZNF268可能參與胚胎肝細(xì)胞的發(fā)育。
另一方面，在人出生前胎肝屬于造血器官，胚肝細(xì)胞參與造血干細(xì)胞微環(huán)境的形成。ZNF268蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化與胚肝造血相對(duì)應(yīng)，這表明在胎肝中ZNF268蛋白質(zhì)可能參與造血微環(huán)境的形成和發(fā)育。
圖5顯示，用抗ZNF268抗體進(jìn)行免疫組化分析表明在3周齡人胚中，ZNF268蛋白質(zhì)在CD34+/CD38-造血細(xì)胞中表達(dá)。在第5周時(shí)，ZNF268蛋白質(zhì)在原始心區(qū)的心腔中的游離細(xì)胞及胚肝的肝血竇中的游離細(xì)胞中高水平表達(dá)，這些細(xì)胞也是CD34+/CD38-型。在造血發(fā)育中，造血干細(xì)胞分化為造血祖細(xì)胞并且造血祖細(xì)胞是3系血細(xì)胞的起源。從干細(xì)胞到祖細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)型均為CD34+/CD38-/Thy-1+/Lin-/CD45RA+/Rhodull。ZNF268蛋白質(zhì)在這些CD34+/CD38-細(xì)胞中的表達(dá)，表明ZNF268蛋白質(zhì)在血細(xì)胞的祖先細(xì)胞中表達(dá)并可能參與早期人胚胎血細(xì)胞的發(fā)育。同時(shí)由于ZNF268蛋白質(zhì)在人胚胎造血干/祖細(xì)胞及胚肝細(xì)胞中的表達(dá)，我們推測(cè)ZNF268蛋白質(zhì)可能在早期人的造血作用中發(fā)揮功能。
權(quán)利要求
1.一種ZNF268蛋白質(zhì)，其特征在于，是一個(gè)典型的krüppel型C2H2鋅指蛋白質(zhì)，序列為Met Ala Thr Arg Val Arg Thr Ala Ser Ile 10Trp Val Pro Pro Leu Gln Glu Arg Asn Ser 20Ser Trp Asp Arg Ile Arg Lys Leu Gln Gly 30Gln Glu Ser Ile Leu Gly Gln Gly Thr Pro 40Gly Leu Gln Pro Leu Pro Gly Thr Pro Arg 50Gln Lys Gln Lys Ser Arg Arg Ile Glu Lys 60Val Leu Glu Trp Leu Phe Ile Ser Gln Glu 70Gln Pro Lys Ile Thr Lys Ser Trp Gly Pro 80Leu Ser Phe Met Asp Val Phe Val Asp Phe 90Thr Trp Glu Glu Trp Gln Leu Leu Asp Pro 100Ala Gln Lys Cys Leu Tyr Arg Ser Val Met 110Leu Glu Asn Tyr Ser Asn Leu Val Ser Leu 120Gly Tyr Gln His Thr Lys Pro Asp Ile Ile 130Phe Lys Leu Glu Gln Gly Glu Glu Leu Cys 140Met Val Gln Ala Gln Val Pro Asn Gln Thr 150Ser Gly Asp Thr Val Trp Lys Ile Asp Asp 160Leu Met Asp Trp His Gln Glu Asn Lys Asp 170Lys Leu Gly Ser Thr Ala Lys Ser Phe Glu 180Cys Thr Thr Phe Gly Lys Leu Cys Leu Leu 190Ser Thr Lys Tyr Leu Ser Arg Gln Lys Pro 200His Lys Cys Gly Thr His Gly Lys Ser Leu 210Lys Tyr Ile Asp Phe Thr Ser Asp Tyr Ala 220Arg Asn Asn Pro Asn Gly Phe Gln Val His 230Gly Lys Ser Phe Phe His Ser Lys His Glu 240Gln Thr Val Ile Gly Ile Lys Tyr Cys Glu 250Ser Ile Glu Ser Gly Lys Thr Val Asn Lys 260Lys Ser Gln Leu Met Cys Gln Gln Met Tyr 270Met Gly Glu Lys Pro Phe Gly Cys Ser Cys 280Cys Glu Lys Ala Phe Ser Ser Lys Ser Tyr 290Leu Leu Val His Gln Gln Thr His Ala Glu 300Glu Lys Pro Tyr Gly Cys Asn Glu Cys Gly 310Lys Asp Phe Ser Ser Lys Ser Tyr Leu Ile 320Val His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys 330Leu His Glu Cys Ser Glu Cys Arg Lys Thr 340Phe Ser Phe His Ser Gln Leu Val Ile His 350Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Asn Pro Tyr 360Glu Cys Cys Glu Cys Gly Lys Val Phe Ser 370Arg Lys Asp Gln Leu Val Ser His Gln Lys 380Thr His Ser Gly Gln Lys Pro Tyr Val Cys 390Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Gly Leu Lys 400Ser Gln Leu Ile Ile His Glu Arg Ile His 410Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Asn Glu 420Cys Gln Lys Ala Phe Asn Thr Lys Ser Asn 430Leu Met Val His Gln Arg Thr His Thr Gly 440Glu Lys Pro Tyr Val Cys Ser Asp Cys Gly 450Lys Ala Phe Thr Phe Lys Ser Gln Leu Ile 460Val His Gln Gly Ile His Thr Gly Val Lys 470Pro Tyr Gly Cys Ile Gln Cys Gly Lys Gly 480Phe Ser Leu Lys Ser Gln Leu Ile Val His 490Gln Arg Ser His Thr Gly Met Lys Pro Tyr 500Val Cys Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Arg 510Ser Lys Ser Tyr Leu Ile Ile His Thr Arg 520Thr His Thr Gly Glu Lys Leu His Glu Cys 530Asn Asn Cys Gly Lys Ala Phe Ser Phe Lys 540Ser Gln Leu Ile Ile His Gln Arg Ile His 550Thr Gly Glu Asn Pro Tyr Glu Cys His Glu 560Cys Gly Lys Ala Phe Ser Arg Lys Tyr Gln 570Leu Ile Ser His Gln Arg Thr His Ala Gly 580Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Thr Asp Cys Gly 590Lys Ala Phe Gly Leu Lys Ser Gln Leu Ile 600Ile His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys 610Pro Phe Glu Cys Ser Glu Cys Gln Lys Ala 620Phe Asn Thr Lys Ser Asn Leu Ile Val His 630Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr 640Ser Cys Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Thr 650Phe Lys Ser Gln Leu Ile Val His Lys Gly 660Val His Thr Gly Val Lys Pro Tyr Gly Cys 670Ser Gln Cys Ala Lys Thr Phe Ser Leu Lys 680Ser Gln Leu Ile Val His Gln Arg Ser His 690Thr Gly Val Lys Pro Tyr Gly Cys Ser Glu 700Cys Gly Lys Ala Phe Arg Ser Lys Ser Tyr 710Leu Ile Ile His Met Arg Thr His Thr Gly 720Glu Lys Pro His Glu Cys Arg Glu Cys Gly 730Glu Lys Pro His Glu Cys Arg Glu Cys Gly 730Lys Ser Phe Ser Phe Asn Ser Gln Leu Ile 740Val His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Asn 750Pro Tyr Glu Cys Ser Glu Cys Gly Lys Ala 760Phe Asn Arg Lys Asp Gln Leu Ile Ser His 770Gln Arg Thr His Ala Gly Glu Lys Pro Tyr 780Gly Cys Ser Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser 790Ser Lys Ser Tyr Leu Ile Ile His Met Arg 800Thr His Ser Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys 810Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ile Trp Lys 820Ser Leu Leu Ile Val His Glu Arg Thr His 830Ala Gly Val Asn Pro Tyr Lys Cys Ser Gln 840Cys Glu Lys Ser Phe Ser Gly Lys Leu Arg 850Leu Leu Val His Gln Arg Met His Thr Arg 860Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Ser Glu Cys Gly 870Lys Ala Phe Ile Arg Asn Ser Gln Leu Ile 880Val His Gln Arg Thr His Ser Gly Glu Lys 890Pro Tyr Gly Cys Asn Glu Cys Gly Lys Thr 900Phe Ser Gln Lys Ser Ile Leu Ser Ala His 910Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Cys 920Lys Cys Thr Glu Cys Gly Lys Ala Phe Cys 930Trp Lys Ser Gln Leu Ile Met His Gln Arg 940Thr His Val Asp Asp Lys His *** 948
2.按權(quán)利要求1所述的ZNF268蛋白質(zhì)的制備，其特征在于包括下列步驟①構(gòu)建含有編碼ZNF268蛋白質(zhì)的多聚核苷酸序列的表達(dá)載體；②將步驟①的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成重組宿主細(xì)胞；③在適合的條件下，培養(yǎng)步驟②中的重組宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)及表達(dá)ZNF268蛋白質(zhì)；④分離純化ZNF268蛋白質(zhì)。
3.按權(quán)利要求1所述的ZNF268蛋白質(zhì)的應(yīng)用，其特征在于，可用于診斷或治療因該蛋白質(zhì)異常而引起的疾病。
4.一種ZNF268蛋白質(zhì)的抗體，其特征在于，可以特異性地與權(quán)利要求1所述的ZNF268蛋白質(zhì)結(jié)合。
5.按權(quán)利要求4所述的ZNF268蛋白質(zhì)抗體的制備，其特征在于包括下列步驟①將ZNF268蛋白質(zhì)與佐劑混合；②用混合物免疫動(dòng)物；③分離免疫動(dòng)物的血液，純化抗體。
6.按權(quán)利要求4所述的ZNF268蛋白質(zhì)抗體的應(yīng)用，其特征在于，可用于診斷、治療或預(yù)防與ZNF268蛋白質(zhì)的異常表達(dá)相關(guān)的疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鋅指蛋白質(zhì)及其抗體,具體地說(shuō),涉及一種與人的造血系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)的蛋白質(zhì)及其抗體。本發(fā)明提供的ZNF268蛋白質(zhì),是一個(gè)典型的krüppel型C
文檔編號(hào)C07K14/435GK1422864SQ0211593
公開(kāi)日2003年6月11日 申請(qǐng)日期2002年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月7日
發(fā)明者李文鑫, 孫燕, 茍德明, 高立 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)