專利名稱：一種重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子rhHGF蛋白質(zhì)的表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的表達(dá)方法，該方法是通過真核基因工程方法來表達(dá)具有野生活性的rhHGF蛋白質(zhì)。
1.rhHGF表達(dá)載體pLX008的構(gòu)建2.rhHGF在真核細(xì)胞中的表達(dá)3.表達(dá)產(chǎn)物活性測(cè)定二、步驟1..rhHGF表達(dá)載體pLX008的構(gòu)建用BamHI和XbaI完全酶切含有HGFcDNA全序列基因片段的重組質(zhì)粒PBSKS-HGF(由美國(guó)著名科學(xué)家閆占清饋贈(zèng))，獲得了長(zhǎng)2.2kb的HGF cDNA完整序列，插入經(jīng)BamHI和XbaI雙酶切的帶有強(qiáng)啟動(dòng)效應(yīng)的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的載體pRC/CMV(由美國(guó)著名科學(xué)家閆占清饋贈(zèng))，獲得重組質(zhì)粒pLX008。經(jīng)篩選及限制性內(nèi)切酶譜鑒定重組正確后，純化質(zhì)粒。
2.人HGF在真核細(xì)胞中的表達(dá)將純化的表達(dá)載體pLX008用磷酸鈣-DNA共沉淀法轉(zhuǎn)染大鼠腎成纖維細(xì)胞(NRK購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所)及中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞(CHO購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所)，采用G418(美國(guó)GIBCO產(chǎn)品)抗性篩選法，篩選兩種細(xì)胞有陽(yáng)性克隆出現(xiàn)后，將細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。之后常規(guī)傳代，待生長(zhǎng)到60-80％融合時(shí)，更換不含G418的培養(yǎng)基，融合狀態(tài)后繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。收集培養(yǎng)物于無菌離心管中，900-1200r/min離心20分鐘，取培養(yǎng)物上清分裝后-20℃保存，用作條件培養(yǎng)基。
3.結(jié)果及表達(dá)產(chǎn)物活性測(cè)定用HCC-7902細(xì)胞(肝癌細(xì)胞)及原代培養(yǎng)成年大鼠肝細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基上清進(jìn)行活性測(cè)定。3H-TdR摻入分析證明，它能有效地抑制體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可以明顯刺激鼠肝細(xì)胞DNA的合成。結(jié)果表明rhHGF基因在宿主細(xì)胞中得到正確的轉(zhuǎn)錄和翻譯，并將有生物活性的表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。
本發(fā)明的關(guān)鍵之一在于選用帶有強(qiáng)啟動(dòng)效應(yīng)的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的pRC/CMV作為載體，并選用限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI將rhHGFcDNA序列定向重組于真核細(xì)胞表達(dá)性載體pRC/CMV中，獲得了真核表達(dá)質(zhì)粒pRC/CMV-rhHGF；關(guān)鍵之二在于本發(fā)明分別選用了細(xì)胞株穩(wěn)定、表達(dá)效率高的CHO和易成活、生活周期短、生長(zhǎng)速度快的NRK作為宿主細(xì)胞；關(guān)鍵之三在于用G418篩選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞。
下面所列實(shí)施例是為便于對(duì)本發(fā)明的理解而非任何限制性目的。
實(shí)施例1.hHGF真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建1.hHGF基因片段的制備用BamHI和XbaI消化PBSKS-HGF質(zhì)粒，電泳證實(shí)酶切完全后，用低熔點(diǎn)膠回收其中的2.2kb長(zhǎng)的DNA片段。微型膠定量，調(diào)節(jié)DNA濃度為0.1μg/μl。
2.載體pRC/CMV的制備pRC/CMV質(zhì)粒5μg，在50μl反應(yīng)體積中，用BamHI/XbaI各1μl消化5小時(shí)，取6μl電泳觀察酶切情況，用0.8％低熔點(diǎn)膠分離5.44kb的區(qū)帶，回收純化后調(diào)節(jié)濃度為0.3μg/μl。
3.基因片段與線性化pRC/CMV的連接、轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的篩選取HGF DNA片段0.6μg和線性化pRC/CMV載體0.4μg，(兩者摩爾比3∶1，DNA總量1μg)，混勻，42℃水浴15分鐘，冰浴冷卻后加4μl 10×連接反應(yīng)緩沖液，2μlT4DNA連接酶，用雙蒸水補(bǔ)足20μl反應(yīng)體積，16℃反應(yīng)12小時(shí)。取7μl連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化JM105，將50-100μl轉(zhuǎn)化菌液涂布于Amp陽(yáng)瓊脂板上，37℃溫育過夜后，篩選陽(yáng)性菌落。
4.pRC/CMV-HGF的篩選與鑒定選取3-5個(gè)單菌落接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，進(jìn)行質(zhì)粒的小量快速抽提。獲得質(zhì)粒后，從每份樣品中取0.5-1μg DNA，進(jìn)行內(nèi)切酶分析。經(jīng)過酶切鑒定分析，HGF基因插入位點(diǎn)和方向完全正確，該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)完全符合設(shè)計(jì)要求。
挑選含有正確重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌株，大量擴(kuò)增，經(jīng)質(zhì)粒抽提和純化后，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2.hHGF蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞中的表達(dá)1.細(xì)胞培養(yǎng)用三蒸水配制細(xì)胞培養(yǎng)液(含DMEM培養(yǎng)基；三抗100u/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素，3mg/ml兩性霉素；10％小牛血清)，在37℃、5％CO2濃度條件下分別培養(yǎng)NRK、CHO細(xì)胞，一般第72-96小時(shí)傳代一次，但不同的細(xì)胞情況不完全一樣。傳代時(shí)，用pH7.2的PBS沖洗細(xì)胞，適量0.25％胰酶消化1-3分鐘(不同細(xì)胞株對(duì)胰酶的耐受性不同)，待細(xì)胞尚未脫壁時(shí)，棄去胰酶，加少量含血清培養(yǎng)基，吸管吹打制成細(xì)胞懸液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，按不同密度分裝入新的培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)。
2.培養(yǎng)細(xì)胞外源基因轉(zhuǎn)染采用磷酸鈣-DNA共沉淀法。
1).轉(zhuǎn)染前20小時(shí)傳代細(xì)胞，以2×105/cm2密度接種于60mm直徑平皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿平皿85-90％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前4-6小時(shí)須更換培養(yǎng)液。
2).制備磷酸鈣-DNA沉淀先將10μl 0.1×TE的DNA溶液(含DNA濃度0.9μg/μl)及125μl 2×HBS(50mM Hepes、280mM NaCl、15mM Na2HPO4、10mM KCl、12mM Glucose，pH5.68)混勻后，緩慢沿壁加入18μl 2mol/L CaCl2邊加邊搖，室溫放置10-15分鐘。
3).欲轉(zhuǎn)染細(xì)胞吸去舊培養(yǎng)液，用無菌滴管加上述DNA沉淀液于細(xì)胞層上，室溫孵育10分鐘，再將原培養(yǎng)液加回平皿中，37℃、5％CO2培養(yǎng)6-12小時(shí)(NRK、CHO不同)，吸出沉淀液，PBS洗細(xì)胞二次，更換新鮮培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。
4).抗性轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選采用G418抗性篩選法，培養(yǎng)48-72小時(shí)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞1∶2傳代，生長(zhǎng)至50-70％融合時(shí)，加G418至終濃度200mg/ml，以后每12小時(shí)增加一次劑量，最終達(dá)600-800mg/ml，3-4天更換一次培養(yǎng)基，去除死亡細(xì)胞。待大部分細(xì)胞死亡后，G418濃度可降為200mg/ml以維持篩選作用。約10-14天，可見細(xì)胞克隆或集落。同時(shí)，用未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作陰性對(duì)照。
實(shí)施例3 表達(dá)產(chǎn)物生物活性測(cè)定方法1).表達(dá)細(xì)胞液的收集將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，常規(guī)傳代，生長(zhǎng)到50-70％融合時(shí)，更換不含G418的培養(yǎng)基，融合狀態(tài)后繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。收集培養(yǎng)基于無菌離心管中，800-1000r/min離心10分鐘，取上清培養(yǎng)基分裝后-20℃保存，用作條件培養(yǎng)基。
2).肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線觀察HCC-7902常規(guī)培養(yǎng)至融合，0.25％胰酶消化3分鐘，制成單細(xì)胞懸液，，以104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種24孔板。分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組按30％體積比加入轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)照組則加入同等體積的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液。兩組細(xì)胞分別又分成5個(gè)小組，每小組含3個(gè)平行孔。37℃、5％CO2培養(yǎng)，每天更換一次培養(yǎng)基。接種后，每隔48小時(shí)，兩組細(xì)胞各檢測(cè)其中一個(gè)小組，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)前每孔加150μl胰酶，準(zhǔn)確消化3分鐘后加500μl培養(yǎng)基終止消化，吸管反復(fù)吹打，以細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)3次，每計(jì)一次數(shù)3遍，計(jì)數(shù)后的細(xì)胞棄去。
結(jié)果轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物HGF生物活性的測(cè)定本發(fā)明分別用肝癌細(xì)胞HCC-7902和原代培養(yǎng)的成年大鼠肝細(xì)胞對(duì)HGF進(jìn)行活性檢測(cè)。
(一)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的觀察HCC-7902單細(xì)胞懸液，以104/孔細(xì)胞數(shù)接種24孔板。實(shí)驗(yàn)組每孔加30％(V∶V)的條件培養(yǎng)基，對(duì)照組加未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)基，分別于接種后48h，96h……計(jì)數(shù)細(xì)胞。同時(shí)觀察了兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基的作用(

圖1、圖2)。
注每個(gè)點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行孔，每孔計(jì)數(shù)3次，每次數(shù)三遍，因此每點(diǎn)由27個(gè)計(jì)數(shù)值平均求得。
由圖1和圖2可以看出，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基組生長(zhǎng)曲線呈“S”型，細(xì)胞經(jīng)48～72小時(shí)潛伏期后進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，數(shù)量倍增明顯，細(xì)胞數(shù)量在整個(gè)生活周期中增加不明顯，生長(zhǎng)曲線呈低平狀，表明細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制。倒置顯微鏡下細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)兩組亦有區(qū)別。
(二)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)上清對(duì)原代培養(yǎng)鼠肝細(xì)胞DNA合成的影響結(jié)果見圖3。
在無血清培養(yǎng)條件下，肝細(xì)胞培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染陽(yáng)性及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)基處理的肝細(xì)胞組，其cpm值顯著高于未轉(zhuǎn)染組。發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系表達(dá)rhHGF的可能性進(jìn)行了探索，構(gòu)建了rhHGF真核表達(dá)性質(zhì)粒，并成功地在CHO、NRK中獲得了高效表達(dá)，為基因工程生成rhHGF提供了重要的工程細(xì)胞株。這對(duì)于大量制備rhHGF并研究肝細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控，肝特異性蛋白的表達(dá)等基礎(chǔ)領(lǐng)域方面有著重要的意義和價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種用真核表達(dá)體系制備肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子rhHGF蛋白質(zhì)的方法，其特征在于所說的方法包括以下步驟hHGF基因的獲取，rhHGF表達(dá)載體pLX008的構(gòu)建和rhHGF在真核細(xì)胞中的表達(dá)及分離純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于hHGF基因的獲取，是用BamHI和XbaI完全酶切含有人HGFcDNA全序列基因片段的PBSKS-HGF(由美國(guó)著名科學(xué)家閆占清饋贈(zèng))，獲得了長(zhǎng)2.2kb的rhHGF cDNA完整序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，是選用帶有強(qiáng)啟動(dòng)效應(yīng)的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的pRC/CMV作為載體，并選用限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI將rhHGFcDNA序列定向重組于真核細(xì)胞表達(dá)載體pRC/CMV中，獲得了真核表達(dá)質(zhì)粒pRC/CMV-rhHGF。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于選用了細(xì)胞株穩(wěn)定、表達(dá)效率高的CHO和易成活、生活周期短、生長(zhǎng)速度快的NRK作為宿主細(xì)胞；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于rhHGF的表達(dá)，采用G418抗性篩選法，篩選兩種細(xì)胞有陽(yáng)性克隆出現(xiàn)后，將細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，之后常規(guī)傳代，待生長(zhǎng)到50-70％融合時(shí)，更換不含G418的培養(yǎng)基，呈融合狀態(tài)后繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，收集培養(yǎng)基于無菌離心管中，800-1000r/min離心10分鐘，取上清培養(yǎng)基分裝后-20℃保存，用作條件培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用真核表達(dá)體系制備肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhHGF)蛋白質(zhì)的方法,通過克隆hHGF基因,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pRC/CMV－rhHGF,選用細(xì)胞株穩(wěn)定、表達(dá)效率高的CHO和易成活、生活周期短、生長(zhǎng)速度快的NRK作為宿主細(xì)胞表達(dá)出具有野生活性的rhHGF,與傳統(tǒng)的原核表達(dá)體系相比,具有易于合成、rhHGF可有效分泌到培養(yǎng)液中、加工方式與天然蛋白相似、能發(fā)生折疊、形成二硫鍵、能發(fā)生糖基化、多聚化及前體加工和修飾等優(yōu)點(diǎn),不但成活工藝簡(jiǎn)單,而且保證了表達(dá)產(chǎn)物功能活性的存在,提供了一種用外源基因表達(dá)產(chǎn)生基因工程藥物的方法。
文檔編號(hào)C07K14/475GK1384115SQ0211782
公開日2002年12月11日 申請(qǐng)日期2002年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月22日
發(fā)明者牛勃, 常冰梅, 向前, 解軍, 楊濤, 閻占清, 郭勇, 胡曉年, 楊琦, 張悅紅 申請(qǐng)人:四川漢龍高新技術(shù)開發(fā)有限公司