專利名稱：隨機(jī)多肽文庫構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的隨機(jī)多肽文庫構(gòu)建方法，具體地，本發(fā)明涉及利用自然界存在的所有核酸資源而構(gòu)建隨機(jī)多肽文庫的方法以及由此構(gòu)建的多肽文庫。更具體地，本發(fā)明涉及利用自然界存在的天然產(chǎn)物—各物種的基因組DNA而構(gòu)建隨機(jī)多肽文庫的方法以及由此構(gòu)建的多肽文庫。
第二類合成方法是利用重組DNA技術(shù)在體內(nèi)表達(dá)可溶的融合蛋白或是病毒的衣殼融合蛋白。第二類合成方法許多都要用到M13噬菌體。1989年，Parmley，S.F.和Smith，G.P.，(1989，Adv.Exp.Med.Biol.251215-218)認(rèn)為將合成的短序列DNA片段克隆進(jìn)M13噬菌體的pIII蛋白可以產(chǎn)生一個有代表性的抗原庫。他們認(rèn)為因?yàn)榫€性抗原表位通常為6個氨基酸，所以應(yīng)該可以用隨機(jī)重組的DNA文庫來表達(dá)所有可能的6肽以分離出結(jié)合抗體的抗原表位。
Scott和Smith(Scott，J.K.and Smith，G.P.，1 990，Science 249386-390)在M13噬菌體表面構(gòu)建和表達(dá)了一個六肽的抗原文庫。他們首先將用BglI酶切的33bp長的寡聚核苷酸片段插入到用SfiI酶切的噬菌體中(fUSE5 RF)。這個33bp長的寡聚核苷酸片段包含一個隨機(jī)的簡并序列(NNK)6，在這里N代表G，A，T和C而K代表G和T。Cwirla等(Cwirla，S.E.，et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876378-6382)也介紹了一個類似的在M13fd噬菌體基因pIII中表達(dá)一個融合6肽文庫的方法。Dower和Cwirla(Dower，Cwirla 1991)介紹了一個類似的表達(dá)5-8個隨機(jī)氨基酸文庫的方法。
Devlin等(1990，Science，249404-406)用合成寡聚核苷酸的方法構(gòu)建了一個15個簡并密碼子的多肽庫(NNS)，這里S代表G或C。
Christian和其同事(Christian，R.B.，et al.，1992，J.Mol.Biol.227711-718)介紹了一種表達(dá)10肽文庫的方法，他們首先合成一段包含簡并密碼子(NN(G/T))10的寡聚DNA，同時這段寡聚DNA在3’端有一自我互補(bǔ)的序列。這樣就形成了一個發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在T4 DNA聚合酶的作用下，以發(fā)卡結(jié)構(gòu)的3’端為引物可以合成一段完整的互補(bǔ)鏈。這個雙鏈DNA用SfiI酶切其兩端后用上述Scott和Smith的方法可以克隆進(jìn)fUSE5載體中。
Lenstra，(1992，J.Immunol.Meth.152149-157)介紹了一種非常費(fèi)力的建庫方法，這種方法用17或23bp的寡聚核苷酸退火形成8個核苷酸長的回文序列，它被克隆進(jìn)β-半乳糖苷酶基因的3’端，在細(xì)菌表達(dá)載體中表達(dá)融合蛋白。DNA首先在Klenow DNA聚合酶的作用下被補(bǔ)成雙鏈，平末端連進(jìn)載體后用HindIII內(nèi)切酶切割，產(chǎn)生的片段克隆到C-末端缺陷的β-半乳糖苷酶基因的3’端，這樣可以產(chǎn)生107個重組子。菌落裂解后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(104/膜)，用幾個不同的單克隆抗體進(jìn)行免疫篩選。經(jīng)過幾輪重復(fù)篩選，分離到了許多目的克隆。
由以上介紹可知，現(xiàn)有的建庫方法都需要人工合成多肽(體外)或寡聚核苷酸(體內(nèi))。體外人工合成多肽設(shè)計起來雖然較簡單，但是要用到昂貴的儀器和復(fù)雜的方法，工作費(fèi)時費(fèi)力，而且還需要較大的財力支持。用合成寡聚核苷酸在體內(nèi)表達(dá)多肽的方法較好的解決了上述問題，它巧妙簡潔而且所需費(fèi)用大大減少，但是它也有一些固有的缺點(diǎn)，如寡聚核苷酸序列設(shè)計起來較復(fù)雜，需要考慮簡并密碼子、終止密碼子以及盡量不要形成回文結(jié)構(gòu)等；在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中還有退火、補(bǔ)平末端和酶切連接等過程，這些都對實(shí)驗(yàn)的成功性造成很大影響。此外，用以上方法所簡建的隨機(jī)多肽庫的長度基本上限定在6-8個氨基酸，并且一種方法只能構(gòu)建一種長度的文庫。
因此，尋找一種消除了以上所說的弊端、實(shí)驗(yàn)程序簡化同時又保持了所建文庫的復(fù)雜性的新的構(gòu)建隨機(jī)多肽文庫的方法是非常需要的。
圖2是實(shí)施例1所述本發(fā)明的構(gòu)建隨機(jī)多肽文庫的方法的一個實(shí)施方案中人基因組DpnII酶切電泳圖，圖中M泳道是DL2000分子量標(biāo)記(購自大連TaKaRa公司)，1泳道是人基因組酶切產(chǎn)物。
圖3是實(shí)施例1所述本發(fā)明的構(gòu)建隨機(jī)多肽文庫的方法的一個實(shí)施方案中所構(gòu)建的文庫的PCR鑒定電泳圖，圖中M泳道是DL2000分子量標(biāo)記，1泳道是PCR產(chǎn)物。
又比如，如果用另外一種識別3個核苷酸的限制性內(nèi)切酶(如CviJI)切割另外一個物種酵母的基因組DNA(1.7×107bp)，理論上產(chǎn)生平均長度為64bp(43＝64)的DNA片段共2.66×105條(1.7×107/64)，這樣長的DNA可以編碼約21.3(64/3≈21.3)個氨基酸，而每64個氨基酸密碼子中有3個終止密碼子，所以每個片段中應(yīng)有3個終止密碼子。因此，這樣的DNA片段連在表達(dá)載體上翻譯的時候，會隨機(jī)終止(因?yàn)榻K止密碼子的分布是隨機(jī)的)。這樣就產(chǎn)生了平均長度在21.33個氨基酸殘基的，長度不一、序列各異的隨機(jī)多肽庫。
用本方法構(gòu)建的隨機(jī)多肽庫的材料并不限于上述所說的情況，例如所用的基因組并不限于人類的，可以包括自然界所有的核酸資源，例如其它動物、植物、微生物的基因組以及mRNA、cDNA等甚至人工合成的核酸。所用的酶也不限于識別4個核苷酸的限制性內(nèi)切酶，應(yīng)包括所有的限制性內(nèi)切酶，而不論它們識別序列的個數(shù)，如包括可識別3個核苷酸的限制性內(nèi)切酶CviJI和CviTI，識別5個，6個，7個，8個或更多個核苷酸的限制性內(nèi)切酶等等。同時還包括兩種或更多限制性內(nèi)切酶的組合。例如同時使用DpnII和EcoRI或更多限制性內(nèi)切酶。
本發(fā)明方法可采用任何生物(包括所有動物，植物和微生物)組織或細(xì)胞，選擇基因組DNA越復(fù)雜的生物，得到的文庫越復(fù)雜。
本發(fā)明方法原則上可以選用任何限制性內(nèi)切酶如DpnII、Sau3A、MboI等。但是識別序列是4個，甚至3個核苷酸的限制性內(nèi)切酶或它們的組合，如同時使用DpnII和CviJI是優(yōu)選的，因?yàn)槠渥钅艹浞掷没蚪MDNA，所制備的文庫復(fù)雜性最高。
本發(fā)明方法可以選用任何表達(dá)載體，包括但不限于質(zhì)粒、噬菌體載體、噬菌粒等。另外，可以選用任何能導(dǎo)致蛋白表達(dá)的多克隆位點(diǎn)。
本發(fā)明方法中多肽的表達(dá)方式可以是體內(nèi)的，也可以是體外的。
本發(fā)明方法中所用的轉(zhuǎn)化方法包括但不限于電擊轉(zhuǎn)化(如化學(xué)轉(zhuǎn)化等)。
本發(fā)明方法可以選用任何可用于制備文庫的宿主菌。
構(gòu)建好的文庫可以通過對文庫的DNA序列分析鑒定文庫所表達(dá)多肽的復(fù)雜性。
根據(jù)本發(fā)明方法獲得的文庫具有如下特征a.不等長限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA產(chǎn)生的DNA片段長度不一。
b.同源文庫中所有的DNA片段都源于所用的同一種生物或幾種生物DNA片段的組合。
c.接口序列文庫內(nèi)的每個克隆具有相同的，本文庫所用內(nèi)切酶連接后的特征序列。
d.如果認(rèn)為基因組DNA序列是隨機(jī)DNA序列，文庫表達(dá)的多肽平均長度為21.33個氨基酸殘基。
e.對于同樣的基因組DNA材料，用不同的限制性內(nèi)切酶消化可以產(chǎn)生完全沒有交叉覆蓋的新的隨機(jī)多肽文庫。對于不同的基因組DNA材料，用相同的限制性內(nèi)切酶消化也可以產(chǎn)生新的隨機(jī)多肽文庫。DNA材料的生物親緣越遠(yuǎn)，文庫的交叉覆蓋越小。
f.其中所述限制性內(nèi)切酶可以是其中的一種，也可以是兩種或更多限制性內(nèi)切酶的組合。
g.利用世界上現(xiàn)有的DNA資源，避免合成隨機(jī)寡聚核苷酸。
h.可以是具有以上特性的文庫的混合文庫混合文庫中的克隆具備未混合之前母文庫的以上特征。
本發(fā)明的隨機(jī)多肽文庫所特有的功能如下a.具有其它隨機(jī)多肽文庫的功能。
b.不等長的隨機(jī)多肽文庫具有等長短隨機(jī)多肽文庫所不具有的長結(jié)構(gòu)域，功能域。
c.并且，不等長的隨機(jī)多肽文庫具有等長長隨機(jī)多肽文庫所不具有的短結(jié)構(gòu)域，功能域。有利于確定結(jié)構(gòu)功能域的最小必要序列。
d.既能夠用于鑒定蛋白-蛋白相互作用，也能用于鑒定蛋白-核酸相互作用本發(fā)明的新的建庫方法消除了現(xiàn)有技術(shù)中的弊端，首先它利用的是自然界存在的天然產(chǎn)物—各物種的基因組DNA，因此它不需要人工合成；第二由于基因組DNA本身的復(fù)雜性(尤其是高等生物)，因此也保證了用這樣的方法所建文庫的復(fù)雜性；第三由于基因組DNA是雙鏈產(chǎn)物，所以本方法不需要退火、補(bǔ)平末端等過程，而是直接的酶切和連接，這樣大大簡化了實(shí)驗(yàn)程序；第四用本方法構(gòu)建的文庫多肽的長短不一、序列各異，平均長度為21個氨基酸，因此這樣的文庫應(yīng)用范圍更廣，可以滿足不同實(shí)驗(yàn)的需要，具有多功能性，是更廣泛意義上的隨機(jī)多肽文庫。
以下參照實(shí)施例和附圖
描述本發(fā)明，應(yīng)理解的是所述實(shí)施例僅是描述性而非限制性的。實(shí)施例1用人血細(xì)胞基因組DNA構(gòu)建隨機(jī)多肽文庫本例中采用人血細(xì)胞分離基因組DNA，所用表達(dá)載體為質(zhì)粒pGADT7(購自Clontech公司)，所用限制性內(nèi)切酶DpnII購自NewEnglish Biolab公司，BamHI購自大連TaKaRa公司。所用宿主菌為大腸桿菌XL1-Blue(購自stratagene公司)具體建庫步驟如下1、提取人血細(xì)胞基因組DNA；取新鮮血液20ml以1300g離心15分鐘，棄上層血漿，用巴斯德吸管將淡黃層小心移至另一管中并再次離心。將第二次離心的淡黃層重懸于15ml抽提緩沖液中，于37℃溫育1小時。之后加蛋白酶至終濃度為100μg/ml，用一玻棒溫和的將酶混入粘滯的溶液中。將裂解細(xì)胞的懸液置于50℃水浴中3小時，不時旋動該粘滯溶液。將溶液冷卻至室溫，如有必要將溶液傾入離心管，加等體積堿性酚，緩慢的來回顛倒離心管10分鐘，小心混合兩相，如此時兩相未能混合形成乳濁液，則將離心管置于一旋轉(zhuǎn)器上1小時，于室溫以1500g離心15分鐘，使兩相分開。用大口徑移液管將粘稠的水相移至一潔凈的離心管中，用酚重復(fù)抽提兩次。第三次酚抽提后用全部水相于4℃4L，50mM Tris·Cl(pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0)溶液透析4次，直至透析液的OD270小于0.05。測定DNA樣品在260nm和280nm處的光吸收A260與A280之比小于1.8。計算DNA樣品濃度(濃度多少1.2ug/ul)。2、人血細(xì)胞基因組DNA的單酶切及酶切產(chǎn)物的回收純化在500μl的離心管中建立酶切反應(yīng)體系如下人血細(xì)胞基因組DNA 10μl(5μg)，10X DpnII酶切緩沖液2μl，無菌雙蒸水6μl，DpnII(10u/μl)2μl，共20μl，37℃反應(yīng)過夜。將所述酶切產(chǎn)物用酚/氯仿抽提兩遍，然后加入1/10體積的3M NaAc溶液，并加入兩倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃沉淀1小時；之后12000rpm，4℃離心15分鐘；將所得沉淀用70％冰冷乙醇漂洗兩遍；將沉淀溶于適量無菌雙蒸水中備用。取少量酶切樣品進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖2所示，所切片段的分子量從100bp到2000bp都有，理論上酶切片段的平均長度是256bp，而實(shí)際上酶切片段長度跨度較大，這從客觀上也增加了文庫的復(fù)雜性。3、質(zhì)粒載體的制備及單酶切根據(jù)分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊所述，用堿裂解法制備質(zhì)粒pGADT7。之后用DpnII的同尾酶BamHI對質(zhì)粒pGADT7進(jìn)行單酶切反應(yīng)，在500μl的離心管中建立酶切反應(yīng)體系如下質(zhì)粒pGADT7 10μl(3μg)，10X BamHI酶切緩沖液2μl，無菌雙蒸水7μl，BamHI(10u/μl)1μl，共20μl，37℃反應(yīng)過夜。用常規(guī)方法經(jīng)CIAP將質(zhì)粒酶切產(chǎn)物去磷酸化。4、連接反應(yīng)將上述制得的基因組DNA酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒酶切產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下連接，在500μl的離心管中建立酶切反應(yīng)體系如下10X連接緩沖液1μl，去磷酸化質(zhì)粒1μl，酶切后基因組DNA 7μl，T4 DNA連接酶1μl，共10μl，16℃反應(yīng)過夜5、電感受態(tài)細(xì)胞制備1)劃線培養(yǎng)XL1-Blue細(xì)胞(含四環(huán)素20μg/ml)2)培養(yǎng)3ml的LB，37℃，250rpm搖培過夜。
3)將3ml過夜培養(yǎng)的LB培養(yǎng)液注入1升的LB培養(yǎng)基中，250rpm搖培至OD值為0.5，約需3-4小時。
4)將這1升培養(yǎng)液分裝至4個500ml的離心瓶中，4℃，5000rpm，離心10min。
5)將沉淀重懸在100ml冰冷的無菌雙蒸水中，并將重懸物合并在2個離心瓶中(即每瓶將包含200ml的重懸物)。
6)4℃，5000rpm，離心10min7)將沉淀重懸在100ml冰冷的無菌雙蒸水中，并將它們合并到一個離心瓶中并且再一次4℃，5000rpm，離心10min。
8)將沉淀重懸在100ml冰冷的10％滅菌甘油中，如上再次離心，最終重懸在2ml冰冷的10％滅菌甘油中，得到無離子、高濃度的電感受態(tài)細(xì)胞。6、電擊轉(zhuǎn)化
在電感受態(tài)細(xì)胞40μl中加入2-3μl上述連接混合物，用電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad，Gene Pluser II system)進(jìn)行常規(guī)電轉(zhuǎn)化，條件為2.5kv。在LB/氨芐青霉素平板上篩選轉(zhuǎn)化子菌落。收集所得菌落，加25％無菌甘油于-70℃保存。7、文庫的鑒定取50μl上述文庫菌液，置于6ml新鮮的LB(+Amp)培養(yǎng)基中，于37℃，250rpm搖培4小時；離心，收集菌體，用堿裂解法提取質(zhì)粒。文庫質(zhì)粒采用PCR進(jìn)行鑒定，，利用pGADT7載體上插入位點(diǎn)兩端的序列為上、下游引物(MATCHMAKER 5’AD LD-Insert ScreeningAmplimer5’-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3’；MATCHMAKER 3’AD LD-Insert Screening Amplimer5’-GTGAACTTGCGGGGTTTTTTCAGTATCTACGATT-3’)，鑒定文庫中外源片段的連入情況。從PCR產(chǎn)物電泳圖譜(圖3)可知，連入片段大小大多數(shù)在100bp和250bp附近，而且數(shù)量很多，這可能有兩種情況1)連入片段大小在100bp和250bp附近，但每種分子都互不相同，也就是文庫的復(fù)雜性較大；2)雖然連入片段大小在100bp和250bp附近，但大部分是同一種分子，只是由于在模板中它們的拷貝數(shù)較多，所以在PCR中得到了優(yōu)先擴(kuò)增，如果是這樣，則文庫的復(fù)雜性較小。
總之，用本發(fā)明的這種構(gòu)建隨機(jī)多肽文庫的方法已經(jīng)初步建立了一個隨機(jī)多肽文庫，這說明這種方法是切實(shí)可行的。實(shí)施例2隨機(jī)多肽文庫的應(yīng)用實(shí)施例1獲得的隨機(jī)多肽庫可以用來篩選PDZ結(jié)構(gòu)域的配體C末端的氨基酸序列。PDZ結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞蛋白中一種重要的結(jié)構(gòu)域，其配體與其相互作用的特點(diǎn)是，配體蛋白的C末端與PDZ相互作用。具體方法如下1)用堿裂解法提取實(shí)施例1獲得的隨機(jī)多肽文庫的質(zhì)粒；2)酵母雙雜交，即，將1)中所得質(zhì)粒與連入外源PDZ結(jié)構(gòu)域基因的pGADT7質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞；3)挑選陽性克隆，測序，得到所有和此PDZ蛋白結(jié)合的C末端的氨基酸序列，經(jīng)過生物信息學(xué)檢索得到與此PDZ相結(jié)合的所有結(jié)合蛋白的全序列。
權(quán)利要求
1.構(gòu)建隨機(jī)多肽文庫的方法，包括如下步驟1)獲得任何來源的核酸，所述核酸選自從任一物種的細(xì)胞或組織提取的基因組DNA或mRNA，cDNA或其它合成的核酸；2)利用一或多種限制性內(nèi)切酶切割所獲得的核酸；3)將所述切割的核酸與合適的載體連接；4)將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的宿主進(jìn)行表達(dá)，從而獲得隨機(jī)多肽文庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸是選自包括動物、植物、微生物以及人的任一物種的基因組DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述限制性內(nèi)切酶的識別序列由3、4、5、6、7、8個或更多個核苷酸組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述限制性內(nèi)切酶的識別序列由3個核苷酸組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述限制性內(nèi)切酶的識別序列由4個核苷酸組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述限制性內(nèi)切酶是DpnII、Sau3A或MboI。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中同時使用DpnII和EcoRI。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述載體選自質(zhì)粒、噬菌體載體、噬菌?；蛉魏纹渌蚬こ讨兴玫妮d體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述載體是質(zhì)粒pGADT7。
10.由權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法構(gòu)建的隨機(jī)多肽文庫。
11.權(quán)利要求10的隨機(jī)多肽文庫包括但不限于應(yīng)用在蛋白質(zhì)和多肽功能的研究以及藥物的開發(fā)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的隨機(jī)多肽文庫構(gòu)建方法，更具體地，本發(fā)明涉及利用自然界存在的所有核酸資源而構(gòu)建隨機(jī)多肽文庫的方法以及由此構(gòu)建的多肽文庫。用本方法構(gòu)建的文庫多肽的長短不一、序列各異，平均長度為21個氨基酸，因此這樣的文庫應(yīng)用范圍更廣，可以滿足不同實(shí)驗(yàn)的需要，具有多功能性，是更廣泛意義上的隨機(jī)多肽文庫。
文檔編號C07K14/00GK1458166SQ02120209
公開日2003年11月26日 申請日期2002年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月16日
發(fā)明者高友鶴, 黃海明 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所