專利名稱：丙－谷二肽合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含氨基酸的二肽合成方法，尤其是一種丙—谷二肽合成方法。
谷氨酰胺是人體中含量最多的氨基酸，谷氨酰胺在肌肉蛋白質(zhì)和血漿蛋白質(zhì)中含量約分別為75％和26％。
谷氨酰胺具有重要的生理作用。谷氨酰胺是生物合成核酸的必需前體物質(zhì)，是蛋白質(zhì)合成與分解的調(diào)節(jié)物，是氨基氮從外周組織轉(zhuǎn)動(dòng)至內(nèi)臟的攜帶者，是腎臟排泄氨的重要基質(zhì)。谷氨酰胺是腸粘膜上皮細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的重要能量物質(zhì)，在維持腸道機(jī)能，促進(jìn)免疫功能，維持體內(nèi)堿平衡及提高機(jī)體對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)等方面都發(fā)揮著極其重要的作用。
在臨床上的嚴(yán)重感染、復(fù)合性骨折、創(chuàng)傷、大手術(shù)、大面積燒傷與惡性腫瘤后期等應(yīng)急和高分解代謝狀態(tài)下，谷氨酰胺的需要大大超過了機(jī)體合成谷氨酰胺的能力，使體內(nèi)谷氨酰胺的含量降低，從而使核酸、蛋白質(zhì)合成減少。若采用傳統(tǒng)的全靜脈營養(yǎng)液(TPN)，則可能導(dǎo)致腸粘膜萎縮，腸粘膜通透性升高和細(xì)菌易位，甚至導(dǎo)致敗血癥及多器官功能衰竭。大量的實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)充GLN的TPN對(duì)許多疾病的預(yù)防和恢復(fù)有顯著作用，若在TPN中加入一定量的谷氨酰胺，以提高血液和肌肉等組織中谷氨酰胺濃度，則對(duì)維持或恢復(fù)腸粘膜功能具有重要作用。給嚴(yán)重感染的病人輸入補(bǔ)充GLN的TPN，明顯保持正氮平衡和促進(jìn)細(xì)胞GLN合成酶的表達(dá)，減輕肌細(xì)胞內(nèi)GLN濃度和核糖體濃度的降低。
近年來，因?yàn)楣劝滨０分匾纳砉δ芎退幚碜饔?，使其在腸外營養(yǎng)中的應(yīng)用受到人們普遍的重視。如上所述，在各種創(chuàng)傷(包括意外傷、手術(shù)傷、及輻射傷)、感染等應(yīng)激條件下，血中和細(xì)胞中的谷氨酰胺濃度降低，而補(bǔ)給現(xiàn)有的氨基酸制劑(不含GLN)，不能使其逆轉(zhuǎn)；一些重要的細(xì)胞功能如蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞的吞噬作用和淋巴細(xì)胞的增殖，都必須依賴充足的GLN。但是由于它的溶解度低，而且溶液中不穩(wěn)定，在加熱滅菌的條件下，生成有毒的焦谷氨酸和氨，所以商品氨基酸制劑中部不含有GLN。目前GLN的應(yīng)用主要有以下途徑(1)現(xiàn)配現(xiàn)用，把GLN晶體加到氨基酸溶液中，然后過濾除菌，在8h內(nèi)輸完。這一過程必須嚴(yán)格無菌操作且工作繁瑣，費(fèi)力，適用范圍受到限制；(2)合成GLN衍生物，如乙酰谷酰胺。它容易合成，加熱穩(wěn)定，在體內(nèi)可形成GLN，便是它的利用率較低，攝入量的40％被從尿中排泄掉；(3)應(yīng)用GLN的二肽。
目前，用于試驗(yàn)研究的二肽主要有兩種甘氨酰谷氨酰胺(L-glynyl-L-glutamine，Gly-Gln)和丙—谷二肽(Ala-Gln)。動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)證明，在體內(nèi)，這兩種二肽很快被分為其組成氨基酸，半衰期很短，血液中只能檢測(cè)到少量的二肽，僅有微量的二肽從尿中排出。說明GLN二肽可有效地利用而且不會(huì)在血積聚，避免了二肽可能產(chǎn)生的藥理及生理性損害。有實(shí)驗(yàn)證明，健康人體長(zhǎng)期靜脈注射滴注Ala-Gln二肽沒有任何副作用及不良反應(yīng)，不影響正常的腎功能。用化學(xué)方法合成的Ala-Gln經(jīng)純化其溶解度是GLN單體的20倍，在儲(chǔ)存和加熱滅菌中也很穩(wěn)定，而進(jìn)入體內(nèi)后即迅速分解成GLN而發(fā)揮作用，使GLN在TPN中的應(yīng)用更加方便可行。
丙—谷二肽合成方法有如下4種1、首先將GLN(谷氨酰胺)的氨基進(jìn)行保護(hù)，形成Cbz-Gln；第二步，將Cbz-Gln的酰氨基保護(hù)形成Cbz-Gln(OC13H9)；第三步，將Cbz-Gln(OC13H9)的羧基保護(hù)形成Cbz-Gln(OC13H9)OMe；第四步，通氫氣形成Gln(OC13H9)OMe；第五步，加入CBZ-ALA；第六步，對(duì)CBZ-ALA活化；第七步，CBZ-ALA和Gln(OC13H9)OMe結(jié)合成肽；第八步，皂化脫甲酯；第九步，酸化脫去全部保護(hù)，形成丙—谷二肽。(文獻(xiàn)Yasutsugu Shimomishi，Studies onthe Synthesis of Peptides Containing Glutamine as the C-Terminal.Y.Bull.Chem.Soc.Jpn.1962，35，1966)該方法反應(yīng)步驟太多，而且試劑昂貴，無實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
2、利用Z-Ala與HOSu在DCC作用下，于20～25℃反應(yīng)5h，過濾去二環(huán)己基脲，然后與未保護(hù)的Gln于碳酸氫鈉的水溶液中進(jìn)行合成。產(chǎn)物在甲醇中還原氫化，脫去保護(hù)基，即可得到丙—谷二肽。(文獻(xiàn)Katoh，T.Kurauchi，M.Eur.Pat311，057，12Apr.1989)該方法的試劑昂貴，而且DCC反應(yīng)后的產(chǎn)物難以除去，而且生產(chǎn)過程復(fù)雜。
3、利用COCl2與Ala反應(yīng)生成混酐，然后與Gln在水中反應(yīng)，pH保持在10.2。最后在酸溶液中脫去保護(hù)，即可得到丙—谷二肽。(文獻(xiàn)Frerst，P.Pfaendetr，P.Ger.Offen.DE3206，784.OlSep1983)此方法的反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單，但光氣為劇毒氣體，而且該反應(yīng)難以反應(yīng)完全，對(duì)人體危害較大。
4、利用手性試劑氯代丙酸通過SOCl2活化，形成酰氯，然后與Gln在NaOH的水溶液中反應(yīng)，pH保持在10。產(chǎn)物為氯代丙酰谷酰胺，再與液氨在一定的壓力下反應(yīng)，即可得到丙—谷二肽。(文獻(xiàn)Takahiro Sano，Toru Sugaya，Process Research ang Development ofl-Alanyl-l-glutamine，a Component of Parenteral Nutrition.Oganic Process Researchand Development.2000，4，147-152)該反應(yīng)的原料為手性試劑，極為昂貴，在合成酰氯步驟中，溫度較高，副反應(yīng)較多。該合成用于生產(chǎn)，成本太高。
本發(fā)明的目的在于提供一種原料便宜、合成工藝簡(jiǎn)單、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、產(chǎn)率高、有利于環(huán)保的丙—谷二肽合成方法。
丙—谷二肽合成方法的步驟1)N端保護(hù)的氨基酸(I)10mmol，與三苯基磷(Ph3P)10～30mmol，最佳15～20mmol，六氯乙烷(C2Cl6)10～30mmol，最佳15～20mmol，在有機(jī)溶劑(II)中反應(yīng)20min～3h，最佳1.5～2h，反應(yīng)溫度-5～30℃，最佳0～10℃，形成活潑酯；2)活潑酯與谷氨酰胺10～30mmol，最佳為15～20mmol，在有機(jī)溶劑(III)和無機(jī)堿水溶液(IV)的混合溶液中進(jìn)行(III和IV的體積比值為0～4，最佳為0.5～2，)反應(yīng)溫度為-5～30℃，最佳為5～10℃，pH控制在8.5～13，最佳為9.5～10.5；3)用無機(jī)酸(V)酸化至pH≤3.0，最佳為2.0～3.0，然后脫去N端保護(hù)基團(tuán)(VI)，可得到丙—谷二肽，產(chǎn)率為30％～65％。
其中(I)，N端保護(hù)的氨基酸主要有N-(O，O-二異丙基)磷酰氨酸(DIPP-l-Ala)，N-(O，O-二乙基)磷酰丙氨酸(DEP-l-Ala)，N-(O，O-二甲基)磷酰丙氨酸(DMP-l-Ala)，芐氧羰基丙氨酸(Z-l-Ala)，(對(duì)甲氧羰基)芐氧羰基丙氨酸(MZ-l-Ala)，叔丁氧羰基丙氨酸(Boc-l-Ala)，2-(二連苯基)異丙氧羰基丙氨酸(Bpoc-l-Ala)，等；(II)有機(jī)溶劑主要有二氯甲烷，甲苯，四氫呋喃，乙腈，1，2-二氯乙烷，等；(III)有機(jī)溶劑主要有乙醇，乙酸乙酯，石油醚，環(huán)己烷，甲苯，二氯甲烷，等；(IV)無機(jī)堿主要有氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸氫鈉，碳酸氫鉀，碳酸鈉，碳酸鉀，等；(V)無機(jī)酸主要有鹽酸，硫酸，硝酸，磷酸，等；(VI)脫保護(hù)基的方法主要有三氟乙酸，氯化氫/冰乙酸，溴化氫/冰乙酸，甲基磺酸，氫化還原，氯化氫/1、4二氧六環(huán)，溴化氫/1，4二氧六環(huán)，等。
與已有的丙—谷二肽合成方法相比，本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是1)原料極為便宜，三苯基磷100g只需50元，六氯乙烷100g只需10元，而傳統(tǒng)方法中的HOBt每100g需1500元，DCC100g需400元，HOSU每100g需700元；R-2-氯代丙酸每1g需500元；2)合成工藝簡(jiǎn)單，中間產(chǎn)物(活潑酯)不需要分離和提純處理，直接進(jìn)行下一步反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，副產(chǎn)物(三苯基氧磷)在有機(jī)相，產(chǎn)物在水相，產(chǎn)物容易分離提純；3)第一步合成中省去了有機(jī)堿，通常有機(jī)堿易揮發(fā)，毒性大，很多有機(jī)堿容易引起二肽的消旋，而且一些有機(jī)堿難以除去，本方法在第一步合成中在酸性介質(zhì)中反應(yīng)，形成活潑酯，而一般這類化合物的合成都需加入三乙胺等有機(jī)堿；4)在第二步反應(yīng)中，采用了水相法，省去了谷氨酰胺氨基酸接保護(hù)基團(tuán)保護(hù)和脫除保護(hù)基團(tuán)，簡(jiǎn)化了合成路線，節(jié)約了成本，縮短了時(shí)間，提高了產(chǎn)率，節(jié)省了溶劑和試劑，對(duì)環(huán)境友好；5)由于第二步中采用了水相法，用無機(jī)堿代替了有機(jī)堿，減少了毒性，產(chǎn)物二肽不容易消旋，而且產(chǎn)物可直接分液得到，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)設(shè)備，降低了生產(chǎn)成本，有利于環(huán)保；6)反應(yīng)結(jié)束后，生成兩個(gè)產(chǎn)物，其一為所需的丙—谷二肽，另一個(gè)為副產(chǎn)物(三苯基氧磷)，三苯基氧磷為不揮發(fā)的固體，容易回收，可以作為一種試劑銷售，既不污染環(huán)境，又可以創(chuàng)造利潤(rùn)；7)整個(gè)合成過程中所采用的試劑毒性均較小。
總之，本方法合成路線簡(jiǎn)單，原料便宜易得，有利于環(huán)保，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低，有著很好的應(yīng)用價(jià)值。
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1N-(O，O-二異丙基)磷酰丙氨酸，三苯基磷和六氯乙烷各10mmol分別加入圓底燒瓶，再加入20mL四氫呋喃，于30℃反應(yīng)2h后，滴加到含有15mmol谷氨酰胺，水20mL，乙醇10mL的混合液中，反應(yīng)中用氫氧化鈉調(diào)pH為10.5，反應(yīng)溫度為-5℃，滴加后反應(yīng)2h。然后用濃鹽酸酸化至pH為3.0，水相濃縮后用飽和氯化氫/冰乙酸室溫反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用乙醇—水重結(jié)晶得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率60％。
實(shí)施例2三苯基磷15mmol用20mL二氯甲烷溶解，滴加到N-(O，O-二異丙基)磷酰丙氨酸10mmol，和六氯乙烷20mmol，10mL二氯甲烷的混合體系內(nèi)，于10℃反應(yīng)3h后，滴加到含有10mmol谷氨酰胺，水20mL，乙酸乙酯20mL的混合液中，反應(yīng)中用氫氧化鈉10mmol，然后用碳酸氫鈉調(diào)pH為9.0，反應(yīng)溫度為10℃，滴加后反應(yīng)1h。然后用稀硫酸酸化至pH為2.0，水相濃縮后用20％溴化氫/冰乙酸室溫反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用甲醇—水重結(jié)晶得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率30％。
實(shí)施例3六氯乙烷15mmol用10mL1，2二氯乙烷，滴加到N-(O，O-二異丙基)磷酰丙氨酸10mmol，和三苯基磷15mmol，10mL1，2二氯乙烷的混合體系內(nèi)，于20℃反應(yīng)。1.5h后，滴加到含有20mmol谷氨酰胺，水20mL中，反應(yīng)中用氫氧化鉀調(diào)pH為13，反應(yīng)溫度為10℃，滴加后反應(yīng)2h。然后用稀硝酸酸化至pH為1.5，水相濃縮后用三氟乙酸室溫反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用異丙醇—水重結(jié)晶得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率52％。
實(shí)施例4N-(O，O-二乙基)磷酰丙氨酸10mmol，三苯基磷10mmol和六氯乙烷15mmol分別加入圓底燒瓶，再加入20mL乙腈，于15℃反應(yīng)2.5h后，滴加到含有30mmol谷氨酰胺，水20mL，甲苯30mL的混合液中，反應(yīng)中用碳酸鈉調(diào)pH為8.5，反應(yīng)溫度為30℃，滴加后反應(yīng)1h。然后用稀硫酸酸化至pH為2，水相濃縮后用飽和溴化氫/1，4二氧六環(huán)室溫反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用四氫呋喃—水重結(jié)晶得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率50％。
實(shí)施例5三苯基磷20mmol用10mL甲氫呋喃溶解，滴加到N-(O，O-二乙基)磷酰丙氨酸10mmol，和六氯乙烷30mmol，10mL的四氫呋喃混合體系內(nèi)，于-5℃反應(yīng)2h后，滴加到含有10mmol谷胺酰胺，水20mL，乙醇20mL的混合液中，反應(yīng)中用氫氧化鈉10mmol，然后用碳酸氫鈉設(shè)pH為9.5，反應(yīng)溫度為-5℃，滴加后反應(yīng)2h。然后用濃鹽酸酸化至pH為3，水相濃縮后用飽和氯化氫/冰乙酸室溫反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用乙醇—水重結(jié)晶得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率35％。
實(shí)施例6六氯乙烷30mmol用20mL二氯甲烷溶解，滴加到N-(O，O-二乙基)磷酰丙氨酸10mmol，和三苯基磷30mmol，10mL二氯甲烷的混合體系內(nèi)，于0℃反應(yīng)40min后，滴加到含有30mmol谷氨酰胺，水20mL，環(huán)己烷10mL的混合液中，反應(yīng)中用氫氧化鉀調(diào)pH為13，反應(yīng)溫度為20℃，滴加后反應(yīng)30min。然后用稀硝酸酸化至pH為1.5，水相濃縮后用三氟乙酸室溫反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用1，4二氧六環(huán)—水重結(jié)晶得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率60％。
實(shí)施例7N-(O，O-二甲基)磷酰丙氨酸10mmol，三苯基磷20mmol和六氯乙烷30mmol分別加入圓底燒瓶，再加入20mL甲苯，于5℃反應(yīng)1h后，滴加到含有10mmol谷氨酰胺，水20mL，乙醇5mL的混合液中，反應(yīng)中用碳酸鈉調(diào)pH為9.5，反應(yīng)溫度為5℃，滴加后反應(yīng)10min。然后用磷酸化至pH為1.0，水相濃縮后用三氟乙酸室溫反應(yīng)15h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用乙醇—水重結(jié)晶得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率40％。
實(shí)施例8三苯基磷30mmol用30mL四氫呋喃溶解，滴加到N-(O，O-二甲基)磷酰丙氨酸10mmol，和六氯乙烷30mmol，10mL四氫呋喃的混合體系內(nèi)，于10℃反應(yīng)20min后，滴加到含有30mmol谷氨酰胺，水20mL，環(huán)己烷20mL的混合液中，反應(yīng)中用氫氧化鈉調(diào)pH為12，反應(yīng)溫度為25℃，滴加后反應(yīng)30min。然后用稀硝酸酸化至pH為1.5，水相濃縮后用20％溴化氫/冰乙酸室溫反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用甲醇—水得結(jié)晶得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率50％。
實(shí)施例9六氯乙烷20mmol用10mL二氯甲烷溶解，滴加到N-(O，O-二甲基)磷酰丙氨酸10mmol，和三苯基磷20mmol，20mL甲苯的混合體系內(nèi)，于0℃反應(yīng)3h后，滴加到含有25mmol谷胺酰胺，水20mL中，石油醚60mL，反應(yīng)中用氫氧化鉀20mmol，然后用碳酸鉀調(diào)pH為10，反應(yīng)溫度為0℃，滴加后反應(yīng)1.5h。然后用濃鹽酸酸化至pH為2.5，水相濃縮后用甲磺酸室溫反應(yīng)20h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用異丙醇—水重結(jié)晶得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率45％。
實(shí)施例10叔丁氧羰基丙氨酸(Boc-Ala)10mmol，三苯基磷15mmol和六氯乙烷20mmol分別加入圓底燒瓶，再加入20mL1，2二氯乙烷于10℃反應(yīng)20min后，滴加到含有30mmol谷氨酰胺，水20mL，環(huán)己烷20mL的混合液中，反應(yīng)中用氫氧化鉀調(diào)pH為11，反應(yīng)溫度為20℃，滴加后反應(yīng)30min。然后用稀硝酸酸化至pH為1.5，水相濃縮后用三氟乙酸室溫反應(yīng)15h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用四氫呋喃—水重結(jié)晶得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率40％。
實(shí)施例11三苯基磷10mmol用10mL甲苯溶解，滴加到10mmol叔丁氧羰基丙氨酸(Boc-A1a)，和六氯乙烷10mmol，20mL甲苯的混合體系內(nèi)，于5℃反應(yīng)2h后，滴加到含有15mmol谷氨酰胺，水20mL，石油醚60mL的混合液中，反應(yīng)中用氫氧化鈉調(diào)pH為12，反應(yīng)溫度為10℃，滴加后反應(yīng)1.5h。然后用稀硫酸酸化至pH為1.5，水相濃縮后用氯化氫/14氧六環(huán)室溫反應(yīng)5h。反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用1，4二氧六環(huán)—水重結(jié)晶得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率52％。
實(shí)施例12六氯乙烷20mmol用10mL四氫呋喃溶解，滴加到叔丁氧基丙氨酸(Boc-Ala)10mmol，和三苯基磷20mmol，10mL四氫呋喃的混合體系內(nèi)，于0℃反應(yīng)1.5h后，滴加到含有20mmol谷氨酰胺，水20mL中，二氯甲烷15mL，反應(yīng)中用氫氧化鉀20mmol，然后用碳酸鈉調(diào)pH為10，反應(yīng)溫度為8℃，滴加后反應(yīng)2h，然后用濃鹽酸酸化至pH為2.0，水相濃縮后甲磺酸室溫反應(yīng)20h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用甲醇—水重結(jié)晶得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率45％。
實(shí)施例13芐氧羰基丙氨酸(Z-Ala)10mmol，三苯基磷10mmol和六氯乙烷10mmol分別加入圓底燒瓶，再加入30mL甲苯，于0℃反應(yīng)3h后，滴加到含有25mmol谷氨酰胺，水20mL的混合液中，反應(yīng)中用氫氧化鈉調(diào)pH為12，反應(yīng)溫度為15℃，滴加后反應(yīng)1.5h。然后用稀鹽酸酸化至pH為2.5，水相濃縮后用氫氣在甲醇中室溫反應(yīng)15h，得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率48％。
實(shí)施例14三苯基磷15mmol用10mL四氫呋喃溶解，滴加到10mmol芐氧羰基丙氨酸(Z-Ala)，和六氯乙烷20mmol，10mL四氫呋喃的混合體系內(nèi)，于0℃反應(yīng)1.5h后，滴加到含有18mmol谷氨酰胺，水20mL，二氯甲烷40mL的混合液中，反應(yīng)中用氫氧化鉀調(diào)pH為13，反應(yīng)溫度為0℃，滴加后反應(yīng)2h。然后用稀硫酸酸化至pH為2.0，水相濃縮后氫氣在甲醇室溫反應(yīng)15h，得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率65％。
實(shí)施例15六氯乙烷30mmol用10mL乙腈溶解，滴加到芐氧羰基丙氨酸(Z-Ala)10mmol，和三苯基磷20mmol，10mL乙腈的混合體系內(nèi)，于5℃反應(yīng)1.0h后，滴加到含有10mmol谷按酰胺，水20mL中，反應(yīng)中用氫氧化鈉20mmol，然后用碳酸氫鉀調(diào)pH為10，反應(yīng)溫度為5℃，滴加后反應(yīng)2h。然后用濃鹽酸酸化至pH為3.0，水相濃縮后用三氟乙酸室溫反應(yīng)40h，反應(yīng)結(jié)束后加入乙醚50mL，析出固體，將固體用1，4二氧六環(huán)—水重結(jié)晶得產(chǎn)物L(fēng)-Ala-L-Gln。產(chǎn)率45％。
實(shí)施例16六氯乙烷30mmol用10mL乙腈溶解，滴加到芐氧羰基丙氨酸(Z-Ala)10mmol，和三苯基磷20mmol，10mL乙腈的混合體系內(nèi)，于10℃反應(yīng)2h后，滴加到含有15mmol纈氨酸，水20mL中，用碳酸氫鈉調(diào)pH為9.5，反應(yīng)溫度為10℃，滴加后反應(yīng)20min。然后用鹽酸調(diào)至pH為2.5，濃縮后用氫氣脫保護(hù)基，得丙—纈二肽，產(chǎn)率60％。
實(shí)施例17三苯基磷10mmol，N-(O，O-二乙基)磷酰苯丙氨酸10mmol，六氯乙烷13mmol，加入20mL四氫呋喃，于10℃反應(yīng)1h后，滴加到15mmol亮氨酸中，反應(yīng)用氫氧化鈉調(diào)pH為11，反應(yīng)溫度為5℃，滴加后，反應(yīng)1h，然后用稀硫酸酸化至pH為2.0，濃縮后，用氯化氫/1，4-二氧六環(huán)脫保護(hù)，析出固體，將固體用乙醇—水重結(jié)晶，得產(chǎn)物苯—亮二肽，產(chǎn)率50％。
權(quán)利要求
1.丙—谷二肽合成方法，其特征在于1)N端保護(hù)的氨基酸10mmol，與三苯基磷10～30mmol，六氯乙烷10～30mmol，在有機(jī)溶劑中反應(yīng)20min～3h，反應(yīng)溫度-5～30℃，形成活潑酯；2)活潑酯與谷氨酰胺10～30mmol，在有機(jī)溶劑和無機(jī)堿水溶液的混合溶液中進(jìn)行，有機(jī)溶劑和無機(jī)堿水溶液的體積比值為0～4，反應(yīng)溫度為-5～30℃，pH控制在8.5～13；3)用無機(jī)酸酸化至pH≤3.0，然后脫去N端保護(hù)基團(tuán)，可得到丙—谷二肽。
2.如權(quán)利要求1所述的丙—谷二肽合成方法，其特征在于1)N端保護(hù)的氨基酸10mmol，與三苯基磷15～20mmol，六氯乙烷15～20mmol，在有機(jī)溶劑中反應(yīng)1.5～2h，反應(yīng)溫度0～10℃，形成活潑酯；2)活潑酯與谷氨酰胺15～20mmol，在有機(jī)溶劑和無機(jī)堿水溶液的混合溶液中進(jìn)行，有機(jī)溶劑和無機(jī)堿水溶液的體積比值為0.5～2，反應(yīng)溫度為5～10℃，pH控制在9.5～10.5；3)用無機(jī)酸酸化至pH為2.0～3.0，然后脫去N端保護(hù)基團(tuán)，可得到丙—谷二肽。
3.如權(quán)利要求1所述的丙—谷二肽合成方法，其特征在于N端保護(hù)的氨基酸有N-(O，O-二異丙基)磷酰氨酸(DIPP-l-Ala)，N-(O，O-二乙基)磷酰丙氨酸(DEP-l-Ala)，N-(O，O-二甲基)磷酰丙氨酸(DMP-l-Ala)，芐氧羰基丙氨酸(Z-l-Ala)，(對(duì)甲氧羰基)芐氧羰基丙氨酸(MZ-l-Ala)，叔丁氧羰基丙氨酸(Boc-l-Ala)，2-(二連苯基)異丙氧羰基丙氨酸(Bpoc-l-Ala)。
4.如權(quán)利要求1所述的丙—谷二肽合成方法，其特征在于有機(jī)溶劑有二氯甲烷，甲苯，四氫呋喃，乙腈，1，2-二氯乙烷。
5.如權(quán)利要求1所述的丙—谷二肽合成方法，其特征在于有機(jī)溶劑有乙醇，乙酸乙酯，石油醚，環(huán)己烷，甲苯，二氯甲烷。
6.如權(quán)利要求1所述的丙—谷二肽合成方法，其特征在于無機(jī)堿有氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸氫鈉，碳酸氫鉀，碳酸鈉，碳酸鉀。
7.如權(quán)利要求1所述的丙—谷二肽合成方法，其特征在于無機(jī)酸有鹽酸，硫酸，硝酸，磷酸。
8.如權(quán)利要求1所述的丙—谷二肽合成方法，其特征在于脫保護(hù)基的有三氟乙酸，氯化氫/冰乙酸，溴化氫/冰乙酸，甲基磺酸，氫化還原，氯化氫/1、4二氧六環(huán)，溴化氫/1，4二氧六環(huán)。
全文摘要
涉及一種丙－谷二肽合成方法，N端保護(hù)的氨基酸與三苯基磷、六氯乙烷在有機(jī)溶劑中反應(yīng)形成活潑酯；活潑酯與谷氨酰胺在有機(jī)溶劑和無機(jī)堿水溶液的混合溶液中進(jìn)行，用無機(jī)酸酸化，然后脫去N端保護(hù)基團(tuán)。其原料極為便宜，合成工藝簡(jiǎn)單，中間產(chǎn)物不需要分離和提純處理，產(chǎn)物容易分離提純；省去了有機(jī)堿、谷氨酰胺氨基酸接保護(hù)基團(tuán)保護(hù)和脫除保護(hù)基團(tuán)，簡(jiǎn)化了合成路線，節(jié)約了成本，縮短了時(shí)間，提高了產(chǎn)率，節(jié)省了溶劑和試劑，對(duì)環(huán)境友好；而且產(chǎn)物可直接分液得到，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)設(shè)備，降低成本，有利環(huán)保；反應(yīng)結(jié)束生成兩個(gè)產(chǎn)物，丙－谷二肽和副產(chǎn)物三苯基氧磷，后者為不揮發(fā)的固體，容易回收，整個(gè)合成過程中所采用的試劑毒性均較小。
文檔編號(hào)C07K5/00GK1392156SQ02123369
公開日2003年1月22日 申請(qǐng)日期2002年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月17日
發(fā)明者趙玉芬, 唐果, 周寧 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)