專利名稱：基因工程菊粉酶水解菊芋生產(chǎn)果糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于基因工程菊粉酶水解菊芋或蔗糖生產(chǎn)果糖的方法，屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及到一種來自于黑曲霉(Aspergillusniger)AF10的菊粉酶基因inuA1的結(jié)構(gòu)和菊粉酶蛋白INUA1的氨基酸序列、表達(dá)INUA1的基因工程酵母菌GS115/inuA1和由INUA1生產(chǎn)果糖的方法。
果糖甜度值高、熱量低、不被口腔微生物發(fā)酵，在血液中果糖轉(zhuǎn)變?yōu)楦翁遣恍枰葝u素為轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，另外果糖具有優(yōu)越的食品加工性能，如甜味可口、焦化溫度低、保濕性強(qiáng)及冰點(diǎn)溫度低等，因此作為甜味劑和食品添加劑，果糖能避免由蔗糖和葡萄糖引起的齲齒、高血壓和糖尿病等副作用，而且是食品甜味劑的首選。果糖在食品飲料工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)中有廣闊的應(yīng)用前景。現(xiàn)有的果糖生產(chǎn)是以淀粉為原料，經(jīng)三種酶(淀粉酶、糖化酶和葡萄糖異構(gòu)酶)催化的多步法工藝過程，其產(chǎn)品的果糖含量最高為55％，工藝過程復(fù)雜，原料利用率和產(chǎn)率都較低。以菊芋(或菊粉)為原料，用菊粉酶水解法生產(chǎn)果糖，近年來已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，而關(guān)鍵技術(shù)是使菊粉酶具有高活性?；蚬こ淌侄问翘岣呔辗勖富钚缘挠行緩街?。本發(fā)明提供了一種來自于黑曲霉(Aspergillus niger)AF10的菊粉酶基因inuA1的結(jié)構(gòu)和菊粉酶蛋白INUA1的氨基酸序列，提供了表達(dá)INUA1的基因工程酵母菌GS115/inuA1，還提供了由INUA1水解菊粉或蔗糖生產(chǎn)果糖的方法。
本發(fā)明從土壤中篩選并鑒定了一株菊粉酶酶源菌株黑曲霉(Aspergillus niger)AF10，PCR方法從AF10的基因組DNA中擴(kuò)增菊粉酶基因inuA1，并測(cè)定PCR產(chǎn)物核苷酸序列，獲得了具有完整閱讀框架的由1515個(gè)核苷酸組成的菊粉酶基因inuA1。通過限制性內(nèi)切酶的切割和DNA聚合酶連接，將inuA1整合至克隆載體pUC118中，獲得inuA1的克隆載體pUC118/inuA1。熱擊法將這個(gè)克隆載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)JM109中，成為含有pUC118/inuA1的大腸桿菌JM109/inuA1。
從JM109/inuA1中PCR擴(kuò)增inuA1，與酵母菌克隆載體pPIC9K重組，形成pPIC9K/inuA1，pPIC9K/inuA1電脈沖法轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichia Pastoris)GS115(His，Mut+)，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并做分子生物學(xué)鑒定，獲得菊粉酶基因工程菌GS115/inuA1。GS115/inuA1甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵分泌胞外菊粉酶，分離純化菊粉酶，測(cè)定其酶學(xué)性質(zhì)。
以每克底物25U的酶添加量，55℃、pH5.5條件下水解菊粉(15％)，最高水解率92.3％，果糖含量為92.1％。
以每克底物25U的酶添加量，55℃、pH5.5條件下水解蔗糖(15％)，1小時(shí)水解率達(dá)到100％，生成46.3％的葡萄糖和47.6％的果糖。
inuA1是首次被提取、測(cè)序和克隆的菊粉酶基因，GS115/inuA1表達(dá)的菊粉酶有較高的水解活性，水解菊粉生產(chǎn)果糖的轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品純度高、生產(chǎn)成本低。這個(gè)菊粉酶還可用于以蔗糖、甜菜或甘蔗浸液、糖蜜為原料生產(chǎn)果糖。
以下是本發(fā)明的最佳實(shí)施例。
實(shí)施例1.菊粉酶基因inuA1克隆(1)提取黑曲霉AF10基因組DNAAF10活化后接種于200ml馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，28℃、135r/min搖床培養(yǎng)24hr，離心并洗滌菌絲體。無菌研缽中，用液氮將菌絲體迅速研磨成粉末狀。在1.5mL離心管中加入約0.1g菌體和500μL DNA提取液，振蕩使之充分混合，再加入100μL 10％SDS、氯化芐300μL，劇烈振蕩使管內(nèi)混合物成乳狀，50℃保溫1hr。然后加入300μlL 3MNaAC(PH5.2)混勻，6000r/min離心15min，收集上清液。加入2倍體積無水乙醇，4℃沉淀20min。10,000r/min室溫離心15min，沉淀用70％乙醇洗一次，室溫盡量揮發(fā)殘留的痕量乙醇，TE緩沖液溶解DNA。向每個(gè)離心管中加入1μg/μl的RNase酶，37℃恒溫30min。用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，以λ-HindIII作為DNA分子量標(biāo)記，10V/cm電壓下電泳30min。
(2)PCR擴(kuò)增菊粉酶基因inuA1以AF10基因組DNA為模板，以A.niger菊粉酶基因(INUB)序列為參考設(shè)計(jì)并合成PCR引物，用Pyrobest DNA聚合酶，擴(kuò)增inuA1。引物F15′-ATGTTGAATCCGAAGGTTGC-3′；R15’-TCATTCAAGTGAAACACTCC-3’。PCR反應(yīng)Buffer 5μL，dNTP 4μL，F(xiàn)10.5μL，R10.5μL，AF10DNA 2μL，PyrobestDNA聚合酶0.25μL，dH2O 37.75μL。反應(yīng)條件94℃ 1min，然后以98℃ 15s、55℃ 30s、72℃ 2min為一個(gè)循環(huán)，共運(yùn)行35個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳分析，在約1.6kb處呈現(xiàn)特異條帶。分別對(duì)3個(gè)PCR產(chǎn)物精制、回收，測(cè)定其核苷酸序列測(cè)定.3個(gè)測(cè)定樣品的核苷酸序列完全一致，結(jié)果如下1ATGTTGAATC CGAAGGTTGC CTACATGGTC TGGATGACCT GCCTGGGTTT51 AACGTTGCCC AGCCAGGCGC AGTCTAATGA TTACCGTCCA TCATACCACT101 TCACACCGGA CCAGTACTGG AACGAGCCAA ACGGCCTGAT TAAAATCGGA151 TCCACCTGGC ACCTGTTCTT TCAACACAAT CCGACGGCCA ATGTGTGGGG201 CAACATATGC TGGGGGCACG CTACGAGCAC CGATCTGATG CACTGGGCCT251 ACAAACCCAC TGCCATTGCG GATGAGAACG GAGTCGAAGC GTTTACCGGT301 ACAGCCTATT ATGATCCAAA CAATACCTCT GGCCTTGGGG ATTCGGCAAA351 CCCACCCTAT CTGGCCTGGT TCACAGGTTA TACCACTTCA AGCCAAACAC401 AGGACCAGCG CCTGGCTTTC AGTGTGGATA ACGGGGCGAC GTGGACCAAA451 TTTCAAGGCA ACCCCATCAT ATCAACTAGC CAGGAAGCAC CACATGATAT501 AACGGGCGGC CTCGAGAGTC GGGATCCAAA GGTATTCTTC CATCGCCAAT551 CGGGGAATTG GATCATGGTT CTCGCCCATG GCGGGCAGGA CAAGCTGTCT601 TTCTGGACGT CTGCAGACAC CATACACTGG ACATGGCAGA GTGACCTGAA651 GTCCACCTCG ATCAACGGCC TATCGTCCGA TATTACAGGG TGGGAAGTCC701 CCGACATGTT TGAACTCCCG GTTGAAGGCA CTGGGGAGAC CACTGGGGTG751 GTGATGATGA CGCCGGCTGA AGGATCTCCT GCCGGTGGTA ACGGGGTCTT801 AGCTATCACC GGTTCTTTTG ACGGGAAAAC TTTTACGGCA GATCCCGTCG851 ATGCTTCGAC CATGTGGCTG GACAATGGGC GTGATTTCGA TGGCGCTCTG901 AGCTGGGTGA ACGTGCCTGC GTCCGATGGA CGGCGGATTA TCGCCGCCGT951 CATGAATAGC TACGGTTCCA ACCCGCCTAC AACCACCTGG AAAGGGATGC1001 TCTCCTTTCC CCGGACGCTG TCGCTCAAGA AAGTTGGCAC GCAGCAGCAC1051 TTTGTTCAAC AGCCGATCAC AGAGTTGGAT ATGACAATTA GTACCAGTAT1101 GCAAACACTA GCAAACCAGA CCATTACCCC TGGCCAAACA TTGCTGTCAT1151 CGATTCGGGG AACTGCTCTC GATGTTCGAG TTGCTTTTTA CCCTGATGCT1201 GGCTCGGTTC TGTCCCTCAC CGTCCGAAAG GGTGCTTCGG AGCAAACAGT1251 CATTAATTAC ACCCAGTCAA ATGCCACATT GTCGGTTGAT CGAACAGAGA1301 GTGGAGATAT CTCGTATGAC ACGGCCGCAG GTGGCGTCCA TACCGCCAAG1351 TTGGAAGAGG ACGGCACCGG ACTGGTTTCC ATCCGGGTGT TGGTGGATAC1401 GTGTTCTGTA GAGGTTTTTG GCGGACAAGG AGAGGCCGTC ATTTCCGACC1451 TCATCTTCCC GAGTGACAGC TCTGACGGCC TGGCCTTGGA GGTAACTGGC1501 GGGAATGCAG TGCTGCAGTC GGTGGACGTA CGGAGTGTTT CACTTGAATG1551 A
閱讀框架全長(zhǎng)1551bp，其中G+C含量為54.3％，沒有內(nèi)含子序列，與已報(bào)道的菊粉酶基因核苷酸有不同程度的同源性.
由inuA1推導(dǎo)的菊粉酶INUA1氨基酸序列如下1 MLNPKVAYMA WMTCLGLTLP SQAQSNDYRP SYHFTPDQYW MNEPNGLIKI51 GSTWHLFFQH NPTANVWGNI CWGHATSTDL MHWAYKPTAI ADENGVEAFT101 GTAYYDPNNT SGLGDSANPP YLAWFTGYTT SSQTQDQRLA FSVDNGATWT151 KFQGNPIIST SQEAPHDITG GLESRDPKVF FHRQSGNWIM VLAGHGQDKL201 SFWTSADTIH WTWQSDLKST SINGLSSDIT GWEVPDMFEL PVEGTGETTW251 VVMMTPAEGS PAGGNGVLAI TGSFDGKTFT ADPVDASTMW LDNGRDFDGA301 LSWVNVPASD GRRIIAAVMN SYGSNPPTTT WKGMLSFPRT LSLKKVGTQQ351 HFVQQPITEL DTISTSMQTL ANQTITPGQT LLSSIRGTAL DVRVAFYPDA401 DSVLSLTVRK GASEQTVINY TQSNATLSVD RTESGDISYD PAAGGVHTAK451 LEEDGTGLVS IRVLVDTCSV EVFGGQGEAV ISTLIFPSDS SDGLALEVTG501 GNAVLQSVDV RSVSLEA.niger AF10菊粉酶INUA1由516個(gè)氨基酸組成，其中存在4個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，第40～45位氨基酸為菊粉酶的保守序列WMNEPN。酸性氨基酸有56個(gè)，堿性氨基酸有39個(gè)。分子量為55851.9，分子式為C2474H3770N658O790S15.理論pI為4.58。負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)有56個(gè)，正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)有28個(gè)。
(3)菊粉酶基因inuA1的克隆將上述PCR產(chǎn)物與克隆載體pUC118重組。首先用“TaKaRa BKLKit”對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行3′末端的平滑化和5′末端的磷酸化。向Eppendorf中加入Blunting Kination Enzyme Mix 1μL，10×BluntingKination Buffer 2μL，PCR反應(yīng)液7μL，dH2O 10μL，37℃，10min。產(chǎn)物精制、回收。加入1μL經(jīng)“TaKaRa BAP，CIAP”脫磷酸化處理的具有平滑末端的載體pUC118，ligation Solution A 6μL，充分混合，16℃，過夜，全部反應(yīng)液用熱沖擊法轉(zhuǎn)化E.coli JM109，涂布于含有Amp和X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)基平板上，30℃，培養(yǎng)24小時(shí)，挑選白色菌落按前述方法做PCR，PCR產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳分析，在1.6kb處呈現(xiàn)特異條帶，獲得了A.niger AF10菊粉酶基因inuA1克隆JM109/inuA1。
實(shí)施例2.菊粉酶基因inuA1轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115構(gòu)建inuA1的酵母轉(zhuǎn)化載體pPIC9K/inuA1。引物F25′-CCGAATTCCAGTCTAATGATTACCGTCCT-3′，R25′-CAGGCGGCCGCTCATTCAAGTGAAACACTCCG-3′。PCR反應(yīng)體系PyrobestDNA聚合酶0.25μL，Buffer 5μL，dNTP 4μL，F(xiàn)20.5μL，R20.5μL，模板(從JM109/inuA1中提取的inuA1重組質(zhì)粒pUC118)2μL，dH2O 37.75μL。反應(yīng)條件94℃1min，然后以98℃15s、55℃ 30s、72℃ 1m30s為一個(gè)循環(huán)，共運(yùn)行35個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳分析，在約1.5kb處呈現(xiàn)特異條帶。PCR產(chǎn)物和酵母表達(dá)載體pPIC9K分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI進(jìn)行切割(切割后的pPIC9K脫磷酸化處理)，用DNA連接酶連接pPIC9K1μL(50ng)，inuA9μL(10ng)，SolnI10μL，16℃，12h。獲得inuA1的酵母轉(zhuǎn)化載體pPIC9K/inuA1，pPIC9K/inuA1熱沖擊方法轉(zhuǎn)化E.coli JM109受體細(xì)胞。從E.coli JM109中提取pPIC9K/inuA1，并用BPU1102I做線性化處理，電脈沖法轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichia Pastoris)GS115(His，Mut+)。轉(zhuǎn)化物涂重組酵母篩選培養(yǎng)基{w/w％，YNB(Yeast Nitrogen Base aminoacids)1.3，Biotin0.00004；葡萄糖2.0，瓊脂1.5}，從中挑選His+菌落，以該菌株的基因組DNA為模板做PCR，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳在1.5kb處呈現(xiàn)特異條帶。獲得菊粉酶基因工程酵母菌GS115/inuA1。
實(shí)施例3.GS115/inuA1菊粉酶發(fā)酵(1)菊粉酶活性測(cè)定方法菊粉酶活性定義55℃，pH5.5條件下1分鐘水解底物生成1μmol己糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位U。
制作酶活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，比色管中分別加入0mg、0.2mg、0.4mg、0.6mg、0.8mg、1.0mg、1.2mg、1.4mg、1.6mg、1.8mg和2.0mg的葡萄糖，蒸溜水定容至2mL，加入菲林試劑A、B液各0.5mL，在沸水浴中恒溫15min后，590nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，繪制葡萄糖量-OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣品酶活性測(cè)定取待測(cè)液20μL(對(duì)照樣品沸水5min滅活)，加入180μL蒸溜水，加入800μL 4％濃度的菊粉(用0.1MpH5.5HAC-NaAC緩沖溶液配制)，55℃，水解10min，置沸水中5min以終止反應(yīng)，加入菲林試劑A、B液各0.5mL，于沸水浴中放置15min顯色，8000rpm10min離心，取上清液在590nm波長(zhǎng)下比色。
(2)GS115/inuA1菊粉酶發(fā)酵菌種活化后接種于50mL/300mL重組酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基中{w/w％，葡萄糖4.0，蛋白胨1.0，酵母膏0.2，KH2PO40.05，Na2HPO40.05，MgSO47H2O0.05，MnSO47H2O0.003，F(xiàn)eSO47H2O0.003，pH5.5}，30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)36小時(shí)。離心收集菌體加入50mL重組酵母發(fā)酵培養(yǎng)基(生長(zhǎng)培養(yǎng)基中不含葡萄糖，其余相同)，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，每隔24小時(shí)加入0.5mL甲醇，72小時(shí)終止發(fā)酵。不同時(shí)間下的發(fā)酵酶活性見圖1。產(chǎn)酶高峰在72小時(shí)，酶活性為50.6U/mL，其發(fā)酵液酶活性比基因來源菌AF10提高了約10倍。
實(shí)施例4.GS115/inuA1菊粉酶性質(zhì)(1)純化GS115/inuA1菊粉酶GS115/inuA1發(fā)酵發(fā)酵液5000rpm、10mim離心，取上清液，80％飽和度(NH4)2SO4沉降過夜，18000rpm、20min離心收集沉降物，用0.1MpH5.0HAC-NaAC緩沖液透析。透析液用蛋白質(zhì)制備儀(Pharmacia Biotech  KTA explorer 10s)分離，使用陰離子交換柱hitrapsp 5mL(Pharmacia)，先用25mL的緩沖溶液A(0.1MpH5.0HAC-NaAC)洗脫，然后用100mL的緩沖溶液A和B(含0.5MNaCl的0.1MpH5.0的HAC-NaAC)溶液梯度洗脫，最后用25mL緩沖溶液B洗脫，洗脫液流速2.0mL/min。流出液以280nm波長(zhǎng)的紫外光測(cè)定OD值。用BC A Protein Assay ReagentKit(PIERCE，Rockford，U.S.A)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。純化蛋白質(zhì)電泳分析聚丙烯酰胺凝膠電泳，上(層)膠濃度4.5％，下(層)膠濃度10％，100v小時(shí)，用Bromo phenol染色液染色，以乙醇脫色液脫色。做聚丙烯酰胺凝膠電泳，在90KD處呈現(xiàn)單一條帶，純化的GS115/inuA1菊粉酶記為INUA1，INUA1的比酶活性為16.3μmol/mg。
(2)菊粉酶性質(zhì)測(cè)定
①最適作用pH分別在pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5和pH7.0的緩沖體系下測(cè)定待測(cè)樣品的酶活性，GS115/inuA1發(fā)酵液菊粉酶的最適作用pH值為5.5，純化菊粉酶的最適作用pH為5.0(圖2)。
②最適作用溫度分別在45℃、50℃、55℃、60℃和65℃的溫度下測(cè)定菊粉酶活性，GS115/inuB1發(fā)酵液和INUA1的最適作用溫度均為55℃(圖3)。
④金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活性的影響向水解體系中加入5mM的金屬離子和化學(xué)試劑，55℃水解10min后測(cè)定酶活性，以未加如金屬離子樣品的酶活性為100％酶活性，各測(cè)定樣品的相對(duì)酶活性如下表所示表.金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活性的影響
實(shí)施例5.GS115/inuA1菊粉酶水解菊粉配制15％的菊粉水溶液100mL，以每克底物25U的酶添加量，55℃、pH5.5、40次/min往復(fù)振蕩水解。高效液相色譜(L-6000 PumpHITACHI)定時(shí)測(cè)定底物菊粉和水解生成物果糖及葡萄糖量，分子篩凝膠柱(GL-C 620，GL Science Co.，Tokyo)，水做流動(dòng)相，柱溫度60℃，流速0.6mL/min，Refractive index檢測(cè)器檢測(cè)。前3個(gè)小時(shí)有較大的水解速率，3小時(shí)菊粉水解率為80％，果糖含量為77.6％，24小時(shí)達(dá)到最高水解率92.3％，果糖含量為92.1％。水解體系中葡萄糖含量小于0.1％。水解體系中底物菊粉和產(chǎn)物果糖及葡萄糖隨時(shí)間變化見圖4。
實(shí)施例6.GS115/inuA1菊粉酶水解蔗糖以15％的蔗糖為底物，按每克底物25U的酶添加兩，55℃、pH5.5水解1小時(shí)，水解率達(dá)到100％，生成46.3％的葡萄糖和47.6％的果糖。


圖1重組酵母GS115/inuA1發(fā)酵生成菊粉酶，不同時(shí)間下測(cè)定發(fā)酵液菊粉酶活性，橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間(小時(shí))，縱坐標(biāo)表示酶活性(μmol/mL)。
圖2重組酵母GS115/inuA1菊粉酶最適作用pH，橫坐標(biāo)表示酶活性測(cè)定緩沖溶液pH值，2個(gè)縱坐標(biāo)分別表示發(fā)酵液菊粉酶活性(左)和經(jīng)純化的菊粉酶INUA1酶活性(右)。
圖3重組酵母GS115/inuA1菊粉酶最適作用溫度，橫坐標(biāo)表示酶活性測(cè)定溫度(℃)，2個(gè)縱坐標(biāo)分別表示發(fā)酵液菊粉酶活性(左)和經(jīng)純化的菊粉酶INUA1酶活性(右)。
圖4菊粉酶水解菊粉，水解體系中底物菊粉和產(chǎn)物果糖及葡萄糖隨時(shí)間變化。橫坐標(biāo)表示水解時(shí)間(小時(shí))，縱坐標(biāo)表示菊粉、果糖和葡萄糖質(zhì)量百分比。
權(quán)利要求
1.一種來自于黑曲霉(Aspergillus niger)AF10的菊粉酶基因inuA1的結(jié)構(gòu)和菊粉酶蛋白INUA1的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菊粉酶基因結(jié)構(gòu)如下1 ATGTTGAATC CGAAGGTTGC CTACATGGTC TGGATGACCT GCCTGGGTTT51AACGTTGCCC AGCCAGGCGC AGTCTAATGA TTACCGTCCA TCATACCACT101 TCACACCGGA CCAGTACTGG AACGAGCCAA ACGGCCTGAT TAAAATCGGA151 TCCACCTGGC ACCTGTTCTT TCAACACAAT CCGACGGCCA ATGTGTGGGG201 CAACATATGC TGGGGGCACG CTACGAGCAC CGATCTGATG CACTGGGCCT251 ACAAACCCAC TGCCATTGCG GATGAGAACG GAGTCGAAGC GTTTACCGGT301 ACAGCCTATT ATGATCCAAA CAATACCTCT GGCCTTGGGG ATTCGGCAAA351 CCCACCCTAT CTGGCCTGGT TCACAGGTTA TACCACTTCA AGCCAAACAC401 AGGACCAGCG CCTGGCTTTC AGTGTGGATA ACGGGGCGAC GTGGACCAAA451 TTTCAAGGCA ACCCCATCAT ATCAACTAGC CAGGAAGCAC CACATGATAT501 AACGGGCGGC CTCGAGAGTC GGGATCCAAA GGTATTCTTC CATCGCCAAT551 CGGGGAATTG GATCATGGTT CTCGCCCATG GCGGGCAGGA CAAGCTGTCT601 TTCTGGACGT CTGCAGACAC CATACACTGG ACATGGCAGA GTGACCTGAA651 GTCCACCTCG ATCAACGGCC TATCGTCCGA TATTACAGGG TGGGAAGTCC701 CCGACATGTT TGAACTCCCG GTTGAAGGCA CTGGGGAGAC CACTGGGGTG751 GTGATGATGA CGCCGGCTGA AGGATCTCCT GCCGGTGGTA ACGGGGTCTT801 AGCTATCACC GGTTCTTTTG ACGGGAAAAC TTTTACGGCA GATCCCGTCG851 ATGCTTCGAC CATGTGGCTG GACAATGGGC GTGATTTCGA TGGCGCTCTG901 AGCTGGGTGA ACGTGCCTGC GTCCGATGGA CGGCGGATTA TCGCCGCCGT951 CATGAATAGC TACGGTTCCA ACCCGCCTAC AACCACCTGG AAAGGGATGC1001 TCTCCTTTCC CCGGACGCTG TCGCTCAAGA AAGTTGGCAC GCAGCAGCAC1051 TTTGTTCAAC AGCCGATCAC AGAGTTGGAT ATGACAATTA GTACCAGTAT1101 GCAAACACTA GCAAACCAGA CCATTACCCC TGGCCAAACA TTGCTGTCAT1151 CGATTCGGGG AACTGCTCTC GATGTTCGAG TTGCTTTTTA CCCTGATGCT1201 GGCTCGGTTC TGTCCCTCAC CGTCCGAAAG GGTGCTTCGG AGCAAACAGT1251 CATTAATTAC ACCCAGTCAA ATGCCACATT GTCGGTTGAT CGAACAGAGA1301 GTGGAGATAT CTCGTATGAC ACGGCCGCAG GTGGCGTCCA TACCGCCAAG1351 TTGGAAGAGG ACGGCACCGG ACTGGTTTCC ATCCGGGTGT TGGTGGATAC1401 GTGTTCTGTA GAGGTTTTTG GCGGACAAGG AGAGGCCGTC ATTTCCGACC1451 TCATCTTCCC GAGTGACAGC TCTGACGGCC TGGCCTTGGA GGTAACTGGC1501 GGGAATGCAG TGCTGCAGTC GGTGGACGTA CGGAGTGTTT CACTTGAATG1551 A
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菊粉酶蛋白INUA1的氨基酸序列1 MLNPKVAYMA MMTCLGLTLP SQAQSNDYRP SYHFTPDQYW MNEPNGLIKI51 GSTWHLFFQH NPTANVWGNI CWGHATSTDL MHWAYKPTAI ADENGVEAFT101 GTAYYDPNNT SGLGDSANPP YLAWFTGYTT SSQTQDQRLA FSVDNGATWT151 KFQGNPIIST SQEAPHDITG GLESRDPKVF FHRQSGNWIM VLAGHGQDKL201 SFWTSADTIH WTWQSDLKST SINGLSSDIT GWEVPDMFEL PVEGTGETTW251 VVMMTPAEGS PAGGNGVLAI TGSFDGKTFT ADPVDASTMW LDNGRDFDGA301 LSWVNVPASD GRRIIAAVMN SYGSNPPTTT WKGMLSFPRT LSLKKVGTQQ351 HFVQQPITEL DTISTSMQTL ANQTITPGQT LLSSIRGTAL DVRVAFYPDA401 DSVLSLTVRK GASEQTVINY TQSNATLSVD RTESGDISYD PAAGGVHTAK451 LEEDGTGLVS IRVLVDTCSV EVFGGQGEAV ISTLIFPSDS SDGLALEVTG501 GNAVLQSVDV RSVSLE
4.表達(dá)INUA1的基因工程酵母菌GS115/inuA1。
5.用GS115/inuA1菊粉酶水解菊粉生產(chǎn)果糖的方法。
6.用GS115/inuA1菊粉酶水解蔗糖、甜菜或甘蔗浸液、糖蜜生產(chǎn)果糖的方法。
全文摘要
本發(fā)明是基因工程菊粉酶水解菊芋生產(chǎn)果糖的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種來自于黑曲霉(Aspergillus niger)AF10的菊粉酶基因inuA1的結(jié)構(gòu)和菊粉酶蛋白INUA1的氨基酸序列，提供了表達(dá)INUA1的基因工程酵母菌GS115/inuA1，還提供了用GS115/inuA1菊粉酶水解菊粉生產(chǎn)果糖的方法和用GS115/inuA1菊粉酶水解蔗糖生產(chǎn)果糖的方法，本發(fā)明還可用于以蔗糖、甜菜或甘蔗浸液、糖蜜為原料生產(chǎn)果糖。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1465699SQ0213244
公開日2004年1月7日 申請(qǐng)日期2002年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月12日
發(fā)明者張苓花, 王運(yùn)吉 申請(qǐng)人:大連輕工業(yè)學(xué)院