專利名稱：水稻抗白葉枯病基因Xa4的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種DNA片段的分離。所述的DNA片段能夠賦予植物抵抗由白葉枯病菌引起的病害。將該片段與其內(nèi)源調(diào)節(jié)序列直接轉(zhuǎn)入植物體，或者將該片段和合適的調(diào)節(jié)序列連接后轉(zhuǎn)入植物體，轉(zhuǎn)基因植物可以產(chǎn)生Xa4介導(dǎo)的對多種病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)。
背景技術(shù)：
植物在生長的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、細(xì)菌、霉菌和線蟲等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果(1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關(guān)的病癥；(2)寄主植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長。
雖然植物缺乏像動物一樣的循環(huán)系統(tǒng)和抗體，也缺乏特化的防衛(wèi)細(xì)胞，但它有一套區(qū)別于脊椎動物免疫系統(tǒng)的抗病防衛(wèi)體系。在這一體系中，植物的每一個細(xì)胞都有對病原物的侵染產(chǎn)生組成型抗性(constitutive resistance)和誘導(dǎo)型抗性(induced resistance)的能力。組成型抗性又稱為被動抗病性，主要靠形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的機(jī)械障礙(主要指能夠抗穿刺和阻止病原物的移動物質(zhì)，如角質(zhì)層、木栓質(zhì)、蠟質(zhì)、木質(zhì)素、硅和二價陽離子等)以及抗病原物的化學(xué)因子(如酚類化合物、生物堿等，但不包括病原物侵染后發(fā)生防衛(wèi)反應(yīng)產(chǎn)生的活性因子)來降低病原物對宿主的損害(王金生，1999，分子植物病理學(xué)，中國農(nóng)業(yè)出版社)。組成型抗性相對較弱。誘導(dǎo)抗性又稱為主動抗性，是在植物和病原微生物長期相互作用中產(chǎn)生的，指寄主植物被病原物侵染后，產(chǎn)生或激活的抗病特性。植物對病原物的這種主動抗病形式由植物的抗病基因介導(dǎo)，其可見的標(biāo)志是過敏反應(yīng)，抗性很強(qiáng)。許多植物抗病基因已經(jīng)被遺傳定位。
植物和病原菌的互作分為親和性互作和非親和性互作兩種。前者是指病原物侵染寄主植物并引起發(fā)病；后者是指病原物遇上抗病寄主和非寄主植物時病害一般不會發(fā)生。植物的主動抗病反應(yīng)主要是針對非親和性病原菌產(chǎn)生。這種反應(yīng)一般具有病原小種特異性。Flor(1956，Adv.Genet.829-54)根據(jù)對亞麻(Linum usitatissmum)銹病(Melampsoralini)的研究提出基因?qū)驅(qū)W說解釋植物主動抗病反應(yīng)。該學(xué)說認(rèn)為，當(dāng)植物攜帶的抗病基因的產(chǎn)物能夠識別病原菌無毒基因(avirulent gene)產(chǎn)物時，植物表現(xiàn)出抗病。針對寄主的每一個抗病基因，在病原菌方面或遲或早都會發(fā)現(xiàn)一個毒性基因(virulentgene)。毒性基因只能克服其對應(yīng)的抗病基因，而產(chǎn)生致病效應(yīng)。這一遺傳假說為深刻理解植物宿主一病原物的相互作用提供了理論基礎(chǔ)，并進(jìn)一步引導(dǎo)了研究者們對病原物無毒基因和植物抗病基因的克隆。研究者們對抗病基因的深入研究進(jìn)一步證明了基因?qū)驅(qū)W說的合理性，并從分子水平上對這一學(xué)說作出了解釋植物對病原物的防衛(wèi)反應(yīng)起始于對病原物特殊信號分子-激發(fā)子(elicitor)的識別(激發(fā)子是病原物無毒基因直接或間接產(chǎn)物)；抗病基因編碼這些信號分子的受體，受體和激發(fā)子的結(jié)合啟動宿主對病原物產(chǎn)生抗性，抑制病原物的生長(Staskawicz等，1995，Science 268661-667)。
植物中已有多個抗病基因被克隆。在已被克隆的植物抗病基因中，大多數(shù)基因都編碼信號分子識別蛋白。這類抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)可以用基因?qū)驅(qū)W說解釋(Baker等，1997，Science 276726-733)。根據(jù)基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，一般可將采用基因?qū)驅(qū)W說原理介導(dǎo)抗病反應(yīng)的抗病基因分為5類(Jones，2000，InDickinson M and Beynon J.Molecular Plant Pathology，Annual Plant Reviews，Vol 4.108-143；Dangl和Jones，2001，Nature 411826-833)(表1)。
表1部分已克隆的采用基因?qū)驅(qū)W說原理介導(dǎo)抗病反應(yīng)的植物抗病基因類基因 宿主 病原菌蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)參考文獻(xiàn)a群1Rps2擬南芥 Pseudomonas CC-NBS-LRR Bent等，1994syringaeRps4擬南芥 P.Syringae CC-NBS-LRR Gassmann等，1999RPS5擬南芥 P.syringae CC-NBS-LRR Warren等，1998Rpp8擬南芥 P.ParasiticaCC-NBS-LRR McDowell等，1998Rpp13 擬南芥 P.parasiticaCC-NBS-LRR Bittner-Eddy，2000Rpm1擬南芥 P.maculicolaCC-NBS-LRR Grant等，1996HRT 擬南芥 TCV CC-NBS-LRR Cooley等，2000Prf 番茄P.syringae CC-NBS-LRR Salmeron等，1996Mi 番茄Meloidogyne， CC-NBS-LRR Milligan等，1998MacrosiphumI2番茄Fusarium. CC-NBS-LRR Simons等，1998OxysporumXal 水稻Xanthomonas CC-NBS-LRR Yoshimura等，1998oryzaePita水稻Magnaporthe CC-NBS-LRR Bryan等，2000griseaPi-b水稻M.griseaCC-NBS-LRR Wang等，1998，
Dm3 萵苣Bremia lactucae CC-NBS-LRR Myers等，1998Mlal 大麥Bluseria graminisCC-NBS-LRR Zhou等，2001Mla6 大麥B.graminis CC-NBS-LRR Halterman等，2001Rp1-D 玉米Puccinia.Sorghi CC-NBS-LRCollins等，1999Rpp5 擬南芥 P.parasitica TIR-NBS-LRR Parker等，1997Rpp1 擬南芥 P.parasitica TIR-NBS-LRR Botella等，1998N 煙草TMV TIR-NBS-LRR Whitham等，1994L6亞麻Melampsoralini TIR-NBS-LRR Lawrence等，1995M 亞麻M.lini TIR-NBS-LRR Eliss等，1995N 亞麻M.lini TIR-NBS-LRR Dodd等，20012 Cf9 番茄Cladosporium LRR-TM Jones等，1994FulvumCf2 番茄C.fulvum LRR-TM Dixon等，1996Cf4 番茄C.fulvum LRR-TM Thomas等，1997cf5 番茄C.fulvum LRR-TM Dixon等，1998HS1pro-1甜菜Heterodera LRR-TM Cai等，1997Shachtii3 Pto 番茄P.syringae 蛋白激酶 Martin等，1993PBSl 擬南芥 P.syringae 蛋白激酶 Swiderski和Innes，20014 Xa21 水稻X.oryzae LRR-TM-蛋白 Song等，1995激酶Xa26(t) 水稻X.oryzae LRR-TM-蛋白 中國專利申請?zhí)柤っ?02139212.95 RPW8 擬南芥 E.Cichoracearum CC-NBS Xiao等，2001a參考文獻(xiàn)目錄Bent A F et al.Science，1994，2651856-1860Bitter Eddy P D et al.Plant J，2000，21177-188Botella M A et al.Plant Cell.1998，101847-1860Bryan G T et al.Plant Cell，2000，122033-2045Cai D et al.Science，1997，275832-834Collins N et al.Plant Cell，1999，111365-1376Cooly M B et al.Plant Cell，2000，663-676Dixon M S et al.Cell，1996，84451-459Dixon M S et al.Plant Cell，1998，101915-1925.
Dodds P N et al.Plant J，2001，27439-452Ellis J G et al.Proc NatAcadSci USA.1995.924185-4188Gassmann Wet al.Plant J，1999，20265-277Grant M Ret al.Science，1995，269843-846Halterman D et al.Plant J，2001，25335-348Jones D A et al.Science，1994，266789-793Lawrence G J et al.Plant Cell，1995，71195-1206Martin G B et al.Science，1993，2621432-1436Meyers B C et al.Plant Cell，1998a，101817-1832Milligan S B et al.Plant Cell，1998，101307-1319Parker J E et al.Plant Cell，1997，9879-894Salmeron J M et al.Cell，1996，86123-133Simons Get al.Plant Cell，1998，101055-1068Song W Y et al.Science，1995，2701772-1804Swiderski M R and Innes R W.Plant J，2001，26101-112Thomas C M et al.Plant Cell，1997，92209-2224Wang Z X et al.Plant J，1999，1955-64Warren R F et al.Plant Cell，1998，101439-1452Whitham S et al.Cell，1994，781101-1115Xiao S et al.Science，2001，291118-120Yoshimura S et al.Proc NatlAcadSci，1998，951663-1668Zhou F et al.Plant Cell，2001，13337-350第一類抗病基因編碼具有NBS-LRR(nucleotide binding site-leucine rich repeat)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，它是已被克隆的抗病基因中最大的一群(表1)。這類抗病基因可被進(jìn)一步分為兩個亞群(Richter和Ronald，2000，Plant Mol.Bio.42195-204)。一個亞群其抗病基因編碼的蛋白氨基端是CC(Coiled-coil)結(jié)構(gòu)域，擬南芥中的RPS2和RPMl以及番茄中的Mi基因?qū)儆谶@一亞群。另一亞群含有TIR結(jié)構(gòu)域(homology to the cytoplasmicdomains of the Toll receptor of Drosophila melanogaster and the IL-1 receptor of birds andmammals)，如煙草中的N基因、擬南芥中的Rpp5和亞麻中的L基因。該類基因編碼的蛋白一般存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，抗病基因編碼蛋白和激發(fā)子的相互作用也發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)；其NBS結(jié)構(gòu)域比較保守，LRR結(jié)構(gòu)域不很規(guī)則，相互之間同源性較差(Baker等，1997，Science 276726-733；Kobe和Deisenhofer，1994，Trend Biochem.Sci.19415-421)。
第二類抗病基因編碼胞外LRR結(jié)構(gòu)域(表1)。這類抗病基因編碼的LRR結(jié)構(gòu)域比第一類抗病基因編碼的LRR規(guī)則。LRR存在于細(xì)胞外，通過跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)將其錨定于細(xì)胞膜上。在這類抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)中很可能激發(fā)子和胞外的LRR結(jié)合，由TM將信號傳遞入胞內(nèi)。該類蛋白質(zhì)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域很小，較保守，可能涉及到和細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞體的相互作用(Jones等，1994，Science 266789-793；Dixon等，1998，PlantCell 101915-1925；Thomas等，1997，Plant Cell 92209-2224)。
第三類抗病基因編碼蛋白激酶(表1)。如番茄的Pro基因(Martin等，1993，Science2621432-2436；美國專利第5,648,599)編碼一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶。這個蛋白質(zhì)是一種典型的信號傳遞蛋白質(zhì)。從結(jié)構(gòu)分析該蛋白似乎缺乏受體的功能。但目前已證明該蛋白能直接和由病原菌avrPto編碼的蛋白結(jié)合，亦能和植物體內(nèi)其它的蛋白-很可能是與信號傳遞相關(guān)的蛋白相互作用。Pto蛋白發(fā)揮作用時需要Prf基因編碼的LZ(leucine zipper)-NBS-LRR類蛋白質(zhì)的協(xié)助(Scofield等，1996，Science 2742063-2065；Tang等，1996，Science 2742060-2063)。另一個抗病基因-PBS1也屬于這一類群。PBS1也編碼一種蛋白激酶，但和Pto不屬于一類。它發(fā)揮作用同樣需要一類NBS-LRR蛋白質(zhì)-RPS5的協(xié)助。
第四類抗病基因編碼受體激酶(表1)。從水稻中分離克隆的抗白葉枯病基因Xa21(Song等，1995，Science 2701772-1804)和Xa26(t)(中國專利申請?zhí)?2139212.9)基因?qū)儆诖祟?。Xa21和Xa26(t)蛋白由LRR、TM和蛋白激酶三部分結(jié)構(gòu)域組成。一般認(rèn)為LRR位于胞外，激酶部分在胞內(nèi)。到目前為止，僅發(fā)現(xiàn)Xa21和Xa26(t)蛋白是具有抗病活性的受體激酶。從結(jié)構(gòu)上分析，這類蛋白具有典型的信號識別和傳遞功能。
第五類抗病基因編碼產(chǎn)物僅包含截短的CC-NBS結(jié)構(gòu)(表1)。擬南芥的RPW8基因?qū)儆诖祟?Xiao等，2001，Science 291118-120)。目前，研究者們還不知道該基因編碼的蛋白質(zhì)如何完成對病原菌的識別。
水稻白葉枯病是一種非常嚴(yán)重的病害，由稻黃單孢桿菌中的致病變種Xanthomonasoryzae pv.oryzae侵染引起。這種病害在亞洲、歐洲、非洲、南美、美國和澳大利亞都有發(fā)生；而以日本、印度和中國發(fā)生比較嚴(yán)重。我國主要發(fā)生在華東、華中、華南稻區(qū)，在西北、西南、華北和東北部分稻區(qū)也有分布。白葉枯病在潮濕和低洼地區(qū)發(fā)病比較頻繁，一般秈稻重于粳稻，雙季晚稻重于雙季早稻，單季中稻重于單季晚稻(過崇儉，1995，中國農(nóng)作物病蟲害，中國農(nóng)業(yè)出版社，14-24)。受侵染的水稻一般減產(chǎn)20-30％，嚴(yán)重時能夠達(dá)到50％(Ou，1985，Rice disease，2nd edition.)。白葉枯病造成米質(zhì)松脆，發(fā)芽率降低。如果在分蘗期出現(xiàn)凋萎型白葉枯，則造成稻株的大量枯死，損失會更大。
根據(jù)對我國各個病區(qū)搜集的835個菌株在5個基本鑒定品種上的反應(yīng)，將我國白葉枯病原菌分為7個生理小種，小種C2和C4是全國的優(yōu)勢小種，其次是小種C1和C3，小種C5、C6、C7是稀有小種。以不同稻區(qū)分析，北方稻區(qū)多為C2，C1和C3次之，小種C4和C6稀有；南方稻區(qū)以及長江流域主要是C4和C2，福建和廣東有少量的C5小種(過崇儉，1995，中國農(nóng)作物病蟲害，中國農(nóng)業(yè)出版社)。
水稻抗白葉枯病基因Xa4是一個在中國和其它亞洲國家的育種中廣泛應(yīng)用的基因(Min，1992，Agricultural Publisher of Science and Technology of China，Beijing，pp58-67)。該基因是一個全生育期顯性抗性基因，主要抗白葉枯病菌菲律賓生理小種1、5、7和8(Ogawa等，1986，Rice Genet.Newsl.383-84；Yoshimura等，1995，Mol.Breed.1375-387；Zhang等，1998，Rice Genet.Newselt.1998，15138-142；Chaudhary，2000，RiceBreeding and Genetics，Published by science publisher，Inc，USA.pp.169-217)。Xa4基因?qū)ξ覈兹~枯病菌的7個生理小種(除在廣東和福建少量出現(xiàn)的生理小種C5外)都有很強(qiáng)的抗性(過崇儉，1995；Chaudhary，2000)。該基因?qū)儆谝环N持久性抗病基因(Reddy和Bentur，2000，Rice Breeding and Genetics，Published by science publisher，Inc，USA.pp.143-167)。為進(jìn)一步提高品種的抗性，將該基因和其它的抗病基因聚合在一起，使品種的抗性提高，抗譜變寬(Huang等，1997，Theor.Appl.Genet.95313-320)。通過對Xa4基因的克隆，研究其抗病機(jī)理，可以揭示該基因具有持久和全生育期抗性的原因。
Xa4基因首先在IR20，IR22和其它的幾個水稻品種中被鑒定出來(Libroio等，1976，SABRAO J.8105-110；Olufowate等，1977，Phytopathology 67772-775；Petpisit等，1977，Crop Sci.17551-554)，并被定位于水稻第11染色體的末端(Yoshimura等，1995，Mol.Breed.1375-387)。Li等(1999，Mol.Gen.Genet.26158-63)鑒定出水稻品種特青也攜帶Xa4基因，并將其定位在第11染色體的兩個分子標(biāo)記RZ536和G2132b之間。Sun等(Theor.Appl.Genet.DOI 10.1007/s00122-002-1117-8)進(jìn)一步將Xa4基因精細(xì)定位于第11染色體的一條47kb的DNA片段上。
在水稻第11染色體的Xa4基因區(qū)段還有抗白葉枯病基因Xa3(Yoshimura等，1995，Mol.Breed.1375-387)、Xa22(t)(Lin等，1996，Phytopathology 861156-1159)和Xa26(t)(中國專利申請?zhí)?2139212.9)。Xa22(t)基因是一個廣譜高抗基因(成株期抗性)，其染色體位點與Xa4緊密連鎖或等位。Xa3基因抗白葉枯病菌菲律賓生理小種1-5，是成株期抗性(Ogawa等，1986，Rice Genet.Newsl.383-84；Yoshimura等，1995，Mol.Breed.1375-387)。Librojo等(1976，SABRAO J.8105-110)在Semora Mangga中鑒定了一個顯性基因，成株期抗性，等位性分析表明這個基因和Xa4基因等位，Librojo等(1976，SABRAO J.8105-110)將其命名為Xa4b。Ogawa等(1986，Rice Genet.Newsl.383-84；)進(jìn)一步分析認(rèn)為Xa4b就是Xa3。由于用于等位性分析的群體較小，不能確定Xa3和Xa4是緊密連鎖還是呈等位關(guān)系。采用分子標(biāo)記分別對Xa3和Xa4基因進(jìn)行了定位，二者的位置很接近，但不能排除它們是等位基因的可能(Yoshimura等，1995，Mol.Breed.1375-387)。遺傳分析和基因序列分析證明Xa26(t)基因是Xa4的等位基因，但是兩個基因的抗譜有差別(中國專利申請?zhí)?2139212.9)。
控制白葉枯病害流行的最好的方法是改良水稻品種的抗性。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為品種改良提供了高效技術(shù)途徑。但利用這一途徑的前體是必須具有優(yōu)良基因克隆。目前已被鑒定的抗白葉枯病基因有20多個，但國際國內(nèi)已報道被分離克隆的抗白葉枯病基因只有兩個Xa21(Song等，1995，Science 2701804-1806，美國專利號5,859,339)和Xa1(Yoshimura等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 951663-1668)。Xa21基因抗譜廣，但它只具有成株期抗性。Xa1基因雖然具有全生育期抗性，但它的抗譜窄。另外，Xa21基因的知識產(chǎn)權(quán)不屬于我國，使利用這個基因克隆改良水稻品種的抗性受到限制。Xa4基因在我國的水稻品種改良中具有很好的應(yīng)用前景，獲得Xa4基因克隆將有利于最有效地利用這一優(yōu)良基因資源。
另外，獲得抗病基因克隆也是研究水稻抗病機(jī)理的前提。揭示水稻抗白葉枯病的機(jī)理可以更好的控制和降低白葉枯病菌對水稻的危害。同時，對克隆的抗病基因的修飾和改造，可以人為控制和增加植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從水稻抗白葉枯病近等基因系IRBB4和秈稻品種特青中分離克隆抗白葉枯病基因Xa4和包含調(diào)控Ya4基因的啟動子的DNA片段，利用這個基因改良其它水稻品種或其它植物抵御病害的能力。
本發(fā)明涉及分離一種包含Xa4基因的DNA片段，該片段賦予植物對由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害產(chǎn)生特異性的抗病反應(yīng)。這一發(fā)明適用于所有對該病原菌敏感的植物。這些植物包括單子葉植物和雙子葉植物。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO1所示序列的亞片段。該DNA序列編碼一種受體蛋白激酶，它包含細(xì)胞外的LRR結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如(附

圖1)所示。
所分離克隆的Xa4抗病基因編碼受體蛋白激酶。這種蛋白質(zhì)包含兩個主要結(jié)構(gòu)域由26個LRR組成的胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。已被克隆的水稻抗白葉枯病基因Xa21(Song等，1995，Science 2701772-1804)和Xa26(t)(中國發(fā)明專利申請?zhí)?2139212.9)也編碼受體蛋白激酶。Xa21蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域由23個LRR組成。另外，Xa4基因和Xa21基因編碼的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域也存在序列上的差異。Xa26(t)蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域雖然也由26個LRR組成，但它與Xa4蛋白的LRR結(jié)構(gòu)域存在序列差異。Xa4基因和Xa26(t)基因編碼的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域也存在序列上的差異。Xa4基因中編碼LRR或蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的核酸片段可能具有獨立的功能。將Xa4基因中編碼胞內(nèi)或胞外結(jié)構(gòu)域的片段與其它核酸片段重組，可構(gòu)成嵌合基因或蛋白質(zhì)，使之具有新的功能。對Xa4基因進(jìn)行修飾或改造，可改變或增加基因的某種功能。例如，將該基因的胞外結(jié)構(gòu)域替換為Xa21基因或Xa26(t)基因的胞外結(jié)構(gòu)域，可能會增加或改變基因的抗譜；對該基因的胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行定點突變，可能會改變基因的抗性和抗譜等。
本發(fā)明同樣包括將Xa4抗病基因的主要結(jié)構(gòu)部分有效連接上合適的調(diào)節(jié)序列所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種基因的植物和這種植物的種子。如這種基因可以是天然的或是嵌合的。例如，將包含該基因的片段和一個組成型表達(dá)的啟動子連接，該啟動子可以在任何環(huán)境條件下和細(xì)胞發(fā)育的任何時期表達(dá)。這種組成型表達(dá)的啟動子包括花椰菜花葉病毒35S的啟動子等。另一方面，也可以將該基因和一個組織特異性表達(dá)的啟動子或發(fā)育時期特異性表達(dá)的啟動子或精確環(huán)境誘導(dǎo)的啟動子連接，這些啟動子稱之為誘導(dǎo)型啟動子。這樣，環(huán)境的改變，發(fā)育時期的不同都可以改變該基因的表達(dá)，同樣，也可以將該基因的表達(dá)限定在某一個組織內(nèi)，使由該基因誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)得到人為的控制。其中環(huán)境條件包含病原菌的攻擊、厭氧條件、和光等，組織和發(fā)育時期包括葉、果實、種子和花等。
本發(fā)明中，Xa4基因的內(nèi)源啟動子也可以控制該基因的表達(dá)。該啟動子同樣也可以控制嵌合基因或其它基因的表達(dá)。因此將該基因的啟動子和任何其它基因連接、特別是與抗病基因連接，同樣會改變植物的抗性，包括抗真菌和細(xì)菌的抗性的等。
在cDNA和基因組文庫中，可以采用已經(jīng)克隆的Xa4基因為探針，篩選到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，可以在基因組中、mRNA和cDNA中，采用PCR技術(shù)，擴(kuò)增到本發(fā)明中的DNA序列中任何感興趣的一段或與其同源的一段。例如，所擴(kuò)增的序列用于蛋白質(zhì)的表達(dá)、用作探針篩選文庫、測序或其它目的等。采用以上技術(shù)，可以分離到包含Xa4基因的序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
將克隆的抗病基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有助于產(chǎn)生新的抗病植物。特別是可以用轉(zhuǎn)化技術(shù)在植株中累加多個抗病基因，而不會產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的連鎖基因組序列?？共』虻目寺∈强朔鹘y(tǒng)育種不能在植物種間轉(zhuǎn)移抗病基因的問題的前提。
在本文的實施例部分，我們闡述了Xa4基因的分離過程和該基因的特點。其流程如圖2所示。
序列表、附圖及其說明序列表SEQ ID No1.包括Xa4基因和Xa4基因啟動子的基因組序列。
圖1.Xa4基因編碼的受體激酶類膜蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其中包括兩個主要的結(jié)構(gòu)域富亮氨酸重復(fù)(LRR)和蛋白激酶(kinase)。在激酶結(jié)構(gòu)域序列中用下劃線標(biāo)注的氨基酸殘基與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的保守區(qū)很相似，與受體激酶的保守亞結(jié)構(gòu)域相同。信號肽序列和LRR區(qū)之間有一段未知功能的序列，這段序列中包含一個CX6C結(jié)構(gòu)(線條框中所示序列)。
圖2.本發(fā)明分離克隆水稻抗白葉枯病基因Xa4的流程圖。
圖3.本發(fā)明的水稻抗白葉枯病基因Xa4在第11染色體分子標(biāo)記遺傳連鎖圖上的位置。
圖4.用DNA雜交技術(shù)分析Xa4基因區(qū)段的BAC克隆之間的重疊關(guān)系。將提取的BAC質(zhì)粒(33P4、65H1、3H8、5B14、31B6、65A17、39F18、26G20、57B2和38G13)用Hind III完全酶切，電泳后轉(zhuǎn)移至尼龍膜。然后用經(jīng)Hind III酶切消化、放射性同位素p32標(biāo)記的BAC克隆3H8、39F18和57B2分別與尼龍膜雜交，根據(jù)雜交帶型的重疊情況確定BAC克隆之間的重疊關(guān)系。
圖5.覆蓋Xa4基因區(qū)段的物理圖譜。短橫線代表不同BAC克隆。豎虛線表示某一BAC克隆包含的分子標(biāo)記經(jīng)過DNA雜交驗證。分子標(biāo)記之間的阿拉伯?dāng)?shù)字表示在F2群體中某一分子標(biāo)記與Xa4基因之間存在重組的單株數(shù)目。Xa4位點被定位在BAC克隆3H8上。
圖6.對水稻品種明恢63的BAC克隆3H8進(jìn)行測序分析后，獲得兩條長DNA序列。一條長36.4kb，另一條長30.4kb。長36.4kb的序列中包含3個編碼LRR-蛋白激酶類蛋白質(zhì)的基因，分別被命名為RKa、RKb和RKc；這條序列中還包括一個編碼蛋白激酶(kinase)類蛋白的基因。垂直虛線示來源于3H8的分子標(biāo)記X4-88、Sub11、2/15B-29和M196-1在3H8或在RKa和RKb基因上的相對位置。分子標(biāo)記之間的阿拉伯?dāng)?shù)字表示在F2群體中某一分子標(biāo)記與Xa4基因之間存在重組的單株數(shù)目。根據(jù)這些結(jié)果和RT-PCR分析結(jié)果，可以確定明恢63中的RKa是Xa4的等位基因。
圖7.從抗白葉枯病近等基因系IRBB4中分離克隆包含RKa基因同源序列片段的技術(shù)路線。
圖8.水稻抗白葉枯病近等基因系IRBB4(IRBB4/Xa4)、特青(TQ/RKa)和93-11(9311/RKa)中的Xa4基因與明恢63中的RKa基因(MH63/RKa)編碼的氨基酸序列比較。特青的TQ/RKb基因、93-11的9311/RKb基因和明恢63的RKb基因(MH63/RKb)編碼的氨基酸序列的比較。“-”表示該處無氨基酸殘基；“·”該處的氨基酸殘基與IRBB4/Xa4相同。
圖9.基因結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示，來自于特青和IRBB4的12kb DNA序列中包含兩個基因RKd2和Xa4的候選基因(與明恢63中的RKa同源的基因)。這兩條序列在Xa4的候選基因的編碼區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)核苷酸的差異；在Xa4的候選基因之前的非編碼區(qū)和位于Xa4的候選基因前面的一個預(yù)測基因(RKd2)的外顯子上各存在一個核苷酸的差異(箭頭所示處)。這一結(jié)果說明在水稻品種“特青”中的抗病候選基因和IRBB4中的抗病候選基因的序列完全相同。
圖10.特青BAC克隆26N11中的抗病基因家族的結(jié)構(gòu)。對26N11進(jìn)行測序形成三個大的重疊群。重疊群TQ/contig A包含六個抗病基因家族成員(RKd1、RKd2、TQ/RKa、/Rke1、Rke2和TQ/RKb)；重疊群TQ/contig B包含一個抗病基因家族成員(RKf)；重疊群TQ/contig C包含三個抗病基因家族成員(Rkg、TQ/RKc和RKh)。矩形代表基因的外顯子，矩形之間用折線連接的區(qū)段代表內(nèi)含子。兩個相鄰基因之間的DNA區(qū)段用直線表示。
圖11.水稻品種“特青”BAC克隆26N11所包含的抗病基因家族成員編碼的氨基酸序列比較。
圖12.水稻品種“特青”BAC克隆26N11的序列與水稻品種“93-11”中的同源序列的重疊關(guān)系。其中TQ/contig A、TQ/contig B和TQ/contig C所示的長線條代表“特青”的序列，其它短線條代表“93-11”中與“特青”的序列同源的序列。
圖13.PCR分析Xa4基因的突變F2株1-22的后代(F3單株)。用根據(jù)水稻品種“明恢63”中的RKa、RKb和RKc基因序列和特青中的RKd1基因序列設(shè)計的引物，通過PCR擴(kuò)增并與它們的抗病親本(IRBB4)和感病親本(IR24)進(jìn)行對照，分析各單株中RKa、RKb、RKc和RKd1的同源基因。其中RKa11L-RKa1R、RKa2L-RKa2R和RKa2L-RKa22R是根據(jù)“明恢63”中的RKa基因設(shè)計的引物。
圖14.利用RKa-2L和RKa22R引物，通過PCR擴(kuò)增IRBB4的總DNA和IRBB4接種白葉枯病菌1天(1d)、3天(3d)、5天(5d)以及對照(0d)的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，檢測Xa4基因是否含有內(nèi)含子。
圖15.Xa4基因內(nèi)含子的剪切位點。
具體實施例方式
以下實施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明。根據(jù)以上的討論和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實施例一Xa4基因的遺傳定位水稻抗白葉枯基因Xa4對許多白葉枯病菌生理小種具有抗性，為對該基因進(jìn)行遺傳定位，我們將帶IR24和其近等基因系一攜帶有Xa4基因的IRBB4雜交，建立了約3000株的F2群體。對IRBB4和IR24以及整個F2群體接種白葉枯病菌生理小種PX061。接種后21天，調(diào)查病斑長度。IRBB4和IR24的平均病斑長度分別為4.9cm和22.4cm。從F2大群體中，隨機(jī)地選出包含255個單株的小群體，測量每個單株的病斑長度，小群體內(nèi)病斑長度和單株數(shù)的關(guān)系表現(xiàn)出明顯的雙峰分布。兩峰的峰谷處于13-15cm的位置，一峰對應(yīng)于抗性單株，另一峰對應(yīng)與感病單株。計算兩峰的單株數(shù)，抗性單株數(shù)和感病單株數(shù)之比符合3∶1的單基因遺傳分離規(guī)律(x2＝0.32，P＞0.5)，說明IRBB4對白葉枯病菌生理小種PXO61的抗性由一個主效顯性基因(即Xa4基因)控制。
在此之前，Yoshimura等(1995，Mol.Breed.1375-387)已將Xa4抗病基因初步定位于11染色體的末端。本發(fā)明首先選取抗病基因附近的分子標(biāo)記進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)有6個RFLP(restriction fragment length polymorphism)標(biāo)記(G181，R1506，S12886，L190，C10295和S10559)和1個SSR(simple sequence repeat)標(biāo)記(RM224)在這個群體的兩個親本之間表現(xiàn)出多態(tài)性。用這些分子標(biāo)記對255個單株的群體進(jìn)行分析，建立了Xa4局部區(qū)段的精細(xì)遺傳連鎖圖(圖3)。Xa4基因被定位于兩個R1506和S12886之間，并距離這兩個標(biāo)記各0.5cM。
實施例二建立覆蓋Xa4基因區(qū)段的物理圖譜Xa4基因區(qū)段的物理圖譜的構(gòu)建采用本實驗室構(gòu)建的明恢63 BAC文庫。該文庫由26,000個克隆組成，平均插入片段150kb，覆蓋水稻基因組9倍(Peng等，1998，ActaBotanica Sinica 401108-1114)。我們首先采用和Xa4基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選BAC文庫。分子標(biāo)記R1506屬于單拷貝探針，用該探針從文庫中篩選到3個重疊的BAC克隆，分別是33P4，65H1和3H8。分子標(biāo)記S12886位于基因的另一側(cè)，用該標(biāo)記篩選到另外3個重疊BAC克隆，分別為26G20、57B2和39F18。另外，用與S12886共分離的分子標(biāo)記Y6855RA(Harushima等，1998，Genetics 148479-494)鑒定出3個BAC克隆，分別是31B6、65A17和7M24。從保存的文庫中將篩選到的BAC克隆取出，擴(kuò)大培養(yǎng)，采用標(biāo)準(zhǔn)堿裂解法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold SpringHarbor Laboratory Press)分離提取BAC質(zhì)粒。將所得BAC質(zhì)粒用Hind III完全酶切、電泳、轉(zhuǎn)移至尼龍膜；然后用Hind III完全酶切的BAC克隆作探針與載有BAC質(zhì)粒的尼龍膜雜交，根據(jù)電泳位置相同的雜交帶的有無和多少確立不同BAC克隆之間的重疊關(guān)系。兩個BAC克隆分享相同的雜交帶越多，則重疊區(qū)段越長，圖4顯示了跨越基因區(qū)段的10個BAC克隆之間的重疊情況。最后，從中確立了6個冗余最少的BAC克隆，建立了覆蓋Xa4基因區(qū)段的重疊群(圖5)。
為確定BAC克隆插入片段的大小，采用限制性內(nèi)切酶Not I對BAC克隆進(jìn)行酶切消化，1％瓊脂糖脈沖場電泳分離酶切片段，并和已知大小的DNA片段的遷移率做比較，計算出插入片段的大小。電泳條件如下電泳緩沖液為0.5x TBE，轉(zhuǎn)換時間(switch time)1-12秒，角度為120度，電壓6V/cm，溫度14C，電泳時間16小時。通過脈沖電泳分析，確定了由6個BAC克隆組成的覆蓋Xa4基因區(qū)段的重疊群長約500kb。
實施例三、精細(xì)定位Xa4基因為精確確定Xa4基因的位置，我們采用和Xa4緊密連鎖的標(biāo)記篩選由642個純合感病F2單株組成的群體尋找重組單株，該群體的所有單株的平均病斑長度都大于15cm。首先，我們采用兩個SSR標(biāo)記-RM224和RM144篩選，RM144距RFLP標(biāo)記RZ5362.4cM，靠近基因的一側(cè)(Temnykh等，Thero Appl Genet，2000，100697-712)。用位于Xa4基因一側(cè)的分子標(biāo)記RM224從F2感病群體中篩選到3個重組單株(108，21 and 5-13)，用位于基因另一側(cè)的分子標(biāo)記RM144從F2感病群體中也篩選到3個重組單株(10-11，16-5 and 4-17)。進(jìn)一步以靠近基因的RFLP標(biāo)記篩選這些單株，在RM224一端，用標(biāo)記R1506檢測到2個重組單株。在RM144一端，用標(biāo)記L190檢測到2個重組單株，而標(biāo)記S12886沒有檢測到重組事件(表2)。在255株的隨機(jī)F2群體中，我們發(fā)現(xiàn)一個抗性重組單株(39)，該單株在RM224一側(cè)表現(xiàn)為雜合帶型，在RM144一側(cè)表現(xiàn)出純和的感病親本帶型，說明在抗病基因和RM144之間有一個重組事件發(fā)生。分子標(biāo)記S12886在該單株中也檢測到這一重組事件。這意味著該重組發(fā)生在S12886和抗病基因之間。
表2.Xa4基因附近的分子標(biāo)記在7個F2重組單株中的基因型F2單株a分子標(biāo)記108215-133910-1116-54-17RM224 H H H H SS SR1506 S H H H SS SX4-88 S S H H SSSub11 S S S H SS S2/15B-29S S S H SS SM196-1 S S S S SSS12886 S S S S SS SL190S S S S HH SRM144 S S S S HH HaS，代表IR24的純合基因型；H，代表兩個親本的雜合基因型；39是抗病單株，其它是感病單株。
為更精確的確定基因的位置，我們用RFLP標(biāo)記Y6855RA和來自BAC克隆3H8的一個亞克隆M196-1作探針，在39號抗性單株中也檢測到重組事件(表2)。這樣，就將Xa4基因定位在BAC克隆3H8上(圖5)。采用其它的幾個來自BAC克隆3H8的亞克隆(X4-88，Sub11和2/15B-29)尋找分子標(biāo)記和抗病基因間的重組事件。在RM224一側(cè)，X4-88和抗病基因間只剩下一個重組單株，而Sub11和2/15B-29與抗病基因Xa4共分離。基于上述分析結(jié)果，我們將Xa4基因定位在M196-1和X4-88之間(圖5)。
為確?？共』蚨ㄎ坏臏?zhǔn)確性，我們對表2中所列的6個感病的重組單株和1個抗病的重組單株進(jìn)一步進(jìn)行了F3家系的接種鑒定。如果這些感病的重組單株F3家系內(nèi)發(fā)生抗性的分離或抗病的重組單株沒有發(fā)生抗性分離，說明這些單株屬于假的重組單株，從而基因定位的位置也會隨之發(fā)生變化。反之，說明基因的定位是正確的。結(jié)果表明對應(yīng)于6個感病的重組單株的F3家系內(nèi)各個單株都表現(xiàn)為感病，沒有發(fā)生抗性的分離(表3)，而重組的分子標(biāo)記位點發(fā)生了分離(RM224或RM144)。39號抗性重組單株的F3家系內(nèi)表現(xiàn)出抗性分離(表3)，RM224位點發(fā)生了分離而RM144位點沒有發(fā)生分離。這些結(jié)果證明Xa4的遺傳定位是正確的。
表3. 7個F2重組單株的F3植株接種白葉枯病菌PXO61后的病斑長度aF2重組單株F3植株21 5-13108 39 10-1116-54-17123.528.830.58.128.8 24.423.9224.624.323.816.9 21.9 24.918.7324.725.027.211.2 24.4 24.121.5422.822.827.07.126.1 24.120.9523.824.625.17.022.0 18.023.8622.524.426.111.4 22.3 23.625.1726.826.926.824.1 19.2 25.621.2822.526.120.410.7 28.1 22.523.7923.422.727.28.822.7 24.510 27.623.731.210.0 22.3 22.311 25.823.728.15.323.8 22.712 27.725.924.69.213 26.323.924.819.314 25.825.57.715 22.316.516 9.0
17 9.818 18.019 12.520 10.4aF2群體的親本IRBB4和IR24的病斑長度分別是5.1cm和27cm。
實施例四測序分析覆蓋Xa4基因位點的BAC克隆和確定Xa4的等位基因1.BAC克隆3H8的Shotgun文庫的構(gòu)建采用超聲波法(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press)構(gòu)建Shotgun文庫。用超聲波處理明恢63 BAC克隆3H8的環(huán)形質(zhì)粒，通過1％瓊脂糖凝膠電泳分離出1.5-2.5kb的DNA片段，純化后用T4-DNA聚合酶補(bǔ)平末端，與Sma I酶切的去磷酸化的pUC18載體平端連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。提取陽性克隆質(zhì)粒，并與空pUC18質(zhì)粒進(jìn)行電泳比較，剔除假陽性克隆及小片段克隆，或用BamHI和EcoRI雙酶切，檢測插入片段大小。
2.隨機(jī)亞克隆片段的測序采用M13-R和M13-F引物、美國Perkin Elmer公司的測序試劑盒(Big Dye Kit)、以雙脫氧核苷酸末端終止法分別從每個亞克隆的兩端測序。測序儀為Perkin Elmer公司的ABI377 Sequencer。
3.原始序列的拼接使用Sequencher 4.1軟件(美國Gene Codes Corporation)拼接序列。用Sequencher 4.1軟件自動去除末端測序較差的序列和pUC18載體序列；用Sequencher 4.1軟件沒有去除干凈的序列則用手工刪除。BAC載體pBeloBAC11的碎片序列和污染的細(xì)菌DNA序列則通過和BAC序列進(jìn)行比較或BLAST分析的方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)加以去除。用Sequencher 4.1軟件對兩條序列進(jìn)行拼接的參數(shù)是重疊序列長度(Mini Overlap)大于20bp(base pair)，重疊序列的一致性(Mini Match)大于85％。每一個堿基的確定都要參照重疊在該位點的多個Shotgun片段序列。對于由一個Shotgun片段序列所覆蓋的區(qū)域要再次測序驗證，以確保堿基的準(zhǔn)確性。而由一個亞克隆覆蓋的斷口處，則對該克隆進(jìn)行長序列膠測序或用primer walking的方法，填補(bǔ)缺口。
4.BAC克隆的序列分析首先用Blastn和Blastx方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)分析所得序列。然后采用GenScan(htto//genes.mit.edu/GENSCAN.html)和Fgenesh(http//www.softberry.com/)軟件分析預(yù)測基因結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果進(jìn)一步用Blastp方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)進(jìn)行確證。兩條或多條核苷酸或氨基酸序列的比較分析使用BLAST 2 sequence方法(Tatiana等，1999，F(xiàn)EMS MicrobiolLett.174247-250)和ClustalW方法(http//www.ebi.ac.uk)。
5.Xa4等位基因的確定在確定BAC克隆3H8包含Xa4基因位點后，測定整個3H8的序列，對序列拼接形成兩個大的序列片段，一個片段長36.4kb，另一個片段長30.4kb，二者之間有一個小于1kb的間隙(圖6)。3H8的亞克隆M196-1和X4-88分別處在這兩個片段上。序列分析發(fā)現(xiàn)在36.4kb的片段上有3個區(qū)段編碼LRR-蛋白激酶類蛋白，它們被分別稱之為RKa、RKb和RKc(圖6)。用GenScan、Fgenesh和Blastx分析表明，RKa、RKb和RKc是3個完整的基因。RKa和RKb的轉(zhuǎn)錄方向相同，而RKc的轉(zhuǎn)錄方向相反。其中RKa的編碼產(chǎn)物與抗白葉枯病基因Xa26(t)和Xa21編碼的產(chǎn)物同源性較高。采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)方法分析(具體操作方法見實施例七)，在IRBB4中檢測到與明恢63 RKa和RKb同源的基因的表達(dá)，沒有檢測到與RKc同源的基因的表達(dá)。在RKa基因的前面，還有一個和蛋白激酶同源的序列(Kinase)(圖6)，序列分析表明它不是一個完整的基因；用RT-PCR分析也沒有檢測到這段序列在IRBB4中表達(dá)。這一結(jié)果意味著Xa4基因很可能也編碼一個LRR-蛋白激酶類蛋白質(zhì)。根據(jù)GenScan、Fgenesh和Blastx分析結(jié)果，在長30.4 kb的序列中存在一個僅編碼LRR結(jié)構(gòu)域的基因和一個與細(xì)胞壁結(jié)合的受體激酶同源程度很高的基因(WAK)(圖6)。用RT-PCR方法分析，沒有檢測到這兩個基因在IRBB4中表達(dá)。
用BAC克隆3H8的亞克隆進(jìn)一步分析表2所列、在Xa4基因區(qū)段發(fā)生重組的F2單株。亞克隆2/15B-29是RKa基因的一部分，它和IRBB4中的抗病基因共分離；亞克隆M196-1是RKb基因的一部分，它檢測到一個重組交換單株(表2和圖6)。以上結(jié)果表明，明恢63的RKa基因標(biāo)記和Xa4基因共分離，由此推測水稻品種明恢63中的RKa基因可能是Xa4的等位基因。
實施例五Xa4基因的分離克隆1.從水稻抗白葉枯病近等基因系IRBB4中分離克隆Xa4的候選基因抗譜分析表明水稻品種明恢63不攜帶Xa4基因(Chen等，2002，Phytopathology92750-754)。而上述結(jié)果表明水稻品種明恢63中的RKa基因可能是Xa4的等位基因。在沒有建立IRBB4基因組文庫的情況下，如何通過已知的明恢63的序列盡快在IRBB4中獲得RKa的等位基因是本發(fā)明的關(guān)鍵。若通過明恢63的序列設(shè)計引物直接擴(kuò)增，由擴(kuò)增帶來的突變無法檢測和排除，且長片段的擴(kuò)增也比較困難。因此，此法不是最佳方案。對已知的明恢63序列進(jìn)行酶切分析，發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶Spe I能夠切下一個19.4kb、帶有完整Rka基因的片段。用此酶對IRBB4的總DNA進(jìn)行酶切分析，有一個大約12kb的片段能夠和RKa基因探針雜交。pCLD04541載體多克隆位點上存在Spe I位點，且該載體比較容易裝入大的片段。因此，本發(fā)明采用圖7所示方案從IRBB4中分離與Rka基因同源的DNA片段。
采用RKa1L和RKa1R引物對(表4)，將每5個含有IRBB4 DNA片段的細(xì)菌克隆混合在一起，直接用細(xì)菌混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選。大約能夠在2000-3000個細(xì)菌克隆中篩選到1個陽性克隆。將所篩選到的陽性克隆進(jìn)行酶切檢測，以及用RKaL和RKaR引物對、RKa2L-RKa2R引物對(表4)擴(kuò)增檢測。用限制性內(nèi)切酶將陽性克隆上的插入片段從pCLD04541載體上切下，連接到Xba I酶切的pUC18載體上，然后進(jìn)行測序分析(測序方法同實施例四)。用GenScan、Fgenesh和Blastx分析顯示，從IRBB4中獲得的DNA片段含有一個完整的、與明恢63中的Rka基因同源的基因(圖8)，即Xa4的候選基因。
表4.用于PCR、RT-PCR和RACE分析的引物引物名稱 引物序列(5’-3’)RKd-F(Kinase) CGCATGTGTCAGACTTTGGTRKd-R(Kinase) GCAGGAAATGCCTGAAGAACLRR f-1 GCAAAGCACCCTCGAAIAAGLRR-r TTCTCCATTGATGCCAACAAWAK-kinase1F TAGGAGCACAACCCCAAAACWAK-kinase1R ATAGGGTGCTGCATGGAAACRKaL CTGGCTCTGTCCCATCAAATRKaR GCTGAAAGCAAAAGCTCCAARKa1L GGTTAGTCACAAGTGGGAAAGGRKa1R AAGATGAAATATGCTCGGTGGTRKa2L CTGCATGGTCAGAIACCAAAAGRKa22RTACGGGATCATGCTACTCGARKa11LTTGGCTTGAACGGCTTAACTRKa11RGTTAAGCCGTTCAAGCCAAGRKa111R GTGGAGAAGCAGCACTCACARKbL GGCTTGCAAACTTTGGACATRKbR GCTTCCCTTGTTCTGAGTGCRKb2R CAGTCCACCACATGGACAAGRKb/3’race-2 TGGTCAAATACCGGAAGGAGRKbL/3’race-1CCATCCCAAACTACTTGGCTAadaptor CTGATCTAGAGGTACCGGATCCOligo-dT17-adaptorCTGATCTAGAGGTACCGGATCC(T)17RKcL TGTTTCGAGTGGCATACAGC
RKcR ATGAGCCGAGCAATGATACCRace ATCAACCGGCARKb/5’-race-A1 GCGTGTCCATACCTCCAAGTRKb/5'-race-A2CCAATCTTGATGCCATCTCCRKb/5'-race-S1CGTAGAACTGGGAGGCTGAARKb/5’-race-S2 CCGCCCCAGTTAAGTTATTG2.從水稻品種特青中分離克隆Xa4的候選基因Li等(1999，Mol.Gen.Genet.26158-63)認(rèn)為水稻品種特青攜帶Xa4基因。本發(fā)明中的接種鑒定也進(jìn)一步顯示特青對所接種的幾個白葉枯病菌生理小種的抗譜與IRBB4表現(xiàn)相同。用明恢63的RKa基因片段作探針，從用特青構(gòu)建的BAC文庫(Zhang等，1996，Mol.Breed.211-24)中篩選到兩個BAC克隆，分別為25P4和26N11。用限制性內(nèi)切酶Spe I對這兩個BAC克隆進(jìn)行消化、電泳、轉(zhuǎn)移至尼龍膜，用RKa基因片段作探針與尼龍膜雜交，檢測到一條約12kb的雜交帶?？寺∵@個12kb的DNA片段，然后測序。將特青中的12kb DNA序列與IRBB4的12kb序列比較分析，在Xa4的候選基因的編碼區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)核苷酸的差異；在Xa4的候選基因之前的非編碼區(qū)和位于Xa4的候選基因前面的一個預(yù)測基因(RKd2)的外顯子上各存在一個核苷酸的差異(圖9)。這一結(jié)果說明特青中的抗病候選基因和IRBB4中的抗病候選基因的序列完全相同。
3.序列分析特青BAC克隆26N11中的抗病基因家族的結(jié)構(gòu)特青BAC克隆26N11包含與明恢63中的RKa基因同源的序列。對整個BAC克隆26N11進(jìn)行測序和序列拼接(操作方法同實施例四)，形成幾個大的重疊群(contig)。BLAST分析顯示，其中3個緊鄰的重疊群包含抗病基因同源序列。這3個重疊群分別為TQ/contig A(33.1kb)、TQ/Contig B(25.5kb)和TQ/Contig C(31.3kb)(圖10)。TQ/Contig B和TQ/contig C之間存在一個小于2kb的序列間隙，TQ/contig A和TQ/Contig B之間的序列間隙包含兩個約2-3kb大小的重迭群。本發(fā)明主要對這3個大的重疊群的序列進(jìn)行了分析。
用GenScan、Fgenesh和Blastx分析顯示，TQ/contig A包含兩個完整的編碼LRR-蛋白激酶類蛋白的基因(圖10)，其序列分別對應(yīng)于明恢63中的RKa和RKb基因；這兩個基因分別被命名為TQ/RKa和TQ/RKb。本實施例的第1和第2節(jié)中已說明TQ/RKa基因是Xa4的候選基因。在TQ/RKa基因的兩側(cè)各有兩個不完整的編碼LRR-蛋白激酶類蛋白的基因，分別被命名為RKd1、RKd2、RKe1和RKe2(圖10)。RKd1和RKe1編碼的氨基酸序列與LRR結(jié)構(gòu)域有同源性；RKd2和RKe2編碼的蛋白和受體激酶的激酶區(qū)同源性很高。根據(jù)目前的分析結(jié)果，不能排除RKd1和RKd2是一個基因的可能性，但即使確定它們是一個基因，這一基因仍然不完整；RKe1和RKe2可能是同一個基因，但尚需進(jìn)一步分析。
序列分析顯示TQ/contig B上有兩個基因(圖10)，其中RKf編碼LRR-蛋白激酶類蛋白，但基因結(jié)構(gòu)不完整。另有一個基因(Pol)與copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的Pol基因(GenBank注冊號AC091665)同源性很高(Score＝139，E value＝1e-55)。
BLAST分析顯示TQ/contig C上的TQ/RKc基因?qū)?yīng)于明恢63中的RKc基因(圖10)。這個重疊群上的另外一個基因RKg和LRR-蛋白激酶類基因相似，但是基因結(jié)構(gòu)不完整。TQ/contig C上的第三個基因是RKh，它僅編碼LRR-蛋白激酶類蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域部分，其結(jié)構(gòu)不完整。
綜合上述分析，可以將特青BAC克隆26N11上包括的LRR-蛋白激酶類基因根據(jù)其編碼產(chǎn)物的完整性分為兩類第一類包括三個基因，即TQ/RKa、TQ/RKb和TQ/RKc，它們是結(jié)構(gòu)完整的基因；第二類基因包括RKd1、RKd2、RKe1、RKe2、RKf、RKg和RKh，它們的結(jié)構(gòu)都不完整，基因內(nèi)有缺失，是假基因。以上各基因可能編碼的氨基酸序列的比較見圖11。序列比較分析顯示特青中的TQ/RKa、TQ/RKb和TQ/RKc基因分別是明恢63中的RKa、RKb和RKc基因的同源基因。對Xa4基因的遺傳分析提示明恢63中的RKb和RKc都不是Xa4的等位基因，而RKa是Xa4的等位基因(圖5和圖6)。因此，對特青BAC克隆26N11進(jìn)行測序分析更進(jìn)一步確認(rèn)特青中的TQ/RKa和IRBB4中與TQ/RKa序列完全相同的基因就是Xa4基因。
4.包含Xa4基因家族的染色體區(qū)段的序列與水稻品種93-11序列的比較分別用明恢63 BAC克隆3H8和特青BAC克隆26N11的DNA序列檢索已公布的水稻品種93-11基因組框架圖序列(http//btn.genomics.org.cn/rice)，然后用Sequencer軟件、ClustalW和Blast 2 sequence分析方法分別比較3H8序列和與3H8同源的93-11序列，以及26N11序列和與26N11同源的93-11序列。分析結(jié)果顯示93-11的序列與特青26N11的序列同源性很高，而與明恢63 3H8的序列差異很大。圖12顯示檢索到的與特青26N11同源的93-11的序列和特青序列的重疊關(guān)系。93-11的序列和特青中對應(yīng)的序列同源性很高，在大部分區(qū)段只表現(xiàn)為個別堿基的差異。但是在特青的TQ/RKa基因和RKe1基因之間，93-11的同源序列中存在512bp的缺失。將特青中的TQ/RKa、TQ/RKb和TQ/RKc基因的序列與93-11中分別與它們同源的序列9311/RKa、9311/RKb和9311/RKc比較，發(fā)現(xiàn)QT/RKa與9322/RKa完全相同，TQ/RKc與9311/RKc之間有小的差異，而TQ/RKb與9311/RKb差異很大。9311/RKb內(nèi)存在較多的終止密碼子。
比較分析IRBB4和93-11對不同白葉枯病菌生理小種的抗性，發(fā)現(xiàn)它們的抗譜完全相同(表5)。綜合以上分析，說明IRBB4中的Xa4基因的候選基因(即明恢63中的RKa基因的等位基因)、特青中的TQ/RKa基因和93-11中的9311/RKa基因序列完全相同，它們是同一個基因，即Xa4基因。
表5.水稻品種IRBB4和93-11對不同白葉枯病菌生理小種抗性(病斑長度，cm)的比較(2002年)

實施例六Xa4基因突變體的分析對Xa4基因進(jìn)行遺傳定位分析過程中，在F2群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個奇怪單株(1-22)。這個單株在抗病基因兩側(cè)的標(biāo)記如RM224、R1506、L190和RM144位點處都是雜合帶型，而該植株表現(xiàn)型卻是感病，似乎在抗病基因的兩側(cè)都發(fā)生了交換(表6)。但這種情況發(fā)生的幾率很低，為了排除田間調(diào)查出錯的可能性，進(jìn)一步對F3家系進(jìn)行了分析，結(jié)果見表7。表7所示F3家系的各個單株，不論RM224標(biāo)記所示的基因型是什么，皆表現(xiàn)為感病。這些結(jié)果排除了田間調(diào)查出錯的可能性。
表6.突變感病單株1-22在Xa4基因區(qū)段的基因型分子標(biāo)記基因型RM224 雜合R1506 雜合X4-88 感病親本(IR24)的帶型RKd1缺失RKa 缺失RKb 兩個親本的帶型(無差異)M196-1 含親本不存在的異常帶型RKc 含親本不存在的異常帶型S12886 含親本不存在的異常帶型L190雜合RM144 雜合表7.突變單株1-22后代(F3)單株的表型和基因型RM224a病斑長度(cm)
1R 24.02R 27.03H 22.34R 24.2突 5H 22.8變 6H 26.0株 7H 25.7后 8R 26.5代 9R 24.4單 10 R 23.1株 11 H 24.812 R 28.3IR24 S 27.1IRBB4R 5.1aS，感病親本(IR24)帶型；R，抗病親本(IRBB4)的帶型；H，雜合帶型.
進(jìn)一步對這個感病突變單株的位于抗病基因兩側(cè)的分子標(biāo)記進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RFLP標(biāo)記S12886和BAC克隆3H8的亞克隆M196-1位點處呈現(xiàn)異常帶型(既非感病親本也非抗病親本的帶型)，3H8的另一個亞克隆X4-88位點處為感病親本的帶型(表6)。用根據(jù)明恢63中的RKa、RKb和RKc基因序列設(shè)計的引物對這個突變株的F3代單株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用RKb基因的引物能夠擴(kuò)增出與這個突變株的兩個親本大小相同的產(chǎn)物；用RKc基因的引物擴(kuò)增，突變單株多出了一條擴(kuò)增產(chǎn)物；用3對RKa基因的引物(RKa11L和RKa1R、RKa2L和RKa2R、RKa2L和RKa22R)擴(kuò)增，除了在RM224位點表現(xiàn)為雜合帶型的F3家系第6號單株(表7)有擴(kuò)增產(chǎn)物外，其它F3單株都無擴(kuò)增產(chǎn)物(圖13)，說明RKa基因區(qū)段發(fā)生了缺失。同時缺失的還有RKd1(LRR)基因部分。這些結(jié)果表明，由抗病親本提供的配子發(fā)生了突變。這一結(jié)果從另一方面證明IRBB4中與明恢63 RKa等位的基因就是Xa4基因。
實施例七Xa4基因結(jié)構(gòu)分析
1.總RNA的抽提總RNA的抽提采用TRIzol Reagent(美國Invitrogen公司)。操作方法按公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行。
2.RT-PCR分析將接種白葉枯病菌生理小種PXO61的明恢63葉片和未接種白葉枯病菌的明恢63葉片用于RT-PCR分析。RT-PCR以兩步法進(jìn)行(Zhou等，2002，Science in China45449-467)。首先，將用于反轉(zhuǎn)錄的總RNA用無RNA酶活性的DNA酶I處理，去除總RNA中可能污染的DNA；將總RNA在65℃處理10分鐘，滅活DNA酶I；然后加入Oligo-dT15，將RNA在72℃變性5分鐘，再加入dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶等，在42℃反轉(zhuǎn)錄90分鐘。第二步，取1微升反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作PCR反應(yīng)。
PCR反應(yīng)引物對于WAK基因WAK-kinase1F和WAK-kinase1R(表4)對于LRR基因LRR f-1和LRR-r(表4)對于Kinase(Rkd)基因RKdL和RkdR(表4)對于IRBB4和特青中的Xa4基因RKaL和RkaR，RKa2L和RKa22R(表4)對于特青中的TQ/RKb基因RKbL和RKbR，RKb2R和RKb/3’race-2(表4)對于特青中的TQ/RKc基因RKcL和RKcR(表4)3.基因末端序列分析采用大連TaKaRa公司的5’Full RACE Core Set試劑盒和3’RACE Core Set試劑盒，通過5’-RACE(rapid amplification of cDNA end)和3’-RACE分析方法，確定Xa4基因的5’和3’末端序列。
進(jìn)行3’-RACE的反轉(zhuǎn)錄和做RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄條件一樣，只是用Oligo-dT17-adaptor代替Oligo-dT15。反轉(zhuǎn)錄完成后，進(jìn)行兩輪擴(kuò)增。第一輪擴(kuò)增引物是RKbL/3'race-1和adaptor；第二輪擴(kuò)增引物是RKb/3’race-2和adaptor。然后通過電泳回收目標(biāo)大小的片段，用pGEM-T Vector System I試劑盒(美國Promega Corporation)對回收片段進(jìn)行克隆。最后對克隆進(jìn)行測序分析。
采用SuperscriptTMII反轉(zhuǎn)錄酶(美國Life Technologies公司)進(jìn)行5’-RACE的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；用于反轉(zhuǎn)錄的特異性引物Race(表4)的磷酸化采用T4 polynucleotide kinase(美國MBI Fermentas公司)，反應(yīng)按試劑說明書進(jìn)行。磷酸化后的引物用10mol/LNH4AC-乙醇沉淀，純化。以后的操作按TaKaRa公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行。進(jìn)行5’-RACE第一輪擴(kuò)增的引物是RKaL和RKa11R；第二輪擴(kuò)增引物是RKaL和RKa111R。
4.基因內(nèi)含子的確定采用GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)軟件對包含Xa4基因區(qū)段的基因組DNA的分析發(fā)現(xiàn)在編碼激酶結(jié)構(gòu)域的區(qū)段存在一個內(nèi)含子，采用跨越該區(qū)段的引物RKa2L和RKa22R擴(kuò)增基因組DNA和RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，RT-PCR產(chǎn)物比從基因組中擴(kuò)增出的產(chǎn)物小，這說明該區(qū)段確實存在一個內(nèi)含子(圖14)。將RT-PCR產(chǎn)物克隆、測序、與基因組DNA比較，確定內(nèi)含子長96bp以及該內(nèi)含子的剪切位點(圖15)。采用Xa4基因區(qū)段的其它引物進(jìn)行RT-PCR、5’RACE和3’RACE分析，沒有再發(fā)現(xiàn)其它內(nèi)含子的存在。
5.基因結(jié)構(gòu)Xa4基因的5’端位于基因起始密碼子上游24bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的2389bp)處，3’端有兩個不同的末端，分別位于終止密碼子下游77bp(序列表SEQID NO1所示序列的5882bp)和216bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的6021bp)處。該基因由兩個外顯子和一個內(nèi)含子組成(圖9)。外顯子1長2911bp(序列表SEQ IDNO1所示序列的2413-5323bp)；外顯子2長386bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的5420-5805bp)；內(nèi)含子靠近基因的3’端，長96bp(序列表SEQ ID NO1所示序列的5324-5419bp)，位于編碼蛋白激酶的結(jié)構(gòu)域內(nèi)。Xa4基因的編碼區(qū)長3297bp，編碼1099個氨基酸。
實施例八Xa4基因的產(chǎn)物和特征根據(jù)Xa4基因的結(jié)構(gòu)特征和對該基因表達(dá)序列的分析，以及結(jié)合BLAST分析，可以確定這個基因編碼一種受體激酶類膜蛋白質(zhì)(圖1)。這個膜蛋白質(zhì)的胞外的結(jié)構(gòu)域由26個LRR組成，其保守結(jié)構(gòu)特征為L/I/VXXL/MXXLXXL/I/VXL/VXXNXL/FXGXI/L/VPXX(其中X代表任意氨基酸殘基)。該保守結(jié)構(gòu)特征與已知的LRR-蛋白激酶類蛋白質(zhì)的LRR結(jié)構(gòu)基本相同(Torii和Clark，2000，InKeris M，Walker J C and Callow J A.Plant Protein Kinases，Advances in BotanicalResearch.Academics Press)。與上述LRR的保守結(jié)構(gòu)特征相比，在Xa4基因編碼的26個LRR中，第1個LRR不完整，第6和11個LRR中間多一個氨基酸殘基，第8和第15個LRR分別在末端多出一個和兩個氨基酸殘基。
LRR區(qū)和信號肽中間的一段序列存在一個保守的CX6C(X代表任意氨基酸殘基)結(jié)構(gòu)(圖1)。CX6C結(jié)構(gòu)可能是受體激酶類蛋白組成二聚體的時候形成二硫鍵的位點(Torii and Clark，2000)。在LRR區(qū)之后，有一段33個氨基酸的序列，它和LRR的保守結(jié)構(gòu)同源性較差。
Xa4基因編碼的受體激酶另一個主要結(jié)構(gòu)是蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(圖1)。其中的DLKPSN和GTVGYMAPE序列分別與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶VIb區(qū)和VII區(qū)的保守性標(biāo)志序列-DLKPEN和G(T/S)XX(Y/F)IAPE(X代表任意氨基酸)很相似，與已知受體激酶的保守的亞結(jié)構(gòu)域序列相同(VIb-DφKXSN和VIII-GTXGYφAPE，其中φ代表脂肪側(cè)鏈氨基酸，X代表任意氨基酸)。
術(shù)語定義本說明書、權(quán)利要求書和其它有關(guān)該專利申請文字材料中使用的術(shù)語的定義如下術(shù)語“植物”包括整個植株、植物的組織(如葉、莖、根等)、植物種子、細(xì)胞和其后代。本文中的植物主要是指可以用于轉(zhuǎn)化的高等植物，包括單子葉植物和雙子葉植物。
“抗病基因”是指編碼能夠在植物細(xì)胞或植物組織中激發(fā)防衛(wèi)反應(yīng)的多肽的基因。抗病的植物表現(xiàn)出較短或很短的菌斑，感病的植物菌斑很長。
“防衛(wèi)反應(yīng)”是由寄主(如植物)產(chǎn)生的特異性、抵抗侵染因子或病原體存在的防衛(wèi)反應(yīng)。
“分離的核酸片段”是單鏈或雙鏈的RNA或DNA聚合物，包括含有合成的、非天然的或改變的核苷酸。DNA聚合物形式的分離核酸片段可以包含一個或多個cDNA、基因組DNA或合成DNA區(qū)段。
“功能等同的亞片段”是指分離的核酸片段的一部分或亞序列，其中無論這些片段或亞序列是否編碼活性酶，都保留改變基因表達(dá)或產(chǎn)生一定表型的能力。如所述片段可用于嵌合基因的設(shè)計或反義抑制等。
“基因”是指表達(dá)特定蛋白的核酸片段，包括所述編碼序列之前(5’非編碼序列)和之后(3’非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。“天然基因”是指同自然界中發(fā)現(xiàn)的一樣具有其自身調(diào)節(jié)序列的基因。“嵌合基因”是指非天然基因的任何基因，包括在自然界中未發(fā)現(xiàn)在一起的調(diào)節(jié)序列和編碼序列組成的基因。因此，嵌合基因可以包括得自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或得自同一來源、但排列方式不同于天然形式的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。“內(nèi)源基因”是指在生物體的基因組中于天然位置的天然基因?！巴庠椿颉笔侵覆皇窃谒黾闹魃矬w中發(fā)現(xiàn)的、而是通過基因轉(zhuǎn)移被引入所述寄主生物體中的基因。外源基因可以包括插入非天然生物體中的天然基因或嵌合基因?！稗D(zhuǎn)基因”是已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化程序被引入基因組中的基因。
“編碼序列”是指編碼特定氨基酸序列的DNA序列?！罢{(diào)節(jié)序列”是指位于編碼序列上游(5’非編碼序列)、之中或下游(3’非編碼序列)影響所連接的編碼序列轉(zhuǎn)錄、RNA加工、穩(wěn)定性或翻譯的核苷酸序列。這種序列可以是天然的或是非天然的。調(diào)節(jié)序列可以包括但不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和聚腺苷酸化識別序列。
“病原體”是指其侵染到活植物組織的細(xì)胞周圍或細(xì)胞中激發(fā)病害反應(yīng)的生物或侵染性因子。
“啟動子”是指能夠控制編碼序列或功能RNA表達(dá)的DNA序列。啟動子序列包括鄰近的上游元件和更遠(yuǎn)的上游元件，后者通常被稱作“增強(qiáng)子”。因為增強(qiáng)子是刺激啟動子活性的DNA序列，可以是所述啟動子的固有元件，或是插入的以提高啟動子水平或組織特異性的異源元件。啟動子可以全部衍生自天然基因，或可以由衍生自自然界中發(fā)現(xiàn)的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包括合成的DNA區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，不同的啟動子可能指導(dǎo)基因在不同組織或不同細(xì)胞類型中表達(dá)，或指導(dǎo)基因在不同發(fā)育階段表達(dá)，或?qū)Σ煌h(huán)境條件應(yīng)答而指導(dǎo)基因表達(dá)。引起基因在大多數(shù)時間、大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動子通常被稱為“組成型啟動子”。另外，由于在大多數(shù)情況下尚未完全確定調(diào)節(jié)序列的實際邊界，因此某些變異的DNA片段可以具有相同的啟動子活性。
“內(nèi)含子”是基因中不編碼蛋白質(zhì)序列的間插序列。雖然這種序列被轉(zhuǎn)錄成RNA，但隨后被剪切去掉。該術(shù)語也用于被切下的RNA序列?！巴怙@子”是基因中被轉(zhuǎn)錄且存在于成熟的信使RNA中的序列，但不必是編碼最終基因產(chǎn)物的序列的一部分。
“3’非編碼序列”是指位于編碼序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化識別序列和編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號的其它序列。通常，聚腺苷酸化信號的特征在于影響聚腺苷酸序列段添加至mRNA前體3’端。Ingelbrech等，1989，Plant Cell1671-680例舉了不同3’非編碼序列的應(yīng)用。
本文中的“表達(dá)”是指功能性終產(chǎn)物的產(chǎn)生?；虻谋磉_(dá)或過量表達(dá)涉及該基因的轉(zhuǎn)錄和所述mRNA翻譯成前體蛋白或成熟蛋白。
“轉(zhuǎn)化”是指將核酸片段轉(zhuǎn)移到寄主生物體的基因組中，并形成穩(wěn)定的遺傳。帶有所述轉(zhuǎn)化核酸片段的寄主生物體被稱為“轉(zhuǎn)基因”生物。水稻、玉米和其它單子葉植物的優(yōu)選細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法是應(yīng)用加速粒子或“基因槍”轉(zhuǎn)化技術(shù)(Klein等，1987，Nature32770-73；美國專利第4,945,050號)，或采用合適的含所述轉(zhuǎn)基因的Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法(Ishida等，1996，Nature Biotech.14745-750)。
“表達(dá)構(gòu)件”是指所分離的核酸片段單獨使用，或與載體和其它的亞片段結(jié)合使用所形成的新的核酸片段。如果使用載體，載體的選擇決定于將來轉(zhuǎn)化寄主植物的方法?！氨磉_(dá)構(gòu)件”和“重組表達(dá)構(gòu)件”在本文中通用。
“PCR”’或“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”是用于合成大量特定DNA區(qū)段的技術(shù)，由一系列重復(fù)的循環(huán)組成(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，CT)。通常由連續(xù)的三個步驟構(gòu)成一個循環(huán)將雙鏈DNA于高溫(如95℃)下變性，將兩種與靶區(qū)段的3’邊界互補(bǔ)的引物于低溫(如55℃)下退火然后在中溫(如72℃)下延伸。
水稻抗白葉枯病基因Xa4Organization Applicant----------------------Street獅子山街City武漢State湖北省Country中國PostalCode430070PhoneNumber027-87282038FaxNumber027-87397735EmailAddresszhanghb@mail.hzau.edu.cn<110>OrganizationName華中農(nóng)業(yè)大學(xué)Application Project-------------------<120>Title水稻抗白葉枯病基因Xa4<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate2002-11-11Sequence--------<213>OrganismName水稻(Oryza sativa)<400>PreSequenceString1gcgggctggc gcccggctag cggtccaaac ggcgacagga gggaggggag atgacgccgg 60cgggaggaaa agggagaaaa ggagggagag aaaggggttt gcccctttgc cgatttggga 120aaaaggagga ggggagcggg gcggtttgac agagggagtg gagggctcgg cctccgcctc 180ttggcagctt gcgcgcagag tggcggggtc gggcggtgac gacggcgagt ggattggagc 240ggagcggcga caccggtgac aggcgagcgc agaggctgac ggcggcgttg atcgggcggt 300cggccactcg gctcgcgcgc ggctggcaac gggcggcgtc cgcgcgggcg cgcacacgct 360ggcccgcggg gccgactggt tgcgcggcag caggcgacgc ggctcgggcg ggaaaccact 420cgggcgcggc ggctcacgcg cacgcgcgcg tggcgcgcgg gccgggcgga gaaggagcgg 480agatggagga gggggtgctc gttgcgcggc tctcgcgcgc gcgaggcggt cagggctgag 540cggggggggg gaagaaggcg ctcggggcgg cgcgcgagcg gcgcgcgggc gaggctgtgc 600gggggggggg ggaaagagac gccgtgggag agagagaggg agagagagag agagagcact 660cgggagaggg agagagggag atgggaaaaa gagagatggg ccgagcgaga ttcggcccat 720cgacctcggg gaggcaaaat agacttttgc ggaggaattg atttggaagg atttggattc 780ggaattgaac tcgacgatag atcggggatt gagatcatga gatggcacgg acactagaca 840acaatcaaag aaacaaattt cgcaattagg gtttttcgga gataaatttt cccgctaggc 900gccacgacgg aacgggcgct acacaatgga atacctgcac catgagcact gcgaagtggt 960tctgcactgt gatttgaagc ctagcaacgt gctatttgat gatgacatga cggcgcatgt1020gtcagacttt ggtattgcaa ggctgctgtt aggtgatgat agctccatga tttctgctag1080catgccagga acagtcaggt acatggcacc aggtaagcta gtatcatctg ttttgctgaa1140tccttgctga tcttttatag agtaattatc aagtggtgca actaatgttt ggtgatcatt1200ttttcttgag cagagtatgg cgcccttggt aaagcatcac ggaagagcga tgtattcagc1260tatgggatca tgttgcttga agtgttcact gcgaagagac caacagatgc tatgtttgtg1320ggagaactaa acatcaggca gtgggttctt caggcatttc ctgcaaacct tgtccatgtc1380atagatggcc aacttgtaca ggacagctct tcttctacca gtagcattga cggctttctt1440atgccagtgt ttgaattggg cttgctctgc tcgtctgact cgccagagca aagaatggtg1500atgagtgatg ttgttgtgac gttgaagaag attaggaagg agtacgtcaa gtcgatagca1560
水稻抗白葉枯病基因Xa4actatgggaa gagatgagaa ccgaacagca gtgttccatt gaccctgcct gactgcatat1620acgaaagaac gaatcatcct ctgcacccat atttgcttct gcattaagaa taacagaata1680atagcatcag caacttgtcc aatgatcaat tactctttac ttctttatgt gtatggatga1740atatgaataa atctcttatg tttcttagct agttacacaa tatttaaatt gtgtacatgt1800atgattgatc tgctgcttca tggatttgca ccatgatatg gttgtaaatg atctgctatt1860aaaatatgct ttatgtccag gccaacataa gaaagaatat tctaacctag aaaggaatga1920agtttgggtg taaacattca agataagaca tggacttcac tggttgcctg acaggccagc1980tctgcttata ggccgcagga taattttcct catttctttt ttttttttta caatttgcaa2040aatctttgat ttataaaatt gtagtcatta tttagaacag gtcaatgata ccgaaattaa2100cgagtatgca acagtcaggg agataatctt ttctaagaat actgatagct atttgtcctg2160tatctatcaa ggtcttggtt agtcacaagt gggaaaggga aaaagttgca tgtgctcata2220tgcttttaga ctagggaagg aaaaatcatc atgcatgctt ggacagttgg acttgttcat2280gtcaggttga ccaatagtca acatcttaga tttagaaaga accagatgcc tgcatgcaca2340atggaatgga gagctaaata aattaacctc aagctgatta ttcctgccgt gccaatgcat2400aagagctcag acatggcgct tggattgcta gtatggatat acattgtgct gttgattgct2460ctgtccactg tgagtgctgc ttctccacca ggtccgagca agagcaacgg cagcgaaacc2520gaccttgctg cactgctggc tttcaaagcg cagctgagtg atcctctcag catccttggc2580agcaattgga cagtcggcac gccattctgc cgatgggtgg gtgtttcttg cagccaccac2640cagcagtgcg tcactgccct agatttgcgg gacactcctt tgctaggaga gctcagccct2700caactcggta acctctcttt cctctctatc ctcaacctca ccaacaccgg cctcacgggg2760tcactcccgg atgatatagg aaggcttcat cgcctcgaga tacttgagct tggctataac2820actctgtcag gtagaatccc agctaccata gggaacctca cgaggcttca agttcttgat2880ctccagttta acagtctatc tggtccaatc ccagcagatc tgcagaacct gcagaacctt2940agtagtatta atctccgtag gaactacctc attggcttga taccaaacaa tctattcaac3000aatacacatt tgctaactta tctcaacatt ggtaacaaca gcctgtccgg accaatacct3060ggttgcattg gctccttgcc aatactacag actctcgtcc tgcaagtcaa taatctcaca3120ggcccagttc caccagccat ctttaacatg tctacgctgc gtgctttagc tcttggcttg3180aacggcttaa ctggtcctct ccctggcaac gcaagtttca acctcccagc tctgcaatgg3240ttctccatca ctagaaatga tttcactggt ccaattccag tagggcttgc agcatgccag3300tacctccaag ttcttggcct gcctaataat ttattccaag gtgctttccc accatggctg3360ggcaaactga cgaatctcaa tatcgtctcc ttgggaggga atcaacttga tgctggtccg3420atccctgctg cacttggcaa cctcaccatg ctgagtgtcc tagatctcgc atcatgcaac3480ctaacaggac ccataccggc ggacattcga cacctaggcc aactttcaga gttgcatctt3540tcaatgaatc aactaacagg acccattcct gcttctattg gcaacctttc tgcattatca3600tacctgctat tgatgggaaa catgttggat ggattagtac cagcaacagt tggtaacatg3660aactcgctaa ggggattaaa tattgcggaa aaccacctac agggggatct tgaattcctt3720tctactgttt ccaactgtag aaagctctct ttccttcgag ttgactctaa ttatttcact3780ggaaacctcc cagactacgt aggtaacctg tcaagcacac tgcagtcatt tgttgtagct3840ggaaacaagt taggtggtga aattccgtct accatttcga atttaactgg cctcatggtg3900ctagcacttt cggataatca attccatagt acaataccag aatcaatcat ggaaatggtg3960aatctccggt ggcttgatct cagtggaaat agcctggctg gctctgtccc atcaaatgcc4020ggaatgctaa agaatgctga aaagctattc cttcaaagca acaaattatc tggctccata4080ccaaaggaca tgggcaacct caccaagtta gagcacctag tactatcaaa taaccaatta4140tcatcaactg taccaccgag catatttcat ctttctagcc ttatccagtt agacctatct4200cataactttt tcagtgatgt gttgccggtt gatataggca atatgaagca aattaacaac4260atagatctct ctaccaatcg ctttactggt agcatcccaa attcgattgg gcaacttcaa4320atgatatcct acttgaacct atctgttaat tcattcgatg attcaattcc agattctttt4380ggtgagctaa ctagcttgca gactttggat ctatcccata ataatatttc tggtaccatc4440cccaagtatc tagccaattt taccatactt attagcttga acttgtcttt caacaatctc4500
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權(quán)利要求
1.賦予植物Xa4基因介導(dǎo)的對白葉枯病菌抗性的DNA片段，其中所述的片段如序列表SEQID NO1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO1所示序列，或者與SEQ ID NO1所示序列的一部分功能等同的亞片段。
2.權(quán)利要求1的DNA片段，其核苷酸序列包含全長的Xa4基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)包含富含亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(LRR)和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列如附圖1所示。
3.包含與合適調(diào)節(jié)序列連接的權(quán)利要求1的基因編碼區(qū)DNA片段。
4.權(quán)利要求1中的DNA片段，其中的基因編碼區(qū)與其它的基因形成嵌合基因，或者其中的基因經(jīng)過修飾改造。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地涉及一種DNA片段的分離、克隆。所述的DNA片段能夠賦予植物抵抗由白葉枯病菌引起的病害。將該片段與其內(nèi)源調(diào)節(jié)序列直接轉(zhuǎn)入植物體，或者將該片段和合適的調(diào)節(jié)序列連接后轉(zhuǎn)入植物體，轉(zhuǎn)基因植物可以產(chǎn)生Xa4介導(dǎo)的對多種病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)。
文檔編號C07H21/04GK1498893SQ0213925
公開日2004年5月26日 申請日期2002年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月11日
發(fā)明者王石平, 孫新立, 曹應(yīng)龍, 張啟發(fā) 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)