專利名稱：新型過(guò)氧二烯縮醛糖苷類衍生物及其制法和其藥物組合物與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型過(guò)氧二烯縮醛糖苷類衍生物，其制備方法，含有它們的藥物組合物，及其作為藥物，尤其是抗病毒藥物的用途。
背景技術(shù)：
金銀花是忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的花蕾，為清熱解毒中藥，治療流行性感冒，大葉肺炎等，具有悠久臨床用藥歷史。
在現(xiàn)有的各種動(dòng)植物疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，病毒扮演著重要的角色。特別是隨著HIV病毒的出現(xiàn)，病毒越來(lái)越成為人類健康的重要威脅。其種類不斷的被發(fā)現(xiàn)，目前發(fā)現(xiàn)的病毒有DNA病毒有痘病毒、虹彩病毒、桿狀病毒、皰癥病毒、腺病毒、乳多空病毒、多DNA病毒、圓環(huán)病毒、細(xì)小病毒等。反轉(zhuǎn)錄病毒有DNA類的嗜肝病毒、RNA類的反轉(zhuǎn)錄病毒等。RNA病毒有呼腸孤病毒、雙RNA病毒、附粘病毒、彈狀病毒、絲狀病毒、正粘病毒、布尼病毒、嵌沙樣病毒、小RNA病毒、杯狀病毒、星狀病毒、諾達(dá)病毒、T4病毒、冠狀病毒、黃病毒、披膜病毒等。
針對(duì)病毒的增殖過(guò)程發(fā)展了各種抗病毒制劑。病毒呈嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生，其增殖明顯地依賴于宿主細(xì)胞的生物合成，抗病毒藥物應(yīng)該選擇性地破壞或抑制細(xì)胞內(nèi)(外)的病毒，而對(duì)細(xì)胞至少對(duì)未感染細(xì)胞不產(chǎn)生致死性損傷。理想的抗病毒藥物應(yīng)該既能作用于病毒增殖周期的某個(gè)或某幾個(gè)環(huán)節(jié)，予以干擾或阻斷，有不影響宿主細(xì)胞的正常代謝。在現(xiàn)有的抗病毒制劑中，能夠選擇性的抑制病毒的藥物并不太多。
在病毒接觸或侵入細(xì)胞時(shí)，需要病毒特異的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合。脫氧葡萄糖，海藻硫酸多糖干擾病毒對(duì)宿主靶細(xì)胞的吸附；金剛烷胺有抑制病毒脫殼的作用，但確切機(jī)制不明，推測(cè)可能作用于病毒受體，病毒與受體的結(jié)合起阻斷，滅活或負(fù)調(diào)節(jié)作用。
核酸合成物及其衍生物是一類深入研究的抗病毒抑制劑，這類物質(zhì)可被DNA和RNA聚合酶識(shí)別，參加核酸的生物合成，在DNA的復(fù)制和RNA的轉(zhuǎn)錄兩個(gè)環(huán)節(jié)中造成堿基的錯(cuò)誤配對(duì)，干擾核酸的正常結(jié)構(gòu)和功能。部分合成物可作為DNA和RNA合成鏈上的終止劑，抑制病毒合成核酸的合成。這樣的化合物有苯并咪唑、胍及其衍生物、5’-碘尿嘧啶、溴乙烯脫氧尿苷、三氟胸苷、阿糖腺苷、無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷、脫氧無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷、二羥丙氧甲基鳥(niǎo)苷、三氮唑核苷、疊氮胸苷、磷甲酸鹽、利福霉素等。
病毒mRNA的抑制過(guò)程需要通過(guò)細(xì)胞機(jī)構(gòu)才能完成，包括病毒mRNA與細(xì)胞的核糖體結(jié)合、細(xì)胞啟動(dòng)子的利用、氨基酸之間共價(jià)鍵的形成、肽鏈前體的加工及最后形成多肽等環(huán)節(jié)。因此大多數(shù)的蛋白抑制劑不能單獨(dú)抑制病毒的合成。此類藥有甲基靛紅-β-縮氨基硫脲、堿性蕊香紅。
某些病毒的囊膜蛋白是以前體的形式合成的，須經(jīng)過(guò)酶的剪切加工方可成為成熟蛋白，形成病毒囊膜。剪切蛋白前體的酶是高度特異的，據(jù)此進(jìn)行了設(shè)計(jì)，研究出了一些酶抑制劑。根據(jù)剪切蛋白的氨基酸序列制備的多肽同類物有抗病毒活性。
抗病毒治療隨著生物工程、DNA重組技術(shù)及蛋白質(zhì)工程的發(fā)展，開(kāi)拓了新的道路。此領(lǐng)域的成功主要有干擾素、反義RNA、合成多肽、抗病毒基因等運(yùn)用于抗病毒。
為了提高抗病毒藥物的治療效果現(xiàn)在運(yùn)用聯(lián)合用藥作用于病毒增殖的不同周期，產(chǎn)生協(xié)同抗病毒作用；制備脂質(zhì)體提高抗病毒藥物的生物利用度。
副粘病毒科的呼吸道合胞病毒可引起從感冒、急性上呼吸道感染到急性喉氣管炎、支氣管炎、毛細(xì)支氣管炎、肺炎等重癥下呼吸道感染，在人類呼吸道感染中占重要位置，可呈爆發(fā)，局部流行或廣泛流行，是人類的一種常見(jiàn)病和多發(fā)病。特別是對(duì)嬰幼兒危害較大，被認(rèn)為是嬰幼兒流行性毛細(xì)支氣管炎或流行性喘憋性肺炎的重要病原，也是引起嬰幼兒死亡的重要原因之一。尋找抗呼吸道合胞病毒藥物的研究工作一直在進(jìn)行。進(jìn)入臨床應(yīng)用的藥物只有病毒唑，可是由于其毒副作用較大又限制了其臨床應(yīng)用。研制開(kāi)發(fā)高效、低毒、價(jià)廉的抗呼吸道合胞病毒藥物仍然是目前國(guó)際上非常重要的研究課題。
正粘病毒科的流感病毒引起的急性上呼吸道傳染病，傳播迅速，易發(fā)生流行爆發(fā)，是人類迄今尚不能有效控制的世界性傳染病。流感流行時(shí)常伴有死亡率的升高，流感肺炎常是老年人和嬰幼兒的一個(gè)重要死因。目前FDA批準(zhǔn)用于治療流感的藥物只有金剛烷胺和金剛乙胺，但它們僅對(duì)甲型流感有效，對(duì)乙型流感無(wú)效，且一旦出現(xiàn)癥狀治療效果不佳，此外毒副作用較大，老年人不易耐受，易產(chǎn)生耐藥毒株等，使其應(yīng)用受限。廣譜抗病毒制劑病毒唑，由于其毒副作用較大，有致畸的可能，沒(méi)有被FDA批準(zhǔn)用于治療流感。因此，尋找藥效可靠、毒副作用小、抗病毒譜廣的抗流感藥物，也是目前國(guó)際上的重要研究課題。
雖然人類為治療的病毒性的疾病進(jìn)行了大量的研究工作，但到目前為止還沒(méi)有取得突破性的進(jìn)展，獲得滿意的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服已有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種新的過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物；本發(fā)明的另一目的在于提供一種新的過(guò)氧雙取代二丁烯縮醛糖苷類化合物的制備方法；本發(fā)明的另一目的在于提供一種新的過(guò)氧雙取代二丁烯縮醛糖苷類化合物及其組合物作為抗病毒藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明再一方面涉及藥物組合物，其包括作為活性成份的過(guò)氧雙取代二丁烯縮醛糖苷類化合物及其異構(gòu)體及制藥領(lǐng)域中常用的載體。
本發(fā)明再一方面涉及的是過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物或含有它的藥物組合物在預(yù)防和/或治療病毒性疾病的應(yīng)用。
具體講，本發(fā)明涉及通式(I)化合物及其異構(gòu)體。
其中，glc是葡萄糖。R1＝R2＝-CH＝CH2另外，本發(fā)明涉及過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物制備方法，它包括如下步驟金銀花以水提取，水提取液減壓濃縮后加醇，除去沉淀；上清液濃縮，濃縮液通過(guò)RA大孔樹(shù)脂，分別以水和醇梯度洗脫，分別濃縮洗脫液；30％醇洗脫的部分通過(guò)NKA-9大孔樹(shù)脂柱，水洗脫NKA-9大孔樹(shù)脂柱，洗脫液濃縮后經(jīng)sephadexLH-20柱層析，用HPLC純化得到目的物。
所述的金銀花可以是新鮮的，或干燥的金銀花植物。所述的醇可以是甲醇、乙醇、丁醇，優(yōu)選是乙醇。
在該方法中，水提取液減壓濃縮后加醇至濃度為70％以除去沉淀。
具體講，以金銀花花蕾為原料，用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的溶劑，優(yōu)選為水提取。金銀花與溶劑的重量比例從1∶10到1∶1，優(yōu)選為1∶5到1∶3。提取次數(shù)為1到5次，優(yōu)選為3次。金銀花與溶劑的重量比例分別為1∶5，1∶3，1∶3。提取溫度為20℃-100℃，優(yōu)選為40℃-80℃，更優(yōu)選為70℃。提取時(shí)間是1/4小時(shí)到4小時(shí)，優(yōu)選為1/2到2小時(shí)，更優(yōu)選為1小時(shí)。
提取液減壓濃縮，濃縮的溫度優(yōu)選為60℃以下，濃縮提取物至1∶1.2(原料金銀花與濃縮物的重量比)，加乙醇至70％濃度(容量比)。離心除去沉淀，上清液濃縮得乙醇溶解物。
乙醇溶解物通過(guò)RA大孔樹(shù)脂，以水和乙醇梯度洗脫，優(yōu)選為分別以水、10％，30％，95％濃度乙醇洗脫，(水和10％乙醇洗至無(wú)色)，并分別濃縮洗脫液，水洗物濃縮后為金銀花原料的18.0％(重量比)，10％乙醇洗脫物濃縮后為金銀花原料的2.0％(重量比)，30％乙醇洗濃縮后為金銀花原料的2.6％(重量比)，95％乙醇洗脫物為金銀花原料的1.5％(重量比)。30％乙醇洗脫部分(D3)抗病毒有效，D3部分通過(guò)NKA-9大孔樹(shù)脂柱，水洗脫，洗脫液濃縮后經(jīng)sephadexLH-20多次柱層析，最后用高效液相(HPLC)純化(儀器TSP3200，檢測(cè)波長(zhǎng)UV240，流動(dòng)相甲醇-水-甲酸30∶70∶0.4，流速1ml/min，保留時(shí)間826)。得到過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物純品，重量為金銀花生藥的0.1％。
獲得的過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物的理化、波譜數(shù)據(jù)如下過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物，白色粉末，mp.138-140°[a]D19-23.6°FABMSm/z517[M+Na+]，495[M+H+]SIMSm/z517[M+Na+]，1070{M[Si(Me)3]8}+分子式C20H30O14IR3495cm-1強(qiáng)吸收UVλmax 240nm1HNMRδ5.36(2H)，5.55(1H)，5.60(1H)，4.85，3.29，3.51，3.40，3.50，3.92，3.72.各1個(gè)氫。
13CNMRδ123.8，134.4，156.1，100.4，101.3，75.6，79.7，72.5，79.2，63.7.
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，所述的本發(fā)明化合物還包括其藥效學(xué)上可接受的鹽、酯或前體藥物。
本發(fā)明因此還涉及含有作為活性成份的本發(fā)明化合物和常規(guī)藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1-90重量％的本發(fā)明化合物。
本發(fā)明化合物的藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將本發(fā)明化合物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?br> 本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜腔或直腸等。
本發(fā)明組合物的給藥途徑可為注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和穴位注射等。
給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其他劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。
本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。
為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。
為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明化合物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。
例如，將本發(fā)明法的組合物制成注射用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
本發(fā)明藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重、性格及個(gè)體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)等，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化。一般來(lái)講，本發(fā)明中藥學(xué)成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明化合物組合物中最后的制劑中所含有的實(shí)際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達(dá)到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的抗病毒的目的。通常對(duì)體重約75公斤患者，所給本發(fā)明化合物的日劑量為0.001mg/kg體重-100mg/kg體重，優(yōu)選3mg/kg體重-30mg/kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥這受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)以及給藥方案。
根據(jù)本發(fā)明的思路，通式(I)化合物進(jìn)行了與抗病毒有關(guān)的藥理試驗(yàn)。從目前發(fā)現(xiàn)的病毒中選擇了有代表性的副粘病毒科的呼吸道合胞病毒和正粘病毒科的流感病毒，進(jìn)行體外抗病毒藥效試驗(yàn)和雞胚內(nèi)抗病毒抑制試驗(yàn)，試驗(yàn)中本發(fā)明化合物顯示出優(yōu)良的抗病毒活性。在對(duì)細(xì)胞和雞胚的毒性測(cè)定試驗(yàn)中與已知的抗病毒藥物相比具有作用明顯且毒性低的特點(diǎn)。
陽(yáng)性對(duì)照藥物病毒唑是衛(wèi)生部藥政局編制的新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編(1993)中指定的。
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是篩選藥物抗病毒藥效的一種常用方法，因呼吸道合胞病毒僅一個(gè)型，故選用呼吸道合胞病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株Long株作為試驗(yàn)用毒株。試驗(yàn)程序、方法和技術(shù)操作均按規(guī)定要求進(jìn)行。
在體外抗病毒藥效試驗(yàn)中比較本發(fā)明化合物各劑量組與病毒對(duì)照組細(xì)胞病變程度，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果采用簡(jiǎn)化直接概率法計(jì)算表明本發(fā)明化合物的4、2、1、0.5mg/ml劑量組對(duì)RSV標(biāo)準(zhǔn)毒株Long株有顯著抑制作用(P＜0.05)；用寇氏法計(jì)算，半數(shù)抑制量(半數(shù)有效量)為0.9597mg/ml，治療指數(shù)為6.2。而陽(yáng)性對(duì)照藥病毒唑注射液各劑量組均未顯示出抑制作用。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行量效關(guān)系判定，本發(fā)明化合物各劑量組與細(xì)胞病變抑制率之間的點(diǎn)子呈直線趨勢(shì)，因此計(jì)算相關(guān)系數(shù)。由原始數(shù)據(jù)直接計(jì)算相關(guān)系數(shù)得結(jié)果，相關(guān)系數(shù)(r)等于0.9949，相關(guān)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)P＜0.0005；回歸系數(shù)(b)等于40.97，回歸方程為Y＝40.97X-76.78，回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)P＜0.025。可以認(rèn)為藥物劑量與抑制率之間存在明顯相關(guān)關(guān)系。
在本發(fā)明化合物對(duì)細(xì)胞的毒性測(cè)定試驗(yàn)中，每毫升含本發(fā)明化合物的10mg、5mg、2.5mg、1.25mg、0.625mg 5個(gè)劑量組和陽(yáng)性對(duì)照藥病毒唑注射液每毫升含20g、10g、5g、2.5g、1.25g 5個(gè)劑量組的試驗(yàn)結(jié)果用寇氏法計(jì)算，得本發(fā)明化合物與病毒唑?qū)ela傳代細(xì)胞的半數(shù)中毒劑量分別為5.95mg/ml和8.41g/ml，95％的可信區(qū)間分別為4.43-7.98mg/ml和6.27-11.28g/ml。最大無(wú)毒劑量分別為2.5mg/ml和5g/ml。表明本發(fā)明化合物的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于病毒唑。
雞胚試驗(yàn)法是鑒定藥物抗病毒藥效試驗(yàn)的一種常用方法。這種試驗(yàn)法不易受外界因素影響，比細(xì)胞培養(yǎng)更接近機(jī)體。流感病毒包括甲、乙、丙三型。甲3型是流感流行的常見(jiàn)型，乙型多引起局部地區(qū)或?qū)W校和兵營(yíng)“單位內(nèi)爆發(fā)”，故選用甲3型及乙型流感病毒作為試驗(yàn)用毒株。
在不同濃度本發(fā)明化合物對(duì)雞胚內(nèi)甲3型流感病毒抑制試驗(yàn)中，比較本發(fā)明化合物各劑量組與甲3型流感病毒對(duì)照組的感染率。試驗(yàn)結(jié)果采用簡(jiǎn)化直接概率法計(jì)算表明本發(fā)明化合物2.5、1.25、0.625mg/胚劑量組對(duì)甲3型流感病毒有顯著抑制作用(P＜0.05)；試驗(yàn)結(jié)果按寇氏法計(jì)算，本發(fā)明化合物對(duì)甲3型流感病毒的半數(shù)抑制量均＜0.3125mg/ml；試驗(yàn)數(shù)據(jù)按ETD50/ED50計(jì)算，本發(fā)明化合物對(duì)甲3型流感病毒的治療指數(shù)＞32。
在本發(fā)明化合物對(duì)雞胚中不同稀釋度甲3型流感病毒抑制試驗(yàn)中試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明化合物(5mg/胚)完全抑制甲3型流感病毒生長(zhǎng)繁殖的病毒最小稀釋倍數(shù)為1∶800(28.28EID50)。病毒唑(5mg/胚)對(duì)試驗(yàn)用病毒稀釋濃度未顯示抑制作用說(shuō)明在不同濃度本發(fā)明化合物對(duì)雞胚內(nèi)乙型流感病毒抑制試驗(yàn)中比較化合物各劑量組與病毒對(duì)照組的感染率，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用簡(jiǎn)化直接概率法計(jì)算表明本發(fā)明化合物的2.5、1.25、0.625、0.3125mg/胚劑量組對(duì)乙型流感病毒有顯著抑制作用(P＜0.05)；按寇氏法計(jì)算，本發(fā)明化合物對(duì)乙型流感病毒的半數(shù)抑制量＜0.3125mg/ml；試驗(yàn)數(shù)據(jù)按ETD50/ED50計(jì)算，本發(fā)明化合物對(duì)乙型流感病毒的治療指數(shù)＞32。
在本發(fā)明化合物對(duì)雞胚中不同稀釋度乙型流感病毒抑制試驗(yàn)中試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明化合物(5mg/胚)完全抑制乙型流感病毒生長(zhǎng)繁殖的病毒最小稀釋倍數(shù)為1∶640(10.5EID50)。病毒唑(5mg/胚)對(duì)試驗(yàn)用病毒稀釋濃度未顯示抑制作用在藥物對(duì)雞胚的毒性測(cè)定中，比較本發(fā)明化合物及病毒唑注射液的毒性，計(jì)算半數(shù)中毒劑量(ETD50)和確定最大無(wú)毒劑量(ETD0)，進(jìn)行藥物毒性測(cè)定。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，化合物和病毒唑注射液雞胚半數(shù)中毒劑量(ETD50)和最大無(wú)毒劑量均＞10mg/胚.陽(yáng)性對(duì)照藥病毒唑10mg/胚劑量，觀察96小時(shí)，雞胚雖存活，但影響其發(fā)育成雞雛。雞胚尿囊腔內(nèi)注入病毒唑(0.45mg/胚)后，經(jīng)半小時(shí)，再注入10或30EID50FM1流感病毒，病毒唑?qū)M1流感病毒在雞胚內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖無(wú)抑制作用。


圖1過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物的制備流程圖。
圖2過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物各劑量組與細(xì)胞病變抑制率的點(diǎn)圖。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例及藥物活性實(shí)驗(yàn)用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但這并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例1 過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物的制備參見(jiàn)附圖1，金銀花花蕾1kg以熱水提取，三次，每次一小時(shí)，三次提取金銀花與水比例分別為5∶1，3∶1，3∶1，水提取液減壓(60℃)，濃縮提取物至1∶1.2(原料與濃縮物比)，加乙醇至70％濃度.離心除去沉淀，上清液濃縮得乙醇溶解物255g，(以生藥計(jì)得率為25.5％)。乙醇溶解物255g通過(guò)RA大孔樹(shù)脂，分別以水、10％，30％，95％濃度乙醇洗脫，(水和10％乙醇洗至無(wú)色)，并分別濃縮洗脫液，得水洗物180g，10％乙醇洗脫物20g，30％乙醇洗脫物26g，95％乙醇洗脫物15.2g，分別為生藥的18.0％，2.0％，2.6％，1.5％。30％乙醇洗脫部分(D3)抗病毒有效，D3部分26g通過(guò)NKA-9大孔樹(shù)脂柱，水洗脫，洗脫液濃縮后經(jīng)sephadexLH-20多次柱層析，最后用HPLC純化(儀器TSP3200，檢測(cè)波長(zhǎng)UV 240，流動(dòng)相甲醇-水-甲酸30∶70∶0.4，流速1ml/min，保留時(shí)間8 26)。得到過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物純品1g，得率為生藥的0.1％。
實(shí)施例2 過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物的制備金銀花花蕾1kg以熱水提取，三次，每次一小時(shí)，三次提取金銀花與水比例分別為5∶1，3∶1，3∶1，水提取液減壓(60℃)，濃縮提取物至1∶1.2(原料與濃縮物比)，加乙醇至70％濃度.離心除去沉淀，上清液濃縮得乙醇溶解物255g，(以生藥計(jì)得率為25.5％)。乙醇溶解物30g通過(guò)D301大孔樹(shù)脂，分別以水、10％，30％，95％濃度乙醇洗脫，(水和10％乙醇洗至無(wú)色)，并分別濃縮洗脫液，得水洗物18.6g，10％乙醇洗脫物2.25g，30％乙醇洗脫物2.83g，95％乙醇洗脫物3.36g。10％乙醇洗脫部分通過(guò)NKA-9大孔樹(shù)脂柱，水洗脫，洗脫液濃縮后經(jīng)sephadexLH-20多次柱層析，最后用HPLC純化(儀器TSP3200，檢測(cè)波長(zhǎng)UV 240，流動(dòng)相甲醇-水-甲酸30∶70∶0.4，流速1ml/min，保留時(shí)間8 26)。得到過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物純品100mg。
過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物的理化、波譜數(shù)據(jù)如下過(guò)氧雙取代縮醛糖苷類化合物，白色粉末，mp.138-140°[a]D19-23.6°FABMSm/z517[M+Na+]，495[M+H+]SIMSm/z517[M+Na+]，1070{M[Si(Me)3]8}+分子式C20H30O14IR3495cm-1強(qiáng)吸收UVλmax 240nm1HNMRδ5.36(2H)，5.55(1H)，5.60(1H)，4.85，3.29，3.51，3.40，3.50，3.92，3.72.各1個(gè)氫。
13CNMRδ123.8，134.4，156.1，100.4，101.3，75.6，79.7，72.5，79.2，63.7.
藥理試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)例1 本發(fā)明化合物的體外抗病毒藥效試驗(yàn)材料 1、受試藥本發(fā)明化合物。(2)陽(yáng)性對(duì)照藥病毒唑(三氮唑核苷，Ribavirin)注射液，含量100mg/ml，批號(hào)000302，煙臺(tái)第二制藥廠生產(chǎn)。(3)病毒株呼吸道合胞病毒(RSV)標(biāo)準(zhǔn)毒株Long株，由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所引進(jìn)。(4)細(xì)胞株Hela傳代細(xì)胞，由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所引進(jìn)。(5)培養(yǎng)基MEM(Minimum Essential Medium)培養(yǎng)基，美國(guó)GibcoBRL公司生產(chǎn)。(6)胎牛血清，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。
(一)呼吸道合胞病毒對(duì)Hela傳代細(xì)胞毒力測(cè)定為了解呼吸道合胞病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株Long株對(duì)Hela傳代細(xì)胞的毒力，計(jì)算細(xì)胞半數(shù)感染濃度，進(jìn)行病毒毒力測(cè)定。試驗(yàn)用細(xì)胞維持液將病毒稀釋成10-6-10-105個(gè)稀釋濃度，按常量分別加入細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋濃度感染4孔細(xì)胞，置36C，5％CO2恒溫箱內(nèi)，經(jīng)2小時(shí)吸附后，棄去含病毒的維持液，加入細(xì)胞維持液，設(shè)4孔正常細(xì)胞對(duì)照，置36C 5％CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每天1次鏡下觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察3天。試驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算半數(shù)感染濃度(TCID50)，確定最大不感染濃度(TCID0)。觀察指標(biāo)細(xì)胞病變(CPE)。RSV對(duì)Hela傳代細(xì)胞所致CPE的特征為細(xì)胞變圓、折光增強(qiáng)、融合細(xì)胞突起，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞固縮和破碎。每孔CPE程度記錄為0表示無(wú)明顯CPE1表示CPE達(dá)1-25％2表示CPE達(dá)26-50％3表示CPE達(dá)51-75％4表示CPE達(dá)76-100％測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表1。
表1.RSV標(biāo)準(zhǔn)毒株Long株對(duì)Hela傳代細(xì)胞的毒力測(cè)定結(jié)果病毒稀接種孔數(shù)平均每孔細(xì)胞 感染率釋濃度 感染程度(％)10-64 4 100.0010-74 4 100.0010-84 2.5 62.501094 0 0.0010-104 0 0.00細(xì)胞對(duì)照組 4 0根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，采用Reed-Muench氏法計(jì)算細(xì)胞半數(shù)感染濃度(TCID50)得呼吸道合胞病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株Long株在Hela傳代細(xì)胞中半數(shù)感染濃度(TCID50)為10-8.2，95％的可信區(qū)間分別為10-7.73--10-8.67；最大不感染濃度(TCID0)為10-9。
(二)本發(fā)明化合物抗病毒藥效試驗(yàn)體外抗病毒藥效試驗(yàn)就是觀察藥物在體外對(duì)病毒生長(zhǎng)繁殖的抑制程度及其有效性，因此進(jìn)行抑制試驗(yàn)。Hela傳代細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板上長(zhǎng)成單層后，棄去培養(yǎng)液，加入用細(xì)胞維持液將病毒稀釋成10-6.5(相當(dāng)于52.67 TCID50)的病毒稀釋液，置36C 5％CO2恒溫箱內(nèi)吸附2小時(shí)，感染細(xì)胞，然后棄去病毒液，按常量分別加入用細(xì)胞維持液稀釋成每毫升含4mg、2mg、1mg、0.5mg、0.25mg 5個(gè)劑量的本發(fā)明化合物，每個(gè)劑量4孔感染細(xì)胞。再按常量分別加入用細(xì)胞維持液稀釋成每毫升含5g、2.5g、1.25g、0.63g、0.31g 5個(gè)劑量的病毒唑注射液，每個(gè)劑量4孔感染細(xì)胞，同時(shí)設(shè)藥物對(duì)照組(不感染病毒，只加藥)，細(xì)胞對(duì)照組(不感染病毒，不加藥)和病毒對(duì)照組(只感染病毒)，每個(gè)對(duì)照組亦均為4孔細(xì)胞，置36C 5％CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每天1次鏡下觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察3天，試驗(yàn)重復(fù)3次。
根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算細(xì)胞病變抑制率，半數(shù)抑制量(半數(shù)有效量)，治療指數(shù)，以及量效關(guān)系。
1)細(xì)胞病變(CPE)抑制率病毒對(duì)照組CPE率-受試藥組CPE率/病毒對(duì)照組CPE率。
2)比較受試藥各劑量組CPE程度與病毒對(duì)照組CPE程度之間差異的顯著性，采用簡(jiǎn)化直接概率法檢驗(yàn)。
3)半數(shù)抑制量或半數(shù)有效量(ED50)按寇氏法計(jì)算。
4)治療指數(shù)(TI)按CTD50/ED50求得。
5)量效關(guān)系判定以藥物劑量對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，CPE抑制率為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，計(jì)算相關(guān)系數(shù)和回歸系數(shù)，進(jìn)行相關(guān)系數(shù)和回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，以判定兩者是否存在相關(guān)關(guān)系本發(fā)明化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)呼吸道合胞病毒抑制試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表2。
表2.本發(fā)明化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)RSV標(biāo)準(zhǔn)毒株Long株抑制試驗(yàn)結(jié)果藥物劑量 平均每孔細(xì)胞 細(xì)胞病變率 細(xì)胞病變病變程度 (％) 抑制率中草藥4.00 1.25 31.25 68.75*提取物2.00 1.50 37.50 62.50*本發(fā)明化合物 1.00 2.25 56.25 43.75*(mg/ml) 0.50 2.65 66.25 33.75*0.25 3.13 78.13 21.875.00 4.00 100.000.00病毒唑2.50 4.00 100.000.00注射液1.25 4.00 100.000.00組(g/ml) 0.63 4.00 100.000.000.31 4.00 100.000.00細(xì)胞對(duì)照組 0.00 0.00病毒對(duì)照組 4.00 100.00本發(fā)明化合物對(duì)照組4.00 0.00 0.00(mg/ml)病毒唑?qū)φ战M 5.00 0.00 0.00(g/ml)注*表示經(jīng)簡(jiǎn)化直接概率法檢驗(yàn)P＜0.05
根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果，采用簡(jiǎn)化直接概率法，比較本發(fā)明化合物各劑量組與病毒對(duì)照組細(xì)胞病變程度，結(jié)果表明，本發(fā)明化合物的4、2、1、0.5mg/ml劑量組對(duì)RSV標(biāo)準(zhǔn)毒株Long株有顯著抑制作用(P＜0.05)。根據(jù)表2資料，用寇氏法計(jì)算，半數(shù)抑制量(半數(shù)有效量)為0.9597mg/ml，治療指數(shù)為6.2。陽(yáng)性對(duì)照藥病毒唑注射液各劑量組均未顯示出抑制作用。
根據(jù)表2試驗(yàn)資料，以藥物劑量對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)繪圖，見(jiàn)附圖2。
參見(jiàn)附圖2，可見(jiàn)，本發(fā)明化合物各劑量組與細(xì)胞病變抑制率之間的點(diǎn)子呈直線趨勢(shì)，因此計(jì)算相關(guān)系數(shù)。由原始數(shù)據(jù)直接計(jì)算相關(guān)系數(shù)。計(jì)算結(jié)果，相關(guān)系數(shù)(r)等于0.9949，相關(guān)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，經(jīng)查表P＜0.0005?；貧w系數(shù)(b)等于40.97，回歸方程為Y＝40.97X-76.78，回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，經(jīng)查表P＜0.025?？梢哉J(rèn)為藥物劑量與抑制率之間存在明顯相關(guān)關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)例2 本發(fā)明化合物對(duì)細(xì)胞的毒性測(cè)定為了解和比較本發(fā)明化合物及病毒唑注射液對(duì)Hela傳代細(xì)胞的毒性，計(jì)算半數(shù)中毒劑量，確定最大無(wú)毒劑量，進(jìn)行藥物毒性測(cè)定。
試驗(yàn)材料同實(shí)驗(yàn)例11、本發(fā)明化合物的毒性測(cè)定用細(xì)胞維持液將本發(fā)明化合物稀釋成每毫升含10mg、5mg、2.5mg、1.25mg、0.625mg 5個(gè)劑量，按常量分別加入細(xì)胞已長(zhǎng)成單層的96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)劑量4孔細(xì)胞，設(shè)4孔正常細(xì)胞對(duì)照，置36C 5％CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每天1次鏡下觀察細(xì)胞毒性，連續(xù)觀察3天。試驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算半數(shù)中毒劑量(CTD50)，確定最大無(wú)毒劑量(CTD0)。
2、陽(yáng)性對(duì)照藥病毒唑注射液毒性測(cè)定用細(xì)胞維持液將病毒唑注射液稀釋成每毫升含20g、10g、5g、2.5g、1.25g 5個(gè)劑量，測(cè)定程序和方法同本發(fā)明化合物的毒性測(cè)定。
測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表3。
表3.本發(fā)明化合物與病毒唑?qū)ela傳代細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果藥物劑量接種平均每孔細(xì)胞 病變率孔數(shù) 病變程度(％)本發(fā)明化合物 0.625 4 00.00(mg/ml) 1.254 00.002.504 00.005.004 125.0010.00 4 4100.001.254 00.00病毒唑 2.504 00.00注射液組 5.004 00.00(g/ml) 10.00 4 375.0020.00 4 4100.00細(xì)胞對(duì)照組 4 0根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，用寇氏法計(jì)算，本發(fā)明化合物與病毒唑?qū)ela傳代細(xì)胞的半數(shù)中毒劑量分別為5.95mg/ml和8.41g/ml，95％的可信區(qū)間分別為4.43-7.98mg/ml和6.27-11.28g/ml。最大無(wú)毒劑量分別為2.5mg/ml和5g/ml。
實(shí)驗(yàn)例3 本發(fā)明化合物對(duì)雞胚內(nèi)甲3型流感病毒抑制試驗(yàn)1、試驗(yàn)材料(1)、受試藥本發(fā)明化合物。(2)、陽(yáng)性對(duì)照藥病毒唑(三氮唑核苷Ribavirin)注射液含量為100mg/ml，批號(hào)000302，煙臺(tái)第二制藥廠生產(chǎn)。(3)、甲3型流感病毒凍干品(A3/漢防05-359 E5 1∶160 28/4 198)及乙型流感病毒凍干品(B/深防97-12 E5 1∶16028/4 198)，均由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所引進(jìn)。(4)、雞胚試驗(yàn)用無(wú)特定病原體雞胚(SPF雞胚)，孵自來(lái)享雞受精卵。
首先測(cè)定病毒攻擊量，得出化合物(5mg/胚)完全抑制甲3型流感病毒生長(zhǎng)繁殖的病毒最小稀釋倍數(shù)為1∶800(28.28EID50)依此確定，在抑制試驗(yàn)中，甲3型流感病毒攻擊量為1∶800。
2、抑制試驗(yàn)將選出的雞胚，隨機(jī)分成7個(gè)組，每組4個(gè)雞胚。根據(jù)藥物毒性測(cè)定結(jié)果，從ETD0開(kāi)始以2倍稀釋法，將本發(fā)明化合物用肉湯稀釋成2.5mg/ml、l.25mg/ml、0.625 mg/ml、0.3125mg/ml 4個(gè)劑量。根據(jù)病毒攻擊量測(cè)定結(jié)果，將甲3型流感病毒用肉湯稀釋成1∶800。將稀釋好的病毒稀釋液，各接種5個(gè)組雞胚，接種尿囊腔，接種量0.1ml。同時(shí)將稀釋好的化合物每個(gè)劑量注入已接種過(guò)甲3型流感病毒的各1個(gè)組，注入尿囊腔，注入量0.1ml。接種過(guò)甲3型病毒稀釋液的組不給藥，作為甲3型病毒對(duì)照組。未接種過(guò)病毒稀釋液的2個(gè)組，1個(gè)組注入實(shí)驗(yàn)中采用的最高劑量受試藥，作為藥物對(duì)照組；1個(gè)組不給處理作為正常對(duì)照組。
3、藥物藥效指標(biāo)1)、抑制率病毒對(duì)照組感染率-受試藥組感染率/病毒對(duì)照組感染率。
2)、比較受試藥各劑量組與病毒對(duì)照組感染率之間差異的顯著性，采用簡(jiǎn)化直接概率法檢驗(yàn)。
3)、半數(shù)有效量(半數(shù)抑制量，ED50)，用寇氏法計(jì)算。
4)、治療指數(shù)(TI)＝ETD50/ED504、抑制試驗(yàn)結(jié)果表4本發(fā)明化合物對(duì)雞胚中甲3型流感病毒抑制試驗(yàn)結(jié)果藥物劑量 病毒接種血凝陽(yáng)性血凝陽(yáng)性抑制率(mg/胚)稀釋倍數(shù)雞胚數(shù) 雞胚數(shù) 率(％)2.5 4 0 0.00100.00*1.25 4 0 0.00100.00*本發(fā)明 0.625 800 4 0 0.00100.00*化合物 0.31254 1 0.2575.00病毒對(duì)照 0 800 4 4 1.00藥物對(duì)照 2.5 0 4 0 0.00正常對(duì)照 0 0 4 0 0.00注*表示經(jīng)簡(jiǎn)化直接概率法檢驗(yàn)P＜0.05本發(fā)明化合物對(duì)甲3型流感病毒抑制試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用簡(jiǎn)化直接概率法，比較本發(fā)明化合物各劑量組與病毒對(duì)照組的感染率。結(jié)果表明，本發(fā)明化合物2.5、1.25、0.625mg/胚劑量組對(duì)甲3型流感病毒，2.5、1.25、0.625、0.3125mg/胚劑量組對(duì)乙型流感病毒有顯著抑制作用(P＜0.05)。
5、半數(shù)抑制量(半數(shù)有效量ED)根據(jù)表4試驗(yàn)數(shù)據(jù)，按寇氏法計(jì)算，本發(fā)明化合物對(duì)甲3型流感病毒的半數(shù)抑制量＜0.3125mg/ml。
6、治療指數(shù)根據(jù)表4的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，按ETD50/ED50計(jì)算，本發(fā)明化合物對(duì)甲3型流感病毒的治療指數(shù)＞32。
實(shí)驗(yàn)例4本發(fā)明化合物5mg/胚對(duì)雞胚中甲3型流感病毒抑制試驗(yàn)將選出的雞胚，隨機(jī)分成15組，每組4個(gè)雞胚。根據(jù)藥物毒性的測(cè)定結(jié)果，稀釋本發(fā)明化合物和病毒唑。根據(jù)甲3型流感病毒毒力測(cè)定結(jié)果，將甲3型流感病毒用肉湯稀釋成1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000 4個(gè)濃度。每個(gè)病毒稀釋濃度接種3組雞胚，接種尿囊腔，接種量0.1ml。接種相同病毒稀釋濃度的3個(gè)組其中1個(gè)組注入稀釋好的本發(fā)明化合物，1個(gè)組注入稀釋好的病毒唑，注入尿囊腔，注入量為0.1ml，1個(gè)組不注入藥，作為病毒對(duì)照組。未接種病毒稀釋液的3個(gè)組其中1個(gè)組注入稀釋好的本發(fā)明化合物，1個(gè)組注入稀釋好的病毒唑，作為藥物對(duì)照組，1個(gè)組不作任何處理，作為正常對(duì)照組。試驗(yàn)重復(fù)3次。
表5 本發(fā)明化合物或病毒唑5mg/胚劑量對(duì)雞胚中不同稀釋度甲3型流感病毒抑制試驗(yàn)結(jié)果藥物劑量 病毒稀釋 接種 血凝陽(yáng)性 血凝陽(yáng)性率(mg/胚) 倍數(shù) 雞胚數(shù) 雞胚數(shù)本發(fā)明5 200 4 4 100.00化合物 400 4 4 100.00800 4 0 0.001000 4 0 0.00病毒唑5 200 4 4 100.00注射液 400 4 4 100.00800 4 4 100.001000 4 4 100.00200 4 4 100.00病毒400 4 4 100.00對(duì)照組 800 4 4 100.001000 4 4 100.00
本發(fā)明化合5 0 4 00.00物對(duì)照組病毒唑?qū)φ战M5 0 4 00.00正常雞胚 0 0 4 00.00對(duì)照組從表5可見(jiàn)，本發(fā)明化合物(5mg/胚)完全抑制甲3型流感病毒生長(zhǎng)繁殖的病毒最小稀釋倍數(shù)為1∶800(28.28EID50)。病毒唑(5mg/胚)對(duì)試驗(yàn)用病毒稀釋濃度未顯示抑制作用。
實(shí)驗(yàn)例5不同濃度本發(fā)明化合物對(duì)雞胚內(nèi)乙型流感病毒抑制試驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)材料如實(shí)驗(yàn)例42測(cè)定病毒攻擊量測(cè)定病毒攻擊量的實(shí)驗(yàn)得出本發(fā)明化合物(5mg/胚)完全抑制乙型流感病毒生長(zhǎng)繁殖的病毒最小稀釋倍數(shù)為1∶640(10.5EID50)。依此確定，在抑制試驗(yàn)中，乙型流感病毒的病毒攻擊量為1∶640。
3、抑制試驗(yàn)將選出的雞胚，隨機(jī)分成7個(gè)組，每組4個(gè)雞胚。根據(jù)藥物毒性測(cè)定結(jié)果，從ETD0開(kāi)始以2倍稀釋法，將本發(fā)明化合物用肉湯稀釋成2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.3125mg/ml 4個(gè)劑量。根據(jù)病毒攻擊量測(cè)定結(jié)果，將乙型流感病毒用肉湯稀釋成1∶640。將稀釋好的乙型病毒稀釋液，各接種5個(gè)組雞胚，接種尿囊腔，接種量0.1ml。同時(shí)將稀釋好的本發(fā)明化合物每個(gè)劑量注入已接種過(guò)乙型流感病毒的4個(gè)組，注入尿囊腔，注入量0.1ml。接種過(guò)乙型病毒稀釋液的第5組不給藥，作為乙型病毒對(duì)照組。未接種過(guò)病毒稀釋液的2個(gè)組，1個(gè)組注入實(shí)驗(yàn)中采用的最高劑量受試藥，作為藥物對(duì)照組；1個(gè)組不給處理作為正常對(duì)照組。本發(fā)明化合物對(duì)乙型流感病毒抑制試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6
1、表6 本發(fā)明化合物對(duì)雞胚中流感病毒抑制試驗(yàn)結(jié)果藥物劑量 病毒 接種血凝陽(yáng)性 血凝陽(yáng)性 抑制率(mg/胚) 稀釋倍數(shù) 雞胚數(shù)雞胚數(shù)率(％)2.54 00.00100.00*本發(fā)明 1.25 4 00.00100.00*化合物 0.625640 4 00.00100.00*0.3125 4 00.00100.00*病毒對(duì)照0640 4 41.00藥物對(duì)照2.5 0 4 00.00正常對(duì)照00 4 00.00注*表示經(jīng)簡(jiǎn)化直接概率法檢驗(yàn)P＜0.05按表6試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用簡(jiǎn)化直接概率法，比較本發(fā)明化合物各劑量組與病毒對(duì)照組的感染率。結(jié)果表明本發(fā)明化合物的2.5、1.25、0.625、0.3125mg/胚劑量組對(duì)乙型流感病毒有顯著抑制作用(P＜0.05)。
4、半數(shù)抑制量(半數(shù)有效量ED)根據(jù)表6試驗(yàn)數(shù)據(jù)，按寇氏法計(jì)算，本發(fā)明化合物對(duì)乙型流感病毒的半數(shù)抑制量＜0.3125mg/ml。
5、治療指數(shù)根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，按ETD50/ED50計(jì)算，本發(fā)明化合物對(duì)乙型流感病毒的治療指數(shù)＞32。
實(shí)驗(yàn)例6本發(fā)明化合物5mg/胚劑量對(duì)雞胚中乙型流感病毒抑制試驗(yàn)表7 本發(fā)明化合物或病毒唑5mg/胚劑量對(duì)雞胚中不同稀釋度乙型流感病毒抑制試驗(yàn)結(jié)果藥物劑病毒稀釋接種雞血凝陽(yáng)性血凝陽(yáng)量(mg/胚)倍數(shù) 胚數(shù) 雞胚數(shù) 性率160 4 4 100.00本發(fā)明 320 4 4 100.00化合物 5640 4 0 0.001280 4 0 0.00病毒唑 5160 4 4 100.00注射液 320 4 4 100.00640 4 4 100.001280 4 4 100.00
病毒對(duì)照組160 44100.00320 44100.00640 44100.001280 44100.00本發(fā)明化合5 0 400.00物對(duì)照組病毒唑?qū)φ战M5 0 400.00正常雞胚對(duì)照組 400.00實(shí)驗(yàn)例7本發(fā)明化合物對(duì)雞胚的毒性測(cè)定將選出的雞胚，隨機(jī)分成12個(gè)組，每組4個(gè)10日齡雞胚。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，用滅菌去離子水將本發(fā)明化合物稀釋成l0mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml 5個(gè)劑量；用滅菌去離子水將病毒唑稀釋成10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/m1、1.25mg/ml、0.625mg/ml5個(gè)劑量。兩藥每個(gè)劑量注入1個(gè)組，注入尿囊腔，注入量為0.2ml。封閉注入孔，孵育條件、觀察方法等同病毒毒力測(cè)定。連續(xù)觀察4天，逐日記錄雞胚生存死亡情況。未注射藥的2個(gè)組雞胚，1個(gè)組作為稀釋液對(duì)照組，注射稀釋液，1個(gè)組作為正常對(duì)照組，不給處理。試驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)觀察結(jié)果，計(jì)算ETD50，確定ETD50。
表8 本發(fā)明化合物及病毒唑注射液對(duì)雞胚的毒性測(cè)定結(jié)果藥物劑量接種雞雞胚存雞胚死(mg/胚) 胚數(shù) 活數(shù) 亡數(shù)0.6254 4 01.2504 4 0本發(fā)明 2.5004 4 0化合物 5.0004 4 010.000 4 4 0
0.625 4 4 0病毒唑1.250 4 4 0注射液2.500 4 4 05.000 4 4 010.0004 4 0稀釋液 4 4 0對(duì)照組正常雞胚4 4 0對(duì)照組根據(jù)表8試驗(yàn)數(shù)據(jù)，化合物和病毒唑注射液雞胚半數(shù)中毒劑量(ETD50)和最大無(wú)毒劑量均＞10mg/胚。
陽(yáng)性對(duì)照藥病毒唑10mg/胚劑量，觀察96小時(shí)，雞胚雖存活，但影響其發(fā)育成雞雛。雞胚尿囊腔內(nèi)注入病毒唑(0.45mg/胚)后，經(jīng)半小時(shí)，再注入10或30EID50FM1流感病毒，病毒唑?qū)M1流感病毒在雞胚內(nèi)的生長(zhǎng)繁殖無(wú)抑制作用。
權(quán)利要求
1.如通式(I)所示的化合物 其特征在于glc是葡萄糖。R1＝R2＝-CH＝CH2
2.制備如權(quán)利要求1所述化合物的方法，其包括以下步驟金銀花以水提取，水提取液減壓濃縮后加醇，除去沉淀；上清液濃縮，濃縮液通過(guò)RA大孔樹(shù)脂，分別以水和醇梯度洗脫，分別濃縮洗脫液；30％醇洗脫的部分通過(guò)NKA-9大孔樹(shù)脂柱，水洗脫NKA-9大孔樹(shù)脂柱，洗脫液濃縮后經(jīng)sephadexLH-20柱層析，用HPLC純化得到目的物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的金銀花是新鮮的，或干燥的金銀花植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的醇是乙醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于水提取液減壓濃縮后加醇至濃度為70％以除去沉淀。
6.一種藥物組合物，其特征在于含有有效劑量的權(quán)利要求1所述的化合物，以及藥效學(xué)上可接受的載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物可以是片劑、膠囊、丸劑、注射劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。
8.如權(quán)利要求1所述的化合物在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的病毒包括正粘病毒科病毒、副粘病毒科病毒。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的正粘病毒科病毒是甲乙丙型流感病毒。
11.如權(quán)利要求11的應(yīng)用，其特征在于所述的副粘病毒科病毒是人呼吸道合胞體病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型過(guò)氧二烯縮醛糖苷類衍生物，其制備方法，含有它們的藥物組合物，及其作為藥物，尤其是抗病毒藥物的用途。
文檔編號(hào)C07H17/00GK1513863SQ0214136
公開(kāi)日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2002年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月10日
發(fā)明者于德全, 陳若蕓, 謝鳳指, 明東升, 周崑, 李洪源, 佟奎民 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所, 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)