專利名稱：牡蠣低分子活性肽及其制備方法和在制備抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種首次從自然界分離提取的多肽和制備方法及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
(2)背景技術(shù)海洋生物活性物質(zhì)抗腫瘤研究是海洋生物活性物質(zhì)開發(fā)與海洋藥物研究的重要方面。自20世紀80年代以來，已相繼從海藻、海綿、腔腸動物和軟體動物中提取出一系列具有抗腫瘤作用的萜類、生物堿、大環(huán)聚酯、肽類、聚醚等化合物，顯示從海洋生物中尋找抗癌新藥有著廣闊前景。牡蠣不僅是一種高營養(yǎng)價值的海產(chǎn)品，也是一種很有藥用價值的海洋生物，其藥用價值和保健功能不僅在中國藥領(lǐng)域中得到推崇，近些年來同樣受到國內(nèi)外一此學者的重視。國內(nèi)外報道了牡蠣提取物具有抗腫瘤作用，如對癌細胞的放射增敏、清除氧自由基以及對動物機體的免疫調(diào)節(jié)作用等。王穎等公開了一種牡蠣提取物抗腫瘤作用的實驗研究(中國海洋藥物，1997，16(1)18-22)；曹棄元等公開了一種牡蠣提取物體外放射增敏作用(中國海洋藥物，1993，12(2)11-13，29)。
(3)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種首次從牡蠣中分離提取的牡蠣低分子活性肽組分(The BioactivePeptides of Oyster in low molecular weight group，BPO-L)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種從牡蠣(Saccostrea cucullata)中分離提取BPO-L的方法。
本發(fā)明的另一目的是BPO-L在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所說的BPO-L的組份含有八種蛋白，分子量分別為44kD、39.8kD、31.6kD、10kD、7.9kD、6.3kD、5.3kD和5.0kD。其中5.3kD的蛋白可被陽離子交換柱瓊脂糖凝膠CM-Sepharose CL-6B強烈吸附，是一種堿性蛋白。
本發(fā)明所說的BPO-L的制備方法是l、將牡蠣勻漿，收集勻漿液；2、對牡蠣勻漿液酸抽提，收集上清液；3、對牡蠣勻漿上清液進行分子篩層析，收集含有牡蠣低分子活性肽組份；4、對含有牡蠣低分子活性肽組份進行脫鹽，收集BPO-L；
5、將獲得的BPO-L進行離子交換柱層析。
在牡蠣勻漿時，可加入Tris-HCl緩沖液，其含量為新鮮牡蠣與Tris-HCl緩沖液的體積比為1∶1。
對牡蠣勻漿液采用酸抽提時，可用20mmol/L HCl反復抽提，收集所有的上清液置冷凍干燥機后即為牡蠣酸提物。
所說的分子篩層析可將牡蠣酸提物溶解于洗脫液中，再將牡蠣酸提物溶解液加到層析柱的葡聚糖凝膠Sephadex G-50膠面上洗脫。
所說的脫鹽可將含有Cl-離子的BPO-L溶解于加樣緩沖液里，再將其加到層析柱的葡聚糖凝膠Sephadex G-25上洗脫。
所說的離子交換柱層析可將BPO-L溶解于NaAc-HAc緩沖液中，再加到離子交換柱的瓊脂糖凝膠CM-SepharoseCL-6B平面上洗脫。
所說的BPO-L可作為制備抗癌藥物的活性組份。
本發(fā)明采用酸抽提和分子篩層析方法有效地對牡蠣進行抽得和分離提取，獲得BPO-L，既能使牡蠣細胞中的蛋白得到充分的抽提，又能使蛋白活性得到最大限度的保留。并且具有明確的抗腫瘤活性作用，能有效地干預癌細胞相關(guān)癌基因與抑癌基因表達，進而誘導癌細胞分化。
(4)


圖1為小分子肽類SDS-PAGE電泳圖。
圖2為BPO-L分離純化操作流程圖。
圖3為凝膠柱Sephadex G-50洗脫曲線。
圖4為凝膠柱Sephadex G-25脫鹽洗脫曲線。
圖5為離子交換柱CM-SepharoseCL-6B洗脫曲線。
圖6為BPO-L對人肺腺癌A549細胞生長的影響。
圖7為BPO-L對人肺腺癌A549細胞分裂指數(shù)的影響。
圖8為BPO-L對人肺腺癌A549細胞細胞周期的影響。
圖9為HE染色觀察結(jié)果圖版。
圖10為A549細胞透射電子顯微鏡觀察圖版。
圖11為0.1mg/ml BPO-L處理后的透射電子顯微鏡觀察圖版。
圖12為BPO-L對A549細胞相關(guān)癌基因與抑癌基因表達的影響圖版。
(5)
具體實施例方式
BPO-L是鮮活牡蠣經(jīng)勻漿，離心再經(jīng)酸抽提和Sephadex G-50凝膠柱層析后，從小分子洗脫峰中分離所得到的一組低分子活性物質(zhì)。該物質(zhì)有八種蛋白，分子量分別為44kD、39.8kD、31.6kD、10kD、7.9kD、6.3kD、5.3kD和5.0kD。其中5.3kD的蛋白可被陽離子交換柱CM-SepharoseCL-6B強烈吸附，是一種堿性蛋白。
圖1為小分子肽類SDS-PAGE電泳圖，其中1.標準蛋白(由上往下分別為溶菌酶14,300Da，β-乳球蛋白18,400，碳酸酐酶29,000Da，卵清蛋白43,000，牛血清白蛋白68,000Da磷酸化酶B97,400；肌球蛋白(重鏈)200,000)；2.牡蠣酸提物；3.牡蠣低分子活性物質(zhì)；4陽離子交換柱柱層析峰。
本發(fā)明所說的BPO-L制備方法參見圖2，其步驟如下1 牡蠣酸提物的制備將新鮮的牡蠣按1∶1(v/v)的比例和Tris-HCl緩沖液混勻，置于組織勻漿機勻漿。收集勻漿液，高速冷凍離心機，4℃離心，棄上清。將收集的沉淀重新懸浮于Tris-HCl緩沖液中，重復勻漿，反復共3次。最后收集的細胞碎片懸浮于20mMHCl中，置于組織勻漿機充分勻漿。收集勻漿液，4℃離心并收集上清。沉淀重新用20mmol/L HCl反復抽提。收集所有的上清液置冷凍干燥機干燥后即為牡蠣酸提物。
2 牡蠣低分子活性肽的分離提取與脫鹽將Sephadex G-50凝膠溶于雙蒸水中并置于沸水浴中，使其充分溶脹，加入凝膠緩沖液稀釋到適當?shù)臐舛?。然后將Sephadex G-50膠緩慢的灌入已經(jīng)垂直裝好的層析柱中(100×φ3.0cm)中使其自然沉降并保留適當?shù)闹撸胶饩彌_液平衡過夜。將冷凍干燥的牡蠣酸提物溶解于洗脫液中，通過長嘴吸管將酸提物溶解液緩慢的加到膠面上，40mL/h流速洗脫，核酸蛋白檢測儀280nm檢測，XWT-S型小型臺式記錄儀記錄，人工收集含有牡蠣低分子活性組分的峰2冷凍干燥。參見圖3(葡聚糖凝膠柱Sephadex G-50洗脫曲線)。
再稱取Sephadex G-25凝膠，沸水溶脹。Tris-HCl緩沖液稀釋，緩慢灌入垂直裝好的層析柱(20×φ2.0cm)中，Tris-HCl緩沖液平衡過夜。將含有Cl-離子的牡蠣低分子活性組分溶解于加樣緩沖液里，100mL/h流速洗脫，核酸蛋白檢測儀280nm處檢測、記錄(參見圖4)，人工收集牡蠣低分子活性組分(即為牡蠣低分子活性肽，BPO-L)，冷凍干燥后-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 3 牡蠣低分子活性肽離子交換柱層析把CM-SepharoseCL-6B凝膠沸水浴充分溶脹，NaAc-HAc緩沖液稀釋后緩慢的灌入垂直裝好的玻璃層析柱(20×φ1.5cm)中，自然沉降，NaAc-HAc緩沖液平衡過夜。將SephadexG-25峰3的凍干品溶解于NaAc-HAc緩沖液中，1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0后，加到柱平面上，緩沖液以80mL/h流速洗脫，核酸蛋白檢測儀280nm處檢測，人工收集含有牡蠣低分子活性肽的峰3(參見圖5，其中↓處表示更換強離子洗脫液)，待基線平衡后，改用NaAc-HAc緩沖液(pH6.0含1.5mol/L NaCl)洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BPO-L的大部分蛋白組分由于不含有堿性氨基酸或含有堿性氨基酸很少而和離子交換柱結(jié)合較弱，因而很容易被洗脫下來，只有少部分蛋白組分帶有強烈的正電荷能夠和離子交換柱上的陽離子發(fā)生交換，強烈吸附，而出現(xiàn)在最后的高離子強度的洗脫峰中。收集此蛋白峰。冷凍干燥，-20℃暫存。
4 牡蠣低分子活性物質(zhì)的SDS-PAGE凝膠電泳按表1，2配制電泳緩沖液以及濃縮膠和分離膠。
表1

表2

先60V恒壓電泳1h后升電壓到90V繼續(xù)恒壓電泳1h。電泳結(jié)束后按常規(guī)聚丙烯酰胺電泳的方法剝膠、固定染色、脫色后獲得結(jié)果，并進行掃描(參見圖1)。結(jié)果顯示牡蠣酸提物由多種蛋白組成，而牡蠣低分子活性肽則主要含有8種小分子蛋白，但經(jīng)離子交換柱層析純化后，其牡蠣低分子活性肽蛋白組分被充分分離，得5.3kD的小分子帶(參見圖5)。
牡蠣低分子活性肽分離所用儀器設(shè)備見表3表3

BPO-L分離所需試劑見表4表4

以下給出BPO-L在制備抗癌藥物中應(yīng)用的實驗資料。
以肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞(引自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心)為實驗模型，研究了牡蠣低分子活性肽對腫瘤細胞的生物學效應(yīng)，所得結(jié)果如下1.BPO-L對人肺腺癌A549細胞增殖抑制作用1)生長曲線測定細胞生長曲線測定結(jié)果顯示人肺腺癌A549細胞增殖速度較快，當接種細胞數(shù)為5×104/mL時，連續(xù)計數(shù)至第7d，細胞數(shù)為129.7×104/mL，為原來的25.94倍，其倍增時間為35.7小時。但經(jīng)不同濃度的BPO-L處理后，A549細胞生長狀態(tài)分別受到不同程度的抑制，其中0.06mg/ml BPO-L處理7d，細胞計數(shù)結(jié)果為88.1×104/mL，細胞數(shù)為原來的17.62倍，和對照組細胞細胞相比，生長抑制率為31.7％(p＜0.01)。0.1mg/ml BPO-L連續(xù)處理7d，細胞減少至78.1×104/mL，為原來的15.62倍，細胞生長抑制率為39.5％，與對照組細胞相比較，具有極顯著性差異(p＜0.01)。而經(jīng)0.15mg/ml BPO-L處理7d后，細胞計數(shù)結(jié)果為65.1×104/mL，細胞數(shù)僅為原來的13.02倍，細胞生長抑制率高達49.8％(p＜0.01)(參見圖6)。由于0.06mg/ml BPO-L對細胞生長的抑制率相對較低，而0.1mg/ml BPO-L對細胞生長的抑制率雖不如0.15mg/ml的高，但0.1mg/ml BPO-L處理時細胞鋪展已較為明顯，細胞生長已受到明顯抑制，因此根據(jù)誘導分化處理原理及超微結(jié)構(gòu)觀察，本研究選擇0.1mg/mlBPO-L作為處理A549細胞的適宜濃度。
2)分裂指數(shù)觀察細胞有絲分裂指數(shù)觀察結(jié)果顯示，A549細胞分裂能力旺盛，在接種第4d后達到分裂高峰，細胞分裂指數(shù)值為34.2‰。而經(jīng)0.1mg/ml BPO-L處理后，細胞的分裂指數(shù)呈下降趨勢，但分裂高峰和對照組一樣，均在接種的第4d(加藥處理后第三天)達到分裂高峰，分裂高峰值為24.3‰，抑制率達28.95％(p＜0.01)(參見圖7)。
3)細胞周期測定應(yīng)用流式細胞儀檢測BPO-L處理對人肺腺癌A549細胞周期分布的影響。檢測結(jié)果顯示，對照組A549細胞G0/G1期細胞比例為46.8％，S期細胞占17.4％，而G2/M期細胞占15.2％。亞G1期細胞占12.9％。經(jīng)0.1mg/ml BPO-L處理后，A549細胞周期出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻抑現(xiàn)象(參見圖8)。其中G0/G1期細胞比例由46.8％上升為51.3％，而S期細胞明顯較少，由17.4％下降為9.9％，G2/M期細胞比例略有下降，由原來的15.2％下降為11.3％，另外，BPO-L處理組的亞G1期細胞比例也明顯上升，由12.9上升到21.5％。
2.BPO-L對人肺腺癌A549細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)變化的影響1)光學顯微鏡觀察光鏡下可見A549細胞具有人肺腺癌細胞典型的形態(tài)特征。排列不規(guī)則，多以大小不同的上皮樣細胞為主，呈同時較常見癌巨細胞、多核細胞以及多極分裂相等。細胞體積較大，細胞核大，核形不規(guī)則，常見畸形核，核內(nèi)常見多個核仁；細胞質(zhì)較少，HE染色不均勻，著色深淺不一。
A549細胞經(jīng)0.1mg/ml BPO-L處理后，均出現(xiàn)細胞體積增大，趨于鋪展狀態(tài)的變化。其中經(jīng)0.1mg/ml BPO-L處理后，A549細胞體積增大，趨向鋪展狀態(tài)十分明顯，細胞核形狀較為規(guī)則，核仁數(shù)量減少，細胞質(zhì)比較豐富，HE染色較為均勻。參見圖9的圖版，圖版說明如下圖版9-1為A549細胞，×536；圖版9-2為0.1mg/ml BPO-L處理的A549細胞，×536。
2)透射電子顯微鏡觀察透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，A549細胞體積比較大，核質(zhì)比例較大，細胞核形狀不規(guī)則，核膜向核內(nèi)有不同程度的凹陷，核仁數(shù)量相對較多，大小不一。細胞核內(nèi)異染色質(zhì)多，除核內(nèi)膜與核仁部位，還有一些呈團塊的散在分布。細胞質(zhì)內(nèi)線粒體體積小，形狀不規(guī)則。高爾基體較少見，體積小，高爾基體囊數(shù)目少，排列不規(guī)則，極性不明顯，高爾基體囊腔有明顯的膨脹現(xiàn)象，甚至呈泡狀化，粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不發(fā)達，呈散在分布，細胞質(zhì)多聚合糖體較多，游離核糖體較少。另細胞質(zhì)含大小，數(shù)量不一的分泌顆粒，參見圖10的圖版，圖版說明如下圖版10-1為透射電鏡觀察A549細胞，×4000；N(細胞核)Nu(核仁)Mi(線粒體)Er(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))G(高爾基體)SG(分泌顆粒)圖版10-2為A549細胞局部，示A549細胞線粒體(Mi)結(jié)構(gòu)，×5000；圖版10-3為A549細胞局部，示細胞核(N)結(jié)構(gòu)，×8000；
圖版10-4為A549細胞局部，示A549細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Er)、分泌顆粒(SG)結(jié)構(gòu)以及多聚核糖體(↑)分布，×20000；圖版10-5為A549細胞局部，示A549細胞線粒體(Mi)，×8000。
0.1mg/ml BPO-L處理后的A549細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，核質(zhì)比減小，細胞核的形狀趨向規(guī)則，呈圓形或卵圓形，細胞核內(nèi)異染色質(zhì)明顯減少，而常染色質(zhì)增多。高爾基體呈典型發(fā)達狀態(tài)。粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量明顯增多，長度長，多聚合糖體減少而游離核糖體增多，使細胞質(zhì)呈電子密度均勻分布。分泌顆粒明顯增多，參見圖11的圖版，圖版說明如下圖版11-1為經(jīng)0.1mg.ml BPO-L處理后，A549細胞形態(tài)，×4000；圖版11-2為BPO-L處理組細胞，示細胞質(zhì)內(nèi)細胞器，×14000；圖版12-3為BP0-L處理組細胞，示細胞核(N)形態(tài)，×8000；圖版11-4為BPO-L處理組細胞，示線粒體(Mi)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Er)、分泌顆粒(SG)分布，×14000；圖版11-5為BPO-L處理組細胞，BPO-L處理組細胞，示線粒體(Mi)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Er)結(jié)構(gòu)，×14000。
3.BPO-L對A549細胞相關(guān)癌基因與抑癌基因表達的影響，參見圖12的圖版，圖版說明如下圖版12-1為免疫細胞化學觀察示A549細胞c-myc基因表達產(chǎn)物的表達；圖版12-2為免疫細胞化學觀察示A549細胞誘導處理后c-myc基因表達產(chǎn)物變化；圖版12-3為免疫細胞化學觀察示A549細胞p53基因表達產(chǎn)物的表達；圖版12-4為免疫細胞化學觀察示A549細胞誘導處理后p53基因表達產(chǎn)物變化；圖版12-5為免疫細胞化學觀察示A549細胞p21基因表達產(chǎn)物的表達；圖版12-6為免疫細胞化學觀察示A549細胞誘導處理后p21基因表達產(chǎn)物變化；圖版12-7為免疫細胞化學觀察示A549細胞Rb基因表達產(chǎn)物的表達；圖版12-8為免疫細胞化學觀察示A549細胞誘導處理后Rb基因表達產(chǎn)物變化。
1)BPO-L對人肺腺癌A549細胞c-myc蛋白表達的影響免疫細胞化學檢測顯示，A549細胞c-myc基因的表達陽性，棕黃色產(chǎn)物分布在細胞質(zhì)區(qū)域，細胞核內(nèi)幾乎沒有表達。經(jīng)過BPO-L處理后，A549細胞中的c-myc蛋白表達有一定程度的下降，細胞免疫反應(yīng)呈陽性，分布在細胞核膜周圍的細胞質(zhì)中。
2)BPO-L對人肺腺癌A549細胞MTp53蛋白表達的影響免疫細胞化學檢測顯示，A549細胞對照組尤其是球形細胞中MTp53蛋白免疫顯色呈強陽性，反應(yīng)產(chǎn)物為深棕黃色顆粒，主要分布在細胞核及核周邊細胞質(zhì)區(qū)域，細胞其他區(qū)域分布相對較少。陽性表達率接近100％。經(jīng)過BPO-L處理后，A549細胞中的MTp53蛋白明顯下降。免疫細胞化學反應(yīng)為弱陽性，棕色反應(yīng)產(chǎn)物主要分布在核仁區(qū)域和核周邊細胞質(zhì)區(qū)域。
3)BPO-L對人肺腺癌A549細胞p21WAF1/C1P1蛋白表達的影響免疫細胞化學檢測可見A549細胞內(nèi)p21WAF1/C1P1蛋白表達較弱，呈弱陽性顯色反應(yīng)，淡棕色反應(yīng)產(chǎn)物主要分布于細胞質(zhì)中，核內(nèi)僅有微量分布。
但經(jīng)0.1mg/ml BPO-L處理的細胞p21WAF1/C1P1蛋白表達均明顯增強，為陽性反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色，細胞質(zhì)內(nèi)p21WAF1/C1P1蛋白表達產(chǎn)物明顯增加，主要分布于核周邊細胞質(zhì)區(qū)域，細胞核內(nèi)的蛋白分布也明顯增多。
4)BPO-L對人肺腺癌A549細胞Rb蛋白表達的影響蛋白免疫細胞化學結(jié)果顯示，對照組A549細胞內(nèi)呈弱陽性表達，淡棕色的反應(yīng)產(chǎn)物均勻的分布在整個細胞中。0.1mg/ml BPO-L處理可明顯提高細胞內(nèi)Rb蛋白產(chǎn)物的含量，顯色反應(yīng)較強，反應(yīng)產(chǎn)物呈黃棕色。
權(quán)利要求
1.牡蠣低分子活性肽，其組份含有八種蛋白，分子量分別為44kD、39.8kD、31.6kD、10kD、7.9kD、6.3kD、5.3kD和5.0kD，其中5.3kD的蛋白可被陽離子交換柱瓊脂糖凝膠CM-SepharoseCL-6B強烈吸附，是一種堿性蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的牡蠣低分子活性肽的制備方法為1)、將牡蠣勻漿，收集勻漿液；2)、對牡蠣勻漿液酸抽提，收集上清液；3)、對牡蠣勻漿上清液進行分子篩層析，收集含有牡蠣低分子活性肽組份；4)、對含有牡蠣低分子活性肽組份進行脫鹽，收集BPO-L；5)、將獲得的BPO-L進行離子交換柱層析。
3.如權(quán)利要求2所述的牡蠣低分子活性肽的制備方法，其特征在于在牡蠣勻漿時，加入Tris-HCl緩沖液，其含量為新鮮牡蠣與Tris-HCl緩沖液的體積比為1∶1。
4.如權(quán)利要求2所述的牡蠣低分子活性肽的制備方法，其特征在于對牡蠣勻漿液采用酸抽提時，用20mmol/L HCl至少抽提兩次，收集所有的上清液置冷凍干燥機后即為牡蠣酸提物。
5.如權(quán)利要求2所述的牡蠣低分子活性肽的制備方法，其特征在于所說的分子篩層析將牡蠣酸提物溶解于洗脫液中，再將牡蠣酸提物溶解液加到層析柱的葡聚糖凝膠SephadexG-50膠面上洗脫。
6.如權(quán)利要求2所述的牡蠣低分子活性肽的制備方法，其特征在于所說的脫鹽將含有Cl-離子的BPO-L溶解于加樣緩沖液里，再將其加到層析柱的葡聚糖凝膠Sephadex G-25上洗脫。
7.如權(quán)利要求2所述的牡蠣低分子活性肽的制備方法，其特征在于所說的離子交換柱層析將BPO-L溶解于NaAc-HAc緩沖液中，再加到離子交換柱的瓊脂糖凝膠CM-SepharoseCL-6B平面上洗脫。
8.牡蠣低分子活性肽在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的牡蠣低分子活性肽在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于在制備抗肺腺癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
涉及一種首次從自然界分離提取的多肽和制備方法及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。牡蠣低分子活性肽其組份含有八種蛋白，分子量分別為44kD、39.8kD、31.6kD、10kD、7.9kD、6.3kD、5.3kD和5.0kD，其中5.3kD的蛋白可被陽離子交換柱瓊脂糖凝膠CM－SepharoseCL－6B強烈吸附，是一種堿性蛋白。采用酸抽提和分子篩層析方法有效地對牡蠣進行抽得和分離提取，獲得BPO－L，既能使牡蠣細胞中的蛋白得到充分的抽提，又能使蛋白活性得到最大限度的保留。并且具有明確的抗腫瘤活性作用，能有效地干預癌細胞相關(guān)癌基因與抑癌基因表達，進而誘導癌細胞分化。
文檔編號C07K1/00GK1478792SQ0214171
公開日2004年3月3日 申請日期2002年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者李祺福 申請人:廈門大學