專利名稱：一種新型免疫抑制融合蛋白、其編碼核酸及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學、免疫學和藥物設(shè)計學領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種新型免疫抑制融合蛋白、其編碼核酸及其用途。
背景技術(shù)：
異體造血干細胞移植(HSCT)及實體臟器器官移植已經(jīng)成為迄今為止醫(yī)治各種惡性血液病、遺傳性疾病、重度放射病以及重癥聯(lián)合免疫缺陷等頑癥和各種臟器功能衰竭的最有效方法之一。由于供-受者間組織相容復合體(MHC)的差異(當然還有其它諸多未知因素)，不可避免的要發(fā)生移植物抗宿主病(GVHD或GVHR)和宿主抗移植物反應(HVGD)，這是導致異體HSCT和器官移植失敗最重要的原因之一。因此，GVHD和HVGD已成為臨床上異體HSCT和器官移植面臨的最大障礙。然而，目前已研制并使用的多種預防和控制GVHD和HVGD的免疫抑制聯(lián)合措施存在的最大缺陷就是，靶向特異性差、全身性毒副作用大、免疫耐受期短。因此，迫切需要能改善或克服上述免疫抑制方法存在的弊端，創(chuàng)造出新一代能特異的防治或減弱GVHD和HVGD的措施。
目前公認，在眾多參與移植排斥反應的細胞因素中，CD4+、CD8+T細胞處于中樞地位，它從激活到發(fā)揮生物效應需經(jīng)三個階段。對這三個階段分別進行的體外阻斷實驗發(fā)現(xiàn)，第一、二階段的阻斷只起到了免疫抑制作用，而阻斷第三階段B7CD28/CTLA4共刺激信號系統(tǒng)(簡稱B7CD28/CTLA4)，T細胞就產(chǎn)生了免疫無能(anergy)。例如在初級免疫應答中，無論使用抗CD28Fab還是CTLA4-Ig阻斷B7CD28/CTLA4共刺激信號系統(tǒng)均能顯著地抑制次級免疫應答。更重要的是，在初級免疫應答中只有在B7分子的參與下才能發(fā)生次級免疫應答，說明B7CD28/CTLA4系統(tǒng)無論是在介導初級免疫應答還是次級免疫應答中都起到?jīng)Q定性作用。
更令研究者驚喜的突破性進展是，利用鼠體內(nèi)模型可完全證明上述體外實驗的發(fā)現(xiàn)，即當體內(nèi)阻斷了B7CD28/CTLA4系統(tǒng)后則能導致免疫耐受，不但可使受體鼠長期耐受同種鼠的移植物，而且能長期耐受異種甚或人類抗原。如將人的胰島細胞移植到人工誘發(fā)糖尿病小鼠的腎小囊下并用新型重組CTLA4-Ig進行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組移植的人胰島細胞不僅功能正常，而且未出現(xiàn)移植排斥的任何組織學證據(jù)；再取原供者人的胰島細胞移植給這些小鼠，CTLA4-Ig治療組移植物存活時間明顯延長，而Ig對照組則不能。提示CTLA4-Ig在體內(nèi)能引起宿主對移植物的特異性耐受。隨后的異種鼠心臟移植和MHC不匹配動物間的骨髓移植實驗均加證實，在特定環(huán)境下，CTLA4-Ig可有效地延長移植物的存活時間，而不需要其它免疫抑制劑的參與，并且CTLA4-Ig治療還不影響造血功能的重建。1999年美國Harvard大學的科學家在國際上首次報道，應用重組CTLA4-Ig阻斷B7CD28/CTLA4系統(tǒng)防治患者造血細胞移植后的GVHD取得顯著療效(Guinan等人，N.Engl.J.Med.1999，3401704-1714)，從而為這一策略的更深入研究尤其是臨床應用奠定了堅實的基礎(chǔ)。因此，B7CD28/CTLA4系統(tǒng)無論是對于誘導免疫耐受還是在防治GVHD方面最為關(guān)鍵，正成為當今異體造血干細胞移植、移植免疫、器官移植和相關(guān)新型免疫抑制劑創(chuàng)新性開發(fā)研究領(lǐng)域最為關(guān)注的焦點。
然而，縱觀目前國際上探索B7CD28/CTLA4系統(tǒng)防治GVHD或誘導免疫耐受的研究手段，采用的均是以抗B7單抗/多抗抑或CTLA4-Ig來進行封閉或阻斷。其缺陷在于第一，無論是抗B7單抗/多抗抑或CTLA4-Ig的封閉或阻斷，誘導的免疫耐受期限太短；第二，僅僅封閉B7CD28/CTLA-4系統(tǒng)所誘導的T細胞免疫耐受可被移植后感染等因素所引起釋放的IL-2及其它細胞因子所逆轉(zhuǎn)，導致移植失?。坏谌?，封閉或阻斷時所用的抗B7單抗/多抗均為鼠源性，毒副作用大。因此，仍然需要新的免疫抑制劑，以便更為有效地抑制免疫排斥，治療自身免疫疾病。
本發(fā)明的一個目的在于提供一種融合蛋白，其中含有免疫配基或其功能性片段或衍生物與毒素蛋白的融合體，能夠特異性靶向淋巴細胞，從而選擇性殺傷參與移植排斥或自身免疫疾病的淋巴細胞。
發(fā)明簡述、在本領(lǐng)域中眾所周知，受體與其相應配基之間具有很高的結(jié)合特異性。發(fā)明人利用這一特異性來靶向性導入能夠殺傷淋巴細胞的毒素蛋白，在選擇性阻斷免疫系統(tǒng)激活途徑的同時還殺死相關(guān)淋巴細胞，從而達到特異性防治GVHD及誘導免疫耐受的效果。
本發(fā)明一方面提供了一種融合蛋白，其中包含免疫配基與毒素蛋白的融合體。
本發(fā)明另一方面提供了編碼所述融合蛋白的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了含有所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達載體、宿主細胞。
本發(fā)明還提供了所述融合蛋白的生產(chǎn)方法及其用途。


圖1為B7-2和B7-1胞外區(qū)cDNA片段PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖。M為DL2000PCR分子量標志，泳道1為B7-1 cDNA胞外區(qū)擴增產(chǎn)物；泳道2為B7-2 cDNA胞外區(qū)擴增產(chǎn)物。
圖2為pRSET-B7-2-PE40KDEL重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為含pRSET-B7-2-PE40KDEL重組質(zhì)粒的宿主細胞BL-21-CodonPlus-RIL的全細胞裂解產(chǎn)物SDS-PAGE電泳結(jié)果。M1為蛋白質(zhì)分子量標記。泳道1為未誘導的全細胞裂解產(chǎn)物，泳道2和3為誘導的全細胞裂解產(chǎn)物。
圖4為表達菌體BL21(DE3)pLysS/pRSETA-B7-2-DE40KDEL融合蛋白含量掃描結(jié)果。
圖5為pRSETA-B7-2-DE40KDEL重組載體表達情況的Western印跡分析。M2為蛋白質(zhì)分子量標記；泳道4為未誘導的全細胞裂解產(chǎn)物；泳道5和6為誘導的全細胞裂解產(chǎn)物。
圖6為重組融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL對Jurkat和Raji細胞系的細胞毒殺傷活性圖。
序列說明SEQ ID NO1和3分別為重組免疫抑制融合體B7-2-PE40KDEL的核苷酸序列及相應的氨基酸序列。
SEQ ID NO2和4為重組免疫抑制融合體B7-1-PE40KDEL的核苷酸序列及相應的氨基酸序列。
SEQ ID NO5為正向引物PF7-2A的序列。
SEQ ID NO6為反向引物PR7-2A的序列。
SEQ ID NO7為正向引物PF7-1A的序列。
SEQ ID NO8為反向引物PR7-1A的序列。
SEQ ID NO9和11分別為B7-2胞外區(qū)的核苷酸序列及相應的氨基酸序列。
SEQ ID NO10和12分別為B7-1胞外區(qū)的核苷酸序列及相應的氨基酸序列。
SEQ ID NO13為正向引物PF7-2B的序列。
SEQ ID NO14為反向引物PR7-2B的序列。
SEQ ID NO15為正向引物PF7-1B的序列。
SEQ ID NO16為反向引物PR7-1B的序列。
SEQ ID NO17為正向引物PF-PEA的序列。
SEQ ID NO18為反向引物PR-PEA的序列。
SEQ ID NO19為反向引物PR-PEB的序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種融合蛋白，其中包含免疫配基與毒素蛋白的融合體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“免疫配基”是指能與淋巴細胞，如T淋巴細胞上的細胞受體相結(jié)合，參與免疫反應途徑如第二信號系統(tǒng)激活的分子，包括天然配基或者其變體、衍生物或部分，它們基本上保留了與相應細胞受體相結(jié)合的能力。
在一個實施方案中，所述免疫配基的相應受體存在于部分或全部淋巴細胞上。更優(yōu)選地，所述配基是B7例如B7-1、B7-2、B7-3、BB1或CD40L等。進一步地，所述配基是B7，其能夠與細胞受體CD28相結(jié)合。
任選地，所述配基是B7-1。同樣優(yōu)選地，所述配基是B7-2。其可以來源于哺乳動物，包括人、小鼠、大鼠等。
本發(fā)明融合蛋白質(zhì)中的免疫配基可以是全長蛋白，或者是其片段、衍生物或變體等，它們基本上保留了所希望的目的活性，在此處是指與相應受體相結(jié)合的活性。在一個實施方案中，融合蛋白中的免疫配基是包含其胞外結(jié)構(gòu)域的片段。
衍生物可以是下列各種多肽(i)其中一個或多個氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)取代，或(ii)其中另外的氨基酸與之相融合，如前導序列或分泌序列或用于純化多肽的序列或蛋白原序列。鑒于本文的教導，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難掌握這種片段和衍生物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應當認識到，免疫配基多肽的一些氨基酸序列可以改變，而不會顯著影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能。如果分析序列中的這種差異，應能記得蛋白質(zhì)中存在決定活性的至關(guān)重要的區(qū)域。一般而言，可以取代形成三級結(jié)構(gòu)的殘基，只要使用行使類似功能的殘基即可。在其它場合下，如果變化發(fā)生在蛋白質(zhì)的非重要區(qū)域，那么殘基的類型有可能完全不重要。
因此，本發(fā)明另外包括基本上表現(xiàn)出能夠與相應細胞受體結(jié)合的免疫配基的各種變異體和片段。這種變異體包括缺失、插入、倒位、重復和類型取代(如原則是用一種親水的殘基取代另一種親水的殘基，而不是用強親水的殘基取代強疏水的殘基)。小的變化或這種“中性的”氨基酸取代一般對活性影響很小。
下文所示的是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的保守氨基酸取代的例子芳香族苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸疏水的亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸極性的谷氨酰胺，天冬酰胺堿性的精氨酸，賴氨酸，組氨酸酸性的天冬氨酸，谷氨酸小的丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甲硫氨酸，甘氨酸用于本發(fā)明的毒素蛋白可以是植物毒素如 蓖麻毒素、植物凝集素、相思豆毒蛋白或者細菌毒素等對細胞具有殺傷能力的蛋白質(zhì)，細菌毒素的實例包括但不限于白喉毒素、志賀氏毒素、假單胞菌外毒素如綠膿桿菌外毒素等。
在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“毒素蛋白”不僅包括天然蛋白，也包括其變體、衍生物和片段等，它們具有與親本蛋白基本相同的殺細胞活性。有關(guān)“變體”、“衍生物”、“片段”的定義參見關(guān)于“免疫配基”的內(nèi)容。
在本發(fā)明的融合蛋白中，免疫配基可以直接和毒素蛋白相連接。優(yōu)選地，它們通過包含一或多個氨基酸的連接肽相連。該連接肽可以具有1-100個氨基酸，優(yōu)選具有1-50、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5個氨基酸。進一步優(yōu)選地，所述連接肽是(Gly4Ser)4。
本發(fā)明的融合蛋白可以經(jīng)基因工程生產(chǎn)，也可以化學合成?；蛘?，本發(fā)明的融合蛋白中，可以有一個或多個氨基酸殘基包含取代基。另外，本發(fā)明的融合蛋白還可以與另外的化合物，如提高多肽半壽期的化合物(如聚乙二醇)相連接。這些衍生物均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
多核苷酸本發(fā)明也包括編碼所述融合蛋白的多核苷酸，其中編碼序列可以在相同的閱讀框中與有助于宿主細胞表達和分泌多肽的多核苷酸序列(例如作為分泌序列行使功能以控制從細胞中轉(zhuǎn)運出多肽的前導序列)融合。
本發(fā)明的多核苷酸也可以具有在框內(nèi)與一種標記序列融合的編碼序列，所述標記序列可用于純化本發(fā)明的多肽。在宿主為細菌的情況下，該標記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標記物以純化與標記序列融合的成熟多肽，或例如，當使用哺乳動物宿主，如COS-7細胞時，標記序列也可以是血凝素(HA)標記物。HA標記物相當于得自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson，I等，細胞，37767(1984))。
載體和宿主細胞本發(fā)明也涉及包括編碼本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸的載體，用重組載體進行基因工程改造的宿主細胞，和通過重組技術(shù)生產(chǎn)融合蛋白的方法。
用本發(fā)明的載體對宿主細胞進行基因工程改造(轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)，所述載體可以是例如克隆載體或表達載體。載體的形式可以是例如質(zhì)粒，病毒顆粒，噬菌體等等。
通過重組技術(shù)可將本發(fā)明的多核苷酸用于生產(chǎn)多肽，因此，例如，所述多核苷酸可包含在多種表達載體中的任一種中以表達多肽。這種載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；細菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；衍生自質(zhì)粒和噬菌體DNA、病毒DNA(如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒和假狂犬病病毒)之聯(lián)合的載體。然而，只要能在宿主中復制和存活，任何其它的載體都可使用。
表達載體中的DNA序列與適當?shù)谋磉_控制序列(啟動子)有效地相連以介導其合成。至于這種啟動子的代表性例子，應提及的有LTR或SV40啟動子，大腸桿菌lac或trp，噬菌體λPL啟動子和已知能控制原核細胞或真核細胞或它們的病毒中的基因表達的其它啟動子。表達載體也含有用于起始翻譯的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。載體也包括用于增強表達的適當序列。
另外，表達載體優(yōu)選含有一個或多個選擇性標記基因以提供可用于選擇已轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如用于真核細胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或大腸桿菌中的四環(huán)素和氨芐青霉素抗性。
可使用含有上文所述適當?shù)腄NA序列以及適當?shù)膯幼踊蚩刂菩蛄械妮d體來轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗饕允顾拗鞅磉_蛋白質(zhì)。
至于適當宿主的代表性例子，應提及的有細菌細胞，如大腸桿菌，鏈霉菌，鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞，如果蠅S2和Spodoptera Sf9；動物細胞，如CHO，COS或Bowes黑素瘤細胞；腺病毒；植物細胞等。根據(jù)本文的教導，本領(lǐng)域技術(shù)人員應能掌握如何選擇適當?shù)乃拗鳌?br> 使用衍生自本發(fā)明DNA構(gòu)建體的RNA，也可利用無細胞的翻譯系統(tǒng)來產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)?？稍谠撕驼婧怂拗髦惺褂玫倪m當?shù)目寺『捅磉_載體描述于Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，紐約(1989)，該文獻已列入本文作為參考。
通過在載體中插入增強子序列可增加高等真核細胞對編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強子是對啟動子起作用以增加其轉(zhuǎn)錄的順式作用的DNA元件，例子包括巨細胞病毒早期啟動子增強子和腺病毒增強子等。
為了將翻譯的蛋白質(zhì)分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、外周質(zhì)空間或胞外環(huán)境中，可將適當?shù)姆置谛盘枔饺氡槐磉_的多肽中。
多肽可以經(jīng)修飾的形式被表達。多肽不僅可包括分泌信號，也可包括其它的異源功能區(qū)域。例如，可在多肽的N-末端加上另外的氨基酸區(qū)域，尤其是帶電的氨基酸以改善多肽在宿主細胞中、純化過程中或隨后的處理和儲存過程中的穩(wěn)定性和持久性。也可以在多肽中加入肽組成成分以便于純化，最終制備多肽之前可除去這類區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知在多肽中加入肽組成成分以引發(fā)分泌或外泌，改善穩(wěn)定性和便于純化等等，這是本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)技術(shù)。
轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株并將宿主菌株培養(yǎng)至適當?shù)募毎芏戎?，通過適當?shù)姆绞?如溫度變化或化學誘導)誘導選定的啟動子，并將細胞再培養(yǎng)一段時間。
一般通過離心收獲細胞，通過物理或化學方法破碎細胞，保留所得的粗提取物以進一步純化。
通過包括冷凍-融化循環(huán)，超聲處理，機械破碎，或使用細胞裂解劑等在內(nèi)的任何便利方法可破碎用于表達蛋白質(zhì)的微生物細胞，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
可使用多種哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達重組蛋白，哺乳動物表達系統(tǒng)的例子包括Gluzman，細胞，23175(1981)所述的猴腎成纖維細胞COS-7系，以及能表達可容性載體的其它細胞系，如C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體可含有復制起點，合適的啟動子和增強子，和任何必需的核糖體結(jié)合位點，聚腺苷酸化位點，剪接供體和受體位點，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5’側(cè)翼的非轉(zhuǎn)錄序列。可使用得自SV40剪接和聚腺苷酸化位點的DNA序列提供所需的非轉(zhuǎn)錄的遺傳元件。
通過包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陽離子或陰離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析和凝集素層析等的方法從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明融合蛋白。最后，可使用高效液相層析(HPLC)完成最終的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是化學合成方法的產(chǎn)物，或由原核或真核宿主(如培養(yǎng)中的細菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動物細胞)通過重組技術(shù)產(chǎn)生。取決于重組生產(chǎn)方法中所用的宿主，本發(fā)明的融合蛋白可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本發(fā)明的融合蛋白也可以包括起始甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明的融合蛋白或多核苷酸可用于抑制過度的或不必要的免疫反應。在一個實施方案中，所述過度的或不必要的免疫反應是移植物抗宿主排斥或宿主抗移植物排斥。在另一個實施方案中，所述免疫反應是自身免疫性疾病，包括但不限于類風濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、牛皮癬、強直性脊柱炎、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥、胰島素依賴性糖尿病等。
藥物組合物可將本發(fā)明的多肽與適當?shù)乃幱幂d體聯(lián)合使用以制成藥物組合物。這種組合物含有治療有效量的本發(fā)明融合蛋白和藥學可接受的載體或賦形劑。所述載體包括但不限于鹽水，緩沖鹽溶液，葡聚糖，水，甘油，乙醇及其聯(lián)合。制劑應適合施用的模式。
本發(fā)明的融合蛋白可在藥物組合物中與一種或多種藥學可接受的賦形劑聯(lián)合施用。應理解當施用于人患者時，護理醫(yī)生在正確的醫(yī)學判斷范圍內(nèi)可決定本發(fā)明藥物組合物每天的總用量。任何具體患者的特定治療有效劑量水平取決于多種因素，包括欲達到的反應的類型和程度，所用其它藥劑的特殊組合(如果有的話)；患者的年齡，體重，健康狀況，性別和飲食；施用的時間，施用的途徑和組合物外泌的速率；治療的期限；與特定組合物聯(lián)合或同時使用的藥物(如化學治療劑)；和醫(yī)學領(lǐng)域眾所周知的其它因素。本領(lǐng)域已知的適當制劑見于Remington’s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack出版公司，Easton，PA。
考慮到各個患者的臨床條件、釋放的位點、施用的方法、施用的計劃和實際操作人員已知的其它因素，以與良好的醫(yī)學實踐一致的方式配制和服用治療所用的融合蛋白組合物。因此，通過上述考慮可確定用于本文目的的“有效量”的融合蛋白。
可以簡便的方式，如局部，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，動脈內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)或皮內(nèi)途徑施用所述藥物組合物。所施用藥物組合物的量應能有效地治療和/或預防過度的或不必要的免疫反應。
本發(fā)明的融合蛋白也可通過在體內(nèi)表達而得以應用，這就是常說的“基因療法”。
因此，例如，可離體用編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)對來自患者的細胞進行改造，然后將經(jīng)改造的細胞提供給需用該融合蛋白治療的患者。這種方法是本領(lǐng)域所熟知的方法。例如，可以通過本領(lǐng)域熟知的方法，利用含有編碼本發(fā)明融合蛋白之RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒對細胞進行改造。
類似地，可通過例如本領(lǐng)域熟知的方法，在體內(nèi)改造細胞以在體內(nèi)表達融合蛋白。本領(lǐng)域中已知，可給患者施用能產(chǎn)生含有編碼本發(fā)明融合蛋白之RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)者細胞以在體內(nèi)改造細胞并在體內(nèi)表達多肽。鑒于本發(fā)明的教導，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易地掌握用來施用本發(fā)明融合蛋白的這些和其它方法。例如，用于改造細胞的表達載體不僅可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒，也可以是腺病毒，所述腺病毒與適當?shù)膫鬟f載體聯(lián)合后可用于在體內(nèi)改造細胞。其它傳遞載體的例子包括基于HSV的載體系統(tǒng)，腺相關(guān)病毒載體，和惰性的載體，如包被有葡聚糖的鐵顆粒。
可從中得到上文所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于Moloney鼠白血病病毒，脾壞死病毒，如Rous肉瘤病毒，Harvey肉瘤病毒，禽白血病病毒，長臂猿白血病病毒(gibbon ape leukemiavirus)，人免疫缺損病毒，腺病毒，骨髓增殖性肉瘤病毒，和乳癌病毒。在一個實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體得自Moloney鼠白血病病毒。
載體包括一個或多個啟動子，可以使用的適當?shù)膯幼影ǖ幌抻谀孓D(zhuǎn)錄病毒的LTR；SV40啟動子；和人巨細胞病毒(CMV)啟動子(Miller等，生物技術(shù)，第7卷，9980-990(1989))或任何其它的啟動子(例如細胞啟動子，如包括但不限于組蛋白，polIII和β-肌動蛋白啟動子等的真核細胞啟動子)。可使用的其它病毒啟動子包括但不限于腺病毒啟動子，胸苷激酶(TK)啟動子，和B19細小病毒啟動子。鑒于本文的教導，合適啟動子的選擇對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸序列受適當啟動子的控制?？墒褂玫倪m當啟動子包括但不限于腺病毒啟動子，如腺病毒主要晚期啟動子；或異源啟動子，如巨細胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動子；誘導型啟動子，如MMT啟動子，金屬硫蛋白啟動子；熱休克蛋白啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人珠蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子，如單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子；逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR(包括上文所述的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR)；β-肌動蛋白啟動子；和人生長激素啟動子。啟動子也可以是天然啟動子。
可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導包裝細胞系以形成生產(chǎn)者細胞系?？杀晦D(zhuǎn)染的包裝細胞系的例子包括但不限于PE501，PA317，Ψ-2，Ψ-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，ΨCRE，ΨCRIP，GP+E-86，GP+envAm12和Miller，人基因療法，15-14(1990)(全文列入本文作為參考文獻)中所述的細胞系。載體可通過本領(lǐng)域已知的任何方法轉(zhuǎn)導包裝細胞。所述方法包括但不限于電穿孔，脂質(zhì)體的應用，和CaPO4沉淀?；蛘咭部蓪⒛孓D(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體包裹在脂質(zhì)體中，或與脂類偶聯(lián)，然后施用于宿主。
生產(chǎn)者細胞系產(chǎn)生含有編碼本發(fā)明融合蛋白之核酸序列的感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。然后可使用這種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)導真核細胞。經(jīng)轉(zhuǎn)導的真核細胞會表達編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸序列。
制備方法本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明融合蛋白的方法，該方法包括(a)在有利于所述融合蛋白產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細胞；和(b)回收該融合蛋白。
在本發(fā)明所述制備方法中，用本領(lǐng)域已知方法在適合多肽產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以在合適的培養(yǎng)基中，在允許多肽表達和/或分離的條件下，通過搖瓶培養(yǎng)、實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、分批加料或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。在包含碳和氮源以及無機鹽的合適的培養(yǎng)基中，采用本領(lǐng)域已知的步驟進行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可由供應商提供或者可以參照公開的組成(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述)來制備。如果多肽被分泌到培養(yǎng)基中，則可以直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以從細胞裂解物中回收。
可以用本領(lǐng)域已知方法回收所產(chǎn)生的多肽。例如，可以通過常規(guī)操作(包括，但不限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀)從培養(yǎng)基中回收多肽。
可以通過各種本領(lǐng)域已知的操作來純化本發(fā)明所述多融合蛋白，這些操作包括，但不限于層析(例如，離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、層析聚焦、和大小排阻層析)、電泳(例如，制備性等電點聚焦)、差示溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提(參見例如，蛋白質(zhì)純化，J.C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，New York，1989)。
下文以舉例說明的方式進一步闡述本發(fā)明，但并不意味著對本發(fā)明的限制。
實施例實施例1B7-2胞外區(qū)cDNA的克隆根據(jù)文獻已發(fā)表B7-2和B7-1基因序列，分別設(shè)計擴增編碼B7-2胞外區(qū)225aa和B7-1胞外區(qū)208aa cDNA的引物，并經(jīng)GOLDKEY軟件加以驗證。B7-2的引物序列為正向引物PF7-2A為5’-GCGGATCCGCTGCTCCTCTG-3’(SEQ ID NO5)，在5’端引入BamHI位點；反向引物PR7-2A為5’-CCCGGGTTAAGGAATGTGGTCTGG-3’(SEQ ID NO6)，在3端引入終止密碼子TAA及SmaI位點。B7-1引物為正向引物PF7-1A為5’-GCGGATCC-3’(SEQ ID NO7)，在5’端引入BamHI位點；反向引物PR7-1A為5’-CCCGGGTTA-3’(SEQ ID NO8)，在3’端引入終止密碼子TAA及SmaI位點。引物PF7-2A與PR7-2A以及PF7-1A與PR7-1A分別擴增編碼人B7-2及B7-1胞外區(qū)可變區(qū)1-225aa和1-208aa片段的cDNA，長度預計分別約為675bp和624bp。
以含B7-2225胞外區(qū)cDNA的pGEM-T-B7-2225(張惠麗等人，中國應用生理學雜志，2001，17(2)117-120)或B7-1208胞外區(qū)cDNA的pGEM-T-B7-1208重組質(zhì)粒(張惠麗等人，中國應用生理學雜志，2001，17(2)117-120)為模板，利用引物PF7-2A與PR7-2A或者PF7-1A與PR7-1A，經(jīng)常規(guī)PCR進行擴增。反應條件是94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃1.5分鐘，25循環(huán)后72℃延伸10分鐘。1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增結(jié)果。參見圖1。
將PCR擴增產(chǎn)物純化后連接入pGEM-T載體(Promega公司)，轉(zhuǎn)化受體菌JM109，挑取陽性重組子，分別稱為pGEM-T-B7-2225(含B7-2225胞外區(qū))及pGEM-T-B7-1208重組質(zhì)粒載體(含B7-1208胞外區(qū))，對其中的插入片段進行序列測定。
結(jié)果顯示B7-2胞外區(qū)序列(SEQ ID NO9)除個別堿基發(fā)生改變外絕大部分與GenBank序列相一致，而B7-1胞外區(qū)序列(SEQ ID NO11)與GenBank序列完全一致。其相應的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO10和12。
實施例2新型重組免疫抑制毒素融合蛋白B7-PE40KDEL表達載體的構(gòu)建根據(jù)B7-2225、B7-1208和PE40靶基因序列，設(shè)計能擴增B7-2225、B7-1208和PE40的正、反向引物PF7-2B和PR7-2B、PF7-1B和PR7-1B以及PF-PEA和PR-PEA。為了進行融合構(gòu)建，使B7-2225、B7-1208與PE40KDEL基因間以柔性接頭(Gly4Ser)4相連接；在此基礎(chǔ)上，又設(shè)計了反向引物PR-PEB，PR-PEB與PR-PEA的不同之處是可使其5′的REDLK被置換為KDEL，并且在引物PF7-2B和PF7-1B中引入EcoRI和MunI酶切位點，在引物PF-PEA中包含一段引物PR7-2B和PR7-1B的重復序列，在引物PR-PEA中引入SmaI酶切位點及連接肽[(Gly4Ser)4]編碼序列。詳見表1。
表1.構(gòu)建含編碼B7-PE40KDEL融合基因的引物序列Table 1 Sequence of oligonucleotides for B7-PE40KDEL amplificationB7-2225PF7-2B5’-GCT GCT CCT CTG AAG ATT CAA G-3’(SEQ ID NO13)PR7-2B5’-CGA CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC GCT TCC ACCGCC TCC AGA TCC GCC GCC ACC AGG AAT GTG GTC TGG 3’(SEQ ID NO14)B7-1208PF7-1B5’-CGCGAATTCATG GTTATCCACGTGACC-3’(SEQ ID NO15)PR7-1B5’-CGA CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC GCT TCC ACC GCC TCC AGA TCC GCC GCC ACCGTT ATC AGG AAA ATG CTC TTG C-3’(SEQ ID NO16)PE40PF-PEA5’-TCG GGC GGT GGT GGG TCG GGC GGC AGC CTG GCC GCG CTG A-3’(SEQ ID NO17)PR-PEA5’-TCC CCC GGG GGA TTA CTT CAG GTC CTC GCG CGG CGG TTT G-3’(SEQ ID NO18)將PE40REDLK定點突變成→PE40KDELPR-PEB5’-TCC CCC GGG GGA TTA CAG CTC GTC CTT CGG CGG TTT GCC GGG CTG GCT-3’(SEQ ID NO19)
分別以含B7-1208或B7-2225胞外區(qū)的pGEM-T-B7-2225或pGEM-T-B7-1208重組質(zhì)粒載體為模板，并聯(lián)合含綠膿桿菌外毒素PE40基因的重組質(zhì)粒載體pZX-PEA(鄭黎燕等人，中華微生物學和免疫學雜志，2001，21(1)95-98)，利用引物PF7-2B和PR7-2B、PF7-1B和PR7-1B以及PF-PEA和PR-PEA，通過重疊延伸-PCR(SOE-PCR)策略來構(gòu)建所期望的B7-PE40KDEL融合基因。這需進行四次PCR反應。
第一次PCR反應是以質(zhì)粒pGEMT-B7-2為模板，以PF7-2B和PR7-2B為正、反向引物，所擴增的B7-2 cDNA為在其N端缺失16aa的完整胞外區(qū)，其長度片段為675bp，并使其5’端帶有接頭。
第二次PCR反應是以質(zhì)粒pZX-PEA為模板，以PF-PEA和PR-PEA為正、反向引物，使所擴增的PE40 DNA為刪除細胞結(jié)合功能區(qū)Ia但包含完整功能II、III區(qū)及Ib區(qū)的毒素基因，其長度片段為1083bp，并使其3’端帶有接頭。須指出的是，由于PE40基因GC含量較高，基因擴增過程中反應體系需加入一定濃度的二甲基亞砜或甘油，方能使擴增產(chǎn)物特異性極高。100ul體積PCR反應體系中包含100ng DNA模板、10×反應緩沖液、上、下游引物各10pmol、10mmol/l dNTP 10ul、25mmol/l MgSO46ul、二甲基亞砜10ul、Taq DNA聚合酶2U、雙蒸水補足體積100ul。PCR反應條件為98℃3min，循環(huán)參數(shù)94℃1min、55℃1min、72℃1.5min、25循環(huán)后、72℃延伸10min。
在第三次PCR反應中，以PF7-2B、PR-PEA為上、下游引物，以前兩次的PCR產(chǎn)物為模板，擴增構(gòu)建成B7-2-PE40融合基因。
最后進行第四次PCR反應，其中以PF7-2B、PR-PEB為正、反向引物，以B7-2-PE40融合基因為模板，使PE40功能III區(qū)羧基端最后5個氨基酸REDLK被定點置換成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白滯留序列KDEL，PCR反應產(chǎn)物回收后進行EcoRI/SmaI雙酶切插入pGEM-T載體，最終獲得的B7-2-PE40KDEL目的基因片段長度為1.8kb。B7-1-PE40KDEL的構(gòu)建亦采取上述相同策略，PCR反應產(chǎn)物回收后MunI/SmaI雙酶切亦可切下約1.8kb片段長度的基因。
將上述構(gòu)建好的B7-1-PE40KDEL及B7-2-PE40KDEL系列融合基因PCR擴增產(chǎn)物純化后連接入pGEM-T載體(Promega公司)，轉(zhuǎn)化受體菌JM109，挑取陽性重組子，分別稱為pGEM-T-B7-1-PE40KDEL及pGEM-T-B7-2-PE40KDEL基因載體。對其中的插入片段進行序列測定，結(jié)果顯示兩融合基因除在極少數(shù)位點發(fā)生某些堿基改變外，絕大部分與文獻報道完全一致，B7-2-PE40KDEL和B7-1-PE40KDEL的核苷酸序列參見SEQ ID NO1和3，其相應的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO2和4。
重組毒素蛋白融合蛋白B7-2-PE40KDE的一級結(jié)構(gòu)中有4個氨基酸發(fā)生了改變，其中有2個可能與二級結(jié)構(gòu)的改變相關(guān)，如PE40區(qū)的二級結(jié)構(gòu)改變是在PE40-II功能區(qū)啟始的15個氨基酸由β片層變?yōu)棣谅菪琍E40-III區(qū)的最末3個氨基酸則由β片層變?yōu)棣罗D(zhuǎn)角。
B7-1-PE40KDEL的一級結(jié)構(gòu)有3個氨基酸發(fā)生改變，二級結(jié)構(gòu)中PE40-II功能區(qū)起始的15個氨基酸由β片層變?yōu)棣谅菪?，PE40-III功能區(qū)的最末3個氨基酸由β片層變?yōu)棣罗D(zhuǎn)角。一級結(jié)構(gòu)中的氨基酸改變，只有一個可能與二級結(jié)構(gòu)的改變相關(guān)，當然也不排除柔性接頭影響了二級結(jié)構(gòu)的可能性。
表2.1.B7-2-PE40KDEL融合蛋白與B7-2及PE40KDEL蛋白一、二級結(jié)構(gòu)比較Table 2.1 primary and second structure comparison among B7-2-PE40KDEL recombinant fusionprotein，B7-2 and PE40KDELB7-2-PE40KDEL結(jié)構(gòu) 一級結(jié)構(gòu) 二級結(jié)構(gòu)B7-2-225 16aa天冬氨酸→谷氨酸 未改變(1-225aa)Link-20(226-245aa)PE40-II-112 246aa甘氨酸→絲氨酸 245-259aa(246-357aa) 265aa苯丙氨酸→絲氨酸 15β片層→15α螺旋PE40-Ib-35(358-392) 284aa苯丙氨酸→絲氨酸 無改變PE40-III-215 605-607aa(393-607) 3β片層→3β轉(zhuǎn)角表2.2.B7-1-PE40KDEL融合蛋白與B7-1及PE40KDEL蛋白一、二級結(jié)構(gòu)比較Table 2.2 primary and second structure comparison among B7-1-PE40KDEL recombinant fusionprotein，B7-1 and PE40KDELB7 1-PE40KDEL結(jié)構(gòu) 一級結(jié)構(gòu) 二級結(jié)構(gòu)B7-1-208 181aa蛋氨酸→蘇氨酸 未改變(1-208aa)Link-20(208-228aa)PE40-II-112 229aa甘氨酸→絲氨酸 229-243aa(229-340)15β片層→15α螺旋PE40-Ib-35(341-375)356aa丙氨酸→絲氨酸 無改變PE40-III-215(376-590) 3β片層→3β轉(zhuǎn)角*aa，amino acid，氨基酸；II，Ib and III are functional domains of PE40 respectively，II，Ib和III分別為PE40功能域。
實施例3重組毒素蛋白融合基因B7-PE40KDEL的表達分別以實施例2中構(gòu)建的質(zhì)粒pGEM-T-B7-2-PE40KDEL和pGEM-T-B7-1-PE40KDEL為模板，以PF7-2B或PF7-1B與PR-PEB為引物擴增目的片段。100ul體積PCR反應體系為100ngDNA模板、10×反應緩沖液、上、下游引物各10pmol、10mmol/l dNTP 10ul、25mmol/l MgSO4 6ul、二甲基亞砜10ul、Taq DNA聚合酶2U、雙蒸水補足體積100ul。 PCR反應條件為98℃3min，循環(huán)參數(shù)94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，25循環(huán)后，72℃延伸10min。PCR反應所擴增的B7-1-PE40KDEL DNA和B7-2-PE40KDEL長度片段分別為1842bp和1791bp。PCR反應產(chǎn)物回收后分別插入pGEM-T載體，BamHI/SmaI雙酶切切下約1.8kb片段，將其定向插入于表達載體pRSETA(Invitrogen公司)，并轉(zhuǎn)化菌株BL21(DE3)pLysS(Invitrogen公司)，獲得了表達B7-2-PE40KDEL毒素蛋白融合蛋白的pRSETA-B7-2-PE40KDEL-表達載體。其示意圖見圖2。
將包含pRSETA-B7-2-PE40KDEL重組表達載體的宿主細胞BL21(DE3)pLysS于37℃培養(yǎng)至細菌生長周期對數(shù)期中期，OD600nm約為0.2-0.5后，以0.1mM IPTG于22-25℃誘導培養(yǎng)6-8小時。菌體裂解后進行10％SDS-PAGE分析的結(jié)果如圖3所示。從圖中可見，重組質(zhì)粒表達了分子量約70kD的特異蛋白，與所預計B7-2-PE40KDEL的分子量大小相符。經(jīng)掃描測得該融合蛋白占菌體總蛋白的20-25％，詳見圖4。
將誘導培養(yǎng)后離心所得菌體懸浮于新配制的20％蔗糖、30mmol/LTris-HCl(pH7.4)、2mmol/L EDTA的緩沖液中，冰浴10分鐘。4℃ 1,000g離心10分鐘，收集上清和沉淀，上清即為外周質(zhì)部分，4℃貯存?zhèn)溆?。沉淀重懸?0mmol/L Tris-HCl(pH.4)、2mmol/L EDTA溶液中，超聲破碎，4℃ 12,000離心15分鐘，上清主要為細胞質(zhì)內(nèi)可溶性表達部分。沉淀部分包括細胞膜組分和不溶性包涵體。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對外周質(zhì)蛋白、細胞質(zhì)蛋白及膜蛋白進行分析，以確定目的蛋白在細胞內(nèi)表達的位置。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本融合蛋白幾乎全部為可溶蛋白存在。以1∶500稀釋的抗人B7單抗和抗PEA多克隆抗以及1∶1000堿性磷酸酶標記的兔抗鼠IgG作用后，用NBT/BCIP顯色。這一Western-blot結(jié)果顯示，表達產(chǎn)物能與B7-2單克隆抗體和PE40多抗發(fā)生特異反應，在70kD處出現(xiàn)強烈的反應帶，而對照菌相應位置則沒有免疫印跡條帶。結(jié)果見圖5。將純化后的目的蛋白液分別制樣進行10％SDS-PAGE蛋白電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用含10％的小牛血清/PBS/疊氮鈉封閉液封閉2小時，然后加入一抗孵育1～2小時；然后用PBS洗滌三次，再用0.1mmol/LTris-HCL、0.05mol/L NaCL洗滌，盡量將磷酸鹽洗凈；然后用10％小牛血清、Tris-HCL，作為二抗體稀釋液二抗，二抗與膜孵育1小時；隨后用0.1mol/l Tris-HCL、0.15mol/l NaCL至少洗滌三次，最后用NBT/BCIP試劑盒進行顯色，至適當?shù)娘@色程度用蒸餾水洗去染色液終止反應。
實施例4重組融合蛋白B7-2-PE40KDEL的純化按照實施例3的方法，擴大規(guī)模，將包含表達載體pRSETA-B7-2-PE40KDEL的宿主細胞BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(Invitrogen公司)大量誘導表達，將培養(yǎng)液于4℃ 4500rpm離心20分鐘，分離收集表達上清和菌體，測定上清中融合蛋白表達含量約為25％。
對于可溶性表達上清，在非變性狀態(tài)下，利用Ni-NTA樹脂進行親和層析純化。以3倍體積的平衡液平衡金屬螯合層析柱，將經(jīng)0.45um過濾的包涵體上清上樣于Ni-NTA樹脂層析柱，流速為1ml/min，4℃作用60min，使液體流出并收集，此為穿過峰(flow-through)；再以3倍體積的平衡液沖洗后，以洗滌液(50mmol/l NaH2PO4，300mmol/l NaCl，40mmol/l咪唑，pH8.0)沖洗至紫外吸收值不再變動；以洗脫液(50mmol/lNaH2PO4，300mmol/l NaCl，250mmol/l咪唑，pH8.0)洗柱并分段收集；將收集的各種成分取樣進行10％SDS-PAGE及Western Blot進行分析鑒定，檢測純化的結(jié)果。
將含有目的蛋白的樣品對透析液充分透析24小時以去除咪唑。MonoQ層析柱用含10％B液(50mmol/L Na2HPO4，2mM EDTA，1mol/L NaCl，pH7.2)的A溶液(50mmol/L Na2HPO4，2mM EDTA，pH7.2)平衡后，將含有目的蛋白的樣品以1ml/min流速上樣，再以3ml含10％B液的A液平衡層析柱后，進行線性梯度洗脫，即經(jīng)20分鐘B液含量由0至100％，流速是1ml/Min，收集各洗脫成分，分段收集與按峰收集相結(jié)合。10％SDS-PAGE及WesternBlot分析鑒定純化產(chǎn)物。
用YM10超濾膜濃縮已經(jīng)陰離子交換純化后的目的蛋白液，上樣于平衡好的Superdex 75凝膠柱，以C液(50mmol/l Na2HPO4(pH7.2)，2mmol/lEDTA，0.2mol/l NaCl)進行分離，流速0.3ml/min，收集目的蛋白，分段收集與按峰收集相結(jié)合，無峰處每1ml體積收集，峰處起每0.5ml體積收集，10％SDS-PAGE檢測蛋白純化的結(jié)果。
重組融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL蛋白含量的測定考馬斯亮藍G-250法(Bradford法)稱取考馬斯亮藍G-250 100mg溶于50ml的95％乙醇中，加100ml 85％磷酸，加蒸餾水定容至1000ml，配成0.1mg/L的染液備用。標準蛋白溶液由BSA配制，按比例稀釋標準蛋白溶液。5ml染液中加100μl蛋白溶液，搖勻，放置2-5分鐘，595nm波長處測定吸收值，作標準曲線。
重組B7-2-PE40KDEL融合蛋白的分子量分析通過12％SDS-PAGE蛋白電泳和凝膠成像系統(tǒng)分析，進行相對遷移率計算，得到重組B7-2-PE40KDEL融合蛋白的相對分子量為72.628kD，與理論預測值69.561kD相比，誤差在5％之內(nèi)。
實施例5重組融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL選擇性細胞毒性的初步鑒定采用MTT法，將高表達CD28的人T淋巴瘤細胞系Jurkat懸浮于含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞濃度為2×105/ml，加入96孔培養(yǎng)板中，再加入按一定比例稀釋的B7-2-PE40KDEL融合蛋白純化樣品，于37℃、5％CO2培養(yǎng)條件下孵育48小時后，加入10ul MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培育6小時后，570nm波長測定吸光密度值計算融合蛋白的細胞毒活性。同時并以CD28陰性表達的人B淋巴白血病細胞系Raji作為陰性對照。同時采用臺盼藍染色在光鏡下直接觀察細胞生存狀態(tài)。
MTT的結(jié)果顯示，重組融合蛋白B7-2-PE40KDEL在0.2ug/ml-2ug/ml濃度范圍內(nèi)對Jurkat細胞有顯著的殺傷效應，甚至在低至10ng/ml的劑量下對Jurkat細胞就有顯著的殺傷效應，劑量達到1000ng/ml其殺傷效率可達90％。結(jié)果見圖6。計算得出其ID50為0.160ug/ml。
在加入融合蛋白48-72小時后，光學顯微鏡下可見Jurkat細胞核皺縮，細胞失去折光性，并隨濃度的增大死亡細胞明顯增加，并成濃度依賴性。臺盼藍拒染結(jié)果亦證明，在所設(shè)計的濃度范圍內(nèi)融合蛋白能特異性地殺傷Jurkat細胞。而對CD28陰性的Raji細胞，即便是在2ug高劑量范圍時均未觀察到任何殺傷效應，Raji細胞生長如常。由此初步證實我們所設(shè)計構(gòu)建的全新型重組免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL對CD28陽性靶細胞是具有選擇性殺傷效應的。
由于95％CD4+及50％CD8+的靜止T細胞表達CD28，激活后又誘導了CTLA4分子的表達。因此，本發(fā)明的新型重組B7-PE40KDEL毒素蛋白融合蛋白在體內(nèi)外即能選擇性殺傷參與移植排斥的絕大多數(shù)CD4+和CD8+T細胞，達到持久防治GVHD和HVGD及誘導特異性免疫耐受的目的，又使機體仍保存一定的免疫力和抗感染能力。由重組B7-PE40KDEL毒素蛋白融合蛋白誘導的免疫耐受是不易逆轉(zhuǎn)的，更不受MHC相合與否的影響，還將使異種器官或組織移植成為可能。
本文所描述和要求保護的發(fā)明并不限定在所公開的具體實施方案的范圍內(nèi)，因為這些實施方案意在舉例說明本發(fā)明的幾個方面。任何等價的實施方案均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實上，除了本文所示和所述，對本發(fā)明的修改方案在參照前面的描述后對本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員而言是顯而易見的。這些修改也包含在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院<120>一種新型免疫抑制融合蛋白、其編碼核酸及其用途<130>
<160>19<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1821<212>DNA<213>
<400>1atggctgctc ctctgaagat tcaagcttat ttcaatgaga ctgcaggcct gccgtgccaa 60tttgcaaact ctcaaaacca aagcctgagt gagctagtag tattttggca ggaccaggaa120aacttggttc tgaatgaggt atacttaggc aaagagaaat ttgacagtgt tcattccaag180tatatgggcc gcacaagttt tgattcggac agttggaccc tgagacttca caatcttcag240atcaaggaca agggcttgta tcaatgtatc atccatcaca aaaagcccac aggaatgatt300cgcatccacc agatgaattc tgaactgtca gtgcttgcta acttcagtca acctgaaata360gtaccaattt ctaatataac agaaaatgtg tacataaatt tgacctgctc atctatacgc420ggttacccag aacctaagaa gatgagtgtt ttgctaagaa ccaagaattc aactatcgag480tatgatggta ttatgcagaa atctcaagat aatgtcacag aactgtacga cgtttccatc540agcttgtctg tttcattccc tgatgttgcg agcaatatga ccatcttctg tattctggaa600
actgacaaga cgcggctttt atcttcacct ttctctatag agcttgagga ccctcagcct 660cccccagacc acattcctgg tggcggcgga tctggaggcg gtggaagcgg tggcggtggc 720tcgggcggtg gtgggtcggg cggcagcctg gccgcgctga ccgcgcacca ggcttgccac 780ctgccgctgg agacttccac ccgtcatcgc cagccgcgcg gctgggaaca actggagcag 840tgcggctatc cggtgcagcg gctggtcgcc ctctacctgg cggcgcggct gtcgtggaac 900caggtcgacc aggtgatccg caacgccctg gccagccccg gcagcggcgg cgacctgggc 960gaagcgatcc gcgagcagcc ggagcaggcc cgtcttgccc tgaccctggc cgccgccgag1020agcgagcgct tcgtccggca gggcaccggc aacgacgagg ccggcgcggc caacgccgac1080gtggtgagcc tgacctgccc ggtcgccgcc ggtgaatgcg cgggcccggc ggacagcggc1140tacgccctgc tggagcgcaa ctatcccact ggcgcggagt tcctcggcga cggcggcgac1200gtcagcttca gcacccgcgg cacgcagaac tggacggtgg agcggctgct ccaggcgcac1260cgccaactgg aggagcgcgg ctatgtgttc gtcggctacc acggcacctt cctcgaagcg1320gcgcaaagca tcgtcttcgg cggggtgcgc gcgcgcaacc aggacctcga cgcgatctgg1380cgcggtttct atatcgccgg cgatccggcg ctggcctacg gctacgccca ggaccaggaa1440cccgacgcac gcggccggat ccgcaacggt gccctgctgc gggtctatgt gccgcgctcg1500agcctgccgg gcttctaccg caccagcctg accctggccg cgccggaggc ggcgggcgag1560gtcgaacggc tgatcggcca tccgctgccg ctgcgcctgg acgccatcac cggccccgag1620gaggaaggcg ggcgcctgga gaccattctc ggctggccgc tggccgagcg caccgtggtg1680
attccctcgg cgatccccac cgacccgcgc aacgtcggcg gcgacctcga cccgtccagc1740atccccgaca aggaacaggc gatcagcgcc ctgccggact acgccagcca gcccggcaaa1800ccgccgaagg acgagctgta a 1821<210>2<211>606<212>PRT<213>
<400>2Met Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Gly1 5 10 15Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu20 25 30Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr35 40 45Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg50 55 60Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln65 70 75 80Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro85 90 95
Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu100 105 110Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu115 120 125Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile Arg Gly Tyr Pro Glu130 135 140Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu145 150 155 160Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr165 170 175Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Ser Ser Asn180 185 190Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser195 200 205Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His210 215 220Ile Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His245 250 255Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Ser Thr Arg His Arg Gln Pro260 265 270Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu275 280 285Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln290 295 300Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly305 310 315 320Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu325 330 335Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp340 345 350Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val355 360 365Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Tyr Ala Leu Leu370 375 380Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp
385 390 395 400Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu405 410 415Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly420 425 430Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly435 440 445Val Arg Ala Arg Asn Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr450 455 460Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu465 470 475 480Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr485 490 495Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu500 505 510Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro515 520 525Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly530 535 540
Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val545 550 555 560Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu565 570 575Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro580 585 590Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu595 600 605<210>3<211>1770<212>DNA<213>
<400>3atggttatcc acgtgaccaa ggaagtgaaa gaagtagcaa cgctgtcctg tggtcacaat 60gtttctgttg aagagccggc acaaactcgc atctactggc aaaaggagaa gaaaatggtg120ctgactatga tgtctgggga catgaatata tggcccgagt acaagaaccg gaccatcttt180gatattacta ataacctctc cattgtgatc ctggctctgc gcccatctga cgagggcaca240tacgagtgtg ttgttctgaa gtatgaaaaa gacgctttca agcgggaaca cctggctgaa300gtgacgttat cagtcaaagc tgacttccct acacctagta tatctgactt tgaaattcca360acttctaata ttagaaggat aatttgctca acctctggag gttttccaga gcctcacctc420
tcctggttgg aaaatggaga agaattaagt gccatcaaca caacagtttc ccaagatcct 480gaaactgagc tctatgctgt tagcagcaaa ctggatttca atatgacaac caaccacagc 540ttcacgtgtc tcatcaagta tggacattta agagtgaatc agaccttcaa ctggaataca 600accaagcaag agcattttcc tgataacggt ggcggcggat ctggaggcgg tggaagcggt 660ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgagc ggcagcctgg ccgcgctgac cgcgcaccag 720gcttgccacc tgccgctgga gacttccacc cgtcatcgcc agccgcgcgg ctgggaacaa 780ctggagcagt gcggctatcc ggtgcagcgg ctggtcgccc tctacctggc ggcgcggctg 840tcgtggaacc aggtcgacca ggtgatccgc aacgccctgg ccagccccgg cagcggcggc 900gacctgggcg aagcgatccg cgagcagccg gagcaggccc gtcttgccct gaccctggcc 960gccgccgaga gcgagcgctt cgtccggcag ggcaccggca acgacgaggc cggcgcggcc1020aacgccgacg tggtgagcct gacctgcccg gtcgccgccg gtgaatgcgt gggcccggcg1080gacagcggcg acgccctgct ggagcgcaac tatcccactg gcgcggagtt cctcggcgac1140ggcggcgacg tcagcttcag cacccgcggc acgcagaact ggacggtgga gcggctgctc1200caggcgcacc gccaactgga ggagcgcggc tatgtgttcg tcggctacca cggcaccttc1260ctcgaagcgt cgcaaagcat cgtcttcggc ggggtgcgcg cgcgcaacca ggacctcgac1320gcgatctggc gcggtttcta tatcgccggc gatccggcgc tggcctacgg ctacgcccag1380gaccaggaac ccgacgcacg cggccggatc cgcaacggtg ccctgctgcg ggtctatgtg1440ccgcgctcga gcctgccggg cttctaccgc accagcctga ccctggccgc gccggaggcg1500
gcgggcgagg tcgaacggct gatcggccat ccgctgccgc tgcgcctgga cgccatcacc 1560ggccccgagg aggaaggcgg gcgcctggag accattctcg gctggccgct ggccgagcgc 1620accgtggtga ttccctcggc gatccccacc gacccgcgca acatcggcgg cgacctcgac 1680ccgtccagca tccccgacaa ggaacaggcg atcagcgccc tgccggacta cgccagccag 1740cccggcaaac cgccgaagga cgagctgtaa1770<210>4<211>589<212>PRT<213>
<400>4Met Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser1 5 10 15Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Pro Ala Gln Thr Arg Ile Tyr20 25 30Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met35 40 45Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn50 55 60Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr65 70 75 80
Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu85 90 95His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro100 105 110Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile115 120 125Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu130 135 140Asn Gly Glu Glu Leu Ser Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro145 150 155 160Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr165 170 175Thr Asn His Ser Phe Thr Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val180 185 190Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp195 200205Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln225 230 235 240Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Ser Thr Arg His Arg Gln Pro Arg245 250 255Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val260 265 270Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val275 280 285Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu290 295 300Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala305 310 315 320Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu325 330 335Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala340 345 350Ala Gly Glu Cys Val Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu355 360 365Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val
370 375 380Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu385 390 395 400Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr ValPhe Val Gly Tyr405 410415His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ser Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val420 425 430Arg Ala Arg Asn Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile435 440 445Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro450 455 460Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val465 470 475 480Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala485 490 495Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu500 505 510Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg515 520 525
Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile530535 540Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp545 550 555 560Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp565 570 575Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu580 585<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5gcggatccgc tgctcctctg20<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>6cccgggttaa ggaatgtggt ctgg 24<210>7
<211>8<212>DNA<213>人工序列<400>7gcggatcc 8<210>8<211>9<212>DNA<213>人工序列<400>8cccgggtta 9<210>9<211>678<212>DNA<213>
<400>9atggctgctc ctctgaagat tcaagcttat ttcaatgaga ctgcaggcct gccgtgccaa 60tttgcaaact ctcaaaacca aagcctgagt gagctagtag tattttggca ggaccaggaa120aacttggttc tgaatgaggt atacttaggc aaagagaaat ttgacagtgt tcattccaag180tatatgggcc gcacaagttt tgattcggac agttggaccc tgagacttca caatcttcag240atcaaggaca agggcttgta tcaatgtatc atccatcaca aaaagcccac aggaatgatt300cgcatccacc agatgaattc tgaactgtca gtgcttgcta acttcagtca acctgaaata360gtaccaattt ctaatataac agaaaatgtg tacataaatt tgacctgctc atctatacgc420
ggttacccag aacctaagaa gatgagtgtt ttgctaagaa ccaagaattc aactatcgag480tatgatggta ttatgcagaa atctcaagat aatgtcacag aactgtacga cgtttccatc540agcttgtctg tttcattccc tgatgttgcg agcaatatga ccatcttctg tattctggaa600actgacaaga cgcggctttt atcttcacct ttctctatag agcttgagga ccctcagcct660cccccagacc acattcct 678<210>10<211>226<212>PRT<213>
<400>10Met Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Gly1 5 10 15Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu20 25 30Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr35 40 45Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg50 55 60Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln65 70 75 80
Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro85 90 95Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu100 105 110Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile Thr Glu115 120 125Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile Arg Gly Tyr Pro Glu130 135 140Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr Ile Glu145 150 155 160Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu Leu Tyr165 170 175Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Ser Ser Asn180 185 190Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu Leu Ser195 200 205Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro Asp His210 215 220
Ile Pro225<210>11<211>624<212>DNA<213>
<400>11gttatccacg tgaccaagga agtgaaagaa gtagcaacgc tgtcctgtgg tcacaatgtt 60tctgttgaag agccggcaca aactcgcatc tactggcaaa aggagaagaa aatggtgctg120actatgatgt ctggggacat gaatatatgg cccgagtaca agaaccggac catctttgat180attactaata acctctccat tgtgatcctg gctctgcgcc catctgacga gggcacatac240gagtgtgttg ttctgaagta tgaaaaagac gctttcaagc gggaacacct ggctgaagtg300acgttatcag tcaaagctga cttccctaca cctagtatat ctgactttga aattccaact360tctaatatta gaaggataat ttgctcaacc tctggaggtt ttccagagcc tcacctctcc420tggttggaaa atggagaaga attaagtgcc atcaacacaa cagtttccca agatcctgaa480actgagctct atgctgttag cagcaaactg gatttcaata tgacaaccaa ccacagcttc540acgtgtctca tcaagtatgg acatttaaga gtgaatcaga ccttcaactg gaatacaacc600aagcaagagc attttcctga taac 624<210>12<211>208<212>PRT<213>
<400>12Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys1 5 10 15Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Pro Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp20 25 30Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn35 40 45Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn50 55 60Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr65 70 75 80Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His85 90 95Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser100 105 110Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys115 120 125Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn130 135 140
Gly Glu Glu Leu Ser Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu145 150 155 160Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr165 170 175Asn His Ser Phe Thr Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn180 185 190Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn195 200 205<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>13gctgctcctc tgaagattca ag 22<210>14<211>73<212>DNA<213>人工序列<400>14cgacccacca ccgcccgagc caccgccacc gcttccaccg cctccagatc cgccgccacc60aggaatgtgg tct 73
<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>15cgcgaattca tggttatcca cgtgacc27<210>16<211>82<212>DNA<213>人工序列<400>16cgacccacca ccgcccgagc caccgccacc gcttccaccg cctccagatc cgccgccacc60gttatcagga aaatgctctt gc 82<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>17tcgggcggtg gtgggtcggg cggcagcctg gccgcgctga 40<210>18<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>18tcccccgggg gattacttca ggtcctcgcg cggcggtttg 40
<210>19<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>19tcccccgggg gattacagct cgtccttcgg cggtttgccg ggctggct 48
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其中包含免疫配基或者其能夠和相應T細胞受體結(jié)合的變體、衍生物、類似物或片段與毒素蛋白的融合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述免疫配基是B7、BB1或CD40L等。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述免疫配基是B7-1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白，其中所述免疫配基是B7-2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中包含所述免疫配基的胞外部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述免疫配基是人的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述毒素蛋白是植物毒素如蓖麻毒素、植物凝集素等或者是細菌毒素如白喉毒素、志賀氏毒素、假單胞菌外毒素等。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的融合蛋白，其中所述毒素蛋白是綠膿桿菌外毒素。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其具有SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列。
10.一種分離的多核苷酸，其中包含編碼權(quán)利要求1-9中任一項的融合蛋白的核酸序列。
11.一種核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求10的多核苷酸及與之可操作連接的控制序列。
12.一種表達載體，其中包含權(quán)利要求11的核酸構(gòu)建體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的表達載體，它是pRSETA-B7-2-PE40KDEL。
14.包含權(quán)利要求11的核酸構(gòu)建體或者權(quán)利要求12或13的表達載體的宿主細胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的宿主細胞，它是原核或真核細胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的宿主細胞，它是細菌如大腸桿菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的宿主細胞，它是包含pRSETA-B7-2-PE40KDEL重組表達載體的BL21-CodonpPlus(DE3)-RIL或者BL21(DE3)pLysS。
18.一種制備權(quán)利要求1-9中任一項的融合蛋白的方法，包括(i)在適于所述融合蛋白表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求14-17任一項的宿主細胞；和(ii)從培養(yǎng)物中回收所述融合蛋白。
19.權(quán)利要求1-9中任一項的融合蛋白在制備可用于抑制過度的或不必要的免疫反應的藥物中的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的用途，其中所述過度的或不必要的免疫反應是移植物抗宿主排斥或宿主抗移植物排斥，或是自身免疫性疾病。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，其中所述自身免疫性疾病是類風濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、牛皮癬、強直性脊柱炎、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥、胰島素依賴性糖尿病等。
22.權(quán)利要求10的多核苷酸在制備可用于抑制自身免疫性疾病的藥物中的用途。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的用途，其中所述自身免疫性疾病是類風濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、牛皮癬、強直性脊柱炎、重癥肌無力、多發(fā)性硬化癥、胰島素依賴性糖尿病等。
24.一種藥物組合物，其中含有免疫抑制有效量的權(quán)利要求1-9任一項的融合蛋白或權(quán)利要求10的多核苷酸，以及藥學可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型免疫抑制融合蛋白、其編碼核酸及其用途。
文檔編號C07K19/00GK1498902SQ0214921
公開日2004年5月26日 申請日期2002年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月6日
發(fā)明者奚永志, 袁志宏, 張惠麗, 關(guān)海容, 孔繁華 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)