專利名稱：锝-99m標記的異腈類配合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種99mTc標記的放射性配合物，其制備方法以及所述配合物作為心血池顯像劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在99mTc標記的放射性藥物化學領(lǐng)域，對以99mTc(I)核為中心核的烷基異腈類配合物([99mTc(CNP)6]+)的研究十分活躍，其結(jié)構(gòu)式見(a)，已報道的該類配合物主要用作心肌灌注顯像劑，如99mTc-TBI(TBI＝t-ButyIsonitrile，特丁基異腈)(Holman BL，Jones AG，Lister-James J et a1.A newTc-99m-labeled myocardial imaging agent，hexakis(t-butylisonitrile)technetium(I)[Tc-99m-TBI]initial experience in the human.J Nucl Med，1984，251350)、99mTc-CPI(CPI＝Carbomethoxyisopropylisonitrile，甲酯異丙異腈)(Holman BL，Sporn V，Jones AG et a1.Myocardial imaging withtechnetium-99m-CPIinitial experience in the human.J Nucl Med，1987，2813)和99mTc-MIBI(MIBI＝2-metisobutyl-isonitrile，2-甲氧基異丁基異腈)(Wackers FJT，Berman DS，Maddahi J et al.Technetium-99mhexakis-2-methoxy-isobutyl-isonitrilehuman biodistribution，dosimetry，safety，and preliminary comparison to thallium-201 for myocardial perfusion imaging.JNucl Med，1989，30301)，其中最為成功的是99mTc-MIBI，已廣泛用于臨床，并用于對多種腫瘤的評價。
心血管系統(tǒng)疾病嚴重影響著人類健康，因此對心血管系統(tǒng)顯像藥物的研究是當今放射性藥物研究的熱點之一。在顯像方面，由于99mTc具有半衰期短(6.02小時)，γ射線能量適中(140千電子伏特)等優(yōu)良核性質(zhì)，使其能與SPECT(Single-Photon Emission Computed Tomography，單光子發(fā)射計算機斷層術(shù))配合用于體內(nèi)顯像，且病人受到的輻射劑量很低。醫(yī)用99Mo/99mTc發(fā)生器的研制成功，使99mTc核素獲取方便，價格低廉，因此99mTc成為放射性標記藥物研究的首選核素，并且取得了很大的進展。
放射性核素心血池顯像能無創(chuàng)傷地測定局部或整體的心臟功能，提供某些心臟功能參數(shù)。對冠心病、心肌病和瓣膜病等心肌疾病的早期診斷、愈后及療效觀察都有一定的價值。由于99mTc的優(yōu)異核性質(zhì)使其成為研究心血池顯像劑的首選核素。
目前臨床上使用最多的心血池顯像劑為99mTc-RBC(血紅細胞)(王學斌，馬小煜，唐志剛，等.紅細胞99mTc體外標記法的研究.同位素，1996，9(4)193-199)。標記方法可分為體外、體內(nèi)和半體外標記法。體外標記法標記率高，但操作繁瑣，時間長，很難保證無菌，因此不能被廣泛使用。體內(nèi)標記法操作相對簡單，其缺點是需要對病人進行兩次注射，而且影響標記率的因素較多，標記率波動較大，使其在臨床上的應(yīng)用受到了一定限制。半體外標記法雖然在一定程度上簡化了體外標記法的操作，但仍需采集病人血樣，因此容易引起交叉感染或病毒感染，而且標記率也要低于體外標記法。
人血清白蛋白(HSA)是人體血液中的天然組份，由576個氨基酸組成的單肽鏈大分子蛋白質(zhì)，其中包括56個賴氨酸殘基、17個酪氨酸酚羥基和一個自由巰基，分子量為68400，有很長的生物半衰期。99mTc-HSA可用作心血池顯像劑，一般直接標記法的標記率不高，標記物穩(wěn)定性差，使其在血液中的清除快，顯像效果差。近年來使用雙功能聯(lián)接劑偶聯(lián)人血清白蛋白進行99mTc標記的報道較多，包括DTPA(二乙三胺五醋酸)、DMP(2，3-二巰基丙酸)等雙功能聯(lián)接劑，其中DMP結(jié)構(gòu)式見(b)。但99mTc-DTPA-HSA從血液中清除較快，需在注射后5～10min顯像，且肝內(nèi)有一定濃集，不利于一些疾病的診斷。較為成功的有99mTc-DMP-HSA(Cambier J-P，Verbeke KA，Vanbilloen HP et a1.99mTc-dimercaptopropionyl-HSA prepared from a labellingkitPreliminary investigations as a blood pool agent.Nucl Med Commun，1997，1831-37)，DMP-HSA的結(jié)構(gòu)式見(c)，該配合物的制備方法已經(jīng)藥盒化。
通過對HSA進行一些結(jié)構(gòu)修飾，有望獲得性能優(yōu)良的心血池顯像劑，但是其為人體提取物，價格昂貴且也可能攜帶一些病毒，這些都在一定程度上限制了其應(yīng)用。
其它用于心血池顯像的99mTc放射性藥物還有99mTc-DX(葡聚糖)和99mTc標記脂質(zhì)體等，但在臨床上都未取得實質(zhì)性進展。
以下為上述幾種化合物的示意結(jié)構(gòu)式 (a)[99mTc(CNR)6]+(b)DMP (c)DMP-HSA由此可以看出，現(xiàn)有較為成功的心血池顯像劑局限于锝-99m標記的血紅細胞或生物提取物HSA，尚存在制備方法復雜、價格昂貴、容易感染病毒以及顯像效果易受其它因素影響等缺點，若能提供一種具有制法簡單、成本低以及顯像效果良好等特點的新型的放射性锝-99m標記的心血池顯像劑，將具有廣闊的應(yīng)用前景。
基于以上考慮，發(fā)明人提出了一類新型锝-99m標記的心血池顯像劑。初步研究結(jié)果表明這類新型心血池顯像劑具有優(yōu)良的生物性能，且制備方法簡單、成本低，有望在臨床上得以推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有優(yōu)良顯像性能的一類新的放射性锝-99m標記的異腈類配合物；本發(fā)明的另一目的在于提供一種新的锝-99m標記的異腈類配合物的制備方法；本發(fā)明的再一目的是提供一種所述的配合物在心血池中作為顯像劑的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種放射性锝-99m標記的異腈類配合物，其結(jié)構(gòu)可用下式
(A)表示 該配合物99mTc-CN-R以99mTc(I)為中心核，與其配位的異腈類配體用式CN-R表示，其中R為任選被1～4個相同或不相同的C1-4烷基或烷氧基取代或未取代的C6-10環(huán)烷基。
上述的C1-4烷基或烷氧基是指具有1～4個碳原子的直鏈或支鏈的烷基或烷氧基，例如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，叔丁基及其相應(yīng)的烷氧基等。
優(yōu)選的本發(fā)明配合物是其中R為任選被1～4個相同或不相同的C1-4烷基或烷氧基取代或未取代的C6-8環(huán)烷基的式(A)配合物。
進一步優(yōu)選的本發(fā)明配合物是其中R為任選被1～4個甲基取代或未取代的C6-8環(huán)烷基的式(A)配合物。
最優(yōu)選的配合物是其中R為環(huán)己基，2-甲基環(huán)己基，2，3-二甲基環(huán)己基，3，3，5-三甲基環(huán)己基，環(huán)庚基或環(huán)辛基的式(A)配合物。
在本研究領(lǐng)域，對于放射性核素標記配合物的結(jié)構(gòu)表征常用該核素的穩(wěn)定同位素或用與該核素化學性質(zhì)相近的穩(wěn)定核素代替該放射性核素來制備同類配合物，進行結(jié)構(gòu)表征并由此推定放射性核素標記配合物的結(jié)構(gòu)，對于放射性核素锝-99m，常用锝-99或用與其同族的錸(Re)代替，從而對锝-99m標記配合物的結(jié)構(gòu)進行推定。本發(fā)明的配合物與現(xiàn)有技術(shù)中以99mTc(I)核為中心核的烷基異腈類配合物([99mTc(CNR)6]+)屬同類配合物，二者的區(qū)別在于配位體的取代基不同，即式(A)中的R不同，因此本發(fā)明的配合物在結(jié)構(gòu)上與現(xiàn)有以99mTc(I)核為中心核的烷基異腈類配合物([99mTc(CNR)6]+)相同?，F(xiàn)有以99mTc(I)核為中心核的烷基異腈類配合物的結(jié)構(gòu)已經(jīng)有文獻報道用99Tc(I)代替99mTc(I)進行結(jié)構(gòu)表征，結(jié)果認為該類配合物具有六配位八面體構(gòu)型，如結(jié)構(gòu)式(A)所示，由此推定，現(xiàn)有以99mTc(I)核為中心核的烷基異腈類配合物的結(jié)構(gòu)與此相同(Abrams MJ，Davison A，Jones AG，et al.Synthesis and Characterization of Hexakis(alkyl isocyanide)and Hexakis(arylisocyanide)Complexes of Technetium(I).Inorg Chem，1983，222798-2800)?？紤]到本發(fā)明所述配合物與現(xiàn)有配合物屬同類，因此，同樣可以推定本發(fā)明所述配合物具有六配位八面體構(gòu)型，如結(jié)構(gòu)式(A)所示，所以本發(fā)明中只對異腈類配體(CN-R)進行表征，而不再對本發(fā)明的配合物的結(jié)構(gòu)進行表征。
本發(fā)明的配體CN-R可通過以下的方式合成 環(huán)烷基取代伯胺 N-環(huán)烷基取代甲酰胺 環(huán)烷基取代異腈式中R為任選被1～4個相同或不相同的C1-4烷基或烷氧基取代或未取代的C6-10環(huán)烷基。C1-4烷基或烷氧基是指具有1～4個碳原子的直鏈或支鏈的烷基或烷氧基，例如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，叔丁基及其相應(yīng)的烷氧基等。
起始反應(yīng)物為被1～4個相同或不相同的C1-4烷基或烷氧基取代或未取代的C6-10環(huán)烷基伯胺，可在市場上購得。在甲酸乙酯的存在下經(jīng)過(1)反應(yīng)得到N-環(huán)烷基取代甲酰胺，再經(jīng)過一步脫水反應(yīng)(2)就可得到目標產(chǎn)物環(huán)烷基取代異腈(CN-R)。反應(yīng)(2)中的脫水體系可以為光氣(OCCl2)/叔胺、氯化氧磷(POCl3)/吡啶(C5H5N)、氯化氧磷(POCl3)/特丁醇鉀(t-(CH3)3COK)以及對甲苯磺酰氯/喹啉等。
另外還有其它一些合成異腈配體的方法(參見Hoffman P，Gokel G，Marquarding D，et a1.Isonitrile Chemistry，Academic Press，New York，1971，P9)。
本發(fā)明提供了制備所述的放射性锝-99m標記的異腈類配合物的方法即放射性高锝酸鹽(99mTcO4-)與異腈配體(CN-R)在還原劑的存在下反應(yīng)制備得到所述的放射性锝-99m標記的異腈類配合物。優(yōu)選的制備方法為下述的濕法或凍干法濕法將高锝酸根99mTcO4-淋洗液(從醫(yī)用99Mo/99mTc發(fā)生器獲得)、還原劑與異腈配體(CN-R)在沸水浴中加熱5～20分鐘，得到產(chǎn)物锝-99m標記的異腈類配合物；該方法中還原劑與異腈配體的用量比為(0.1～10)∶(1～20)，因高锝酸根99mTcO4-為放射性示蹤量，其化學量可以不考慮。
凍干法將還原劑、賦形劑和異腈配體(CN-R)按(0.1～10)∶(20～100)∶(1～20)的重量比溶于充氮二次水中(充氮量要足以保證還原劑不被氧化)，無菌過濾后分裝于容器中，經(jīng)冷凍干燥后，加塞密封，得到凍干藥盒；如果分裝的容器為西林瓶，則每支凍干藥盒還原劑用量為0.05～5mg；配體的含量為0.5～10mg。
將約18.5～185兆貝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(從醫(yī)用99Mo/99mTc發(fā)生器獲得)加入凍干藥盒中，搖勻后在60～110℃下加熱5～20分鐘，得到產(chǎn)物為锝-99m標記的異腈類配合物。
上述方法中，還原劑為將99mTc7+(99mTcO4-)還原為99mTc1+(99mTc(I))的常規(guī)化學試劑，例如SnCl2·2H2O、Na2S2O4或甲脒亞磺酸(FSA)等；賦形劑為保護凍干藥盒中的還原劑以及決定凍干粉末外觀，且不會影響最終配合物制備的化學物質(zhì)，例如檸檬酸鈉、葡萄糖或維生素C等。
本發(fā)明提供的放射性锝-99m標記的異腈類配合物制法簡單、成本低。生物試驗結(jié)果表明其在小鼠血液中有很高的攝取和很好的滯留，具有較高的靶/非靶比值，適合用作心血池顯像劑。


圖1為99mTc-TMCHI配合物的血液相對滯留率-時間關(guān)系曲線；圖2為99mTc-TMCHI配合物在狗體心、肝和肺內(nèi)的放射性-時間曲線；圖3A為99mTc-TMCHI配合物注射后30分鐘狗體前位胸部平面圖像；圖3B為99mTc-TMCHI配合物注射后30分鐘狗體后位胸部平面圖像；圖4A為99mTc-TMCHI配合物注射后60分鐘狗體前位胸部平面圖像；圖4B為99mTc-TMCHI配合物注射后60分鐘狗體后位胸部平面圖像；圖5A為99mTc-TMCHI配合物注射后90分鐘狗體前位胸部平面圖像；圖5B為99mTc-TMCHI配合物注射后90分鐘狗體后位胸部平面圖像；圖6A為99mTc-TMCHI配合物注射后120分鐘狗體前位胸部平面圖像；圖6B為99mTc-TMCHI配合物注射后120分鐘狗體后位胸部平面圖像。
具體實施例方式
以下通過具體的制備例和實施例可使本發(fā)明得到更清楚地說明一、制備例1.配體CN-R的制備(參見中國專利申請00107287.0)1)異腈類配體的合成路線a.
b.
式中Py為吡啶，R′為環(huán)己基、2-甲基環(huán)己基、2，3-二甲基環(huán)己基、3，3，5-三甲基環(huán)己基、環(huán)庚基或環(huán)辛基。
2)甲酰胺(R′-NHCHO)的合成將35.2mmol的甲酸乙酯(約2.60g)慢慢滴加到冰浴冷卻的40mmol伯胺(R′-NH2，式中R′的定義如1)中所述)中，當放熱反應(yīng)停止后，將反應(yīng)液回流2小時，用25cm韋氏分餾柱減壓分餾，收集到產(chǎn)品為無色透明粘稠液體。稱重，計算產(chǎn)率。經(jīng)紅外譜圖指認證實為甲酰胺。表1列出了幾種甲酰胺的產(chǎn)率、沸點及紅外吸收特征峰值。幾種甲酰胺的產(chǎn)率均在90％左右，沸點隨分子量的增大而增高。
表1R′-NHCHO的沸點、產(chǎn)率及IR特征峰指認

3)異腈(R′-N≡C)類配體的合成a.將0.03mol甲酰胺(R′-NHCHO，式中R′的定義如1)中所述)和0.19mol吡啶(約15mL，新蒸)以及9mL石油醚(30～60℃)依次加入到100mL三口瓶中，在冰水浴中及攪拌條件下滴加2.76g(約0.018mol)POCl3。滴加完畢后，回流10分鐘。將反應(yīng)液冷卻，滴加24mL冰水，攪拌至固體全溶。分出有機相，水相以3×10mL石油醚洗滌。合并有機相后以3×10mL水洗滌，最后將有機相用適量無水CaSO4干燥過夜。
b.將干燥劑濾出后，進行減壓蒸餾。先以水泵減壓，除去低沸點的溶劑；然后換用油泵減壓，收集到產(chǎn)品為無色透明液體，有惡臭。稱重，計算產(chǎn)率。相關(guān)數(shù)據(jù)列于表2中。
表2異腈(R′-N≡C)配體的沸點及IR特征峰指認

二、實施例1.異腈凍干藥盒的制備(以制備100支為例)稱取異腈配體(CN-R)100mg和檸檬酸鈉2000mg溶于99mL充氮二次水中(充氮時間不少于25分鐘)，再加入含10mg SnCl2·2H2O的鹽酸溶液1mL，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值為5～7。經(jīng)無菌過濾后分裝于100支青霉素小瓶中，然后置于冷凍干燥機中冷凍干燥24小時，加塞密封，得到凍干藥盒。
當異腈配體不同時可得到相應(yīng)的凍干藥盒。根據(jù)藥盒產(chǎn)量以及對每支藥盒中組分含量要求的不同，可調(diào)節(jié)SnCl2·2H2O、檸檬酸鈉以及異腈配體的用量，使它們的重量比落在(0.1～10)∶(20～100)∶(1～20)范圍內(nèi)。
2.99mTc-TMCHI的制備1)濕法將約18.5～185兆貝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(從醫(yī)用99Mo/99mTc發(fā)生器獲得)加入到含0.1mL SnCl2·2H2O鹽酸溶液(含0.1mgSnCl2·2H2O和3.6mg起保護還原劑作用的檸檬酸鈉)和0.5mL TMCHI乙醇溶液(2.0g/L)的西林瓶中，置于沸水浴中反應(yīng)15分鐘，即得到所需的99mTc-TMCHI配合物。
2)凍干法將約18.5～185兆貝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(從醫(yī)用99Mo/99mTc發(fā)生器獲得)加入到TMCHI凍干藥盒內(nèi)，混勻后沸水浴加熱15分鐘，即得到所需的99mTc-TMCHI配合物。
3.99mTc-COI的制備1)濕法將約18.5～185兆貝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(從醫(yī)用99Mo/99mTc發(fā)生器獲得)加入到含1mL SnCl2·2H2O鹽酸溶液(含5mgSnCl2·2H2O和180mg起保護還原劑作用的檸檬酸鈉)和0.5mL COI乙醇溶液(1.0g/L)的西林瓶中，置于60℃水浴中反應(yīng)20分鐘，即得到所需的99mTc-COI配合物。
2)凍干法將約18.5～185兆貝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(從醫(yī)用99Mo/99mTc發(fā)生器獲得)加入到COI凍干藥盒內(nèi)，混勻后60℃水浴加熱20分鐘，即得到所需的99mTc-COI配合物。
4.99mTc-CN-R′(式中R′的定義如制備例中所述)的制備1)濕法將約18.5～185兆貝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(從醫(yī)用99Mo/99mTc發(fā)生器獲得)加入到含0.05mL SnCl2·2H2O鹽酸溶液(含0.05mgSnCl2·2H2O和1.8mg起保護還原劑作用的檸檬酸鈉)和1mL CN-R′乙醇溶液(10g/L)的西林瓶中，在110℃反應(yīng)5分鐘，即得到所需的99mTc-CN-R′配合物。
2)凍干法將約18.5～185兆貝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(從醫(yī)用99Mo/99mTc發(fā)生器獲得)加入到CN-R′凍干藥盒內(nèi)，混勻后在110℃加熱5分鐘，即得到所需的99mTc-CN-R′配合物。
對99mTc-CN-R′的性能測定描述如下1.99mTc-CN-R′的層析鑒定采用乙腈為展開劑，聚酰胺薄片為載體，結(jié)果見表3。由此可將產(chǎn)物(99mTc-CN-R′)與99mTcO4-以及99mTcO2·xH2O分開，并以此計算產(chǎn)物的放射化學純度。
表399mTc-CN-R′的層析結(jié)果(Rf)

2.99mTc-TMCHI/COI的脂水分配系數(shù)的測定按實施例制備好放射化學純度大于95％的99mTc-TMCHI/COI配合物溶液。取0.1mL(約1.11MBq)待測配合物溶液，加入到含2.0mL正辛醇和2.0mL蒸餾水的10mL離心試管中，蓋好后充分振蕩5分鐘，然后在離心機中離心分層5分鐘，分別取有機相和水相各0.1mL于干凈試管中，在井型γ探測器上測其放射性計數(shù)，則分配系數(shù)P為N有/N水，重復本操作2～3次后取平均值為該配合物的脂水分配系數(shù)。99mTc-TMCHI、99mTc-COI配合物的脂水分配系數(shù)分別為912.53和274.37。
3.99mTc-TMCHI/COI的體外穩(wěn)定性測定分別將按實施例制備好的99mTc-TMCHI/COI配合物溶液在室溫下放置不同時間(1、2、3、4、5和6小時)，然后進行點樣層析分析，計算放射化學純度。實驗結(jié)果表明99mTc-TMCHI/COI在室溫下可穩(wěn)定存在6小時以上，其外觀和放射化學純度均無明顯變化。
4.99mTc-TMCHI/COI在小鼠體內(nèi)的生物分布按實施例分別制備好放射化學純度大于95％的99mTc-TMCHI/COI配合物溶液。從正常昆明小鼠(體重約20克)的尾靜脈注射0.1mL(約1.11MBq)待研究的配合物溶液，然后于注射后不同時間(5～60分鐘)將小鼠斷頭處死。取其血、心、肝、肺、腎和腦等有關(guān)組織和器官，擦凈后稱重，并在井型γ探頭中測其放射性計數(shù)，計算各組織的百分注射劑量(％ID)和每克百分注射劑量(％ID/g)，百分之一注射劑量的計算是取0.1mL(注射量)配合物溶液，稀釋至100倍后再分別取0.1mL于三支小試管中，在測量組織放射性計數(shù)的同時測量其放射性計數(shù)，百分之一劑量為三支小試管中放射性計數(shù)的平均值。每次實驗取3～4組平行數(shù)據(jù)，生物分布結(jié)果列于表4中。
表499mTc-COI和99mTc-TMCHI在小鼠體內(nèi)分布結(jié)果(x±s，n＝3)注射后時間(分鐘)配合組織物％ID/g ％ID53060 5 30 60A7.78±0.459.33±0.437.54±1.05 0.73±0.04 0.96±0.07 0.74±0.08心B7.45±0.556.61±0.536.50±1.20 0.74±0.03 0.63±0.11 0.56±0.13肝A31.5±1.4331.70±7.03 32.65±5.16 28.50±1.87 32.80±5.3031.60±4.93B9.32±0.7813.53±0.86 18.73±4.03 9.19±0.26 13.30±1.1016.8±2.87肺A57.7±12.136.90±7.50 24.30±7.13 11.9±4.01 8.43±2.27 3.34±0.48B24.5±5.5719.10±1.30 26.90±2.40 4.88±0.91 4.00±0.78 5.47±0.91腎A7.62+0.53 10.90±0.90 9.49±0.42 2.02±0.12 3.10±0.13 2.61±0.23B4.88±1.426.04±0.857.17±0.66 1.30±0.32 1.60±0.15 1.60±0.10腦A1.51±0.131.54±0.231.50±0.47 0.64±0.05 0.65±0.09 0.63±0.04B1.20±0.181.27±0.231.10±0.31 0.52±0.08 0.55±0.11 0.49±0.14血A56.8±4.5054.90±1.87 50.30±5.50 55.38±4.30 53.53±1.5049.04±4.70B44.4±2.8040.4±3.1040.4±0.67 51.95±3.17 47.27±3.8747.27±1.03注1)A為配合物99mTc-COI，B為配合物99mTc-TMCHI；2)全血質(zhì)量按體重6.5％計。
由表4中數(shù)據(jù)可見，99mTc-COI在小鼠體內(nèi)有一定的心、腦攝取，但肝、肺、血等本底攝取相對較高，因此不適于心、腦顯像。同樣，99mTc-TMCHI配合物在小鼠的心、腦、血和腎中的攝取以及清除與99mTc-COI相似；但其在肝和肺中的初始濃集明顯低于99mTc-COI。這些實驗事實均表明兩種配合物的生物性質(zhì)有明顯不同。
盡管兩種配合物均不具備用于心、腦顯像的可能，但令人興奮的是兩種配合物在小鼠的血液中均有很高的濃集很好的滯留，而且非靶本底攝取較低，可以用于心血池顯像。
5.99mTc-TMCHT/COI的動物異常毒性試驗
1)按實施例制備好放射化學純度大于95％的99mTc-TMCHI/COI配合物溶液，體積3mL，取0.25mL緩慢注射于小鼠(昆明小白鼠，體重約20克，雌雄各半)尾靜脈(5～4秒鐘)，共5只，按《中國藥典》(2000版，二部)規(guī)定觀察48小時，未見異常反應(yīng)，并且無一死亡，72小時后解剖觀察，心、肝、脾、肺、腎未見異常，按給藥量換算(每公斤體重)相當于人體最大可能用量的200倍以上。
2)按實施例制備好放射化學純度大于95％的99mTc-TMCHI/COI配合物溶液，體積3mL，用生理鹽水沖稀至6mL，取0.5mL緩慢注射于小鼠(昆明小白鼠，體重約20克，雌雄各半)尾靜脈，共5只，按《中國藥典》(2000版，二部)規(guī)定觀察48小時，未見異常反應(yīng)，并且無一死亡，按給藥量換算(每公斤體重)相當于人體最大可能用量的200倍以上。
異常毒性實驗結(jié)果表明，昆明小白鼠在本實驗中所用劑量按每公斤給藥量換算均大于人體用量的200倍，小鼠全部存活48小時以上，未見任何不良反應(yīng)，解剖檢查未見各臟器異常表現(xiàn)，說明99mTc-TMCHI/COI注射液的毒性較低，可以進入臨床試用研究。
6.99mTc-TMCHI的體外蛋白結(jié)合實驗按上述方法制備好待研究配合物99mTc-TMCHI。配制牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)的生理鹽水溶液。
1)將4×1mL BSA生理鹽水溶液(5mg/mL)分置于4支10mL的離心試管中，再用定量移液管分別向其中添加15μL(約0.3～0.6MBq)的99mTc-TMCHI配合物溶液，充分振搖后在35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15min，分別測定其總放射性計數(shù)。然后分別向其中滴加30μL 10％的三氯乙酸溶液并振搖，離心分離白色的蛋白沉淀，分別測定蛋白沉淀和上清液的放射性計數(shù)，并計算血清蛋白的放射性計數(shù)占總放射性計數(shù)的百分比，將4次測定結(jié)果平均后得到標記配合物與BSA的結(jié)合率。
另取出5mL生理鹽水，每次1mL，分5次充分洗滌上一步所得的血清蛋白沉淀，經(jīng)離心分離后，測定每次上清洗脫液的放射性計數(shù)。根據(jù)總的上清洗脫液的放射性計數(shù)占蛋白沉淀的初始放射性計數(shù)的百分比，計算出各標記配合物在BSA中的活性洗脫百分率，從而考察配合物與BSA是否有特異性結(jié)合。
2)采取同上步驟測定HSA與99mTc-TMCHI配合物之間的蛋白結(jié)合率以及活性洗脫百分率。
99mTc-TMCHI配合物與BSA和HSA的蛋白結(jié)合實驗結(jié)果列于表5中。由表中數(shù)據(jù)可見99mTc-TMCHI的蛋白結(jié)合率很高。同樣可見，99mTc-TMCHI的活性洗脫率明顯較低，表明其可能與HSA和BSA有某種特異性結(jié)合。
表599mTc-TMCHI配合物的蛋白結(jié)合實驗結(jié)果

注R*為相對血液滯留率，為注射后60分鐘和5分鐘時的血液攝取值之比。
因為配合物的蛋白結(jié)合率和活性洗脫率分別與其在血液中的攝取和滯留有關(guān)，所以我們將配合物在小鼠體內(nèi)的血液攝取值(注射后5分鐘和60分鐘)同列于表5中。由此可見，配合物99mTc-TMCHI具有用于心血池顯像的潛質(zhì)，因為該配合物不僅具有很高的蛋白結(jié)合率(血液初始攝取高)，而且其活性洗脫率也較低(在血液中的滯留時間長)。
基于小鼠體內(nèi)分布實驗結(jié)果和血清蛋白結(jié)合實驗數(shù)據(jù)，可以預(yù)測99mTc-TMCHI配合物有望在進一步的研究中取得成功。配合物99mTc-COI與99mTc-TMCHI的性質(zhì)相似(脂溶性及小鼠體內(nèi)分布結(jié)果)，因而同樣具有深入研究的價值。
7.99mTc.-TMCHI的血藥動力學試驗按前述方法制備好放射化學純度大于95％的99mTc-TMCHI配合物。并將配合物溶液的放射性濃度調(diào)至約18.5MBq/mL。
從正常昆明小鼠的尾靜脈注射0.1mL(約1.85MBq)99mTc-TMCHI配合物溶液，分別在注射后不同時間(2、5、10、30、60和120分鐘)用定量毛細管從眼底取血10μL，然后在阱型γ探頭中測量其放射性計數(shù)。計算單位體積血液攝取之百分注射劑量(％ID/mL)。每種配合物分別取四組平行數(shù)據(jù)。百分之一注射劑量的計算是取0.1mL(ID)配合物溶液，稀釋100倍后再分別取0.1mL于3支小試管中，在測量組織放射性計數(shù)的同時測量其放射性計數(shù)，百分之一劑量為3支小試管中放射性計數(shù)的平均值。
血藥動力學試驗結(jié)果列于表6中。由此可見，99mTc-TMCHI配合物在小鼠的血液中有很高的攝取(2分鐘時的血液攝取值大于50％ID/mL)。
相對滯留率R*的計算是以2分鐘時的每毫升血液攝取值為基數(shù)，其余各時相的每毫升血液攝取值與之相比，即得到相應(yīng)時相的R*值。圖1所示為99mTc-TMCHI配合物的相對滯留率與時間關(guān)系曲線。由此可見，99mTc-TMCHI配合物在血液中的生物半減期超過了120分鐘，這說明它們在血液中有很好的滯留，符合心血池顯像的要求。而且99mTc-TMCHI配合物的代謝曲線與99mTc-DMP-HSA的血液滯留一時間關(guān)系曲線十分相似(劉華，王學斌，吳戰(zhàn)宏，等.心血池顯像劑99mTc-DMP-HSA的研制(II).北京師范大學學報(自然科學版)，2001，37(4)517-521)。進一步說明了該類配合物與現(xiàn)有的心血池顯像劑99mTc-DMP-HSA至少在小鼠體內(nèi)具有可比性。
表6 正常小鼠體內(nèi)血藥動力學試驗結(jié)果(x±s，n＝4)注射后時間(分鐘)配合物項目2 5 10 3060 120％ID/mL 57.22+0.40 53.52+2.23 48.46+2.89 41.30±2.0034.73+1.46 29.55+2.5799mTc-TMCHIR*1 0.940.85 0.72 0.61 0.528.99mTc-TMCHI的健康犬SPECT顯像試驗按前述方法制備好99mTc-TMCHI配合物溶液。將狗用戊巴比妥施以全麻后取仰臥位固定于床上，由舌下靜脈注射2mL(約555MBq)99mTc-TMCHI配合物溶液，使用TOSHIBA GCA-7200A型雙探頭SPECT儀立即進行動態(tài)平面顯像。并用感興趣區(qū)(ROI)法采集心、肝和肺部放射性計數(shù)，繪制藥物在狗體內(nèi)的代謝曲線。并在注射藥物后30、60、90和120分鐘采集胸部區(qū)域平面圖像。
99mTc-TMCHI配合物在狗體內(nèi)的代謝曲線見圖2，圖中曲線1表示心臟的代謝曲線，曲線2表示肺的代謝曲線，曲線3表示肝的代謝曲線；注射后30、60、90和120分鐘的前、后位胸部平面圖像見圖3A～圖6B(圖3A～圖6B中，箭頭所指方向為心臟位置)。
由圖2可見，在注射藥物后初期心臟有極短時間的高攝取，但幾分鐘后便快速從心臟中清除一部分，然后保持在一個較高的水平上。肝的攝取在初期的極短時間里較心臟攝取低，但很快便超過心臟的攝取。肺攝取始終低于心臟攝取，也即說明99mTc-TMCHI配合物在狗體內(nèi)的心/肝比值小于1，而心/肺比值卻始終大于1。由圖3A和圖3B可以看出99mTc-TMCHI配合物在注射后30分鐘時便可清楚地顯現(xiàn)心臟輪廓，由圖6A和圖6B可見其在血液中的滯留也很好，在注射后120分鐘時，由于本底的降低，使得心臟更加清晰。
根據(jù)99mTc-TMCHI配合物在狗體內(nèi)的顯像結(jié)果，認為其具有發(fā)展為新型心血池顯像劑的潛質(zhì)。
99mTc-CN-R是本發(fā)明人研制出的一類新的99mTc標記異腈配合物，與現(xiàn)有99mTc標記異腈配合物的化學組成不同，其中配體CN-R的R為任選被1～4個相同或不相同的C1-4烷基或烷氧基取代或未取代的C6-10環(huán)烷基。特別是當CN-R為TMCHI和COI時，配合物顯示出優(yōu)良的生物性能，在血液中有較高的攝取，早期就有較高的靶/非靶比值，可用于心血池顯像。與現(xiàn)有心血池顯像劑99mTc-RBC和99mTc-DMP-HSA的明顯不同之處在于后二者均為生物提取物，標記過程復雜，價格昂貴，而且也容易感染病毒。而本發(fā)明的99mTc-TMCHI/COI配合物則克服了現(xiàn)有心血池顯像劑的不足之處TMCHI/COI均為有機小分子，合成簡單，標記方法成熟且容易得到高放射化學純度的配合物，存放時間長，且價格也遠遠低于現(xiàn)有心血池顯像劑。
本發(fā)明所述的配合物為新的锝-99m標記異腈配合物。從小鼠的生物分布數(shù)據(jù)來看，本發(fā)明所述的配合物，特別是配合物99mTc-TMCHI、99mTc-COI的生物性能優(yōu)良，有望發(fā)展為一類具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的99mTc標記心血池顯像劑。與現(xiàn)有的心血池顯像劑99mTc-DMP-HSA在小鼠體內(nèi)生物分布數(shù)據(jù)比較結(jié)果列于表7。由此可見，99mTc-TMCHI/COI在注射后早期均有較高的靶/非靶比值，特別是某些指標要優(yōu)于99mTc-DMP-HSA，可望用于心血池顯像。目前，在狗體內(nèi)的SPECT顯像已取得初步成功，參見圖2～圖6B。
99mTc-CN-R的制備過程經(jīng)藥盒化后十分簡便，特別是價格便宜更加有利于99mTc-TMCHI/COI在臨床上推廣應(yīng)用。
該類配合物能在室溫下穩(wěn)定存在6小時以上以及異常毒性試驗結(jié)果符合要求為其在臨床上的應(yīng)用打下基礎(chǔ)；生物分布實驗結(jié)果表明該類配合物在小鼠的血液中有很高的攝取和很好的滯留，而且非靶本底(如心、肝和肺等)的攝取較低，具有較高的靶/非靶比值；進一步的體外蛋白結(jié)合實驗、血藥動力學試驗以及初步的SPECT顯像實驗均在不同側(cè)面支持了生物分布實驗結(jié)果，表明該類配合物具有用于心血池顯像的潛質(zhì)。
因此，本發(fā)明的放射性锝-99m標記的異腈類配合物其具有制法簡單，成本低，效果好的優(yōu)點，可望成為一種具有良好前景的新型心血池顯像劑。
表799mTc-TMCHI/COI及99mTc-DMP-HSA在小鼠體內(nèi)的每克組織分布比(n＝3)配合物99mTc-TMCHI99mTc-COI99mTc-DMP-HSA[1]注射后時間(分鐘)5 30 60 5 30 60 10 30 60R(血/心)5.966.116.227.305.886.675.17 4.504.46R(血/肺)1.812.121.500.981.492.072.80 4.153.89R(血/肝)4.762.992.161.801.731.542.32 1.931.62R(血/腎)9.106.695.637.455.035.304.75 3.853.22注[1]劉華，王學斌，吳戰(zhàn)宏，等.心血池顯像劑99mTc-DMP-HSA的研制(II).北京師范大學學報(自然科學版)，2001，37(4)517-52權(quán)利要求
1.一種放射性锝-99m標記的異腈類配合物，結(jié)構(gòu)式為 其特征在于，所述配合物以99mTc(I)為中心核，與其配位的異腈類配體用式CN-R表示，其中R為任選被1～4個相同或不相同的C1-4烷基或烷氧基取代或未取代的C6-10環(huán)烷基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的放射性锝-99m標記的異腈類配合物，其特征在于，所述的R為任選被l～4個相同或不相同的C1-4烷基或烷氧基取代或未取代的C6-8環(huán)烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的放射性锝-99m標記的異腈類配合物，其特征在于，所述的R為任選被1～4個甲基取代或未取代的C6-8環(huán)烷基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的放射性锝-99m標記的異腈類配合物，其特征在于，所述的R為環(huán)己基，2-甲基環(huán)己基，2，3-二甲基環(huán)己基，3，3，5-三甲基環(huán)己基，環(huán)庚基或環(huán)辛基。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的放射性锝-99m標記的異腈類配合物的方法，其特征在于，所述的放射性锝-99m標記的異腈類配合物按下述濕法制備將高锝酸根99mTcO4-淋洗液、還原劑與異腈配體CN-R在沸水浴中加熱5～20分鐘，得到產(chǎn)物锝-99m標記的異腈類配合物，其中，還原劑與異腈配體的用量比為(0.1～10)∶(1～20)，高锝酸根99mTcO4-為放射性示蹤量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備權(quán)利要求1所述的放射性锝-99m標記的異腈類配合物的方法，其特征在于，所述的還原劑為SnCl2·2H2O、Na2S2O4或甲脒亞磺酸FSA。
7.一種制備權(quán)利要求1所述的放射性锝-99m標記的異腈類配合物的方法，其特征在于，所述的放射性锝-99m標記的異腈類配合物按下述凍干法制備將還原劑、賦形劑和異腈配體CN-R按(0.1～10)∶(20～100)∶(1～20)的重量比溶于充氮二次水中，無菌過濾后分裝于容器中，經(jīng)冷凍干燥后，加塞密封，得到凍干藥盒；將約18.5～185兆貝可99mTcO4-淋洗液加入凍干藥盒中，搖勻后在60～110℃下加熱5～20分鐘，得到產(chǎn)物锝-99m標記的異腈類配合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的分裝容器為西林瓶，每支凍干藥盒還原劑用量為0.05～5mg；配體的含量為0.5～50mg。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的還原劑為SnCl2·2H2O、Na2S2O4或甲脒亞磺酸FSA；所述的賦形劑為檸檬酸鈉、葡萄糖或維生素C。
10.權(quán)利要求1至4中任一項所述的锝-99m標記的異腈類配合物用作心血池顯像劑。
全文摘要
一種锝－99m標記的異腈類配合物，以
文檔編號C07F13/00GK1504472SQ0215339
公開日2004年6月16日 申請日期2002年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月29日
發(fā)明者張現(xiàn)忠, 王學斌 申請人:北京師范大學