專利名稱：內(nèi)源性凝血激活化合物——在探查內(nèi)源性凝血中的用途的制作方法
本申請(qǐng)涉及用于內(nèi)源性凝血的激活化合物和它們?cè)谄涮讲橹械挠猛尽?br> 由“內(nèi)源性途徑”引發(fā)的凝血在體外由使血液與帶負(fù)電荷表面接觸所導(dǎo)致。在體內(nèi)提供纖維蛋白凝塊生長(zhǎng)的次級(jí)增強(qiáng)。
由“內(nèi)源性途徑”引發(fā)的凝血(以下稱之為“內(nèi)源性凝血”)的探查在試驗(yàn)中用于體外檢測(cè)凝血異常或者監(jiān)測(cè)用具有抗凝血活性的物質(zhì)治療的患者。
內(nèi)源性凝血途徑體外是由與負(fù)電荷接觸的XII因子(f.XII)的活化作用引發(fā)的。在其他酶因子的存在下，例如XI因子(f.XI)、前激肽釋放酶(PK)、高分子激肽原(HMWK)、IX因子(f.IX)——已知也稱抗血友病因子B——和輔因子——抗血友病因子A(f.VIIIc)，在血小板磷脂(PF3)和鈣(Ca++)的同時(shí)存在下激發(fā)酶型活化級(jí)聯(lián)。
在一系列活化作用的最后，被活化的IX因子(f.IX)繼而激發(fā)第二系列酶的活化級(jí)聯(lián)，包括X因子(f.X)和II因子(f.II)——已知也稱凝血酶原；在血小板因子(PF3)、鈣(Ca++)和輔因子——V因子(f.V)的存在下完成該活化作用。
第二活化級(jí)聯(lián)終止于凝血酶(f.IIa)的生成，它轉(zhuǎn)化纖維蛋白原為纖維蛋白，后者是血液或血漿凝塊的主要成分。
簡(jiǎn)化的內(nèi)源性(體外)凝血途徑流程可以如下所述 一般而言，進(jìn)行凝血探查的目的是為了尋找可能患有出血綜合征的患者的生物學(xué)異?；蛘弑O(jiān)測(cè)疾病在凝血水平下的后果，或者監(jiān)測(cè)可以直接或間接改變凝血的醫(yī)療措施。
為此，有人已經(jīng)提出了不同的試驗(yàn)，根據(jù)參與內(nèi)源性凝血途徑的因子的定性或定量觀察，研究影響由凝血酶轉(zhuǎn)化纖維蛋白原所致纖維蛋白生成的不同異常。
不同的試驗(yàn)在商業(yè)上可用于探查內(nèi)源性凝血(已知也稱內(nèi)在凝血)，特別可以提到活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間試驗(yàn)APTT，它能夠在參與內(nèi)源性途徑的因子水平下檢測(cè)血漿樣本中的異?；蛉狈?，這些異常體現(xiàn)在超出正常限度以外的凝血時(shí)間。
進(jìn)行APTT試驗(yàn)的目的是為了了解最常見(jiàn)的體質(zhì)性出血疾病，即維勒布蘭德氏病和血友病A與B。該試驗(yàn)也經(jīng)常用于監(jiān)測(cè)肝素療法。
概言之，APTT試驗(yàn)的原理在于向供試血漿樣本加入帶負(fù)電的XII因子激活物(接觸激活物)和血小板膜磷脂的代用品以及鈣離子。
所測(cè)量的凝血時(shí)間相當(dāng)于在加入接觸激活物、血小板代用品、鈣與凝血塊出現(xiàn)之間的時(shí)間。它是轉(zhuǎn)化血漿中凝血酶原的1％為凝血酶所需的時(shí)間。然后在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生纖維蛋白的生成。鈣是系統(tǒng)的激發(fā)要素。
適合于進(jìn)行APTT試驗(yàn)的激活物是相當(dāng)多的。它們例如包括固體激活物，例如二氧化硅、玻璃或高嶺土，或液體激活物，例如鞣花酸(逆沒(méi)食子酸)及其衍生物或硫苷酯類。
盡管基于固體激活物的試劑得到廣泛使用，不過(guò)它們不是沒(méi)有某些缺點(diǎn)的。它們所含有的高嶺土或二氧化硅顆粒趨向于在凝血試驗(yàn)期間沉降出來(lái)。因此，必須加以連續(xù)攪拌，產(chǎn)生有關(guān)試劑不穩(wěn)定性和難以在自動(dòng)儀器中進(jìn)行試驗(yàn)的問(wèn)題。進(jìn)而，諸如高嶺土等激活物不能用于進(jìn)行光學(xué)凝血測(cè)量。
液體激活物是固體激活物的替代選擇。不過(guò)，諸如鞣花酸等激活物已知容易誘發(fā)試驗(yàn)結(jié)果改變。進(jìn)而，它們的敏感性與前述試劑相比減低了。有人已經(jīng)提出了各種聯(lián)合使用，以改進(jìn)這類試劑的性能。作為實(shí)例，國(guó)際專利申請(qǐng)WO-A-91/16453推薦基于鞣花酸、苯酚和金屬離子的試劑，優(yōu)選地與硫酸葡聚糖聯(lián)用。
有文獻(xiàn)已經(jīng)描述過(guò)其他接觸激活物溶液，特別是歐洲專利EP-A-0525035，其中接觸激活物是羥基取代的芳族化合物，選自沒(méi)食子酸鹽和鞣酸；國(guó)際專利申請(qǐng)WO-A-98/44352，其中接觸激活物是鞣花酸；和美國(guó)專利US-A-5550028，其中接觸激活物是四羥基-1，4-醌。
有人還提出硫苷酯類作為經(jīng)由內(nèi)在途徑凝血的激活化合物。不過(guò)，它們的活性水平一直不被認(rèn)為是足夠的，這類化合物的進(jìn)一步缺點(diǎn)在于比其他可利用的激活物相對(duì)昂貴。
因此，需要新穎的凝血試劑或者改進(jìn)現(xiàn)有的試劑，在保留從經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)來(lái)看的優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，具有足夠的穩(wěn)定性和敏感性，誘導(dǎo)較短的活化時(shí)間，能夠用于自動(dòng)分析儀器，以大量進(jìn)行試驗(yàn)。
本發(fā)明涉及這類替代的接觸激活物，它們能夠參與內(nèi)源性凝血和產(chǎn)生系統(tǒng)與試驗(yàn)，它們能夠探查這種內(nèi)源性凝血，檢測(cè)異常。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些激活物在APTT型測(cè)定法中的用途，該測(cè)定法用于探查內(nèi)源性凝血。
按照特定的實(shí)施方式，內(nèi)源性凝血的激活物與這樣的化合物有關(guān)，它們可以關(guān)于在某些病理學(xué)中所面臨的一些凝血時(shí)間異常來(lái)調(diào)節(jié)用于APTT的試劑的響應(yīng)敏感性。
在能夠激活內(nèi)源性凝血的物質(zhì)的研究上下文中，本發(fā)明人已經(jīng)研究了與目前在APTT試驗(yàn)中用作凝血激活物的化合物相比具有有利的溶解性質(zhì)的化合物，特別是從沒(méi)食子酸開(kāi)始，它們已經(jīng)研究了能夠激活內(nèi)源性凝血的衍生物。
在不涉及本發(fā)明領(lǐng)域的領(lǐng)域中，專利申請(qǐng)DE2750560A1描述了用乙二醇或各種聚乙二醇酯化沒(méi)食子酸所得到的酯。這些酯用作玻璃纖維的保護(hù)材料，包括在含有混凝土的復(fù)合材料中。
在另一領(lǐng)域中，也就是用于對(duì)抗食品中的脂肪與油變質(zhì)的抗氧化化合物領(lǐng)域，Weetall H.H.(Applied Biochemistry andBiotechnology(應(yīng)用生物化學(xué)與生物工程)，vol11，1985)提出從沒(méi)食子酸合成酯，特別是利用醇和二醇。該出版物指出，如果酯和二醇酯的確是利用鞣酸酶從黑曲霉(Aspergillus niger)合成的，那么產(chǎn)物的具體性質(zhì)仍然有待測(cè)定。
有關(guān)試劑是內(nèi)源性凝血途徑的接觸激活物，在PF3和鈣的存在下，在37℃下培育血漿樣本后，能夠具有促凝血活性，也就是激活XII因子為活化的XIIa因子的活性。
優(yōu)選地，這些化合物是可溶的，或者如果必要的話可以在修飾后被賦予可溶性。
因此，本發(fā)明提供下式化合物 其中·A選自下式 或 Mq+代表陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2；·R代表 或 m等于2、3、4或5，n是1與170之間的整數(shù)；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外來(lái)氨基酸，r是1與10之間的整數(shù)。
上文定義的化合物中，本發(fā)明在特定的實(shí)施方式涉及這樣的化合物，它們具有能夠被溶解的優(yōu)點(diǎn)，特別是在含水溶液中。優(yōu)選地，它們是完全可溶的。
由上文已給出含義的R構(gòu)成的側(cè)鏈?zhǔn)沁@樣的，n值優(yōu)選在1或以上與170或以下之間。確切地說(shuō)，n在1至50的范圍內(nèi)，例如1至30，1至20是有利的。
特別優(yōu)選地，n等于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
按照本發(fā)明，第一類優(yōu)選的化合物定義如下 其中R代表 或 m等于2、3、4或5，n是1與170之間的整數(shù)；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外來(lái)氨基酸，r是1與10之間的整數(shù)。
本發(fā)明的第一種優(yōu)選實(shí)施方式中，在式(I)或(II)之一中，R代表 m和n具有上文給出的含義。
有利地，在本發(fā)明上下文中，式(II)化合物是這樣的R代表-[-O-CH2-CH2-]n-OH其中n是1與170之間的整數(shù)，優(yōu)選在1與10之間。
這種優(yōu)選形式的本發(fā)明化合物(II)相當(dāng)于聚乙二醇沒(méi)食子酸酯的氧化形式。
這種氧化形式是由式(II)中芳族環(huán)的-OH基團(tuán)之一在堿性介質(zhì)中的氧化作用所得的醌形式。
本發(fā)明化合物在進(jìn)一步的方面還可以由具有下式的一類構(gòu)成，它們相當(dāng)于離子化形式的式(III)，與在本發(fā)明文件中所定義的一價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子締合 其中R代表 m等于2、3、4或5；n是1與170之間的整數(shù)；Mq+是陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2。
除了4-位醌以外，這種第二類具有式(III)的本發(fā)明化合物在離子化形式(醇化鈉)中包含兩個(gè)-OH官能團(tuán)(3-位和5-位)，當(dāng)介質(zhì)的pH大于pKa時(shí)生成離子化形式。
確切地說(shuō)，本發(fā)明涉及氧化的乙二醇或聚乙二醇的沒(méi)食子酸酯的堿形式，所述化合物在堿性介質(zhì)中與陽(yáng)離子締合。
優(yōu)選地，它是乙二醇沒(méi)食子酸酯的堿形式，其中R具有上文給出的含義，m＝2，n＝1。
這種堿形式的氧化的乙二醇沒(méi)食子酸酯是水溶性的。
為了能夠使用，所得組合物的pH必須減少至生理學(xué)上可接受的值。加入陽(yáng)離子可以加速和穩(wěn)定化平衡在生理pH下向醌的鈉形式(根據(jù)式III)移動(dòng)，這賦予其立即凝血的性質(zhì)。
上文確定的式(I)化合物中，本發(fā)明有利地提供如下定義的化合物 其中·A是 或， ·R是-CH2-CH2-OH；
Mq+是陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2。
這些化合物分別是氧化的乙二醇沒(méi)食子酸酯的酸形式和氧化的乙二醇沒(méi)食子酸酯的堿或鹽形式。
堿性醌鹽形式是以在355nm波長(zhǎng)下可檢測(cè)的黃色為特征的，由于其在含水介質(zhì)中的溶解性而是特別有利的。
為了制備上文和下文定義的本發(fā)明化合物，陽(yáng)離子Mq+有利地是金屬陽(yáng)離子，特別是Mn2+或Cu2+或Co2+。
作為替代選擇，它可以由非金屬陽(yáng)離子構(gòu)成，例如反荷離子，它在本發(fā)明化合物的制備期間通過(guò)在堿性介質(zhì)中加熱得到供應(yīng)。下文定義了這樣一種制備方法，Mq+有利地是Na+、K+或NH4+。
陽(yáng)離子的濃度可以被定義為對(duì)正常參照樣本所觀察到的凝血時(shí)間的函數(shù)。對(duì)金屬離子有利的是，該濃度在5微摩爾(μM)至15μM范圍內(nèi)，優(yōu)選約10μM。
本發(fā)明在進(jìn)一步特定的實(shí)施方式提供一類式(I)化合物 其中·A選自下式 其中Mq+代表陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2；·R代表-[-NH-CH2-CH2-]n-NH2，其中n是1與170之間的整數(shù)。
確切地說(shuō)，在R的定義的上下文中，n在1至50的范圍內(nèi)，例如1至30，1與20之間是有利的。
優(yōu)選的聚乙二胺沒(méi)食子酸酯是由氧化芳族環(huán)上-OH基團(tuán)之一所得到的醌形式。它相當(dāng)于下式 其中n是1與170之間的整數(shù)；優(yōu)選在1至50的范圍內(nèi)，例如1至30，1至20是有利的。
上式中，n特別優(yōu)選地等于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
有利地，它是乙二胺沒(méi)食子酸酯(n＝1)。
本發(fā)明化合物還可以是與一價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子、特別是金屬陽(yáng)離子締合的形式。這些化合物具有下式 ·其中n是1與170之間的整數(shù)；·Mq+是陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2。
確切地說(shuō)，n在1至50的范圍內(nèi)，例如1至30，1至20是有利的。
特別優(yōu)選地，n等于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
本發(fā)明在第三種實(shí)施方式提供一種化合物，其特征在于它具有式(I) 其中·A選自下式 或，
其中Mq+代表陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2；·R是氨基酸殘基或肽。
優(yōu)選地，如本發(fā)明的前兩種實(shí)施方式所示，本發(fā)明化合物是由芳族環(huán)上-OH基團(tuán)之一的氧化作用所得到的醌形式 或者是與一價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子締合的形式 其中M、q和p具有上文給出的定義。
優(yōu)選用于制備上述化合物的氨基酸是絲氨酸，其中 在這種情況下，本發(fā)明化合物有利地具有下式 或 M、q和p具有上文給出的含義。
本發(fā)明還提供一種組合物，其特征在于它包含多種化合物的混合物，特別是至少兩種選自上述那些的化合物的混合物，無(wú)論化合物來(lái)自上述那些相同的類或相同的組，或者相反，化合物屬于上述那些不同的類或組。
確切地說(shuō)，組合物的特征在于它包含至少兩種不同的下式化合物 這些化合物關(guān)于基團(tuán)A是相同或不同的，關(guān)于基團(tuán)R是相同或不同的，A和R具有上文給出的含義。
本發(fā)明優(yōu)選涉及一種組合物，其特征在于它包含化合物(IV)與(V)的混合物，分別構(gòu)成氧化的乙二醇沒(méi)食子酸酯(EGGox)的酸與堿形式，具有下式 和 M、q和p具有上述定義。
因此，該組合物包含氧化的乙二醇沒(méi)食子酸酯的酸與堿形式的混合物，相當(dāng)于在堿性介質(zhì)中加熱時(shí)或者在金屬陽(yáng)離子的存在下從乙二醇沒(méi)食子酸酯所得酮-烯醇平衡的產(chǎn)物。
通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)條件，特別是改變反應(yīng)介質(zhì)中的pH或陽(yáng)離子濃度，氧化的乙二醇沒(méi)食子酸酯的酸與堿形式之間的平衡可以向這些形式之一移動(dòng)。
有利地，所定義的組合物的特征在于它是一種溶液，優(yōu)選為含水溶液。
在前述定義的上下文中，本發(fā)明在特定的方面涉及一種組合物，其中氧化的乙二醇沒(méi)食子酸酯的式(V)堿形式是主要的。
關(guān)于構(gòu)成用于內(nèi)源性凝血的激活組合物，特別是用于進(jìn)行探查內(nèi)源性凝血的體外試驗(yàn)，這種水溶性堿形式具有完全有利的性質(zhì)。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，上述定義之一的組合物具有生理學(xué)上可接受的堿性pH。該pH是在氧化EGG后調(diào)節(jié)的，例如在緩沖分子的存在下MOPS((N-嗎啉代基)丙磺酸)或TRICINE(N-三(羥甲基)甲基甘氨酸)。選擇MOPS分子是有利的。
在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，組合物的特征在于它包含沒(méi)食子酸酯的不同形式的混合物，由酮-烯醇平衡生成，具有下式 M、q和p具有上文給出的定義之一。
沒(méi)食子酸酯烯醇化物的一種或另一種形式的存在取決于反應(yīng)條件，酮-烯醇平衡因此移動(dòng)得到更多或更少量的所生成的沒(méi)食子酸酯形式之一。
在本發(fā)明的上下文中，傾向于存在式(V)的氧化的沒(méi)食子酸酯的式(V)堿形式。
優(yōu)選的本發(fā)明化合物和組合物還可以被定義為進(jìn)行一種方法的結(jié)果，該方法包含下列步驟·用乙二醇酯化沒(méi)食子酸，回收由乙二醇沒(méi)食子酸酯(EGG)構(gòu)成的反應(yīng)產(chǎn)物之一，具有下式 ·使EGG與堿性介質(zhì)接觸，并加熱至70℃至90℃的溫度，移動(dòng)酮-烯醇平衡。
酮-烯醇平衡形成反應(yīng)有利地在80℃下進(jìn)行24小時(shí)。
利用上述方法制備得到3種沒(méi)食子酸酯形式的混合物，所述混合物有可能向氧化形式移動(dòng)。
優(yōu)選地，所得組合物的特征在于該方法進(jìn)一步包含下列步驟·通過(guò)調(diào)節(jié)pH，穩(wěn)定化所得酮-烯醇平衡；·在堿性pH下回收溶液中的式(IV)與(V)化合物。
EGG的氧化形式是在氫氧化鈉的存在下生成的，特別是過(guò)量的氫氧化鈉，使酮-烯醇平衡向氧化的乙二醇沒(méi)食子酸酯的堿形式移動(dòng)。熱處理是在70℃至90℃的溫度下進(jìn)行的，優(yōu)選為80℃，時(shí)間為24小時(shí)。
溶液的pH是堿性pH，加入緩沖劑可以終止氫氧化鈉的作用，緩沖劑有助于穩(wěn)定化所得酮-烯醇平衡。特別優(yōu)選地，本發(fā)明組合物的pH在7.6至7.8范圍內(nèi)。
所加入的緩沖劑例如可以是MOPS或TRIS緩沖劑。
組合物含有本發(fā)明化合物的濃度在100μM至1000μM范圍內(nèi)。
在本發(fā)明上下文中所定義的組合物和化合物與血漿樣本接觸后能夠激活內(nèi)源性凝血；換句話說(shuō)，在約37℃的溫度下，在PF3和鈣的存在下，在與血漿樣本接觸和培育之后，它們能夠激活XII因子為XIIa因子。
本發(fā)明還涉及用于體外檢查血液樣本內(nèi)源性凝血的試劑系統(tǒng)，該系統(tǒng)在其試劑中包括如上定義的化合物或組合物。
優(yōu)選的本發(fā)明試劑包含下式?jīng)]食子酸鹽的活化形式 M、q和p具有上文給出的定義；R代表 或 m等于2、3、4或5，n是1與170之間的整數(shù)；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外來(lái)氨基酸，r是1與10之間的整數(shù)。
確切地說(shuō)，在R的定義上下文中，n在1至50的范圍內(nèi)，例如1至30，1至20是有利的。
在上式中特別優(yōu)選地，n等于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在測(cè)定本發(fā)明化合物的濃度時(shí)考慮這樣的事實(shí)，在APTT系統(tǒng)中，健康受試者血漿的預(yù)期凝血時(shí)間一般在28至40秒的范圍內(nèi)。在這種上下文下，本發(fā)明化合物和其他用于凝血試驗(yàn)的成分的濃度可以從健康血漿樣本的所需凝血時(shí)間加以限定。確切地說(shuō)，本發(fā)明化合物的濃度可以在100μM與1000μM之間。
優(yōu)化試劑主要成分濃度的目的在于使凝血時(shí)間對(duì)至少30名健康受試者血漿樣本來(lái)說(shuō)都在這種間隔內(nèi)。
進(jìn)而，優(yōu)化關(guān)于APTT試劑活性成分的生化參數(shù)可以使時(shí)間延長(zhǎng)，由此可以調(diào)節(jié)對(duì)某些被APTT試驗(yàn)揭示的疾病的檢測(cè)敏感性。因此，例如，在狼瘡抗凝物綜合征的病例中見(jiàn)到過(guò)時(shí)間比健康參照受試者延長(zhǎng)至少20％。關(guān)于用未分級(jí)的肝素抗凝劑治療的受試者血漿，見(jiàn)到時(shí)間比參照時(shí)間延長(zhǎng)1.5至3.0倍。關(guān)于A與B型血友病，需要最大可能的敏感性，時(shí)間大為延長(zhǎng)。
優(yōu)選地，如此構(gòu)成的試劑包含活化的乙二醇沒(méi)食子酸酯?；钚詠?lái)自所得酮-烯醇平衡及其在生理學(xué)上可接受的pH下的穩(wěn)定化作用。
在特定的發(fā)明實(shí)施方式中，沒(méi)食子酸酯、特別是乙二醇沒(méi)食子酸酯在所述組合物或試劑系統(tǒng)中的濃度有利地在100至1000μM范圍內(nèi)，優(yōu)選為100μM。
本發(fā)明還涉及上述定義中的任意化合物或任意組合物用于制備試劑用途，該試劑用于探查內(nèi)源性凝血，尤其用于進(jìn)行APTT試驗(yàn)，其中所述化合物或組合物是與一種成分締合的，該成分具有調(diào)節(jié)本發(fā)明化合物或組合物的響應(yīng)敏感性的活性。
敏感性的調(diào)節(jié)可以在于減少對(duì)血漿樣本所觀察到的凝血時(shí)間的延長(zhǎng)，這些血漿樣本來(lái)自患有狼瘡抗凝固類型病變的患者或者用抗凝物質(zhì)治療的患者，例如基于非分餾的肝素抗凝劑。
作為替代選擇，這種敏感性的調(diào)節(jié)可以在于減少對(duì)非病理血漿樣本所測(cè)量到的凝血時(shí)間。
這樣一種適合于調(diào)節(jié)用本發(fā)明化合物或組合物制備的試劑的敏感性的成分是一種聚氨基酸，特別是取代的聚氨基酸，尤其是部分取代，取代涉及被琥珀?；?-CO-CH2-CH2-COOH)或戊二?；?-OC(CH2)3CO)取代的氨基。
取代必須不會(huì)影響原始成分的空間構(gòu)型和/或穩(wěn)定性，在這樣的情況下被取代的聚氨基酸將不再能夠?qū)崿F(xiàn)其對(duì)敏感性的調(diào)節(jié)作用。
出于這些原因，完全取代的聚氨基酸將是不適宜的。
按照優(yōu)選的發(fā)明實(shí)施方式，調(diào)節(jié)成分是取代的聚賴氨酸(D-或L-聚賴氨酸或其混合物)，尤其是琥珀酰化的，例如它是取代的L-聚賴氨酸，琥珀?；腖-聚賴氨酸是有利的。本發(fā)明人尤其使用琥珀?；腖-聚賴氨酸，在SIGNMA目錄(2001-2002)中可以查到。還可以使用戊二?；木圪嚢彼?。
有利地可以使用琥珀?；腖-聚賴氨酸，其分子量在20000至300000Da的范圍內(nèi)，優(yōu)選50000至300000Da。
調(diào)節(jié)成分在為了進(jìn)行APTT試驗(yàn)而制備的試劑中的濃度、特別是琥珀?；疞-聚賴氨酸(SIGMA)的濃度在10至100μg/ml的范圍內(nèi)，優(yōu)選50至100μg/ml。
可以在制備用于探查內(nèi)源性凝血的試驗(yàn)、例如APTT的試劑期間的任意時(shí)間加入取代的聚氨基酸，特別是琥珀?；木圪嚢彼帷?br> 除了用于內(nèi)源性凝血的接觸激活物以外，本發(fā)明的試劑系統(tǒng)還包含血小板膜磷脂的代用品。這種代用品可以是腦磷脂從哺乳動(dòng)物大腦提取的磷脂懸液。
本發(fā)明還涉及一種試劑系統(tǒng)，它還包含獨(dú)立于其他試劑的Ca2+離子，用于激發(fā)參與內(nèi)源性途徑的因子的活化作用。
本發(fā)明試劑和為了進(jìn)行APTT試驗(yàn)而酌情使用的其他成分可以被安排在試劑盒內(nèi)。
用于探查凝血、特別是內(nèi)源性凝血的本發(fā)明化合物、組合物或試劑可以用于測(cè)量血液樣本、特別是血漿樣本的活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)。在這一點(diǎn)上，我們有利地使用排除了血小板的血漿。
在這種測(cè)量的上下文中，用于進(jìn)行該試驗(yàn)的正常條件特別要符合樣本制備。
血漿樣本最初可以用檸檬酸鹽處理，例如使樣本中所含有的Ca2+離子形成配合物，以便樣本不再能夠凝固。然后用作為凝血激活物的本發(fā)明化合物或組合物和磷脂代用品培育樣本。然后加入Ca2+離子，加入量等于已經(jīng)形成配合物的量，以激發(fā)凝血。
本發(fā)明化合物或組合物的活性要求它們的pH是生理學(xué)上可接受的數(shù)值。
本發(fā)明的化合物、組合物或試劑還可以用于測(cè)定全血的凝血時(shí)間或血漿的凝血時(shí)間。
因此，本發(fā)明還可涉及根據(jù)上述說(shuō)明的化合物或組合物在試劑系統(tǒng)制備中的用途，該試劑系統(tǒng)用于檢查參與內(nèi)源性凝血途徑的凝血因子。有關(guān)因子主要是XII、XI、IX和VIII因子。
在這里的上下文中，本發(fā)明例如涉及與維勒布蘭德氏病、血友病A與B有關(guān)的異常的檢測(cè)或者抗凝劑的檢測(cè)。這些異常導(dǎo)致APTT時(shí)間超出正常值以外，后者通常在20與40秒之間。
因此，本發(fā)明還涉及用于測(cè)量活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)的方法，包含下列步驟·在允許內(nèi)源性凝血途徑活化的條件下，在血小板膜磷脂代用品的存在下，使排除了血小板的血漿樣本與根據(jù)本發(fā)明的化合物或組合物接觸；
·加入Ca2+離子，加入量等于這些離子在血漿樣本中已經(jīng)形成配合物的量；·測(cè)量轉(zhuǎn)化纖維蛋白原為纖維蛋白所需的時(shí)間。
確切地說(shuō)，在進(jìn)行上述方法的上下文中，血漿樣本由排除了血小板的血漿構(gòu)成，在37℃下用血漿培育凝血激活物達(dá)約2至5分鐘。磷脂膜代用品是在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)加入的，或者是與激活物混合的，或者是在反應(yīng)期間單獨(dú)加入的。
然后加入鈣離子，例如氯化鈣的形式，濃度在20mM至25mM的范圍內(nèi)。然后測(cè)量纖維蛋白生成所需的時(shí)間。
當(dāng)它超出相當(dāng)于正常凝血情形的時(shí)間間隔(也就是在20與40秒之間)時(shí)，所測(cè)量的時(shí)間表明內(nèi)源性凝血途徑的參數(shù)之一處于異常狀態(tài)，包括缺失，或者表明在供試血漿中存在抗凝化合物。
當(dāng)供試血漿包含異常量的內(nèi)源性凝血途徑因子時(shí)，本發(fā)明可以利用這樣一種系統(tǒng)定量分析有關(guān)因子，該系統(tǒng)排除了該因子，其中所有其他參數(shù)都是被過(guò)量引入的。在這種系統(tǒng)中，在加入所要研究的血漿之后，只有所要測(cè)定的因子是限量的。
本發(fā)明還涉及用于制備下式化合物的方法 其中·A代表選自下式的一種或多種化合物 Mq+代表陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2；·R代表 或， m等于2、3、4或5，n是1與170之間的整數(shù)；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外來(lái)氨基酸，r是1與10之間的整數(shù)；所述方法包含下列步驟·在含有至少一個(gè)醇官能團(tuán)的化合物的存在下酯化沒(méi)食子酸，或者在含有至少一個(gè)胺官能團(tuán)的化合物的存在下酰胺化沒(méi)食子酸；·使所得沒(méi)食子酸衍生物與OH-離子接觸，生成下式化合物 ·在能夠生成下式配合物的條件下加入金屬陽(yáng)離子Mq+(其中q等于1或2) ·通過(guò)加入緩沖劑，例如MOPS或TRICINE，在生理學(xué)上可接受的pH下穩(wěn)定化合物(II)與(III)之間所得平衡；·回收所得溶液。
這種方法優(yōu)選地是這樣的，在乙二醇的存在下進(jìn)行酯化作用，生成乙二醇沒(méi)食子酸酯，由此當(dāng)反應(yīng)完全時(shí)，可以回收酮-烯醇平衡的產(chǎn)物，確切地包含氧化的乙二醇沒(méi)食子酸酯的酸與堿形式，如果必要的話，還有殘余量的乙二醇沒(méi)食子酸酯。
該方法的定義涵蓋優(yōu)選類或組的本發(fā)明化合物或組合物的定義。
在特定的發(fā)明實(shí)施方式中，可能需要回收大部分氧化的乙二醇沒(méi)食子酸酯的式(V)堿形式，為此向這種堿形式移動(dòng)平衡可以是有利的。
本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了進(jìn)一步的方法，用于制備具有內(nèi)源性凝血活化性質(zhì)的本發(fā)明式A化合物。該方法包含下列步驟·酯化沒(méi)食子酸；·在緩沖溶液中，在堿性pH下，加熱所得沒(méi)食子酸酯至70℃至90℃的溫度，優(yōu)選為80℃，達(dá)16小時(shí)至24小時(shí)，優(yōu)選為24小時(shí)；·回收存在于溶液中的不同形式的沒(méi)食子酸酯。
本發(fā)明的其他性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)將因下列實(shí)施例而變得顯而易見(jiàn)，它們構(gòu)成發(fā)明主題的優(yōu)選實(shí)施方式和再現(xiàn)方式。
實(shí)施例1本例中，用利用各種陽(yáng)離子制備的本發(fā)明APTT試劑測(cè)量凝血時(shí)間。測(cè)試了不同類型的血漿，包括正常的和被APTT試驗(yàn)揭示有疾病的·CK-Prest＝參照APTT試劑，其中接觸激活物是高嶺土；·pool N＝來(lái)自健康受試者的等量血漿的混合物；·CCN＝凝血對(duì)照正常對(duì)照血漿，正常水平；·CCP＝凝血對(duì)照病理對(duì)照血漿，疾病水平；·肝素＝接受抗凝劑治療的患者血漿，抗凝劑是基于未分級(jí)的肝素的鈉或鈣鹽形式；·狼瘡＝表現(xiàn)狼瘡抗凝物綜合征的患者血漿；·def.f.VIIIc＝表現(xiàn)f.VIIIc缺乏(血友病A)的患者血漿。
測(cè)量是利用一種止血儀器(STA-Diagnostica Stago)進(jìn)行的。
實(shí)施例2下例中，利用從沒(méi)食子酸的酰胺或酯所得APTT試劑測(cè)定不同血漿的凝血時(shí)間。
·正常血漿＝等量正常受試者血漿的混合物；·CCN＝凝血對(duì)照正常對(duì)照血漿，正常水平；·CCP＝凝血對(duì)照病理對(duì)照血漿，疾病水平；·肝素＝接受抗凝劑治療的患者血漿，抗凝劑是基于未分級(jí)的肝素的鈉或鈣鹽形式；·狼瘡＝表現(xiàn)狼瘡抗凝物綜合征的患者血漿；·def.f.VIIIc＝表現(xiàn)f.VIIIc缺乏(血友病A)的患者血漿。
從該表可以看出，利用乙二醇沒(méi)食子酸酯得到最接近于參照試劑CK-Prest的結(jié)果。
實(shí)施例3在80℃下加熱24小時(shí)后，500μM乙二醇沒(méi)食子酸酯的pH7.00溶液在APTT凝血試驗(yàn)中變?yōu)榛钚?。下表顯示分子的活化動(dòng)力學(xué)。
比較乙二醇沒(méi)食子酸酯溶液與參照試劑CK-PREST的促凝血活性，后者是其中激活物為高嶺土的APTT試劑。用于測(cè)量凝血時(shí)間的儀器是自動(dòng)STA Diagnostica Stago止血儀(系列n°307)。
出現(xiàn)凝血活性的同時(shí)，顯現(xiàn)黃色，可在355nm下測(cè)量。
供試血漿是定性對(duì)照血漿CCN＝凝血對(duì)照正常；CCP＝凝血對(duì)照病理，批次n°980901。
所制備的APTT試劑＝乙二醇沒(méi)食子酸酯，500μM，在80℃下氧化+Tricine，50mM，pH7.00+腦磷脂(血小板磷脂代用品)。
實(shí)施例4在合理的加熱時(shí)間(＜4天)內(nèi)，從常用于生物系統(tǒng)的那些選擇的各種緩沖分子可以產(chǎn)生顯著的促凝血活性，接近于參照試劑CK-PREST。它們是下列分子·TRICINEN-三(羥甲基)甲基甘氨酸；·HEPESN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸；·MOPS(N-嗎啉代基)丙磺酸；·TRIS[三(羥甲基)氨基甲烷]。
TRICINE和MOPS緩沖劑是優(yōu)選使用的，至于TRIS，在乙二醇沒(méi)食子酸酯的活化期間出現(xiàn)沉淀，至于HEPES緩沖劑，加熱不得不進(jìn)行更長(zhǎng)的時(shí)間。下表顯示關(guān)于2份對(duì)照血漿(正常和病理)、1份健康供體血漿混合物和4份表現(xiàn)在APTT型凝血系統(tǒng)中可檢測(cè)的疾病的血漿所得情況·pool N＝大量正常血漿的混合物；·CCN＝凝血對(duì)照正常對(duì)照血漿，正常水平；·CCP＝凝血對(duì)照病理對(duì)照血漿，病理水平；·LA＝患有狼瘡抗凝物綜合征的患者血漿；·Hep＝接受抗凝劑治療的患者血漿，抗凝劑是基于未分級(jí)的肝素的鈣鹽形式。測(cè)試了2種肝素血水平的兩份血漿0.09和0.034國(guó)際單位每ml；·def.f.VIIIc＝血友病A的血漿，VIIIc因子的活性為40％。
所得凝血時(shí)間以秒表示。
計(jì)算患者血漿所得凝血時(shí)間除以正?；旌衔锼媚獣r(shí)間之比或者病理凝血對(duì)照(CCP)除以正常對(duì)照(CCN)之比，得到用4種緩沖劑所制備的每種試劑的響應(yīng)敏感性。
R＝患者凝血時(shí)間/Pool N凝血時(shí)間
實(shí)施例5APTT試劑的使用具有兩個(gè)目的·利用正常-異常響應(yīng)進(jìn)行內(nèi)源性血液凝固途徑的一般性探查；·分析與定量探查參與內(nèi)源性凝血途徑的凝血因子f.XII-XI-IX-VIIIc；·有可能利用這樣一種系統(tǒng)在患者血漿中測(cè)定內(nèi)源性途徑中的任意凝血因子，該系統(tǒng)被特別排除了該因子。所有其他參數(shù)是被過(guò)量引入的；只有所要測(cè)定的因子是限量的。在相同條件下生成校準(zhǔn)曲線，在與之比較后活性成為可量化的。根據(jù)缺乏的多少，凝血時(shí)間在或多或少的程度上延長(zhǎng)了(參見(jiàn)VIIIc因子的例子)。

如此構(gòu)成的APTT試劑的最佳活性取決于乙二醇沒(méi)食子酸酯和腦磷脂的濃度。
下表顯示不同病癥和一些對(duì)照的代表性血漿所得結(jié)果。
濃度可以在100μM至1000μM的范圍內(nèi)選擇。我們的優(yōu)選濃度是100μM。
最佳腦磷脂濃度的測(cè)定
實(shí)施例7選擇氯化錳的濃度本例中，利用按照本發(fā)明制備的APTT試劑測(cè)量凝血時(shí)間，其中氯化錳的濃度是不同的。
供試血漿是定性對(duì)照血漿。使用兩種水平正常水平和病理水平。
同時(shí)測(cè)試商品CK Prest試劑，構(gòu)成參照。
優(yōu)選地，濃度采用10μM。
實(shí)施例8可以有利的是能夠調(diào)節(jié)APTT試劑對(duì)于在各種病理情形中觀察到的某些凝血時(shí)間異常的響應(yīng)敏感性。這種調(diào)節(jié)作用的目的在于獲得具有與響應(yīng)敏感性有關(guān)的特定性質(zhì)的試劑，這些性質(zhì)從一個(gè)生產(chǎn)批次到另一個(gè)批次是可再現(xiàn)的。
本發(fā)明人已經(jīng)觀察到，在含有乙二醇沒(méi)食子酸酯的APTT試劑中加入琥珀?；疞-聚賴氨酸(SIGMA)時(shí)，從表現(xiàn)狼瘡抗凝物綜合征的患者或者從用基于未分級(jí)的肝素的抗凝劑治療的患者所得血漿有可能減少凝血時(shí)間。而且還觀察到，琥珀?；疞-聚賴氨酸的使用可以減少對(duì)正常人群所得血漿所測(cè)量的凝血時(shí)間。
通過(guò)使用或多或少在氨基水平上被琥珀?；蛭於；〈木郯被峥梢缘玫竭@些觀察結(jié)果，目的是定義試劑的敏感性水平。
一種優(yōu)選的發(fā)明實(shí)施方式在于使用部分取代的L-聚賴氨酸。下表總結(jié)實(shí)施例所用各種對(duì)照血漿所得到的結(jié)果。
CCN凝血對(duì)照正常CCP凝血對(duì)照病理Pool N大量正常血漿的混合物L(fēng)A表現(xiàn)狼瘡抗凝物綜合征的患者血漿肝素接受基于未分級(jí)的肝素的抗凝劑治療的患者血漿Def VIII C血友病A血漿，VIII因子活性為40％
關(guān)于琥珀?；疞-聚氨酸在本發(fā)明框架內(nèi)的使用，琥珀?；疞-聚氨酸的分子量?jī)?yōu)選在50000至300000Da的范圍內(nèi)，對(duì)于該范圍分子量的濃度優(yōu)選為50μg/ml。
權(quán)利要求
1.下式化合物 其中·A選自下式 Mq+代表陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2；·R代表 ，或 m等于2、3、4或5，n是1與1 70之間的整數(shù)；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外來(lái)氨基酸，r是1與10之間的整數(shù)，其條件是若m是2、3或4，則該化合物不是
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，具有下式 其中R代表-[-O-CH2-CH2-]n-OHn是1與170之間的整數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，具有下式 其中·R代表-[-O-CH2-CH2-]n-OH，其中n是1與170之間的整數(shù)；·M+代表陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的化合物，具有式(II)或(III)，其中R代表-[-O-CH2-CH2-]n-OHn是1與10之間的整數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中n等于1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)的化合物，具有下式 其中·A是 或， M+是陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2；·R是-CH2-CH2-OH。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，具有下式 其中·A是 或， M+是陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2；·R是天然或外來(lái)氨基酸殘基或肽，優(yōu)選為絲氨酸。
8.組合物，其特征在于它包含至少兩種不同的下式化合物的混合物 這兩種化合物關(guān)于基團(tuán)A是相同或不同的，關(guān)于基團(tuán)R是相同或不同的，所述基團(tuán)A和R是這樣的·A選自下式 M+代表陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2；·R代表 或， m等于2、3、4或5，n是1與170之間的整數(shù)，優(yōu)選在1與50、1與30或1與20之間；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外來(lái)氨基酸，r是1與10之間的整數(shù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其特征在于它包含化合物(IV)與(V)的混合物，分別構(gòu)成氧化的乙二醇沒(méi)食子酸酯的酸與堿形式，具有下式 和 其中M+是陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的組合物，其特征在于它包含不同形式的乙二醇沒(méi)食子酸酯，由酮-烯醇平衡生成，具有下式 其中·A選自下式 或， M+代表陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2；·R是-CH2-CH2-OH。
11.能夠通過(guò)進(jìn)行這樣一種方法獲得的組合物，該方法包含下列步驟·用乙二醇酯化沒(méi)食子酸，回收由乙二醇沒(méi)食子酸酯(EGG)構(gòu)成的反應(yīng)產(chǎn)物之一，具有下式 ·使EGG與堿性介質(zhì)接觸，并加熱至70℃至90℃的溫度達(dá)24小時(shí)，移動(dòng)酮-烯醇平衡。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的化合物，其特征在于該方法進(jìn)一步包含下列步驟·通過(guò)調(diào)節(jié)pH，穩(wěn)定化所得酮-烯醇平衡；·在堿性pH下回收溶液中的式(IV)與(V)化合物。
13.可以通過(guò)進(jìn)行下列步驟獲得的化合物·酯化沒(méi)食子酸；·在緩沖溶液中，在堿性pH下，加熱所得沒(méi)食子酸酯至70℃至90℃的溫度達(dá)16小時(shí)至24小時(shí)；·回收存在于溶液中的不同形式的沒(méi)食子酸酯。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至7、11至13任意一項(xiàng)的化合物，其特征在于它是含水溶液的形式。
15.組合物，其特征在于它包含可以利用根據(jù)權(quán)利要求11至13任意一項(xiàng)的方法獲得的化合物的混合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求8至10任意一項(xiàng)的組合物，其特征在于它主要包含下式的堿性EGGox M+代表陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2。
17.根據(jù)權(quán)利要求8至10或16任意一項(xiàng)的組合物，其特征在于它在穩(wěn)定化的平衡中含有式(IV)和(V)化合物，并且具有生理學(xué)上可接受的pH。
18.根據(jù)權(quán)利要求8至10或16或17任意一項(xiàng)的組合物，其特征在于它含有式(IV)與(V)化合物的混合物，并且它的pH在7.6至7.8的范圍內(nèi)。
19.根據(jù)權(quán)利要求8至10或16至18任意一項(xiàng)的組合物，它能夠在與血漿樣本接觸后激活內(nèi)源性凝血，進(jìn)一步包含選自MOPS和TRICINE的緩沖劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求8至10或16至19任意一項(xiàng)的組合物，其特征在于它所含有的化合物的濃度足以在與血漿樣本接觸后激活內(nèi)源性凝血。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)的化合物，其特征在于該陽(yáng)離子是金屬陽(yáng)離子。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的化合物，其特征在于該金屬陽(yáng)離子選自Mn2+、Cu2+和Co2+。
23.根據(jù)權(quán)利要求8至10或15至20任意一項(xiàng)的組合物，其特征在于該陽(yáng)離子是金屬陽(yáng)離子。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其特征在于該金屬陽(yáng)離子選自Mn2+、Cu2+和Co2+。
25.用于體外檢查內(nèi)源性凝血的試劑系統(tǒng)，包含根據(jù)權(quán)利要求1至7或11至14或21或22任意一項(xiàng)的化合物或下式化合物 其中m等于2、3或4，或根據(jù)權(quán)利要求8至10或15至20或23或24任意一項(xiàng)的組合物，其條件是它構(gòu)成內(nèi)源性凝血激活物，所述系統(tǒng)進(jìn)一步包含血小板膜磷脂的代用品。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑系統(tǒng)，其特征在于該內(nèi)源性凝血激活物包含下式活化形式的EGG 其中M+是陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2；R代表 或 m等于2、3、4或5，n是1與170之間的整數(shù)；或-AA1-AA2-..................-AArAA是天然或外來(lái)氨基酸，r是1與10之間的整數(shù)。
27.根據(jù)權(quán)利要求8至10或15至20或23或24任意一項(xiàng)的組合物或根據(jù)權(quán)利要求25或26的試劑，其特征在于它的EGG濃度在100μM至1000μM的范圍內(nèi)。
28.與能夠調(diào)節(jié)其敏感性的成分聯(lián)合的根據(jù)權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)的化合物或符合下式的化合物 其中m是2、3或4，或根據(jù)權(quán)利要求8至24或27任意一項(xiàng)的組合物，或根據(jù)權(quán)利要求25或26的試劑，所述成分是取代的聚氨基酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的化合物、組合物或試劑，與琥珀?；圪嚢彼崧?lián)合。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的化合物、組合物或試劑，與分子量在20000至300000Da范圍內(nèi)的琥珀?；圪嚢彼崧?lián)合。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的化合物、組合物或試劑，與戊二酰化聚賴氨酸聯(lián)合。
32.根據(jù)權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)的化合物或下式化合物 其中m是2、3或4，或根據(jù)權(quán)利要求8至10或15至20或23或24任意一項(xiàng)的組合物或根據(jù)權(quán)利要求25至27任意一項(xiàng)的試劑或根據(jù)權(quán)利要求28至30任意一項(xiàng)的組合物用于準(zhǔn)備試驗(yàn)的用途，該試驗(yàn)用于體外檢查內(nèi)源性凝血。
33.根據(jù)權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)的化合物或下式化合物 其中m是2、3或4，或根據(jù)權(quán)利要求8至10或15至20或23或24任意一項(xiàng)的組合物或根據(jù)權(quán)利要求25或26的試劑或根據(jù)權(quán)利要求28至30任意一項(xiàng)的組合物的用途，用于探查內(nèi)源性途徑凝血。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的用途，其中測(cè)定活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)。
35.根據(jù)權(quán)利要求32的用途，其中測(cè)定活化全血的凝血時(shí)間。
36.根據(jù)權(quán)利要求32的用途，其中測(cè)定活化血漿的凝血時(shí)間。
37.根據(jù)權(quán)利要求1至7任意一項(xiàng)的化合物或下式化合物 其中m是2、3或4，或根據(jù)權(quán)利要求8至10或15至20或23或24任意一項(xiàng)的組合物或根據(jù)權(quán)利要求25或26的試劑或根據(jù)權(quán)利要求28至30任意一項(xiàng)的組合物的用途，用于檢查參與內(nèi)源性凝血途徑的凝血因子。
38.用于制備下式化合物的方法 其中·A選自下式 M+代表陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2；·R代表-[-O-CH2-CH2-]n-OHn是1與170之間的整數(shù)；所述方法包含下列步驟·在含有醇官能團(tuán)的化合物的存在下使沒(méi)食子酸反應(yīng)；·使所得沒(méi)食子酸酯與堿性介質(zhì)接觸，生成下式化合物 ·在能夠生成下式配合物的條件下加入金屬陽(yáng)離子Mq+(其中q等于1或2) ·加入緩沖劑，在生理學(xué)上可接受的pH下穩(wěn)定化合物(II)與(III)之間所得平衡；·回收所得溶液。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其特征在于在乙二醇的存在下進(jìn)行酯化作用，生成乙二醇沒(méi)食子酸酯(EGG)，并且回收參與酮-烯醇平衡的EGG形式混合物。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其特征在于回收下式EGG的可溶形式 M+是陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2。
41.用于制備下式化合物的方法 其中·A選自下式 或， M+代表陽(yáng)離子，q等于1或2，p滿足p×q＝2；·R代表-[-O-CH2-CH2-]n-OH，其中n是1與170之間的整數(shù)；該方法包含下列步驟·酯化沒(méi)食子酸；·在緩沖溶液中，在堿性pH下，加熱所得沒(méi)食子酸酯至70℃至90℃的溫度達(dá)16小時(shí)至24小時(shí)；·回收存在于溶液中的不同形式的沒(méi)食子酸酯。
42.用于測(cè)量活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)的方法，包含下列步驟·在允許內(nèi)源性凝血途徑活化的條件下，在血小板膜磷脂代用品的存在下，使排除了血小板的血漿樣本與根據(jù)權(quán)利要求1至7或11至14或21或22任意一項(xiàng)的化合物或下式化合物 其中m等于2、3或4，或根據(jù)權(quán)利要求8至10或15至20或23或24任意一項(xiàng)的組合物或根據(jù)權(quán)利要求25或26的試劑系統(tǒng)或根據(jù)權(quán)利要求28至30任意一項(xiàng)的組合物接觸；·加入Ca2+離子，加入量在20mM至25mM的范圍內(nèi)；·測(cè)量轉(zhuǎn)化纖維蛋白原為纖維蛋白所需的時(shí)間。
全文摘要
本發(fā)明涉及內(nèi)源性凝血途徑的接觸激活物和它們?cè)谔讲槟惓Ｖ械挠猛?。本發(fā)明的激活物是沒(méi)食子酸的衍生物，優(yōu)選為聚乙二醇沒(méi)食子酸酯。
文檔編號(hào)C07C69/84GK1460098SQ0280079
公開(kāi)日2003年12月3日 申請(qǐng)日期2002年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月23日
發(fā)明者J-P·羅辛, S·斯特尤斯, G·奎恩廷 申請(qǐng)人:斯塔戈診斷公司