專(zhuān)利名稱(chēng)：在根和苗端表達(dá)外源基因的啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能使導(dǎo)入植物的外源基因在根和/或莖端表達(dá)的啟動(dòng)子。更具體地，本發(fā)明涉及在根和/或莖端表達(dá)外源基因的方法，是利用水稻過(guò)氧化氫酶基因B(下面用CatB表示)的部分啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行的。
背景技術(shù)：
根作為支持物起到防止植物倒下的作用，更重要的是，根可以吸收水分和養(yǎng)料。根的分支延伸擴(kuò)展了其表面積以致增加了吸收的面積。根還具有分泌有機(jī)酸，使有機(jī)酸與磷、鐵等結(jié)合，從而促進(jìn)它們的吸收。根還有合成和分泌如潤(rùn)滑劑等物質(zhì)的功能，這有助于根尖在土壤中的生長(zhǎng)。根還可合成和儲(chǔ)藏植物激素。而且，根蓄積通過(guò)光合作用獲得的能量，或者在幼苗期蓄積磷并在日后移送。不能象動(dòng)物一樣移動(dòng)的植物，尤其是根，遭受來(lái)自周?chē)h(huán)境的很多壓力，它們采取許多措施以抵抗這些壓力。
根的這些功能，例如在水稻中，與下面的基因有關(guān)環(huán)葉綠素(cyclophyllin)(Cyp)基因(Buchholz etal.，plant Mol.Biol.25837-843(1994))，脂轉(zhuǎn)移蛋白(LTP)基因(Vignols etal.，Gene 16265-270(1994))，苯丙氨酸氨基裂合酶(PAL-ZB8)基因(Zhu et al.，Plant Mol.Biol.29535-550(1995))，組蛋白H3基因(Terada et al.Plant Mol.Biol.2717-26(1995))，堿性幾丁質(zhì)酶(RC24)基因(Xu et al.，Plant Mol.Biol.30387-401(1996))，caleosin基因(Naested et al.，Plant Mol.Biol.44463-476(2000))等，它們已知能在根中表達(dá)。
在除了水稻以外的一些植物中，擬南芥屬的延伸因子eFF1A基因(Tremousaygue et al.，Plant J 20553-561(1999))，黑芥子酶基因Pyk10(Nitz etal.，Plant Science 161337-346(2001))，鐵轉(zhuǎn)運(yùn)者(IRT2)基因(Vert et al.，Plant J26181-189(2001))等；煙草的谷光甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)基因(Klinedinst et al.，Plant Mol Biol 42679-688(2000))，硝酸鹽還原酶(Hansch et al.，J Exp Bot521251-1258(2001))等；或亞麻的果膠甲酯酶(Roger et al.，Plant Science160713-721(2001))等，已知它們能在根中表達(dá)。
苗端指的是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的莖端和其周?chē)牟糠?。在高等植物中，莖端能進(jìn)行細(xì)胞分化以產(chǎn)生新的細(xì)胞。莖端中表達(dá)的基因的實(shí)例包括煙草(Nicotiana tabacum)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(Itp1)基因(Canevascini et al.，PlantPhysiol.，112513-524(1996))，同源框(NTH15)基因(Tamaoki et al.，Plant CellPhysiol.，38917-927(1997))，和赤霉素3β羥化酶基因(Itoh et al.，Plant J.，2015-24(1999))；擬南芥屬二氫吡咯-5-羧酸酯還原酶基因(Hua et al.，PlantPhysiol.，1141215-1224(1997))，ERECTA基因(Yokoyama et al.，PlantJ.，15301-310(1998))，ATML1基因(Sessions et al.，Plant J.，20259-263(1998))，和FAD3基因(Matsuda et al.，Planta，213833-840(2001))。這些研究證實(shí)以上基因表達(dá)的組織特異性受其啟動(dòng)子調(diào)控。
近來(lái)，將能在根中表達(dá)的啟動(dòng)子與能對(duì)根的發(fā)育，抗病性和脅迫抗性有作用的基因聯(lián)系起來(lái)，以及將基因?qū)胫参锏姆椒?，作為有前景的生物技術(shù)受到人們的注意。
有人嘗試?yán)貌《净虻膯?dòng)子在植物中表達(dá)外源基因(例如，MacFarlane and Poppvich，Virology 26729-35(2000)；和Mazithulela et al.，Plant Science 15521-29(2000))。然而，病毒感染后會(huì)造成傳播。衍生于植物基因的啟動(dòng)子比衍生于病毒基因的啟動(dòng)子更能將基因的表達(dá)位置限制在細(xì)胞水平。
在玉米等中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些已知在根中表達(dá)的基因的啟動(dòng)子。重組DNA技術(shù)可在根中賦予抗病性。題為“控制植物中線蟲(chóng)的基因和方法”的美國(guó)專(zhuān)利6,284,948公開(kāi)了賦予根抗線蟲(chóng)性的實(shí)例。此處，利用植物遍在蛋白基因啟動(dòng)子使線蟲(chóng)抗性基因得以表達(dá)。然而，該遍在蛋白啟動(dòng)子的器官特異性水平低并且被恒定地表達(dá)。
根特異性啟動(dòng)子的一個(gè)實(shí)例在美國(guó)專(zhuān)利6,271,437中公開(kāi)，該專(zhuān)利名稱(chēng)為“大豆基因啟動(dòng)子”。它描述了一種方法，其中用大豆包囊線蟲(chóng)基因的啟動(dòng)子在根中表達(dá)外源基因。根特異性啟動(dòng)子實(shí)例參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2001/0016954，其名稱(chēng)為“根特異性啟動(dòng)子”。這些實(shí)例包括衍生于擬南芥的b1-微管蛋白基因啟動(dòng)子，核糖體蛋白R(shí)PL16A基因啟動(dòng)子，ARSK1基因啟動(dòng)子，和大豆金屬硫蛋白(metallothionein)樣的基因的啟動(dòng)子。據(jù)記載這些啟動(dòng)子可用于賦予線蟲(chóng)抗性。
這些啟動(dòng)子有下面的問(wèn)題啟動(dòng)子的活性通常不足以用于實(shí)際應(yīng)用；啟動(dòng)子在單子葉植物包括谷類(lèi)諸如水稻等中不起作用；它們的器官特異性較低；等等。
因此，如果分離出能在谷類(lèi)的各種發(fā)育階段發(fā)揮作用的啟動(dòng)子，揭示出這些啟動(dòng)子的特征，制備出具有不同組織特異性和高活性的啟動(dòng)子盒，所述的啟動(dòng)子盒將對(duì)作物諸如水稻等的育種非常有用。
本發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供在根和/或莖端中具有高水平活性的的植物啟動(dòng)子。更具體的是，本發(fā)明的目的是提供實(shí)用啟動(dòng)子，其克服了常規(guī)啟動(dòng)子的活性問(wèn)題(即活性通常不足以用于實(shí)際應(yīng)用；在單子葉植物例如水稻等中并未顯示所述的活性，活性的器官特異性低；等等)。

發(fā)明內(nèi)容
(解決問(wèn)題的手段)基于水稻過(guò)氧化氫酶B(CatB)基因啟動(dòng)子區(qū)的部分堿基序列能用于在根中表達(dá)外源基因這一發(fā)現(xiàn)得出本發(fā)明。
本發(fā)明提供1.一種啟動(dòng)子，包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。
2.1項(xiàng)中所述的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子包括SEQ ID NO.11所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。
3.1項(xiàng)中所述的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子包括SEQ ID NO.12所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。
4.用于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的組合物，該組合物包括
1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)所述目的基因。
5.項(xiàng)4中的組合物，其中所述啟動(dòng)子包括SEQ ID NO.11所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。
6.項(xiàng)4中的組合物，其中所述啟動(dòng)子包括SEQ ID NO.12所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。
7.項(xiàng)4中的組合物，其中所述的植物是單子葉植物或雙子葉植物。
8.項(xiàng)4中的組合物，其中所述的植物是單子葉植物。
9.項(xiàng)4中的組合物，其中所述的植物是水稻，擬南芥屬，玉米，小麥，大麥，番茄，黃瓜，茄子，馬鈴薯，萵苣(lettuce)，日本小蘿卜(Japanese radish)，胡蘿卜。
10.項(xiàng)4中的組合物，其中目的基因編碼選自下組的至少一種多肽可賦予抗性的多肽，促進(jìn)根發(fā)育的多肽，和用于再分化植物體的選擇標(biāo)記。
11.項(xiàng)4中的組合物，其中根和莖端的至少一個(gè)位置包括根尖部分。
12.項(xiàng)4中的組合物，其中根和莖端的至少一個(gè)位置包括單子葉植物幼苗的分生組織區(qū)域。
13.項(xiàng)4中的組合物，其中根和莖端的至少一個(gè)位置包括莖端部分。
14.在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物表達(dá)盒，該植物表達(dá)盒包括1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)所述目的基因。
15.在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的質(zhì)粒，該質(zhì)粒包括
1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)所述目的基因，其中啟動(dòng)子與目的基因可操縱地連接。
16.適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物細(xì)胞，該植物細(xì)胞包括1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)所述目的基因。
17.適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物組織，該植物細(xì)胞包括1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)所述目的基因。
18.適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物包括1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)所述目的基因。
19.適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物種子，該植物種子包括1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)所述目的基因。
20.在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的方法，該方法包括
1)提供植物，該植物包含編碼啟動(dòng)子的核酸，該啟動(dòng)子包括SEQ IDNO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；2)提供植物，該植物包含編碼目的基因的核酸，和3)將植物置于允許啟動(dòng)子進(jìn)行操作的條件下。
21.由在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的方法得到的基因產(chǎn)物，該方法包括1)提供植物，該植物包含編碼啟動(dòng)子的核酸，該啟動(dòng)子包括SEQ IDNO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；2)提供植物，該植物包含編碼目的基因的核酸，和3)將植物置于允許啟動(dòng)子作用的條件下。
22.產(chǎn)生適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物的方法，該方法包括1)提供一種包含啟動(dòng)子的質(zhì)粒，該啟動(dòng)子包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；2)用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；并且3)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
14-22項(xiàng)由5-13項(xiàng)的特征具體說(shuō)明。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示的是實(shí)驗(yàn)中所用的各種DNA構(gòu)建體。
圖2顯示制備B1(＝CatBD1-GUS/pTN2)和B2(＝CatBD2-GUS/pTN2)的方法。
圖3為導(dǎo)有B1的水稻幼株(T0代，再分化第一代)的GUS染色照片。
圖4為導(dǎo)有B1的擬南芥屬幼株(T2代)的GUS染色照片((a)黑色背景；(b)亮背景)。
圖5為Cat啟動(dòng)子區(qū)。
發(fā)明詳述除非特別指出，本發(fā)明書(shū)中單數(shù)形式的冠詞(例如，英文的“a”，“an”，“the”等；德文的“ein”，“der”，“das”，“die”等；法文的“un”，“une”，“l(fā)e”，“1a”等；及其它語(yǔ)言中的冠詞，形容詞等)應(yīng)理解為包括復(fù)數(shù)形式的概念。還應(yīng)理解的是本文所用術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域通常理解的定義，除非特別說(shuō)明。
(序列描述)SEQ ID No.1為CatB啟動(dòng)子區(qū)(1364bp)的核酸序列(-1066到+298，以cDNA起臺(tái)點(diǎn)為+1；見(jiàn)圖5)。
SEQ ID No.2為CatB基因(4985bp)核酸序列。
SEQ ID No.3為BΔ3片段(866bp)。
SEQ ID No.4為B1片段(627bp)。在位點(diǎn)1到6，CatB過(guò)氧化氫酶基因的堿基序列中AAAAAA變?yōu)锳AGCTT，這是HindIII的切割位點(diǎn)。在460位，T由C取代，由此破壞了CatB過(guò)氧化氫酶基因的翻譯起始密碼子。
SEQ ID No.5為B2片段(524bp)。在位點(diǎn)1到6，CatB過(guò)氧化氫酶基因的堿基序列中AAAAAA變?yōu)锳AGCTT，這是HindIII的切割位點(diǎn)。在位點(diǎn)357，T由C取代，由此破壞了CatB過(guò)氧化氫酶基因的翻譯起始密碼子。
SEQ ID No.6為相應(yīng)于CatB cDNA的102-131的序列。
SEQ ID No.7為相應(yīng)于CatB cDNA的484-455的序列。
SEQ ID No.8為本文一實(shí)施方案中所用的引物3D3-F1。
SEQ ID No.9為本文一實(shí)施方案中所用的引物3D3-F2。
SEQ ID No.10為本文一實(shí)施方案中所用的引物BD3-MR。
SEO ID No.11為-329到+298的啟動(dòng)子區(qū)。
SEQ ID No.12為-329到-227的啟動(dòng)子區(qū)。
(術(shù)語(yǔ)定義)本文所用“啟動(dòng)子”指的是與RNA聚合酶結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的遺傳元件或因子。本文所用“啟動(dòng)子區(qū)”指的是在某結(jié)構(gòu)基因序列的鄰近區(qū)具有啟動(dòng)子活性的區(qū)域。啟動(dòng)子區(qū)是指正?；蛏嫌蔚奶囟▔A基序列，該序列在該基因轉(zhuǎn)錄開(kāi)始時(shí)與RNA聚合酶結(jié)合。本文“啟動(dòng)子活性”指的是，通過(guò)特定因子作用于RNA聚合酶等而起始轉(zhuǎn)錄的活性。
本文的“植物”包括任何單子葉植物和雙子葉植物。優(yōu)選植物的實(shí)例包括屬于稻科的單子葉植物，諸如小麥，玉米，水稻，大麥，高梁等，優(yōu)選植物的其它實(shí)例包括煙草，甜辣椒(pimento)，茄子，瓜，番茄，甘薯，卷心菜，洋蔥，花椰菜，胡蘿卜，黃瓜，柑橘屬果樹(shù)，中國(guó)卷心菜(Chinesecabbage)，萵苣，桃，馬鈴薯，和蘋(píng)果。優(yōu)選的植物并不限于作物，還包括花，樹(shù)，草，雜草等。除非特別說(shuō)明，否則植物指的是完整植物，植物器官，植物組織，植物細(xì)胞和種子。植物器官的實(shí)例包括根，葉，莖，花等。植物細(xì)胞的實(shí)例包括愈傷組織和懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞。
本文的“根和莖端的至少一個(gè)位置”指由根和莖端組成的一組位置中選出的至少一個(gè)位置。因此，“根和莖端的至少一個(gè)位置”包括根的一部分和莖端的一部分?！案颓o端的至少一個(gè)位置”還包括分生組織。
本文的“分生組織”指的是植物的形成層，該層包括分化細(xì)胞和能分化成其它分裂細(xì)胞或特定類(lèi)型細(xì)胞的位點(diǎn)。分生組織經(jīng)常在生長(zhǎng)部位觀察到。分生組織的實(shí)施例包括生長(zhǎng)點(diǎn)，莖端(苗端)，根端或根尖，根端分生組織，頂端分生組織等等。
本文的“根”指的是存在于地下的，起支持作用并吸收水分的器官。尖部稱(chēng)為根冠，其內(nèi)部由表皮包繞并稱(chēng)為中柱。中柱內(nèi)通行導(dǎo)管和篩管。根毛為表皮細(xì)胞伸出的部分，位置略靠根尖后方。根毛內(nèi)的或周?chē)谋砥ぜ?xì)胞強(qiáng)有力的吸水。根毛的壽命從數(shù)天到數(shù)周不等，期間根不斷延伸，使根毛的位置不斷向前。整個(gè)根還稱(chēng)為根系統(tǒng)。例如，在水稻種子根中，從單個(gè)胚芽鞘的各個(gè)節(jié)或其以上的部位長(zhǎng)出約5-20個(gè)不定根。自節(jié)點(diǎn)生長(zhǎng)的根稱(chēng)為冠根(crown root)。大量的根生長(zhǎng)自上節(jié)點(diǎn)。第一和第二分支根生長(zhǎng)自上節(jié)點(diǎn)。根的長(zhǎng)度最大可約有1m。根包含分生組織。
本文的“莖端”還指苗端，以及莖及其周?chē)恢玫母朔稚M織。莖端包括形成莖和側(cè)葉的營(yíng)養(yǎng)莖端，和形成花序和花的生殖莖端。莖端包含分生組織。莖端指的是營(yíng)養(yǎng)期的莖端和其周?chē)糠?。高等植物的莖端能分裂成新的細(xì)胞。
本文的“過(guò)氧化氫酶”指的是能催化分解過(guò)氧化物的反應(yīng)的酶(EC1.11.1.6)。在有H2O2，CH3OOH，C2H5OOH存在時(shí)，過(guò)氧化氫酶可以氧化C2H5OH，CH3OH，CH3COOH，HCOOH， HNO2，等等。過(guò)氧化氫酶存在于任何需氧細(xì)胞中，無(wú)論它們是動(dòng)物，植物或微生物來(lái)源。在動(dòng)物中，肝臟，腎和紅細(xì)胞包含大量的過(guò)氧化氫酶。牛肝過(guò)氧化氫酶分子量約為230000。一個(gè)該酶分子包含4個(gè)血紅素功能基團(tuán)。在植物中，過(guò)氧化氫酶包括本發(fā)明人分離的過(guò)氧化氫酶B。
本文中核酸分子的“片段”指的是長(zhǎng)度短于參考DNA的全長(zhǎng)，但卻足以用作探針或引物的多核苷酸。一種DNA片段如果要作為其來(lái)源核酸分子的選擇性探針或選擇性引物，必需具有特異性雜交能力。本文中“與...特異性雜交的DNA”是給定核酸分子能通過(guò)其DNA片段而被單獨(dú)檢測(cè)出或被擴(kuò)增。選擇性探針代表性的長(zhǎng)度為至少10個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少20個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選30，40或50個(gè)核苷酸，進(jìn)一步可以有大于50個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。利用選擇性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增可得到選擇性探針。當(dāng)用選擇性引物作為PCR引物對(duì)中的至少一個(gè)引物時(shí)，該選擇性引物的代表性長(zhǎng)度為9個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選15個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選至少17，18，19，20，21，22，23，24，25，30或50個(gè)核苷酸，或超過(guò)50個(gè)核苷酸。
本文所用核酸分子的“同系物”指的是具有與參考DNA核苷酸序列同源的核苷酸序列的核酸分子。代表性的是，同系物指的是在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與參考核酸分子雜交的多核苷酸。在本發(fā)明啟動(dòng)子的情況中，啟動(dòng)子的“同系物”指的是具有與該啟動(dòng)子同源的核酸序列，并且具有相同或相似的特征(例如，位點(diǎn)特異性，時(shí)期特異性，對(duì)脅迫的反應(yīng)等)的核酸分子。
本文中基因“同源性”指的是在兩個(gè)或更多個(gè)基因序列間同一性的幅度。因此，兩基因間同源性越高，其序列間同一性越大。兩基因間是否具有同源性可通過(guò)直接比較它們的序列或通過(guò)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的方法來(lái)確定。在兩基因序列直接互相比較時(shí)，如果基因序列代表性地互相具有至少50％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，則這些基因具有同源性。
本文同源性的幅度利用序列分析工具BLAST以默認(rèn)參數(shù)確定。
因此，如果核酸分子含有本發(fā)明啟動(dòng)子序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，則該核酸分子與本發(fā)明啟動(dòng)子序列具有相同或相似的活性。這種活性可利用β-葡糖醛酸酶(GUS)基因，螢光素酶基因，或GFP基因作為報(bào)道基因而分析確定，或通過(guò)生物學(xué)或細(xì)胞組織學(xué)檢測(cè)來(lái)證實(shí)。這樣的分析是本領(lǐng)域常用的已知技術(shù)。(Maliga et al，Methods in Plant Molecular BiologyAlaboratory course.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995)；Jefferson，PlantMolec.Biol.Reporter 5387(1987)；Ow et al.，Science 234856(1986)；Sheen etal.，Plant J.8777-784(1995))。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能毫無(wú)困難的證實(shí)含有本發(fā)明啟動(dòng)子序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的核酸分子與本發(fā)明啟動(dòng)子序列具有相同或相似的活性，或有實(shí)質(zhì)上高于或等同于本發(fā)明啟動(dòng)子序列的活性。本文中，當(dāng)啟動(dòng)子活性在檢測(cè)誤差范圍內(nèi)通過(guò)上述分析得到證實(shí)時(shí)，稱(chēng)該啟動(dòng)子活性具有實(shí)質(zhì)上高于或等同于本發(fā)明啟動(dòng)子的活性。
本發(fā)明啟動(dòng)子的長(zhǎng)度通常為至少10個(gè)核苷酸，可以?xún)?yōu)選至少20個(gè)核苷酸，至少30個(gè)核苷酸，至少40個(gè)核苷酸，至少50個(gè)核苷酸，至少60個(gè)核苷酸，至少70個(gè)核苷酸，至少80個(gè)核苷酸，至少90個(gè)核苷酸，至少100個(gè)核苷酸，至少150個(gè)核苷酸，至少200個(gè)核苷酸，至少300個(gè)核苷酸。
可以使用與常規(guī)啟動(dòng)子(例如，最小啟動(dòng)子(衍生自35S的包含有約80個(gè)堿基對(duì)的啟動(dòng)子)(Hatton et al.Plant J.，7859-876(1995)；Rouster et al.，PlantJ.，15435-440(1998)；Washida et al.，Plant Mol.Biol.，401-12(1999)；等)相連的本發(fā)明的啟動(dòng)子。這種情況中，如果最初沒(méi)有或具有弱的組織特異性的啟動(dòng)子，或具有另一類(lèi)特異性的啟動(dòng)子，與本發(fā)明的啟動(dòng)子或其片段相連，則所得的啟動(dòng)子可在根和/或莖端有組織特異性的功能(Hatton et al.Plant J.，7859-876(1995)；Rouster et al.，Plant J.，15435-440(1998)；Washida et al.，PlantMol.Biol.，401-12(1999)。
本發(fā)明的啟動(dòng)子可用于修飾單子葉植物和雙子葉植物以及其它生物體。這是由于這兩種植物具有相似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。例如，據(jù)報(bào)道玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子以相同的組織特異性在煙草中表達(dá)(Schernthaner et al.，EMBO J.，&1249-1255(1988))；水稻谷蛋白基因啟動(dòng)子以相同的組織特異性在煙草中表達(dá)(Leisy et al.，Plant Mol.Biol.，1441-50(1989))。尤其優(yōu)選的受試植物除水稻外包括小麥，玉米，大麥，高粱，柑桔，中國(guó)卷心菜，萵苣，煙草，桃，馬鈴薯，番茄和蘋(píng)果。
本文在論述基因時(shí)，“載體”指的是能將靶多核苷酸序列導(dǎo)入靶細(xì)胞的載體。這樣的載體含有能在原核細(xì)胞，酵母，動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，動(dòng)物個(gè)體中自我復(fù)制或被并入其染色體，并位于適合本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)的啟動(dòng)子。植物細(xì)胞的“重組載體”包括Ti質(zhì)粒，煙草花葉病毒載體，等等。
載體導(dǎo)入方法的實(shí)例包括將DNA導(dǎo)入植物的的任何方法。例如，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及利用以下物質(zhì)進(jìn)行的轉(zhuǎn)化土壤桿菌(日本專(zhuān)利申請(qǐng)59-140885，日本專(zhuān)利申請(qǐng)60-70080，和WO94/00977)，電穿孔的方法(日本專(zhuān)利申請(qǐng)60-251887)，粒子槍(基因槍)的方法(日本專(zhuān)利2606856和日本專(zhuān)利2517813)等。
對(duì)本發(fā)明啟動(dòng)子表達(dá)的“檢測(cè)或鑒定”通過(guò)下面所述合適的方法進(jìn)行，例如，mRNA測(cè)量和免疫測(cè)定的方法。分子生物學(xué)測(cè)量方法，包括，例如，northern印跡方法，斑點(diǎn)印跡的方法，PCR的方法等。免疫學(xué)的方法包括例如，ELISA的方法，RIA的方法，熒光抗體的方法，western印跡的方法，免疫組織學(xué)染色的方法，等使用微量滴定板的方法。鑒定方法包括ELISA方法，RIA方法等。
“表達(dá)水平”指的是在靶細(xì)胞等中表達(dá)的本發(fā)明蛋白質(zhì)或mRNA的水平。這種表達(dá)水平包括通過(guò)任何合適的方法(包括利用本發(fā)明的抗體進(jìn)行的免疫測(cè)定方法，例如ELISA的方法，RIA的方法，熒光抗體的方法，western印跡的方法，免疫組織學(xué)染色的方法等)評(píng)估的本發(fā)明多肽的蛋白質(zhì)水平；通過(guò)包括生物學(xué)測(cè)量方法(包括northern印跡方法，斑點(diǎn)印跡的方法，PCR的方法等)的任何合適的方法評(píng)估的本發(fā)明多肽的mRNA的水平?！氨磉_(dá)水平的改變”指的是由本發(fā)明肽的蛋白質(zhì)或mRNA水平所確定的表達(dá)水平的升高或降低，所述肽的蛋白質(zhì)或mRNA的水平可通過(guò)包括上述的免疫學(xué)或生物學(xué)測(cè)量方法的任何合適的方法評(píng)估。通過(guò)觀察表達(dá)水平的絕對(duì)值或相對(duì)值，就有可能確定特定啟動(dòng)子是否特異性地作用。
“轉(zhuǎn)化體”指的是通過(guò)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的整個(gè)生物或其部分，例如細(xì)胞等。轉(zhuǎn)化體的實(shí)例包括原核細(xì)胞，酵母，動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞等。轉(zhuǎn)化體也稱(chēng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，轉(zhuǎn)化組織，轉(zhuǎn)化宿主等，這取決于所轉(zhuǎn)化的物質(zhì)。
本文所表達(dá)的“基因”具有本領(lǐng)域通常的含義，指能確定遺傳特征的因子。由本發(fā)明的方法表達(dá)的目的基因是期望通過(guò)本發(fā)明的方法而能夠特異表達(dá)的任何基因，包括能賦予抗線蟲(chóng)抗性的，抗土壤病原體抗性等的多肽，能促進(jìn)根發(fā)育的多肽，再分化植物體的選擇性標(biāo)記等。
本文中的“再分化”指的是自實(shí)體(entity)的一部分重建整個(gè)實(shí)體的現(xiàn)象。例如，從組織諸如細(xì)胞，葉，根等形成植物體。
使轉(zhuǎn)化體再分化為植物體的方法在本領(lǐng)域是熟知的。這種方法在下面文獻(xiàn)中進(jìn)行了說(shuō)明，Rogers et al.，Methods in Enzymology 118627-640(1986)；Tabata et al.，Plant Cell Physiol.，2873-82(1987)；Shaw，Plant MolecularBiologyA practical approach.IRL press(1988)；Shimamoto et al.，Nature 338274(1989)；Maliga et al.，Methods in Plant Molecular BiologyA laboratoorycourse.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995)等。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可基于目的轉(zhuǎn)基因植物來(lái)利用上述熟知的方法實(shí)施再分化。
再分化轉(zhuǎn)化體中經(jīng)修飾的目標(biāo)特性的存在通過(guò)基于該特性的類(lèi)型實(shí)施相應(yīng)試驗(yàn)而證實(shí)。例如，GUS基因作為報(bào)道基因與啟動(dòng)子融合，然后將其導(dǎo)入植物體以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體。通過(guò)組織學(xué)染色檢測(cè)GUS活性來(lái)證實(shí)轉(zhuǎn)化。在這種情況中，GFP基因或螢光素酶基因(其是熒光蛋白質(zhì)的編碼基因)可用作報(bào)道基因。任何這些基因可用于各種啟動(dòng)子的分析中。在下面的實(shí)施例中對(duì)這些基因進(jìn)行了詳述。在欲于賦予病原菌抗性(脅迫抗性)時(shí)，模式菌(例如，丁香假單胞菌煙草致病菌種)被接種到再分化植物體。在該情況中，再分化植物體特性的變化可通過(guò)將其與對(duì)照植物比較而觀察有無(wú)變化來(lái)評(píng)估。
可通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法培養(yǎng)植物。下面舉例說(shuō)明培養(yǎng)植物的方法，例如“Moderu-shokubutsu-no-Jikken-Purotokoru For Ine·ShiroinunazunaSaibo-kogaku Bessatsu-shokubutsu-saibo-kogaku sirizu4；Ine-nosaibaiho[Experimental Protocol for Model plants For Rice and Arabidopsis thalianaCelluar Engineering，Special Issue，Plant Cellular Engineering Series 4；RiceCultivating Methods]”(Kazutoshi Okuno)pp.28-32，and“Arabidopushisu-no-saibaiho[Cultivating Methods for Arabidopsis]”(YasuoTanba)pp.33-40(Supervised by Koshimamoto and Kiyotaka Okada)，它們?cè)诒疚牟](méi)有詳細(xì)描述。例如，擬南芥可通過(guò)利用土壤培養(yǎng)，巖棉(rock wool)培養(yǎng)，或水培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)。播種后，如果是在白色熒光燈(約6000lux)的恒定光照下培養(yǎng)植物，大約四周就可先觀察到開(kāi)花。開(kāi)花后約16天種子才能完全成熟。一莢(pod)中可得40-50個(gè)種子。自播種到死亡的2-3個(gè)月期間，約可獲得10000粒種子。種子的休眠期短。完全成熟的種子干燥約一周，吸水后2-3天便萌芽。注意的是，如果種子在吸水并播種后于4℃低溫處理2-4天，則會(huì)很快萌芽。
(優(yōu)選的實(shí)施方案)本發(fā)明一方面涉及包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。優(yōu)選的是，啟動(dòng)子包含SEQ ID NO.11所示序列的至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸。
更優(yōu)選的是，本發(fā)明提供一種核酸分子，其包含SEQ ID NO.12所示序列中至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸。啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。該核酸分子具有在根(包括分生組織)中特異性啟動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子活性。就本發(fā)明人所知，這種能賦予啟動(dòng)子活性的序列先前并未具體在水稻和擬南芥屬中發(fā)現(xiàn)，因此，本發(fā)明可以說(shuō)在本領(lǐng)域獲得了有益的效果。
上述具體序列范圍僅表明本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的序列范圍。本發(fā)明并不限于此。因此，根據(jù)本發(fā)明所描述的方法，本發(fā)明可指定為由本領(lǐng)域技術(shù)人員所篩選的另一合適區(qū)域。通過(guò)參考本領(lǐng)域通常用的已知技術(shù)，無(wú)需經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)就可實(shí)施這類(lèi)篩選方法。
另一方面，本發(fā)明提供用于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)基因的組合物，該組合物包括1)啟動(dòng)子，它包含SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并且具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)目的基因。
如上所述，啟動(dòng)子1)啟動(dòng)特異于根和莖端的至少一個(gè)位置的表達(dá)。因此，該組合物提供能在根和莖端的至少一個(gè)位置特異性表達(dá)的系統(tǒng)，即在本領(lǐng)域中具有有益的用途。
在一實(shí)施方案中，啟動(dòng)子可包含SEQ ID NO.11所示序列中至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。
在另一實(shí)施方案中，啟動(dòng)子可包含SEQ ID NO.12所示序列中至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。在另一實(shí)施方案中，植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。生物體并不限于單子葉植物或雙子葉植物。因此，本發(fā)明的啟動(dòng)子可衍生自除了植物以外的生物體，例如動(dòng)物等，或除了單子葉植物和雙子葉植物以外的其它植物，只要該啟動(dòng)子具備相同的效應(yīng)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物可以為單子葉植物。更優(yōu)選的是，植物可以為水稻，擬南芥屬植物，玉米，小麥，大麥，番茄，黃瓜，茄子，馬鈴薯，萵苣，日本小蘿卜或胡蘿卜。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明啟動(dòng)子的長(zhǎng)度可為至少20個(gè)核苷酸，至少30個(gè)核苷酸，至少40個(gè)核苷酸，至少50個(gè)核苷酸，至少60個(gè)核苷酸，至少70個(gè)核苷酸，至少80個(gè)核苷酸，至少90個(gè)核苷酸，至少100個(gè)核苷酸，至少150個(gè)核苷酸，至少200個(gè)核苷酸，或至少300個(gè)核苷酸。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動(dòng)子可以與另一啟動(dòng)子相連。這種情況中，通過(guò)將最初沒(méi)有或具有弱的組織特異性，或具有另一種類(lèi)型的特異性的啟動(dòng)子，與本發(fā)明的啟動(dòng)子或其片段相連，有可能產(chǎn)生一種可在根和/或莖端的至少一個(gè)位置具有組織特異性的啟動(dòng)子。
在另一實(shí)施方案中，目的基因可以是編碼選自下述的至少一種多肽的基因能賦予抗性，例如抗線蟲(chóng)抗性或抗土壤病原體抗性的多肽，能促進(jìn)根發(fā)育的多肽，以及再分化植株的選擇性標(biāo)記。
在另一實(shí)施方案中，根和莖端的至少一個(gè)位置可包括根尖部分。在另一實(shí)施方案中，根和莖端的至少一個(gè)位置可包括莖端部分。根和莖端的至少一個(gè)位置可包括單子葉植物(例如水稻)幼苗的分生組織。通過(guò)僅在幼苗植物中啟動(dòng)表達(dá)，有可能產(chǎn)生一種作物(例如水稻)，該作物中導(dǎo)入的基因不表達(dá)產(chǎn)物或者其產(chǎn)物不會(huì)殘留。
另一方面，本發(fā)明提供在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物表達(dá)盒，該植物表達(dá)盒包括1)一種啟動(dòng)子，它包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并且具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)該目的基因。
植物表達(dá)盒可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來(lái)制備。這類(lèi)制備技術(shù)在本文實(shí)施例中舉例說(shuō)明。
另一方面，本發(fā)明提供在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的質(zhì)粒，該質(zhì)粒包括
1)一種啟動(dòng)子，它包括SEQ ID NO.1所示序列的至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)該目的基因。
所述啟動(dòng)子與目的基因可操縱地連接。所述質(zhì)粒(或載體)可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來(lái)制備。這種制備技術(shù)在實(shí)施例中舉例說(shuō)明。
另一方面，本發(fā)明提供一種適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物細(xì)胞，該植物細(xì)胞包括1)一種啟動(dòng)子，它包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)該目的基因。
所述植物細(xì)胞可通過(guò)本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)制備。例如，這種植物細(xì)胞可利用本發(fā)明的質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)制備。這類(lèi)方法在本文實(shí)施例中具體舉例說(shuō)明。
另一方面，本發(fā)明提供一種適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物組織，該植物組織包括1)一種啟動(dòng)子，它包括SEQ ID NO.1所示序列的至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)該目的基因。
所述的植物組織可通過(guò)例如，使本發(fā)明的植物細(xì)胞再分化來(lái)制備?；蛘呖蓪⒈景l(fā)明的組合物直接注入到植物組織來(lái)制備該植物組織。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的。
另一方面，本發(fā)明提供一種適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物包括1)一種啟動(dòng)子，它包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)該目的基因。
植物組織可通過(guò)例如，使本發(fā)明的植物細(xì)胞再分化來(lái)制備。這樣的技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的，包括例如對(duì)于雙子葉植物(例如，煙草，擬南芥屬，等)。Rogers et al.，Methods in Enzymology 118627-640(1986)；Tabata et al.，Plant Cell Physiol.，2873-82(1987)；Shaw，Plant Molecular BiologyA Practicalapproach.IRL press(1988)；Maliga et al.，Methods in Plant Molecular BiologyA laboratory course.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995)；對(duì)于水稻，Shimamoto et al.，Nature 338274(1989)；Hiei et al.，Plant J.6271-282(1994)；Toki，Plant Mol.Biol.Rep.1516-21(1997)；等。
另一方面，本發(fā)明提供一種適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物種子。該植物種子包括1)一種啟動(dòng)子，它包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)該目的基因。
這樣的植物種子可通過(guò)上述再分化并同時(shí)保持其生育力而制備。這樣的再分化技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的，包括如對(duì)于雙子葉植物(例如，煙草，擬南芥屬，等)。Rogers et al.，Methods in Enzymology 118627-640(1986)；Tabataet al.，Plant Cell Physiol.，2873-82(1987)；Shaw，Plant Molecular BiologyAPractical approach.IRL press(1988)；Maliga et al.，Methods in Plant MolecularBiologyA laboratory course.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1995)；對(duì)于水稻，Shimamoto et al.，Nature 338274(1989)；Hiei et al.，PlantJ.6271-282(1994)；Toki，Plant Mol.Biol.Rep.1516-21(1997)。
另一方面，本發(fā)明提供一種在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的方法，該方法包括1)提供具有編碼啟動(dòng)子的核酸的植物，其中該啟動(dòng)子包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并且具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；2)提供具有編碼目的基因的核酸的植物，和3)將植物置于允許啟動(dòng)子進(jìn)行操作的條件下。
一旦指定了本發(fā)明的啟動(dòng)子，上述方法可利用本領(lǐng)域通常所用的熟知的技術(shù)實(shí)施。所述表達(dá)方法在上文中描述。
另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)由在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的方法得到的基因產(chǎn)物，該方法包括1)提供具有編碼啟動(dòng)子的核酸的植物，其中所述啟動(dòng)子包括如SEQ IDNO.1所示序列的至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并且具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；2)提供具有編碼目的基因的核酸的植物，和3)將植物置于允許啟動(dòng)子進(jìn)行操作的條件下。
根和莖端的至少一個(gè)位置是活躍增生的組織。利用該方法可以得到大量的目的基因。
另一方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物的方法，該方法包括1)提供一種包含啟動(dòng)子的質(zhì)粒，該啟動(dòng)子包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，并且具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；2)用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；并且3)培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
提供質(zhì)粒的方法，轉(zhuǎn)化方法和培養(yǎng)方法在本領(lǐng)域是熟知的，并且已在本文中進(jìn)行了描述。
本發(fā)明人已經(jīng)分離并分析了水稻過(guò)氧化氫酶CatB基因(DDBJ登記號(hào)D64013)的結(jié)構(gòu)。而且，5′上游啟動(dòng)子區(qū)(-1066到+298該DNA片段在本文中稱(chēng)為BΔ0，其中cDNA起始點(diǎn)為+1)與報(bào)道基因(β-葡糖醛酸酶(GUS))融合。將融合體利用電穿孔導(dǎo)入由水稻培養(yǎng)細(xì)胞系(Oc細(xì)胞)制備的原生質(zhì)體中，以便利用因短暫基因表達(dá)所致的GUS酶活來(lái)指示測(cè)量啟動(dòng)子活性的強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其具有的活性比通常用于將基因?qū)胫参锏幕ㄒ嘶ㄈ~病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子高約20倍。因此，這揭示了該啟動(dòng)子可用于產(chǎn)生表達(dá)有用基因的啟動(dòng)子盒，本發(fā)明得以完成并以此提交專(zhuān)利申請(qǐng)(日本專(zhuān)利2955644，題目為“水稻CatB基因啟動(dòng)子”)。
進(jìn)一步地，通過(guò)northern雜交分析，本發(fā)明人公開(kāi)CatB在水稻植株幼苗的根部表達(dá)較強(qiáng)，而在成熟個(gè)體中卻不表達(dá)；并且在葉，莖，花中不能很強(qiáng)地表達(dá)(Iwamoto et al.Plant Science 15139-46(2000))(表1)。
表1水稻過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)的器官特異性(主要表達(dá)位置)

(由Iwamoto et al.，Plant Science 15139-46(2000)發(fā)表的northern分析數(shù)據(jù)以及其后得到的數(shù)據(jù)的概括。)基于上述的結(jié)果，本文力圖鑒定CatB基因啟動(dòng)子區(qū)中調(diào)控器官特異性的部分(日本登記號(hào)2955644)。
具體地，使CatB基因啟動(dòng)子區(qū)BΔ0缺失5′-側(cè)區(qū)域，產(chǎn)生多種DNA片段，將它們與報(bào)道基因(GUS)融合，然后導(dǎo)入載體(圖1和2)。將載體導(dǎo)入水稻和擬南芥屬進(jìn)行轉(zhuǎn)化。對(duì)第一代再分化植物或后代植物的各種組織進(jìn)行GUS組織染色以研究表達(dá)位點(diǎn)。
結(jié)果顯示，即使是cDNA起始點(diǎn)(+1)上游-329到+298的短啟動(dòng)子DNA片段(B1)也能使報(bào)道基因在水稻幼苗的根中表達(dá)(圖3，表2和表3)，以及在擬南芥屬幼苗植株的根和莖端表達(dá)(圖4，表4)。
表2水稻幼株的GUS染色(T0再分化第一代)

數(shù)字個(gè)體數(shù)；ND＝未確定(未研究)
表3花期的水稻植株的GUS染色(T0再分化第一代)

表4擬南芥屬幼苗植株的GUS染色(T2代)

器官特異性表達(dá)幅度在轉(zhuǎn)化植物個(gè)體間有差異，但在約一半的第一代再分化水稻植株中(具有導(dǎo)入的B1∷GUS構(gòu)建體(圖1中的B1))，報(bào)道基因在根中強(qiáng)表達(dá)。據(jù)認(rèn)為在水稻中報(bào)道基因的類(lèi)似地在莖端強(qiáng)表達(dá)。
由于啟動(dòng)子區(qū)的5′側(cè)逐漸增大的較大區(qū)域缺失，水稻幼株根部表達(dá)的特異性降低。按照表達(dá)特異性從高到低的順序依次為BΔ0(71％)＝BΔ3(75％)＞B1(48％)＞B2(19％)(表2)。啟動(dòng)子區(qū)越長(zhǎng)，表達(dá)的特異性越強(qiáng)。如果目的植物是從再分化個(gè)體組成的組篩選的，則甚至有可能從B1獲得特異性表達(dá)的植物體。因此，可根據(jù)目的來(lái)篩選BΔ0，BΔ3，或B1。
缺失-329到-227的區(qū)域的啟動(dòng)子(B2)在水稻和擬南芥屬的根中具有較低的表達(dá)水平(表2和4)。因此，該-329到-227區(qū)域是根中表達(dá)所必需的。該區(qū)沒(méi)有與根中表達(dá)相關(guān)的已知的順式元件。很有可能在該區(qū)中存在新的順式元件。
根據(jù)這一結(jié)果，開(kāi)發(fā)了一種方法，它可以從水稻過(guò)氧化氫酶CatB基因的1364個(gè)堿基的啟動(dòng)子區(qū)(先前作為專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)峤?獲得多種最長(zhǎng)達(dá)630個(gè)堿基的序列，用于在單子葉植物(例如水稻等)和雙子葉植物(例如擬南芥屬等)幼株的根和莖端表達(dá)外源基因。
通常而言，啟動(dòng)子堿基序列的保守性是低的。利用幾百個(gè)堿基的啟動(dòng)子堿基序列進(jìn)行篩選不容易檢測(cè)出具有相似活性水平的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(蛋白質(zhì))結(jié)合的位置(順式元件)的保守性較高。因此，根據(jù)本發(fā)明的特異性序列利用計(jì)算機(jī)搜尋順式元件數(shù)據(jù)庫(kù)，可得到許多順式元件候選物。相信可用生物信息學(xué)技術(shù)確定順式元件候選物的真實(shí)作用。
在后文中，本發(fā)明利用實(shí)施例進(jìn)行描述。下面所提供的實(shí)施例僅僅是舉例說(shuō)明。因此，本發(fā)明的范圍不僅僅限于實(shí)施例，而是由所附的權(quán)利要求書(shū)限定。
實(shí)施例(實(shí)施例1水稻過(guò)氧化氫酶CatB基因的分離)分離水稻過(guò)氧化氫酶CatB基因的方法在日本專(zhuān)利2955644，題目為“水稻CatB基因的啟動(dòng)子”中描述(注冊(cè)日1999年7月)。簡(jiǎn)而言之，該方法如下。
(從基因組庫(kù)中進(jìn)行篩選)用CatA cDNA的一部分克隆CatB基因。λ噬菌體的插入部分(克隆#51)通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，該部分含有非全長(zhǎng)的cDNA(約1.8kbp全長(zhǎng)的3′末端1.35kbp，其中總共約450bp的5′非翻譯區(qū)和一些編碼區(qū)缺失)，是在CatAcDNA克隆期間獲得的。自相同噬菌體制備DNA并用作模板。使用λgt11-正向引物和λgt11-反向引物(Toyobo Co.，Ltd.)。產(chǎn)物用Centricon-100(Amicon)純化濃度為25ng/10ul，并用作多引發(fā)(multi-prime)標(biāo)記方法的探針(Amersham)。
水稻基因組DNA庫(kù)(RICE Genomic Library)購(gòu)自CLONTECHLaboratories Inc.(Palo Alto，CA，US)，用于篩選CatB基因，如下。噬菌體λEMBL-3含有該基因組庫(kù)，根據(jù)本領(lǐng)域常用的方法，用其感染大腸桿菌菌株NM538，以形成噬菌斑。將噬菌斑轉(zhuǎn)移到尼龍膜上以允許與上述的探針雜交。注意探針已用32P標(biāo)記。
雜交溶液6×SSC-0.1％SDS，5×Denhardt′s，100ug/ml鮭精DNA；雜交溫度65℃；雜交時(shí)間過(guò)夜。
此后，在下面相對(duì)溫和的條件下洗膜。洗滌條件2×SSC-0.1％SDS，室溫，5分鐘+30分鐘；1×SSC-0.1％SDS，68℃，1小時(shí)。
洗滌之后，將尼龍膜根據(jù)通常所用方法進(jìn)行放射自顯影以檢測(cè)與探針雜交的克隆。從證實(shí)發(fā)生了雜交的每種噬菌體制備DNA。
用限制酶Sal I和Sca I消化上述噬菌體DNA。消化產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離。將分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上以允許與上述作為探針的CatA cDNA片段雜交。雜交的條件與上面所述的相同。在下面所述的條件下洗膜。洗滌條件2×SSC，室溫，5-10分鐘，兩次；2×SSC-0.1％SDS，65℃，30分鐘。
洗滌之后，將尼龍膜根據(jù)通常本領(lǐng)域所熟知的方法放射自顯影以檢測(cè)與探針雜交的DNA片段。
發(fā)現(xiàn)了具有基本上相同的信號(hào)強(qiáng)度和帶型的克隆(推定它們具有相同的結(jié)構(gòu))，以及帶型僅部分匹配的克隆。前一類(lèi)具有基本上相同的信號(hào)強(qiáng)度和帶型的克隆被認(rèn)為對(duì)應(yīng)于CatA基因。實(shí)際上，克隆74是對(duì)應(yīng)于CatAcDNA的基因。另一方面，后一類(lèi)具有僅部分匹配的帶型的克隆可能是缺乏CatA基因的克隆或者是具有除CatA以外的其它的過(guò)氧化氫酶基因的克隆。所以，用CatA cDNA作探針在下述溫和條件或嚴(yán)謹(jǐn)條件下實(shí)施雜交，對(duì)所得的模式互相比較。
溫和雜交條件50％甲酰胺，6×SSC-0.1％SDS，5×Denhardt′s，100ug/ml鮭精DNA；雜交溫度37℃；雜交時(shí)間過(guò)夜。
洗膜的條件與上述的相同2×SSC-0.1％SDS，室溫，5分鐘+30分鐘；1×SSC-0.1％SDS，68℃，1小時(shí)。
嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件50％甲酰胺，6×SSC-0.1％SDS，5×Denhardt′s，100ug/ml鮭精DNA；雜交溫度42℃；雜交時(shí)間過(guò)夜。
洗膜的條件2×SSC-0.1％SDS，室溫，5分鐘+30分鐘；1×SSC-0.1％SDS，68℃，1小時(shí)。
嚴(yán)謹(jǐn)條件下的雜交檢測(cè)到與標(biāo)準(zhǔn)雜交相同數(shù)目的條帶。另一方面，溫和條件下的雜交顯示的條帶數(shù)目大于在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的數(shù)目。根據(jù)這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)具有僅部分匹配的帶型的克隆很有可能是與CatA相似并具有部分不同的堿基序列的DNA，即，除了CatA以外的過(guò)氧化氫酶基因，但不是缺乏CatA基因的克隆。
約20個(gè)具有僅部分匹配的帶型的克隆被認(rèn)為是過(guò)氧化氫酶同功酶基因的候選基因，對(duì)它們進(jìn)行進(jìn)一步進(jìn)行分析。在這些克隆之中，根據(jù)詳述的基于CatA堿基序列的Southern分析，部分堿基序列分析，PCR分析等推斷克隆7為不同于CatA的過(guò)氧化氫酶基因。還發(fā)現(xiàn)克隆7具有與CatB cDNA不同的序列，將其指定為CatC。CatC堿基序列在The journal of Japan Societyfor Bioscience，Biotechnology，and Agrochemistry 68,404(1994)中描述。
有一些克隆具有帶型不同于CatA和克隆7(CatC)的帶型中，其中對(duì)克隆6進(jìn)行更詳細(xì)的分析?？寺?的DNA的堿基序列也進(jìn)行部分分析。該序列與CatB基因的cDNA序列匹配(Plant Physiol.(1994)1051015-1016)。
基于上述的信息，合成兩種DNA寡聚物以得到CatB基因的5′非翻譯區(qū)。
GGTCGATTCTCATCTCTCCCACAACAAATCSEQ ID No.6(對(duì)應(yīng)于CatB cDNA的102-131)CAATGTCTCAGGGCTTCCACGCTCATGCACSEQ ID No.7(對(duì)應(yīng)于CatB cDNA的484-455)另一方面，從愈傷組織制備水稻cDNA庫(kù)。用該cDNA庫(kù)的DNA作模板，用上述兩種合成DNA作引物，在標(biāo)準(zhǔn)條件下實(shí)施PCR。擴(kuò)增后，獲得約400bp的DNA片段。用這些400bp的DNA片段作探針以再次篩選上述的被認(rèn)為是CatB基因的克隆。結(jié)果獲得幾個(gè)可雜交的克隆。
其中，上述的克隆6在400bpPCR擴(kuò)增產(chǎn)物上游的至少約1kbp處具有5′-上游區(qū)，并且全長(zhǎng)至少約5kbp。該克隆命名為克隆U6。制備克隆U6的限制酶圖譜(未顯示)。
包含5′-上游區(qū)約1kbp的多個(gè)片段(Sal I-Eco RI消化的片段)和它們的下游片段(Eco RI-Eco RI消化的片段)從克隆U6中切下，插入到用于序列分析的載體(pUC18)中以產(chǎn)生逐步遞增地缺失較大的5′節(jié)段和3′節(jié)段的大量質(zhì)粒從而確定堿基序列。因此，CatB(4985bp)的核酸序列由SEQ ID No.2表示。
(實(shí)施例2構(gòu)建CatBΔ0(-1066到+298)-GUS/pBI121)如在題為“水稻CatB基因的啟動(dòng)子”的日本專(zhuān)利2955644中所述，構(gòu)建CatBΔ0(-1066到+298)-GUS/pBI121。簡(jiǎn)而言之，如下進(jìn)行構(gòu)建。
所得CatB基因長(zhǎng)度為4985bp。而且，發(fā)現(xiàn)第一外顯子存在于SEQ IDNo.2的1073到1216；第二外顯子存在于1333到1429；第三外顯子存在于2341到2618；第四外顯子存在于2970到3746；第五外顯子存在于3968到4057；第六外顯子存在于4252到4319；第七外顯子存在于4410到4503；第八外顯子存在于4616到4881；第一到第七內(nèi)含子存在于相應(yīng)外顯子之間?；谏鲜龅男蛄?，推斷啟動(dòng)子區(qū)為位于1073前的序列。該序列信息可用于切出啟動(dòng)子區(qū)。具有水稻CatB基因啟動(dòng)子的質(zhì)粒CatB-GUS-Δ0如下述制備。
克隆U6用SalI和EcoRI切割以切下2.3kbp的片段。該片段與已用SalI和EcoRI切割的pUC 18連接。所得的重組質(zhì)粒用Eco47I(Toyoboco.，Ltd.制備)消化。收集約2kbp的片段。該片段用DNA聚合酶的K1enow片段消化，然后用PstI消化。結(jié)果，得到具有克隆U6中7到1370位所示序列(SEQ IDNo.2)的片段A。該片段A包含有第一外顯子上游的序列，第一外顯子，第一內(nèi)含子，和第二外顯子。該片段的5′-末端為PstI位點(diǎn)，3′-末端為平末端。
植物細(xì)胞的表達(dá)載體pBI221(Clonetech)具有花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子，β-葡糖醛酸酶(GUS)編碼區(qū)，胭脂氨酸合成酶終止子(NOS·T)。該pBI221用PstI和SmaI消化，收集PstI-SmaI大片段B。該大片段B從pBI221去除了CaMV 35S啟動(dòng)子區(qū)。將大片段B與具有克隆U6中7到1370位序列的片段A連接，以產(chǎn)生CatB-GUS-Δ0。
(水稻細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和GUS基因的表達(dá))將70ml具有下述組成的AA培養(yǎng)基放入300-ml燒瓶中。對(duì)水稻Oc細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)并溫和攪拌(90rpm)。
AA培養(yǎng)基的組成(Mol.Gen.Genet.16167-76(1978))1)無(wú)機(jī)鹽 濃度(mg/l)MnSO4·4-6H2O 10H3BO33ZnSO4·7H2O2Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·2H2O 0.025CoCl2·6H2O 0.025KI 0.75CaCl2·2H2O 150MgSO4·7H2O 250NaH2PO4·H2O 150KCl 30002)鐵成分Fe-EDTA 403)維生素，有機(jī)成分蔗糖 20000煙酸1-硫胺素鹽酸 10鹽酸吡哆醇 1肌醇 100L-精氨酸 177L-甘氨酸 7.5L-谷氨酰胺 900L-天冬氨酸 3004)激素酸2，4-D 1細(xì)胞分裂素 0.2GA3 0.1每周將10ml所述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到70ml新鮮培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)移之后，第5天的細(xì)胞用來(lái)制備原生質(zhì)體。根據(jù)Mol Gen.Genet 206408-413(1987)所描述的方法制備原生質(zhì)體。將第5天傳代培養(yǎng)的愈傷組織細(xì)胞懸浮物轉(zhuǎn)移到塑料Petri培養(yǎng)皿中。用抽吸器除去培養(yǎng)基。20ml酶溶液(4％纖維素酶RS(Yakult)，1％解析酶R10(Yakult)，0.4M甘露糖醇，0.5％CaCL2·2H2O，0.5％硫酸葡聚糖鉀。用石蠟?zāi)じ卜馀囵B(yǎng)皿并置于28℃的暗處。約5小時(shí)后，將培養(yǎng)基進(jìn)行尼龍網(wǎng)過(guò)濾以除去未消化的物質(zhì)，然后接著進(jìn)行多次洗滌。
將由此獲得的原生質(zhì)體懸浮于EP緩沖液(5mM MgCL2，70mM KCL，0.1％ MES，0.4M甘露糖醇，加入雙蒸水至pH5.6；過(guò)濾除菌，Nature338274-276(1989))中。取出部分(0.5ml)懸浮液與20μg/ml的上述質(zhì)粒DNA和30μl/ml的鮭精DNA混合。然后，將混合物在一次性小杯中利用Gene-Pulser(Bio-Rad，CA)進(jìn)行電穿孔(300V/cm)(電極間距為0.4cm)，其中電容500μF，電阻100Ω。原生質(zhì)體在冰上靜置10分鐘。將1.5ml R2P培養(yǎng)基添加到原生質(zhì)體中。混合物置于Millicell(Millipore，CA)中。將Millicell置于含有5ml R2P培養(yǎng)基的6cm塑料盤(pán)中(Plant Cell Physiol.141113-1121(1973))。在Millicell外添加撫育細(xì)胞。在暗處28℃進(jìn)行培養(yǎng)。撫育細(xì)胞的存在對(duì)Cat A-GUS-Δ0，Cat B-GUS-Δ0和Cat C-GUS-Δ0的表達(dá)沒(méi)有影響。
R2P培養(yǎng)基的組分(1)主要成分(mg/ml)KNO34000(NH4)2SO4335MgSO4·7H2O 250Ca2Cl2·2H2O 150NaH2PO4·H2O 273(2)次要成分(mg/ml)MnSO4·4H2O 1.6ZnSO4·7H2O 2.2CuSO4·5H2O 0.125H3BO33.0NaMoO4·2H2O 0.125Na2EDTA7.5FeSO4·7H2O 5.5(3)有機(jī)成分(mg/ml)肌醇 100煙酸 1.0鹽酸吡哆醇 1
鹽酸硫胺素 10蔗糖(g/l)1372，4-D(mg/l) 2.0pH5.6用于激活GUS的原生質(zhì)體如下述進(jìn)行基本處理，“Rabo-manyuaruShokubutsu-idennshi-no-kino-kaiseki[Laboratory ManualAnalysis of PlantGene Functions]”(Masaki Iwabuti.Toshiro Shimura，Maruzen，1992，p.55)，電穿孔之后，將原生質(zhì)體在暗處28℃培養(yǎng)4天。用1ml Falcon pipette(#7521)收集所得原生質(zhì)體并置于1.5ml微量管中，接著室溫9000rpm離心3分鐘。所得沉淀分析前保持在-80℃。
將200μl提取緩沖液(50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，10mM Na2EDTA，0.1％TritonX-100，0.1％十二烷基肌氨酸，10mM β-巰基乙醇)添加到冰水中冰凍的沉淀中，靜置5分鐘以使其解凍。通過(guò)超聲裝置(Branson Sonifier250型)在下述條件下處理混合物1分鐘Output control 2和Duty Cycle 10％。處理之后，將混合物在4℃15000rpm離心20分釧。收集上清(原生質(zhì)體提取物)并用作測(cè)定GUS活性的樣品，利用Bradford方法(Anal.Biochem 72248-254(1976))測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度。
根據(jù)Jefferson等(同上)描述的方法測(cè)定GUS的活性。通過(guò)向反應(yīng)液中添加20％(v/v)甲醇而消除內(nèi)源GUS活性。從至少兩次試驗(yàn)中獲得結(jié)果，試驗(yàn)包括三次相同的試驗(yàn)(三份樣品)。
結(jié)果顯示CatB基因啟動(dòng)子與對(duì)照即CaMV CatA和CatC啟動(dòng)子(未顯示)相比具有相對(duì)高水平的活性。
(實(shí)施例3通過(guò)PCR方法修飾起始密碼子的堿基和制備CatB的5′上游DNA片段(B1片段，B2片段)，及構(gòu)建質(zhì)粒)通過(guò)PCR制備水稻過(guò)氧化氫酶基因CatB的5′-上游DNA片段(B1片段，B2片段)，該片段在起始密碼子中帶有點(diǎn)突變。以Cat BΔ0(-1066到+298)-GUS/pBI121為模板，用引物3D3-F1(5′GTG AAG CTT TCG ATC ACG ATGAGC GAG-3′(SEQ ID No.8)和BD3-MR(5′-GTA GGG ATC CGT GGC GTGATT TG-3′(SEQ ID No.9)，以及Pfu DNA聚合酶(Promega)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備B1片段(-329到+298，cDNA的起始點(diǎn)為+1)，其中的引物3D3-F1用于將HinDIII切割位點(diǎn)導(dǎo)入DNA片段的5′-末端鄰接區(qū)，引物BD3-MR用于以C取代CatB起始密碼子ATG中的T。
使用引物3D3-F2(5′GTT AAG CTT GTC TTA TCT CCT CGT GAT CC-3′(SEQ ID No.10)，將Hind III切割位點(diǎn)導(dǎo)入DNA片段5′端鄰接區(qū)域的引物)和BD3-MR經(jīng)PCR擴(kuò)增制備B2片段(-226到+298)。
將所得DNA片段用限制酶HindIII和BamHI處理，并使用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Shuzo)將其并入已用HindIII和BamHI處理的載體Cat BΔ0-GUS/pBI121中GUS基因的上游區(qū)。將載體導(dǎo)入高感受態(tài)的用于轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α(Toyobo co.，Ltd.)。自大腸桿菌中純化載體，測(cè)定并證實(shí)其堿基序列。載體用限制酶HindIII和EcoRI處理以切出含有B1或B2片段的DNA片段，GUS基因和胭脂氨酸合成酶基因終止子(NOS-ter)。將該DNA片段并入已用HindIII和EcoRI處理的雙元載體TN2(Fukuoka et al.，Plant CellReports 19815-820(2000))。
(實(shí)施例5將基因?qū)胫参?用土壤桿菌屬(EHA105)將pTN2導(dǎo)入水稻(品種Nippponbare)，方法見(jiàn)Hiei等(Plant J.6271-282(1994))和Toki(Plant Mol.Biol.Rep.1516-21(1997))。
將pTN2通過(guò)部分修飾下述方法的方法導(dǎo)入擬南芥屬(品種Cloumbia)“Moderu-shokubutsu-no-Jikkeh-Purotokoru For Ine·ShiroinunazunaSaibo-kogaku Bessatsu-shokubutsu-saibo-kogaku sirizu4；Genatsu-Shitsujyunho-niyoru-Keishitsu-tenkan[Experimental Protocol for Model plants For Rice andArabidopsis thalianaCelluar Engineering，Special Issue，Plant CellularEngineering Series 4；Transformation by a vacuum infiltration method”(TakashiAraki)pp.109-113(Supervised by Koshimamoto and Kiyotaka Okada)”。
(實(shí)施例6植物GUS組織染色方法)通過(guò)部分修飾下述方法的方法觀察GUS活性“Shokubutsu-no-Saibo-wo-miru-jikken-purotokoruIdenshihatsugen-kara-saibonaikouzou.kino-made；Saibo-kogaku Bessatsu-shokubutsu-saibo-kogaku sirizu62-3；Saibo-reberu-de-GUSkassei-wo-miru-hoho[Experimental Protocol forobserving Plant cellsFrom Gene Expression to Intracellular Structure.Function；Cellular Engineering，Special Issue，Plant Cellular Engineering Series 62-3；Method for Observing GUS activity at Cellular Level]，(Misa Takahashi andHiromichi Morikawa)，pp.71-79(supervised by Hiroho Fukuda，MikioNishimura，and Kenzo Nakamura)。
①制備X-Gluc溶液[100mM磷酸緩沖液(pH7.0)，1mM X-Gluc，0.3mM高鐵氰化鉀，0.3mM亞鐵氰化鉀，0.2％Triton-X100]。
②將500μl X-Gluc溶液分散于24孔滴定板的各孔中。
③將水稻和擬南芥的每一組織或切片置于孔中并在28℃處理16小時(shí)。
④除去X-Gluc溶液。加入70％乙醇以脫色。
⑤除去70％乙醇，將組織.切片浸入50％甘油溶液中。
⑥通過(guò)顯微鏡或立體顯微鏡觀察組織·切片。
(結(jié)果)不同的植物轉(zhuǎn)化株之間器官特異性的程度有差異。然而，在導(dǎo)有B1∷GUS構(gòu)建體(圖1中B1)的第一代再分化水稻植株中，約有一半的植株基報(bào)道基因在根中表達(dá)強(qiáng)。對(duì)于轉(zhuǎn)化的擬南芥屬植株，報(bào)道基因在導(dǎo)有B1∷GUS構(gòu)建體(圖1中B1)的大部分?jǐn)M南芥T2代中的根和莖端表達(dá)強(qiáng)。
工業(yè)應(yīng)用通過(guò)利用該啟動(dòng)子，就有可能在根中合成抗線蟲(chóng)或抗土壤病原體的抗性物質(zhì)；在根中合成促進(jìn)根發(fā)育的物質(zhì)；產(chǎn)生基因重組植物，其中再分化植物體的選擇性標(biāo)記的表達(dá)限于幼株的根部，而在植物成熟時(shí)抑制表達(dá)等。而且，莖端的表達(dá)能力可用于開(kāi)發(fā)在增殖活動(dòng)旺盛的細(xì)胞中抑制基因表達(dá)的技術(shù)。
本發(fā)明CatB基因啟動(dòng)子區(qū)的部分堿基序列可用于在根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)外源基因。因此，該啟動(dòng)子可用于開(kāi)發(fā)特異于育種植物(例如水稻等)的根和莖端的至少一個(gè)位置的啟動(dòng)子，這是通過(guò)使用在根和莖端的至少一個(gè)位置合成的蛋白質(zhì)或分泌到細(xì)胞外的物質(zhì)進(jìn)行基因操作而實(shí)現(xiàn)的。
例如，通過(guò)利用該啟動(dòng)子就有可能在根中合成抗線蟲(chóng)或抗土壤病原體的抗性物質(zhì)；在根中合成促進(jìn)根發(fā)育的物質(zhì)；產(chǎn)生基因重組的植物，其中再分化植物體的選擇性標(biāo)記的表達(dá)限于根，以在植物成熟時(shí)抑制表達(dá)等。
序列表<110>AR030<120>在根和苗端表達(dá)外源基因的啟動(dòng)子<130>AR030PCT<140><141><160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1364<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>1ctgcaggtca acggatctta tttttccatt ataatatata taataaataa atatatgttt 60acttttatta tagtacttta aaagataaat ctatatatgt tgttctagtt cctttaaact 120aaatattatt aaagttatta atggttaaag ttataaaagt ttgatatcaa actcgtccaa 180aatgtcgatt aatatcgaac cggagcgagt acagtattag tagcaagtca gccacatggg 240acatggccca catgcatgca cgtcgtatga acacaccgtg attctttgcc acttgcataa 300tattctagca ctgctatact acacgacgac tgacggcgac gtcagttcag tttagtttgc 360cgcatccatc gcgaaggcta ctctacccat cccatttttt tttaaaaaaa aatactataa 420atctaaatat cttacattag atttgtatat tttaaagcaa agagaataat atgtagatat 480aagtatgtac ctactcgctc gagcacaaga tcactgcaac aagcattgaa gatcgctcct 540agcaatggtc tcaacttacc atgtaaacta agagcaacta taatgttttt cttttattag 600gaatggttgc atcttatatt ttgagattga gaaaacacat atagaaatta tacaggattt 660agcatttggg atgccggccg gattcctgat ttcccagtct ctggctttct ttttaaacaa 720aaacgaaaaa agcagtgatc cgatcgatca cgatgagcga gctagtaagc tccaaaacaa 780aatagagtac gtacgtataa tcctagagtc cggataataa taatccgttt ggttcgcgtt 840aaaaaagtct tatctcctcg tgatcccttt ttttggatcg atccatgttc gtagtacgtg 900acaagcacgc gcaccaaccg aagcaggtac ctgtgtcgct gcctgtgggc cccacacacc 960ccaagacggc cattaataaa caaacacgac gtggacgaag agaagggagg ccggcaagaa 1020gcatactagc acgctacgaa accccccttc tcttcgtccc caaattgcac tacaaaaaag 1080gccgcccctt tcttctctcc tcgtccttat caccaccaat ccgatcctct tctcttctct 1140tctcttcttc cccacatcca gttcgattct catctctccc acaacaaatc acgccatgga 1200tccctacaag gtgccgcctt ttcctgattt tcttttcttc tagatcgatc gtcgatttgg 1260tttggtttgg tttcttgatg cgctcatccc aatctgactg actcactgga ttcctcctcc 1320ttgcagcatc ggccgtccag cgggagcaat tccaccttct ggac 1364<210>2<211>4985<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>2gtcgacctgc aggtcaacgg atcttatttt tccattataa tatatataat aaataaatat 60atgtttactt ttattatagt actttaaaag ataaatctat atatgttgtt ctagttcctt 120taaactaaat attattaaag ttattaatgg ttaaagttat aaaagtttga tatcaaactc 180gtccaaaatg tcgattaata tcgaaccgga gcgagtacag tattagtagc aagtcagcca 240catgggacat ggcccacatg catgcacgtc gtatgaacac accgtgattc tttgccactt 300gcataatatt ctagcactgc tatactacac gacgactgac ggcgacgtca gttcagttta 360gtttgccgca tccatcgcga aggctactct acccatccca ttttttttta aaaaaaaata 420ctataaatct aaatatctta cattagattt gtatatttta aagcaaagag aataatatgt 480agatataagt atgtacctac tcgctcgagc acaagatcac tgcaacaagc attgaagatc 540gctcctagca atggtctcaa cttaccatgt aaactaagag caactataat gtttttcttt 600tattaggaat ggttgcatct tatattttga gattgagaaa acacatatag aaattataca 660ggatttagca tttgggatgc cggccggatt cctgatttcc cagtctctgg ctttcttttt 720aaacaaaaac gaaaaaagca gtgatccgat cgatcacgat gagcgagcta gtaagctcca 780aaacaaaata gagtacgtac gtataatcct agagtccgga taataataat ccgtttggtt 840cgcgttaaaa aagtcttatc tcctcgtgat cccttttttt ggatcgatcc atgttcgtag 900tacgtgacaa gcacgcgcac caaccgaagc aggtacctgt gtcgctgcct gtgggcccca 960cacaccccaa gacggccatt aataaacaaa cacgacgtgg acgaagagaa gggaggccgg 1020caagaagcat actagcacgc tacgaaaccc cccttctctt cgtccccaaa ttgcactaca 1080aaaaaggccg cccctttctt ctctcctcgt ccttatcacc accaatccga tcctcttctc 1140ttctcttctc ttcttcccca catccagttc gattctcatc tctcccacaa caaatcacgc 1200catggatccc tacaaggtgc cgccttttcc tgattttctt ttcttctaga tcgatcgtcg 1260atttggtttg gtttggtttc ttgatgcgct catcccaatc tgactgactc actggattcc 1320tcctccttgc agcatcggcc gtccagcggg agcaattcca ccttctggac caccaactcc 1380ggcgcccccg tctggaacaa caactccgcc ctcaccgtcg gagagcgagg tactgagctg 1440ctccatcctc catcttcctc atctcttcct ccacgaatct atacttccta tcgatccatg 1500tgctttatgt ctgcttagag gcgtatttgg gcttgcttcc atcatgatcc aatgttaact 1560ttgagcgatc agatgcttaa taatttgtct gtgtctggta gcaacagaaa aggtccctgg 1620atctgtgtga attggactgt agcacgacgt gtgcgatctt gccttactat tgttccttta 1680gagctattca aagtttgcat ctttggtgtg ggggggtttt cagccttttg ctttgagtaa 1740catgtccttg tcactacctt gtgattcatc tgtgctgctt acacacaaag aggaagatct 1800ctagtttggt tgcactatgt tcttgttatt gctcggttac actccttcat caacgctaaa 1860agacgcagtc ttgatatttt tctctgtcgc tgtcaatctg tcataccatt aataaagaac 1920gtataaaaat tgaccttttc cccattcata gtagtgatta tctcacttgt cctcagttct 1980aaaacagcat tcttgttttt tgggggtttt tttaccatta tcggttcact ttacaaagta 2040atctgatgac gatcaaattt actggagtac cagagaagca caagtctatt tcatacatat 2100atccaacatg actcaagttt cgaaagtgac tggaagtcat gttccaaatg tcatggtcac 2160taaaagtacc aaactctgac aaagatgtat ttgcatctag aactaagtgc ttctatcatc 2220gatctgtgaa gttttctttc tagtgttttc cctttattta tactcagcaa ctcctgtatt 2280tttgcaatct gtaatcatgg ctgttttgtg gtttgacatg atgaattctt caatcgacag 2340gccctatcct ccttgaggac tatcatctga ttgaaaagct tgcacagttt gacagggagc 2400gtatccctga acgtgtcgtt catgcaaggg gagccagtgc caagggattt tttgaggtta 2460ctcatgatat ttctcacctc acatgtgctg attttctccg tgctcctggt gttcagaccc 2520cagttattgt tcggttctcc acagtcgtgc atgagcgtgg aagccctgag acattgaggg 2580aaccacgtgg ttttgctgtc aagttttaca ctagagaggt acttgctctt tcgcttcttt 2640ctttcatagg attgtaggag ggagacattc agtataatgt attcttcaag cataaggctg 2700tagaatcaaa tgtctagttg ttctcagttg gttaagtaga acatgaaaga ttggttgtcc 2760tttacctcca cactccatag gtccagtgca ttgcttaatc ttatatctac taaagcaaat 2820gagggtaatt tggtcttata tatctcaaaa gtctcacaca ttggacatat atctaaccag 2880tgtcacctac aactttgtct tactgtttat ttactgattt gcattcagtg ctgccatatt 2940ttgatatttt ctgagtcaat gcttttcagg gtaattttga tcttgttggg aacaatatgc 3000ctgtcttttt tatccgagat gggatgaaat tccctgacat ggtccatgct ttcaagccaa 3060gtccaaagac caatatgcag gagaactgga gaatagttga tttcttttca caccacccag 3120agagcctgca catgttctcc ttcctctttg acgatgtagg catcccactc aaccacaggc 3180acatggaggg ttttggtgtc aacacctaca ccctaatcaa taaggatgga aagcctcacc 3240ttgtcaaatt ccactggaag cctacctgtg gtgtcaaatg cctgttggat gatgaagctg 3300tgactgttgg cggcacctgc cacagccatg ccacgaagga cttgactgat tctattgcag 3360cagggaatta cccagagtgg aagctttaca tccagactat tgatcctgat catgaggaca 3420gatttgactt cgatcctctt gatgtcacca agacatggcc agaggatatc atccccctgc 3480agccagttgg acggatggtc ctgaacaaaa acattgataa cttctttgca gaaaatgaac 3540agcttgcttt ctgcccagcg ataattgtcc ctggaatcca ttactctgat gataagctgc 3600tccagacaag aattttctcc tatgctgata cccaaaggca ccgtcttggc ccaaactatt 3660tgatgcttcc tgtgaatgca ccaaaatgtg cataccacaa caaccaccac gatggctcca 3720tgaatttcat gcacagggat gaagaggtac tgtgtgtata tactttcaga gatacatctc 3780ctgcattcag ttgttgtgat gcatctttct gtttttgtcc attacatatt gtttcttcca 3840gtcaacacaa acagaatggg actatcattc agtttattgc atttacatct atttgccttg 3900tttttaggtt aactacttcc cttcaattca gtttattgca tttacatcta tttgccttgt 3960tttttaggtt aactacttcc cttcaaggtt tgatgctgca cgtcatgctg agaaggtccc 4020tattcctcct cgtgttctaa caggctgtcg ggaaaaggtg tgtaacttgg tccacttgaa 4080ctccttgcgc tgttaccttg tgagcatggt tttgtcccgc tacattagga gactatttgc 4140tgatttggaa tgcgatgaaa tatgtattat agatgtggta ccctggaaag tacaatgacc 4200acatgcattt gacacaatgt tttctgcctc tcttttttgt tggaaatgca gtgtgtcatt 4260gacaaggaga acaatttcca acaggctggt gagagatacc ggtcatttga ccctgccagg 4320tttgttcttg ttcaatttaa ttcgtgtgaa cacatcgaag agtttgagca acaacgctaa 4380ttaaactttt ctttttgtat gtaacacagg caagatcgtt ttctccagcg gtgggttgat 4440gctctctcag atcctcgtat 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acgtacgtat 300aatcctagag tccggataat aataatccgt ttggttcgcg ttaaaaaagt cttatctcct 360cgtgatccct ttttttggat cgatccatgt tcgtagtacg tgacaagcac gcgcaccaac 420cgaagcaggt acctgtgtcg ctgcctgtgg gccccacaca ccccaagacg gccattaata 480aacaaacacg acgtggacga agagaaggga ggccggcaag aagcatacta gcacgctacg 540aaacccccct tctcttcgtc cccaaattgc actacaaaaa aggccgcccc tttcttctct 600cctcgtcctt atcaccacca atccgatcct cttctcttct cttctcttct tccccacatc 660cagttcgatt ctcatctctc ccacaacaaa tcacgccatg gatccctaca aggtgccgcc 720ttttcctgat tttcttttct tctagatcga tcgtcgattt ggtttggttt ggtttcttga 780tgcgctcatc ccaatctgac tgactcactg gattcctcct ccttgcagca tcggccgtcc 840agcgggagca attccacctt ctggac 866<210>4<211>627<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>4aagctttcga tcacgatgag cgagctagta agctccaaaa caaaatagag tacgtacgta 60taatcctaga gtccggataa taataatccg tttggttcgc gttaaaaaag tcttatctcc 120tcgtgatccc tttttttgga tcgatccatg ttcgtagtac gtgacaagca cgcgcaccaa 180ccgaagcagg tacctgtgtc gctgcctgtg ggccccacac accccaagac ggccattaat 240aaacaaacac 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1.一種啟動(dòng)子，包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。
2.權(quán)利要求1中所述的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子包括SEQ ID NO.11所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且所述啟動(dòng)子具有與SEQ IDNO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。
3.權(quán)利要求1中所述的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子包括SEQ ID NO.12所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且所述啟動(dòng)子具有與SEQ IDNO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。
4.用于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的組合物，該組合物包括1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)所述目的基因。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述啟動(dòng)子包括SEQ ID NO.11所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。
6.權(quán)利要求4的組合物，其中所述啟動(dòng)子包括如SEQ ID NO.12所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性。
7.權(quán)利要求4的組合物，其中所述的植物是單子葉植物或雙子葉植物。
8.權(quán)利要求4的組合物，其中所述的植物是單子葉植物。
9.權(quán)利要求4的組合物，其中所述的植物是水稻，擬南芥屬，玉米，小麥，大麥，番茄，黃瓜，茄子，馬鈴薯，萵苣，日本小蘿卜，或胡蘿卜。
10.權(quán)利要求4的組合物，其中目的基因編碼選自下述組的至少一種多肽賦予抗性的多肽，促進(jìn)根發(fā)育的多肽，以及用于再分化植物體的選擇標(biāo)記。
11.權(quán)利要求4的組合物，其中根和莖端的至少一個(gè)位置包括根尖部分。
12.權(quán)利要求4的組合物，其中根和莖端的至少一個(gè)位置包括單子葉植物幼苗的分生組織區(qū)域。
13.權(quán)利要求4的組合物，其中根和莖端的至少一個(gè)位置包括莖端部分。
14.在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物表達(dá)盒，該植物表達(dá)盒包括1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)所述目的基因。
15.在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的質(zhì)粒，該質(zhì)粒包括1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)該目的基因，其中啟動(dòng)子與目的基因可操縱地連接。
16.適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物細(xì)胞，該植物細(xì)胞包括1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)該目的基因。
17.適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物組織，該植物細(xì)胞包括1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)該目的基因。
18.適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物包括1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)該目的基因。
19.適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物種子，該植物種子包括1)一種包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；和2)該目的基因。
20.在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的方法，該方法包括1)提供帶有編碼啟動(dòng)子的核酸的植物，其中該啟動(dòng)子包括SEQ IDNO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；2)提供帶有編碼所述目的基因的核酸的植物，和3)將植物置于允許啟動(dòng)子進(jìn)行操作的條件下。
21.由在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的方法得到的基因產(chǎn)物，該方法包括1)提供帶有編碼啟動(dòng)子的核酸的植物，其中該啟動(dòng)子包括SEQ IDNO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；2)提供帶有編碼所述目的基因的核酸的植物，和3)將植物置于允許啟動(dòng)子進(jìn)行操作的條件下。
22.適應(yīng)于在植物的根和莖端的至少一個(gè)位置表達(dá)目的基因的植物的產(chǎn)生方法，該方法包括1)提供一種包含啟動(dòng)子的質(zhì)粒，該啟動(dòng)子包括SEQ ID NO.1所示序列中至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并且具有與SEQ ID NO.1所示序列基本上相同或比其高的啟動(dòng)子活性；2)用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；并且3)培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在根和莖端的至少一個(gè)位置特異性誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。利用該啟動(dòng)子，有可能在根中合成抗線蟲(chóng)或抗土壤病原體的抗性物質(zhì)；在根中合成促進(jìn)根發(fā)育的物質(zhì)；產(chǎn)生基因重組植物，其中再分化植物體的選擇性標(biāo)記限定在幼株植物的根部表達(dá)，而在植物成熟時(shí)抑制該表達(dá)；等。而且，莖端的表達(dá)能力可用于開(kāi)發(fā)在增殖活動(dòng)旺盛的細(xì)胞中抑制基因表達(dá)的技術(shù)。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1476477SQ02803187
公開(kāi)日2004年2月18日 申請(qǐng)日期2002年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月25日
發(fā)明者肥后健一, 巖本政雄, 肥后廣美, 美, 雄 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所