專利名稱：Flt4(VEGFR-3)作為靶用于腫瘤成像和抗腫瘤治療的制作方法
本申請是一份繼續(xù)申請，它要求申請日為1998年10月9日的美國專利申請系列號09/169,079；現(xiàn)在是美國專利號6,107,046的申請日為1997年7月28日的美國專利申請系列號08/901,710；現(xiàn)在是美國專利號5,776,755的申請日為1994年11月14日的美國專利申請系列號08/340,011；現(xiàn)在放棄的申請日為1994年6月9日的美國專利申請系列號08/257,754的優(yōu)先權；后兩份申請又是現(xiàn)在放棄的申請日為1992年10月9日的美國專利申請系列號07/959,951的部分繼續(xù)申請。本文引用所有這些申請以其整體作為參考。
本發(fā)明的領域本發(fā)明一般涉及受體基因，特別是受體酪氨酸激酶的基因，其插入重組DNA載體，和在宿主微生物菌株和宿主真核細胞中生產(chǎn)所得蛋白質。更具體的說，本發(fā)明涉及Flt4，一種受體酪氨酸激酶；涉及編碼Flt4的核苷酸序列；涉及編碼Flt4的DNAs及其基因產(chǎn)物的生產(chǎn)方法；涉及特異性地識別(雜交)編碼該受體的核酸的核酸探針；涉及特異性地識別該受體的抗體；和涉及使用該探針和抗體及其它Flt4結合化合物的方法，例如，用于鑒定動物和人體組織中的淋巴管和毛細血管后微靜脈(HEV)，和增進或防止表達Flt4的細胞在病理學條件下的生長。
背景負責分化細胞和組織的發(fā)育，維持和修復的細胞行為大部分受到通過生長因子和相似配體及其受體傳導的細胞間信號調節(jié)。受體位于效應細胞的細胞表面且它們結合被認為是生長因子以及其它激素樣配體的肽或者多肽。該相互作用的結果是在效應細胞中的迅速生物化學變化，以及細胞基因表達的迅速和長期再調整。與各種細胞表面相聯(lián)的一些受體可結合特定生長因子。
酪氨酸磷酸化是跨質膜信號傳導的一種關鍵方式。一些酪氨酸激酶基因編碼諸如表皮生長因子(EGF)，胰島素，胰島素樣生長因子-I(IGF-I)，血小板衍生生長因子(PDGF-A和-B)和成纖維細胞生長因子(FGFs)的多肽生長因子和激素的跨膜受體[Heldin等，Cell Regulation，1555-566(1990)；Ullrich等，Cell，61243-54(1990)]。一些造血生長因子的受體是酪氨酸激酶；它們包括c-fms，即集落刺激因子1受體[Sherr等，Cell，41665-676(1985)]和c-kit，即前造血生長因子受體[Huang等，Cell，63225-33(1990)]。
這些受體的區(qū)別在于其特異性和親和力。一般來說，受體酪氨酸激酶是糖蛋白，它由能夠結合特定生長因子的胞外域，通常是該蛋白質的α-螺旋部分的跨膜結構域，近膜結構域(在此該受體可受到例如，蛋白質磷酸化的調節(jié))，酪氨酸激酶結構域(它是該受體的酶組件)，和在許多受體中與酪氨酸激酶底物的識別和結合相關的羧基末端尾組成。
在一些受體酪氨酸激酶中，可選擇的剪接加工和可選擇的多聚腺苷化能夠從相同基因產(chǎn)生一些不同的多肽。它們可以含有或者不含上面列舉的各種結構域。因此，一些胞外域可作為細胞分泌的分離蛋白被表達且該受體的一些形式可缺少酪氨酸激酶結構域且僅含有通過跨膜結構域插入質膜的胞外域加上一個短羧基末端尾。
血管系統(tǒng)的生理學，胚胎血管發(fā)生和血管生成，血液凝固，傷口愈合和再生，以及一些疾病都與血管內(nèi)層的血管內(nèi)皮相關。血管樹的形成通過血管生成發(fā)生，且根據(jù)一些理論，淋巴系統(tǒng)的形成在動脈和靜脈形成后短期內(nèi)通過從靜脈萌發(fā)開始。參見Sabin，F(xiàn).R.，Am.J.Anat.，943(1909)；和van derPutte，S.C.J，Adv.Anat.Embryol.Cell Biol.，513(1975)。
胎兒階段后，除了與新脈管形成相關的血管生成期間外，內(nèi)皮細胞增殖非常緩慢。生長因子刺激的血管生成通過特異性內(nèi)皮細胞表面受體酪氨酸激酶發(fā)揮其效力。
在受體酪氨酸激酶的配體中，血小板衍生生長因子(PDGF)已經(jīng)表明在雞尿囊絨膜中具有血管生成性，盡管較弱。轉化生長因子α(TGFα)是由一些腫瘤細胞類型和由巨噬細胞分泌的一種血管生成因子。肝細胞生長因子(HGF)，即c-met原癌基因編碼的受體的配體，也具有較強的血管生成性，在培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞中誘導與TGFα相似的反應。
證據(jù)表明存在主要負責刺激內(nèi)皮細胞生長，分化，以及某些分化功能的內(nèi)皮細胞特異性生長因子和受體。研究最廣泛的生長因子是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，即PDGF家族的一個成員。血管內(nèi)皮生長因子是二硫鍵連接的23kDa亞基的二聚體糖蛋白，由于其對內(nèi)皮細胞的促有絲分裂活性及其誘導血管通透性的能力而被發(fā)現(xiàn)(因此其替代名稱是血管通透性因子)。VEGF的其它報導的效力包括轉移細胞內(nèi)Ca2+，誘導纖溶酶原激活物和纖溶酶原激活物抑制劑-1的合成，刺激內(nèi)皮細胞中的己糖運輸，和促進單核細胞的體外遷移。由不同mRNA剪接變異體編碼的4種VEGF同種型表現(xiàn)出同樣能夠刺激內(nèi)皮細胞的有絲分裂。VEGF的121和165氨基酸同種型以可溶性形式分泌，而189和206氨基酸殘基的同種型保持與細胞表面相聯(lián)且具有較強的肝素親和力。對于有關胎盤生長因子的可溶性非肝素結合形式和肝素結合形式也已有描述(PlGF；分別是131和152個氨基酸)，它在胎盤，滋養(yǎng)層腫瘤，和培養(yǎng)的人內(nèi)皮細胞中表達。
VEGF的表達方式表明其與正常血管系統(tǒng)的發(fā)育和維持及腫瘤血管生成相關。鼠發(fā)育期間，整個交配后7.5天的內(nèi)胚層表達VEGF且神經(jīng)外胚層室在毛細向內(nèi)生長階段產(chǎn)生VEGF。在鵪鶉發(fā)育的第二天，卵黃囊的血管化區(qū)域以及整個胚胎表現(xiàn)出表達VEGF。另外，在成年小鼠中靠近簾式內(nèi)皮膜的上皮細胞顯示出持續(xù)的VEGF表達，表明了在該特定內(nèi)皮表型和功能的維持中的作用。
已經(jīng)鑒定了VEGF的兩個高親和性受體，即VEGFR-1/Flt1(fms-樣酪氨酸激酶-1)和VEGFR-2/Kdr/Flk-1(含有激酶插入結構域的受體/胎兒肝臟激酶-1)。這些受體屬于PDGF-受體家族。然而，VEGF受體在其胞外域中具有7個免疫球蛋白樣環(huán)(相對于PDGF家族其它成員中的5個)和較長的激酶插入片斷。VEGF受體的表達主要發(fā)生在血管內(nèi)皮細胞中，盡管也有一些存在于單核細胞和黑素瘤細胞系中。已報導只有內(nèi)皮細胞與VEGF反應會增殖，且不同來源的內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出不同的反應。因此，通過VEGFR-1和VEGFR-2介導的信號似乎是細胞類型特異性的。
VEGFR-1和VEGFR-2以高親和性結合VEGF165(Kd分別為大約20pM和200pM)。Flk-1受體也顯示出與VEGF反應進行自身磷酸化，但是Flt1的磷酸化幾乎不可檢測。VEGFR-2介導的信號引起形態(tài)學的顯著改變，肌動蛋白的再組織和過度表達該受體的豬主動脈內(nèi)皮細胞的膜起皺。在這些細胞中，VEGFR-2也介導配體誘導的趨化性和促有絲分裂性；而VEGFR-1轉染的細胞缺乏對VEGF的促有絲分裂反應。相反，VEGF對表達VEGFR-1的大鼠竇狀隙內(nèi)皮細胞具有較強的生長刺激效應。磷蛋白與VEGFR-1和VEGFR-2的共沉淀不同，表明不同信號分子與受體特異性細胞內(nèi)序列相互作用。
在原位雜交試驗中，在卵黃囊和胚內(nèi)中胚層(估計為交配后(p.c.)7.5天的胚胎，內(nèi)皮從它產(chǎn)生)中，且后來在推定的成血管細胞，心內(nèi)膜和大血管及小血管內(nèi)皮(交配后12.5天)中發(fā)現(xiàn)小鼠VEGFR-2mRNA的表達。在血管芽和胚胎及出生后早期的大腦的分支血管增生的內(nèi)皮細胞中豐富的VEGFR-2mRNA和成年大腦中表達減少表明VEGFR-2是血管發(fā)生和血管生成的主要調節(jié)劑。VEGFR-1的表達同樣與小鼠胚胎中的早期血管形成和與愈合皮膚傷口中的新脈管形成相關。然而，在成年器官中檢測到高水平的VEGFR-1表達，表明VEGFR-1在不涉及細胞生長的成熟血管的靜止內(nèi)皮中起作用。從原腸胚形成開始的中胚層中觀察到VEGFR-2的鳥類同系物，而VEGFR-1同系物首先在共表達內(nèi)皮標記的細胞中發(fā)現(xiàn)。在體外的鵪鶉外胚層培養(yǎng)物中，這些細胞的血管發(fā)生性分化所需的FGF-2上調VEGFR-2的表達。發(fā)現(xiàn)兩種VEGF受體的表達在發(fā)育晚期變得更有限。在人類胎兒組織中，VEGFR-1和VEGFR-2表現(xiàn)出重疊的，但略有不同的表達方式。這些資料表明VEGF及其受體以旁分泌方式起作用，以調節(jié)內(nèi)皮細胞的分化和組織的新脈管形成。
最近已表明VEGF是內(nèi)皮細胞生長和血管生成的低氧癥誘導型刺激物，且使用特異性單克隆抗體抑制VEGF活性顯示出減小實驗腫瘤的生長及其血管的密度。[Ferrara等，Endocrine Reviews，184-25(1997)；Shibuya等，Adv.Cancer Res.，67281-316(1995)；Kim等，Nature，362841-844(1993)]。
大小超過幾立方毫米的實體瘤的生長依賴于血管供給，使得血管生成成為抗癌治療的具有吸引力的靶。用內(nèi)源性血管生成抑制劑或包括制管張素，纖溶酶原的片斷，和內(nèi)抑制素，膠原蛋白18的片斷的“抑制素”報道了令人鼓舞的結果。[O′Reilly等，Cell，79315-328(1994)；O′Reilly等，Cell，88277-85(1997)。]。正常情況下兩種因子均由原發(fā)性腫瘤產(chǎn)生且保持轉移休眠。全身性施用任一抑制素也顯示出誘導并維持動物模型中原發(fā)性腫瘤的休眠。受體和通過抑制素的信號傳導，以及激活它們的蛋白酶有待鑒定。對于在癌癥和其它病理學疾病狀態(tài)的治療中控制血管生成的其它治療性分子的需求仍然存在。
已表明原發(fā)性乳腺癌表達一些血管生成性多肽，其中VEGF最豐富。[參見，例如，Relf等，Cancer Res.，57963-969(1997)]。在侵入性和非侵入性導管(原位)乳腺癌中，腫瘤細胞含有高水平的VEGF mRNA。[Brown等，Hum.Pathol.，2686-91(1995)]。鄰近原位癌的內(nèi)皮細胞表達VEGFR-1和VEGFR-2 mRNA。VEGF及其受體負責惡性乳房腫瘤的血管生成性進展，因為在一些獨立的研究中，發(fā)現(xiàn)腫瘤血管密度與該疾病的預后之間相關。[Weidner等，J.Natl.Cancer Inst.，841875-1887(1992)]。存在對于乳腺癌和乳腺癌相關的血管生成的其它標記的需求，以便改進診斷和篩選，和用作治療性干涉的靶子。
淋巴系統(tǒng)的主要功能是提供組織的液體回流和轉運許多血管外物質回血液。另外，在化膿過程期間，淋巴細胞離開血液，通過淋巴器官和其它組織遷移，并進入淋巴管中，通過胸導管返回血液。特化的小靜脈，即毛細血管后微靜脈(HEVs)，再次結合淋巴細胞并引起其外滲入組織。因此，淋巴管，且特別是淋巴結在免疫學和在不同腫瘤的轉移發(fā)展中起重要作用。
自20世紀開始以來，關于淋巴系統(tǒng)的胚胎起源提出了三個不同的理論。然而，淋巴管難以鑒定，因為沒有可用于它們的已知的特異性標記。
淋巴管最普遍借助于淋巴造影術進行研究。在淋巴造影術中，將X-射線造影劑直接注射進淋巴管中。該造影劑沿淋巴系統(tǒng)的輸出導液管分布。造影劑在淋巴結集中，在此停留達半年，在此時間期間的X-射線分析允許追蹤淋巴結的大小和結構。該診斷法在患有淋巴結轉移瘤和淋巴惡性腫瘤，例如淋巴瘤的癌癥患者中尤其重要。然而，本領域仍然需要改進的材料和方法用于淋巴組織造影。
本發(fā)明小結本發(fā)明闡述了一種位于5號染色體上的新的受體酪氨酸激酶基因，鑒定為來自人白血病細胞的一種未知的酪氨酸激酶-同源性PCR-cDNA片斷[Aprelikova等，Cancer Res.，52.746-748(1992)]。該基因及其編碼的蛋白質稱為Flt4。該縮寫來自短語fms-樣酪氨酸激酶4。
Flt4是在結構上與VEGFR-1和VEGFR-2基因產(chǎn)物密切相關的受體酪氨酸激酶。由于該相似性和隨后發(fā)現(xiàn)的在這三個受體的配體之間的相似性，F(xiàn)lt4受體也稱為VEGFR-3。名稱Flt4和VEGFR-3在本文中可交換使用。盡管這三個受體之間具有相似性，但是Flt4的成熟形式與VEGFRs的區(qū)別在于它在胞外域被蛋白酶剪切成兩個二硫鍵連接的125/120kD和75kD的多肽。Flt4基因編碼4.5和5.8kb的mRNAs，表現(xiàn)出可選擇的3’外顯子且分別編碼190kD和195kD的多肽。
進一步的區(qū)別證據(jù)是VEGF不表現(xiàn)出與Flt4的特異性結合且不誘導其自身磷酸化。
在組織研究中Flt4，F(xiàn)lt1，和KDR/Flk-1受體mRNA信號的比較表現(xiàn)出重疊的，但不同的表達方式。Kaipainen等，J.Exp.Med.，1782077(1993)。Flt4基因表達似乎比VEGFR-1或VEGFR-2的表達更有限。Flt4的表達在頭間充質成血管細胞，主靜脈和在交配后8.5天的小鼠胚胎尿囊的胚外中通過原位雜交首次變得可檢測。在交配后12.5天的胚胎中，在發(fā)育中的靜脈和推定的淋巴管內(nèi)皮上觀察到Flt4信號，而動脈內(nèi)皮呈現(xiàn)陰性。在發(fā)育晚期期間，F(xiàn)lt4 mRNA變得局限在發(fā)育的淋巴管中。在成人組織中只在淋巴管內(nèi)皮和一些毛細血管后微靜脈中表達Flt4 mRNA且在淋巴結轉移癌的淋巴竇中和在淋巴管瘤中出現(xiàn)表達增加。該結果支持淋巴管的靜脈起源的理論。
從人紅白血病細胞系中克隆的Flt4受體酪氨酸激酶cDNA的蛋白質產(chǎn)物是N-糖基化的且在其胞外域中含有7個免疫球蛋白樣環(huán)。Flt4的胞質酪氨酸激酶結構域與Flt1和KDR的相應結構域在氨基酸水平上有大約80％的相同性且與血小板衍生生長因子，集落刺激因子-1，干細胞因子的受體，和Flt3受體有大約60％的相同性。參見Pajusola等，Cancer Res.，525738(1992)。
本發(fā)明提供了用于Flt4蛋白質及其肽片斷生產(chǎn)和用于從其它來源回收相關基因的編碼Flt4受體酪氨酸激酶的分離的多核苷酸(例如，確定結構的DNA或RNA片斷)。
本發(fā)明提供了能被插入微生物或真核細胞中且能夠表達該編碼蛋白的含有編碼Flt4受體酪氨酸激酶或相關蛋白的異源性片斷的重組DNA載體。
本發(fā)明提供了能夠產(chǎn)生有用量的Flt4受體酪氨酸激酶和來自許多物種的功能相似的蛋白質的真核細胞。
本發(fā)明提供了可在實室合成或者通過微生物生產(chǎn)的肽，該肽模擬天然Flt4受體酪氨酸激酶蛋白的活性。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及抑制Flt4受體酪氨酸激酶蛋白的活性的肽。
特別優(yōu)選的肽選自由如下肽組成的組中(a)Flt4-短鏈形式，具有SEQ.IDNOs.1和2中所示的核苷酸和推定的氨基酸序列；和(b)在其羧基末端具有不同的核苷酸和相應的氨基酸殘基的第二種形式，即Flt4-長鏈形式，具有SEQ.ID NOs.3和4所示的核苷酸和推定的氨基酸序列。Flt4長鏈形式具有1363個氨基酸殘基的長度。
DNA和RNA分子，重組DNA載體，和包含編碼上述任一蛋白質或肽的核苷酸序列的修飾微生物或真核細胞也是本發(fā)明的一部分。具體地說，含有如下兩個DNA序列的全部或部分的序列，互補DNA或RNA序列，或相應的RNA序列是特別優(yōu)選的(a)諸如SEQ ID NO1的DNA序列，編碼Flt4-短鏈形式[SEQ ID NO2]，和(b)諸如SEQ ID NO3的DNA序列，編碼SEQID NO1的核苷酸3913-4416改變的Flt4，即編碼Flt4-長鏈形式[SEQ ID NO4]。
還提供了含有較長序列之片段的DNA和RNA分子用于實施涉及通過遺傳工程技術生產(chǎn)該肽和生產(chǎn)寡核苷酸探針的本發(fā)明的優(yōu)選方面。
由于本文鑒定了編碼Flt4蛋白的DNA序列，因此可通過例如，聚合酶鏈式反應或者使用商業(yè)上可得到的設備通過化學合成生產(chǎn)編碼Flt4蛋白的DNA，之后使用重組DNA技術的已知技術將該基因插入任一許多可得到的DNA載體中。另外，自動設備也可得到，使得直接合成本文公開的任一肽容易實現(xiàn)。
本發(fā)明還涉及Flt4肽和其它構建體，且涉及Flt4作為淋巴管內(nèi)皮細胞的特異性標記的用途。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明涉及識別Flt4的核酸探針和抗體，特別是單克隆抗體，和含有該抗體的組合物。
另外在一個具體實施方案中，本發(fā)明涉及監(jiān)測組織樣品和生物體中淋巴管的方法。提供描述淋巴組織，且特別是淋巴管狀態(tài)(發(fā)炎，感染，損傷，生長，等)的臨床檢測方法，和提供檢測淋巴管，且從而檢測生物體中的淋巴血管化的方法也是本發(fā)明的一個目的。
本發(fā)明的另一目的是提供特異性識別Flt4受體蛋白或其各種表位的單克隆抗體。使用這些單克隆抗體用于檢測和測量組織，且特別是淋巴組織中Flt4受體的量的診斷目的也是本發(fā)明的一個目的。在抗-Flt4抗體的上下文中，術語“特異性識別Flt4”，“特異性結合Flt4”，“Flt4特異性的”等是指抗體相對于包括VEGFR-2/Kdr/Flk-1和VEGFR-1/Flt1的其它內(nèi)皮細胞表面受體優(yōu)先與Flt4結合(免疫反應)。因此，對Flt4特異性的抗-Flt4抗體或其它Flt4結合化合物可用于按照本文所述的本發(fā)明的方法鑒定和/或標記組織或生物學樣品中的Flt4(例如，醫(yī)學造影，檢測，篩選，或定向療法)，因為它們根本不能結合其它抗原的表位，或者僅以明顯低于其Flt4結合親和力的親和力結合其它抗原以至于在這些實際背景中不明顯。
本發(fā)明的另一方面涉及測定細胞樣品中存在Flt4-受體的方法，包括步驟(a)將細胞樣品與本發(fā)明的抗體，特別是單克隆抗體接觸；和(b)檢測所述的單克隆抗體與Flt4受體的結合。從下文的詳細描述顯而易見的是，有關組織樣品中Flt4受體的存在，數(shù)量，密度，和位置方面的信息與疾病狀態(tài)的類型和嚴重性具有診斷和預后相關性；且如果需要將基于抗-Flt4的治療方案特異性地只適應于患有特征在于在腫瘤或在圍繞，服務或供給腫瘤的血管或淋巴管和組織中表達Flt4的疾病的那些患者時具有治療相關性。因此篩選Flt4受體的存在可構成治療方案的第一步，和/或療程期間的監(jiān)測步驟。
本發(fā)明還涉及在淋巴血管化和炎癥，感染和免疫學情況中調節(jié)(例如，拮抗或增強)Flt4功能的方法。例如，在一個實施方案中，該方法包括通過提供足夠量的Flt4-結合化合物以抑制參與該反應，特別是其中Flt4的功能與諸如轉移癌，淋巴瘤，炎癥(慢性或急性的)，感染和免疫學疾病的疾病相關的Flt4內(nèi)皮細胞位點來抑制Flt-4介導的淋巴血管化。由于許多腫瘤通過淋巴管轉移，因此涉及抑制Flt4配體和Flt4之間相互作用的療法預期具有廣闊的應用，可作為抗癌治療方案的一部分用于抑制腫瘤轉移。
本發(fā)明還涉及特異性Flt4-刺激配體和單克隆抗體及其刺激淋巴管內(nèi)皮的用途，和從對該配體的研究中得到的在需要時，例如在與Flt4功能相關的各種疾病狀態(tài)中抑制Flt4功能的片段和肽以及抗體。
本發(fā)明提供了Flt4受體酪氨酸激酶的配體的細胞系來源。使用這些細胞的條件培養(yǎng)基，可通過使用本領域的標準方法純化和克隆Flt4配體。使用該條件培養(yǎng)基或純化的配體，可獲得用于Flt4配體和二聚體化抑制劑以及Flt4信號轉導抑制劑的試驗系統(tǒng)，它允許鑒定和制備該抑制劑。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，PC-3細胞系的條件培養(yǎng)基包含能夠刺激Flt4受體并調節(jié)某些內(nèi)皮細胞的生長和分化以及分化功能的蛋白質或其片段。Flt4配體或其肽或衍生物用于調節(jié)內(nèi)皮細胞生長，分化及其分化功能并用于產(chǎn)生該配體的興奮劑和拮抗劑。具體地說，F(xiàn)lt4配體用于調節(jié)淋巴管內(nèi)皮。然而，當從重組來源純化或生產(chǎn)時，F(xiàn)lt4配體也可刺激相關的KDR/Flk-1受體。
Flt4-刺激配體的鑒定使得測定該配體的抑制劑或Flt4功能的抑制劑直接成為可能?？蓪⒃撘种苿┖唵蔚丶尤牒蠪lt4配體的條件培養(yǎng)基中，且如果它們抑制自身磷酸化，則它們起Flt4信號抑制劑的作用。例如，可測定重組或合成肽(包括但不限于Flt4胞外域的片段)對Flt4-配體相互作用或Flt4二聚體化的抑制。這種推定的Flt4抑制劑和另外的抗Flt4配體的抗體，抑制Flt4受體-配體相互作用的肽或其它化合物，以及與編碼Flt4配體的mRNA序列互補的反義寡核苷酸可用于調節(jié)內(nèi)皮細胞和用于治療與內(nèi)皮細胞功能相關的疾病。
稱為VEGF-C的Flt4配體的詳細鑒定在申請日為1998年2月2日且作為國際公開號WO 98/33917公開的PCT專利申請?zhí)朠CT/US98/01973中；在申請日為1996年8月1日且作為國際公開號WO 97/05250公開的PCT專利申請PCT/FI96/00427中；和在其中要求優(yōu)先權所依賴的美國專利申請優(yōu)先權文件中提供，所有這些文獻在本文中引用以供參考。前體-VEGF-C原的推定氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO21描述。
稱為VEGF-D的第二個Flt4配體的詳細描述在Achen等，Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.，95(2)548-553(1998)，和在Genbank登錄號AJ000185中提供，本文引用該兩篇文獻以供參考。前體-VEGF-D原的推定氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO22描述。
本發(fā)明還涉及治療患有以細胞中表達Flt4酪氨酸激酶(Flt4)為特征的疾病的哺乳動物生物體的方法，包括給哺乳動物生物體施用一種組合物的步驟，該組合物包含有效抑制Flt4配體蛋白與生物體細胞中表達的Flt4的結合的化合物，從而抑制Flt4功能。該疾病可以是上文已經(jīng)提及的疾病，例如以不希望的淋巴血管化為特征的疾病。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在與至少一些乳腺癌，和可能的其它癌癥相關的血管系統(tǒng)中也出現(xiàn)Flt4表達(即，表達水平大大超出相應正常(健康)組織的血管系統(tǒng)中幾乎不可檢測或者不可檢測的表達水平)。因此，在優(yōu)選的實施方案中，該細胞包含內(nèi)皮細胞(淋巴管或血管的內(nèi)皮細胞)。在另一實施方案中，該細胞包含腫瘤細胞，例如表達Flt4的某些淋巴瘤。特別包含人類的治療。
“有效抑制Flt4配體蛋白質與生物細胞中表達的Flt4的結合的化合物”是指抑制可從PC-3條件培養(yǎng)基分離的本文描述為血管內(nèi)皮生長因子C的Flt4配體的結合的任何化合物。預期該化合物也有效抑制血管內(nèi)皮生長因子D與Flt4的結合。舉例性的化合物包括下列多肽(a)含有抗-Flt4抗體的抗原結合片段的多肽；(b)含有可溶性Flt4片段的多肽(例如，胞外域片段)，其中該片段和多肽能夠與Flt4配體結合；(c)含有脊椎動物血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)多肽的片段或類似物的多肽，其中該多肽和片段或類似物結合，但不能激活在天然宿主細胞(即在其表面表達天然Flt4蛋白質的生物細胞)上表達的Flt4；和(d)含有脊椎動物血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)多肽的片段或類似物的多肽，其中該多肽和片段或類似物結合，但不能激活在天然宿主細胞上表達的Flt4。使用例如，VEGF-C和重組表達的Flt4以標準體外篩選試驗可鑒定的小分子抑制劑也是可預期的。含有抗-Flt4抗體的抗原結合片段的多肽是非常優(yōu)選的。該多肽包括，例如特異性結合Flt4的多克隆和單克隆抗體；該抗體的片段；嵌合和人源化抗體；特異性結合Flt4且也特異性結合另一抗原的雙特異性抗體等等。結合循環(huán)Flt4配體且從而抑制該配體與Flt4的結合的化合物的用途也是可預期的。該化合物包括抗-VEGF-C或抗-VEGF-D抗體或者包含其抗原結合片段的多肽。在相關變化形式中，本發(fā)明包含中斷下游細胞內(nèi)Flt4信號傳導，從而抑制Flt4功能的治療方法。
在一個優(yōu)選的變化中，該化合物還含有一個在本文別處描述的檢測標記，或者細胞毒性劑。舉例性的細胞毒性劑包括植物毒素(例如，蓖麻毒蛋白，皂草素)，細菌或真菌毒素，放射性同位素(例如，211-砹，212-鉍，90-釔，131-碘，99m-锝，和本文所述的其它元素)，抗-代謝藥物(例如，氨甲蝶呤，5-氟脫氧尿苷)，烷基化試劑(例如，苯丁酸氮芥)，抗有絲分裂劑(例如，長春花生物堿)，和DNA插入劑(例如，阿霉素)。其它舉例性的試劑包括化合物或應用于細胞時誘導DNA損傷的處理。該試劑和因素包括誘導DNA損傷的輻射和波，例如-照射，X-射線，紫外照射，微波，電子發(fā)射等。也描述為“化療劑”的各種化合物起誘導DNA損傷的作用，其全部打算用于本文公開的結合治療方法中。預期可使用的化療劑包括，例如，阿霉素，5-氟尿嘧啶(5FU)，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(VP-16)，喜樹堿，放線菌素-D，絲裂霉素C，順式鉑氨(CDDP)和甚至是過氧化氫。本發(fā)明還包含一種或多種DNA損傷劑的組合使用，不論是以輻射為基礎還是實際化合物，例如使用X-射線與順式鉑氨或者使用順式鉑氨與表鬼臼毒素吡喃葡糖苷。還有其它試劑為阿霉素(也稱為阿霉素doxorubicin)，VP-16(也稱為表鬼臼毒素吡喃葡糖苷)等，柔紅霉素(插入DNA中，抑制DNA-介導的RNA聚合酶且抑制DNA合成)；絲裂霉素(也稱為突變霉素和/或絲裂霉素-C)；放線菌素D；長春新堿和環(huán)磷酰胺；博萊霉素；VP16(表鬼臼毒素吡喃葡糖苷)；腫瘤壞死因子[TNF]；紫杉醇；苯丙氨酸氮芥；環(huán)磷酰胺，苯丁酸氮芥。本發(fā)明的肽的給藥可在其它試劑處理之前或者之后間隔幾分鐘到幾周進行。在其它試劑和表達構建體分別給藥的實施方案中，一般應確保每次給藥時間之間的重要時間期限不期滿，以便該試劑和以肽為基礎的治療劑仍然能夠發(fā)揮優(yōu)勢結合效應。在這種情況下，預期可在互相之間大約12-24小時之內(nèi)施用兩種用藥程式，更優(yōu)選在互相之間大約6-12小時之內(nèi)，最優(yōu)選僅大約12小時的延遲時間。在一些情況下，為了治療有效需要延長時間期限，盡管在各次給藥之間過去了幾天(2，3，4，5，6或7)到幾周(1，2，3，4，5，6，7或8)。特別包含用一種或兩種試劑的重復治療。
同樣，為了改良用藥，該組合物優(yōu)選還包含藥用上可接受的稀釋劑，佐劑，或載體介質。
正如本文所作的詳細說明，F(xiàn)lt4的表達盡管大量局限于健康成人的淋巴管內(nèi)皮，但是在圍繞至少某些腫瘤的血管系統(tǒng)中已鑒定到Flt4的表達。因此，本發(fā)明還包括治療患有以血管內(nèi)皮細胞中表達Flt4酪氨酸激酶(Flt4)為特征的腫瘤疾病的哺乳動物生物體的方法，包括步驟給需要該治療的哺乳動物生物體施用一種組合物，該組合物包含一種有效抑制Flt4配體蛋白質與生物體血管內(nèi)皮細胞中表達的Flt4的結合的化合物，從而抑制Flt4-介導的血管內(nèi)皮細胞的增生。特別包含治療選自癌(例如，乳腺癌)，鱗狀細胞癌，淋巴瘤，黑素瘤，和肉瘤的腫瘤疾病。然而，本文詳細描述的篩選技術可鑒定以血管內(nèi)皮細胞中Flt4表達為特征的其它腫瘤將是顯而易見的，該腫瘤是對本文所述的抗-Flt4治療方案敏感的候選腫瘤。特別包含治療以血管內(nèi)皮細胞中Flt4的表達為特征的乳腺癌。以血管內(nèi)皮細胞中Flt4酪氨酸激酶的表達為特征的腫瘤疾病是指與健康組織的血管中正常觀察到的不可檢測或者幾乎不可檢測的水平相比其中的Flt4在血管系統(tǒng)中以高得多的水平可鑒定的疾病，正如本文的例證。
化合物的治療有效量可使用本領域公認的劑量增大和劑量反應試驗根據(jù)經(jīng)驗確定。用于腫瘤治療的治療有效量是指有效減小腫瘤生長的量，或者有效停止腫瘤生長的量，或者有效縮小或完全消除腫瘤的量，且對于接受癌癥治療的患者無不可接受的副作用水平。如果該化合物包含抗體或其它多肽，特別包含的劑量級別為每千克體重0.1至100mg抗體，且更優(yōu)選1至10mg/kg。對于一般表現(xiàn)出較長的循環(huán)半壽期的人源化抗體，特別包含以從每天到每隔1月范圍的間隔給藥，更優(yōu)選以每周的間隔，或者每隔1周，或者每隔3周的間隔給藥。監(jiān)測治療的進展，病人的副作用，和循環(huán)抗體水平將為最佳給藥方案提供進一步的指導。來自以其它抗體為基礎的癌癥治療(例如，抗-HER2，抗-EGF受體)的公開的和正在進行的臨床試驗的數(shù)據(jù)也提供了有用的給藥方案指導。
對于本文所述的治療方法，優(yōu)選的化合物包括含有抗-Flt4抗體的抗原結合片斷的多肽，含有可溶性Flt4胞外域片斷的多肽。人的和人源化的抗-Flt4抗體是非常優(yōu)選的。非常優(yōu)選的Flt4胞外域片斷含有Flt4胞外域的配體結合部分。例如，含有Flt4胞外域的前3個免疫球蛋白樣結構域的可溶性片斷是非常優(yōu)選的。僅結合Flt4配體，或者與其它肽(例如VEGFR-1或VEGFR-2的免疫球蛋白樣結構域)融合時的更小片斷也是可預期的。同樣，可預料到提高可溶性和/或穩(wěn)定性，血清半壽期，或其它特征以提高治療效力的改良。例如，可預料到含有Flt4胞外域和免疫球蛋白Fc肽(特別是IgG1 Fc同種型)之間的融合以提高可溶性和血清半壽期的多肽。[Compare Achen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95548-553(1998)]。
本發(fā)明的治療方法可預期的優(yōu)勢在于這樣的事實，即在健康組織的血管系統(tǒng)中一般不以任何明顯的水平表達Flt4。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，治療性化合物包含雙特異性抗體，或其片斷，其中該抗體或片斷特異性地結合Flt4且特異性地結合血管內(nèi)皮標記抗原?！把軆?nèi)皮標記抗原”是指在增生的血管內(nèi)皮細胞上表達，且優(yōu)選不在淋巴管內(nèi)皮細胞上表達的任何細胞表面抗原。舉例性的血管內(nèi)皮標記包括PAL-E[deWaal等，Am.J.Pathol.，1501951-1957(1994)]，VEGFR-1和VEGFR-2[Ferrara等，Endocrine Reviews，184-25(1997)]，Tie[Partanen等，Mol.Cell.Biol.，121698-1707(1992)]，endoglin[美國專利號5,776,427，在本文中引用以其整體作為參考]，和von Willebrandt因子。雙特異性抗體預期優(yōu)選定位于表達Flt4和血管內(nèi)皮標記的腫瘤相關性血管系統(tǒng)上。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，該化合物還包含用于殺死腫瘤細胞和/或殺死供給腫瘤細胞的血管系統(tǒng)的與雙特異性抗體偶連的抗腫瘤劑或細胞毒性劑。舉例性的試劑包括上文所述的那些試劑，也包括刺激宿主中針對該腫瘤的免疫反應的治療性蛋白，例如抑制素，細胞因子，趨化因子等。
在替代的實施方案中，該化合物包含識別由Flt4/Flt4配體復合物(例如，由與VEGF-C或VEGF-D結合的Flt4組成的復合物)組成的一個(或多個)表位的抗體(或雙特異性抗體)。
與具有抑制血管生成因子的潛力的廣譜試劑偶連或者共同給藥的治療性化合物也是可預期的。該試劑包括，例如，可結合肝素抑制血管生成因子的肝素結合藥物(例如戊聚糖和蘇拉明類似物)；抑制內(nèi)皮細胞生長和遷移的化學試劑，例如煙曲霉素類似物。目前研究的其它試劑包括Marimastat(BritishBiotech，Annapolis MD；指示非小細胞肺癌，小細胞肺癌和乳腺癌)；AG3340(Agouron，LaJolla，CA；用于多形成膠質細胞瘤)；COL-3(Collagenex，Newtown PA；用于腦腫瘤)；Neovastat(Aetema，Quebec，Canada；用于腎癌和非小細胞肺癌)；BMS-275291(Bristol-Myers Squibb，Wallingford CT；用于轉移性非小細胞肺癌)；Thalidomide(Celgen；用于黑素瘤，頭和頸癌，卵巢癌，轉移性前列腺癌，和卡波西肉瘤；復發(fā)性或轉移性結腸直腸癌(含有佐劑)；婦科肉瘤，肝癌，多發(fā)性骨髓瘤；CLL，復發(fā)性或進行性腦癌，多發(fā)性骨髓瘤，非小細胞肺癌，非轉移性前列腺癌，頑固多發(fā)性骨髓瘤，和腎癌)；Squalamine(Magainin Pharmaceuticals Plymouth Meeting，PA；非小細胞癌和卵巢癌)；Endostatin(EntreMEd，Rockville，MD；用于實體瘤)；SU5416(Sugen，San Francisco，CA；復發(fā)性頭和頸癌，晚期實體瘤，IIIB或IV期乳腺癌；復發(fā)性或進行性腦癌(小兒)；卵巢癌，AML；神經(jīng)膠質瘤，晚期惡性腫瘤，晚期結腸直腸癌，von-Hippel Lindau疾病，晚期軟組織癌；前列腺癌，結腸直腸癌，轉移性黑素瘤，多發(fā)性骨髓瘤，惡性間皮瘤；轉移性腎癌，晚期或復發(fā)性頭和頸癌，轉移性結腸直腸癌)；SU6668(Sugen San Francisco，CA；晚期腫瘤)；干擾素-α；抗-VEGF抗體(國家癌癥研究所，Bethesda MD；Genentech SanFranscisco，CA；頑固性實體瘤；轉移性腎細胞癌，未治療的晚期結腸直腸癌)；EMD121974(Merck KCgaA，Darmstadt，Germany；HIV相關性卡波西肉瘤，進行性或復發(fā)性退行性神經(jīng)膠質瘤)；白介素12(Genetics Institute，Cambridge，MA；卡波西肉瘤)和IM862(Cytran，Kirkland，WA；卵巢癌，未治療的結腸和直腸起源的轉移癌和卡波西肉瘤)。
也可預期抗-Flt4化合物與前藥的偶連可通過抗-Flt4化合物靶向腫瘤血管并隨后在腫瘤生長的位置被定向激活(例如，通過照射)。使用該前藥的策略具有最小化該藥物對表達Flt4的健康淋巴管的副作用的預期優(yōu)勢。
同樣，本發(fā)明包括治療患有以在血管內(nèi)皮細胞中表達Flt4酪氨酸激酶(Flt4)為特征的腫瘤疾病的哺乳動物生物體的方法，包括步驟鑒定患有以在血管內(nèi)皮細胞中表達Flt4為特征的腫瘤疾病狀態(tài)的哺乳動物生物體，和給需要該治療的哺乳動物生物體施用一種組合物，該組合物包含一種有效抑制Flt4配體蛋白質與生物體血管內(nèi)皮細胞中表達的Flt4結合的化合物，從而抑制Flt4-介導的血管內(nèi)皮細胞的增生。
本發(fā)明還提供了篩選存在Flt4受體酪氨酸激酶蛋白(Flt4)的生物學樣品的方法，包括步驟(a)將懷疑含有Flt4的生物學樣品與含有Flt4結合化合物的組合物在該化合物可與該生物學樣品中的Flt4結合的條件下接觸；(b)在可去掉該樣品中未與Flt4結合的Flt4結合化合物的條件下洗滌該生物學樣品；和(c)通過檢測洗滌步驟后的樣品中與Flt4受體酪氨酸激酶結合的Flt4結合化合物篩選存在Flt4的樣品。優(yōu)選的是，該化合物含有選自如下組成的組中的多肽(a)含有抗-Flt4抗體的抗原結合片斷的多肽；和(b)含有Flt4配體或Flt4結合片斷或其類似物的多肽。特異性結合Flt4，且還含有檢測標記的抗體是非常優(yōu)選的。
本發(fā)明還涉及造影懷疑含有表達Flt4受體酪氨酸激酶蛋白質(Flt4)之細胞的脊椎動物組織的方法，包含步驟(a)用含有Flt4結合化合物的組合物接觸脊椎動物組織；和(b)通過檢測與該組織結合的Flt4結合化合物造影組織。優(yōu)選的是，該組織是人組織，且該方法還包含在接觸步驟后和造影步驟前，在可從組織中去掉未結合該組織中Flt4的Flt4化合物的條件下洗滌該組織的步驟。
在有關變化中，本發(fā)明提供了造影脊椎動物生物體組織中的腫瘤的方法，包括步驟(a)將懷疑含有腫瘤的脊椎動物組織與含有Flt4結合化合物的組合物接觸；(b)檢測與所述組織中的細胞結合的Flt4結合化合物；和(c)通過鑒定Flt4結合化合物結合的血管內(nèi)皮細胞造影實體瘤，其中表達Flt4的血管與組織中腫瘤的存在和位置相關。在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法還包含用特異性結合在淋巴管內(nèi)皮中基本上不存在的血管內(nèi)皮標記(例如，PAL-E，VEGFR-1，VEGFR-2)的第二化合物(例如抗體)接觸該組織；和檢測與該組織中的細胞結合的第二化合物的步驟；其中該造影步驟包括鑒定用Flt4結合化合物和第二化合物標記的血管，且其中用Flt4結合化合物和第二化合物標記的血管與組織中腫瘤的存在和位置相關。可預料到使用第二化合物可幫助醫(yī)師更迅速地區(qū)分表達Flt4的血管與在其表面表達Flt4的正常淋巴管。
本發(fā)明還涉及篩選腫瘤疾病狀態(tài)的方法，包括步驟(a)用含有特異性結合Flt4受體酪氨酸激酶的抗體或抗體片斷的組合物接觸懷疑具有腫瘤疾病狀態(tài)的哺乳動物生物體的組織；(b)檢測與哺乳動物生物體中的細胞結合的抗體或抗體片斷；和(c)從與哺乳動物生物體的細胞結合的抗體的數(shù)量或分布篩選腫瘤疾病。如本文所述，在至少一些腫瘤的血管系統(tǒng)中強烈染色Flt4(它在血管系統(tǒng)中通常是不可檢測的或者幾乎不可檢測的)。因此，在一個實施方案中，在篩選步驟中，與血管內(nèi)皮細胞結合的抗體或抗體片斷的檢測與腫瘤疾病的存在相關。在該方法中，應明白“檢測”是指按本文所述以比相應正常(健康)組織中存在的幾乎不可檢測或者不可檢測的水平明顯更高的水平進行的檢測。通過與用健康生物體的組織進行的對照進行比較可證實該差別表達。特別包含篩選哺乳動物組織的腫瘤。如上所述，通過給所述的哺乳動物施用特異性結合血管內(nèi)皮標記的第二化合物可進一步幫助該方法的實施，其中該檢測步驟包含檢測與新血管內(nèi)皮細胞結合的所述第一和第二化合物。
從前面所述也可預料到用于本發(fā)明方法中的所述各種化合物也打算作為本發(fā)明的方面。該化合物包括例如，抗-Flt4抗體和上文所述的雙特異性抗體。同樣，本文所述的任何化合物(單獨或者結合)在制備用于本文所述的治療或診斷或造影目的的藥物中的用途也打算作為本發(fā)明的一個方面。該藥物還可包含藥用上可接受的稀釋劑，佐劑，載體等。
同樣，本發(fā)明包括以有利于其用于實施本發(fā)明的方法的方式包裝的含有本發(fā)明的化合物或組合物的試劑盒。在最簡單的實施方案中，該試劑盒包括在諸如密封的瓶或管的容器中包裝的，帶有粘貼于容器上或包含在包裝中的描述該化合物或組合物在實施本發(fā)明方法中的使用的標簽的本發(fā)明的化合物或組合物。優(yōu)選的是，該化合物或組合物以單位劑量形式包裝。在另一實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含與在血管內(nèi)皮細胞表面表達但在淋巴管內(nèi)皮中基本上不存在的標記(抗原)結合的第二化合物一起包裝的Flt4結合化合物。
另外，在肽或多肽用于造影或治療，和/或使用抗體將在細胞表面的Flt4蛋白表達用作檢測，篩選，造影等的靶的情況中描述了本發(fā)明的許多方面。諸如含有配體結合性可溶Flt4片斷的多肽的蛋白治療劑的治療性遞送也可用基因治療的材料和方法完成。例如，將含有編碼目的治療肽的多核苷酸的裸露DNA構建體或基因治療表達載體構建體傳遞給需要該治療的哺乳動物受試者。優(yōu)選的是，該構建體含有與編碼該治療肽的序列可操作地相連的啟動子或其它表達調控序列以啟動該治療肽在體內(nèi)的表達。在一種變化中，該核酸包裹在脂質體中。在另一變化中，該核酸是諸如逆轉錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，痘苗病毒，皰疹病毒的病毒載體，或者開發(fā)用于哺乳動物基因治療方案的其它載體。舉例性的治療方法包括給患者施用含有基因治療構建體的藥用組合物的步驟，或者離體轉化或轉染細胞并將轉化細胞導入患者的步驟。同樣，檢測細胞或組織的Flt4表達可使用在Northern雜交或在原位雜交試驗中與Flt4 mRNA序列特異性雜交的多核苷酸探針；或者通過進行定量PCR或測量樣品中的Flt4 mRNA的其它技術進行。
本發(fā)明的其它特征和變化對本領域的技術人員而言從包括詳細描述的本申請的整體內(nèi)容將是顯而易見的，且所有這些特征打算作為本發(fā)明的方面。同樣，本文描述的本發(fā)明的特征可再組合進也打算作為本發(fā)明的方面的其它實施方案中，而不管該特征的組合是否作為本發(fā)明的方面或實施方案在上文被具體提及。另外，只有在本文中作為本發(fā)明的關鍵被描述的該限定特征可照此被考慮；不含在本文中未作為關鍵被描述的限定特征的本發(fā)明的變化打算作為本發(fā)明的方面。
除了前面所述，作為另一方面，本發(fā)明包括以任何方式比上文具體提及的變化范圍更窄的本發(fā)明的所有實施方案。盡管申請人發(fā)明了所附權利要求書的全部范圍，但是所附權利要求書并不打算將他人的現(xiàn)有技術成果包含在其范圍內(nèi)。因此，在專利局或其它實體或個人提醒申請人在某權利要求的范圍內(nèi)包含法定現(xiàn)有技術的情況時，申請人保留按適用的專利法行使修改權利的權利以重新限定該權利要求的主題實體以便明確排除該權利要求范圍中的該法定現(xiàn)有技術或法定現(xiàn)有技術的顯而易見的變化。以該所附權利要求書限定的本發(fā)明的變化也打算作為本發(fā)明的方面。
附圖的簡要描述

圖1A是Flt4 cDNA克隆結構的圖解描述；圖1B是Northern雜交凝膠的照片復印件；圖2A-F提供了Flt4的結構特征的圖解描述和與Flt1酪氨酸激酶序列的比較；圖3A是克隆J.1.1和I.1.1的cDNA插入片斷3’端的圖解描述；圖3B是用反義RNA探針與Flt4 RNA的長鏈和短鏈形式雜交的放射自顯影照片的復印件；圖3C是用反義RNA探針與Flt4 RNA的長鏈和短鏈形式雜交的放射自顯影照片的復印件；圖4是顯示來自不同物種的DNA樣品中Flt4序列的雜交分析的凝膠照片復印件；圖5A-5H顯示了在管內(nèi)癌中表達VEGFR-3的血管的免疫組織化學鑒定。在相鄰切片(圖5A，B)中，VEGFR-3和PAL-E圍繞充滿癌細胞的導管裝飾成相似形式的“項鏈”血管(箭頭)。比較了染色VEGFR-3(圖5C)，層粘連蛋白(圖5D)，膠原蛋白XVIII(圖5E)和SMA(圖5F)的另一組相鄰切片。雙染色PAL-E和VEGFR-3(圖5G)并與僅染色VEGFR-3的相鄰切片(圖5H)進行比較。與病變導管相鄰的血管為雙陽性(箭頭)，而VEGFR-3陽性血管存在于導管間的基質中離病變導管近距離處(箭頭)。注意基底層在雙染色操作中為PAL-E陽性。放大倍數(shù)圖5A，B為400倍。圖5C，D，E，F(xiàn)為320倍。圖5E，F(xiàn)為480倍。
詳細描述下面描述了稱為Flt4的新受體酪氨酸激酶的克隆，測序和表達。Flt4基因定位于5q35染色體區(qū)域上，其中許多生長因子和生長因子受體位于該區(qū)域。Flt4的胞外域由包括12個潛在的糖基化位點的7個免疫球蛋白樣環(huán)組成。根據(jù)結構相似性，F(xiàn)lt4和以前已知的Flt1和KDR/FLK1受體組成一個III型酪氨酸激酶的亞家族。Flt4基因表達為5.8kb和4.5kb的mRNAs，發(fā)現(xiàn)其區(qū)別在于它們的3’端序列且在HEL和DAMI白血病細胞中差別表達。
Wilm′s腫瘤細胞系，成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞系，和未分化的畸胎癌細胞系表達Flt4；而分化的畸胎癌細胞為陰性。大多數(shù)胎兒組織也表達Flt4 mRNA，其中脾，腦中間帶和肺顯示出最高水平。在成人組織中，以表達依次下降的順序在胎盤，肺，腎，心臟和肝臟中發(fā)現(xiàn)最高的表達水平。在原位雜交中，F(xiàn)lt4放射自顯影顆粒點綴在胎兒肺的內(nèi)皮細胞上。胎兒組織中Flt4的免疫組織化學染色證實了內(nèi)皮細胞的染色。與Flt1和KDR比較Flt4的表達方式在18周大的人胎兒組織中區(qū)別極大。參見Kaipainen等，J.Exp.Med.，1782077(1993)。
按實施例4和11所述已產(chǎn)生了含有Flt4 cDNA的表達載體并在COS和NIH3T3細胞中表達。
本發(fā)明的Flt4 DNAs和多肽可用于純化Flt4配體，和調節(jié)各種器官中內(nèi)皮細胞的生長和分化?？勺C實它們在某些疾病的診斷/治療中也是有價值的。
在下面的描述中，在重組DNA(rDNA)技術中使用的許多術語是廣泛使用的。為了提供對說明書和權利要求書，包括對該術語給定的范圍的清楚和一致的理解，提供了下列定義。
基因.含有RNA聚合酶模板的DNA序列。從基因轉錄的RNA可編碼或者不編碼蛋白質。編碼蛋白質的RNA稱為信使RNA(mRNA)，且在真核生物中，它由RNA聚合酶II轉錄。然而，構建含有可轉錄RNA序列的RNA聚合酶II模板的基因也是已知的，該模板具有與特定mRNA互補的序列，但一般不翻譯。該基因構建體本文稱為“反義RNA基因”且該RNA轉錄子稱為“反義RNA”。反義RNA一般不能翻譯，因為在反義RNA序列中存在翻譯終止密碼子。
“互補DNA”或“cDNA”基因包括通過逆轉錄不含插入序列(內(nèi)含子)的mRNA合成的重組基因。
克隆載體.它是一種質?；蚴删wDNA或其它DNA序列，能在宿主細胞中自主復制，且其特征在于有一個或少數(shù)核酸內(nèi)切酶識別位點，可在該位點以可確定的方式切割該DNA序列而不喪失該載體的基本生物學功能，且可將DNA剪接進該位點以便使其復制和克隆。該克隆載體可進一步含有適用于鑒定該克隆載體轉化的細胞的標記。例如，該標記可以是四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性。術語“載體”有時用于表示“克隆載體”。
表達載體.它是相似于克隆載體且在轉化進宿主后能夠表達克隆進其中的基因的載體。克隆的基因通常置于諸如啟動子序列的某些調控序列的控制下(即，可操作地相連)。表達調控序列可根據(jù)該載體設計成在原核還是在真核宿主中表達可操作相連的基因而變化，且還可含有轉錄元件，例如增強子元件，終止序列，組織特異性元件，和/或翻譯起始和終止位點。
本發(fā)明涉及重組Flt4蛋白質(短鏈和長鏈形式)的表達和這些蛋白質的功能衍生物。
功能衍生物.Flt4蛋白的“功能衍生物”是具有生物學活性(功能或者結構)基本上相似于非重組Flt4蛋白的生物學活性的蛋白質。Flt4蛋白的功能衍生物可含有或者不含諸如共價連接的糖類的翻譯后修飾，這取決于該修飾對特定功能的效果的必要性。術語“功能衍生物”打算包括一種分子的“片斷”，“變異體”，“類似物”，和“化學衍生物”。
如本文所用，一個分子含有一般不是該分子的一部分的其它化學半分子時稱為是另一分子的“化學衍生物”。該半分子可提高該分子的可溶性，吸收率，生物學半壽期等。作為替代，該半分子可降低該分子的毒性和消除或減弱該分子的任一不良副作用等。能介導該效果的半分子在Remington′sPharmaceutical Sciences(1980)中公開。將該半分子偶連到某分子上的方法是本領域熟知的。
片斷.諸如Flt4蛋白的分子的“片斷”是指該分子的任一部分，例如肽核心區(qū)，或肽核心區(qū)的變異體。
變異體.諸如Flt4蛋白的分子的“變異體”是指在結構和生物學活性上基本上相似于整個分子或其片斷的分子。因此，只要兩個分子具有相似活性，即使一個分子的組成或二級，三級，或四級結構與在另一個中所發(fā)現(xiàn)的不同，或者即使氨基酸殘基的序列不同，它們?nèi)匀豢烧J為是本文所用的術語變異體。
類似物.Flt4蛋白或遺傳序列的“類似物”是指在功能上基本上相似于Flt4蛋白或本文的遺傳序列的蛋白質或遺傳序列。
優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明涉及申請人所稱的“Flt4”，酪氨酸激酶的受體，編碼Flt4的核酸分子(例如，cDNAs，基因組DNAs，RNAs，反義RNAs，等)，從Flt4基因序列及其產(chǎn)物生產(chǎn)Flt4肽或Flt4蛋白質，重組Flt4表達載體，F(xiàn)lt4的類似物和衍生物，以及Flt4和相關蛋白質的診斷和/或治療用途，F(xiàn)lt4配體，F(xiàn)lt4拮抗劑和抗-Flt4抗體。
重組Flt4的生產(chǎn)通過在合適的宿主細胞中克隆和表達編碼Flt4的序列或其功能等價物可生產(chǎn)有生物學活性的Flt4。
使用重組DNA技術生產(chǎn)Flt4可分成一步一步的方法進行描述(1)分離或產(chǎn)生所需Flt4的編碼序列(基因)；(2)構建能夠指導所需Flt4合成的表達載體；(3)轉染或轉化能夠復制和表達Flt4基因和/或加工該基因產(chǎn)物以產(chǎn)生所需Flt4的合適宿主細胞；和(4)鑒定和純化所需的Flt4產(chǎn)物。
Flt4基因的分離或產(chǎn)生Flt4或其功能等價物的核苷酸編碼序列可用于構建能指導所需Flt4產(chǎn)物表達的重組表達載體。在本發(fā)明的該方法的實施中，本文所述的核苷酸序列，或其片斷或功能等價物可用于產(chǎn)生能指導重組Flt4產(chǎn)物在合適宿主細胞中表達的重組分子。編碼Flt4的核苷酸序列可從產(chǎn)生Flt4-樣活性和/或表達編碼Flt4的mRNA的各種細胞來源獲得。申請人鑒定了許多Flt4的合適人細胞來源，包括人胎盤，白血病細胞和某些腫瘤細胞系。
從該細胞來源分離和純化的RNA通過cDNA克隆或者通過基因組克隆可獲得編碼Flt4的序列。例如，F(xiàn)lt4序列可使用本領域熟知的技術從cDNA或基因組DNA材料通過聚合酶鏈式反應擴增?？寺〉腸DNA或基因組文庫可使用本領域熟知的技術制備且可用與Flt4基因的任一部分基本上互補的核苷酸探針篩選特定的Flt4 DNAs?？蛇x擇全長克隆，即含有所需Flt4的完整編碼區(qū)的那些克隆用于構建表達載體。作為選擇，可使用本領域的標準技術通過化學合成全部或部分合成編碼Flt4的DNAs。由于核苷酸編碼序列的遺傳簡并性，編碼基本上相同或功能上等價的氨基酸序列的其它DNA序列可用于實施本發(fā)明的方法。這種Flt4核苷酸序列的改變包括不同核苷酸的缺失，添加或取代，導致該序列編碼相同或功能上等價的基因產(chǎn)物。該基因產(chǎn)物可在序列內(nèi)含有導致沉默改變的氨基酸殘基的缺失，添加或取代，從而產(chǎn)生有生物學活性的產(chǎn)物。該氨基酸取代可根據(jù)所涉及的殘基的極性，電荷，可溶性，疏水性，親水性和/或兩親性特性的相似性進行。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似親水性值的不帶電荷的極性頭部基團或非極性頭部基團的氨基酸包括下列氨基酸亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸；甘氨酸，丙氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸。
Flt4表達載體的構建使用該信息，提供了能以合理數(shù)量提供Flt4受體酪氨酸激酶的各種重組DNA載體。編碼具有本文鑒定的關鍵結構特征的合成蛋白質以及其它來源的同一家族的蛋白質的有關結構的其它重組DNA載體可使用重組DNA技術的標準技術從Flt4受體酪氨酸激酶cDNA產(chǎn)生。作為該技術的一個例子產(chǎn)生了表達Flt4受體酪氨酸激酶的轉化子(見實施例3和4)?？墒褂眯掳l(fā)現(xiàn)的序列和結構信息，通過轉染真核細胞以制備Flt4受體酪氨酸激酶及其各種結構域用于生物學目的。
表達Flt4基因產(chǎn)物的轉染子或轉化子的鑒定含有重組編碼序列且表達具有生物學活性的成熟產(chǎn)物的宿主細胞可通過至少4個普通方法鑒定(a)DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-反義RNA雜交；(b)含有或不含“標記”基因功能；(c)通過測量Flt4 mRNA轉錄子在宿主細胞中的表達評估轉錄水平；和(d)通過免疫測定法且最終通過其生物學活性的測量檢測成熟基因產(chǎn)物。
在第一種方法中，使用含有與Flt4編碼序列同源的核苷酸序列的探針通過DNA-DNA雜交可檢測插入表達載體中的Flt4編碼序列的存在。
在第二種方法中，可根據(jù)是否存在某些“標記”基因功能(例如，胸苷激酶活性，抗生素抗性，氨甲蝶呤抗性，轉化表型，在桿狀病毒中的包函體形成，等)鑒定和選擇重組表達載體/宿主系統(tǒng)。例如，如果Flt4編碼序列插入載體的標記基因序列內(nèi)，可通過缺乏標記基因功能鑒定含有該編碼序列的重組子。作為選擇，可將標記基因與Flt4序列串連置于用于控制Flt4編碼序列表達的相同或不同啟動子的控制下。響應誘導或選擇表達該標記表明表達Flt4編碼序列。
在第三種方法中，F(xiàn)lt4編碼區(qū)的轉錄活性可通過雜交試驗評估。例如，可分離多聚腺苷化RNA并使用與Flt4編碼序列或其特定部分同源的探針通過Northern印跡進行分析。作為選擇，可提取宿主細胞的總核酸并測定與該探針的雜交。
在第四種方法中，F(xiàn)lt4的表達可通過免疫學評估，例如，通過Western印跡，諸如放射免疫沉淀，酶聯(lián)免疫測定等的免疫測定法評估。然而，表達系統(tǒng)成功的最終檢驗包含檢測有生物學活性的Flt4基因產(chǎn)物。如果該宿主細胞分泌該基因產(chǎn)物，可測定從培養(yǎng)轉染的宿主細胞獲得的無細胞培養(yǎng)基的Flt4活性。如果該基因產(chǎn)物不分泌，可測定細胞溶胞產(chǎn)物的該活性。在每種情況下，可使用測量與Flt4結合的配體或Flt4的其它生物學活性的測定法。
Flt4的衍生物，類似物和肽與Flt4相關的衍生物，類似物和肽的生產(chǎn)和使用也是可預料到的且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)具體應用，與天然Flt4相比可增強或減小該衍生物，類似物，或肽的生物學活性。本發(fā)明與Flt4相關的衍生物，類似物和肽可通過本領域已知的各種方法產(chǎn)生。在遺傳和蛋白質水平上的方法和操作也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可使用本領域標準化的肽合成法獲得Flt4肽。在蛋白質水平上，可使用許多化學修飾法通過本領域已知的技術產(chǎn)生Flt4-樣衍生物，類似物，或肽，該技術包括但不限于內(nèi)肽酶(例如，溴化氰，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，V8蛋白酶等)或外肽酶的特異性化學裂解，乙?；?，甲?；趸?。
優(yōu)選的衍生物，類似物，和肽是那些保留Flt4配體結合活性的衍生物，類似物，和肽。結合Flt4配體但不轉導與其反應的信號的那些衍生物，類似物和肽用作Flt4抑制劑。結合Flt4配體且通過例如，包含細胞內(nèi)Flt4自身磷酸化的過程轉導與其反應的信號的那些衍生物，類似物和肽可與天然Flt4以相同的方式使用。用于該結合和/或自身磷酸化試驗的優(yōu)選Flt4配體是含有按本文所述可從PC-3條件培養(yǎng)基分離的大約23kd多肽的配體。命名為血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)的該配體在申請日為1996年8月1日且作為國際公開WO 97/05250公開的PCT專利申請PCT/FI96/00427中，和在其中要求優(yōu)先權所依據(jù)的美國專利申請優(yōu)先權文件中已被詳細鑒定，本文引用所有這些文獻以其整體作為參考。
抗-Flt4抗體識別Flt4或有關蛋白的多克隆和單克隆抗體的生產(chǎn)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可使用本領域已知的各種方法生產(chǎn)抗Flt4表位的多克隆抗體。為了生產(chǎn)抗體，通過注射Flt4或合成Flt4肽可免疫各種宿主動物(包括但不限于兔，小鼠，大鼠等)?？墒褂酶鞣N佐劑增強免疫反應，依賴于宿主物種，佐劑包括但不限于Freund′s(完全和不完全)佐劑，諸如氫氧化鋁的礦物膠，諸如溶血卵磷脂，多聚醇，聚陰離子，油乳化劑，匙孔帽貝血藍蛋白，二硝基酚的表面活性物質，和諸如BCG(卡介苗)和Corynebacterium parvum的潛在有用的人佐劑。
抗Flt4表位的單克隆抗體可通過使用為在培養(yǎng)物中通過傳代細胞系生產(chǎn)抗體分子而提供的任一技術制備。這些技術包括但不限于最初由Kohler等，Nature，256495-497(1975)描述的雜交瘤技術，和最近的人B-細胞雜交瘤技術[Kosbor等，Immunology Today，472(1983)]和EBV-雜交瘤技術[Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R Liss，Inc.，第77-96頁(1985)]?？笷lt4的抗體也可從克隆的免疫球蛋白cDNAs在細菌中生產(chǎn)。使用重組噬菌體抗體系統(tǒng)，可在細菌培養(yǎng)物中迅速生產(chǎn)和選擇抗體且可遺傳改造其結構。
含有該分子獨特型的抗體片斷可通過已知技術產(chǎn)生。例如，該片斷包括但不限于通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab′)2片斷；通過還原F(ab′)2片斷的二硫鍵產(chǎn)生的Fab′片斷，和通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的兩個Fab片斷。
抗Flt4的抗體在Flt4多肽的親和純化中和在Flt4生物合成，代謝和功能的解釋中可用于成熟Flt4和Flt4前體和亞組分形式的定性和定量檢測。Flt4酪氨酸激酶活性的檢測可用作生成和放大該試驗中的Flt4特異性信號的酶手段?？笷lt4抗體也可用作診斷和治療劑。
Flt4，編碼Flt4的核酸分子和抗-Flt4的抗體的用途申請人預期本發(fā)明的組合物具有各種廣泛的用途，包括Flt4，F(xiàn)lt4類似物和衍生物，編碼Flt4的核酸分子，反義核酸分子和抗-Flt4抗體的診斷和/或治療用途。
編碼Flt4的核酸分子或其片斷可用作檢測和定量編碼Flt4的mRNAs的探針。利用核酸探針檢測含有全部或部分已知基因序列的序列的試驗是本領域熟知的。Flt4 mRNA的水平可表示出現(xiàn)和/或存在瘤形成以及其它人類疾病的發(fā)作和/或進行。因此，能檢測和定量Flt4 mRNA的試驗提供了有價值的診斷工具。
反義Flt4 RNA分子在治療上用于抑制編碼Flt4的mRNAs的翻譯，其中治療目的包含需要除去存在的Flt4或者下調其水平。例如，F(xiàn)lt4反義RNA在治療Flt4與病因相關，例如由于其過度表達的疾病中可用作Flt4拮抗劑。
另外，F(xiàn)lt4反義RNAs在解釋Flt4的功能機制中有用。編碼Flt4的核酸分子可用于按本申請中的單獨描述生產(chǎn)重組Flt4蛋白和相關分子。
抗-Flt4抗體可用于診斷和定量各種情況中的Flt4。例如，抗Flt4各種結構域的抗體可用作Flt4免疫測定或Flt4免疫組織化學評估的基礎。Flt4的酪氨酸激酶活性可用于這些試驗中作為酶放大反應以產(chǎn)生Flt4信號?？?Flt4抗體也可用于研究細胞表面的Flt4量。
可生產(chǎn)起Flt4配體興奮劑或拮抗劑作用的抗體，從而使得調節(jié)Flt4的活性成為可能。另外，可通過合成方法或者從隨機寡核苷酸通過重組方法產(chǎn)生隨機肽并借助于Flt4胞外域選擇表現(xiàn)出與Flt4受體特異性結合的肽。也可使用本領域的標準方法使用Flt4胞外域從噬菌體展示文庫選擇該肽片斷。該肽可具有對抗或拮抗活性。Flt4抗體也可與各種化合物偶連后提供有價值的診斷工具用于體內(nèi)造影表達Flt4的細胞和組織或者腫瘤。
抗Flt4的單克隆抗體可共價或者非共價偶連到合適的超磁性，順磁性，電子密集性，聲波發(fā)生性或放射性試劑上以產(chǎn)生定向造影劑?？捎玫鞍姿饣蚧瘜W處理產(chǎn)生的抗體片斷或者通過使用單克隆抗體的表位結合域產(chǎn)生的分子代替完整抗體。然后可將該造影劑用作人體X-射線，磁共振，聲波圖或閃爍圖造影的造影劑用于診斷目的。
Flt4的分子生物學Flt4 cDNA克隆的完整序列在SEQ ID NOs1和3中描述，依賴于兩者擇一的剪接，伸展長度為4195個或4795個核苷酸且含有1298個或1363個氨基酸的開放閱讀框。核苷酸和推定的Flt4氨基酸序列(短鏈形式)在SEQ IDNOs1和2中表示。圖2顯示了Flt4氨基酸序列與Flt1酪氨酸激酶氨基酸序列的比較。參見Shibuya等，Oncogene，55 19-524(1990)。
大部分是疏水氨基酸的推定信號肽序列在起始子甲硫氨酸之后。圍繞相應ATG的序列與共有翻譯起動序列一致[Kozak，Nucl.Acids Res.，158125-8135(1987)]。兩個Flt4多肽的推定胞外部分均是775個氨基酸長且含有12個潛在的天冬酰胺連接的糖基化(NXS/T)位點。它還含有表現(xiàn)出對于免疫球蛋白超家族成員的蛋白質所述的間隔方式的一些氨基酸殘基[Williams等，Annu.Rev.Immunol.，6381-405(1988)]。它有12個半胱氨酸殘基且可組織成7個免疫球蛋白樣結構域。如圖2所示，鑒定了大致如下的7個免疫球蛋白樣結構域Ig-I(SEQ ID NO1，位置158-364；SEQ ID NO2，氨基酸47-115)；Ig-II(SEQ ID NO1，位置479-649；SEQ ID NO2，氨基酸154-210)；Ig-III(SEQ ID NO1，位置761-961；SEQ ID NO2，氨基酸248-314)；Ig-IV(SEQ ID NO1，位置1070-1228；SEQ ID NO2，氨基酸351-403)；Ig-V(SEQ ID NO1，位置1340-1633；SEQ ID NO2，氨基酸441-538)；Ig-VI(SEQ ID NO1，位置1739-1990；SEQ ID NO2，氨基酸574-657)；和Ig-VII(SEQ ID NO1，位置2102-2275；SEQ ID NO2，氨基酸695-752)。推定的Ig-樣結構域IV缺少半胱氨酸殘基。圖2還顯示了Flt1胞外域(SEQ.ID No.5)，它是與Flt4最近的人類同源物。從該附圖可見Ig-樣區(qū)域的半胱氨酸殘基對比和極相似的組成。
Flt4的胞質結構域通過23個疏水氨基酸殘基的推定跨膜區(qū)與胞外部分分開。該序列在胞質側的側翼是一個堿性區(qū)域，認為它是跨膜與胞質結構域之間的連接點。酪氨酸激酶同源性結構域在殘基843處開始且包含一個ATP-結合口袋和在Y1068處與c-src的Y416同源的推定自身磷酸化位點(圖2)。Flt4的酪氨酸激酶催化結構域由一個大部分疏水且顯示出與Flt1無同源性的65個氨基酸的序列(氨基酸944-1008)分成兩個亞結構域。與Flt1不同，F(xiàn)lt4在其激酶插入片斷中不含酪氨酸殘基。
Flt4 mRNA的第二種形式具有編碼Flt4蛋白長鏈形式的擇一3’端。
在圖3A-C中，表示了通過擇一的剪接產(chǎn)生Flt4 mRNA的短鏈和長鏈形式。圖3A顯示了克隆J.1.1和I.1.1的cDNA插入片斷3’端的結構示意圖。表示了克隆J.1.1的TAG終止密碼子以及多聚腺苷化位點(poly A)?？寺.1.1與克隆J.1.1的區(qū)別在于陰影片斷(分別是Flt4 mRNA的長鏈和短鏈形式)。TAA和polyA表示克隆I.1.1的終止密碼子和多聚腺苷化位點。另外，表示了EcoRI和Aval的限制性核酸內(nèi)切酶的裂解位點。用于cRNA保護分析的克隆I.1.1的256bp EcoRl-AvaI插入片斷在下面表示。陰影最重的片斷表示用于體外轉錄反義鏈的線型化有義RNA模板上的多接頭序列。還顯示了RNAse保護分析后保護片斷的結構示意圖。圖3B和3C顯示了256bp35S-標記的反義RNA探針的放射自顯影圖，且211和124bp的消化片斷表示從所示細胞系(Tera-2是畸胎癌細胞系，這里用視黃酸(RA)處理10天或不處理進行分析)通過多聚腺苷化RNA保護的Flt4 RNA的短鏈和長鏈形式。陰性對照泳道表示了用轉移RNA保護的結果。注意到Tera-2細胞分化期間Flt4mRNAs的減量調節(jié)?？寺?3的Tera-2細胞由Dr.C.F.Graham(英國牛津大學動物學系)提供。傳代18-40代的細胞用于該試驗。細胞在補充了10％胎牛血清和抗生素的Eagle′s極限必需培養(yǎng)基(MEM)中維持。為了誘導分化，將細胞以1.5×103個細胞/cm2的密度涂布在明膠覆蓋的組織培養(yǎng)級平皿上。第二天向培養(yǎng)基中加入2×10-6M的RA。在RA存在下培養(yǎng)細胞達10天。
圖3A-C中所示的結果表示了由擇一的剪接產(chǎn)生的這兩個Flt4(短鏈和長鏈)形式的羧基末端的產(chǎn)生。
根據(jù)其推定的氨基酸序列，F(xiàn)lt4屬于III型RTKs。更具體的說，F(xiàn)lt4屬于RTKs超家族，在其胞外部分含有7個Ig-環(huán)，因此它與含有5個Ig-環(huán)的III型RTKs的其它成員不同。Flt4與從人基因組DNA文庫作為v-ros-相關性DNA克隆的FLT家族的原型受體，即Flt1[Shibuya等，Oncogene，5519-524(1990)]和從小鼠肝臟造血干細胞富集區(qū)克隆的小鼠FLK1受體[Matthews等，Cell，651143-1152(1991)；Matthews等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，889026-9030(1991)]具有最近的同源性。Flt4的胞外域與人Flt1和小鼠FLK1分別顯示出33％和37％的氨基酸序列相同性。Flt1和FLK1與Flt4一樣在諸如肺，心臟和腎的各種正常組織中廣泛表達。另外，最近鑒定的人內(nèi)皮細胞受體酪氨酸激酶KDR[Terman等，Oncogene，61677-1683(1991)]與Flt4和Flt1家族成員表現(xiàn)出顯著的同源性。從可得到的序列資料可計算出KDR與Flt4在酪氨酸激酶(TK)結構域具有81％的相同性。另外，KDR的胞外域也具有7個Ig-環(huán)結構且其TK1和TK2結構域與小鼠FLK1受體的相應結構域具有95％和97％的相同性。這表明KDR是小鼠FLK1的人類同源物。
盡管Flt4 TK結構域與Flt1和FLK1/KDR的TK結構域具有大約80％的相同性，但是它與III型RTK的其它受體的TK結構域僅具有大約60％的相同性。由于這些其它受體在胞外區(qū)還僅具有5個Ig-樣結構域，因此可將Flt4，F(xiàn)lt1和FLK1/KDR分類進III型RTKs內(nèi)的一個獨立的FLT亞家族中。
在PDGFRs，c-fms和c-kit的激酶插入片斷中位于序列D/E-D/E-y-M/V-P/D/E-M[Cantley，等，Cell，64281-302(1991)](SEQ.ID NO.6)中的酪氨酸殘基是自身磷酸化位點，當磷酸化時，它結合磷脂酰肌醇3’-激酶(PI-3K)的SH2結構域[Reedijk等，EMBO J.，111365-1372(1992)]。令人感興趣的是，與這些III型RTKs不同，F(xiàn)LT亞家族的成員或Flt3/FLK2受體不含該共有基序。
8個人III型RTK基因聚集在3個不同染色體上。4號染色體上含有c-kit，PDGFR-α和KDR基因[Yarden等，EMBO J.，63341-3351(1987)；Stenman等，Genes，Chromosomes，Cancer，1155-158(1989)；Terman等，Oncogene，61677-1683(1991)]。Flt1和Flt3基因位于染色體13q12上[Satoh等，Jpn.J.Cancer Res.，78772-775(1987)；Rosnet等，Genomics，9380-385(1991)]，而Flt4位于5號染色體的q35帶上[Aprelikova等，Cancer Res.，52746-748(1992)]；靠近fms和PDGFR-β基因[Warrington等，Genomics，11701-708(1991)]。在白血病細胞中發(fā)現(xiàn)5號染色體的長臂上包含易位。在患有頑固貧血癥和大紅細胞癥的患者骨髓細胞中發(fā)現(xiàn)5號染色體的長臂部分缺失[VanDen Berghe等，Nature，251437-439(1974)]。在一些其它骨髓增生性疾病，例如具有過量胚細胞的頑固性貧血癥[Swolin等，Blood，58986-993(1981)]，原因不明的骨髓組織轉化[Whang-Peng等，Leuk.Res.，241-48(1978)]，慢性骨髓白血病[Tomiyasu等，Cancer Genet.Cytogenet.，2309-315(1980)]，真性紅細胞增多癥[Van Den Berghe等，Cancer Genet.Cytogenet.，1157-162(1979)]和原發(fā)性血小板增多[Nowell等，Cancer，422254-2260(1978)]中發(fā)現(xiàn)畸形5q染色體。
關于Flt4 mRNA表達的發(fā)現(xiàn)表明其蛋白質產(chǎn)物對于某些白血病細胞是特征性的。已表明存在一些在成巨核細胞和內(nèi)皮細胞之間共有的鑒別抗原，一個例子是血小板糖蛋白IIIa[Ylanne等，Blood，721478-1486(1988)；Kieffer等，Blood，721209-1215(1988)；Berridge等，Blood，6676-85(1985)]。另外，某些內(nèi)皮細胞，例如胎兒時期肺和腎的內(nèi)皮細胞表達Flt4。
為了進一步了解發(fā)育期間Flt4的作用，克隆了小鼠Flt4的部分cDNAs。在原位雜交中使用這些探針分析了小鼠發(fā)育期間Flt4 mRNA的表達。確定了在血管發(fā)生和淋巴系統(tǒng)的血管生成期間表達Flt4。在正常和病理成人組織中也證實了這些發(fā)現(xiàn)的相關性，因為在正常和病理學條件下在成人組織的淋巴管內(nèi)皮細胞中，以及在一些毛細血管后微靜脈(HEVs)中都發(fā)現(xiàn)了Flt4。
小鼠Flt4 cDNA片段的克隆顯示了其推定的氨基酸序列與相應的人序列幾乎相同(在研究的兩個片段中有大約96％的氨基酸相同性)。小鼠Flt4cDNA相同性的進一步證據(jù)從Northern雜交試驗獲得，其中來自兩物種的探針都從小鼠組織產(chǎn)生典型的5.8kb mRNA信號。對從成年小鼠各種組織分離的RNA進行的分析表明在肝，肺，心，脾和腎中表達Flt4，在腦和睪丸中沒有或有極少的雜交。這種表達方式類似于由Galland等，Oncogene，81233(1993)早期報道的方式。Rnase保護的結果表明在小鼠發(fā)育期間從交配后8.5天的胚胎開始需要Flt4基因，且相對表達水平似乎十分穩(wěn)定。
對于原位雜交，選擇編碼胞外域序列的小鼠Flt4 cDNA的兩個片段。這樣允許清楚地區(qū)分相關FLK-1的雜交模式與Flt1受體模式，F(xiàn)lt1與Flt4在胞外區(qū)僅顯示出極低程度的序列相同性。參見Millauer等，Cell，72835(1993)；Yamaguchi等，Development，118489(1993)；Peters等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908915(1993)；Finnerty等，Oncogene，82293(1993)。
與FLK-1，F(xiàn)lt1，Tie和Tek內(nèi)皮受體酪氨酸激酶基因相似，F(xiàn)lt4在交配后(p.c.)7.5天的胚胎中不表達。在交配后8.5天的胚胎中，有強烈的Flt4信號位于尿囊，頭間充質的成血管細胞，背主動脈，和主靜脈中。在心內(nèi)膜中可見微弱的信號。相反，卵黃囊的成血管細胞為陰性，與FLK-1和Flt1，Tie和Tek不同。參見Korhonen等，Oncogene，8395(1993)；和Peters等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908915(1993)。Flt4的表達局限于靜脈系統(tǒng)在11.5天的小鼠胚胎樣品中甚至更清楚，而Tie mRNA還在動脈中表達。在交配后12.5天的胚胎中，F(xiàn)lt4信號點綴發(fā)育中的靜脈和推定的淋巴管內(nèi)皮，但與內(nèi)皮Tie受體酪氨酸激酶不同，動脈內(nèi)皮為陰性。在發(fā)育的晚期，F(xiàn)lt4 mRNA變得局限在無血細胞的血管叢，該血管叢代表發(fā)育中的淋巴管。在成人組織中只有淋巴管內(nèi)皮和一些毛細血管后微靜脈表達Flt4 mRNA。在淋巴竇和毛細血管后微靜脈，轉移性淋巴結，和在淋巴管瘤中出現(xiàn)表達增強。
由于解釋來自小鼠胚胎的資料存在困難，因此研究了人內(nèi)皮，因為人類的淋巴系統(tǒng)更明確。另外，可在細胞培養(yǎng)物中研究從各種內(nèi)皮建立的細胞以觀察在體外條件下是否保持Flt4表達的特異性。已知內(nèi)皮細胞系在體外培養(yǎng)時喪失分化特征。因此，不能不預期它們?yōu)镕lt4 mRNA陰性。培養(yǎng)的主動脈內(nèi)皮細胞也不含F(xiàn)lt4 mRNA。然而，從微血管系統(tǒng)和從股靜脈和臍靜脈生長的人內(nèi)皮細胞中可獲得信號。因此，在細胞培養(yǎng)物中保留了至少一些Flt4表達特異性。
成人組織的原位雜交分析證實了在發(fā)育中的小鼠胚胎中觀察到的Flt4局限于淋巴系統(tǒng)的結果。在淋巴管內(nèi)皮和在人淋巴結竇中可見Flt4的表達。令人感興趣的是，具有立方內(nèi)皮，顯示出運輸白細胞到淋巴結功能的一些HEVs也呈Flt4-陽性。另外，平行雜交分析表明與正常淋巴結相比在轉移癌的這些結構中Flt4 mRNA水平增強。在淋巴管瘤中Flt4也極顯著，淋巴管瘤是由結締組織基質和生長的有內(nèi)皮襯里的淋巴導管組成的良性腫瘤。Flt4mRNA局限在這些腫瘤的淋巴管內(nèi)皮上且在其動脈，靜脈和毛細血管中不存在。在人肺中，淋巴管結構是鑒定的唯一Flt4-陽性管。
上述結果表明Flt4是成人組織中的淋巴管和一些毛細血管后微靜脈的新標記。該結果也支持了關于淋巴管的靜脈起源的理論。Flt4作為一種生長因子受體可參與這些血管的分化和功能。Flt4通過Flt4的配體，即VEGF-C介導的生物學效應的詳細鑒定在申請日為1996年8月1日且作為國際公開號WO97/05250被公開的PCT專利申請PCT/FI96/00427中提供。
這些結果與根據(jù)本發(fā)明的Flt4-結合化合物結合允許選擇性地標記淋巴管內(nèi)皮，特別是通過使用與放射性，電子密集性或其它可見的報道物質偶連的本發(fā)明的抗體進行標記?？蓪⒑蠪lt4受體內(nèi)化誘導型單克隆抗體或配體的物質注射進淋巴系統(tǒng)，從而將預定的分子轉運到淋巴管內(nèi)皮。也可使用根據(jù)本發(fā)明的Flt4-結合化合物檢測毛細血管后微靜脈，特別是表達Flt4受體的水平增強的活化HEVs。根據(jù)我們的了解，目前還沒有這樣的特異性標記可用于淋巴管內(nèi)皮。
基因治療本發(fā)明還涉及基因治療方法。具體地說，可將癌癥細胞的血管系統(tǒng)或者癌細胞本身與能夠給該細胞的血管系統(tǒng)提供諸如本發(fā)明的可溶性VEGFR-3片段的治療肽的表達構建體以達到治療效果的方式接觸。該治療效果可以是，例如，在腫瘤血管系統(tǒng)中抑制VEGFR-3，抑制血管生成，抑制淋巴管生成，消除，消退或者抑制腫瘤生長，誘導腫瘤或甚至腫瘤細胞本身的血管或淋巴管系統(tǒng)的編程性細胞死亡。
對于這些實施方案，舉例性的表達構建體包含病毒或從病毒基因組產(chǎn)生的改造構建體。該表達構建體一般包含編碼待表達的基因的核酸且還含有在給藥到其上的細胞中引起該基因表達的其它調控區(qū)。該調控區(qū)包括，例如，啟動子，增強子，多聚腺苷化信號等。
現(xiàn)在普遍認識到可使用各種病毒載體將DNA導入細胞中。在該實施方案中，包括含有目的基因的病毒載體的表達構建體可以是腺病毒(參見例如，美國專利號5,824,544；美國專利號5,707,618；美國專利號5,693,509；美國專利號5,670,488；美國專利號5,585,362；分別在本文中引用以供參考)，逆轉錄病毒(參見例如，美國專利號5,888,502；美國專利號5,830,725；美國專利號5,770,414；美國專利號5,686,278；美國專利號4,861,719，分別在本文中引用以供參考)，腺伴隨病毒(參見例如，美國專利號5,474,935；美國專利號5,139,941；美國專利號5,622,856；美國專利號5,658,776；美國專利號5,773,289；美國專利號5,789,390；美國專利號5,834,441；美國專利號5,863,541；美國專利號5,851,521；美國專利號5,252,479，分別在本文中引用以供參考)，腺病毒-腺伴隨病毒雜合體(參見例如，美國專利號5,856,152，本文引用以供參考)或痘苗病毒或皰疹病毒(參見例如，美國專利號5,879,934；美國專利號5,849,571；美國專利號5,830,727；美國專利號5,661,033；美國專利號5,328,688，分別在本文中引用以供參考)載體。
在其它實施方案中，包含非病毒傳遞。它們包括磷酸鈣沉淀(Graham和Van Der Eb，Virology，52456-467，1973；Chen和Okayama，Mol.Cell Biol.，72745-2752，1987；Rippe等，Mol.Cell Biol.，10689-695，1990)，DEAE-葡聚糖(Gopal，Mol.Cell Biol.，51188-1190，1985)，電穿孔(Tur-Kaspa等，Mol.CellBiol.，6716-718，1986；Potter等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，817161-7165，1984)，直接顯微注射(Harland和Weintraub，J.Cell Biol.，1011094-1099，1985)，DNA-裝載的脂質體(Nicolau和Sene，Biochim.Biophys.Acta，721185-190，1982；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，763348-3352，1979；Felgner，Sci Am.276(6)102-6，1997；Felgner，Hum Gene Ther.7(15)1791-3，1996)，細胞超聲處理(Fechheimer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，848463-8467，1987)，使用高速微粒的基因轟擊(Yang等，Proc.Natl.Acad.SciUSA，879568-9572，1990)，和受體介導的轉染(Wu和Wu，J.Biol.Chem.，2624429-4432，1987；Wu和Wu，Biochemistry，27887-892，1988；Wu和Wu，Adv.Drug Delivery Rev.，12159-167，1993)。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，表達構建體(或甚至上述的肽)可包埋在脂質體中。脂質體是以磷脂雙層膜和內(nèi)部的水介質為特征的囊狀結構。多層脂質體具有被水介質分開的多個脂層。它們在將磷脂懸浮于過量水溶液中時自發(fā)形成。脂類成份在形成密閉結構前進行自我重排并在脂雙層之間包埋水和溶解的溶質(Ghosh和Bachhawat，見Liver diseases，targeted diagnosisand therapy using specific receptors and ligands，Wu G，Wu C編，紐約MarcelDekker，第87-104頁，1991)。將DNA加入陽離子脂質體中引起從脂質體向光學雙折射的液晶壓縮球體的拓撲學轉變(Radler等，Science，275(5301)810-4，1997)。這些DNA-脂類復合物是用于基因治療和傳遞的潛在非病毒載體。
脂質體介導的核酸傳遞和外源性DNA的體外表達已經(jīng)非常成功。本發(fā)明還包含涉及“脂轉染”技術的各種商業(yè)方法。在本發(fā)明的某些實施方案中，該脂質體可與血凝病毒(HVJ)復合。已經(jīng)表明這樣有利于與細胞膜的融合且促進脂質體包裹的DNA進入細胞(Kaneda等，Science，243375-378，1989)。在其它實施方案中，脂質體可與核內(nèi)非組蛋白的染色體蛋白質(HMG-1)復合或連接使用(Kato等，J.Biol.Chem.，2663361-3364，1991)。在另一實施方案中，該脂質體可與HVJ和HMG-1兩者復合或連接使用。鑒于該表達構建體已經(jīng)成功用于體外和體內(nèi)轉移和表達核酸，因此它們可適用于本發(fā)明。
可用于將編碼治療基因的核酸傳遞進細胞的其它載體傳遞系統(tǒng)包括受體介導的傳遞載體。它們利用了在幾乎所有的真核細胞中通過受體介導的胞吞選擇性攝取大分子。由于各種受體的細胞類型特異性分布，該傳遞可具有高度特異性(Wu和Wu，1993，出處同上)。
受體介導的基因定向載體一般由兩種成份組成細胞受體特異性配體和DNA結合試劑。一些配體已被用于受體介導的基因轉移。最廣泛鑒定的配體是脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu，1987，出處同上)和轉鐵蛋白(Wagner等，Proc.Nat′l.Acad Sci.USA，87(9)3410-3414，1990)。最近，識別與ASOR相同的受體的合成新生糖蛋白已被用作基因傳遞載體(Ferkol等，F(xiàn)ASEB J.，71081-1091，1993；Perales等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 914086-4090，1994)且表皮生長因子(EGF)也被用于將基因傳遞給鱗狀癌細胞(Myers，EPO 0273085)。
在其它實施方案中，傳遞載體可包含配體和脂質體。例如，Nicolau等(Methods Enzymol.，149157-176，1987)采用乳糖苷神經(jīng)酰胺，半乳糖末端的脫唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂摻入脂質體中并觀察到胰島素基因的肝細胞吸收增加。因此，可行的是通過含有或不含脂質體的各種受體-配體系統(tǒng)也可將編碼治療基因的核酸特異性地傳遞進特定細胞類型中。
在本發(fā)明的另一實施方案中，表達構建體可簡單地由裸露的重組DNA或質粒組成。構建體的轉移可通過上文提及的物理或化學穿透細胞膜的任一方法進行。它特別適用于體外轉移，然而，它也可適合于體內(nèi)使用。Dubensky等(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，817529-7533，1984)成功地將CaPO4沉淀形式的多瘤病毒DNA注射進成年和新生小鼠的肝臟和脾，證實了活躍的病毒復制和急性感染。Benvenisty和Neshif(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，839551-9555，1986)也證實了直接腹膜內(nèi)注射CaPO4沉淀的質粒導致轉染基因的表達。
用于將裸露的DNA表達構建體轉移進細胞的本發(fā)明的另一實施方案可包含粒子轟擊。該方法依賴于將DNA包裹的微粒加速到允許它們穿透細胞膜并進入細胞而不殺死它們的高速度的能力(Klein等，Nature，32770-73，1987)。已經(jīng)開發(fā)了一些用于加速小粒子的裝置。一種該裝置依賴于高壓放電產(chǎn)生電流，該電流再提供動力(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，879568-9572，1990)。所用的微粒由諸如鎢或金珠的生物學惰性物質組成。
本領域的技術人員熟知如何將基因傳遞應用到體內(nèi)和離體情況中。對于病毒載體，一般會制備病毒載體原種。依賴于病毒的類型和可達到的效價，可給患者傳遞1×104，1×105，1×106，1×107，1×108，1×109，1×1010，1×1011或1×1012個感染性顆粒。對于脂質體或其它非病毒配制品通過比較相對吸收效率可推斷出相似的數(shù)值。作為藥用上可接受的組合物的配制品在下文中描述。
可考慮各種傳遞途徑用于各種腫瘤類型。下面關于傳遞途徑的部分包含廣泛列舉的可能途徑。對于幾乎任何腫瘤，可考慮全身性傳遞。這證實對于攻擊微觀的或轉移性癌癥特別重要。如果可鑒定分散的腫瘤塊，可采用各種直接的，局部性和區(qū)域性方法。例如，可用表達載體或蛋白質直接注射腫瘤。在切除術之前，期間或之后可處理腫瘤基底層。切除術之后，一般通過在手術后的位置留下的導管傳遞該載體?？衫媚[瘤血管系統(tǒng)通過注射支持靜脈或動脈將該載體導入腫瘤中。也可利用更末梢的血管供給途徑。
在一個不同的實施方案中，可考慮離體基因治療。在離體實施方案中，取出患者的細胞并在體外維持至少一段時間。在該時間期間，傳遞該治療，隨后將該細胞再導入患者；優(yōu)選的是，已殺死了樣品中的任何腫瘤細胞。
提供下列實施例僅用于舉例說明本發(fā)明且不以任何方式限制其范圍。
實施例1
編碼Flt4的cDNA克隆的分離和鑒定材料和方法寡聚-dT引物產(chǎn)生的在噬菌體λgtl 1[由費城兒童醫(yī)院，PA的MortimerPoncz博士惠贈；Poncz等，Blood，69219-223(1987)]中的人HEL細胞cDNA文庫用從相同文庫PCR擴增的cDNA片段進行篩選[Aprelikova等，CancerRes.，52746-748(1992)]。鑒定陽性噬斑并按[Sambrook等，MolecularCloning-A Laboratory Manual，冷泉港實驗室出版，(1989)]所述純化。噬菌體λ的cDNA插入片段作為EcoRI片段被分離并亞克隆進GEM3Zf(+)質粒(Promega)中。分離完整的Flt4蛋白編碼區(qū)。使用雙脫氧鏈終止法用根據(jù)獲得的序列設計的寡核苷酸引物測序從HEL-文庫分離的3個重疊克隆(圖1所示)。在兩條鏈上測序cDNAs的所有部分。使用GCG軟件包程序[Devereux等，Nucleic Acids Res.，12387-395(1984)和Apple MacIntosh的Prosite程序]進行序列分析。
圖1A顯示了分析的Flt4 cDNA克隆的結構示意圖。箭頭表示用于探測圖1B所示的Northern印跡的亞克隆限制性片段(其大小以kb表示)。E＝EcoRI位點，S＝SphI位點。圖1B顯示了用圖1A所示的探針對DAMI和HEL白血病細胞RNAs的Northern雜交分析。
結果從HEL細胞cDNA文庫通過PCR克隆方法分離的210bp長的Flt4 cDNA片段用作分子探針以篩選寡聚-dT-引物產(chǎn)生的人紅白血病細胞cDNA文庫。
對克隆的核苷酸序列分析揭示了一個1298個氨基酸(aa)殘基的開放閱讀框(SEQ ID NO2，圖2)。圖中標記的翻譯起始子甲硫氨酸被典型的共有序列包圍[Kozak，Nucleic Acids Res.，12857-872(1984)]且隨后是用于轉移進內(nèi)質網(wǎng)的信號序列特征性的疏水氨基酸序列。
將Flt4的胞外域排列成7個免疫球蛋白樣環(huán)(圖2)。該圖還顯示了Flt4與Flt1的比較，它們含有非常相似的結構。Flt1的氨基酸序列作為SEQ.IDNO5提供。
氨基酸殘基775-798形成疏水鏈序列，它很可能作為該受體的跨膜結構域起作用，疏水鏈后面是一些堿性殘基，位于該多肽推定的胞質一側上。近膜結構域有44個殘基的長度，在842位氨基酸的酪氨酸激酶序列同源性的開始處之前。由于在65個氨基酸的激酶插入序列上同源性中斷，因此該同源性首先在該受體的羧基末端尾的1175位氨基酸處喪失。在氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(Swissprot和NBRF)中對有關酪氨酸激酶結構域的檢索鑒定了在催化性酪氨酸激酶區(qū)分別具有大約80％和60％同源性的Flt1和PDGFRB酪氨酸激酶。
實施例2抗-Flt4抗血清的制備將編碼Flt4短鏈形式的推定C-末端的657個堿基對的EcoRI片段克隆進pGEX-1λT細菌表達載體(Pharmacia)中含有谷胱甘肽-S-轉移酶編碼區(qū)的閱讀框中以便在大腸桿菌中產(chǎn)生GST-Flt4融合蛋白。在細菌中生產(chǎn)所得的融合蛋白并通過谷胱甘肽親和色譜法按照廠商的指導進行部分純化。使用該蛋白質免疫家兔以便產(chǎn)生抗Flt4的多克隆抗體。使用第三次加強免疫后的抗血清。
實施例3Flt4在COS細胞中的表達材料和方法將全長Flt4蛋白的編碼序列(從3個克隆組合，圖1)插入SVpoly哺乳動物表達載體[Stacey等，Nucleic Acids Res.，182829(1990)]的HindIII-BamHI位點構建SV14-2。將該表達載體(SV-FLT4短鏈和SV-FLT4長鏈，含有各自形式的Flt4 cDNA)通過DEAE-葡聚糖轉染法[McCutchanetal.，J.Natl.Cancer Inst.，41.351-357(1968)]導入COS細胞中。轉染2天后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞并刮擦進免疫沉淀緩沖液(10mM Tris pH7.5，50mMNaCl，0.5％脫氧膽酸鈉，0.5％ Nonidet P40，0.1％SDS，0.1TIU/ml抑肽酶)中。超聲處理溶胞產(chǎn)物，在10,000xg下離心15分鐘并與3ml抗血清在冰上溫育過夜。加入蛋白A瓊脂糖(Pharmacia)并在旋轉條件下繼續(xù)溫育30分鐘。沉淀物用免疫沉淀緩沖液洗滌4次，用PBS洗滌一次且在SDS-PAGE分析前用水洗滌一次。
結果通過將全長Flt4短鏈和長鏈蛋白的編碼區(qū)克隆進pSVpoly表達載體的HindIII-BamHI位點并將這些表達載體轉染進COS細胞檢驗Flt4 cDNA序列的預期結構。這兩個構建體產(chǎn)生的蛋白質區(qū)別在于其C-末端長鏈形式含有額外的65個氨基酸。轉染2天后，裂解細胞并使用針對含有預期Flt4蛋白短鏈形式的40個羧基末端氨基酸殘基(即，F(xiàn)lt4的短鏈和長鏈形式共有的部分)的GST-Flt4融合蛋白產(chǎn)生的抗體進行免疫沉淀。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析免疫沉淀的多肽。免疫前的血清沒有顯示出任何特異性帶，而Flt4-特異性抗體識別大約170和190KD的兩條帶。這兩條帶代表Flt4蛋白的不同糖基化形式。
實施例4Flt4在NIH3T3細胞中的表達材料和方法將全長Flt4 cDNA(短鏈形式)亞克隆進含有莫洛尼鼠類白血病毒長末端重復啟動子的LTRpoly載體(參見Makela，等，Gene，118293-294(1992)，公開了質粒載體pLTRpoly，具有ATCC保藏號77109和GeneBank登錄號X60280)中。該LTR-FLT4表達載體與pSV2neo標記質粒用于共轉染NIH3T3細胞，分析G418抗性克隆的Flt4表達。
對于Western免疫印跡分析，將一個匯合的大平板上的細胞在2.5％SDS，125mM Tris，pH6.5中裂解。細胞溶胞產(chǎn)物在SDS-PAGE上電泳并電印跡到硝酸纖維素膜上。用針對Flt4羧基末端肽產(chǎn)生的抗血清溫育膜，并使用辣根過氧化物酶偶連的豬抗兔抗血清(Dako)和ECL試劑(Amersham)觀察結合的抗體。對于代謝標記，用100μCi/ml35S-甲硫氨酸標記培養(yǎng)物1小時。標記后，洗滌細胞兩次并在其生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)1或2小時，裂解，用抗-Flt4抗體免疫沉淀，并通過SDS-PAGE和自動熒光術分析。
結果在Flt4短鏈形式轉染的NIH3T3細胞中可檢測到170和190KD的多肽，但在僅用pSV2neo轉染的細胞中沒有。除了這兩條帶外，在產(chǎn)生Flt4的克隆中觀察到大約120Kd的主要帶。代謝標記和脈沖追蹤實驗表明作為Flt4多肽短鏈形式的翻譯后加工的結果產(chǎn)生該蛋白質。
實施例5Flt4基因座的染色體定位由于已經(jīng)觀察到一些III型受體基因的聚集，因此測定Flt4的染色體定位具有重大意義。因此，分析了嚙齒類-人雜交細胞，表明Flt4與人5號染色體連鎖。
使用攜帶部分5號染色體的雜交細胞確定了Flt4基因位于5q33-＞5qter區(qū)。通過濾膜雜交檢驗這些雜交細胞中Flt4基因座的存在。Flt4-陽性雜交細胞共有的且在Flt4-陰性雜交細胞中不存在的5號染色體區(qū)域是5q33.1-qter。因此在雜交細胞中人染色體5q33-qter與Flt4序列的存在相關。該區(qū)域定位結果表明Flt4基因座與CSF1R/血-小板衍生生長因子受體-β(PDGFRB)基因座以及與β-腎上腺素能受體(ADRBR)基因座遠端聚集(telomeric)，因為這些基因座均存在于Flt4陰性的雜交細胞GB13中。
實施例6Flt4 mRNA在腫瘤細胞系和內(nèi)皮細胞中的表達用于本試驗的白血病細胞系(K562)在一些以前的文獻中已有報導；[Lozzio等，Blood，45321-334(1975)]，HL-60[Collins等，Nature，270347-349(1977)]，HEL[Martin等，Science，2161233-1235(1982)]，DAMI[Greenberg等，Blood，721968-1977(1988)]，MOLT-4[Minowada等，J.Natl.Cancer Inst.，49891-895(1972)]，Jurkat[Schwenk等，Blut，31299-306(1975)]，U937[Sundstrom等，Int.J.Cancer，17565-577(1976)]，KG-1[Koeffler等，Science，2001153-1154(1978)]，JOK-1[Andersson等，1982，見R.F.Revoltella(編)，Expression of Differentiated Functions in Cancer Cells，239-245，Raven Press，紐約]和ML-2[Gahmberg等，1985，見L.C.Anderson，等(編)，Gene Expression During Normal and Malignant Differentiation，107-123，Academic Press，London]。還分析了從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得的下列腫瘤細胞系JEG-3，絨毛膜癌；A204，橫紋肌肉瘤；SK-NEP-1，腎胚細胞瘤；BT-474，乳腺癌；Y79，成視網(wǎng)膜細胞瘤。白血病細胞在含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素的RPMI中生長。Dami細胞在含有10％馬血清的Iscove′s改良的DMEM中培養(yǎng)。通過融合第一代人臍靜脈內(nèi)皮細胞與A549肺癌細胞獲得的永久內(nèi)皮雜交細胞系(EAhy926)[Edgell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，503734-3737(1983)]在含有10％FCS和抗生素的DMEM-HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
按[Sambrook等，見上文]所述從該細胞系提取Poly(A)+RNA。5μg的Poly(A)+RNA樣品在含有甲醛的瓊脂糖凝膠中電泳并使用標準條件印跡[Sambrook等，見上文]。Flt4 cDNA克隆的插入片斷通過隨機引物方法標記并與該印跡雜交。雜交在50％甲酰胺，5x Denhardt′s溶液(100x Denhardt′s溶液是Ficoll，聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白各2％)，5x SSPE(3M NaCl，200mM NaH2PO4·H2O，20mM EDTA，pH7.0)，0.1％SDS(十二烷基磺酸鈉)，和0.1mg/ml超聲處理的鮭精DNA中42℃下18-24小時。濾膜在1x SSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7.0)，0.1％ SDS中65℃下洗滌并用柯達XAR-5膠片曝光。
用從8個白血病細胞系(HEL，K562，DAMI，U937，MOLT4，HL60，Jurkat，和KG-1)和內(nèi)皮雜交細胞系(EAhy926)提取的poly(A)+RNA進行Northern分析。用GAPDH探針進行的雜交用作內(nèi)部對照用于上樣等量的RNA進行分析。只有HEL紅白血病細胞，和DAMI成巨核細胞白血病細胞表達5.8kb和4.5kb的Flt4 mRNA。K562紅白血病，Jurkat和MOLT-4 T-細胞白血病，以及HL-60前髓細胞白血病，U937單核細胞白血病，和KG-1髓細胞樣白血病細胞為Flt4 mRNA陰性。
用從5個腫瘤細胞系(JEG-3，A-204，SK-NEP-1，BT-474，和Y79)和兩個上述白血病細胞系(JOK-1，MOLT4)提取的poly(A)+RNA進行Northern分析。標記的S2.5 cDNA克隆(見圖1)用作雜交探針。用β-肌動蛋白探針進行的雜交用作內(nèi)部對照用于上樣等量的RNA進行分析。只有SK-NEP-1nefroblastoma和Y79成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞觀察到含有Flt4轉錄子。
用載體(-)或視黃酸(+)處理10天后分析Tera-2畸胎癌細胞以誘導神經(jīng)元分化[Thompson等，J.Cell Sci.，7237-64(1984)]。在對從該細胞分離的poly(A)+RNA進行的Northern印跡分析中，發(fā)現(xiàn)未分化的細胞表達5.8kb和4.7kb的Flt4 mRNAs，但在分化10天后，在Northern印跡和雜交中檢測不到Flt4 mRNA。這些結果表明在這些細胞的分化期間減量調節(jié)Flt4。
在未分化的和TPA-分化的HEL細胞中也分析了Flt4 mRNA的表達。HEL和DAMI細胞系都具有雙重成紅細胞/成巨核細胞表型且可通過用腫瘤促進劑12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)處理誘導成巨核細胞標記的進一步表達。我們分析了在其分化期間在這些細胞中是否刺激Flt4的表達。用TPA或用于溶解它的DMSO處理2天后分析HEL細胞。剝離Flt4信號后，用Rb-1和β-肌動蛋白cDNAs探測該濾膜以證實泳道的均等上樣。根據(jù)放射自顯影的光密度計掃描分析和相對于GAPDH基因的組成型表達的標準化(normalization)，測定了在TPA誘導的HEL細胞中，當該細胞進行成巨核細胞分化時Flt4 mRNA水平增加大約3.4倍。
實施例7胎兒肺中的Flt4表達在原位雜交中在芬蘭中央醫(yī)院大學和Turku大學的聯(lián)合倫理委員會的許可下獲得了15周年齡的人胎兒肺組織。該樣品在4℃下在10％的福爾馬林中固定18小時，脫水，包埋于蠟中，并切成6μm的切片。使用SP6和T7聚合酶和[35S]-UTP從線形化質粒DNA中產(chǎn)生206和157個堿基(反義和有義)的RNA探針。按照Wilkinson等，Development，99493-500(1987)；Wilkinson，Cell，5079-88(1987)所述對切片進行原位雜交，使用下列改良1)在石蠟包埋前使用二甲苯代替甲苯；2)切成6μm的切片，放在用2％3-氨丙基-三乙氧基甲硅烷(Sigma)預處理的載玻片表面的二乙基焦碳酸酯處理的水層上；3)省去對該探針的堿性水解；4)雜交混合物含有60％的去離子甲酰胺；5)高度嚴格條件洗滌是在含有50mM DTT和1x SSC的溶液中在65℃下80分鐘；6)該切片用NTB-2乳劑(Kodak)覆蓋且在4℃下儲存。曝光14天后，載玻片在柯達D-19顯影劑中顯影2.5分鐘并用Unifix(柯達)固定5分鐘。切片用溶于水中的蘇木精染色。
在使用反義探針的雜交試驗中，主要在15周年齡的胎兒肺的某些內(nèi)皮細胞中觀察到Flt4 mRNA。用有義鏈探針和用RNAse A-處理的切片進行的對照雜交中未產(chǎn)生超出背景的信號。
對于免疫過氧化物酶染色，使用1∶100稀釋的抗-Flt4抗體，過氧化物酶偶連的豬抗-兔抗體和本領域的標準方法。用免疫前的血清或免疫原封閉的血清的對照染色未產(chǎn)生信號。分析了17周年齡的人胎兒肺組織，結果與原位雜交實驗中的那些mRNA一致某些肺大血管的內(nèi)皮用兔抗-Flt4抗血清染色為陽性。
實施例8在非人哺乳動物物種中鑒定Flt4基因在圖4中，顯示了在不同物種DNA中檢查Flt4序列存在的實驗結果。為了揭示Flt4基因在進化中的保守程度，將2.5kb的cDNA片斷(見圖1)與從不同動物和酵母中純化且用EcoRI消化的基因組DNAs雜交。該雜交溶液包含50％的甲酰胺，5x Denhardt′s溶液(100x Denhadt′s溶液是Ficoll，聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白各2％)，5x磷酸鈉鹽溶液-EDTA(3M NaCl，200mM NaH2PO4-H2O，20mM EDTA，pH7.0)，0.1％十二烷基磺酸鈉，和0.1mg/ml超聲處理的鮭精DNA。在42℃下進行雜交24小時。濾膜在1x標準檸檬酸鹽溶液(150mM NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7.0)和0.1％十二烷基磺酸鈉中65℃下洗滌且用柯達XAR-5膠片曝光。在猴，大鼠，小鼠，狗，奶牛，兔，和雞DNAs中發(fā)現(xiàn)了特異性帶，但酵母DNA未產(chǎn)生信號。從鵪鶉中已經(jīng)分離出Flt4 cDNA。參見Eichmann等，Gene，174(1)3-8(1996年9月26日)和Genbank登錄號X83287。
實施例9Flt4基因在成人組織中的表達使用心臟，腦，胎盤，肺，肝臟，骨骼肌，腎和胰腺組織的2μgpoly(A)+RNA(Multiple Tissue Northern Blot，Clontech Inc.)通過與Flt4 cDNA探針雜交分析成人組織中的Flt4 mRNA表達。用組成型表達的基因的探針進行的對照雜交顯示出泳道均勻上樣。
各種人組織的poly(A)+RNA與Flt4 cDNA片斷的雜交顯示出在胎盤，肺，心臟和腎中有5.8和4.5kb遷移率的mRNA帶和6.2kb的微弱標記帶。在肝臟和骨骼肌中可見微弱的mRNA帶，而胰腺和腦中即使含有Flt4 RNA，也似乎含量極少。
實施例10人胎兒組織中的Flt4表達為了檢查人胎兒組織中的Flt4 mRNA表達，將含有來自16-19周人胎兒的下列組織的總RNA的Northern印跡與1.9kb Flt4 cDNA片斷(見圖1)雜交且所得的放射自顯影用光密度計掃描。從相應的溴化乙錠(EtBr)染色凝膠的紫外照片估計RNA的量對該結果進行標準化。下列符號表示依次遞增的mRNA水平-，+，++，+++。
表1胎兒組織mRNA腦腦膜 +皮層板++中間帶+++室管膜區(qū) +小腦 ++脈絡叢+肝臟 +胰腺 +小腸 -心臟 +肺+++腎++腎上腺++皮膚 ++脾臟 +++胸腺 -人胎兒組織的分析表明除了胸腺和小腸外均含有Flt4轉錄子。在肺和脾臟中發(fā)現(xiàn)最高的表達水平。
實施例11Flt4表達載體全長Flt4 cDNA(短鏈形式)通過如下方式產(chǎn)生a)將SphI-裂解的Flt4 PCR片斷[使用引物寡核苷酸5′-ACATGCATGCCACCATGCAGCGGGGCGCCGCGCTGTGCCTGCGACTGTGGCTCTGCCTGGGACTCCTGGA-3′(SEQ.IDNO.7)(正向)和5′-ACATGCATGCCCCGCCGGTCATCC-3′(反向)(SEQ.IDNO.8)從S2.5kb克隆(見圖1)擴增]連接到S2.5kb片斷的5’端，使用兩個SphI位點亞克隆進pSP73載體(Promega)；b)將用寡核苷酸引物5′-CGGAATTCCCCATGACCCCAAC-3′(SEQ.ID NO.9)(正向)和5′-CCATCGATGGATCCTACCTG AAGCCGCTTTCTT-3′(SEQ.ID NO.10)(反向)從0.6kb EcoRI片斷(見圖1)擴增的含有最后138個堿基的PCR片斷使用EcoRI和BamHI位點連接到構建體a)的3’端；c)在構建體b)的EcoRI位點連接1.2kb的EcoRI片斷；d)將所得的全長HindIII-BamHI片斷連接進HindIII-BamHI裂解的SV-poly表達載體[Stacey等，Nucl.Acids Res.，182829(1990)]中。
實施例12Flt4配體的鑒定在不含胎牛血清(FBS)的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天的PC-3前列腺癌細胞系(ATCC CRL 1435)中得到的條件培養(yǎng)基通過以16,000xg離心20分鐘澄清并篩選誘導Flt4酪氨酸磷酸化的能力。
將重組表達Flt4的NIH3T3-細胞(見實施例13)再接種到5cm直徑的細胞培養(yǎng)皿上并在含有10％胎牛血清和抗生素的Dulbecco′s改良極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中生長至匯合。匯合細胞在磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌兩次并在DMEM/0.2％牛血清白蛋白中饑餓過夜。為了進行刺激，用1ml條件培養(yǎng)基代替饑餓培養(yǎng)基且細胞在37℃下培養(yǎng)5分鐘。
用PC-3條件培養(yǎng)基刺激后，將含有該細胞的培養(yǎng)板放在冰上并用含有100mM NaVO4的Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl洗滌兩次。從培養(yǎng)皿上去掉該洗滌溶液并在含有抑肽酶，1mM PMSF和1mM NaVO4的RIPA緩沖液[10mM Tris-HCl pH7.5，50mM NaCl，0.5％脫氧膽酸鈉，0.5％ Nonidet P40，0.1％十二烷基磺酸鈉(SDS)]中裂解該細胞，超聲處理該溶胞產(chǎn)物10秒兩次。然后以16,000xg離心該溶胞產(chǎn)物30分鐘，將上清轉移到新試管中并用于免疫沉淀。
抗Flt4 C-末端的多克隆抗體(上文所述)可用于免疫沉淀。將細胞溶胞產(chǎn)物的上清用2至4μl兔多克隆抗-Flt4抗血清在冰上溫育2小時。加入大約30μl50％(vol/vol)的蛋白質A-Sepharose(Pharmacia)的PBS溶液，在+4℃旋轉條件下繼續(xù)溫育45分鐘。用RIPA緩沖液洗滌免疫沉淀3次并用PBS洗滌一次。然后在7.5％凝膠中對免疫沉淀進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并印跡到硝酸纖維素膜上。用單克隆抗磷酸酪氨酸抗體(anti-P-Tyr)(1∶2000稀釋的PT-66 Sigma，cat.P-3300)溫育Western印跡，接著用過氧化物酶偶連的兔抗小鼠抗體(1∶1000稀釋，Dako，cat.P 161)使用化學發(fā)光檢測系統(tǒng)(Amersham)進行檢測。在有些情況下，在50℃的100mM 2-巰基乙醇，2％ SDS，62.5mM Tris-HCl pH6.7中偶爾攪拌的條件下剝離印跡30分鐘以清除以前的信號并用抗-Flt4抗體(1∶1000稀釋)再染色，接著用過氧化物酶偶連的豬抗兔抗體(1∶1000稀釋，Dako，P217)染色。作為Flt4的酪氨酸磷酸化的陽性對照，使用以100mM酪氨酰磷酸酶抑制劑過釩酸鈉(PerVO4)處理20分鐘的表達Flt4的NIH3T3細胞的抗-Flt4免疫沉淀。通過向細胞培養(yǎng)基中加入100mM(終濃度)的正釩酸鈉和2mM(終濃度)的過氧化氫并在37℃下5％CO2中培養(yǎng)細胞20分鐘進行細胞的過釩酸鈉處理。該操作導致產(chǎn)生釩酸鹽的過氧化形式(氧釩基氫過氧化物)，它是活細胞中蛋白質酪氨酸磷酸酶的非常有效的抑制劑。
PC-3細胞的條件培養(yǎng)基刺激120kD多肽的酪氨酸磷酸化，該多肽與Flt4的酪氨酸磷酸化的加工后的成熟形式共同遷移。用抗-Flt4抗體再染色印跡后可證實該共同遷移。
為了證實120kD多肽不是該條件培養(yǎng)基的非特異性成份，通過SDS-PAGE分離15ml的條件培養(yǎng)基，印跡到硝化纖維素上，并用anti-P-Tyr抗體染色印跡。檢測到一些多肽，但它們中沒有一個與Flt4共同遷移，表明120kD帶確實是從刺激細胞免疫沉淀的酪氨酸磷酸化蛋白。通過用肝素瓊脂糖CL-6B(Pharmacia)在室溫下預處理2小時的PC-3條件培養(yǎng)基的刺激分析(泳道3)表明Flt4配體不與肝素結合。
非條件培養(yǎng)基不誘導Flt4自身磷酸化。另外，未轉染的NIH3T3細胞和用FGFR-4轉染的NIH3T3細胞用來自PC-3細胞的條件培養(yǎng)基刺激時都沒有表現(xiàn)出120KD多肽的酪氨酸磷酸化。當使用Centricon-10濃縮器(Amicon)將PC-3條件培養(yǎng)基濃縮4倍時刺激活性大量增加。另外，濃縮后獲得的流走液含有分子量不超過10,000(＜10,000)的蛋白質，不能刺激Flt4的磷酸化。用50ml偶連到CNBr-活化的瓊脂糖上的Flt4胞外域(Flt4EC-6xHis，見下文)(1mg/ml)按廠商的指導預處理PC-3細胞的濃縮條件培養(yǎng)基完全消除Flt4的酪氨酸磷酸化。用瓊脂糖CL-4B同樣預處理該條件培養(yǎng)基不影響其刺激活性。
這些數(shù)據(jù)證實PC-3細胞產(chǎn)生Flt4的可溶性配體。上述實驗證實了該配體與重組Flt4 EC結構域結合。因此，可使用重組Flt4 EC結構域在親和色譜中純化該配體。純化的蛋白質可在SDS-PAGE中電泳，印跡到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上并通過本領域的標準方法可測定其氨基末端序列。另外，可將純化的配體消化成肽用于其氨基末端序列的測定。從該純化的蛋白質獲得的肽序列用于合成編碼該序列的寡核苷酸的混合物?？煞派湫詷擞浽摴押塑账峒捌浠パaDNA鏈配對物并用于篩選從PC-3細胞制備的cDNA文庫以獲得編碼該配體的cDNA，這些都通過本領域的標準方法進行(Wen等，Cell 69559-572(1992))。作為選擇，該寡核苷酸及其配對物可用作聚合酶鏈式反應(PCR)中的引物以便使用從PC-3細胞RNA制備的cDNA作模板擴增編碼該配體的序列。該cDNA合成和PCR(RT-PCR)的方法是本領域的標準方法(Innis等，1990，PCR protocols，Academic Press；McPherson，M.J.等，1991，PCR，a practical approach，IRL Press；Partanen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，878913-8917(1990))。另一選擇是通過使用克隆進真核表達載體(例如，使用提供的Invitrogen Librarian克隆試劑盒和載體，例如pcDNA I或pcDNA III)的cDNAs并用Flt4-堿性磷酸酶(Cheng和Flanagan，Cell，79157-168，(1994))，F(xiàn)lt4-免疫球蛋白(Flt4-Ig)(Lyman等，Cell，751157-1167(1993))，或相似的親和試劑通過本領域的標準方法篩選轉染進例如，COS細胞的該文庫從PC-3細胞克隆Flt4配體。
實施例13細胞系和轉染NIH3T3細胞和293-EBNA細胞(Invitrogen)在含有10％ FCS的DMEM中培養(yǎng)。為了穩(wěn)定表達，用LTR-FLT41載體與pSV-neo載體(見上文實施例4)一起通過使用DOTAP轉染試劑(Boehringer-Mannheim)的脂轉染法轉染NIH3T3細胞，其中Flt4 cDNA在莫洛尼鼠類白血病毒LTR啟動子的控制下表達。COS-1細胞通過DEAE葡聚糖方法(McClutchan和Pagano，J.Natl.Cancer Inst.，41351-35(1968))轉染。轉染細胞在500mg/ml新霉素中選擇。
實施例14Flt4融合蛋白的構建和表達pVTBac-FLT4EC-6xHis融合構建體。編碼Flt4的cDNA末端修飾如下編碼胞外域(EC)的Flt4 cDNA序列3’端使用寡核苷酸5′-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3′(SEQ ID NO13，SalI位點下劃線，含有相應于SEQ ID NO1的核苷酸2184-2204的序列)和編碼用于結合Ni-NTA柱(Qiagen，Hilden，Germany)的6個組氨酸殘基和接著的終止密碼子的5′CGCGGATCCCTAGTGATGGTGATGGTGATGTCTACCTTCGATCATGCTGCCCTTATCCTC-3′(SEQ ID NO14，BamHI位點下劃線，含有與SEQ ID NO1的核苷酸2341-2324互補的序列)進行擴增。該擴增的片斷用SalI和BamHI消化并作為SalI-BamHI片斷連接進LTR-FLT41載體(見實施例4)，代替含有編碼Flt4跨膜和胞質結構域的序列的單一SalI-BamHI片斷。
無Flt4信號序列編碼區(qū)的Flt4 cDNA 5’端使用寡核苷酸5′-CCCAAGCTTGGATCCAAGTGGCTACTCCATGACC-3′(SEQ ID NO11，HindIII和BamHI位點下劃線，含有相應于SEQ ID NO1的核苷酸86-103的序列)和5′-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3′(SEQ ID NO12，含有與SEQ ID NO1的核苷酸700-681互補的序列)通過PCR擴增。該擴增片斷(含有SEQ ID NO1的核苷酸86-700)用HindIII和SphI消化(相應于SEQ ID NO1的核苷酸588-593的SphI位點在Flt4 cDNA的擴增區(qū)內(nèi))。
所得的HindIII-SphI片斷用于代替剛在上文所述的修飾的LTR-FLT41載體中的HindIII-SphI片斷(HindIII位點在Flt4插入片斷與該載體的pLTRpoly部分的接頭5’端，SphI位點在Flt4 cDNA中且相應于SEQ ID NO1的核苷酸588-593)。然后所得的Flt4EC-6xHis插入片斷作為BamHI片斷連接進pVTBac質粒的BamHI位點(Tessier等，Gene 98177-183(1991))。該構建體與桿狀病毒基因組DNA一起通過脂轉染法轉染進SF-9細胞。產(chǎn)生重組病毒并用于感染High-Five細胞(Invitrogen)。
Flt4-AP融合構建體。編碼Flt4 EC結構域的序列的3’端使用寡核苷酸5′-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3′(SEQ ID NO15)和5′-CGGGATCCCTCCATGCTGCCCTTATCCT-3′(SEQ ID NO16)進行擴增并作為SalI-BamHI片斷連接進LTR-FLT41載體，代替編碼跨膜和胞質結構域的序列。然后所得的插入片斷作為HindIII-BamHI片斷連接進質粒APtag-1的HindIII-BglII位點，位于堿性磷酸酶編碼區(qū)的閱讀框中(Flanagan和Leder，1990，Cell63，185-194)。用該Flt4-AP構建體和pSV2neo(Southern和Berg，J.Mol.Appl.Genet.1327-341(1982))通過使用DOTAP轉染試劑(Boehringer)的脂轉染法共轉染NIH3T3細胞并在500mg/ml新霉素存在下選擇轉染細胞。通過染色堿性磷酸酶活性的比色反應檢測生產(chǎn)進該培養(yǎng)基中的重組蛋白(Cheng和Flanagan，Cell 79.157-168(1994))。
Flt4-Ig構建體。編碼Flt4-免疫球蛋白嵌合體的重組DNA構建如下。編碼Flt4的cDNA 5’端，包括編碼信號序列的Flt4核苷酸使用引物5′-GGCAAGCTTGAATTCGCCACCATGCA GCGGGGCGCC-3′(SEQ ID NO17)和5′-GTTGCCTGTGAT GTGCACCA-3′(SEQ ID NO18)通過PCR進行擴增并作為HindIII-SphI片斷連接進LTR-FLT41載體。Flt4 EC-編碼序列的3’端使用寡核苷酸5′-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3′(SEQ ID NO19)和5′-CGCGGATCCAAGCTTACTTACCTTCCATGCT GCCCTTATCCTCG-3′(SEQ ID NO20)進行擴增并作為SalI-BamHI片斷連接進LTR-FLT41載體代替編碼跨膜和胞質結構域的序列。含有剪接供體位點的該Flt4 EC插入片斷首先連接進含有編碼人免疫球蛋白重鏈鉸鏈的外顯子和恒定區(qū)外顯子的pHγCE2(Karjalainen，K.，TIBTECH，9109-113(1991))中。然后將含有Flt4-Ig嵌合體的EcoRI-BamHI插入片斷通過本領域的標準方法(Klenow)鈍端化并連接進pREP7(Invitrogen)的鈍端化HindIII位點中。將該構建體通過磷酸鈣沉淀法轉染進293-EBNA細胞中且該條件培養(yǎng)基用于通過蛋白質A-瓊脂糖親和色譜法分離Flt4-Ig蛋白質。
實施例15-17Flt4配體的純化和測序在血清耗盡條件下由PC-3細胞產(chǎn)生的細胞培養(yǎng)物上清使用Centriprep過濾筒濃縮30-50倍并上樣到固定Flt4胞外域的柱子上。使用可供選擇的構建體和方法制備兩種親和性基質。在第一種情況下，F(xiàn)lt4EC-6xHis融合蛋白與CNBr-活化的瓊脂糖4B(Pharmacia)交聯(lián)，在第二種情況下，F(xiàn)lt4-Ig融合蛋白與蛋白質A瓊脂糖使用二甲基庚二酸(dimethylpimelidate)偶連(Schneider等，1982，J.Biol.Chem.25710766-10769)。從親和柱上洗脫的物質使用離子交換和反相高壓色譜法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進一步純化。檢驗色譜餾分刺激Flt4的酪氨酸磷酸化的能力。微量測序純化的生物學活性配體蛋白并根據(jù)獲得的氨基酸序列制備簡并寡核苷酸用于從例如，PC-3細胞分離的poly(A)+RNA產(chǎn)生的cDNA文庫中分離和克隆編碼該配體的cDNA。
命名為血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)的Flt4配體的詳細鑒定，以及天然人，非人哺乳動物，和鳥類編碼VEGF-C的多核苷酸序列，和VEGF-C變異體和類似物在1998年2月2日申請的國際專利申請?zhí)朠CT/US98/01973(作為國際公開號WO 98/33917于1998年8月6日公開)；Joukov等，J.Biol.Chem.，273(12)6599-6602(1998)；Joukov等，EMBO J.，16(13)3898-3911(1997)；和在1996年8月1日申請的國際專利申請?zhí)朠CT/FI96/00427(作為國際公開號WO 97/05250公開)中提供，本文引用所有這些文獻以其整體作為參考。正如其中的詳細說明，人VEGF-C開始作為419個氨基酸的prepro-VEGF-C多肽在人細胞中產(chǎn)生。人prepro-VEGF-C的氨基酸序列在SEQ ID NO21中提供，且編碼人VEGF-C的cDNA根據(jù)布達佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209(USA)(保藏日期為1995年7月24日且ATCC保藏號為97231)。其它物種的VEGF-C序列也有報導。例如，見Genbank登錄號MMU73620(Mus musculus)；和CCY15837(Coturnix coturnix)，本文引用以供參考。
prepro-VEGF-C多肽在多個階段中加工以產(chǎn)生大約21-23KD(通過在還原條件下的SDS-PAGE估計)的成熟且最有活性的VEGF-C多肽。該加工包括裂解信號肽(SEQ ID NO21，殘基1-31)；裂解羧基末端肽(大約相應于SEQID NO21的氨基酸228-419且具有Balbiani環(huán)3蛋白質(BR3P)序列的間隔半胱氨酸殘基痕跡的模式[Dignam等，Gene，88133-40(1990)；Paulsson等，J.Mol.Biol.，211331-49(1990)])以產(chǎn)生大約29KD的部分加工形式；裂解(明顯在細胞外)氨基末端肽(大約相應于SEQ ID NO21的氨基酸32-103)以產(chǎn)生大約21-23kD的完全加工后的成熟形式。實驗證據(jù)證實VEGF-C的部分加工后的形式(例如，29kD的形式)能結合Flt4(VEGFR-3)受體，而與VEGFR-2的高親和力結合僅與VEGF-C的完全加工后形式發(fā)生。似乎VEGF-C多肽天然相聯(lián)成非二硫化鍵連接的二聚體。
另外，已證實SEQ ID NO2的氨基酸103-227對于維持VEGF-C的功能不都是關鍵性的。由SEQ ID NO2的氨基酸113-213(且不含殘基103-112和214-227)組成的多肽保留結合和刺激VEGF-C受體的能力，預期跨越從大約殘基131到大約殘基211的多肽將保留VEGF-C的生物學活性。已表明在156位置的半胱氨酸殘基對于VEGFR-2的結合能力是重要的。然而，VEGF-CΔC156多肽(即，由于缺失或取代而缺少該半胱氨酸的類似物)仍是VEGFR-3的有效激活劑。SEQ ID NO2中165位置的半胱氨酸對于結合任一受體是必需的，而在83或137位置缺少半胱氨酸的類似物與天然VEGF-C競爭結合兩種受體并刺激兩種受體。
人VEGF-C與來自其它物種的VEGF-C的序列對比(使用任一普遍接受的序列對比算法進行)顯示了可導入修飾(例如，插入，取代，和/或缺失)而不破壞VEGF-C的生物學活性的其它殘基。在對比排列的兩個或多個物種的VEGF-C多肽上具有不同的氨基酸，特別是具有不同化學特性的側鏈的不同氨基酸的任一位置很可能是容許修飾而同時不消除功能的位置。人，鼠和鵪鶉VEGF-C的一個舉例性的序列對比在PCT/US98/01973的圖5中提供。
除了上述因素外，應明白可對野生型VEGF-C序列進行無數(shù)的保守氨基酸取代，這樣，特別是如果該取代的數(shù)目較小時，很可能導致多肽保留VEGF-C的生物學活性?！氨Ｊ匕被崛〈笔侵赣镁哂邢嗨苹瘜W特性的側鏈的氨基酸進行的氨基酸取代。進行保守取代的相似氨基酸包括具有酸性側鏈(谷氨酸，天冬氨酸)；堿性側鏈(精氨酸，賴氨酸，組氨酸)；極性酰胺側鏈(谷氨酰胺，天冬酰胺)；疏水脂肪族側鏈(亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，丙氨酸，甘氨酸)；芳香側鏈(苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)；小側鏈(甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甲硫氨酸)；或脂肪族羥基側鏈(絲氨酸，蘇氨酸)的那些氨基酸。也包含不破壞VEGF-C生物學活性的一個或幾個內(nèi)部氨基酸的添加或缺失。
從前面所述可預期許多VEGF-C多肽和變異體以高親和力結合Flt4(VEGFR-3)，因此它們可在涉及使用Flt4結合化合物造影或篩選組織樣品的本發(fā)明方面中用作Flt4結合化合物。特別有利的是含有減小或消除VEGFR-2結合親和性以便所得的多肽對VEGFR-3結合特異性增加的改變的VEGF-C形式。如上所述，該改變包括Cys156的缺失或取代，它基本上消除了VEGFR-3結合親和性，或者破壞天然prepro-VEGF-C蛋白酶解加工位點的氨基酸序列改變(因為完全加工后的VEGF-C具有最高的VEGFR-2親和性)。另外，修飾成保留Flt4結合親和性但不能激活Flt4自身磷酸化的VEGF-C分子在本文所述的治療方法中是有用的Flt4拮抗劑。從上述教導顯而易見的還有本文所述的Flt4配體可用于測定法中作為一種另外的標記以便證實人Flt4等位基因變異體的身份，和證實與本文教導的Flt4序列具有同源性的非人基因序列(參見，例如，實施例8和圖4)事實上是Flt4的非人相應物。prepro-VEGF-C推定的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO21提供。
命名為血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)的第二種Flt4配體的詳細描述，以及編碼VEGF-D的人多核苷酸序列，和VEGF-D變異體和類似物在申請日為1997年8月21日且作為國際公開號WO 98/07832于1998年2月26日公開的國際專利申請?zhí)朠CT/US97/14696；和Achen，等，Proc.Nat′l Acad.Scu.U.S.A.，95(2)548-553(1998)中提供，也在本文中引用以供參考。正如其中的詳細說明，人VEGF-D首先作為354個氨基酸的prepro-VEGF-D多肽在人細胞中產(chǎn)生。prepro-VEGF-D的cDNA和推定的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO22描述。來自其它物種的VEGF-D序列也有報導。參見例如，Genbank登錄號D89628(Mus musculus)；和AF014827(Rattus norvegicus)，本文引用以供參考。
prepro-VEGF-D多肽具有21個氨基酸的推定信號肽且以與prepro-VEGF-C的加工類似的方式明顯通過蛋白酶解加工。缺少SEQ ID NO22的殘基1-92和202-354的“重組成熟”VEGF-D保留激活受體VEGFR-2和VEGFR-3的能力，且似乎作為非共價相連的二聚體締合。VEGF-D多肽作為本發(fā)明的Flt4結合化合物的用途與上文對VEGF-C所述類似。同樣，預期對VEGF-D的類似改變(除去VEGF同源性結構域中8個保守半胱氨酸的第二個，即Cys136，或除去蛋白酶解加工位點)將導致多肽的VEGFR-2結合親和性降低或消失，從而增加Flt4的特異性。修飾成保留Flt4結合親和性但不能激活Flt4自身磷酸化的VEGF-D分子在本文所述的治療方法中是有用的Flt4拮抗劑。
實施例18小鼠Flt4 cDNA探針的克隆來自129SV小鼠的λFlXII基因組文庫(Stratagene)的大約106個噬斑用覆蓋胞外域的上述S2.5人Flt4受體cDNA片斷進行篩選。也參見Pajusola等，Cancer Res.，525738(1992)。從陽性噬斑亞克隆2.5kb的BamHI片斷并從兩端測序。從該亞克隆，使用聚合酶鏈式反應擴增一個覆蓋小鼠Flt4cDNA序列的核苷酸1745-2049的外顯子片斷并克隆進pBluescript KSII+/-載體(Stratagene)。參見Finnerty等，Oncogene，82293(1993)。
同樣克隆覆蓋核苷酸1-192的第二個片斷。
實施例19小鼠組織中Flt4 mRNA的分析按照Chomczynski等，Anal.Biochem.，162156(1987)所述從發(fā)育中的胚胎(交配后8-18天和年齡為1天的小鼠)中分離總RNA。來自交配后8天的胚胎樣品也包括胎盤。
對于Rnase保護分析，使用[32P]-UTP和用于反義方向的T7聚合酶從實施例18獲得的線型化鼠類Flt4質粒產(chǎn)生RNA探針。所用的β-肌動蛋白探針相應于公開的小鼠β-肌動蛋白序列的核苷酸1188-1279。參見Tokunaga，等，Nucleic.Acid.Res.，142829(1986)。在6％聚丙烯酰胺/7M尿素凝膠中純化后，將標記的轉錄子與30μg總RNA在52℃下雜交過夜。未雜交的RNA用RNase A(10 U/ml)和T1(1mg/ml)在37℃，pH 7.5下消化1小時。Rnases通過蛋白酶K在37℃下消化15分鐘滅活且該樣品在6％聚丙烯酰胺/7M尿素凝膠中分析。
在本實驗中分析的Flt4的表達模式表明從肺，肝臟，心，腎，骨骼肌和脾中獲得了極微弱的mRNA信號，而睪丸和腦明顯沒有特異性信號。通過Rnase保護試驗對在小鼠發(fā)育的不同時期中收集的一系列RNAs的分析表明在從交配后第8天到新出生的小鼠的整個胚胎發(fā)生中表達Flt4 mRNA，且信號強度無大的變化。
實施例20在小鼠胚胎中對Flt4的原位雜交為了更好地將Flt4轉錄子定位到細胞和組織上，將交配后7.5天和8.5天的小鼠胚胎切片與標記的Flt4 RNAs雜交。小鼠胚胎從CBA與NMRI小鼠的交配產(chǎn)生。通過頸脫位處死懷孕的小鼠且立即冷凍胚胎或者通過磷酸鹽緩沖液轉移進4％低聚甲醛中。胚胎和分離的小鼠器官在4℃下固定18小時，脫水，包埋于石蠟中，并切成6μm的切片。
192個和305個核苷酸的RNA探針(反義和有義)(見實施例18)使用[35S]-UTP從線形化質粒產(chǎn)生。對切片的原位雜交按照Wilkinson等，Development，99493(1987)；和Wilkinson等，Cell，5079(1987)所述進行，本文引用它們以供參考，并采用下列改良1)在石蠟包埋前使用二甲苯代替甲苯；2)切成6μm的切片，放在用2％3-三乙氧基甲硅烷基丙胺預處理的載玻片表面的二乙基焦碳酸酯處理的水層上；3)省去對該探針的堿性水解；和4)高度嚴格洗滌是在含有30mM DTT和1x SSC的溶液中在65℃下80分鐘。該切片用NTB-2乳劑(Kodak)覆蓋且在4℃下儲存。載玻片曝光14天，顯影，并用蘇木精染色。用有義鏈進行的對照雜交和RNAse A-處理的切片中未產(chǎn)生超出背景的特異性信號。
在交配后7.5天的小鼠胚胎中未檢測到Flt4 mRNA表達，但在發(fā)育的第8.5天在發(fā)育中的主動脈中檢測到明亮的信號。相反，發(fā)育中的卵黃囊為Flt4-陰性。在胚外組織中，在尿囊中顯著表達Flt4，而發(fā)育中的卵黃囊血島為陰性。另一方面，頭間充質的成血管細胞為強烈的Flt4-陽性。在發(fā)育中的胎盤中，首先在外周靜脈竇中可見Flt4信號。在交配后9.5天的胎盤中，靜脈竇內(nèi)皮和與Reichert′s膜部分融合的巨細胞表達Flt4 mRNA。
因此，盡管在最早的內(nèi)皮細胞前體，即成血管細胞中Flt4的表達非常顯著，但是似乎僅局限于交配后8.5天的胚胎的某些血管中。已知在發(fā)育中的小鼠胚胎的所有內(nèi)皮細胞中都表達Tie受體，因此為這些細胞提供了一個標記。參見Korhonen，等，Oncogene，8395(1993)；和Korhonen等，Blood.802548-2555(1992)。顯然，與Tie探針相反，F(xiàn)lt4探針與交配后11.5天的胚胎的動脈內(nèi)皮，例如與發(fā)育中的背主動脈或頸動脈內(nèi)皮雜交極弱。相反，F(xiàn)lt4信號在發(fā)育中的靜脈中更顯著得多。例如，在圍繞發(fā)育中的后腎的靜脈中檢測到Flt4信號，而Tie探針主要識別后腎內(nèi)的毛細血管。
觀察到Flt4 mRNA分布在交配后12.5天的小鼠胚胎的一些區(qū)域，特別是在腋區(qū)的擴張血管中特別顯著。在頸區(qū)的中部矢狀切片中可見相似的Flt4-陽性血管結構(數(shù)據(jù)未顯示)。表達Flt4的血管的血管叢樣方式出現(xiàn)在眶周區(qū)和圍繞發(fā)育中的脊椎。另外，位于發(fā)育中的皮膚正下方，有明顯的Flt4-陽性血管網(wǎng)。在包括發(fā)育中的大腦的一些區(qū)域獲得了較弱的毛細血管信號。在頸區(qū)小血管中，在發(fā)育中的鼻口部的小血管中和在發(fā)育中的舌基部以及在尾區(qū)也可檢測到Flt4 mRNA。另外，肝臟為點狀方式的Flt4 mRNA強陽性。
在進一步的發(fā)育期間，F(xiàn)lt4 mRNA似乎變得更局限于胚胎的某些血管。交配后14.5天的胚胎恰好表現(xiàn)出這種限制表達方式。在該胚胎的中間矢狀切片中，在其前面部分沿發(fā)育中的脊柱觀察到最顯著的Flt4信號。認為該信號來源于胸導管的內(nèi)皮細胞，胸導管是在該發(fā)育時期形成的最大淋巴管。相反，背主動脈和下腔靜脈為陰性。腸系膜區(qū)擴張的血管也是Flt4強陽性。另外，與交配后12.5天的胚胎一樣，沿眶周，下顎，以及頸區(qū)的解剖學邊界的血管網(wǎng)含有Flt4陽性內(nèi)皮。在圍心腔和在全部皮下組織中存在相似結構。顯然，與Flt4-陰性血管相反，所有Flt4-陽性血管在其腔內(nèi)沒有血細胞。這些表達方式表明Flt4變得局限于該發(fā)育時期的淋巴管內(nèi)皮。我們觀察到Flt4表達的另一位點在發(fā)育中的骨髓竇狀隙中。
也分析了交配后16.5天的胚胎胸腔上部的橫切面與Flt4探針的雜交。進行蘇木精-曙紅染色以觀察該區(qū)域的不同血管類型。它們包括頸動脈和頭臂動脈，靜脈腔，和胸導管，其中胸導管較小且沒有圍繞的肌肉和結締組織。在更高放大倍數(shù)下觀察到胸導管以及附近的小血管的內(nèi)皮細胞與Flt4探針雜交。
實施例21在培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞中分析Flt4 mRNA實施例20中所述的原位雜交結果表明在靜脈內(nèi)皮細胞及后來在淋巴管和一些靜脈內(nèi)皮細胞中表達Flt4，但在動脈內(nèi)皮中不表達。為了確定在體外是否維持該調控，我們使用Northern印跡和雜交分析研究了培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞。
從人主動脈，股靜脈，臍靜脈，和從包皮微血管分離內(nèi)皮細胞，培養(yǎng)并按本領域以前所述鑒定。參見Van Hinsberg等，Arteriosclerosis，7389(1987)；和Van Hinsberg，等，Thromb.Haemostas，57148(1987)。在5至8代(分裂比率為1∶3)后達到匯合密度時將它們用于分離多聚腺苷化RNA。
內(nèi)皮細胞系EA hy926(Edgell等，Proc.Natl.Acad.Sci.，803734-3737(1983))，BCE(Folkman等，Proc.Natl.Acad.Sci.，765217-5221(1979))和LEII(Schreiber等，Proc.Natl.Acad.Sci.，826138(1985))不表達Flt4。然而，培養(yǎng)的人微血管，靜脈和臍靜脈內(nèi)皮細胞為Flt4-特異性5.8和4.5kb mRNAs陽性，而主動脈內(nèi)皮細胞為陰性。相反，另一內(nèi)皮受體酪氨酸激酶基因Tie作為4.4kb mRNA在所有試驗的內(nèi)皮細胞類型中都表達。
實施例22成人組織中的Flt4 mRNA實施例20中獲得的結果表明Flt4 mRNA變得大部分局限于發(fā)育期間的淋巴管內(nèi)皮。由于該發(fā)現(xiàn)在人體中的潛在意義，我們還使用人Flt4探針研究了在成人組織中Flt4的表達。所用的人Flt4探針是覆蓋cDNA堿基對1-595(SEQ ID NO1)的EcoRI-SphI片斷。也參見Pajusola等，Cancer Res.，525738(1992)。Von Willebrand因子探針是覆蓋堿基對1-2334的EcoRI-HindIII片斷。Bonthron，等，Nucleic Acids Res.，1417125(1986)。
我們使用常規(guī)固定的材料進行了組織病理學診斷。正常肺組織從患有表皮樣癌的左側下肺葉切除術獲得。腸系膜和腸系膜淋巴結從患有結腸腺癌的患者獲得。鄰近唾液腺的正常淋巴結由于其異常大小而被摘除。來自兩個病人的扁桃體和兩個闌尾無診斷改變。研究的兩個淋巴管肌瘤和三個膽囊淋巴管瘤具有相似的結果。
對于人體組織，用10％福爾馬林固定的常規(guī)樣品用于組織病理學診斷，正常的原位雜交法正好產(chǎn)生背景，而微波處理代替蛋白酶K能夠特異性雜交。Shi，等，J.Biol.Chem.，2665774(1991)；Catoretti，等，J.of Pathol.，168357(1992)。
在腸系膜，肺和闌尾淋巴管內(nèi)皮中產(chǎn)生Flt4信號，而靜脈，動脈和毛細血管為陰性。為了研究Flt4是否在HEVs中表達，研究了扁桃體。事實上，在扁桃體中，在一些HEVs中檢測到Flt4-特異性放射自顯影顆粒。
實施例23分析正常和轉移性淋巴結和淋巴管瘤中的Flt4 mRNA分析了部分人腸系膜淋巴結(見實施例22)的Flt4表達。在淋巴竇和輸入及輸出淋巴管中觀察到Flt4表達。在含有腺癌轉移瘤的淋巴結中觀察到相同的方式。在正常和轉移性淋巴結的一些HEVs中也呈陽性。與所有血管中vonWillebrandt因子的原位信號相比顯而易見的是在膽囊淋巴管瘤中Flt4的表達是淋巴管內(nèi)皮特有的。
與這些結果一致，在皮膚淋巴管瘤(一種以推測的淋巴管內(nèi)皮增生為特征的罕見疾病)的內(nèi)皮中對Flt4的免疫染色呈強陽性。參見Lymboussaki等，Am.J.Pathol.，153(2)395-403(1998年8月)，本文引用以其整體作為參考。
另外，對Flt4的免疫染色在卡波西肉瘤皮膚結狀病灶組織樣品內(nèi)鑒定到紡錘形細胞。參見Jussila等，Cancer Res.，581599-1604(1998年4月)。鑒于Flt4的明顯淋巴管特異性，可認為這些結果與卡波西肉瘤中某些細胞具有淋巴管內(nèi)皮起源的觀點一致。參見，例如，Beckstead等，Am J.Pathol.，119294-300(1985)；和Dictor等，Am J.Pathol.，130411-417(1988)。
實施例24Flt4定位于胎兒內(nèi)皮細胞正如實施例2所述，編碼短鏈形式的40個羧基末端氨基酸的Flt4 cDNA片斷作為657bp的EcoRI片斷克隆進pGEX-1λT細菌表達載體(Pharmacia)的谷胱甘肽-S-轉移酶編碼區(qū)的閱讀框內(nèi)。在大腸桿菌中生產(chǎn)所得的GST-Flt4融合蛋白并使用谷胱甘肽-瓊脂糖4B柱通過親和色譜法純化。凍干純化的蛋白，溶于PBS中，與Freund′s佐劑混合，并用于免疫兔。使用第三次加強免疫后的抗血清。
從用前列腺素誘導的合法流產(chǎn)獲得17和20周大的人胎兒組織。本研究由郝爾辛基大學中心醫(yī)院的倫理委員會批準。從胎兒足長度估計妊娠年齡。將胎兒組織包埋于Tissue-Tek(Miles)中，立即冷凍，并儲存在-70℃。
抗-Flt4抗血清與GST-瓊脂糖柱交叉吸附以去掉抗-GST-抗體并然后通過GST-Flt4親和色譜法純化。用丙酮固定一些6μm厚的恒冷箱組織切片并用在甲醇中的0.3％H2O2處理30分鐘以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。洗滌后，用5％正常豬血清溫育該切片。然后用抗Flt4抗體溫育切片并洗滌。用過氧化物酶偶連的豬抗兔IgG隨后通過使用0.2％3，3-二氨基聯(lián)苯胺(Amersham)作底物染色過氧化物酶活性檢測結合的抗體。切片在Meyer′s蘇木精中復染。
人胎兒腸系膜的抗-Flt4免疫過氧化物酶染色表明在一些血管的內(nèi)皮上存在Flt4蛋白，而用抗原封閉的抗-Flt4抗體和免疫前的血清進行的對照染色為陰性。為了進行比較，用抗因子VIII-相關性抗原的抗血清染色切片，該抗原是血管內(nèi)皮細胞特有的。在不含紅血細胞的血管內(nèi)皮細胞中觀察到對Flt4的免疫過氧化物酶染色，而血管為陰性。無紅血細胞的血管很可能是淋巴管內(nèi)皮細胞；該血管在腸系膜中特別常見?？挂蜃覸III相關性抗原的抗體染色所有血管中的內(nèi)皮細胞。
實施例25抗Flt4單克隆抗體的生產(chǎn)融合I通過在High-Five細胞中表達Flt4EC-6xHis-pVTBac質粒構建體(實施例14)生產(chǎn)重組Flt4胞外域蛋白。使用Ni-NTA親和色譜法按照廠商的指導(Qiagen)結合并洗脫重組Flt4胞外域的COOH-末端編碼的6xHis標記從感染的High-Five細胞的培養(yǎng)基純化Flt4胞外域(Flt4EC)。
通過腹膜內(nèi)注射用Freund′s完全佐劑乳化的純化重組產(chǎn)生的Flt4胞外域蛋白(150μg/只小鼠)免疫4月齡Balb/c雄性小鼠。以3到4周的間隔給予150μg的加強注射且在另一3周間隔后給予最后加強(10μg Flt4 EC溶于PBS中，腹膜內(nèi)給藥)。最后加強劑量4天后，處死小鼠且將小鼠脾淋巴細胞與SP 2/0漿細胞瘤細胞分別以2∶1的比率融合。
在96-孔培養(yǎng)板(NUNC)中在含有20％胎牛血清和HAT添加劑(次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷；GIBCO，043-01060H；稀釋50倍)的Ex-Cell 320培養(yǎng)基(SERALAB)中收獲融合細胞。細胞在+37℃下，5％ CO2的空氣中培養(yǎng)。10天后，將添加了HAT的培養(yǎng)基更換成補充了HT的細胞培養(yǎng)基(GIBCO；043-01065H，稀釋50倍)。HT培養(yǎng)基與HAT培養(yǎng)基相同，但缺少氨基蝶呤。
在3周時，通過下面實施例26所述的抗原特異性ImmunoFluoroMetric試驗(IFMA)測定特異性抗體的產(chǎn)量。按Staszewski等，Yale Journal of Biologyand Medicine，57865-868(1984)所述的有限稀釋法克隆該主克隆。將陽性克隆傳代到24-孔組織培養(yǎng)板(NUNC)上，再克隆，并按相同方法再檢驗。通過熒光激活細胞分類術(FACS)檢測陽性克隆。
除了一個克隆產(chǎn)生很可能屬于IgA型的Ig外，穩(wěn)定克隆分泌的免疫球蛋白屬于IgG1類型。使用針對小鼠亞類的大鼠單克隆抗體作為IFMA中的生物素偶連物(SEROTEC)測定單克隆抗體的亞類。
使用Balb/c小鼠在腹水中產(chǎn)生單克隆抗體。將上述雜交瘤腹膜內(nèi)注射進用降植烷(2，6，10，14-四甲基十五烷98％，ALDRICH-CHEMIE D7924Steinheim，Cat.No.T 2，280-2)預處理動物后的小鼠中。在雜交瘤細胞前大約兩周注射0.5ml降植烷(i.v.)。注射的細胞量是每只小鼠大約7.5到9×106個。注射雜交瘤后10至14天收集腹水。
融合II通過用Freund′s完全佐劑乳化的重組產(chǎn)生的Flt4胞外域蛋白(20μg/只小鼠)腹膜內(nèi)注射免疫兩個月大的Balb/c小鼠(雌性)。以3到4周的間隔給予20μg的加強注射且在另一3周間隔后給予最后加強(10μg Flt4溶于PBS中，i.v.給藥)。最后加強給藥4天后，處死小鼠且將小鼠脾淋巴細胞與SP 2/0漿細胞瘤分別以2∶1的比率融合。
在96-孔培養(yǎng)板(FALCON)中在含有20％胎牛血清和HAT添加劑(次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷；GIBCO BRL 21060-017；稀釋1∶50倍)的OptiMEM 1(含有Glutamax，1，51985-026，GIBCO BRL)中收獲融合細胞。細胞在37℃下，5％CO2的空氣中培養(yǎng)。10天后，將添加了HAT的培養(yǎng)基更換成補充了HT的細胞培養(yǎng)基(GIBCO BRL；41065-012，稀釋1∶50倍)。
在3周時，通過下面實施例26所述的抗原特異性ImmunoFluoroMetric試驗(IFMA)測定特異性抗體的產(chǎn)量。按Staszewski等，(1984)所述的有限稀釋法克隆該主克隆。將陽性克隆傳代到24-孔組織培養(yǎng)板(FALCON)上，再克隆，并按相同方法再檢驗。通過FACS檢測陽性克隆。
2E11和6B2克隆分泌屬于IgG1型的免疫球蛋白，2B12克隆產(chǎn)生屬于亞類IgM的Ig。使用抗小鼠亞類重鏈的大鼠單克隆抗體作為IFMA中的生物素偶連物(SEROTEC)測定小鼠亞類IgG1且使用小鼠單克隆抗體同種型分類試劑盒(Dipstick Format)(19663-0 12，Life Technologies Inc.)測定小鼠亞類IgM。
實施例26抗Flt4單克隆抗體的特異性純化的，重組Flt4胞外域-6xHis融合產(chǎn)物(按實施例14和25所述生產(chǎn))按Mukkala等，Anal.Biochem，176(2)319-325(1989)所述用銪標記，并采用如下改良將過量250倍摩爾數(shù)的異硫氰酸DTTA-Eu(N1螯合物，WALLAC，F(xiàn)inland)加入Flt4溶液(0.5mg/ml溶于PBS)中且通過加入0.5M碳酸鈉緩沖液，pH9.8將pH調節(jié)到大約9。在+4℃下進行標記過夜。使用以TSA緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.8，含有0.15M NaCl)作洗脫劑的PD-10(PHARMACIA，Sweden)去掉未結合標記。
純化后，將1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)加入標記的Flt4中且標記物在+4℃下儲存。通過測量該熒光與已知EuCl3標準的比率(Hemmila等，Anal.Biochem.，137335-343(1984))測定為，每個Flt4分子摻入的銪離子的平均數(shù)目為1.9。
使用兔抗小鼠Ig(Z 259，DAKOPATTS)覆蓋的微量滴定條孔(NUNC，polysorb)，使用夾心式免疫熒光測定試驗篩選實施例25中產(chǎn)生的抗體。通過Platewash 1296-024(WALLAC)用DELFIA洗滌溶液將預覆蓋的孔洗滌一次。DELFIA測定緩沖液用作細胞物培養(yǎng)上清和脾切除的小鼠血清的稀釋緩沖液(以1∶1000至1∶100,000的稀釋度)，其中脾切除的小鼠血清用作初步篩選試驗的陽性對照。
通過在Plateshake搖床(1296-001，WALLAC)上搖動5分鐘開始在+4℃下過夜溫育(或者在室溫下溫育2小時)，接著按上文所述用洗滌溶液洗滌4次。
在100μl測定緩沖液中以1∶500的稀釋度加入銪標記的Flt4。在Plateshake搖床上5分鐘和在室溫下溫育1小時后，按上文所述洗滌滴定條。
以200μl/孔加入增強溶液(DELFIA)。然后在Plateshake搖床上搖動平板5分鐘，通過ARCUS-1230(WALLAC)10-15分鐘測量熒光的強度。(Lovgren等，見Collins W.P.(編)Alternative Immunoassays，John Wiley & Sons Ltd.(1985)，第203-216頁)。DELFIA結果表明試驗的所有單克隆抗體結合Flt4 EC抗原。選擇與Flt4反應的單克隆抗體(和產(chǎn)生該抗體的雜交瘤)用于進一步篩選。
所得的單克隆抗體用于雙抗體免疫熒光染色表達LTR-FLT41構建體的NIH3T3細胞和新霉素抗性轉染的NIH3T3細胞。使用EDTA從培養(yǎng)板分離該細胞，染色，并在熒光激活細胞分選儀(FACS)上分析。FACS分析的結果以所示單克隆抗體染色陽性的細胞百分數(shù)提供(見下文表2)。
a)LTR轉染的細胞的FACS結果b)NEO細胞的FACS結果(對照)LTR-FLT41-轉染的細胞的FACS結果表明該抗體有效識別Flt4-表達細胞。同一抗體對新霉素磷酸轉移酶轉染的NIH3T3細胞僅產(chǎn)生背景染色。因此，該抗體特異性識別細胞表面的Flt4酪氨酸激酶。
發(fā)現(xiàn)命名為抗-Flt4雜交瘤9D9F9的一個克隆穩(wěn)定分泌通過IFMA測定為屬于免疫球蛋白類型IgG1的單克隆抗體。雜交瘤9D9F9于1995年3月23日保藏在德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心，人和動物細胞培養(yǎng)物和病毒部，Mascheroder Weg lb，3300 Braunschweig，Germany，且給定保藏號為ACC2210。
融合II抗體還使用了上述銪標記的Flt4胞外域蛋白篩選實施例25所述的融合II抗體。使用兔抗小鼠Ig(Z 259，DAKO)覆蓋的微量滴定孔(Nunc，Polysorb)，使用Flt4-特異性IFMA篩選該抗體。通過使用DELFIA Plate洗滌用洗滌溶液(Wallac)洗滌預覆蓋的孔一次。
DELFIA試驗緩沖液用作細胞培養(yǎng)物上清(在初步篩選中稀釋度為1∶2)和脾切除的小鼠血清(稀釋度從1∶1000到1∶100,000)的稀釋緩沖液，其中脾切除的小鼠血清用作陽性對照。作為標準，使用濃度在1.0ng/ml和250ng/ml之間的純化抗-Flt4 9D9F9(小鼠亞類IgG1)。樣品首先在Plateshake搖床上室溫下?lián)u動5分鐘，然后在+4℃下溫育大約18小時。首先洗滌支架4次，然后加入Eu-標記的Flt4(1∶2000，在100μl測定緩沖液中)，最后在室溫下溫育支架1小時。按所述方法洗滌后，加入增強溶液(200μl/孔，Wallac)，并在Plateshake搖床上搖動支架5分鐘。通過ARCUS-1230(Wallac)測量熒光強度。選擇與Flt4反應的單克隆抗體在采用表達Flt4的NIH3T3細胞的雙抗體免疫熒光染色測定法中按上文所述進一步篩選。
所得的融合II的抗Flt4單克隆抗體和相應的FACS分析結果(表示為用所示單克隆抗體染色陽性的細胞百分數(shù))在表3中總結。
使用親和純化的抗-Flt4 9D9F9制備用于定量抗-Flt4抗體的標準曲線。線型范圍達到從1.0ng/ml到250ng/ml。
在表面表達全長Flt4的用pLTRFLT41構建體共轉染的NIH3T3細胞的溶胞產(chǎn)物在6.5％SDS-PAGE上電泳，將蛋白質轉移到硝化纖維素硝酸鹽膜(0.45μm，SCHLEICHER & SCHUELL)上且用含單克隆抗體的雜交瘤細胞培養(yǎng)物上清(1∶10，在含有甲醇4％，SDS 0.04％的50mM TRIS-40mM甘氨酸緩沖液中)免疫印跡。使用與HRP-偶連的兔抗小鼠Ig(P161，DAKO，在含有150mM鹽水，5％奶粉的20mM TRIS緩沖液，pH7.5中1∶1000稀釋)和ECL(增強化學發(fā)光，AMERSHAM)溫育檢測單克隆抗體的特異性。％a
a)LTR轉染的細胞的FACS結果b)NEO細胞的FACS結果(對照)c)基于親和純化的抗-FLT 9D9F9抗體用作標準定量的Mab產(chǎn)量NF在FACS中不起作用WB成功用于Western免疫印跡實施例27使用抗-Flt4抗體鑒定在細胞溶胞產(chǎn)物中和在人組織淋巴管內(nèi)皮細胞中表達的Flt4前面實施例所述的雜交瘤9D9生產(chǎn)的單克隆抗體用于免疫沉淀和Western印跡HEL細胞的溶胞產(chǎn)物。正如實施例6的報道，以前在HEL細胞中觀察到Flt4 mRNA的表達。大約2×107個培養(yǎng)的HEL細胞在實施例11限定的RIPA緩沖液中裂解并用大約2微克的9D9抗體(按實施例11對多克隆抗體所述)免疫沉淀。對于Western分析，通過SDS-PAGE(6％凝膠)電泳免疫沉淀并電印跡到硝酸纖維素膜上。使用1微克/ml 9D9抗體的稀釋液在免疫沉淀的Western印跡分析中檢測相應于Flt4多肽的175kD和125kD的多肽帶。
使用9D9單克隆抗體和堿性磷酸酶ABC-AP試劑盒(Dako)進行人皮膚組織的免疫染色。簡單地說，含有6μm成人皮膚樣品的載玻片在室溫(RT)下干燥30分鐘，用冷丙酮固定10分鐘，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次5分鐘。然后將樣品在RT下用2％馬血清溫育30分鐘并在PBS中洗滌3次5分鐘。
對于免疫染色，將樣品與9D9第一抗體在室溫下溫育1小時并用PBS洗滌3次5分鐘。洗滌后，樣品與生物素標記的兔抗小鼠第二抗體在室溫下溫育30分鐘，并再用PBS洗滌3次5分鐘。
通過用ABC-AP復合物在室溫下溫育樣品30分鐘，用PBS洗滌3次，用AP-底物(Sigma Fast Red TR/Naphtol AS-MX(Cat.No.F-4648))室溫下溫育15分針，并用水漂洗可檢測結合的抗體。然后用Mayer′s蘇木精復染樣品30秒并用水漂洗。使用水封固并蓋上蓋玻片，在顯微鏡下分析該樣品。觀察這些人皮膚切片中淋巴管內(nèi)皮細胞的9D9抗體染色。血管內(nèi)皮顯示出極弱的染色或無染色。進一步的分析用于證實淋巴管內(nèi)皮的明顯特異性。參見Lymboussaki等，Am.J.Pathol.，153(2)395-403(1998年8月)；和Jussila等，Cancer Res.，581599-1604(1998年4月)，本文引用這兩篇文獻以其整體作為參考。
這些結果還證實了Flt4作為淋巴管內(nèi)皮的有用標記的用途和抗-Flt4抗體用于鑒定和觀察組織樣品在這些細胞中表達的Flt4的用途。
實施例28VEGF-C/VEGFR-3信號途徑在乳腺癌血管生成中的增量調節(jié)上面的實施例證實了Flt4(VEGFR-3)用作正常組織淋巴管內(nèi)皮的特異性抗原標記。下列方法還證實了VEGFR-3用作抗原標記(例如，用于診斷和篩選)和作為惡性乳腺腫瘤的治療靶。與組織學上正常的乳腺組織相比在侵襲性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)VEGFR-3陽性血管大量增多(P＜0.0001)。
材料和方法新鮮冷凍的乳腺組織樣品從郝爾辛基大學病理學系的病例中取回。樣品由導管癌(n＝6)，小葉癌(n＝6)，管內(nèi)癌(n＝8)，纖維腺瘤(n＝4)，和組織學正常的乳腺組織(n＝12)組成。所有樣品在手術切除后立即在液氮中冷凍，并存儲在-70℃。
抗人Flt4(VEGFR-3)的小鼠單克隆抗體(Mabs)基本上按前面實施例，例如實施例25所述生產(chǎn)。VEGFR-3胞外域蛋白(VEGFR-3EC)通過在昆蟲細胞中的重組桿狀病毒表達，從培養(yǎng)基中純化。然后使用標準方法生產(chǎn)抗VEGFR-3EC的小鼠單克隆抗體且通過蛋白質A親和色譜法從雜交瘤腹水液或Tecnomouse培養(yǎng)物上清純化該免疫球蛋白餾分。
空氣干燥5μm的組織樣品冷凍切片并在冷丙酮中固定10分鐘。切片在磷酸鹽緩沖液(PBS)中再水合并在5％正常馬血清中室溫下溫育30分鐘。然后在潮濕大氣中室溫下用Mabs 9D9F9(實施例26)以1.0μg/ml的濃度溫育切片2小時。還研究了抗VEGFR-3EC不同表位的其它抗-VEGFR-3 Mab；克隆2E11D11(實施例26)和7B8F9(基本上按實施例26所述制備)分別以9.5和8.5μg/ml的濃度使用。隨后在生物素標記的抗小鼠血清中溫育30分鐘，接著使用Vectastain Elite Mouse IgG ABC試劑盒的試劑(Vector laboratories，Burlingame，USA)溫育60分鐘。用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC，Sigma，St.Louis，USA)顯色過氧化物酶活性10分鐘。最后，用蘇木精染色切片20秒。通過省去第一抗體，或者通過使用相同同種型的無關第一抗體進行陰性對照。使用純化的桿狀病毒免疫原封閉9D9抗體的結合作為另一陰性對照。在這些實驗中，抗體與在PBS中過量10倍摩爾數(shù)的VEGFR-3EC蛋白質溫育過夜。在+4℃下以4000rpm離心4分鐘后，小心收集上清，然后用作第一抗體。與用抗-VEGFR-3抗體染色的切片鄰近的5μm冷凍切片用于免疫染色血管內(nèi)皮標記PAL-E(0.15μg/ml，Monosan，Uden，荷蘭)，層粘連蛋白(1∶4000稀釋的克隆LAM-89上清，Sigma，St Louis，MO)，膠原蛋白XVIII(1.9μg/ml)，α-平滑肌肌動蛋白(SMA，0.5μg/ml，克隆1A4，Sigma)，VEGFR-1(1∶200稀釋的克隆19上清)或VEGFR-2(1∶100稀釋)。
染色程序后對所有樣品進行病理學檢查。按照Gasparini和Harris.[Gasparini G，和Harris A，J Clin.Oncol.，13765-782(1995)]推薦的指導從PAL-E染色的載玻片[de Waal等，Am.J.Pathol.，1501951-1957(1997)]獲得血管密度。以相同的方式試驗VEGFR-3陽性血管的密度。首先在低放大倍數(shù)下瀏覽載玻片，然后通過在最高血管密度的區(qū)域(“血管熱點”)或在具有最高VEGFR-3陽性血管密度的區(qū)域計數(shù)每個400x放大倍數(shù)的高倍視野(hpf)中染色血管的數(shù)目來估計腫瘤內(nèi)的血管密度。每張載玻片最少計數(shù)5個視野，隨后平均3個最高的計數(shù)。
在兩個管內(nèi)癌中進行雙染色以區(qū)分淋巴管和血管的免疫組織化學染色。丙酮固定的5μm冷凍切片與抗-PAL-E抗體溫育1小時，與生物素標記的馬抗小鼠抗體(Vectastain Elite Mouse IgG ABC試劑盒，Vector laboratories，Burlingame，USA)溫育30分鐘，與ABC-過氧化物酶(Vectastain，1∶100)溫育45分鐘，最后用AEC顯色10分鐘。對于第二步，用抗-VEGFR-3抗體溫育切片1小時(0.14μg/ml)，接著用生物素標記的抗小鼠抗體溫育30分鐘(1∶200稀釋的克隆上清)，ABC-過氧化物酶溫育30分鐘(1∶100)，含有0.01％過氧化物的生物素標記的酪胺(tyramin)溶液(1∶2.000)溫育5分鐘，ABC-堿性磷酸酶(1∶100)溫育20分鐘，并用堅牢藍(Sigma，St.Louis，USA)按照以前文獻中所述的ISH信號增強方法顯色20分鐘。[Kerstens等，J.Histochem.Cytochem.，43347-352(1995)]。與雙染色切片相鄰的冷凍切片(5μm)按上文所述僅用VEGFR-3抗體也進行了免疫染色。
在兔中針對相應于文獻中所述的成熟分泌的人血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)N-末端氨基酸殘基2-18的合成肽(VEGF-C的prepro-VEGF-C多肽的殘基104-120)生產(chǎn)多克隆抗體。[Joukov等，EMBO J.，163898-3911(1997)，本文引用以其整體以供參考]。使用與環(huán)氧活化的瓊脂糖-6B柱偶連的免疫原性多肽親和純化該抗血清并使用以表達VEGF-C或對照β-半乳糖苷酶的腺病毒載體感染的細胞試驗VEGF-C的特異性染色。
選擇8個管內(nèi)癌和用于分析VEGFR-3的所有侵襲性癌進一步分析VEGF-C的表達。空氣干燥與用抗-VEGFR-3抗體染色的切片相鄰的5微米冷凍切片并在冷丙酮中固定10分鐘。該切片在PBS中再水合并在5％正常山羊血清中溫育30分鐘，然后在潮濕的空氣中室溫下用在PBS中1∶200稀釋的兔抗人VEGF-C多克隆抗體溫育2小時。隨后在生物素標記的抗兔血清中溫育30分鐘，接著使用Vectastain Elite Rabbit IgG ABC試劑盒的試劑(Vector laboratories，Burlingame，USA)溫育60分鐘。該切片按上文所述進一步處理。作為陰性對照，使用純化的免疫原封閉VEGF-C抗體的結合。在這些實驗中，VEGF-C抗體與在PBS中過量10倍摩爾數(shù)的VEGF-C蛋白質溫育過夜。在+4℃下以4000rpm離心4分鐘后，小心收集上清并用于免疫染色。
通過用相應于人XVIII型膠原蛋白N-末端NC1結構域共有區(qū)域的重組多肽QH48.18[Saarela等，Matrix Biology，16319-28(1998)]免疫小鼠由DiaBor Ltd.(Oulu，F(xiàn)inland)產(chǎn)生抗人XVIII型膠原蛋白的單克隆抗體。通過ELISA試驗和使用多肽QH48.18的Western分析且還通過對冷凍人組織切片的免疫熒光染色篩選該克隆。雜交瘤克隆的篩選產(chǎn)生了3個單克隆抗體，在提及的所有三個試驗(ELISA，Western，免疫熒光染色)中均為陽性。具有最強信號的一個抗體，DB 144-N2用于隨后的實驗中。它產(chǎn)生與多克隆抗-all hu(XVIII)相同的染色方式(例如，在成人皮膚和腎樣品中)。
結果A.在組織學正常的乳腺組織和在良性纖維腺瘤中的VEGFR-3在正常乳腺組織中VEGFR-3的免疫組織化學染色表明在管間基質的毛細血管中表現(xiàn)出極弱的染色。這些血管不形成任一特異性方式，但是分散在各處的基質中。在正常乳腺組織樣品中VEGFR-3陽性血管的密度范圍為每個hpf從6到17個，中值為9(n＝12)。大多數(shù)該血管為血管內(nèi)皮標記PAL-E和基底層成份膠原蛋白XVIII強染色，表明VEGFR-3在正常乳腺組織的血管中弱表達。然而，清楚染色VEGFR-3的基質中的一些薄血管為PAL-E陰性和XVIII型膠原蛋白弱陽性，表明它們是淋巴管。在良性纖維腺瘤中也同樣發(fā)現(xiàn)了VEGFR-3陽性血管，而其密度(每個hpf中值為8條血管；范圍為3-19；n＝4)與組織學正常的乳腺組織(中值8相對于9；P＞0.1，Mann-Whitney檢驗)沒有區(qū)別。
B.管內(nèi)癌中的VEGFR-3陽性血管在管內(nèi)癌中，觀察到不同方式的強染色VEGFR-3陽性血管。該血管圍繞病變導管形成弓形結構(圖5A)。在相鄰切片的血管內(nèi)皮標記PAL-E的染色(圖5B)中也觀察到該“項鏈”形式，表明在毛細血管內(nèi)皮中VEGFR-3表達增強。為了更明確地區(qū)分血管和淋巴管和搜尋血管壁中存在的平滑肌細胞和外膜細胞，使用抗平滑肌α-肌動蛋白(SMA)和基底層成份層粘連蛋白和XVIII型膠原蛋白的抗體進行進一步染色。根據(jù)該染色，靠近管內(nèi)癌的小血管同時表達VEGFR-3和基底層蛋白，但SMA染色更弱，表明它們在血管壁中被外膜細胞/平滑肌細胞不完全覆蓋(圖5C-5F中的黑色箭頭)。相反，與管內(nèi)病灶有一些距離的更大血管一般是VEGFR-3陰性，而對層粘連蛋白，膠原蛋白XVIII和SMA為陽性(紅色箭頭)。另外，發(fā)現(xiàn)了VEGFR-3陽性，但對基底層蛋白層粘連蛋白和XVIII型膠原蛋白僅極弱染色且對SMA根本不染色的血管(綠色箭頭)。認為它們代表淋巴管。
C.血管和淋巴管的差別雙染色選擇兩個管內(nèi)癌用于免疫組織化學雙染色操作以便更清楚地區(qū)分淋巴管與血管。[參見de Waal等，Am.J.Pathol.，1501951-1957(1997)]。使用該方法，將VEGFR-3陽性血管染成藍色，而PAL-E陽性血管和基底層染成棕色。兩種試驗的樣品都表現(xiàn)出相似的染色方式腫瘤充滿導管內(nèi)層的血管主要為PAL E陽性(圖5G和5H中的箭頭)而在管間基質中相距短距離的推測為淋巴管的VEGFR-3陽性血管為PAL E陰性(圖5G和5H中的黑色箭頭)。為了排除由于可能的雙染色人為現(xiàn)象造成的錯誤判斷，用抗-VEGFR-3單獨染色相鄰的5μm切片。該染色證實了一些PAL-E陽性血管也是VEGFR-3陽性。
D.管內(nèi)癌細胞中的VEGF-C，VEGFR-1，和VEGFR-2及其相鄰血管中的受體抗人VEGF-C的多克隆親和純化抗體用于染色8個管內(nèi)癌樣品。所有試驗的樣品含有至少一些VEGF-C，但是在染色強度和表達方式上觀察到相當大的不均一性。在一些情況下，大多數(shù)癌細胞為VEGF-C強陽性，而在其它情況下，只有一些癌細胞產(chǎn)生染色信號。相反，在圍繞病變導管的正常組織中觀察到極少或者沒有染色，盡管在未病變的正常導管上皮中也獲得了微弱的信號?？乖忾]實驗表明VEGF-C染色是特異性的。其它VEGF-C受體，VEGFR-2，以及其它VEGF受體(VEGFR-1)都在鄰近管內(nèi)癌細胞的相同“項鏈”血管中表達。
E.VEGFR-3陽性血管和侵襲性乳腺癌中的VEGF-C強染色的VEGFR-3陽性血管也存在于試驗的所有侵襲性導管癌和小葉癌中。VEGFR-3陽性血管似乎不形成任何特異性的分布方式；大多數(shù)這種血管也與PAL-E抗原發(fā)生免疫反應。在侵襲性乳腺癌中腫瘤內(nèi)VEGFR-3陽性血管密度(中值為21，范圍為每個hpf有9-56個血管；n＝12)與正常乳腺組織相比(中值21比9；P＜0.0001，Mann-Whitney檢驗)顯著提高。有時，可觀察到癌細胞侵入VEGFR-3陽性淋巴管中。
在試驗的侵襲性癌(n＝12)中VEGF-C的免疫染色差異極大。一些癌細胞為VEGF-C強陽性，而其它染色極弱，或者在一些情況下觀察不到染色。與管內(nèi)癌一樣，在這些切片的結締組織中觀察到極少染色或無染色。
上述數(shù)據(jù)揭示了似乎主要是大多數(shù)成人組織中淋巴管內(nèi)皮標記的VEGFR-3也在正常乳腺組織的毛細血管內(nèi)皮中極弱表達。更有意義的是，在管內(nèi)癌中，在充滿腫瘤的導管內(nèi)層檢測到“項鏈”形式的強染色VEGFR-3陽性血管。這些血管中大多數(shù)表達血管內(nèi)皮標記PAL-E和基底層成份層粘連蛋白和膠原蛋白XVIH，但是比位于離腫瘤細胞更遠的血管明顯具有更少的外膜細胞/平滑肌細胞，正如使用抗SMA的抗體染色所示。這些特征表明“項鏈”血管正在進行血管生成。離病變導管一段距離的第二組血管為VEGFR-3陽性，但對基底層成份為極弱的陽性且為PAL-E陰性，表明它們是淋巴管。這些血管也缺少SMA-陽性外膜細胞成份。另外在侵襲性乳腺癌中，PAL-E陽性血管增量調節(jié)VEGFR-3，盡管所見的血管形式在圍繞腫瘤細胞的結締組織基質中更隨機地組織。該結果表明與腫瘤生長相關的血管生成期間在乳腺癌中增量調節(jié)VEGFR-3表達。在原位癌中發(fā)現(xiàn)的VEGFR-3陽性血管的數(shù)目大量提高與這樣的假說一致，即癌細胞產(chǎn)生可激活緊靠癌細胞附近的血管生長的因子。
由于VEGF-C以高親和性結合VEGFR-3和VEGFR-2，且由于管內(nèi)癌和侵襲性癌細胞通常為VEGF-C蛋白染色陽性，因此該生長因子是癌癥中VEGFR-3和VEGFR2陽性血管的候選生長因子。這些資料與另一研究一致，其中35個隨機惡性侵襲性腫瘤(包括乳腺癌，鱗狀細胞癌，淋巴瘤，黑素瘤，和肉瘤)幾乎一半在Northern印跡分析中含有VEGF-C mRNA。[參見Salven等，Am.R Pathol.，153(1)103-108(1998年7月)，本文引用以其整體作為參考]?？傊疚膱蟮赖臄?shù)據(jù)提供了用可抑制VEGFR-3和/或VEGFR-2的VEGF-C介導性刺激的試劑治療乳腺癌且可能還有其它非淋巴癌的指征。預期的抑制劑包括抗-VEGF-C抗體；抗-VEGFR-3抗體；抗-VEGFR-2抗體；與VEGFR-3和VEGFR-2或VEGFR-1之一結合的雙特異性抗體；結合循環(huán)VEGF-C的VEGFR-3的可溶性胞外域片段；結合VEGFR-3和/或VEGFR-2且抑制該受體活化的VEGF-C片段和類似物；結合VEGFR-3和/或VEGFR-2且與合適的治療劑偶連的VEGF-C多肽，片段，和類似物；VEGFR-3酪氨酸激酶抑制劑；和結合并抑制這些受體的小分子。另外，由于VEGF-D結合VEGFR-3和VEGFR-2，預期抗-VEGF-D抗體和抑制性VEGF-D片段和類似物是合適的抑制劑。人或人源化抗體及其片段對于選擇抗體試劑用于人體治療的情況是優(yōu)選的。另外，作為本發(fā)明的另一方面，可預期使用任一上述試劑評估體外或體內(nèi)的哺乳動物組織用于，例如診斷目的和篩查惡性腫瘤和惡性腫瘤的擴散。
對于任一上述試劑，預期可通過附著一個可檢測的標記，包括但不限于放射性同位素(例如，14C，133I和125I)，發(fā)色團(例如，熒光素，藻膽蛋白質；四乙基羅丹明；產(chǎn)生用于通過熒光，吸光度，可見色，或凝集作用檢測的熒光或有色產(chǎn)物，產(chǎn)生用于通過電子顯微鏡檢術檢測的電子密集產(chǎn)物的酶)；或諸如鐵蛋白的電子密集分子，過氧化物酶，或金粒進一步改良該試劑用于診斷和篩查。同樣，可通過與諸如植物，動物，微生物或真菌來源的毒素的具有抗腫瘤特性的分子；放射性同位素；藥物，酶；和/或細胞因子及其它治療蛋白連接(例如，偶連)或共同給藥進一步改良該試劑用于治療目的。(參見，例如，Pietersz & McKenzie，“治療癌癥的抗體偶連物”，Immunological Reviews，12957-80(1992)，本文引用以供參考。
實施例29作為人體治療劑給藥的抗-Flt4抗體A.抗-Flt4單克隆抗體的人源化在本文中，例如在實施例28中報道的Flt4的生物學表明了抑制配體介導的Flt4受體信號傳導的Flt4抑制劑(拮抗劑)的治療用途。Flt4-中和抗體包含用作Flt4拮抗劑的一類治療劑。下面的方法用于提高作為人體治療劑的抗-Flt4單克隆抗體的實用性，通過“人源化”單克隆抗體以提高其血清半壽期并導致它們在人類宿主中具有較小的免疫原性(即，防止對非人抗-Flt4抗體的人抗體反應)。
人源化的原理在文獻中已有描述且通過抗體蛋白的模塊組裝實現(xiàn)。為了最小化結合補體的可能性，優(yōu)選IgG4同種型的人源化抗體。
例如，通過產(chǎn)生含有諸如本文所述的抗-Flt4單克隆抗體的非人目的抗體蛋白的可變區(qū)與人抗體分子恒定區(qū)的嵌合抗體達到人源化水平。(參見，例如，Morrison和Oi，Adv.Immunol.，4465-92(1989))。Flt4中和抗-Flt4抗體的可變區(qū)從B-細胞雜交瘤的基因組DNA或者從目的雜交瘤分離的mRNA產(chǎn)生的cDNA中克隆。將V區(qū)基因片段與編碼人抗體恒定區(qū)的外顯子連接，且所得的構建體在合適的哺乳動物宿主細胞(例如，骨髓瘤或CHO細胞)中表達。
為了實現(xiàn)更高水平的人源化，僅將編碼非人單克隆抗體基因的抗原結合互補性決定區(qū)(“CDR”)的那部分可變區(qū)基因片段克隆進人抗體序列中。[參見，例如，Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-36(1988)；和Tempest等，BiolTechnology，9266-71(1991)]。如有必要，將圍繞CDR3區(qū)的人抗體的β-折疊結構也修飾成更接近反映原始單克隆抗體的抗原結合區(qū)的三維結構。(參見，Kettleborough等，Protein Engin.，4773-783(1991)；和Foote等，J.Mol.Biol.，224487-499(1992))。
在另一替代方法中，通過例如，定點誘變改變非人抗體的選定表面殘基，同時保留非人抗體的所有內(nèi)部和接觸殘基可人源化非人目的單克隆抗體的表面。參見Padlan，Molecular Immunol.，28(4/5)489-98(1991)。
采用上述方法使用Flt4-中和抗-Flt4單克隆抗體和產(chǎn)生它們的雜交瘤，例如抗體9D9F9，以產(chǎn)生人源化的Flt4-中和抗體用作治療或減輕其中Flt4表達有害的病癥。
B.來自噬菌體展示的人Flt4-中和抗體通過噬菌體展示技術產(chǎn)生人Flt4-中和抗體，例如按Aujame等，HumanAntibodies，8(4)155-168(1997)；Hoogenboom，TIBTECH，1562-70(1997)；和Rader等，Curr.Opin.Biotechnol.，8503-508(1997)所述，引用所有這些文獻以供參考。例如，F(xiàn)ab片斷形式或連接的單鏈Fv片斷的抗體可變區(qū)與絲狀噬菌體次要外殼蛋白pIII融合。該融合蛋白的表達及其摻入成熟噬菌體外殼產(chǎn)生在其表面存在抗體且含有編碼該抗體的遺傳材料的噬菌體顆粒。含有該構建體的噬菌體文庫在細菌中表達，且使用標記的或固定的Flt4作為抗原探針淘選(篩選)該文庫的Flt4-特異性噬菌體抗體。
C.來自轉基因小鼠的人Flt4-中和抗體基本上按Bruggemann和Neuberger，Immunol.Today，17(8)391-97(1996)，和Bruggemann和Taussig，Curr.Opin Biotechnol.，8455-58(1997)所述在轉基因小鼠中產(chǎn)生人Flt4-中和抗體。使用常規(guī)免疫方法用Flt4組合物免疫在種系結構中攜帶人V-基因片斷且在其淋巴組織中表達該轉基因的轉基因小鼠。使用常規(guī)方法用來自免疫小鼠的B細胞產(chǎn)生雜交瘤并進行篩選以鑒定分泌抗-Flt4人抗體的雜交瘤(例如，如上所述)。
D.雙特異性抗體產(chǎn)生特異性結合Flt4且特異性結合與病理學和/或治療相關的其它抗原的雙特異性抗體，分離，并使用已在文獻中描述的標準方法檢驗。參見，例如Pluckthun & Pack，Immunotechnology，383-105(1997)；Carter等，J.Hematotherapy，4463-470(1995)；Renner & Pfreundschuh，ImmunologicalReviews，1995，第145期，第179-209頁；Pfreundschuh的美國專利號5,643,759；Segal等，J.Hematotherapy，4377-382(1995)；Segal等，Immunobiology，185390-402(1992)；和Bolhuis等，Cancer Immunol.Immunother.，341-8(1991)，本文引用所有這些文獻以其整體作為參考。
實施例30證實抗-Flt4療法對于癌癥治療的效果的動物模型預期任何癌癥治療可接受的動物可用于證實抗-Flt4療法對于癌癥治療的效果。使用標準劑量-反應試驗證實乳腺癌治療效果的實驗模型包括在Tekmal和Durgam，Cancer Lett.，118(1)21-28(1997)；Moshakis等，Br.J.Cancer，43575-580(1981)；和Williams等，J.Nat.Cancer Inst.，66147-155(1981)中所述的那些模型。除了鼠類模型外，還包含狗和豬模型，因為至少某些抗-人Flt4抗體(例如，9D9抗體)也識別來自狗和豬的Flt4。監(jiān)測腫瘤大小和副作用以證實相對于對照的治療效果。
實施例31可溶性FLT4抑制VEGF-C介導的腫瘤生長和轉移為了進一步證實VEGF-C在腫瘤發(fā)生中的體內(nèi)作用，將過量表達重組VEGF-C的MCF-7人乳腺癌細胞同位移植進SCID小鼠。VEGF-C的過量表達增進腫瘤生長，但與VEGF-A的過量表達不同，它對腫瘤血管生成的影響很小。另一方面，VEGF-C強烈促進與腫瘤相關的淋巴管的生長，該淋巴管在腫瘤周圍，通常有腫瘤細胞滲入。VEGF-C的這些效果可被可溶性VEGFR-3融合蛋白抑制。這些數(shù)據(jù)表明VEGF-C可增量調節(jié)腫瘤生長和/或通過淋巴管的轉移，且可通過抑制VEGF-C與其受體之間的相互作用來抑制這些效果。具體地說，可使用可溶性VEGFR-3/Flt4抑制該相互作用。
材料和方法A.質粒表達載體的制備將編碼人VEGF-C或VEGF165的cDNAs導入pEBS7質粒(Peterson和Legerski，Gene，107279-84，1991)中。使用相同載體表達含有與人免疫球蛋白γ鏈的Fc-結構域融合的VEGFR-3前3個免疫球蛋白同源結構域的可溶性受體嵌合體VEGFR-3-Ig，和在相似構建體中含有VEGFR-1前5個Ig同源結構域的VEGFR-1-Ig(Achen，等，Proc NatlAcadSci USA，95548-53，1998)。
B.轉染細胞的產(chǎn)生和分析通過電穿孔用質粒DNA轉染人MCF-7乳腺癌細胞系的MCF-7S 1亞克隆并按以前所述(Egeblad和Jaattela，Int J Cancer，86617-25，2000)選擇和培養(yǎng)穩(wěn)定的細胞集落。在補充了100μCi/ml[35S]-甲硫氨酸和[35S]-半胱氨酸(Redivue Pro-Mix，Amersham Pharmacia Biotech)的無甲硫氨酸和半胱氨酸的MEM(Gibco)中代謝標記該細胞。使用抗VEGF-C抗體從該條件培養(yǎng)基中免疫沉淀該標記的生長因子(Joukov，等，EMBO J，163898-911，1997)或VEGF(MAB293，R & D Systems)。使用蛋白質A瓊脂糖(AmershamPharmacia Biotech)沉淀該免疫復合物和VEGFR-Ig融合蛋白，在0.5％ BSA，0.02％ Tween 20的PBS中洗滌兩次并在PBS中洗滌一次，在還原條件下在SDS-PAGE中分析。
C.細胞增生和腫瘤發(fā)生試驗將細胞(20,000個/孔)在24孔板中一式四份涂板，1，4，6，或8天后在平行板上胰酶消化并使用血細胞計數(shù)器計數(shù)。4和6天后提供新鮮培養(yǎng)基。對于腫瘤發(fā)生試驗，通過胰酶作用收獲亞匯合培養(yǎng)物，洗滌兩次并將PBS中的107個細胞接種進切除卵巢的SCID小鼠第二(腋窩)乳腺的脂肪墊中，該小鼠攜帶含有0.72mg 17β-雌二醇(Innovative Research of America)的皮下60天緩釋型藥丸。卵巢切除和藥丸移植在腫瘤細胞接種前4-8天進行。以盲試方式每周兩次測量腫瘤的長度和寬度，腫瘤體積計算為長度×寬度×深度X0.5，假定腫瘤為半橢圓體且深度與寬度相同(Benz等，Breast Cancer ResTreat，2485-95，1993)。
D.血管的組織學和定量切除腫瘤，在4％多聚甲醛(pH7.0)中固定24小時，并包埋于石蠟中。按照公開的方法(Partanen等，Cancer，862406-12，1999)用抗PECAM-1(Pharmingen)，VEGFR-3(Kubo等，Blood，96546-553，2000)或PCNA(Zymed Laboratories)的單克隆抗體或抗LYVE-1(Banerji等，J CellBiol，144789-801，1999)，VEGF-C(Joukov等，EMBO J，163898-911，1997)或層粘連蛋白的多克隆抗體免疫染色切片(7μm)。從切片中最高血管密度(血管熱點)的3個區(qū)域(60x放大倍數(shù))測定PECAM-1陽性血管數(shù)目的平均值。使用盲試腫瘤樣品進行所有組織學分析。
E.可溶性VEGFR-3的腺病毒表達和伊文思藍排出試驗將編碼VEGFR-3-Ig融合蛋白的cDNA亞克隆進pAdBglII質粒并按以前所述(Laitinen等，Hum Gene Ther.，91481-6，1998)產(chǎn)生腺病毒。在腫瘤細胞接種前3小時將VEGFR-3-Ig或LacZ對照(Laitinen等，Hum Gene Ther.，91481-6，1998)腺病毒以109pfu/只小鼠靜脈內(nèi)注射進SCID小鼠中。3周后，麻醉每組中的四只小鼠，切開腹部皮膚并將幾微升PBS中的3％伊文思藍染料(Sigma)注射進腫瘤中。肉眼觀察腫瘤中染料的排出。
結果A.VEGF-C或VEGFR-3-Ig的表達不影響體外的MCF-7細胞生長如上所述用編碼全長人VEGF-C或可溶性VEGFR-3融合蛋白(VEGFR-3-Ig)的表達質粒轉染MCF-7人乳腺癌細胞并選擇穩(wěn)定的細胞集落。為進行比較，在相同細胞中表達人VEGF165或VEGFR-1-Ig。使用免疫沉淀法分析這些細胞的條件培養(yǎng)基的有效產(chǎn)量和該蛋白質的分泌。在還原條件下在PAGE中分析來自代謝標記的MCF-7細胞的VEGF-C，VEGF或可溶性受體蛋白的免疫沉淀。
該研究揭示了VEGF-C，VEGF，可溶性VEGFR-3融合蛋白或可溶性VEGFR-1融合蛋白的過量表達不影響MCF-7乳腺癌細胞的體外增生。當將該細胞接種進24孔平板并使用血球計數(shù)器測量其生長時，發(fā)現(xiàn)不影響轉染細胞的生長率。
B.VEGF-C 增′進腫瘤生長而不影響腫瘤血管生成為了測定VEGF-C的體外效力，將MCF-7細胞集落植入切除卵巢的SCID小鼠的乳腺脂肪墊中，該小鼠攜帶緩釋雌激素藥丸以提供支持MCF-7腫瘤生長所需的恒定激素水平。
VEGF-C的過量表達顯著增加腫瘤生長(VEGF-C545mm3±110mm3，對照268mm3±69mm3，在第13天，n＝8，p＜0.0001，學生t-檢驗)。然而，VEGF-C的過量表達對腫瘤生長的影響比VEGF-A的顯著性低得多(VEGF-A1136mm3±339mm3，對照189mm3±57mm3，在第15天，n＝6，p＜0.0001，學生t-檢驗)。通過分別混合VEGF-C或VEGF過量表達的MCF-7細胞與表達可溶性VEGFR-3或VEGFR-1融合蛋白的細胞可抵消增加的腫瘤生長。另外，發(fā)現(xiàn)通過靜脈內(nèi)注射重組腺病毒在肝臟中表達的循環(huán)可溶性VEGFR-3-Ig也抑制VEGF-C過量表達的腫瘤生長的增加。
為了研究VEGF-C對腫瘤血管生成的影響，染色腫瘤切片的PECAM-1，它是一種主要在血管中表達且在淋巴管中微弱表達的內(nèi)皮抗原。腫瘤中PECAM-1陽性血管的定量揭示了VEGF-C的過量表達對腫瘤血管的密度具有極小的影響(VEGF-C腫瘤為40.2±12.2個血管/個顯微鏡視野，n＝18且對照腫瘤為36.6±11.6，n＝23，三個不同實驗的平均值)。相反，VEGF-A的過量表達使得血管密度增加大約兩倍。
C.VEGF-C的過量表達與淋巴管形成和腫瘤細胞的內(nèi)部淋巴管生長相關通過免疫染色淋巴管特異性標記LYVE-1分析VEGF-C對腫瘤相關的淋巴管的影響(Banerji等，J Cell Biol，144789-801，1999)。該標記揭示了在VEGF-C過量表達的腫瘤周圍淋巴管高度增生。在許多LYVE-1日性內(nèi)皮細胞中檢測到增生的細胞核抗原(PCNA)，表明這些淋巴管活躍增生。通過VEGFR-3染色且缺乏基底層成份層粘連蛋白染色鑒定淋巴管結構。在一些VEGF-C過度表達的腫瘤內(nèi)部也存在薄淋巴管。
腫瘤外周的淋巴管通常被VEGF-C陽性腫瘤細胞滲入。截然相反的是，VEGF過度表達和對照腫瘤不含或者僅含少量淋巴管。
D.循環(huán)可溶性VEGFR-3融合蛋白抑制VEGF-C誘導的淋巴管生成在人乳腺癌中，使用centinel node方法跟蹤淋巴排出和轉移癌擴散(作為綜述，參見Parker等，Radiol Clin North Am，38809-23,2000)。為了跟蹤MCF-7腫瘤的淋巴排出，將伊文思藍染料注射進用VEGFR-3-Ig或對照腺病毒感染的小鼠中的VEGF-C過量表達或對照腫瘤中。對照實驗表明用VEGFR-3-Ig腺病毒感染培養(yǎng)的人胚胎腎細胞導致大量分泌可溶性VEGFR-3-Ig融合蛋白且靜脈內(nèi)感染小鼠導致血清中VEGFR-3-Ig融合蛋白的高系統(tǒng)水平。將伊文思藍染料注射進腫瘤導致淋巴管染色而血管不染色，且揭示了與對照腫瘤相比圍繞VEGF-C過量表達的腫瘤的擴張的淋巴管的數(shù)目增加。大多數(shù)擴張的淋巴管在用VEGFR-3-Ig腺病毒處理的小鼠的VEGF-C過量表達的腫瘤中不存在。
上述數(shù)據(jù)證實了在MCF-7乳房腫瘤中VEGF-C過量表達強烈且特異性地誘導腫瘤相關的淋巴管生長，但對腫瘤血管生成無重大影響。另外，證實了VEGF-C-介導的腫瘤生長增加和腫瘤相關性淋巴管形成受到可溶性VEGFR-3融合蛋白(即，一種選擇用于抑制對表達VEGFR-3的內(nèi)皮細胞的VEGF-C-介導的刺激的試劑)的抑制。
由于缺乏特異性標記，過去難以確定腫瘤是主動誘導淋巴管形成還是僅僅通過過度生長包圍已有的淋巴管且由于腫瘤內(nèi)的高間隙液壓而壓迫它們。最近來自各種實驗模型的數(shù)據(jù)表明存在后一種情況(Leu等，Cancer Res，604324-7,2000；Stohrer等，Cancer Res，604251-5，2000)。這里首次表明VEGF-C的過度表達可誘導與實驗腫瘤相關的淋巴管生長。VEGF-C誘導的腫瘤外周的淋巴管高度增生且大多數(shù)充滿腫瘤細胞，而腫瘤內(nèi)的淋巴管是扁平的且沒有腔。與正常成人組織中的淋巴管內(nèi)皮細胞不同，與MCF-7腫瘤相關的淋巴管內(nèi)皮細胞活躍增生。因此，似乎大多數(shù)腫瘤外周和腫瘤內(nèi)部的淋巴管可通過已有淋巴管內(nèi)皮細胞的增生產(chǎn)生。
通過淋巴進入局部淋巴結的癌擴散在臨床使用中長期作為一種重要的預后指標。本實施例中證實的與VEGF-C過量表達的腫瘤相關的擴張淋巴管內(nèi)部腫瘤細胞的生長非常類似于人乳腺癌中與轉移瘤擴散進淋巴結且存活率低相關的腫瘤外周的淋巴侵入(Lauria等，Cancer，761772-8，1995)。因此，本文報導的數(shù)據(jù)提供了VEGF-C表達促進通過淋巴系統(tǒng)的腫瘤轉移的證據(jù)。因此，鑒于實施例28和其它數(shù)據(jù)表明在許多類型的實體瘤血管中VEGFR-3受到增量調節(jié)(Valtola等，Am J Pathol，1541381-90，1999；Partanen等，Cancer，862406-12，1999；Kubo等，Blood，96546-553，2000)，本實施例證實了實現(xiàn)VEGF-C過量表達的腫瘤模型大都有淋巴管生成。
正如VEGFR-3融合蛋白抑制VEGF-C過量表達的腫瘤生長的能力所示，VEGF-C對腫瘤生長的影響不僅僅是由于細胞集落之間的變異。通過將伊文思藍染料注射進腫瘤，證實了大型排出淋巴管數(shù)目的增加與VEGF-C過量表達的腫瘤相關。很可能功能性淋巴管的數(shù)目越多導致淋巴排出越好，因此間隙壓力越低且VEGF-C過量表達的腫瘤中血液灌注增強。無論是VEGF-C/D-VEGFR-3介導進行性腫瘤通過血管發(fā)生的淋巴管生成達到特定的腫瘤進程，還是兩者都有，本發(fā)明的治療方法將抑制這些進程。
最后，上述結果表明腫瘤細胞產(chǎn)生的VEGF-C可誘導腫瘤周圍的淋巴管生長，從而促進癌的淋巴內(nèi)擴散。該數(shù)據(jù)表明通過，例如采用可溶性VEGFR-3蛋白的基因療法抑制腫瘤相關的淋巴管生成是抑制腫瘤轉移的有價值的方法。
實施例32
在表達可溶性VEGFR-3/FLT4的小鼠中抑制淋巴管生成前面的實施例證實了VEGF-C增加體內(nèi)腫瘤生長且該腫瘤生長的促進與淋巴管相關。VEGF-C的這些效果受到可溶性VEGFR-3融合蛋白的抑制。本實施例提供了可溶性VEGFR-3是VEGF-C/VEGF-D信號傳導的有效抑制劑的進一步證據(jù)，當在轉基因小鼠的皮膚中表達時，它抑制淋巴管生成且誘導已經(jīng)形成的淋巴管退化而血管系統(tǒng)保持完整。
更具體的說，本實施例表明由與免疫球蛋白(Ig)γ-鏈的Fc區(qū)連接的VEGFR-3胞外部分的配體結合部分組成的嵌合蛋白(VEGFR-3-Ig)中和VEGF-C和VEGF-D的活性且在小鼠表皮中在角蛋白-14(K14)啟動子控制下表達時抑制皮膚淋巴管系統(tǒng)的形成。由于在這些小鼠中血管網(wǎng)絡保持正常，因此該抑制對于淋巴管似乎是特異性的。VEGFR-3-Ig誘導胚胎發(fā)育期間淋巴管的退化，表明該受體的連續(xù)信號對于淋巴管系統(tǒng)的維持是必需的。
材料和方法A.VEGF-C，VEGF-D和VEGFR-Ig融合蛋白的生產(chǎn)人VEGF-C的成熟形式如上文實施例31和Joukov等，(EMBO J.163898-3911，1997)所述。VEGF-D從R&D Systems(Minneapolis，Minnesota)獲得。由與人IgGI Fc區(qū)融合的人VEGFRs的配體結合區(qū)組成的VEGFR-1-Ig和VEGFR-3-Ig蛋白在果蠅屬S2細胞(Invitrogen，Carlsbad，California)中生產(chǎn)。
B.VEGFR-3生物測定將表達VEGFR-3/EpoR嵌合體的Ba/F3細胞(Achen，Eur.J Biochem.267，2505-2515，2000)以15,000個細胞/孔一式三份接種在補充了100ng/ml的VEGF-C和所示濃度的VEGFR-Ig蛋白的96-孔微量滴定平板上。48小時后，通過加入MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-yl)-2，5-二苯基溴化四氮唑(Sigma)，0.5mg/ml)測定細胞活力，接著再培養(yǎng)2小時，加入等體積的細胞溶胞產(chǎn)物溶液(10％SDS，10nM HCl)并在37℃下培養(yǎng)過夜。在540nm下測量吸光度。
C.轉基因小鼠的產(chǎn)生使用PCR擴增編碼人VEGFR-3 Ig-同源性結構域1-3的序列。用于該目的的引物是5′-TACAAAGCTTTTCGCCACCATGCAG-3′(SEQ ID NO23)和5’-IACAGGATCCI℃ATGCACAATGACCTC-3′(SEQ ID NO24)。
將該PCR產(chǎn)物克隆進plg-plus載體(Ingenius，R & D Systems)的含有人IgGI Fc尾的閱讀框中。然后將VEGFR-3-Ig構建體轉移進人角蛋白-14啟動子表達載體中。將該表達盒片斷注射進FVB/NIH和DBAxBalbC雜交品種的受精的小鼠卵母細胞中產(chǎn)生7個品系的K14-VEGFR-3-Ig小鼠。分析轉基因表達且從表達轉基因的所有3個建立品系按下文所述證實其表型。
D.轉基因表達的分析對于northern印跡，對在1％瓊脂糖中的從皮膚提取的10μg總RNA進行電泳，轉移到尼龍膜(Nytran)上，用相應的[32P]-標記的cDNA探針進行雜交且通過放射自顯影法曝光。對于western印跡，將皮膚活組織勻漿進補充了1mM PMSF，1mU/ml抑蛋白酶肽，1mM Na3VO4和10μg/ml亮抑蛋白酶肽的裂解緩沖液(20mM Tris，pH7.6，1mM EDTA，50mM NaCl，50mM NaF，1％ Triton-X100)中。從1mg總蛋白中沉淀Ig-融合蛋白并在SDS-PAGE中分離，轉移到硝化纖維素上并使用辣根過氧化物酶偶連的兔抗人IgG抗體(DAKO，Carpinteria，California)和增強化學發(fā)光檢測系統(tǒng)進行檢測。
E.免疫組織化學和TUNEL染色用抗小鼠VEGFR-3的大鼠單克隆抗體(Kubo等，Blood 96546-553，2000)或CD31/PECAM-1(PharMingen，San Diego，California)，抗小鼠LYVE-1的兔多克隆抗體(Banerji等，J Cell Biol，144789-801，1999)，或生物素標記的抗人IgG Fc區(qū)的小鼠單克隆抗體(Zymed，San Diego，California)染色來自4％多聚甲醛(PFA)固定的組織的石蠟切片(5μm)。對于TUNEL染色，使用原位細胞死亡檢測試劑盒(熒光素；Roche，Indianapolis，IN)進行DNA片斷的檢測。
F.血管和淋巴管的觀察為了觀察血管(Thurston等，Science 286，2511-2514(1999))，通過股靜脈注射(IV)100μl 1mg/ml生物素標記的番茄(Lycopersicon esculentum)凝集素(Sigma)且使其循環(huán)2分鐘。通過用PBS中的1％ PFA/0.5％戊二醛灌注固定后，通過ABC-3，3′-二氨基聯(lián)苯胺過氧化物酶反應觀察結合的凝集素。然后通過β-半乳糖苷酶底物X-Gal(Sigma，St.Louis，MO)染色VEGFR-3+/LacZ小鼠中的淋巴管。為了觀察功能性淋巴管，將伊文思藍染料(5mg/ml；Sigma，St.Louis，MO)注射進下肢爪墊或者將TRITC-葡聚糖(Sigma，8mg/ml)注射進耳朵或尾巴并分別通過光學或熒光顯微鏡分析淋巴管。
G.血清中VEGFR-3-Ig蛋白的檢測用抗人IgG(Zymed，2μg/ml溶于PBS中)或人VEGFR-3(克隆7B8，4μg/ml)的小鼠抗體覆蓋ELISA平板(Nunc Maxisorp，Copenhagen，Denmark)。將小鼠血清稀釋進溫育緩沖液(5mg/ml BSA，0.05％ Tween 20溶于PBS中)并使其在室溫下結合2小時。然后在加入小鼠抗人IgG1(Zymed，1∶500)前1小時用溫育緩沖液洗滌平板3次。然后在孔中溫育與堿性磷酸酶偶連的鏈霉菌抗生物素蛋白(Zymed，1∶5000)30分鐘，接著加入底物(1mg/ml對硝基苯磷酸溶于0.1M二乙醇胺，pH10.3中)且在405nm下閱讀吸光度。
H.磁共振成像使用連接到9.4 T垂直磁體(Oxford Instruments，Oxford，UK)上的s.m.i.s.控制臺(Surrey Medical Imaging Systems，Guildford，UK)獲得MRI數(shù)據(jù)。使用單環(huán)表面線圈(直徑為35mm)用于信號傳輸和檢測。T2-加權的(TR2000ms，TE 40ms，4次掃描/行)多切片自旋-回波順序使用的FOV為25.6mm2(矩陣大小256×128)且切片厚度橫向為1.3mm。集中在1.2ppm的飽和脈沖用于減少T2-圖像中的脂肪信號。使用在自旋-回波順序(TR 2000ms，TE 40ms)中沿切片軸的單極擴散梯度(b-值≈800s/mm2)獲得擴散加權的MRI，通過將MRI數(shù)據(jù)擬合成b-值的單指數(shù)函數(shù)計算水表面擴散系數(shù)(ADC)。
結果A.可溶性VEGFR-3抑制VEGF-C-介導的體外信號傳導為了抑制通過VEGFR-3的VEGF-C信號傳導，采用由VEGFR-3的前3個Ig-同源結構域和IgG Fc結構域組成的融合蛋白。VEGFR-3-Ig以與全長胞外域相同的效率結合VEGF-C和VEGF-D并抑制VEGF-C-誘導的VEGFR-3磷酸化及隨后在表達VEGFR-3的內(nèi)皮細胞中p42/p44促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)激活。相反，不結合VEGF-C的相似VEGFR-1-Ig融合蛋白不影響p42/p44 MAPK激活。
使用能夠在不存在IL-3的條件下傳輸IL-3依賴型Ba/F3細胞的VEGF-C依賴型存活和增生信號的嵌合VEGFR-3/促紅細胞生成素(Epo)受體在生物試驗中也測定了可溶性VEGFR-3對VEGF-C信號傳導的影響(Achen等，Eur.J.Biochem.，2672505-2515，2000)。在該細胞測定中，在0.5∶1摩爾比(VEGFR-3-IgVEGF-C)下VEGF-C-依賴型細胞存活受到完全抑制，而VEGFR-1-Ig無影響。同樣，VEGFR-3-Ig也消除VEGFR-3/EpoR細胞的VEGF-D-誘導型存活。相反，即使VEGFR-2-Ig的摩爾數(shù)過量10倍也只能部分消除VEGF-C依賴性活力，這也許是由于VEGF-C與VEGFR-2的親和性更低。
B.可溶性VEGFR-3抑制體內(nèi)淋巴管的形成為了測定體內(nèi)VEGFR-3-Ig的抑制效果，在指導轉基因表達到皮膚的基層表皮細胞中的K14啟動子控制下表達該融合蛋白。通過對皮膚RNA的northern印跡和對皮膚蛋白提取物的western印跡檢測小鼠中的VEGFR-3-Ig表達。這些小鼠表現(xiàn)健康且能生育并具有正常壽命。對皮膚的組織學檢查揭示了真皮和皮下層增厚?？贵w染色證實了在基層角質細胞中表達VEGFR-3-Ig。染色皮膚切片的淋巴管內(nèi)皮標記VEGFR-3(Jussila等，CancerRes.581599-1604，1998；Kubo等，Blood，96546-553，2000)和LYVE-1(Banerji等，J Cell Biol，144789-801，1999)時，在轉基因小鼠中沒有觀察到淋巴管，即使在對照小鼠的皮膚中淋巴管被染色。相反，在轉基因和野生型皮膚中均染色了血管的泛內(nèi)皮標記PECAM-1/CD31。
C.可溶性VEGFR-3抑制淋巴管生成但不能抑制血管生成為了更好地觀察淋巴管，將K14-VEGFR-3-Ig小鼠與在Flt4基因座表達β-gal的雜合型VEGFR-3+/LacZ小鼠(Dumont等，Science 282，946-949，1998)交配。當使用底物X-gal染色耳朵皮膚的整體固定的組織標本時，沒有檢測到淋巴管，而在對照小鼠中，觀察到染成藍色的淋巴管。在使用生物素標記的凝集素進行的血管灌注染色(Thurston等，Science 286，2511-2514，1999)中，在K14-VEGFR-3-Ig小鼠中血管表現(xiàn)正常。
使用功能性測定監(jiān)測注射進皮膚的伊文思藍染料或TRITC-葡聚糖的命運也證實了不存在淋巴管。注射進野生型小鼠下肢爪墊后，該染料迅速集中到圍繞坐骨靜脈的淋巴管，而在集合淋巴管不存在或者退化的轉基因小鼠中在該淋巴管中未見染料。對真皮內(nèi)注射進耳朵或尾巴的TRITC葡聚糖使用熒光顯微鏡檢術也觀察到對照小鼠中的淋巴管，而在轉基因小鼠中未見該淋巴管。
D.循環(huán)可溶性VEGFR-3與內(nèi)部器官的淋巴組織瞬時丟失相關在兩周大時，與對照VEGFR-3+/LacZ同窩交配的小鼠相比時，VEGFR-3-Ig/VEGFR-3+/LacZ小鼠在諸如隔膜，心，肺，盲腸，胰腺，腸系膜和食道的器官內(nèi)如果還有淋巴管，也僅有少量薄且退化的淋巴管。通過免疫染色VEGFR-3和LYVE-1證實了X-Gal染色獲得的該發(fā)現(xiàn)。另外，在心包中缺乏淋巴管與至少一些小鼠中心包液的積累相關。在3周大時，淋巴管的再生長明顯。在成年轉基因小鼠中，只有一些諸如心臟和隔膜的器官有異常形式和不完全發(fā)育的淋巴管。
在內(nèi)部器官中可見的該效果表明可溶性VEGFR-3-Ig蛋白質在血流中循環(huán)。事實上使用特異性酶聯(lián)免疫吸附試驗在轉基因小鼠血清中檢測到該融合蛋白；其水平在100-200ng/ml之間變化，在幼齡小鼠中最高。根據(jù)我們的體外實驗，該濃度可中和大約20-40ng/ml的VEGF-C。VEGFR-3-Ig蛋白在血流中相當穩(wěn)定，因為靜脈內(nèi)注射的重組VEGFR-3-Ig在血清中存在至少9小時。
E.轉基因表型具有人淋巴水腫特征K14-VEGFR-3-Ig小鼠與其野生型同窩交配小鼠的區(qū)別在于其腳腫脹，且在出生時已經(jīng)可見。老年小鼠表現(xiàn)出皮膚增厚，真皮纖維變性和皮下脂肪沉積增加。磁共振成像(MRI)揭示了在轉基因小鼠的腳部皮膚和皮下組織有顯著的T2-高強度區(qū)，表明液體累積增加，而在同窩交配的對照小鼠中沒有該區(qū)域。這些高強度區(qū)的表面擴散系數(shù)(ADC)為1.99
×10-3mm2/s，比ADC為1.32
×10-3mm2/s的正常組織更高，且比脂肪的該值高大約1-2個數(shù)量級(Thurston，等，Science 286，2511-2514(1999)。另外，淋巴結的大小和外觀有變化，特別是在圍繞下腔靜脈的大型主動脈旁淋巴結中。然而，在VEGFR-3-Ig小鼠中可見腸系膜淋巴結和淋巴集結。
F.發(fā)育中的淋巴管通過內(nèi)皮細胞的編程性細胞死亡進行退化在胚胎發(fā)生期間，在E14.5時出現(xiàn)K14-啟動的轉基因表達顯著增加，到E16.5時，該表達包圍整個胚胎皮膚(Byrne，等，Development 120，2369-2383，1994)。當通過X-Gal染色在VEGFR-3+/LacZ背景中分析時，E15的轉基因和野生型胚胎之間皮膚的淋巴網(wǎng)無區(qū)別。在E15.5-16.5時，轉基因胚胎的淋巴管在某些區(qū)域退化。在E17.5時，淋巴管仍形成連續(xù)網(wǎng)絡但是比對照胚胎中更細。在E18.5時，轉基因胚胎中全部皮膚淋巴網(wǎng)絡中斷，且在出生后在皮膚中沒有或者僅有少量單個中斷的淋巴管，主要伴隨著大型皮膚血管。因此，在胚胎發(fā)生期間在皮膚中開始形成淋巴管，但是當轉基因開始表達時發(fā)生退化。然而，正如在Tie-啟動子-LacZ背景中通過X-Gal染色所示，在K14-VEGFR-3-Ig胚胎中不會抑制皮膚血管系統(tǒng)的形成(Korhonen等，Blood86，1828-1835(1995))。
使用TUNEL染色檢測內(nèi)皮細胞中的編程性細胞死亡，通過同時染色PECAM-1可鑒定該細胞。在E17.5和E18.5時在轉基因胚胎的真皮中首先看見編程性死亡的內(nèi)皮細胞。在野生型胚胎中沒有看見內(nèi)皮細胞的編程性死亡。在轉基因皮膚中幾乎僅在VEGFR-3陽性內(nèi)皮中檢測到TUNEL-陽性細胞，表明VEGFR-3-Ig介導的編程性細胞死亡靶向淋巴管內(nèi)皮。
本實施例表明可溶性VEGFR-3融合蛋白抑制淋巴管生成且導致已有的胎兒體內(nèi)淋巴管退化。因此連續(xù)的VEGFR-3信號傳導是胎兒發(fā)育和淋巴管系統(tǒng)的維持所必需的。
K14-VEGFR-3-Ig小鼠的皮膚中缺乏淋巴管與在諸如人淋巴水腫(淋巴系統(tǒng)不全引起的一種疾病且其特征在于嚴重性遞增的肢端腫大)的真皮且特別是皮下脂肪層的增厚相關(Witte等，淋巴管發(fā)生機理，意義和臨床含義。參見Regulation of Angiogenesis(編輯，Goldberg，I.D.& Rosen，E.M.)65-112(Birkhauser Verlag，Basel，瑞士)1997；Mortimer，Cancer 83，2798-2802(1998))。在作為遺傳疾病的原發(fā)性淋巴水腫中，表面或皮下淋巴管通常發(fā)育不全或有再生障礙，它們不能將淋巴液轉運進靜脈循環(huán)。當手術，輻射，感染或創(chuàng)傷損傷淋巴管時形成非遺傳的繼發(fā)性或獲得性淋巴水腫。在淋巴水腫中，間隙空間內(nèi)富含蛋白的液體累積導致組織纖維變性和脂肪變性，干擾傷口愈合，且對感染易感。在K14-VEGFR-3-Ig小鼠中，在真皮中缺乏大分子運輸，且特別是在老年小鼠中存在真皮纖維變性的跡象。另外，在轉基因小鼠中腳腫大且在皮膚和皮下組織中液體累積增加與人淋巴水腫的癥狀相似。因此K14-VEGFR-3-Ig小鼠的皮膚表型共有人淋巴水腫的一些特征。在一些淋巴水腫家族的研究中，在Flt4的酪氨酸激酶編碼區(qū)中檢測到雜合失活的錯義突變(Karkkainen等，Nature Genet.，25153-159，2000；Irrthum等，Am.J.Hum.Gen.67259-301 2001)。至少一些淋巴水腫患者由于VEGFR-3信號傳導有缺陷而具有淋巴機能障礙。與這些觀察一致，本實施例中的結果表明通過可溶性VEGFR-3蛋白中斷VEGFR-3的信號傳導可完全破壞淋巴網(wǎng)絡并導致淋巴水腫樣表型。另外，在一些淋巴水腫病例中，某些局部淋巴結的大小和外觀可變，表明淋巴流動和有功能的淋巴管系統(tǒng)是正常淋巴結形成所必需的。
VEGFR-3-Ig也誘導已經(jīng)形成的淋巴管退化。因此，發(fā)育期間抑制VEGF-C和/或VEGF-D與VEGFR-3的結合導致淋巴管內(nèi)皮細胞的編程性細胞死亡和淋巴管網(wǎng)絡的破壞，這表明連續(xù)的VEGFR-3信號是淋巴管內(nèi)皮細胞存活所必需的。在細胞培養(yǎng)物中，VEGFR-3激活與內(nèi)皮細胞存活相關的生化信號傳導級聯(lián)。盡管在皮膚中過量表達VEGF-C(Jeltsch等，Science，2761423-1425，1997)或VEGF-D的轉基因小鼠形成增生的真皮淋巴管系統(tǒng)，但是當與K14-VEGFR-3-Ig小鼠交配時其真皮淋巴管也退化。由于兩種VEGFR-3配體也在皮膚中表達，因此在K14-VEGFR-3-Ig小鼠中觀察到的表型可能是由于同時抑制了VEGF-C和VEGF-D。
盡管VEGF-C和VEGF-D對于體外和體內(nèi)的血管內(nèi)皮細胞都具有促有絲分裂活性(Joukov等，EMBO J.16，3898-3911，1997；Achen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，548-553，1998；Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，14389-143921998；Witzenbichler等，Am.J..Pathol.153，381-394，1998；Marconcini等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，9671-9676，1999)，但是VEGFR-3-Ig似乎不影響血管。K14-啟動子表達的延遲起動可解釋VEGFR-3-Ig蛋白的淋巴管特異性。在大約E14.5-16.5之前看不到K14-啟動子活性的大量增加(Byrne等，Development 1202369-2383，1994)。盡管在E8.5時在發(fā)育中的血管中首先檢測到內(nèi)源性VEGFR-3的表達，但到E14.5-16.5時，在健康血管內(nèi)皮中該表達受到大幅度減量調節(jié)(Dumont等，Science 282，946-949 1998；Kaipainen，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，3566-3570，1995)。因此，在發(fā)育期間，當正常情況下在健康組織的血管內(nèi)皮中不再存在VEGFR-3時，VEGFR-3信號比其它受體在皮膚的血管發(fā)生中起更小的作用。
在幼齡VEGFR-3-Ig小鼠中，一些內(nèi)部器官幾乎完全缺乏淋巴管，但是它們在成年小鼠中再生，盡管在一些器官中再生成異常形式。因此淋巴管系統(tǒng)的生長和維持可在成年器官中被再活化。VEGFR-3抑制水平的降低或來自例如，成熟結締組織基質的獨立信號可再活化淋巴管發(fā)生，但是沒有獲得可表明VEGF-C或VEGF-D水平增加對其負責的證據(jù)。然而，通過腺病毒載體以超過通常在間隙液中發(fā)現(xiàn)的VEGF-C的量施用VEGF-C可導致成人組織中的淋巴管生長。在基因治療中使用不再結合VEGFR-2的修飾的VEGF-C(美國專利號6,130,071；Joukev等，J.Biol.Chem.，2736599-6602)可防止其對血管內(nèi)皮的潛在影響。
因此，可溶性VEGFR-3是體內(nèi)淋巴管發(fā)生的有效且特異性的抑制劑。可溶性VEGFR-3包含在本說明書別處所述的Flt4的胞外片斷。正如上文所見，優(yōu)選的可溶性VEGFR-3是包含VEGFR-3前3個結構域的VEGFR-3，然而，應明白可溶性VEGFR-3可以是或多或少含有圖2所示的VEGFR-3野生型序列的VEGFR-3的片斷。例如，該可溶性肽也可包含一個或多個IgIV，IgV，IgVI，IgVII。作為選擇，可溶性VEGFR-3可包含只有IgI與選自由IgII，IgIII，IgIV，IgV，IgVI和IgVII組成的組中的一個或多個結構域的任意組合。
另外，本實施例還建立了具有人淋巴水腫特征的小鼠模型。由于淋巴水腫通常與皮膚相關，因此該小鼠模型用于了解和鑒定該疾病和用于試驗可應用于病人的新療法。
在本發(fā)明小結和詳細描述中引證的包括專利和雜志文章的所有文獻在此引用以其整體作為參考。
盡管結合其具體實施方案已經(jīng)在此描述了本發(fā)明，但應理解可作出進一步的修改，且本申請試圖覆蓋一般遵循本發(fā)明的原理且包括與本說明書有偏差的本發(fā)明的任何變化，用法，或改編，因為它們落在本發(fā)明所屬領域的已知或常規(guī)實踐的范圍內(nèi)，且可應用于上文所述和下面所附權利要求書范圍內(nèi)的必要特征。
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<221>CDS<222>(20)..(3913)<400>1ccacgcgcag cggccggag atg cag cgg ggc gcc gcg ctg tgc ctg cga ctg 52Met Gln Arg Gly Ala Ala Leu Cys Leu Arg Leu1 5 10tgg ctc tgc ctg gga ctc ctg gac ggc ctg gtg agt ggc tac tcc atg 100Trp Leu Cys Leu Gly Leu Leu Asp Gly Leu Val Ser Gly Tyr Ser Met15 20 25acc ccc ccg acc ttg aac atc acg gag gag tca cac gtc atc gac acc 148Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val Ile Asp Thr30 35 40ggt gac agc ctg tcc atc tcc tgc agg gga cag cac ccc ctc gag tgg 196Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro Leu Glu Trp45 50 55gct tgg cca gga gct cag gag gcg cca gcc acc gga gac aag gac agc 244Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp Lys Asp Ser60 65 70 75gag gac acg ggg gtg gtg cga gac tgc gag ggc aca gac gcc agg ccc 292
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atc agc ctg gag ctg gtg gtg aat gtg ccc ccc cag ata cat gag aag 1300Ile Ser Leu Glu Leu Val Val Asn Val Pro Pro Gln Ile His Glu Lys415 420 425gag gcc tcc tcc ccc agc atc tac tcg cgt cac agc cgc cag gcc ctc 1348Glu Ala Ser Ser Pro Ser Ile Tyr Ser Arg His Ser Arg Gln Ala Leu430 435 440acc tgc acg gcc tac ggg gtg ccc ctg cct ctc agc atc cag tgg cac 1396Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Val Pro Leu Pro Leu Ser Ile Gln Trp His445 450 455tgg cgg ccc tgg aca ccc tgc aag atg ttt gcc cag cgt agt ctc cgg 1444Trp Arg Pro Trp Thr Pro Cys Lys Met Phe Ala Gln Arg Ser Leu Arg460 465 470 475cgg cgg cag cag caa gac ctc atg cca cag tgc cgt gac tgg agg gcg 1492Arg Arg Gln Gln Gln Asp Leu Met Pro Gln Cys Arg Asp Trp Arg Ala480 485 490gtg acc acg cag gat gcc gtg aac ccc atc gag agc ctg gac acc tgg 1540Val Thr Thr Gln Asp Ala Val Asn Pro Ile Glu Ser Leu Asp Thr Trp495 500 505acc gag ttt gtg gag gga aag aat aag act gtg agc aag ctg gtg atc 1588Thr Glu Phe Val Glu Gly Lys Asn Lys Thr Val Ser Lys Leu Val Ile510 515 520cag aat gcc aac gtg tct gcc atg tac aag tgt gtg gtc tcc aac aag 1636Gln Asn Ala Asn Val Ser Ala Met Tyr Lys Cys Val Val Ser Asn Lys525 530 535gtg ggc cag gat gag cgg ctc atc tac ttc tat gtg acc acc atc ccc 1684Val Gly Gln Asp Glu Arg Leu Ile Tyr Phe Tyr Val Thr Thr Ile Pro540 545 550 555gac ggc ttc acc atc gaa tcc aag cca tcc gag gag cta cta gag ggc 1732Asp Gly Phe Thr Ile Glu Ser Lys Pro Ser Glu Glu Leu Leu Glu Gly560 565 570cag ccg gtg ctc ctg agc tgc caa gcc gac agc tac aag tac gag cat 1780Gln Pro Val Leu Leu Ser Cys Gln Ala Asp Ser Tyr Lys Tyr Glu His575 580 585ctg cgc tgg tac cgc ctc aac ctg tcc acg ctg cac gat gcg cac ggg 1828Leu Arg Trp Tyr Arg Leu Asn Leu Ser Thr Leu His Asp Ala His Gly590 595 600aac ccg ctt ctg ctc gac tgc aag aac gtg cat ctg ttc gcc acc cct 1876Asn Pro Leu Leu Leu Asp Cys Lys Asn Val His Leu Phe Ala Thr Pro605 610 615ctg gcc gcc agc ctg gag gag gtg gca cct ggg gcg cgc cac gcc acg 1924Leu Ala Ala Ser Leu Glu Glu Val Ala Pro Gly Ala Arg His Ala Thr620 625 630 635ctc agc ctg agt atc ccc cgc gtc gcg ccc gag cac gag ggc cac tat 1972Leu Ser Leu Ser Ile Pro Arg Val Ala Pro Glu His Glu Gly His Tyr640 645 650gtg tgc gaa gtg caa gac cgg cgc agc cat gac aag cac tgc cac aag 2020Val Cys Glu Val Gln Asp Arg Arg Ser His Asp Lys His Cys His Lys
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Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly Asn His Leu Asn Val Val Asn Leu900 905 910Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gln Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu915 920 925Phe Cys Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Phe Leu Arg Ala Lys Arg Asp930 935 940Ala Phe Ser Pro Cys Ala Glu Lys Ser Pro Glu Gln Arg Gly Arg Phe945 950 955 960Arg Ala Met Val Glu Leu Ala Arg Leu Asp Arg Arg Arg Pro Gly Ser965 970 975Ser Asp Arg Val Leu Phe Ala Arg Phe Ser Lys Thr Glu Gly Gly Ala980 985 990Arg Arg Ala Ser Pro Asp Gln Glu Ala Glu Asp Leu Trp Leu Ser Pro99510001005Leu Thr Met Glu Asp Leu Val Cys Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg Gly101010151020Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala025103010351040Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Ser Asp Val Val Lys Ile Cys Asp Phe104510501055Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly106010651070Ser Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp107510801085Lys Val Tyr Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu109010951100Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val Gln Ile105111011151120Asn Glu Glu Phe Cys Gln Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Met Arg Ala112511301135Pro Glu Leu Ala Thr Pro Ala Ile Arg Arg Ile Met Leu Asn Cys Trp114011451150Ser Gly Asp Pro Lys Ala Arg Pro Ala Phe Ser Glu Leu Val Glu Ile115511601165Leu Gly Asp Leu Leu Gln Gly Arg Gly Leu Gln Glu Glu Glu Glu Val117011751180Cys Met Ala Pro Arg Ser Ser Gln Ser Ser Glu Glu Gly Ser Phe Ser185119011951200Gln Val Ser Thr Met Ala Leu His Ile Ala Gln Ala Asp Ala Glu Asp120512101215
Ser Pro Pro Ser Leu Gln Arg His Ser Leu Ala Ala Arg Tyr Tyr Asn122012251230Trp Val Ser Phe Pro Gly Cys Leu Ala Arg Gly Ala Glu Thr Arg Gly123512401245Ser Ser Arg Met Lys Thr Phe Glu Glu Phe Pro Met Thr Pro Thr Thr125012551260Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu Ala265127012751280Ser Glu Glu Phe Glu Gln Ile Glu Ser Arg His Arg Gln Glu Ser Gly128512901295Phe Ser Cys Lys Gly Pro Gly Gln Asn Val Ala Val Thr Arg Ala His130013051310Pro Asp Ser Gln Gly Arg Arg Arg Arg Pro Glu Arg Gly Ala Arg Gly131513201325Gly Gln Val Phe Tyr Asn Ser Glu Tyr Gly Glu Leu Ser Glu Pro Ser133013351340Glu Glu Asp His Cys Ser Pro Ser Ala Arg Val Thr Phe Phe Thr Asp345135013551360Asn Ser Tyr<210>5<211>1311<212>PRT<213>人(Homo sapiens)(FLT1)<400>5Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro20 25 30Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr35 40 45Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro50 55 60Glu Asn Asn Asn Asn Asn Asn Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu65 70 75 80Ser Ile Thr Lys Ser Ala Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser85 90 95Thr Leu Thr Leu Asn Thr Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser100 105 110Cys Lys Tyr Leu Ala Val Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser115 120 125
Ala Ile Tyr Ile Phe Ile Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met130 135 140Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu145 150 155 160Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys165 170 175Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp180 185 190Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile195 200 205Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr210 215 220Asn Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln225 230 235 240Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val245 250 255Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr260 265 270Trp Ser Tyr Pro Asp Asn Asn Asn Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser Val275 280 285Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr Ser290 295 300Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr305 310 315 320Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val325 330 335His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val Lys His Arg Lys Gln Gln340 345 350Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser Tyr Arg Leu Ser Met Lys355 360 365Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val Trp Leu Lys Asp Gly Leu370 375 380Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu Thr Arg Gly Tyr Ser Leu385 390 395 400Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Ile Leu405 410 415Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys Asn Leu Thr Ala Thr Leu420 425 430Ile Val Asn Val Lys Pro Gln Ile Tyr Glu Lys Ala Val Ser Ser Phe435 440 445Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser Arg Gln Ile Leu Thr Cys450 455 460
Thr Ala Tyr Gly Ile Pro Gln Pro Asn Thr Ile Lys Trp Phe Trp His465 470 475 480Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu Ala Arg Cys Asp Phe Cys Ser Asn485 490 495Asn Glu Glu Ser Phe Ile Leu Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ala500 505 510Asp Ser Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr Gln Arg Met Ala515 520 525Ile Ile Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val Val Ala Asp530 535 540Ser Arg Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala Ser Asn Lys Val Gly545 550 555 560Thr Val Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr Asp Val Pro Asn Gly565 570 575Phe His Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Asn Asn Glu Gly Glu Asp580 585 590Leu Lys Leu Ser Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val Thr595 600 605Trp Ile Leu Leu Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn610 615 620Asn Asn Asn Asn Asn Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser625 630 635 640Ile Ser Lys Gln Lys Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile Thr Leu645 650 655Asn Leu Thr Ile Met Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ala660 665 670Cys Arg Ala Arg Asn Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln Lys Lys675 680 685Glu Ile Thr Ile Arg Asp Gln Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu690 695 700Ser Asp His Thr Val Ala Ile Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His705 710 715 720Ala Asn Gly Val Pro Glu Pro Gln Ile Thr Trp Phe Lys Asn Asn His725 730 735Lys Ile Gln Gln Glu Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr740 745 750Leu Phe Ile Glu Arg Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys755 760 765Lys Ala Thr Asn Gln Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr770 775 780
Val Gln Gly Thr Ser Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu Ile Thr Leu Thr785 790 795 800Cys Thr Cys Val Ala Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Leu805 810 815Ile Arg Lys Met Lys Arg Ser Ser Asn Ser Glu Ile Lys Thr Asp Tyr820 825 830Leu Ser Ile Ile Met Asp Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gln Cys835 840 845Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg850 855 860Leu Lys Leu Gly Lys Ser Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val865 870 875 880Gln Ala Ser Ala Phe Gly Ile Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val885 890 895Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala900 905 910Leu Met Thr Glu Leu Lys Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn915 920 925Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Gln Gly Gly Pro Leu Met930 935 940Val Ile Val Glu Tyr Cys Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys945 950 955 960Ser Lys Arg Asp Leu Phe Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met965 970 975Glu Pro Lys Lys Glu Lys Met Glu Pro Gly Leu Glu Gln Gly Lys Lys980 985 990Pro Arg Leu Asp Ser Val Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly99510001005Phe Gln Glu Asp Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser101010151020Asp Gly Phe Tyr Lys Glu Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr1025 103010351040Ser Phe Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys104510501055Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn106010651070Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn107510801085Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met109010951100Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val
1105 111011151120Trp Ser Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser112511301135Pro Tyr Pro Gly Val Gln Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu Arg114011451150Glu Gly Met Arg Met Arg Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu Ile Tyr115511601165Gln Ile Met Leu Asp Cys Trp His Arg Asp Pro Lys Glu Arg Pro Arg117011751180Phe Ala Glu Leu Val Glu Lys Leu Gly Asp Leu Leu Gln Ala Asn Val1185 119011951200Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Pro Ile Asn Ala Ile Leu Thr Gly120512101215Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Thr Pro Ala Phe Ser Glu Asp Phe Phe122012251230Lys Glu Ser Ile Ser Ala Pro Lys Phe Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp123512401245Val Arg Tyr Val Asn Ala Phe Lys Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys125012551260Thr Phe Glu Glu Leu Leu Pro Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr1265 127012751280Gln Gly Asp Ser Ser Thr Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe128512901295Thr Trp Thr Asp Ser Lys Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Glu Val130013051310<210>6<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在第1位和第2位的氨基酸獨立地選自天冬氨酸或谷氨酸<220>
<223>在第4位的氨基酸獨立地選自甲硫氨酸或纈氨酸<220>
<223>在第5位的氨基酸獨立地選自脯氨酸或天冬氨酸或谷氨酸<220>
<223>人工序列的描述共有序列<400>6Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Met1 5<210>7<211>70
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>7acatgcatgc caccatgcag cggggcgccg cgctgtgcct gcgactgtgg ctctgcctgg 60gactcctgga70<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>8acatgcatgc cccgccggtc atcc 24<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>9cggaattccc catgacccca ac22<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>10ccatcgatgg atcctacctg aagccgcttt ctt 33<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>11cccaagcttg gatccaagtg gctactccat gacc 34
<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>12gttgcctgtg atgtgcacca 20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>13ctggagtcga cttggcggac t 21<210>14<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>14cgcggatccc tagtgatggt gatggtgatg tctaccttcg atcatgctgc ccttatcctc 60<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>15ctggagtcga cttggcggac t 21<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>16cgggatccct ccatgctgcc cttatcct28
<210>17<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>17ggcaagcttg aattcgccac catgcagcgg ggcgcc 36<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>18gttgcctgtg atgtgcacca 20<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>19ctggagtcga cttggcggac t 21<210>20<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>20cgcggatcca agcttactta ccttccatgc tgcccttatc ctcg 44<210>21<211>419<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala1 5 10 15Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe
20 25 30Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala35 40 45Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser50 55 60Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met65 70 75 80Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln85 90 95Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala100 105 110His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys115 120 125Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe130 135 140Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr145 150 155 160Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr165 170 175Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu180 185 190Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser195 200 205Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile210 215 220Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn225 230 235 240Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys245 250 255Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser260 265 270Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu275 280 285Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys290 295 300Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys305 310 315 320Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu325 330 335Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro340 345 350
Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys355 360 365Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr370 375 380Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser385 390 395 400Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro405 410 415Gln Met Ser<210>22<211>354<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Met Tyr Arg Glu Trp Val Val Val Asn Val Phe Met Met Leu Tyr Val1 5 10 15Gln Leu Val Gln Gly Ser Ser Asn Glu His Gly Pro Val Lys Arg Ser20 25 30Ser Gln Ser Thr Leu Glu Arg Ser Glu Gln Gln Ile Arg Ala Ala Ser35 40 45Ser Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ile Thr His Ser Glu Asp Trp Lys Leu50 55 60Trp Arg Cys Arg Leu Arg Leu Lys Ser Phe Thr Ser Met Asp Ser Arg65 70 75 80Ser Ala Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp Ile85 90 95Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg Thr Gln Cys Ser100 105 110Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr115 120 125Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly130 135 140Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr145 150 155 160Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro165 170 175Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu180 185 190Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile Arg Arg Ser Ile Gln195 200 205Ile Pro Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro Ile
210 215 220Asp Met Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu Gln Glu Glu225 230 235 240Asn Pro Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gln Glu Pro Ala245 250 255Leu Cys Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys Glu Cys Val260 265 270Cys Lys Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu Ile Gln His Pro Lys Asn Cys275 280 285Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gln Lys His290 295 300Lys Leu Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe305 310 315 320His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys325 330 335Arg Phe Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro His Ser Arg Lys340 345 350Asn Pro
權利要求
1.一種純化的多肽，它包含哺乳動物血管內(nèi)皮生長因子受體-3(VEGFR-3)胞外域(EC)的一部分，其中所述的部分結合至少一種VEGFR-3配體且由VEGFR-3 EC的至少第一個，第二個，和第三個免疫球蛋白樣結構域組成，且其中該多肽缺少VEGFR-3免疫球蛋白結構域IV-VII，其中該多肽是缺少任何跨膜結構域的可溶性多肽。
2.根據(jù)權利要求1的純化多肽，其中該部分基本上由VEGFR-3-EC的第一個，第二個，和第三個免疫球蛋白結構域組成。
3.根據(jù)權利要求1-2任一項的純化多肽，其中VEGFR-3是人VEGFR-3。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一項的純化多肽，其中該多肽還包含VEGFR-2或VEGFR-3的免疫球蛋白樣結構域。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一項的純化多肽，其中該VEGFR-3包含選自由SEQ ID NO2和SEQ ID NO4組成的組中的一個氨基酸序列。
6.根據(jù)權利要求1-4中任一項的純化多肽，其中該VEGFR-3包含由多核苷酸或寡核苷酸編碼的氨基酸序列，該多核苷酸或寡核苷酸在所述多核苷酸或寡核苷酸不能與編碼VEGFR-1的人基因雜交的雜交條件下與編碼VEGFR-3的人基因雜交，所述的雜交條件包括(a)雜交溶液含有50％的甲酰胺，5x Denhardt′s溶液，5x SSPE，0.1％SDS，和0.1mg/ml超聲處理的鮭精DNA；(b)在42℃的溫度中雜交持續(xù)18至24小時；和(c)雜交后在65℃的洗滌溫度中洗滌，所用洗滌溶液包含1x SSC和0.1％SDS。
7.一種融合蛋白，它含有與免疫球蛋白Fc肽融合的根據(jù)權利要求1-6任一項的多肽。
8.根據(jù)權利要求1-7任一項的多肽或融合蛋白，它還包含附著到該多肽上的細胞毒性劑。
9.根據(jù)權利要求8的多肽或融合蛋白，其中該細胞毒性劑選自由植物毒素，細菌毒素，真菌毒素，放射性同位素，抗代謝產(chǎn)物，烷基化試劑，抗有絲分裂劑，和DNA插入劑組成的組中。
10.一種組合物，它含有根據(jù)權利要求1-9任一項的多肽或融合蛋白以及一種藥用上可接受的載體。
11.一種多核苷酸，它含有編碼根據(jù)權利要求1-7任一項的多肽或融合蛋白的核苷酸序列。
12.根據(jù)權利要求11的多核苷酸，還包含與編碼該多肽的序列可操作相連的表達控制序列。
13.一種表達載體，它包含與根據(jù)權利要求11的多核苷酸可操作地相連的表達調控序列。
14.根據(jù)權利要求13的表達載體，其中該表達調控序列包含在哺乳動物細胞中啟動表達的啟動子。
15.根據(jù)權利要求14的表達載體，它是選自由逆轉錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，痘苗病毒和皰疹病毒組成的組中的病毒載體。
16.一種組合物，它含有根據(jù)權利要求11-15任一項的多核苷酸或載體和一種藥用上可接受的載體。
17.用根據(jù)權利要求11-15任一項的多核苷酸或載體轉化或轉染的細胞。
18.根據(jù)權利要求1-10任一項的多肽，融合蛋白，或組合物在診斷腫瘤疾病的方法中的用途。
19.根據(jù)權利要求1-10任一項的多肽，融合蛋白，或組合物在治療腫瘤疾病的方法中的用途。
20.根據(jù)權利要求18-19任一項的多肽，融合蛋白，或組合物，其中該腫瘤疾病是以血管或淋巴管的新脈管形成為特征的腫瘤，且其中新脈管形成包括表達VEGFR-3的內(nèi)皮細胞。
21.根據(jù)權利要求18-19任一項的多肽，融合蛋白，或組合物，其中該腫瘤疾病是乳腺癌。
22.根據(jù)權利要求1-10任一項的多肽，融合蛋白，或組合物在診斷腫瘤轉移的方法中的用途。
23.根據(jù)權利要求1-10任一項的多肽，融合蛋白，或組合物在預防腫瘤轉移的方法中的用途。
24.根據(jù)權利要求11-17任一項的多核苷酸，載體，細胞，或組合物在診斷腫瘤疾病的方法中的用途。
25.根據(jù)權利要求11-17任一項的多核苷酸，載體，細胞，或組合物在治療腫瘤疾病的方法中的用途。
26.根據(jù)權利要求24-25任一項的多核苷酸，載體，細胞，或組合物，其中該腫瘤疾病是以血管或淋巴管的新脈管形成為特征的腫瘤，且其中新脈管形成包含表達VEGFR-3的內(nèi)皮細胞。
27.根據(jù)權利要求24-25任一項的多核苷酸，載體，細胞，或組合物，其中該腫瘤疾病是乳腺癌。
28.根據(jù)權利要求11-17任一項的多核苷酸，載體，細胞，或組合物在診斷腫瘤轉移的方法中的用途。
29.根據(jù)權利要求11-17任一項的多核苷酸，載體，細胞，或組合物在預防腫瘤轉移的方法中的用途。
30.一種抑制癌細胞增生或轉移擴散的方法，包括給患有癌癥的哺乳動物受試者施用含有編碼一種多肽的核苷酸序列的多核苷酸，該多肽含有哺乳動物VEGFR-3-EC結構域的一部分，其中所述的部分與至少一種VEGFR-3配體結合且由VEGFR-3-EC的至少一種免疫球蛋白樣結構域組成，其中該編碼的多肽是缺少任何跨膜結構域的可溶性多肽，且其中在允許所述的多核苷酸吸收且從而由哺乳動物受試者中的細胞表達編碼的多肽的條件下進行給藥，且其中以抑制所述細胞增生的有效量施用該多核苷酸，載體，或組合物。
31.權利要求30的方法，其中該給藥包括施用包含該多核苷酸的載體。
32.根據(jù)權利要求30的方法，其中所述的給藥包含施用在根據(jù)權利要求11-17任一項的多核苷酸，載體，或組合物中的所述多核苷酸。
33.權利要求30-32的方法，其中所述的多核苷酸，載體或組合物包裹在脂質體中。
34.權利要求31的方法，其中所述的病毒載體選自由逆轉錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，痘苗病毒和皰疹病毒組成的組中。
35.根據(jù)權利要求30-34任一項的方法，其中該哺乳動物受試者被診斷為患有以表達VEGFR-3的內(nèi)皮細胞增生為特征的癌癥且其中所述的給藥抑制所述受試者中血管生成和淋巴管生成中的至少一種。
36.根據(jù)權利要求35的方法，其中該癌癥包括以血管或淋巴管的新脈管形成為特征的腫瘤，且其中新脈管形成包含表達VEGFR-3的內(nèi)皮細胞且其中所述的給藥抑制所述受試者中血管生成和淋巴管生成中的至少一種。
37.根據(jù)權利要求30-33任一項的方法，其中該癌癥細胞表達選自由VEGFR-3，VEGF-C和VEGF-D組成的組中的至少一種多肽。
38.根據(jù)權利要求30-37任一項的方法，其中該受試者是人。
39.根據(jù)權利要求30-37任一項的方法，其中所述的癌癥是乳腺癌。
40.根據(jù)權利要求30-37任一項的方法，它還包含給受試者施用第二種癌癥治療劑的步驟。
41.權利要求40的方法，其中所述的第二種癌癥治療劑包括化療劑，放射性試劑，編碼癌癥治療劑的核酸和抗淋巴管生成劑或抗血管生成劑。
42.根據(jù)權利要求30-41任一項的方法，其中該細胞在可手術的腫瘤中，且其中在切除腫瘤之前，期間，或之后進行該給藥步驟。
43.根據(jù)權利要求30的方法，其中該受試者具有選自由腦，肺，肝臟，脾臟，腎，淋巴結，小腸，血細胞，胰腺，結腸，胃，乳房，子宮內(nèi)膜，前列腺，睪丸，卵巢，皮膚，頭頸，食道，骨髓和血液組成的組中的組織，器官，或細胞的癌癥。
44.抑制哺乳動物受試者中癌癥的轉移擴散的方法，包括給懷疑患有癌癥的哺乳動物受試者施用抑制所述癌癥轉移擴散有效量的根據(jù)權利要求1-10任一項的多肽，融合蛋白或組合物。
45.抑制哺乳動物受試者中癌癥的轉移擴散的方法，包括給懷疑患有癌癥的哺乳動物受試者施用抑制或減小所述癌癥生長有效量的根據(jù)權利要求1-10任一項的多肽，融合蛋白或組合物。
46.治療癌癥的方法，包括給診斷患有癌癥的哺乳動物受試者施用一種組合物，該組合物包含根據(jù)權利要求1-10任一項的多肽，融合蛋白或組合物，而施用的量能有效抑制或減小該癌癥生長或腫瘤擴散。
47.一種含有編碼一種多肽的核苷酸序列的多核苷酸在制備用于抑制癌細胞的細胞增生的藥物中的用途，該多肽含有哺乳動物VEGFR-3-EC結構域的一部分，其中所述的部分與至少一種VEGFR-3配體結合且由VEGFR-3-EC的至少一種免疫球蛋白樣結構域組成，其中該編碼的多肽是缺少任何跨膜結構域的可溶性多肽。
48.根據(jù)權利要求47的用途，其中所述的多核苷酸在載體中。
49.根據(jù)權利要求47的用途，其中所述的多核苷酸是根據(jù)權利要求11-17任一項的多核苷酸，載體，細胞或組合物。
50.根據(jù)權利要求47-49的用途，其中所述的多核苷酸包裹在脂質體中。
51.根據(jù)權利要求48的用途，其中所述的載體是包含選自由逆轉錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，痘苗病毒和皰疹病毒組成的組中的病毒載體。
52.根據(jù)權利要求47的用途，其中所述的藥物用于被診斷為患有以表達VEGFR-3的內(nèi)皮細胞增生為特征的疾病的哺乳動物受試者且其中所述的藥物抑制所述受試者中血管生成和淋巴管生成中的至少一種。
53.根據(jù)權利要求52的用途，其中該疾病包含以血管或淋巴管的新脈管形成為特征的腫瘤，且其中新脈管形成包含表達VEGFR-3的內(nèi)皮細胞且其中所述的藥物抑制所述受試者中血管生成和淋巴管生成中的至少一種。
54.根據(jù)權利要求52的用途，其中該癌細胞表達選自由VEGFR-3，VEGF-C和VEGF-D組成的組中的一種多肽。
55.根據(jù)權利要求47-54任一項的用途，其中所述的癌癥是乳腺癌。
56.根據(jù)權利要求47-54任一項的用途，所述的藥物還包含第二種癌癥治療劑。
57.根據(jù)權利要求56的用途，其中所述的第二種癌癥治療劑包括化療劑，編碼癌癥治療劑的核酸和抗淋巴管生成劑或抗血管生成劑。
58.根據(jù)權利要求47的用途，其中該細胞在可手術的腫瘤中，且其中在切除腫瘤之前，期間，或之后進行該給藥步驟。
59.根據(jù)權利要求47的用途，其中所述的藥物用于具有選自由腦，肺，肝臟，脾臟，腎，淋巴結，小腸，血細胞，胰腺，結腸，胃，乳房，子宮內(nèi)膜，前列腺，睪丸，卵巢，皮膚，頭頸，食道，骨髓和血液組成的組中的組織，器官，或細胞癌癥的受試者。
60.根據(jù)權利要求1-10任一項的多肽，融合蛋白或組合物在制備用于抑制哺乳動物受試者中癌轉移擴散的藥物中的用途。
61.根據(jù)權利要求1-10任一項的多肽，融合蛋白或組合物在制備用于抑制或減小哺乳動物受試者中癌生長的藥物中的用途。
62.根據(jù)權利要求1-10任一項的多肽，融合蛋白或組合物在制備用于治療哺乳動物受試者中癌癥的藥物中的用途。
63.根據(jù)權利要求1-10任一項的多肽，融合蛋白或組合物在制備用于治療哺乳動物受試者中癌癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了純化的Flt4受體酪氨酸激酶多肽和其片斷，編碼該多肽的多核苷酸，特異性結合該多肽的抗體，及其用途。
文檔編號C07K19/00GK1494552SQ02806049
公開日2004年5月5日 申請日期2002年1月22日 優(yōu)先權日2001年1月19日
發(fā)明者卡里·阿利塔洛, 奧爾加·阿普雷利科瓦, 卡特里·帕朱索拉, 埃利那·阿姆斯特朗, 賈納·科霍南, 阿賈·凱佩南, 帕朱索拉, 阿姆斯特朗, 阿普雷利科瓦, 凱佩南, 卡里 阿利塔洛, 科霍南 申請人:路德維格癌癥研究院, 利森蒂亞有限公司