專利名稱：方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測技術，優(yōu)選利用等位基因特異性擴增技術如擴增不應突變系統(tǒng)(ARMS)或優(yōu)選利用等位基因選擇性雜交探針技術如Molecular Beacons或TaqMan，檢測真菌中對應于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的一個或多個細胞色素b突變的診斷方法，該細胞色素b突變引起了對嗜球果傘素類似物或在相同的交叉抗藥性組中的化合物的抗藥性。本發(fā)明也涉及用在本發(fā)明方法中的突變特異寡核苷酸，及含有這些寡核苷酸的診斷試劑盒。
背景技術：
殺真菌劑在農(nóng)業(yè)中的廣泛應用是相對近代的現(xiàn)象，在過去40年期間發(fā)生了大部分重要進展。以前，農(nóng)民常常忽視或沒有認識到真菌病原體對他們農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的影響。然而，現(xiàn)今這些損失是不可接受的，農(nóng)民依靠殺真菌化學藥劑的應用控制真菌疾病。結果，商品化的殺真菌劑已經(jīng)變成了整個農(nóng)用化學品商業(yè)的重要部分，1996年全世界的銷售約是59億美元，相當于整個農(nóng)用化學品市場的18.9％(WoodMackenzie，1997a‘Agchem products-The key agrochemical productgroups’，in Agrochemical Service，Update of the ProductsSection，1997年5月，1-74)。農(nóng)民已經(jīng)可以得到大量的殺真菌劑；最近版本的The Pesticide Manual(Tomlin，1994第10版，BritishCrop Protection Council，F(xiàn)arnham，UK，和the Royal Society ofChemistry，Cambridge，UK)包含目前使用的158種不同殺真菌活性組分。然而，目標是新化合物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的進一步工業(yè)研究是極其深入細致的，并且產(chǎn)品管理程序在確保具有特定作用方式和/或?qū)儆谔囟ɑ衔锵盗械臍⒄婢鷦┑淖詈煤妥铋L持久效能方面極其重要。特別地，當引入具有新作用方式的殺真菌劑時，研究開發(fā)有效的抗藥性處理策略至關重要(Fungicide Resistance ManagementInto The NextMillenium(Russell)1999，in Pesticide Outlook，1999年10月(213-215)。
嗜球果傘素類似物組成了主要新系列的農(nóng)業(yè)殺真菌劑，認為其是自從20世紀70年代1，2，4-三唑發(fā)現(xiàn)以來農(nóng)業(yè)殺真菌劑史上最激動人心的發(fā)展。
嗜球果傘素類似物的殺真菌活性是它們能抑制真菌中線粒體呼吸的結果。更具體地，已經(jīng)證實這些化合物有新的單點作用方式，通過阻斷泛醌醇(ubiquinol)細胞色素c氧化還原酶復合物(細胞色素bc1)發(fā)揮它們對真菌的作用，因此在真菌細胞中降低了高能ATP的產(chǎn)生(Becker等，1981 FEBs Letts.132329-33)。該族抑制劑阻止了多聚體細胞色素b蛋白質(zhì)上泛醌氧化還原位點Qo的電子傳遞(Esposti等，1993 Biochim.et Biophys Acta 1143(3)243-271)。不同于許多線粒體蛋白質(zhì)，細胞色素b蛋白質(zhì)是線粒體編碼的。
文獻報道表明在細胞色素b靶位點特定氨基酸的改變能影響嗜球果傘素類似物的活性。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(此后稱為S.cerevisiae)(JP Rago等，1989 J.Biol.Chem.26414543-14548)，小鼠(Howell等，1988 J.Mol.Biol.203607-618)，Chlamydomonas reinhardtii(Bennoun等，1991 Genetics 127335-343)和紅細菌(Rhodobacter spp)(Daldal等，1989 EMBOJ.8(13)3951-3961)中已經(jīng)進行了深入的誘變研究。研究了在海膽Paracentrotus lividus(Esposti等，1990 FEBS 263245-247)和擔子菌真菌Mycena galopoda和Strobilurus tenacellus(Kraiczy等，1996 Eur.J.Biochem.23554-63)(兩者都產(chǎn)生了嗜球果傘素類似物的天然變異體)中對嗜球果傘素類似物抗藥性的天然基礎，從該研究中收集了相關信息。存在兩個不同的細胞色素b基因區(qū)域，其中氨基酸改變對嗜球果傘素類似物的活性有顯著的作用。這些區(qū)域包含氨基酸殘基125-148和250-295(根據(jù)釀酒酵母(S.cerevisiae)殘基編號系統(tǒng))。更精確地，已經(jīng)表明在殘基126，129，132，133，137，142，143，147，148，256，275和295的氨基酸改變引起了對嗜球果傘素類似物的抗藥性(Brasseur等，1996 Biochim.Biophys.Acta 127561-69和Esposti等，(1993)Biochimica etBiophysica Acta，1143243-271)。
公開的國際專利申請?zhí)朩O 00/66773描述了真菌細胞色素b基因中突變的鑒定，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基143位置引起了編碼的蛋白質(zhì)中甘氨酸到丙氨酸的置換(G143A)。本發(fā)明第一次鑒定了重要植物病原真菌田間分離物細胞色素b基因中其它突變的至關重要性，所述重要植物病原真菌顯示了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中的化合物的抗藥性。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明第一方面，現(xiàn)在我們提供了檢測真菌細胞色素b基因中一個或多個突變存在或缺乏的方法，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中的氨基酸置換，其中所述突變的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中的任何其它化合物的抗性，所述方法包括利用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測技術鑒定真菌核酸中所述突變的存在或缺乏。
根據(jù)本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實施方式，現(xiàn)在我們提供了檢測真菌細胞色素b基因中一個或多個突變存在或缺乏的方法，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換，其中所述突變的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗藥性，所述方法包括利用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測技術鑒定真菌核酸中所述突變的存在或缺乏。
在本發(fā)明中，現(xiàn)在我們發(fā)明了基于單核苷酸多態(tài)性檢測方法，包括等位基因特異性擴增，檢測真菌細胞色素b基因中一個或多個點突變的診斷方法。根據(jù)本發(fā)明，本領域技術人員知曉大量分析方法，所述分析方法可以用于檢測在一個或多個多態(tài)位置變異核苷酸的存在或缺乏。一般地，等位基因變異的檢測需要突變辯別技術，可選的擴增反應和可選的信號產(chǎn)生系統(tǒng)。Nollau等，Clin.Chem.431114-1120，1997和在標準教科書，例如‘Laboratory Protocols forMutation Detection’，U.Landegren編輯，Oxford University Press，1996及‘PCR’第二版，Newton和Graham，BIOS Scientific Publisherslimited，1997中綜述了許多當前用于等位基因變異檢測的方法。等位基因特異擴增反應包括基于引物的方法如基于PCR的方法，更具體地，等位基因特異性聚合酶鏈式反應(PCR)延伸(ASPCR(allelespecific polymerase chain reaction extension))。一種這樣的ASPCR方法是ARMS(擴增不應誘變系統(tǒng)(Amplification RefractoryMutagenesis System))。在美國專利號5639611中描述了ASPCR技術，并且在歐洲專利號EP 332435中充分描述了ARMS技術。
所有這些基于PCR的方法都適合用于本發(fā)明方法中，并且特別優(yōu)選基于ARMS的方法的應用。本發(fā)明方法也包括使用非辯別性PCR，接著是產(chǎn)生的擴增子的特異探測。
所有這些方法都適合于特異性等位基因的檢測，其中該等位基因賦予了對任何嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗藥性，而且已經(jīng)研究開發(fā)了用于點突變檢測的Robust試驗，該點突變在眾多真菌植物病原體中賦予了這種抗性。當對一個化合物的抗性機理也賦予了對另外一個化合物的抗性時，即使作用方式不同，可以認為化合物處在相同的交叉抗藥性組中。
可以用在這里描述的本發(fā)明任何方面中的檢測一個或多個突變的其它單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測技術包括，例如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，單鏈構象多態(tài)性，多克隆分析(multiple clonalanalysis)，等位基因特異寡核苷酸雜交，單核苷酸引物延伸(Singlenucleotide primer extension)(Juvonen等，(1994)Hum Genet 9316-20；Huoponen等，(1994)Hum Mutat 3 29-36；Mashima等，(1995)，Invest Opthelmol.Vision.Sci 36，1714-20；Howell等，(1994)AmJ Hum Genet.55 203-206；Koyabashi等，(1994)Am.J.Hum.Genet.55 206-209；Johns和Neufeld(1993)Am J Hum Genet 53 916-920；Chomyn等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA 89 4221-4225)和InvaderTM技術(從Third Wave Technologies Inc.502 South RosaRoad，Madison，WI 53719 USA可得到)。
基于PCR的檢測系統(tǒng)的應用對于在這里所述的本發(fā)明所有方面和實施方式是優(yōu)選的。常常與基于PCR的靶DNA片段擴增聯(lián)合使用的等位基因選擇性雜交探針技術也是這里所述的本發(fā)明所有方面和實施方式優(yōu)選的。
在本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實施方式中，現(xiàn)在我們提供了檢測真菌細胞色素b基因中一個或多個突變存在或缺乏的診斷方法，該突變引起了編碼蛋白質(zhì)中F129L置換，其中所述突變的存在引起了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的真菌抗性，所述方法包括檢測PCR反應期間產(chǎn)生的擴增子的存在，其中所述PCR反應包括在適當核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，用診斷引物接觸包含真菌核酸的試驗樣品，其中所述擴增子的檢測與所述核酸中所述突變的存在或缺乏直接相關。
PCR反應期間產(chǎn)生的擴增子的檢測可以直接依賴突變存在所特異的引物的延伸，即其中引物延伸依賴突變的存在，因此，僅僅當存在突變時，引物結合和/或被延伸時才產(chǎn)生擴增子(如用ARMS技術的情況)，類似地，它可以直接依賴突變?nèi)狈λ禺惖囊?例如野生型序列)的延伸，或者可以直接與含有突變DNA序列的PCR延伸產(chǎn)物連接，即其中檢測的是含有突變DNA序列的擴增子。特別優(yōu)選第一個替代方案。在利用了等位基因選擇性擴增的本發(fā)明上述方法中，所述診斷方法包括檢測PCR反應期間產(chǎn)生的擴增子的存在，其中所述PCR反應包括在適當核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，用診斷引物接觸包含真菌核酸的試驗樣品，其中所述擴增子的產(chǎn)生與所述核酸中所述突變的存在或缺乏直接相關。
擴增子可以來源于任何PCR循環(huán)，而且這包括第一個等位基因特異引物延伸產(chǎn)物。
在可替代的優(yōu)選實施例中本發(fā)明方法利用等位基因選擇性雜交探針技術如Molecular Beacons或TaqMan(如本文所述，參見實施例18)。
在本發(fā)明第一方面特別優(yōu)選的實施方式中，現(xiàn)在我們提供了檢測真菌細胞色素b基因中一個或多個突變存在或缺乏的診斷方法，該突變引起了編碼蛋白質(zhì)中F129L置換，其中所述突變的存在引起了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的真菌抗性，所述方法包括在適當核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，用適于在編碼蛋白質(zhì)中引起F129L置換的突變的診斷引物接觸包含真菌核酸的試驗樣品，這樣當在樣品中存在引起了編碼蛋白質(zhì)中F129L置換的突變時或當野生型序列存在時，診斷引物被延伸；和通過參照診斷引物延伸產(chǎn)物的存在和缺乏檢測所述突變的存在和缺乏。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選實施方式中提供了檢測真菌細胞色素b基因中一個或多個突變存在或缺乏的方法，該突變引起了編碼蛋白質(zhì)中F129L置換，其中所述突變的存在引起了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的真菌抗性，所述方法包括在適當核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，用針對特定突變的診斷引物接觸包含真菌核酸的試驗樣品，這樣當在樣品中存在所述突變時，診斷引物被延伸；和通過參照診斷引物延伸產(chǎn)物的存在和缺乏檢測所述突變的存在和缺乏。
根據(jù)本發(fā)明第一方面特別優(yōu)選的實施方式，現(xiàn)在我們提供了檢測真菌細胞色素b基因中一個或多個突變存在或缺乏的方法，該突變引起了編碼蛋白質(zhì)中F129L置換，其中所述突變的存在引起了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的真菌抗性，所述方法包括在適當核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，用針對特定突變的診斷引物接觸包含真菌核酸的試驗樣品，這樣僅僅當樣品中存在所述突變時，診斷引物才被延伸；通過參照診斷引物延伸產(chǎn)物的存在和缺乏檢測突變的存在和缺乏。
這里所用術語診斷引物用于表示特別用于鑒定突變或野生型序列存在或缺乏的引物，術語普通引物表示與診斷引物所結合鏈相對的DNA鏈結合的引物，位于診斷引物識別區(qū)域的3’，并且通過普通引物與診斷引物一起作用允許在PCR過程中擴增居間DNA序列段。如果診斷引物是ARMS引物，當與突變體或野生型序列比較時，它可以有3’錯配。
在本發(fā)明這個和進一步的方面和實施方式中，優(yōu)選用檢測系統(tǒng)檢測引物延伸產(chǎn)物的延伸，該檢測系統(tǒng)是診斷引物或相對鏈上普通引物的組成部分?？商娲?，如果Taqman或TaqmanMGB探針與診斷引物和普通引物一起使用，Taqman或TaqmanMGB探針將包括檢測手段。這里更充分地描述了這些。
當對一個化合物的抗性機理也賦予了對另外一個化合物的抗性時，即使作用方式不同，可以認為化合物處在相同的交叉抗藥性組中。嗜球果傘素類似物和在相同交叉抗藥性組中的化合物包括例如，腈嘧菌酯(azoxystrobin)，picoxystrobin，亞胺菌(kresoxim-methyl)，trifloxystrobin，pyraclostrobin，噁唑酮菌(famoxadone)和fenamidone(pyraclostrobin的詳情參見2000年11月的BCPCConference in Brighton-參見摘要5A-2)。也應該注意到因為嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中的化合物對復合物IIIQo位點的作用，所以現(xiàn)在常常稱它們?yōu)镼o位點抑制劑(QoIs)。
在抗嗜球果傘素類似物植物病原真菌的野外分離物中，我們發(fā)現(xiàn)了真菌編碼細胞色素b的核酸中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)序列細胞色素b中第129個密碼子/氨基酸的位置是對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的真菌抗性的關鍵決定因素。這里描述的本發(fā)明方法特別適于檢測與編碼釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129位置對應位置的突變，其中由另一個氨基酸置換了編碼的苯丙氨酸殘基，該另一個氨基酸阻止嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的活性，并且在攜帶有突變體細胞色素b基因的真菌中引起抗性表型，由此引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗性。
優(yōu)選地，該方法用于突變的檢測，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了所述苯丙氨酸殘基被選自異亮氨酸，亮氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，纈氨酸，酪氨酸的氨基酸置換。最優(yōu)選待檢測的突變引起了亮氨酸置換苯丙氨酸殘基。
引起了編碼蛋白質(zhì)中F129L置換的真菌細胞色素b基因的突變通常是在密碼子第一位(堿基)從胸腺嘧啶到胞嘧啶堿基的改變，或者是在密碼子第三位(堿基)從胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鳥嘌呤堿基的改變，并且對于這里所述本發(fā)明的所有方面和實施方式優(yōu)選檢測這些單核苷酸多肽性。進一步，也可能出現(xiàn)在密碼子第一位從胸腺嘧啶到胞嘧啶的改變和在密碼子第三位(堿基)從胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鳥嘌呤堿基的改變的稀有聯(lián)合，本發(fā)明所有方面和實施方式包括了這些。
應該注意在本專利申請中常引述賦予了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物抗性的細胞色素b基因的突變和等位基因變異體(等位基因)。這種引述基本上是同義的，盡管術語突變傾于暗示新或近的基因改變，而等位基因變異體暗示被分析的種群中基因的替代形式，在這里也是賦予抗性的形式，已經(jīng)存在了一些時間。在天然種群分析期間，這些替換物是不可區(qū)分的。
應該注意，細胞色素b蛋白質(zhì)的野生型和突變體/等位基因變異體形式特性差異的本性需要在各呼吸作用復合物III種類所謂的Qo位點內(nèi)進行氨基酸置換，該呼吸作用復合物III種類部分地由細胞色素b蛋白質(zhì)組成，其中賦予對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物抗性的基因編碼所述細胞色素b蛋白質(zhì)。通過改變的氨基酸的密碼子變化引起了這種氨基酸置換。典型地，以及在這里所考慮的特定實施例中，通過該密碼子中三個核苷酸殘基中僅一個核苷酸殘基的變化引起目的氨基酸置換。因此，可以描述這種變化為單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。
偶爾地，因為遺傳密碼的簡并性，兩個緊密連接(在3個核苷酸內(nèi))的置換也可以引起由單核苷酸多態(tài)性引起的氨基酸置換。這里稱這種情形為“簡單核苷酸多態(tài)性(simple nucleotide polymorphisms)”。根據(jù)它們的性質(zhì)，預測這種多態(tài)性比SNPs更罕見，因為發(fā)生這種多態(tài)性所需的序列變化需要相同密碼子內(nèi)至少兩個單獨的堿基變化，而不僅僅是一個堿基變化。
這里所用術語F129L用于意指真菌細胞色素b序列中，在與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞色素b序列第129個密碼子/氨基酸位置等同的位置，用亮氨酸殘基置換苯丙氨酸殘基。這種命名用于這里引用的所有其它殘基變化，即相對于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞色素b蛋白質(zhì)序列引用所有的位置。從EMBL和SWISSPROT數(shù)據(jù)庫(參見，EMBL記錄號X84042和SWISSPROT記錄號P00163)可得到釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)細胞色素b基因和蛋白質(zhì)序列。本領域技術人員將理解由于氨基或羧基末端和/或一個或多個內(nèi)部缺失或插入的結果，不同物種來源的等同蛋白質(zhì)的精確長度和記錄(register)可以變化。然而，因為含有與釀酒酵母(S.cerevisiae)中F129對應的殘基的氨基酸序列段非常保守(Widger等，Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.81(1984)674-678)，所以在本領域技術人員能力范圍內(nèi)，通過視覺觀察或幾個序列對齊程序(包括Megalign或Macaw)之一的應用，在新獲得的真菌細胞色素b序列中鑒定精確地對應的殘基是顯而易見的和容易的。盡管在本發(fā)明申請中稱為F129(因為位置和功能等同)，但是在新細胞色素b中該苯丙氨酸的精確位置可以不是從其氨基末端開始的第129個殘基。在SWISSPROT記錄號P00163中提供了釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b共有序列。這里描述的本發(fā)明所有方面和實施方式中，優(yōu)選相對于EMBL記錄號X84042中提供的釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b序列定義細胞色素b序列中的位置?？商娲?，這里描述的本發(fā)明所有方面和實施方式中，優(yōu)選相對于SWISSPROT記錄號P00163中提供的釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b共有序列定義細胞色素b序列中的位置。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了真菌細胞色素b基因中一個或多個核苷酸多態(tài)性的診斷方法，該方法包括在與三聯(lián)體一個或多個堿基對應的位置確定真菌核酸的序列，其中該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，并且通過參照細胞色素b基因中一個或多個多態(tài)性，確定真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物的抗藥性狀態(tài)。
在這里描述的本發(fā)明所有方面和實施方式中，優(yōu)選三聯(lián)體中僅一個堿基顯示了突變，即僅在一個位置有單核苷酸多態(tài)性出現(xiàn)，其中該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，并且進一步優(yōu)選突變在三聯(lián)體的第一或第三個堿基。
根據(jù)本發(fā)明這個方面的優(yōu)選實施方式，提供了在真菌細胞色素b基因中單核苷酸多態(tài)性的診斷方法，該方法包括在與三聯(lián)體第一或第三個堿基對應的位置確定真菌核酸的序列，其中該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，并且通過參照細胞色素b基因中的多態(tài)性，確定所述真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物抗藥性狀態(tài)。
在本發(fā)明上述方面的一個實施方式中，這里描述的診斷方法是這樣的診斷方法，其中在DNA中對應于三聯(lián)體第一或第三個堿基的位置的單核苷酸多態(tài)性是在密碼子第一個堿基出現(xiàn)T或C，在密碼子第三個堿基出現(xiàn)T，C，A或G，其中該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
表1編碼苯丙氨酸和亮氨酸的密碼子序列

在野生型細胞色素b中，如果在129位置的苯丙氨酸殘基是TTT或TTC密碼子編碼的，那么在密碼子第一位置突變?yōu)镃(胞嘧啶)的單堿基突變將引起在嗜球果傘素抗藥性突變體的Qo位點苯丙氨酸殘基的置換。同樣地，如果在野生型細胞色素b中，在129位置的苯丙氨酸殘基是TTT或TTC密碼子編碼的，那么在密碼子第三個位置突變?yōu)锳(腺嘌呤)或G(鳥嘌呤)的單堿基突變在嗜球果傘素抗藥性突變體的Qo位點將引起苯丙氨酸殘基的置換。第一位置的置換(從T到C)連同第三位置的置換(從T或C到A或G)的雙置換也可能引起這種苯丙氨酸到亮氨酸的置換(參見表1)。
為了確定是否作為在129位置亮氨酸殘基存在的結果特定的植物病原體或植物病原體群體對Qo位點抑制劑殺真菌劑是抗性的或含有顯著水平的抗性等位基因，只需確定和/或測定是否病原體或群體在其相關密碼子的第一位置有C殘基和/或在第三位置有A或G殘基。完成這種評估的一個方法是利用基于診斷引物如ARMS引物的技術。(在Newton等，Nucleic Acid Research 17(7)2503-2516 1989中充分描述了ARMS引物的概念)。
作為上述苯丙氨酸和亮氨酸密碼子特征(參見表1)的結果，當利用ARMS技術檢測和/或測定殘基129的狀態(tài)時，可能設計適合的PCR引物，該PCR引物具有確定病原體細胞色素b基因相關密碼子第一或第三個位置特定殘基身份和/或數(shù)量的能力。這種設計僅需要知道野生型序列。不需要知曉抗性由F129L突變引起的目的新真菌的抗性分離物。在表2中列出了相關植物病原真菌的一些例子。無論如何，該表不意指是唯一的。本領域的植物病理學家將能夠容易地鑒定與本發(fā)明方法相關的那些真菌。
表2可以測定F129L的物種例子

這里描述的本發(fā)明方法在植物病原真菌，特別是下列任何真菌物種方面特別有用葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥專化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，煙草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隱匿柄銹菌(Pucciniarecondita)和堀病柄銹菌(Puccinia horiana)，并且最特別地在下列真菌物種方面特別有用葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥專化型(Erysiphe，graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola。
在本發(fā)明其它方面提供了檢測真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物抗藥性的方法，所述方法包括鑒定編碼真菌細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌核酸中一個或多個突變的存在或缺乏，其中所述突變的存在引起了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗藥性，所述方法包括鑒定單核苷酸多態(tài)性的存在或缺乏，該單核苷酸多態(tài)性出現(xiàn)在對應于三聯(lián)體一個或多個堿基的位置，其中該三聯(lián)體編碼真菌細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在這個方面進一步優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了檢測真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物抗藥性的方法，所述方法包括鑒定編碼真菌細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌核酸中突變的存在或缺乏，其中所述突變的存在引起了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗藥性，所述方法包括鑒定單核苷酸多態(tài)性的存在或缺乏，該單核苷酸多態(tài)性出現(xiàn)在對應于三聯(lián)體第一和/或第三個堿基的位置，其中該三聯(lián)體編碼真菌細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在本發(fā)明這方面優(yōu)選實施方式中，用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測技術鑒定在對應于三聯(lián)體第一和/或第三個堿基的位置的單核苷酸多態(tài)性的存在和缺乏，其中該三聯(lián)體編碼細胞色素b基因中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
本發(fā)明進一步提供了編碼全部或部分野生型細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌DNA序列，其中所述DNA序列在野生型蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置編碼苯丙氨酸殘基，其中從真菌中可得到或獲得所述的序列，所述真菌選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinulanecator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，Mycosphaerella musicola，Cercosporaarachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomycescarpophillum，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymellalycopersici)，煙草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隱匿柄銹菌(Puccinia recondita)和堀病柄銹菌(Puccinia horiana)，優(yōu)選地，選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，煙草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隱匿柄銹菌(Puccinia recondita)和堀病柄銹菌(Pucciniahoriana)。
根據(jù)本發(fā)明上述方面的真菌DNA序列優(yōu)選在對應于三聯(lián)體中一個或多個堿基(優(yōu)選第三個堿基)的DNA位置的任一側(cè)或兩側(cè)含有約30個核苷酸，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，因為這種核酸的范圍提供了本領域技術人員設計用在這里所述的所有單核苷酸多態(tài)性檢測技術中/與這里所述的所有單核苷酸多態(tài)性檢測技術一起使用的物種和突變特異性試劑和/或方法必需的所有信息。這里所用術語約30意指序列可以包含不超過30個核苷酸，例如5個，多至10，15，20，或25個核苷酸，或可以包含多于30個核苷酸，例如約50個核苷酸，即達到35，40，45或50或更多個核苷酸。
與所有DNA和蛋白質(zhì)序列有關的這里所用術語“全部或部分的”用于意指DNA序列或蛋白質(zhì)序列或其片段。DNA或蛋白質(zhì)片段可以例如是整個序列長度的10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％或95％。
本發(fā)明也延及本發(fā)明DNA序列編碼的新的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，可以分析含有基因組(線粒體)DNA和cDNA的兩種樣品，這對本領域技術人員是顯而易見的。對于樣品含有基因組DNA的情況，當利用序列信息時，需要考慮內(nèi)含子結構。在下表3中提供了包含根據(jù)本發(fā)明上述方面的部分野生型細胞色素b基因序列的野生型真菌DNA序列的例子，并且所述序列形成了本發(fā)明的另一個方面。
表3一系列重要植物病原體的位于對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b序列129密碼子的密碼子兩側(cè)的野生型細胞色素b基因組和/或cDNA序列段(第一個和最后殘基以粗體和下劃線表示)

在上表中，三聯(lián)體第一和第三個堿基是粗體和下劃線形式，該三聯(lián)體編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，所述第一和第三個堿基在被適當替換時引起可替代的氨基酸對正常苯丙氨酸殘基的置換，其中所述的置換賦予了對嗜球果傘素類似物和相同交叉抗藥性組內(nèi)化合物的抗藥性。
本發(fā)明也延及與表3中所述DNA序列顯示了同源性或序列同一性的真菌DNA序列，并且包括例如在相同物種不同樣品或分離物中發(fā)現(xiàn)的DNA序列的變異。這里變異可以，例如是因為可替代密碼子使用的應用，改變的內(nèi)含子/外顯子線粒體組構和氨基酸置換而造成。
在本發(fā)明另一個方面提供了真菌DNA序列，其編碼全部或部分真菌細胞色素b蛋白質(zhì)，其中當與相應的編碼細胞色素b蛋白質(zhì)的野生型DNA序列對齊所述真菌DNA序列時，在對應于三聯(lián)體一個或多個堿基的DNA位置觀察到該真菌DNA序列含有單核苷酸多態(tài)性突變，其中該三聯(lián)體編碼該蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，所述單核苷酸多態(tài)性突變引起了可替代的氨基酸對正常苯丙氨酸殘基的置換。
在本發(fā)明該方面的另一個優(yōu)選實施方式中提供了編碼全部或部分細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌DNA序列，其中當與相應的編碼細胞色素b蛋白質(zhì)的野生型DNA序列對齊所述真菌DNA序列時，在對應于三聯(lián)體第一或第三個堿基的DNA位置觀察到該真菌DNA序列含有單核苷酸多態(tài)性突變，其中該三聯(lián)體編碼該蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，所述單核苷酸多態(tài)性突變引起了可替代的氨基酸對正常苯丙氨酸殘基的置換。
根據(jù)本發(fā)明上述方面的真菌DNA序列優(yōu)選在對應于三聯(lián)體中一個或多個堿基，優(yōu)選對應于三聯(lián)體中第三個堿基的DNA位置任一側(cè)或兩側(cè)含有約30個核苷酸，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，因為這種核酸的范圍提供了本領域技術人員設計用在所有單核苷酸多態(tài)性技術中的物種和突變特異性試劑和/或方法必需的所有信息。這里所用術語約30意指序列可以包含不超過30個核苷酸，例如5個，多達10，15，20，或25個核苷酸，或可以包含多于30個核苷酸。
本發(fā)明進一步提供了編碼全部或部分突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌DNA序列，其中在所述DNA中一個或多個突變的存在賦予了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組內(nèi)化合物的抗藥性，所述突變出現(xiàn)在對應于三聯(lián)體一個或多個堿基的DNA位置，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
本發(fā)明該方面優(yōu)選的實施方式中，進一步提供了編碼全部或部分突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌DNA序列，其中在所述DNA中突變的存在賦予了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組內(nèi)化合物的抗藥性，所述突變出現(xiàn)在對應于三聯(lián)體第一或第三個堿基的DNA位置，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在本發(fā)明上述方面，優(yōu)選地，在對應于編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母細胞色素b殘基129的位置的氨基酸的三聯(lián)體第一或第三個堿基的DNA位置出現(xiàn)的突變分別是胸腺嘧啶到胞嘧啶和胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鳥嘌呤。
優(yōu)選從選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥專化型/大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophorateres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，Mycosphaerella musicola，Cercosporaarachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomycescarpophillum，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymellalycopersici)，煙草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隱匿柄銹菌(Puccinia recondita)和堀病柄銹菌(Puccinia horiana)，優(yōu)選地選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥專化型/大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophorateres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola中的真菌可得到或得到根據(jù)本發(fā)明以上方面的編碼全部或部分突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌DNA序列，其中在所述DNA中一個或多個突變的存在賦予了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組內(nèi)化合物的抗藥性。
本發(fā)明也延及包含全部或部分表4中提供的序列的DNA序列，其中在對應于三聯(lián)體第一堿基的DNA位置的殘基是胞嘧啶殘基，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。這些序列，包括包含表4所述序列的那些序列，形成了本發(fā)明的另一方面。
表4植物病原體細胞色素b基因序列段，其中與蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b129殘基的位置的密碼子第一堿基對應的殘基(粗體所示)是胞嘧啶殘基，結果編碼亮氨酸


本發(fā)明也延及包含全部或部分表5中提供的序列的DNA序列，其中在對應于三聯(lián)體第三個堿基的DNA位置的殘基是腺嘌呤殘基，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。這些序列形成了本發(fā)明的另一方面。
表5植物病原體細胞色素b基因序列段，其中與該蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b129殘基的位置的密碼子第三個堿基對應的殘基(粗體所示)是腺嘌呤殘基，結果編碼亮氨酸

本發(fā)明也延及包含全部或部分表6中提供的序列的DNA序列，其中在對應于三聯(lián)體第三個堿基的DNA位置的殘基是鳥嘌呤殘基，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。這些序列形成了本發(fā)明的另一方面。
表6植物病原體細胞色素b基因序列段，其中與該蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b129殘基的位置的密碼子第三個堿基對應的殘基(粗體所示)是鳥嘌呤殘基，結果編碼亮氨酸

本發(fā)明也延及包含全部或部分表7中提供的序列的DNA序列，其中在對應于三聯(lián)體第一個堿基的DNA位置的殘基是胞嘧啶，在相應密碼子第三個堿基的殘基是腺嘌呤，其中該三聯(lián)體編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。這些序列形成了本發(fā)明的另一方面。
表7植物病原體細胞色素b基因序列段，其中與該蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b129殘基的位置的密碼子第一堿基對應的殘基(下劃線所示)是胞嘧啶，相應密碼子第三堿基處的粗體表示的殘基是腺嘌呤，結果編碼亮氨酸


本發(fā)明也延及包含全部或部分表8中提供的序列的DNA序列，其中在對應于三聯(lián)體第一堿基的DNA位置的殘基是胞嘧啶，在相應密碼子第三堿基的殘基是鳥嘌呤，其中該三聯(lián)體編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。這些序列形成了本發(fā)明的另一方面。
表8植物病原體細胞色素b基因序列段，其中與該蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b129殘基的位置的密碼子第一堿基對應的殘基(下劃線所示)是胞嘧啶，相應密碼子第三堿基的粗體表示的殘基是鳥嘌呤，結果編碼亮氨酸


本發(fā)明也延及對所述含有所述多態(tài)性的DNA序列顯示了同源性或序列同一性的真菌DNA序列，并且包括例如在相同物種不同樣品中發(fā)現(xiàn)的DNA序列的變異。這些變異可以，例如是可替代密碼子使用的應用，改變內(nèi)含子/外顯子組構和氨基酸置換造成的。
如這里所述的編碼全部或部分野生型或突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的DNA序列優(yōu)選是分離的形式。例如通過從與其天然存在的任何物質(zhì)部分地純化。該DNA序列是從這里公開的真菌可分離(可得到)或分離(獲得)的。
可以在公開的國際專利申請?zhí)朩O 00/66773中發(fā)現(xiàn)本文提供的野生型序列3’末端下游的進一步序列信息，這里并入該專利申請的教導以供參考。本文提供的序列信息和教導可以與公開的國際專利申請?zhí)朩O 00/66773中的序列信息和教導一同使用以設計鑒定對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129和/或143的位置的突變存在和缺失的方法，并且本發(fā)明延及任何這種方法。
本發(fā)明進一步提供了計算機可讀介質(zhì)，其上存儲有這里所述的和要求保護的任何序列，包括如這里所述的編碼突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的DNA序列的全部或部分，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選細胞色素b蛋白質(zhì)序列，其中在等同于氨基酸殘基129的位置的氨基酸殘基是亮氨酸，所述氨基酸殘基129殘基處在等同于釀酒酵母(S.cerevisiae)殘基129的位置，并且一個或多個突變的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何化合物的抗藥性，所述突變出現(xiàn)在對應于如下三聯(lián)體一個或多個堿基的DNA位置，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸；編碼突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的DNA或突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的氨基酸序列的全部或部分，所述突變出現(xiàn)在對應于三聯(lián)體一個或多個堿基的DNA位置，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中所述蛋白質(zhì)來自真菌并賦予真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物的抗藥性，所述真菌選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥專化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，煙草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隱匿柄銹菌(Pucciniarecondita)和堀病柄銹菌(Puccinia horiana)，優(yōu)選地選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，蘋果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinulanecator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola；編碼真菌的野生型細胞色素b序列的DNA或該野生型細胞色素b序列的氨基酸序列的全部或部分，其中所述真菌選自下列真菌葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，煙草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隱匿柄銹菌(Pucciniarecondita)和堀病柄銹菌(Puccinia horiana)，優(yōu)選地，選自引起真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物抗藥性葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，蘋果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinulanecator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola；或任何等位基因特異寡核苷酸；這里公開的等位基因特異寡核苷酸探針，等位基因特異引物，普通或診斷引物。
例如，在同源性檢索，作圖，單元型分型(haplotyping)，基因型分型(genotyping)或任何其它生物信息學分析中可以利用計算機可讀介質(zhì)?？梢岳萌魏斡嬎銠C可讀介質(zhì)，例如光盤，磁帶，軟盤，硬驅(qū)動機或計算機芯片。
本發(fā)明多核苷酸序列，或其部分，特別是與這里鑒定的單核苷酸多態(tài)性有關和鑒定這里鑒定的單核苷酸多態(tài)性，尤其是與在編碼的蛋白質(zhì)中引起F129L改變的真菌細胞色素b中T到C(第一堿基)和/或T到A或G和C到A或G(第三堿基)的改變有關和鑒定所述這些改變的多苷酸序列，是有價值的信息資源。通過在計算機可讀介質(zhì)存儲序列信息，然后在標準生物信息學程序中利用該信息，使得該信息資源的應用最容易便利化。本發(fā)明多核苷酸序列作為用于序列同一性和其它檢索分析的數(shù)據(jù)庫中的成分特別有用。如這里所用的，在計算機可讀介質(zhì)中序列信息的存儲，和在與本發(fā)明多核苷酸和多核苷酸序列有關的序列數(shù)據(jù)庫中的應用包括了可以被整理，轉(zhuǎn)換或存儲在有形媒介中，如計算機磁盤(優(yōu)選以計算機可讀形式)中的本發(fā)明多核苷酸任何可檢測的化學或物理特性。例如，色譜掃描數(shù)據(jù)或峰值數(shù)據(jù)，照相掃描或峰值數(shù)據(jù)，質(zhì)譜數(shù)據(jù)，序列凝膠(或其它)數(shù)據(jù)。
也提供了用于進行序列鑒定的基于計算機的方法，所述方法包括步驟提供計算機可讀媒介中的含有本發(fā)明多態(tài)性的多核苷酸序列，比較含有所述多態(tài)性的多核苷酸序列和至少一個其它多核苷酸或多肽序列以鑒定同一性(同源性)，即篩選多態(tài)性的存在。
本發(fā)明進一步提供了真菌細胞色素b蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)賦予真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物的抗藥性，其中在所述蛋白質(zhì)中，由于在編碼所述蛋白質(zhì)的DNA中一個或多個突變的存在，所以改變了正常的苯丙氨酸殘基，所述突變出現(xiàn)在對應于三聯(lián)體第一和/或第三堿基的DNA位置，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方式中進一步提供了真菌細胞色素b蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)賦予真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物的抗藥性，其中在所述蛋白質(zhì)中，由于在編碼所述蛋白質(zhì)的DNA中突變的存在，所以改變了正常的苯丙氨酸殘基，所述突變出現(xiàn)在對應于三聯(lián)體第一或第三堿基的DNA位置，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在根據(jù)本發(fā)明上述方面的蛋白質(zhì)中，優(yōu)選地，由可替代的氨基酸置換蛋白質(zhì)中的苯丙氨酸殘基，所述的置換導致真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物顯示了抗藥性。
根據(jù)本發(fā)明上述方面，優(yōu)選地，突變引起了選自異亮氨酸，亮氨酸，半胱氨酸，絲氨酸，纈氨酸，酪氨酸的氨基酸，最優(yōu)選亮氨酸對所述苯丙氨酸殘基的置換。
在本發(fā)明的另一個方面提供了具有識別所述突變體細胞色素b蛋白質(zhì)能力的抗體。
在本發(fā)明另一方面提供了檢測真菌細胞色素b基因中一個或多個突變存在或缺乏的方法，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸殘基的置換，所述方法包括用任何或一種單核苷酸多態(tài)性檢測方法鑒定真菌核酸樣品中所述突變的存在或缺乏，其中所述單核苷酸多態(tài)性檢測方法是基于對應于三聯(lián)體一個或多個堿基的位置上游和/或下游約30到90個核苷酸的序列信息，該三聯(lián)體編碼野生型或突變蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在本發(fā)明該方面進一步優(yōu)選實施方式中提供了檢測真菌細胞色素b基因中一個或多個突變存在或缺乏的方法，該突變在編碼蛋白質(zhì)中引起了F129L置換，所述方法包括用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測方法鑒定真菌核酸樣品中所述突變的存在或缺乏，其中所述單核苷酸多態(tài)性檢測方法基于對應于三聯(lián)體第一或第三堿基的位置上游和/或下游約30到90個核苷酸的序列信息，該三聯(lián)體編碼野生型或突變體蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在本發(fā)明該方面的進一步優(yōu)選實施方式中提供了檢測真菌細胞色素b基因中第一堿基胸腺嘧啶到胞嘧啶的突變和/或第三堿基胸腺嘧啶到腺嘌呤或鳥嘌呤的突變或胞嘧啶到腺嘌呤或鳥嘌呤的突變的方法，該突變在編碼蛋白質(zhì)中引起了F129L置換，所述方法包括用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測方法鑒定真菌核酸樣品中所述突變的存在或缺乏，其中所述單核苷酸多態(tài)性檢測方法基于對應于三聯(lián)體第一或第三堿基的位置上游和/或下游約30到90個核苷酸的序列信息，該三聯(lián)體編碼野生型或突變體蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在本發(fā)明該方面進一步特別優(yōu)選的實施方式中提供了檢測真菌細胞色素b基因中第一堿基胸腺嘧啶到胞嘧啶的突變和/或第三堿基胸腺嘧啶到腺嘌呤或鳥嘌呤的突變或胞嘧啶到腺嘌呤或鳥嘌呤的突變的方法，該突變在編碼蛋白質(zhì)中引起了F129L置換，所述方法包括用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測方法鑒定真菌核酸樣品中所述突變的存在或缺乏，其中所述單核苷酸多態(tài)性檢測方法基于對應于三聯(lián)體第一或第三堿基的位置上游和/或下游約30到90個核苷酸的序列信息，該三聯(lián)體編碼野生型或突變體蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在本發(fā)明該方面進一步特別優(yōu)選實施方式中提供了檢測真菌細胞色素b基因中第三堿基胞嘧啶到腺嘌呤之突變的方法，該突變在編碼蛋白質(zhì)中引起了F129L置換，所述方法包括用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測方法鑒定真菌核酸樣品中所述突變的存在或缺乏，其中所述單核苷酸多態(tài)性檢測方法基于對應于三聯(lián)體第一或第三堿基的位置上游和/或下游約30到90個核苷酸的序列信息，該三聯(lián)體編碼野生型或突變體蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在本發(fā)明上述方面，優(yōu)選地，單核苷酸多態(tài)性檢測方法基于對應于三聯(lián)體第三堿基的位置上游和/或下游約30到90核苷酸的序列信息，該三聯(lián)體編碼野生型或突變體蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
這里所用術語“上游”用于意指序列“5’方向”，術語“下游”意指序列“3’方向”。
根據(jù)本發(fā)明上述方面，序列信息優(yōu)選來源于選自下面的真菌葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥專化型/大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，蘋果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinulanecator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，煙草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隱匿柄銹菌(Pucciniarecondita)和堀病柄銹菌(Puccinia horiana)，優(yōu)選地選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viricola)，禾白粉菌小麥?；?大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，蘋果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinulanecator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola，更優(yōu)選地選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophorateres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola。
這里所用術語“約30”意指序列可以包含不超過30個核苷酸，例如5個，不超過10，15，20，或25個核苷酸，或可以包含多于30個核苷酸。在本發(fā)明上述方面，優(yōu)選地，所用核酸序列信息是對應于三聯(lián)體第一或第三堿基的位置上游和/或下游約30，優(yōu)選30個核苷酸，該三聯(lián)體編碼野生型或突變體蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明，核酸優(yōu)選是DNA。方便地，核酸的試驗樣品是來源于真菌材料的總DNA制備物，來源于真菌材料的cDNA制備物或真菌材料本身或含有真菌核酸的植物或種子提取物。在本說明書中，我們描述了通過利用總基因組DNA或cDNA制備物檢測F129L突變。然而，可以理解，試驗樣品同樣可以是核酸，其序列對應于試驗樣品中的序列。即，在樣品核酸中所述區(qū)域的全部或部分在用于本發(fā)明方法中之前，可以首先利用任何方便的技術如PCR分離或擴增。
本發(fā)明提供了分析農(nóng)業(yè)野外樣品的DNA中突變的方法，由于農(nóng)業(yè)野外樣品特別的來源，與涉及人樣品的類似情況比較，其通常相當不明確，其中這里描述的診斷方法更常用于人樣品。當與常常含有來源于僅一個個體的DNA的人樣品比較時，農(nóng)業(yè)野外樣品更難于研究，并且在非常大量的野生型DNA和/或存在于野外分離物中的其它生物體的外來DNA中檢測以低頻率出現(xiàn)的突變事件在技術上要求更高。
只要用于聚合的任何適合的酶在任何顯著的程度上沒有內(nèi)在的區(qū)別正常和突變體模板序列的能力，就可以利用該酶。適合的酶的例子包括沒有顯著3’-5’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定酶，例如Taq DNA聚合酶，特別是‘Ampli Taq Gold’TMDNA聚合酶(Applied Biosystem)，Stoffel片段，或Taq(棲熱水生菌(Thermus aquaticua))或Tth(嗜熱棲熱菌(Thermus thermophiulus))DNA聚合酶的其它適當N-末端缺失修飾物。
在本發(fā)明另一個方面中提供了能結合編碼野生型細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌核酸序列的等位基因特異寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含識別編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的苯丙氨酸殘基的核酸序列的序列。
在優(yōu)選實施方式中，所述真菌核酸序列從下面的真菌中選取葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥?；?Eryrsiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，蘋果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinulanecator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，煙草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隱匿柄銹菌(Pucciniarecondita)和堀病柄銹菌(Puccinia horiana)。
在本發(fā)明該方面優(yōu)選實施方式中，所述真菌核酸序列從下組真菌中選擇葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teresa)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicolael)，蘋果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuligineaca)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinulanecator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola，在特別優(yōu)選的實施方式中，真菌核酸選自葡萄生單軸霉(Plasmoparaviticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥?；?Erysiphe graminisf.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinulanecator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola。
根據(jù)本發(fā)明上述方面，真菌核酸優(yōu)選是DNA。
在本發(fā)明另一方面我們提供了能結合編碼突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌核酸序列的等位基因特異寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含識別編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸的核酸序列的序列，所述氨基酸選自異亮氨酸，亮氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，纈氨酸，酪氨酸，最優(yōu)選亮氨酸。
在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方式中，我們提供了具有結合編碼突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌核酸序列能力的等位基因特異寡核苷酸，所述真菌核酸序列選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，煙草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隱匿柄銹菌(Pucciniarecondita)和堀病柄銹菌(Puccinia horiaina)，其中所述寡核苷酸包含識別編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸的核酸序列的序列，所述氨基酸選自異亮氨酸，亮氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，纈氨酸，酪氨酸，最優(yōu)選亮氨酸。
在本發(fā)明該方面的進一步優(yōu)選實施方式中，我們提供了具有結合編碼突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌核酸序列能力的等位基因特異寡核苷酸，所述真菌核酸序列選自葡萄生單軸霉(Plasmoparaviticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥專化型(Erysiphe graminisf.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraninicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola。
根據(jù)本發(fā)明上述方面的真菌核酸優(yōu)選是DNA。
在本發(fā)明進一步方面提供了具有檢測在對應于三聯(lián)體一個或多個堿基的DNA位置的野生型細胞色素b基因序列能力的等位基因特異寡核苷酸探針，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在本發(fā)明進一步方面提供了具有檢測在對應于三聯(lián)體一個或多個堿基的DNA位置的真菌細胞色素b基因多態(tài)性能力的等位基因特異寡核苷酸探針，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在本發(fā)明該方面進一步優(yōu)選的實施方式中提供了具有檢測在對應于三聯(lián)體第一和/或第三個堿基的DNA位置的真菌細胞色素b基因多態(tài)性能力的等位基因特異寡核苷酸探針，該三聯(lián)體編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在本發(fā)明該方面進一步優(yōu)選的實施方式中提供了具有檢測在對應于三聯(lián)體第一或第三個堿基的DNA位置的真菌細胞色素b基因多態(tài)性能力的等位基因特異寡核苷酸探針，該三聯(lián)體編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在本發(fā)明該方面進一步優(yōu)選的實施方式中提供了具有檢測在對應于三聯(lián)體第三個堿基的DNA位置的真菌細胞色素b基因多態(tài)性能力的等位基因特異寡核苷酸探針，該三聯(lián)體編碼在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在本發(fā)明該方面進一步優(yōu)選實施方式中，所述多態(tài)性是在所述密碼子第一個堿基從胸腺嘧啶到胞嘧啶堿基的改變，所述密碼子第三個堿基從胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鳥嘌呤的改變，該突變存在于選自下列的真菌中葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminincola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporiorides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，煙草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隱匿柄銹菌(Pucciniarecondita)和堀病柄銹菌(Puccinia houiana)。
在本發(fā)明該方面進一步優(yōu)選的實施方式中，所述多態(tài)性是在所述密碼子第一個堿基從胸腺嘧啶到胞嘧啶堿基的改變，所述密碼子第三個堿基從胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鳥嘌呤的改變，突變存在于選自下列的真菌中葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥專化型/大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pserdoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola。
等位基因特異寡核苷酸探針優(yōu)選長度是12到50個核苷酸，更優(yōu)選長度約是12-35個核苷酸，最優(yōu)選長度約12-30個核苷酸。
這種探針的設計對于普通技術的分子生物學家是顯而易見的，并且可以根據(jù)DNA或RNA序列信息。這種探針具有任何適合的長度，如達到50個堿基，達到40個堿基，更適合的達到30個堿基的長度，如，例如8-25或8-15個堿基長度。一般地，這種探針將包含與所述基因中相應野生型或變異體座位完全互補的堿基序列。然而，只要寡核苷酸探針的辨別力不被不適當?shù)赜绊懀绻枰?，可以引入一個或多個錯配。本發(fā)明探針可以帶有一個或多個標記以利于檢測(例如，熒光標記，包括例如FAM和VIC)。
本發(fā)明進一步提供了可以檢測根據(jù)本發(fā)明的核苷酸多態(tài)性的核苷酸引物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了具有檢測在對應于三聯(lián)體一個或多個堿基的DNA位置的細胞色素b基因多態(tài)性能力的等位基因特異引物，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明該方面優(yōu)選實施方式，提供了具有檢測在對應于三聯(lián)體第一和/或第三堿基的DNA位置的細胞色素b基因多態(tài)性能力的等位基因特異引物，該三聯(lián)體編碼在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明該方面進一步優(yōu)選的實施方式，提供了具有檢測在對應于三聯(lián)體第一或第三堿基的DNA位置的細胞色素b基因多態(tài)性能力的等位基因特異引物，該三聯(lián)體編碼在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明該方面進一步優(yōu)選的實施方式，提供了具有檢測在對應于三聯(lián)體第三個堿基的DNA位置的細胞色素b基因多態(tài)性能力的等位基因特異引物，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
在上述方面中，DNA序列中所述突變優(yōu)選是在所述三聯(lián)體第一堿基從胸腺嘧啶到胞嘧啶堿基的改變和在所述三聯(lián)體第三堿基從胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鳥嘌呤的改變，最優(yōu)選在第三位置從胞嘧啶到腺嘌呤的改變。
在本發(fā)明另一方面提供了具有檢測編碼野生型細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌DNA序列能力的等位基因特異引物，所述真菌DNA序列從如下真菌選擇葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥專化型/大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophorateres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，Mycosphaerella musicola，Cercosporaarachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomycescarpophillum，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymellalycopersici)，煙草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隱匿柄銹菌(Puccinia recondita)和堀病柄銹菌(Puccinia horiana)，其中所述引物具有檢測編碼在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的苯丙氨酸殘基的DNA序列的能力。
在本發(fā)明該方面優(yōu)選實施方式中提供了具有檢測編碼野生型細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌DNA序列能力的等位基因特異引物，所述真菌DNA序列選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophorateres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola，其中所述引物具有檢測編碼在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的苯丙氨酸殘基的DNA序列的能力。
在本發(fā)明該方面優(yōu)選實施方式中，所述真菌DNA序列選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola。
在本發(fā)明另一方面我們提供了具有檢測編碼部分突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌DNA序列的能力的等位基因特異引物，其中所述等位基因特異引物能夠檢測編碼在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸的DNA序列，所述氨基酸選自異亮氨酸，亮氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，纈氨酸，酪氨酸，最優(yōu)選亮氨酸。
在本發(fā)明該方面進一步的實施方式中，我們提供了能夠檢測編碼部分突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌DNA序列的等位基因特異引物，其中所述等位基因特異引物能夠檢測編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸的DNA序列，所述氨基酸選自異亮氨酸，亮氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，纈氨酸，酪氨酸，最優(yōu)選亮氨酸。
在本發(fā)明該方面優(yōu)選實施方式中，我們提供了具有檢測編碼部分突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌DNA序列能力的等位基因特異引物，所述真菌DNA序列選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥專化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyreophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymella lycopersici)，煙草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隱匿柄銹菌(Pucciniarecondita)和堀病柄銹菌(Puccinia horiana)，其中所述引物能夠檢測編碼在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸的DNA序列，所述氨基酸選自異亮氨酸，亮氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，纈氨酸，酪氨酸，最優(yōu)選亮氨酸。
在本發(fā)明該方面進一步優(yōu)選實施方式中，我們提供了具有檢測真菌編碼部分突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的DNA序列能力的等位基因特異引物，所述真菌DNA序列選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?大麥專化型(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)，黑麥喙孢(Rhyunchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerellafijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerothecafuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Didymella bryoniae，番茄亞隔孢殼菌(Didymellalycopersici)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola，其中所述引物能檢測編碼在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸的DNA序列，所述氨基酸選自異亮氨酸，亮氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，纈氨酸，酪氨酸，最優(yōu)選亮氨酸。
通常在擴增反應，如PCR反應中，等位基因特異引物與普通引物一起使用，通過在特定序列位置，例如ARMS測定中所用的特定序列位置的一個等位基因的選擇性擴增，該擴增反應提供了等位基因間的辯別。
現(xiàn)在，我們能設計用于上面列出的真菌物種中F129L突變的引物，已經(jīng)證明該引物能可靠地和有力地檢測特異突變。所述引物檢測在對應于三聯(lián)體第一堿基的DNA位置的胸腺嘧啶到胞嘧啶堿基的改變，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，和/或檢測在對應于三聯(lián)體第三堿基的DNA位置的胸腺嘧啶或胞嘧啶到腺嘌呤或鳥嘌呤堿基的改變，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。這里等位基因特異引物指診斷引物。
因此，本發(fā)明另一方面提供了能夠在對應于三聯(lián)體第一和/或第三堿基位置結合含有突變體類型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與真菌細胞色素b基因的所述突變體形式中存在的核苷酸對應，并且所述核苷酸的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗性。
因此，在該方面進一步實施方式中，本發(fā)明提供了能夠在對應于三聯(lián)體第一或第三堿基位置結合含有突變體類型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與真菌細胞色素b基因的所述突變體形式中存在的核苷酸對應，并且所述核苷酸的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗藥性。
因此，在該方面的進一步實施方式中，本發(fā)明提供了能夠在對應于三聯(lián)體第一和/或第三個堿基位置結合含有突變體類型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與真菌細胞色素b基因的所述突變體形式中存在的核苷酸對應，并且所述核苷酸的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗藥性。
因此，在該方面進一步優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了能夠在對應于三聯(lián)體第一或第三堿基位置結合含有突變體類型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與真菌細胞色素b基因的所述突變體形式中存在的核苷酸對應，并且所述核苷酸的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗藥性。
因此，本發(fā)明的另一方面提供了能夠在對應于三聯(lián)體第三堿基的位置結合含有突變體類型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中在對應于釀酒酵母(S.cerevisiaec)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與真菌細胞色素b基因的所述突變體形式中存在的核苷酸對應，并且所述核苷酸的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗藥性。
因此在另一方面，本發(fā)明提供了具有在對應于三聯(lián)體第一堿基的位置結合含有突變體類型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板能力的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與真菌細胞色素b基因的所述突變體形式中存在的核苷酸對應，并且所述核苷酸的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗藥性。
本發(fā)明診斷引物優(yōu)選至少20個核苷酸長度，最優(yōu)選約26個核苷酸長度。然而，本發(fā)明的診斷引物也可以是15到20個核苷酸之間的長度。本領域技術人員將理解本發(fā)明的診斷引物可以是與編碼真菌細胞色素b蛋白質(zhì)的核酸的有義或反義鏈雜交的這種引物。
在本發(fā)明上述方面優(yōu)選實施方式中，引物的倒數(shù)第二個核苷酸(-2)與在野生型細胞色素b序列相應位置存在的核苷酸不相同。
在進一步優(yōu)選實施方式中，是引物的-3核苷酸與在野生型細胞色素b序列相應位置存在的核苷酸不相同。
也可以與-2或-3核苷酸一起引入其它去穩(wěn)定成分。
在本發(fā)明上述方面進一步特別優(yōu)選的實施方式中，我們提供了能夠結合含有對應于三聯(lián)體第一和/或第三堿基的突變體類型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與真菌細胞色素b基因的所述突變體形式中存在的核苷酸對應，其中剩余核苷酸中多至10，如多達8，6，4，2，1個核苷酸可以相對于野生型序列改變，而不顯著影響診斷引物的特性。
在本發(fā)明該方面進一步特別優(yōu)選的實施方式中，我們提供了能結合含有對應于三聯(lián)體第一或第三堿基的突變體類型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與真菌細胞色素b基因的所述突變體形式中存在的核苷酸對應，其中剩余核苷酸中多達10，如多達8，6，4，2，1個核苷酸可以相對于野生型序列改變，而不顯著影響診斷引物的特性。
在本發(fā)明上述方面進一步特別優(yōu)選的實施方式中，我們提供了能結合含有對應于三聯(lián)體第三堿基的突變體類型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與真菌細胞色素b基因的所述突變體形式中存在的核苷酸對應，其中剩余核苷酸中多達10，如多達8，6，4，2，1個核苷酸可以相對于野生型序列改變，而不顯著影響診斷引物的特性。
在本發(fā)明上述方面進一步特別優(yōu)選的實施方式中，我們提供了能結合含有對應于三聯(lián)體第一堿基的突變體類型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與真菌細胞色素b基因的所述突變體形式中存在的核苷酸對應，其中剩余核苷酸中多達10，如多達8，6，4，2，1個核苷酸可以相對于野生型序列改變，而不顯著影響診斷引物的特性。
在本發(fā)明上述方面進一步特別優(yōu)選的實施方式中，我們提供了包含下面給定序列和其衍生物的診斷引物，其中在3’末端最末端的核苷酸與下面給定的序列相同，其中剩余核苷酸中達到10，如達到8，6，4，2，1個核苷酸可以改變，而不顯著影響診斷引物的特性。
如本領域技術人員將理解的，診斷(例如ARMS)引物有高Tm，優(yōu)選地，在本發(fā)明所有方面中，ARMS引物是約26個核苷酸長度。適合地，診斷引物的序列可以和下面(參見表9到13)提供的完全相同。在下列表9到13中列出的所有引物中，倒數(shù)第二的核苷酸已從野生型細胞色素b序列改變以使模板/引物雜合體去穩(wěn)定，由此使其對期望模板更有選擇性，并且根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選這些引物。也可以改變替代上文討論的那些的或除上文討論的那些之外的堿基，而不會不利地影響引物與模板結合的能力，這對引物設計領域技術人員顯而易見。
表9用于F129L突變檢測的ARMS引物設計，其中編碼亮氨酸殘基的三聯(lián)體第一堿基是胞嘧啶。

表10用于F129L突變檢測的ARMS引物設計，其中編碼亮氨酸殘基的三聯(lián)體第三堿基是腺嘌呤殘基。

表11用于F129L突變檢測的ARMS引物設計，其中編碼亮氨酸殘基的三聯(lián)體第三堿基是鳥嘌呤。

表12用于F129L突變檢測的ARMS引物設計，其中編碼殘基129的三聯(lián)體第一堿基是胞嘧啶，第三堿基是腺嘌呤殘基，因此編碼亮氨酸。

表13用于F129L突變檢測的ARMS引物設計，其中編碼殘基129的三聯(lián)體第一堿基是胞嘧啶，編碼三聯(lián)體第三堿基是鳥嘌呤，因此編碼亮氨酸。

為了舉例說明的目的，包含在表9到13中的引物包括●用于葡萄生單軸霉(P.teres)，禾生球腔菌(C.graminicola-Cgr3)和蘋果黑星菌(V.ineaqualis)的ARMS引物，該引物可以有效地用于基因組DNA制備物或生物樣品，包括真菌分離物，真菌培養(yǎng)物，真菌孢子或感染的植物材料。
●用于蒼耳單絲殼菌(S.fulginea)，番茄粉孢(O.lycopersicon)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(L.taurica)Lt1，Lt2，Lt3和Lt4，葡萄白粉病鉤絲殼霉(U.necator)，蔓延疫霉(Phytopthora infestans)，茄屬絲核菌(R.solani)，D.bryoniae Db1和Db2，和D.lycopersici的ARMS引物，該引物可能僅對cDNA有效。
●用于葡萄生單軸霉(P.viticola)，黑麥喙孢(R.secalis)，禾生球腔菌(M.graminicola)，M.fijiensis var.difformis，禾生球腔菌(C.graminicola)Cgr1和Cgr2，瓜果腐霉(P.aphanidermatum)，辣椒和芒果盤長孢狀刺盤孢(C.gloesporides-chilli and mango)，古巴假霜霉(P.cubensis)，落花生尾孢(C.arachidola)，Mycosphaerella musicola和馬鈴薯早疫病鏈格孢(A.solani)的ARMS引物，該引物可以有效地與基因組DNA制備物，cDNA制備物，cDNA制備物或生物樣品，包括真菌分離物，真菌培養(yǎng)物，真菌孢子或感染的植物材料一起使用。
對于目前沒有表征目的核苷酸多態(tài)性周圍內(nèi)含子/外顯子組構的那些物種推薦cDNA材料。
上表9-13中描述的ARMS引物提供了本發(fā)明診斷引物的具體例子。
為了使上表所示引物適于用在標準ASPCR反應中，在3’末端的最后堿基應該與點突變對應，不引入去穩(wěn)定堿基。
可以用任何適合的合成方法生產(chǎn)這種引物。在標準教科書中可以發(fā)現(xiàn)這種方法的例子，例如“Protocols For Oligonucleotides AndAnaloguesSynthesis And Properties；”Method In MolecularBiology Series；20卷；Sudhir Agrawal編輯，HumanaISBN0-89603-247-7；1993；第一版。
應當理解，可以設計診斷引物以顯示在編碼蛋白質(zhì)中引起F129L置換的一個或多個突變的缺乏，即檢測編碼苯丙氨酸的野生型序列，或證實在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b密碼子129的位置編碼亮氨酸的序列的存在。優(yōu)選ARMS引物用于檢測在編碼蛋白質(zhì)中引起F129L置換的突變的缺乏。這里描述了為該目的設計的引物。
野生型序列的檢測作為相對于突變檢測的對照是有用的，當希望定量在樣品中存在的野生型和突變體等位基因時也是必要的。
因此，在本發(fā)明另一方面提供了能夠結合含有對應于三聯(lián)體第一和/或第三堿基的野生型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與野生型真菌細胞色素b基因中存在的核苷酸對應，所述野生型真菌顯示對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物敏感。
因此，在本發(fā)明該方面的進一步實施方式中提供了具有結合含有對應于三聯(lián)體第一或第三堿基的野生型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板能力的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與野生型真菌細胞色素b基因中存在的核苷酸對應，所述野生型真菌顯示了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的敏感性。
因此，在本發(fā)明該方面的進一步實施方式中提供了能結合含有對應于三聯(lián)體第三堿基的野生型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與野生型真菌細胞色素b基因中存在的核苷酸對應，所述野生型真菌顯示了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的敏感性。
在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方式中，引物的倒數(shù)第二個核苷酸(-2)與在野生型細胞色素b序列相應位置存在的核苷酸不相同。
在進一步優(yōu)選實施方式中，引物的-3核苷酸與在野生型細胞色素b序列相應位置存在的核苷酸不相同。
也可以與-2或-3核苷酸一起引入其它去穩(wěn)定成分。
本發(fā)明診斷引物優(yōu)選至少20個核苷酸長度，最優(yōu)選26個核苷酸長度，但是其也可以是15到20之間的長度。
在本發(fā)明上述方面進一步特別優(yōu)選的實施方式中，我們提供了能結合含有對應于三聯(lián)體第一和/或第三堿基的野生型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與野生型真菌細胞色素b中存在的核苷酸對應，其中剩余核苷酸中達到10，如達到8，6，4，2，1個核苷酸可以相對于野生型序列改變，而不顯著影響診斷引物的特性。
在本發(fā)明上述方面進一步特別優(yōu)選的實施方式中，我們提供了能結合含有對應于三聯(lián)體第一或第三堿基的野生型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與野生型真菌細胞色素b中存在的核苷酸對應，其中剩余核苷酸中達到10，如達到8，6，4，2，1個核苷酸可以相對于野生型序列改變，而不顯著影響診斷引物的特性。
在本發(fā)明該方面進一步特別優(yōu)選的實施方式中，我們提供了包含下面給定序列和其衍生物的診斷引物，其中在3’末端最末端的核苷酸于下面給定的序列相同，其中剩余核苷酸中達到10，如達到8，6，4，2，1個核苷酸可以改變，而不顯著影響診斷引物的特性。方便地，診斷引物的序列可以完全和下面(表14和15)提供的序列相同。在下面列出的大部分引物中，倒數(shù)第二個核苷酸已從野生型細胞色素b改變以使模板/引物雜合體去穩(wěn)定，由此使其對期望模板更有選擇性。也可以改變替代以上討論的那些的或除以上討論的那些之外的堿基，而不會不利地影響引物與模板結合的能力，這對引物設計領域技術人員顯而易見。
表14用于植物病原體細胞色素b基因密碼子129位置1處野生型序列檢測的ARMS引物設計。

表15用于植物病原體細胞色素b基因密碼子129的位置3野生型序列檢測的ARMS引物設計。

為了使上表所示引物適于用在標準ASPCR反應中，在3’末端的最后堿基應該對應于野生型序列，不引入去穩(wěn)定堿基。
上述例子涉及基于DNA正向鏈的ARMS引物。特別優(yōu)選基于DNA正向鏈的ARMS引物的應用。然而，也可以利用基于反向(反義)鏈的ARMS引物。
如果期望，ARMS引物也可以基于DNA反向鏈。遵循上述用于正向鏈引物的相同原理，設計這種反向鏈引物，即引物可以至少是20個核苷酸長度，最優(yōu)選26個核苷酸長度，但是其也可以是15到20之間的長度，并且引物3’末端的最末端核苷酸匹配相關的模板，即突變體或野生型模型，優(yōu)選地，優(yōu)化改變倒數(shù)第二的殘基，這樣它不匹配相關的模板。此外，引物剩余核苷酸中達到10，如達到8，6，4，2，1個核苷酸可以改變，而不顯著影響診斷引物的特性。
在許多情況下，在一輪或多輪PCR擴增中，方便地一起使用本發(fā)明的診斷引物和這里稱為普通引物的另外擴增引物。在歐洲專利號EP-B1-0332435中闡述了該方面的方便的例子。所述另外擴增引物是正向或反向普通引物。在下表16中給出了可以用于特定植物病原體的這種普通引物的例子。
表16與ARMs引物一起使用的普通正向和反向引物的例子


以前在公開的國際專利申請?zhí)朩O 00/66773中描述了表16中用于黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，Mycosphaerella fijiensisvar.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fjlginea)(cDNA)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)(cDNA)，禾生刺盤孢-Cgr1(Colletotrichum graminicola-Cgr1)，辣椒盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichum gloeosporioides-chilli)，番茄粉孢(Oidiumlycipersicum)，韃靼內(nèi)絲白粉菌-Lt4(Leveillula taurica-Lt4)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，Cercospora arachidola，茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，蔓延疫霉(Phytopthora infestans)和Mycospharella musicola的普通引物。
在表3-8和公開的國際專利申請?zhí)朩O 00/66773中提供的較長序列的情況下，本領域技術人員將能利用這些信息設計適合的引物。
普通引物可以是任何方便的病原體特異序列，該序列識別位于突變選擇引物3’的細胞色素b基因(或其它目的基因)的互補鏈，這對本領域技術人員將是顯而易見的。
PCR擴增子大小優(yōu)選50到400bp長，但是可以從30到2500bp長，或潛在地從30到10,000bp長。
可以利用適合的對照引物，從F129L位置上游設計該對照引物。對照引物可以是對突變或野生型序列擴增不特異的任何引物。當與上述相應的反向(“普通”)引物一起使用這些引物時，不管F129L點突變是否存在，都將出現(xiàn)擴增。
表17適于用在本發(fā)明中的對照引物的例子

本發(fā)明旨在延及上表中公開的所有新的寡核苷酸(其可以用作引物)。
可以用各種方法檢測診斷引物延伸的產(chǎn)物和/或擴增產(chǎn)物的存在或缺乏。這對于核酸檢測方法領域的技術人員顯而易見。優(yōu)選的方法避免需要放射標記的試劑。特別優(yōu)選的檢測方法是基于診斷引物延伸產(chǎn)物存在和/或缺乏的熒光檢測的方法。特定的檢測方法包括凝較電泳分析，在1998年11月25日以Zeneca Limited名義提交的PCT申請PCT/GB98/03521中所述的“Scorpions”TM產(chǎn)品檢測，這里并入其教導作參考。進一步優(yōu)選的檢測方法包括如公開的PCT申請WO 99/04037中所述的ARMS線性延伸(ALEX)和利用ALEX的PCR。方便地，利用實時檢測。特別優(yōu)選如PCT申請?zhí)朠CT/GB98/03521和公開的英國專利申請?zhí)朑B2338301中所述“Scorpions”TM產(chǎn)品檢測的應用用在這里描述的本發(fā)明所有方面中。特別優(yōu)選如這里所述ARMS和Scorpion技術聯(lián)合用在這里描述的本發(fā)明的所有方面中，并且優(yōu)選的檢測方法是基于熒光的檢測方法。這些檢測方法中許多適于利用所有上述引物定量操作?？梢栽诓煌嚬苤羞M行或在一個試管中多路進行這些不同的PCRs。利用這種方法，可以對在野生型分子背景中存在的點突變分子的頻率進行評估。
本領域技術人員知曉，基于ARMS引物的技術提供了在等位基因選擇性雜交探針雜交后選擇性引發(fā)鄰接序列復制的能力，探針中3’殘基精確地匹配一個或其它SNP替代物?？赡艿氖?，在例如在密碼子129第一位存在C殘基的情況下能夠例如產(chǎn)生高選擇擴增的ARMS引物將很好地結合可替代的，野生型的，含有T殘基的基因的細胞色素b基因，因為除了3’和倒數(shù)第二個殘基外，存在完全的匹配。ARMS引物的關鍵特性是，因為在關鍵3’殘基的錯配，沒有鄰接區(qū)域的復制。
本領域技術人員也將理解，在給出包含在本專利申請中的植物病原真菌細胞色素b序列數(shù)據(jù)庫后，也可以利用其它的單核苷酸多態(tài)性(SNP)或簡單核苷酸多態(tài)性檢測技術檢測F129L突變。這種方法包括等位基因選擇性雜交技術如例如，如在專利號US-A-5487972和US-A-5210015中所述的“TaqMan”TM產(chǎn)品檢測；例如在通過Applied-Biosystems(850 Lincoln Centre Drive，F(xiàn)oster City，CA 94404，USA)可以得的the Applied Biosystems User BulletinPrimerExpress Version 1.5和TaqMan MGB Probes for AllelicDiscrimination(2000年5月)中以及本文中所述的“TaqManMGB”和“turbo TaqMan”探針(也參見實施例)。也可以用于檢測F129L突變的其它SNP或簡單核苷酸多態(tài)性檢測技術包括如在專利號WO-95/13399中概述的“Molecular Beacon”產(chǎn)品檢測和如在專利申請WO 97/05280中概述的表面增強拉曼共振光譜學(surfaceenhanced Raman resonance spectroscopy)(SERRS)，這里并入這兩篇文獻為參考文獻?？梢杂糜诖_定密碼子129位置存在的等位基因的其它SNP和/或簡單多態(tài)性檢測技術包括，但不限于″PyrosequencingTM″(Pyrosequencing AB，Uppsala，Sweden)，鎖定核酸(LNA)技術(Exiqon A/S，Bygstubben 9，2950 Vedbk，丹麥)，動態(tài)等位基因特異雜交(DASH)(Hybaid US，8 East ForgeParkway，F(xiàn)ranklin.MA 02038，USA)和變性高效液相層析(dHPLC)(Giordano M.等，Genomics 56(1999)247-253，Oefner P.J.J.Chromatogr.，BBiomed.Sci.Appl.739(2000)345-355)，再一次，這里并其為參考文獻。
熟練的使用者也會理解，例如，通過設計具有識別包含兩個置換的突變體序列能力的TaqMan MGB探針，或因為SNP和/或簡單核酸識別序列技術在幾個緊密連鎖的位置直接確定序列，如Pyrosequencing技術的情況，可以容易地改變一些該技術以在密碼子129的位置檢測編碼亮氨酸的等位基因，其中該密碼子129通過2個堿基的改變(例如TTT→CTA)不同于野生型苯丙氨酸密碼子。在其它情況下，特別是依賴于等位基因特異擴增方法(例如，ARMS等)的情況下，可以期望研究開發(fā)幾種檢測方法，包括對有義和反義序列作用以區(qū)分單和雙核苷酸多態(tài)性的可能引物。也可能聯(lián)合不同的SNP檢測技術(例如，ARMS和Pyrosequencing)以允許單和雙核苷酸多態(tài)性之間最敏感和特異的檢測和辯別。本發(fā)明延及用在這里描述的本發(fā)明適合方面和實施方式中的不同SNP檢測技術的聯(lián)合。例如Taqman(或TaqmanMGB)探針可以與ARMS引物和普通引物聯(lián)合使用。如果是這種情況，則優(yōu)選ARMS引物提供了對SNP突變檢測的特異性，并且Taqman(和TaqmanMGB)探針提供了檢測手段(例如待檢測的熒光團)。
如這里所示例的，我們利用了與作為檢測方法的基于DNA反向鏈的Scorpion檢測聯(lián)合的基于DNA正向鏈的ARMS引物。這里我們也示例了與作為檢測方法的基于DNA正向鏈的Scorpion檢測聯(lián)合的基于DNA反向鏈的ARMS引物。ARMS引物和Scorpion檢測成分的可替代聯(lián)合對本領域技術人員顯而易見。例如，基于DNA正向鏈的引物可以是ARMS引物與Scorpion檢測系統(tǒng)的聯(lián)合，并且這可以與基于DNA反向鏈的普通引物一起使用，或者基于DNA反向鏈的引物可以是ARMS引物與Scorpion檢測系統(tǒng)的聯(lián)合，并且這可以與基于DNA正向鏈的普通引物一起使用。
在這里所述的實例中，Scorpion檢測成分是在普通引物上。對突變和野生型序列特異的ARMS引物和普通熒光標記引物聯(lián)合使用。在不同PCR試管中進行這兩種反應，當探針結合產(chǎn)生的擴增子時熒光發(fā)射?？商娲?，Scorpion檢測成分摻入ARMS引物。在這種情況下，可以用不同熒光團標記兩個ARMS引物，并且與普通引物(這次是沒有標記的)一起使用。這三種引物可以包含在相同反應中，因為由此產(chǎn)生的突變體和野生型擴增子將引起不同的熒光發(fā)射。這種測定通常稱為多重測定法。
如在公開的英國專利申請?zhí)朑B2338301中所述，可以以大量不同方式利用Scorpion技術，如嵌入實施方式，其中Scorpion引物尾部帶有嵌入染料，該嵌入染料具有被摻入在雙鏈核酸分子堿基之間的能力，一旦它被摻入，其就變成高度發(fā)熒光的；FRET實施方式，其中包含在引物中的染料形成了能量轉(zhuǎn)移對；非猝滅劑(No-Quencher)實施方式，其中熒光團附著到Scorpion引物尾部；雙分子實施方式，其中熒光團和猝滅劑可以引入到兩個獨立的，但互補的分子上；捕獲探針實施方式，其中可以用相同的不可擴增的尾特異地捕獲和探測到擴增子，及莖(Stem)實施方式，其中引物尾含有自身互補的莖。在公開的英國專利申請?zhí)朑B2338301中充分地描述了這些實施方式，這里并入其教導作為參考。
如上所述，可以用Taqman探針或TaqmanMGB探針作為用于突變存在和/或缺乏檢測的等位基因特異雜交探針。在這些情況下，這種探針與普通正向和反向引物聯(lián)合使用，該普通正向和反向引物分別對突變上游和下游的DNA序列特異。更具體地，設計用第一熒光報道染料(例如VICTM)標記的第一Taqman探針(或第一TaqmanMGB探針)以與野生型序列雜交。設計用不同的第二熒光報道染料(例如FAM)標記的第二Taqman探針(或第一TaqmanMGB探針)以與突變雜交。該第一和第二探針還都以猝滅劑分子標記。在正向和反向引物位點之間，每種探針特異地與其互補序列退火，并且當探針退火時，作為猝滅劑分子緊密接近的結果，熒光報道染料的熒光猝滅。在PCR期間，有5’到3’外切核酸酶活性的Taq DNA聚合酶僅從與它們的特異靶序列雜交的探針切割報道染料。這引起了報道染料與猝滅劑分子的物理分離，因此引起了報道染料熒光的增加。因為探針是用不同熒光報道基因染料標記的，所以適合地它們就可以用在分離的反應中以檢測野生型或突變體序列，或可替代地它們可以同時用在相同的反應試管中。當用在相同的反應中，這種測定可以稱為多重測定法。在可從AppliedBiosystems(850 Lincoln Centre Drive，F(xiàn)oster City，CA 94404，USA)得到Applied Biosystems User Bulletin用于等位基因辯別的Primer Express版本1.5和TaqMan MGB探針(May 2000)中描述了TaqMan MGB探針?；赥aqMan的測定法特別用于對試驗樣品中突變的存在與否提供相對快速“是/否”回答。
這里描述的本發(fā)明方法可靠地以每1,000,000個野生型等位基因中1個突變等位基因到每10,000個野生型等位基因中1個突變等位基因，優(yōu)選每100,000個野生型等位基因中1個突變等位基因到每10,000個野生型等位基因中1個突變等位基因范圍的檢測水平檢測真菌細胞色素b基因中一個或多個單核苷酸多態(tài)性突變，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換(F129L)，其中所述突變的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗藥性。本發(fā)明方法也可以檢測以較高頻率存在，例如每100個野生型等位基因中1個突變等位基因，每10個野生型等位基因中1個突變等位基因的頻率存在或僅存在突變等位基因時的突變。類似地，本發(fā)明方法可以用于檢測突變等位基因背景中的野生型等位基因的頻率。
由于使用ARMS技術而變得更敏感的等位基因特異引物延伸和用在本發(fā)明中的定量檢測方法的聯(lián)合應用使這成為了用于檢測以低頻率出現(xiàn)的真菌單和/或簡單多核苷酸多態(tài)性突變的極其有價值的技術。
負責引起給定分離物中存在的對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的真菌抗藥性的這些等位基因的檢測使得表型生物測定的結果能夠與靶基因的DNA輪廓有關。作為抗藥性機理的單點突變的發(fā)現(xiàn)解釋了抗藥性的定量特性，并且單孢子分離物序列的確認證實了在測定被測試驗樣品中抗藥性和敏感性分離物頻率中篩選的精確性。
如這里所示例的，聯(lián)合Scorpion系統(tǒng)與等位基因特異引物延伸，ARMS的特異性和實時熒光檢測的方法的發(fā)展使得能夠分析比生物測定程序中可行的樣品更多的樣品的抗性突變的存在。更多的樣品數(shù)能夠鑒定比通過生物測定可能容易檢測到的百分數(shù)頻率低的百分數(shù)頻率的抗性突變。在可能從野外數(shù)據(jù)知曉抗藥性以前，這能夠在種群中鑒定抗藥性。該方法的高處理量特性使得能夠比利用生物測定的方法取樣和檢測更廣泛的區(qū)域和更多地理上不同的位點。在異質(zhì)和/或異核細胞中，可以通過生物測定表型地評估基因的作用前，等位基因特異引物延伸如聯(lián)合實時熒光檢測的ARMS允許種群中抗藥性基因存在的檢測，因此，當樣品帶有低頻率的抗性基因型時，降低了分類樣品為敏感型的錯誤。通過同時讀取實時技術獲得結果比等待植物中(in planta)疾病發(fā)展快得多，使得能夠?qū)μ锏厍闆r快速反應，并且給出關于抗藥性處理的意見更快。
本發(fā)明的一個或多個診斷引物可以適合地與在本發(fā)明方法中使用的說明書及適當包裝材料一起包裝，作為試劑盒銷售。方便地，試劑盒將包含下列的一個或多個診斷、野生型、對照和普通寡核苷酸引物；適當?shù)暮塑杖姿?，例如dATP，dCTP，dGTP，dTTP，如前所述的適當聚合酶，和緩沖溶液。
本發(fā)明的一個或多個等位基因選擇性雜交探針可以方便地與在本發(fā)明方法中使用的說明書和適當包裝材料一起包裝，作為試劑盒銷售。適合地，試劑盒將包含下列的一個或多個使得包含靶病原體細胞色素b基因區(qū)域的DNA片段能夠選擇性擴增的寡核苷酸引物，所述靶病原體細胞色素b基因區(qū)域包含來源于野生型和抗嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的分離物的密碼子129，診斷野生型(F129)和抗藥性(A129)選擇性雜交探針，適合的核苷三磷酸，例如dATP，dCTP，dGTP，dTTP，如前所述的適合聚合酶，和緩沖溶液。
在本發(fā)明另一方面提供了檢測植物病原真菌對殺真菌劑抗藥性的方法，所述方法包括檢測真菌細胞色素b基因中一個或多個突變，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換(F129L)，其中所述突變的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗藥性，所述方法包括用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測技術鑒定真菌核酸中所述突變的存在或缺乏。
在本發(fā)明該方面的進一步實施方式中提供了檢測植物病原真菌對殺真菌劑抗藥性的方法，所述方法包括檢測等位基因特異雜交探針的雜交，其中所述探針雜交的檢測直接與真菌細胞色素b基因中突變的存在或缺乏有關，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換(F129L)，其中所述突變的存在引起了對殺真菌劑的真菌抗藥性，該殺真菌劑的靶蛋白質(zhì)由線粒體基因編碼。
在本發(fā)明該方面的進一步實施方式中提供了檢測植物病原真菌對殺真菌劑抗藥性的方法，所述方法包括檢測PCR反應期間產(chǎn)生的擴增子的存在，其中所述的PCR反應包括在適合的核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，用診斷引物接觸含有真菌核酸的試驗樣品，其中所述擴增子的檢測直接與真菌細胞色素b基因中突變的存在或缺乏相關，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換(F129L)，其中所述突變的存在引起了對殺真菌劑的真菌抗藥性，該殺真菌劑的靶蛋白質(zhì)由線粒體基因編碼。
在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方式中提供了檢測植物病原真菌對殺真菌劑抗藥性的方法，該殺真菌劑的靶蛋白質(zhì)由細胞色素b基因編碼，該方法包括在適合的核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，以用于真菌細胞色素b基因中一個或多個特異突變的診斷引物接觸包含真菌核酸的試驗樣品，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換(F129L)，其中所述突變的存在引起了對殺真菌劑的真菌抗藥性，以致當在樣品中存在所述突變時，延伸診斷引物；通過參照診斷引物延伸產(chǎn)物的存在或缺乏檢測所述突變的存在或缺乏。
在本發(fā)明該方面進一步優(yōu)選的實施方式中提供了檢測植物病原真菌對殺真菌劑抗藥性的方法，該殺真菌劑的靶蛋白質(zhì)由線粒體基因編碼，該方法包括在適合的核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，用針對真菌細胞色素b基因中一個或多個特異突變的診斷引物接觸包含真菌核酸的試驗樣品，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換(F129L)，其中所述突變的存在引起了對所述殺真菌劑的真菌抗藥性，以致僅當在樣品中存在所述突變時，才延伸診斷引物；通過參照診斷引物延伸產(chǎn)物的存在或缺乏檢測所述突變的存在或缺乏。
在上述方面和實施方式中描述的本發(fā)明方法特別適合與植物病原真菌株系一起使用，其中細胞色素b基因中一個或多個突變的存在引起了真菌抗藥性，最特別地是引起了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物的抗藥性，其中真菌DNA中的突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸殘基的置換，更特別地引起了編碼蛋白質(zhì)中F129L置換，特別地，其中在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129位置的密碼子第一位置，突變是T到C堿基的改變，或在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129位置的密碼子第三位置突變是從T或C到A或G堿基的改變。
本發(fā)明另一方面提供了檢測和定量真菌細胞色素b基因中一個或多個突變的頻率的方法，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換(F129L)，其中所述突變的存在引起了對嗜球果傘素類似物的真菌抗藥性，所述方法包括在真菌基因組中檢測突變的存在或缺乏，其中所述突變的存在引起了對所述殺真菌劑的真菌抗藥性，所述方法包括用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測技術鑒定和定量真菌核酸中所述突變的存在和缺乏。
在本發(fā)明該方面的進一步優(yōu)選實施方式中提供了檢測和定量真菌細胞色素b基因中一個或多個突變的頻率的方法，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換(F129L)，其中所述突變的存在引起了對殺真菌劑的真菌抗藥性，該殺真菌劑靶蛋白質(zhì)由線粒體基因編碼，所述方法包括在真菌基因中檢測突變的存在或缺乏，其中所述突變的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中任何其它化合物的抗藥性，所述方法包括用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測技術鑒定和定量真菌核酸中所述突變的存在和缺乏。
在本發(fā)明該方面的進一步實施方式中提供了檢測和定量真菌細胞色素b基因中一個或多個突變的頻率的方法，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換(F129L)，其中所述突變的存在引起了植物病原真菌對真菌殺蟲劑的抗藥性，該殺真菌劑靶蛋白質(zhì)由線粒體基因編碼，所述方法包括通過用適合的診斷性野生型(F129)和抗藥性(A129)選擇性雜交探針接觸含有真菌核酸的試驗樣品檢測等位基因選擇性探針的雜交，其中所述等位基因特異性探針的雜交的檢測直接與所述核酸中所述突變的存在和缺乏兩者有關，其中所述突變的存在引起了對殺真菌劑的抗藥性，該殺真菌劑靶蛋白質(zhì)由線粒體基因編碼，并通過參照PCR反應期間產(chǎn)生的擴增子的存在或缺乏檢測和定量所述突變的相對存在和缺乏。
在本發(fā)明該方面的進一步實施方式中提供了檢測和定量真菌細胞色素b基因中一個或多個突變的頻率的方法，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換(F129L)，其中所述突變的存在引起了植物病原真菌對真菌殺蟲劑的抗藥性，該殺真菌劑靶蛋白質(zhì)由線粒體基因編碼，所述方法包括檢測PCR反應期間產(chǎn)生的擴增子的存在，其中所述的PCR反應包括在適合的核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，用適合引物接觸含有真菌核酸的試驗樣品，其中所述擴增子的檢測直接與所述核酸中突變的存在和缺乏兩種有關，其中所述突變的存在引起了對殺真菌劑的真菌抗藥性，該殺真菌劑靶蛋白質(zhì)由線粒體基因編碼，并通過參照PCR反應期間產(chǎn)生的擴增子的存在或缺乏，檢測和定量所述突變的相對存在和缺乏。
在本發(fā)明該方面的進一步優(yōu)選實施方式中提供了檢測和定量真菌細胞色素b基因中一個或多個突變的頻率的方法，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換(F129L)，其中所述突變的存在引起了植物病原真菌對真菌殺蟲劑的抗藥性，該殺真菌劑靶蛋白質(zhì)由線粒體基因編碼，所述方法包括在適合核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，用診斷引物接觸包含真菌核酸的試驗樣品以檢測所述核酸中特定突變的存在和缺乏，特定突變的存在引起了對所述殺真菌劑的抗藥性，使得僅當樣品中存在適合的真菌模板時，才延伸與特定突變?nèi)狈痛嬖谟嘘P的診斷引物；并通過參照診斷引物延伸產(chǎn)物的存在或缺乏，檢測和定量所述突變的相對存在和缺乏。
在上述方面和實施方式中描述的本發(fā)明方法特別適合用于植物病原真菌株系，其中細胞色素b基因中突變的存在引起了真菌抗藥性，最特別地是引起了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物的抗藥性，最特別地是由于在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的密碼子第一位置從T到C堿基改變的突變，和/或在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的密碼子第三位置從T或C到A或G堿基改變的突變，優(yōu)選地，由于在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的密碼子第一位置從T到C堿基改變的突變，或優(yōu)選地，由于在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的密碼子第三位置從T或C到A或G堿基改變的突變，最優(yōu)選地，由于在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的密碼子第三位置從C到A堿基改變的突變，所以真菌DNA中的突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了苯丙氨酸殘基的置換。
然而，本發(fā)明另一個方面提供了篩選應用于農(nóng)作物的活性殺真菌劑和其最佳施用水平的方法，包括分析具有感染所述農(nóng)作物能力的的真菌樣品，和檢測和/或定量所述真菌的細胞色素b基因中一個或多個突變的存在和/或缺乏，所述突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換，其中所述突變的存在可以引起對殺真菌劑的抗藥性，該殺真菌劑的靶蛋白質(zhì)由線粒體基因編碼，然后篩選活性殺真菌劑和其最佳施用水平。這可以例如通過用本發(fā)明方法首先測試目的植物病原真菌中F129L突變出現(xiàn)的頻率來完成。一旦對F129L突變出現(xiàn)的天然出現(xiàn)頻率進行了最初的評估，就可以試驗不同真菌控制方案。例如，可以將一定范圍不同比率和/或數(shù)量和/或施用頻率的殺真菌劑(優(yōu)選作為嗜球果傘素殺真菌劑)施用于真菌的進一步試驗樣品(優(yōu)選謹慎維持恒定的疾病選擇壓力)，并且對于每一個方案，可以用本發(fā)明方法評估F129L突變出現(xiàn)的頻率。然后可以繪出所使用的真菌控制方案和F129L突變的介導的抗藥性的出現(xiàn)頻率之間的相關性。本領域技術人員從該相關性能容易地評估最好的真菌控制方案以維持真菌控制和對所用真菌試劑的低水平抗藥性。
在本發(fā)明該方面特別優(yōu)選的實施方式中，檢測方法包括任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測技術，更優(yōu)選地，包括在適合的核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，利用用于特定突變的診斷引物接觸包含真菌核酸的試驗樣品，這樣當在樣品中存在所述突變時，延伸診斷引物；通過參照診斷引物延伸產(chǎn)物的存在或缺乏，檢測所述突變的存在或缺乏，并且定量通過如下方式來實現(xiàn)在適合核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，用診斷引物接觸含有真菌核酸的試驗樣品以檢測所述核酸中特定突變的存在和缺乏，所述突變的存在引起了對殺真菌劑的抗藥性，該殺真菌劑靶蛋白質(zhì)由線粒體基因編碼，使得當在樣品中存在適合的真菌模板時，延伸與特定突變?nèi)狈痛嬖谟嘘P的診斷引物；通過參照診斷引物延伸產(chǎn)物的存在或缺乏，檢測和定量所述突變的相對存在和缺乏。
在本發(fā)明該方面進一步特別優(yōu)選的實施方式中，檢測方法包括在適合的核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，將用于特定突變的診斷引物接觸包含真菌核酸的試驗樣品，這樣僅當在樣品中存在所述突變時，才延伸診斷引物；通過參照診斷引物延伸產(chǎn)物的存在或缺乏，檢測所述突變的存在或缺乏，并且，通過如下方式實現(xiàn)定量在適合核苷三磷酸和聚合試劑存在的情況下，用診斷引物接觸含有真菌核酸的試驗樣品以檢測所述核酸中特定突變的存在和缺乏，所述突變的存在引起了對殺真菌劑的抗藥性，該殺真菌劑的靶蛋白質(zhì)由線粒體基因編碼，以致僅當在樣品中存在適合的真菌模板時，才延伸與特定突變?nèi)狈痛嬖谟嘘P的雜交診斷引物；和通過參照診斷引物延伸產(chǎn)物的存在或缺乏，檢測和定量所述突變的相對存在和缺乏。
在本發(fā)明該方面特別優(yōu)選的實施方式中，檢測方法包括任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測技術，更優(yōu)選地，包括將用于特定突變的等位基因特異性雜交探針接觸包含真菌核酸的試驗樣品，以致當在樣品中存在所述突變時，雜交探針雜交；通過試驗樣品中野生型(F129)植物病原體細胞色素b基因量的檢測和定量，檢測所述突變的存在或缺乏，而定量通過如下方式來實現(xiàn)在適合核苷三磷酸和聚合試劑存在的情況下，用等位基因特異性探針接觸含有真菌核酸的試驗樣品以檢測所述核酸中特定突變的存在和缺乏，所述突變的存在引起了對殺真菌劑的抗藥性，線粒體基因編碼該殺真菌劑的靶蛋白質(zhì)，以致當在樣品中存在適合的真菌模板時，與特定突變?nèi)狈痛嬖谟嘘P的雜交探針雜交；通過參照雜交產(chǎn)物的存在或缺乏，檢測和定量所述突變的相對存在和缺乏。
這里描述的本發(fā)明方法特別適合用于植物病原真菌株系，其中細胞色素b基因中突變的存在引起了殺真菌劑抗藥性，最特別地是引起了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物的抗藥性，并且其中真菌DNA中的突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸殘基的置換，更特別地引起了編碼蛋白質(zhì)中F129L置換，特別地，其中在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的密碼子第一位置，突變是T到C堿基的改變，或其中在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的密碼子第三位置，突變是從T或C到A或G堿基的改變，優(yōu)選C到A堿基改變。
本發(fā)明另一方面提供了控制農(nóng)作物真菌感染的方法，包括給農(nóng)作物施用殺真菌劑，其中根據(jù)上述本發(fā)明的任何篩選方法篩選所述殺真菌劑。
上述本發(fā)明的方法特別適合用于植物病原真菌株系，其中真菌細胞色素b基因中一個或多個突變的存在引起了編碼蛋白質(zhì)中F129L的置換，其中所述突變的存在引起了殺真菌劑抗藥性，最特別地，所述突變的存在引起了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物的抗藥性。
本方面的另一方面提供了用于殺真菌活性化合物檢測的測定法，包括對真菌株系篩選化合物，其中已根據(jù)這里描述的本發(fā)明方法檢測了該真菌的真菌細胞色素b基因中一個或多個突變的缺乏或存在，該突變引起了編碼蛋白質(zhì)中F129L的置換，引起了殺真菌劑抗藥性，該殺真菌劑的靶蛋白質(zhì)由線粒體基因編碼；然后確定對所述真菌株系的殺真菌活性。
這里描述的本發(fā)明方法特別適合用于植物病原性真菌株系，其中細胞色素b基因中一個或多個突變的存在引起了殺真菌劑抗藥性，最特別地是引起了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物的抗藥性，其中真菌DNA中的突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸殘基的置換，更特別地引起了編碼蛋白質(zhì)中F129L置換，特別地，其中突變是在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基143的位置的密碼子第一位置T到C堿基的改變，或突變是在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的密碼子第三位置從T或C到A或G堿基的改變，優(yōu)選從C到A堿基的改變。
通過應用這里描述的本發(fā)明方法，可以確定待施用于農(nóng)作物的殺真菌劑的適合的施用率和/或殺真菌劑的適當聯(lián)合。
這里描述的本發(fā)明方法特別適用于在作物中監(jiān)測真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗藥性組中化合物的抗藥性，所述農(nóng)作物如谷類，水果和蔬菜如菜籽油菜(canola)，向日葵，煙草，甜菜，棉花，大豆，玉米，小麥，大麥，稻，高粱，西紅柿，芒果，桃，蘋果，梨，草莓，香蕉，瓜，馬鈴薯，胡蘿卜，萵苣，甘藍，洋蔥，葡萄樹和草坪草。
這里描述的本發(fā)明方法對于檢測真菌細胞色素b基因中低頻率的一個或多個突變特別敏感，所述突變在編碼蛋白質(zhì)中引起了F129L的置換，其中所述突變的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物的抗性，或使其成為篩選植物病原真菌是否發(fā)生殺真菌抗藥性的特別有用的和商業(yè)上重要的方式，其中抗藥性是由于上面描述的突變引起的。
ARMS和其它基于等位基因選擇性擴增的定量PCR檢測系統(tǒng)與技術如Taqman和Molecular Beacons等之間的關鍵不同是后面的方法依賴于等位基因辯別性雜交探針提供熒光信號的能力，該熒光信號與那時存在的靶PCR產(chǎn)物量成比例地相關。這意味著可以用單一，非選擇性和常規(guī)的引物對擴增靶基因的野生型/親本和變異體/突變體等位基因然后從來源于等位基因辯別性雜交探針的熒光信號讀取來源于每個等位基因的PCR產(chǎn)物量，和在每輪PCR循環(huán)中與起始樣品中存在的量直接相關的量。在Taqman測定法情況下，通過DNA聚合酶相關的5’外切核酶“釋放”該信號，該5’外切核酶介導從雜交等位基因選擇性探針的釋放熒光團，而在Molecular Beacons情況下，通過5’和3’偶聯(lián)熒光團和猝滅劑類在Beacon對靶等位基因雜交中的分離釋放該信號。
在等位基因選擇性擴增技術的情況下，如ARMS，基于引物特異性的差異PCR反應確定了反應中任何時候出現(xiàn)的特異性PCR產(chǎn)物的量，其又直接與起始樣品中存在的等位基因的量相關。然后，通過非特異性技術，如嵌入雙鏈DNA特異染料，如SYBRGreen I(MolecularProbes Inc.，4849 Pitchford Ave.，Eugene，Oregon，USA)或靶基因特異但等位基因非選擇性的探針，如Scorpions實現(xiàn)存在的PCR產(chǎn)物量的定量測定。
如本領域技術人員將理解的，這些差異和它們的相關特征提供了區(qū)別性的優(yōu)點和潛在的缺點，包括-●一旦得到常規(guī)靶基因選擇性PCR引物，僅需要設計和驗證單對SNP辯別性Taqman或Molecular Beacon探針。
●對于每個基于等位基因辯別ARMS/Scorpion的測定法，需要設計和驗證等位基因選擇性引物對(ARMS)和靶基因特異性雜交探針(Scorpions)。
●因為Scorpion探針與靶基因產(chǎn)物雜交的分子內(nèi)特性，所以當利用Scorpion探針時，有高的信號強度和反應速度(Whitcombe D.，Theaker J.，Guy S.P.，Brown T.&Little S.(1999)NatureBiotechnology 17(1999)，804-807 Thelwell N.，Millington S.，Solinas A.，Booth J.，&Brown T.(2000)Nucleic Acids Research28(2000)3752-3761)。
●如果發(fā)生任何非特異性擴增，伴隨非序列選擇性雙鏈DNA檢測技術可能出現(xiàn)的復雜化，這可能是由于田地樣品中污染DNA和/或引物二聚體形成的結果。
然而，在許多情況下，這些方法中每一種非常適于，例如檢測和測量該申請中所述的細胞色素b基因等位基因F129和/或L129的相對量。當正在評估特定植物病原體相對均一分離物的基因型時，例如，懷疑嗜球果傘素/QoI殺真菌劑失效的各疾病樣品，這是特別正確的。
然而，專家將理解，存在很重要的情形，其中基于等位基因選擇性擴增的技術，特別是基于ARMS/Scorpions的技術提供的高度敏感和選擇性能力，具有實際的優(yōu)點。與該申請直接相關的特定情況是在來源于群體的核酸制備物的分析中，該群體包含這里描述的可替代SNPs，如F129和L129等位基因的混合物。更具體地，當可替代的SNPs的相對頻率在廣泛范圍變化時就是這種情況。
將理解，正常地植物病原體的田間樣品包含這種種群，并且實際上，分析來源于特定地理區(qū)域，種植園，葡萄園，農(nóng)場，田地，果園或小塊土地的代表性種群常常是農(nóng)用化學品性能的最重要指標，該農(nóng)用化學品性能受靶害蟲中存在的SNPs，如編碼細胞色素b基因中F129和L129等位基因的SNPs的影響。
本領域技術人員也將理解，線粒體編碼的基因，如細胞色素b基因也構成了一種背景，其中分析種群技術的適用性特別重要。雖然生物體如植物病原體在它們營養(yǎng)生長階段幾乎總是單倍體或二倍體，具有0、1、1+1或0+2個拷貝的可替代的核編碼的目的基因的等位基因，但是對于線粒體編碼的基因，情況可能復雜得多。單個植物病原體每個核可能有數(shù)十個，有時數(shù)百個線粒體，單個線粒體其自身也可能具有多個線粒體基因組。因此，本質(zhì)上線粒體基因是群體的成員，即使線粒體基因取自標稱是個體的，微生物學純化的分離物的樣品，當與來自于同樣樣品的核基因比較時，線粒體基因群體更大，更復雜和多樣。
用于分析種群，特別是重要的等位基因以相對低水平存在的種群的基于等位基因選擇性擴增的定量PCR技術的較大適用性源于PCR方法的內(nèi)在特性它是基于指數(shù)擴增的技術(參見，例如Saiki等，Science 230(1985)1350，PCR(Newton & Graham)3-5頁(1994)BIOS Scientific Publishers ISBN 1 872748 82 1和The Encyclopediaof Molecular Biology(Kendrew & Lawrence編輯)864-866頁(1994)Blackwell Science Ltd.ISBN 0 632 02182 9)。
首先，這意味如果在樣品中以顯著不同濃度(例如，100倍，1,000倍或10,000倍)存在能用普通引物對擴增的基因的兩個等位形式，那么在PCR期間將維持它們相對的豐度。因此，通過等位基因特異性探針，如Taqman或Molecular Beacons退火獲得的雜交信號的相對強度將總是反映該差異。低于100倍，1,000倍或10,000倍強度的熒光信號在背景水平上是極其難以檢測的。其次，正常地，PCR反應受限于合成PCR產(chǎn)物所需核苷酸的完全利用。因此，在較低豐度種類的顯著擴增可能開始前，高豐度種類的指數(shù)擴增可能嚴重地消耗或甚至用盡了核苷酸的供應。此外，雜交是動力學過程，并且在雙分子反應，如Taqman和Molecular Beacons中，該速率是反應物濃度的函數(shù)。因此，較豐富PCR產(chǎn)物的較高濃度將引起與其相關探針以較高速率退火。作為這些因素的結果，我們發(fā)現(xiàn)在混合種群中，Molecular Beacon和Taqman測定法有效范圍僅覆蓋約10-50倍，并且更具體地，少于10倍的差異。
相比之下，等位基因選擇性擴增技術不受由于等位基因/SNPs變化的濃度而引起的這種競爭效應的影響。在反映樣品中特定等位基因/SNP存在的信號變得明顯時的PCR循環(huán)是該等位基因起始濃度的簡單函數(shù)。因為沒有競爭擴增產(chǎn)物存在，所以沒有對底物的競爭，并且熒光信號總是可以接近最大值。
結果，在平行反應中用適合的等位基因選擇性擴增試劑分析包含不同等位基因/SNPs混合物的DNA群體時，可以在非常廣泛的范圍獲得起始樣品中等位基因/SNPs相對濃度的精確評估。典型地，我們發(fā)現(xiàn)用基于ARMS/Scorpions的測定法容易獲得0.01-99.99％(104)的范圍，常?？梢垣@得0.001-99.999％(105)的范圍，有時可以獲得0.0001-99.9999％(106)的范圍。
參考實施例和附圖進一步舉例說明了本發(fā)明。


圖1表描述了瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)分離物的來源和對腈嘧菌酯(azoxystrobin)的敏感性。
圖2表描述了對于腈嘧菌酯處理的草皮的疾病發(fā)展。
圖3對應于氨基酸73到283的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)細胞色素b區(qū)域的分子特征概述。
圖4兩個共有K3758序列與部分野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)細胞色素b基因序列的堿基對對齊。
圖5兩個共有K3758序列與部分野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)細胞色素b基因序列的氨基酸對齊。
圖6聯(lián)合有義等位基因選擇性ARMS引物用在瓜果腐霉(P.aphanidermatum)F129L測定中的反義Scorpion引物的莖-環(huán)二級結構。
圖7曲線圖，表示用引物Pt129-1進行的野生型質(zhì)粒擴增(孔A3和A4)和突變體質(zhì)粒的擴增(孔A1和A2)。
圖8曲線圖，表示表示用引物Pt129-4進行的突變體質(zhì)粒的擴增(孔A1和A2)和野生型質(zhì)粒擴增(孔A3和A4)。
圖9聯(lián)合反義等位基因選擇性ARMS引物用在瓜果腐霉(P.aphanidermatum)F129L測定中的有義Scorpion引物的莖-環(huán)二級結構。
圖10ARMS引物Pt129-A14和Pt129-C4在適合模板上的Ct值曲線圖。
圖11ARMS引物Pt129-A14和Pt129-A14之間ΔCt對模板濃度的曲線圖。
圖12曲線圖，表示當向野生型(F129)等位基因恒定背景摻入10倍稀釋度的抗藥性(L129)等位基因時，用ARMS引物Pt129-A14進行的L129等位基因的擴增。
圖13用于瓜果腐霉(P.aphanidermatum)F129L測定中的log10DNA濃度對ΔCt的作圖。
圖14表示用于植物劑量反應測定中的葡萄生單軸霉(P.viticola)樣品I112和I116b制備的流程圖。
圖15表示分離物I112和I116b的DNA對齊。
圖16表示分離物I112和I116b的氨基酸對齊。
圖17表示用于葡萄生單軸霉(P.viticola)的有義Scorpion引物。
圖18用于葡萄生單軸霉(P.viticola)F129L測定中的log10 DNA濃度對ΔCt的作圖。
圖19表示用于葡萄生單軸霉(P.viticola)的反義Scorpion引物。
圖20表示兩個馬鈴薯早疫病鏈格孢(A.solani)分離物的核苷酸對齊。
圖21表示兩個馬鈴薯早疫病鏈格孢(A.solani)分離物的氨基酸對齊。
發(fā)明的詳述實施例在下面實施例3，4，5，6，7，8，9，12，13，14，15，16和17中，用ScorpionTM系統(tǒng)(AstraZeneca Diagnostics)作為產(chǎn)物檢測系統(tǒng)。在1998年11月25日Zeneca Limited提交的PCT申請?zhí)朠CT/GB98/03521中充分地描述了該檢測系統(tǒng)，這里并入該申請教導作為參考。這個新的檢測系統(tǒng)利用具尾引物和整合信號系統(tǒng)。該引物有模板結合區(qū)和包含接頭及靶結合區(qū)的尾部。在應用中，尾部的靶結合區(qū)與引物延伸產(chǎn)物的互補序列雜交。該靶特異性雜交事件與信號系統(tǒng)偶聯(lián)，其中雜交引起了可檢測的變化。該系統(tǒng)的檢測方法提供了許多優(yōu)于其它系統(tǒng)的重要優(yōu)點。僅需要單個引物/檢測者類型?；谂c引物延伸產(chǎn)物雜交的靶結合區(qū)的容易獲得，其提供了增加的簡單性和增強的特異性。新合成的引物延伸產(chǎn)物是靶物質(zhì)，因此獲得的輸出信號與延伸引物的量直接相關。它不取決于其它的雜交事件和酶促步驟。對探針位點的鏈內(nèi)和鏈間競爭是有限的，因此探針設計變得簡化。因為相互作用是單分子的，所以信號反應非常迅速，允許增加的循環(huán)速率，后者是實驗效率的重要特征。
下述實施例中設計的Scorpion引物共同地有下列修飾●六乙二醇(hexethylene glycol，HEG)單體作為封閉部分，該封閉部分位于引物的模板結合區(qū)和尾部區(qū)之間，其中封閉部分阻止了聚合酶介導的引物模板尾部區(qū)的鏈復制。
●向引物5’末端添加FAM熒光分子。FAM是可以例如通過ABI PRISM7700儀器(PE Biosystems)的488nm激光容易檢測到的熒光分子之一。
●MR(甲基紅)是與尿嘧啶殘基附著的非熒光猝滅劑。
在Scorpion引物設計中也可以包含其它的熒光分子和猝滅機制，并且適合用于本發(fā)明中。
在實施例18中，示例了依賴于TaqMan測定系統(tǒng)的測定法。
實施例1對Qo位點抑制劑殺真菌劑顯示了高水平抗藥性的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分離物的鑒定在1999年，Iowa State University的G.Peng，M.L.Gleason和F.W.Nutter提供給Zeneca Agricultural Products(現(xiàn)在的Syngenta Crop Protection)一系列22種瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分離物以允許勾畫對腈嘧菌酯(azoxystrobin)的敏感性，Iowa State University的Guangbin Peng(Peng，G.等，Phytopathology 89(1999)S59.)以前測定了分離物對殺真菌劑mefenoxam的敏感性和在瓊脂平板上分離物的生長速率。圖1中顯示這些分離物的背景信息和它們的腈嘧菌酯(azoxystrobin)抗藥性概述。
為了能夠評估上面分離物的腈嘧菌酯(azoxystrobin)(嗜球果傘素)抗藥性，在含有砂質(zhì)土的4×4平方英寸的塑料罐中生長多年生黑麥草(Lolium perenne L.)。用Agsorb吸附粘土(極細紅色)固定種子，并且在種子周圍提供高水平的濕度以幫助發(fā)芽。用噴霧嘴給罐子澆水，并且用紙蓋住以減少蒸發(fā)。一天用噴霧嘴澆草皮罐子3-5次。當幼苗出現(xiàn)時，從罐子移去紙罩以防止黃化現(xiàn)象，用扇形噴嘴澆水減少到一天兩次。處理前，在溫室中(17-32℃；14h光周期)維持罐子12-16天。在這個期間，用電的Black and Decker手提式大剪刀剪草皮。
在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上維持圖1中概述的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分離物培養(yǎng)物，用0.05g/L硫酸鏈霉素修改了該馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。在250ml塑料(聚氯乙烯)燒瓶中，用40ml去離子水過夜水合有機生長(organically grown)的黑麥谷粒(50g)。在接下來的期間，高壓滅菌燒瓶2次，每次45分鐘。麥粒冷卻后，向每個燒瓶添加10個1×1cm瓜果腐霉(P.aphanidermatum)瓊脂塊。在生長室中(26℃；14h光周期)溫育含有感染黑麥粒的燒瓶7天以允許真菌定居于黑麥粒。然后通過在每個罐子中心表面放置4個麥粒，用真菌定居的黑麥谷粒接種草皮。
以3美制加侖/1000平方英尺噴霧體積，用定位于草皮上方18英寸的扇形霧錐噴嘴(8004E)在自動噴室中施以腈嘧菌酯(azoxystrobin)處理。為了防止從一個處理到另一個處理的攜帶，以最低濃度開始，最高濃度結束進行施用。在兩次處理間，用丙酮洗噴嘴一次，并且用去離子水(100ml/漂洗)洗兩次。用Heritage(腈嘧菌酯)，以0.4，0.133，0.044，0.015，0.005和0盎斯Heritage/1000平方英尺的比率噴霧草皮。施用后，讓草皮干燥，并轉(zhuǎn)移到生長室(25-28℃；14 h光周期)過夜。
如前所述施用的一天后，用真菌定居的黑麥粒接種草坪。然后，隨機選擇所有的處理，放置在露水室中(25-28℃，14h光周期)中4天。在疾病評估前24h，移草皮到生長室中。接種后5天，評估每個罐中腐霉感染的草皮面積百分數(shù)。除了分離物99-150外，瓜果腐霉(P.aphanidermatum)的所有分離物都對腈嘧菌酯敏感(表1)。敏感分離物的ED80值落在已確定的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)基線分配的ED80值范圍(圖1)。發(fā)現(xiàn)分離物99-150對腈嘧菌酯是抗藥性的。這是植物病原體真菌瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分離物對腈嘧菌酯抗藥性的首次報道。
然后，用比Heritage腈嘧菌酯推薦的商用比率高一直到9倍的比率3.6，1.2，0.4，0.133，0.044，0.015，0.005和0盎斯/1000平方英尺，通過在兩個單獨實驗中實驗證實了抗藥性分離物99-150和敏感分離物P32R的敏感性。敏感分離物P32R根據(jù)所用比率對腈嘧菌酯反應，在最高比率時感染草皮的百分數(shù)急劇下降。即使在比Heritage腈嘧菌酯推薦的比率高9倍時，抗藥性分離物99-150也不對腈嘧菌酯反應(表2)。
這項工組中研究的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分離物的前處理的信息是有限的。無論如何，我們認為表1中沒有收集日期信息的分離物從來沒有暴露于嗜球果傘素，因為一些分離物是在這些殺真菌劑商品化引入前，早于6年以前收集的。然而，1998年收集的分離物(包括抗藥性分離物99-150)可能曾暴露于嗜球果傘素。施用的數(shù)量未知。
為了在分子水平上進一步研究以研究抗藥性機理，將抗藥性分離物90-150送到英國的the Syngenta Jealott’s Hill InternationalResearch Station。在Jealott’s Hill收到分離物99-150后，分配給分離物99-150保藏號K3758。
實施例2與野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)細胞色素b基因比較，瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分離物K3758(99-150)細胞色素b基因的定向克隆和測序用下述方法進行瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分離物K3758(99-150)細胞色素b基因的表征，如表3所概述。
通過最初在25℃，12小時熒光燈下，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Oxoid)上培養(yǎng)7天制備用于分析的K3758，根據(jù)制造商的介紹說明進行制備。然后，在無菌條件下，收獲等份的菌絲體生長物，接種到100mls如下制備的甘油肉湯中甘油 2ml酵母提取物 1gMgSO4·7H2O 0.05gNaNO30.6gKCl0.05gKH2PO40.15g加H2O 到100ml充分混合，在15磅/平方英寸高壓滅菌15分鐘。
然后，在25℃，在定軌搖床上溫育培養(yǎng)物7天。然后通過在Richardson瓶子中離心收集由此得到的菌絲體生長物，在-80℃作為冷凍沉淀貯藏以備分析。然后，用Qiagen DNeasy植物小量制備試劑盒，除了最初的提取步驟外，基本上根據(jù)制造商的方案在兩個單獨等份的200mg菌絲體上進行基因組DNA的制備。
在第一菌絲體樣品的情況下，該提取物是通過在Qiagen試劑盒的400μl緩沖液AP1和4μl Rnase及BIO 101 FastDNATM試劑盒的“裂解基質(zhì)聯(lián)合3”″(1/4″sphere+garnet基質(zhì))中浸解菌絲體來進行。在FP120 FastPREPTM儀器中(Anachem Ltd.，Anachem House，CharlesStreet，Luton，Bedfordshire LU20EB，UK)以設定速度5進行該提取本身4×40秒(總共160秒)。然后，在13,000rpm離心提取管5分鐘以沉淀殘渣。然后轉(zhuǎn)移上清液到1.5ml微量離心管，通過依照Qiagen DNeasy植物小量制備試劑盒程序的步驟3-13完成DNA的制備，用2×100μl緩沖液AE進行最終基因組DNA洗脫。
通過向2ml微量離心管中的菌絲體沉淀添加400μl緩沖液AP1和4μl Rnase及無菌鋼珠進行第二個樣品的提取。然后在SpexCertiPrep 8000 Mixer Mill(Glen Creston Ltd)中攪拌該管10分鐘。如前述，然后轉(zhuǎn)移上清液到1.5ml微量離心管，通過依照QiagenDNeasy植物小量制備試劑盒程序的步驟3-13完成DNA的制備，同時用2×100μl緩沖液AE進行最終基因組DNA洗脫。
然后，為了細胞色素b基因的PCR擴增，用無菌蒸餾H2O(純的，1∶10和1∶100)進行每個基因組DNA制備物的10倍系列稀釋。然后用每個稀釋度的10μl作為PCRs模板，其中在每種情況下，一式兩份地用引物17F和15R進行所述PCRs，引物17F和15R跨越真菌細胞色素b基因氨基酸73到283的編碼區(qū)(根據(jù)釀酒酵母(S.cerevisiae)的編號系統(tǒng))。
17F 5’AAATAACGGTTGGTTAATTCG 3’15R 5’TCTTAAAATTGCATAAAAAGG 3’)PCR循環(huán)條件包括起始在94℃溫育3分鐘，隨后94℃45秒、42℃45秒和72℃1分鐘30秒進行30輪循環(huán)。為了結束PCR，也包括最終延伸步驟在72℃進行10分鐘。在根據(jù)制造商(Invitrogen)的程序，克隆反應產(chǎn)物到pCR2.1-TOPO中前，通過凝膠電泳分析反應產(chǎn)物。然后，挑選來源于每個克隆事件的10個轉(zhuǎn)化體用于Wizard Plus質(zhì)粒DNA制備(Promega)。為了證實PCR產(chǎn)物存在，用限制酶EcoRI消化質(zhì)粒DNAs，通過凝膠電泳分析。然后，用M13正向和反向引物測序來源于每個起始K3758樣品的5個單獨質(zhì)粒中正確大小的插入片段(ABi377XL自動測序儀)。用適合的分析程序(Seqman，Editseq和Macaw)分析序列數(shù)據(jù)。
然后，對齊兩個分離物K3758樣品推導的細胞色素b基因序列和先前測定的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)WT(野生型)序列。在圖4和圖5中顯示了核苷酸和氨基酸對齊，其中用如在遺傳密碼(GeneticCodes)(NCBI分類學)Http//www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wprintgc？mode＝t中所述的“Mold，Protozoan and CoelenterateMitochondrial Code-Number 4”預測了氨基酸序列。該分析的顯著特征是●野生型和K3758細胞色素b序列的高水平同一性，具有僅僅單核苷酸和由此產(chǎn)生的氨基酸的置換。
●發(fā)現(xiàn)了野生型和K3758在對應于殘基143的區(qū)域有相同序列，在上述區(qū)域，我們自己和其它人發(fā)現(xiàn)了在植物病原性真菌中所有以前Qo靶位點抗藥性突變體存在突變(Windass等，WO 00/66773；Sierotzki等，Pest Manag.Sci.56(2000)833-841；Sierotzki等，Pest Biochem.Physiol.68(2000)107-1120).
●在對應于酵母細胞色素b殘基129的位置單苯丙氨酸到亮氨酸置換的存在(F129L)。
更詳細地考慮該結果所有10個測序的K3758插入片段都有作為密碼子氨基酸129第三堿基的A。分析樣品1的5個插入片段，2個含有懷疑是PCR錯誤的其它序列差異(小量制備2含有3個差異，小量制備3含有2個差異)，而且共有序列2的5個插入片段中，3個含有序列差異(小量制備1含有2個差異，小量制備4含有2個差異，小量制備5含有3個差異)，再一次懷疑該序列差異是通常的PCR錯誤。因此，只有在對應于密碼子129第三堿基位置的A殘基的存在是K3758和野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)細胞色素b序列間的一致差異。
有趣地，已經(jīng)報道了在釀酒酵母(S.cerevisiae)，莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus)和Chlamydomonas reinhardtii中F129L置換賦予了對myxothiazol(另一個Qo抑制劑)的抗藥性(Esposti等，Biochimica et Biophysica Acta，1143(1993)243-271)。然而，在植物病原真菌中先前沒有這種置換的報道。
實施例3具有區(qū)別野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和株系K3758中發(fā)現(xiàn)的F129和L129等位基因的能力的ARMS引物的設計利用根據(jù)實施例2獲得的野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和分離株K3758的細胞色素b基因的序列，設計各種特異性ARMS引物以檢測該F129L點突變的存在或缺乏基于野生型序列的三個正向ARMS引物Pt129-1TTTATTTTAATGATGGCAACAGCTT Cpt129-2TTTATTTTAATGATGGCAACAGCTT Cpt129-3TTTATTTTAATGATGGCAACAGCTT C基于F129L突變的三個正向ARMS引物Pt129-4TTTATTTTAATGATGGCAACAGCTT APt129-5TTTATTTTAATGATGGCAACAGCTT APt129-6TTTATTTTAATGATGGCAACAGCTT A及設計的點突變上游的對照引物Pt129-STATTTTTATTTTAATGATGGCAACA C在每個上述ARMS引物中，-1堿基(引物序列的3’末端堿基)對應于靶點突變位點。以粗體顯示的堿基不同于野生型瓜果腐霉(P,aphanidermatum)細胞色素b序列。在Pt129-1和Pt129-4引物中，-2位置從T變?yōu)锳堿基。在Pt129-2和Pt129-5引物中，-2位置從T變?yōu)镃堿基。在Pt129-3和Pt129-6引物中，-2位置從T變?yōu)镚堿基。對序列進行這些替代將使模板/引物雜合體去穩(wěn)定，使得任何引物更特異地針對相應的模板延伸。文獻中的例子已經(jīng)表明去穩(wěn)定ARMS引物降低了引物對錯誤模板上錯誤引發(fā)的風險(Newton等，Nucleic AcidResearch 17(7)2503-2516 1989)。
通過Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成所有引物。在使用前，在每500μl總體積重蒸餾無核酸酶的H2O中，稀釋引物到5μM。然后，在PCR中，進一步稀釋引物到500nM的終濃度。
實施例4
用在監(jiān)測瓜果腐霉(P.aphanidermatum)F129和L129等位基因狀態(tài)中的Scorpion引物的設計再一次利用根據(jù)實施例2獲得的野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和分離株K3758的細胞色素b基因的序列，通過向反向PCR引物中摻入檢測系統(tǒng)，設計ScorpionTM寡核苷酸以檢測野生型和L129等位基因的選擇性擴增，所述反向PCR引物被設計與實施例3描述的ARMS SNP檢測和標準引物一起使用。用ARMS引物得到的擴增子是172bp長，用對照引物得到的擴增子是176bp長。
更具體地，用Oligo 5和MFold程序(MFold應用Zucker的能量最小化方法預測RNA或DNA分子的最佳和次佳二級結構(Zucker，M.(1989)Science 244，48-52；SantaLucia，J.Jr.(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，1460-1465)設計Scorpion引物。
由此得到的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)Scorpion引物序列是 其中下劃線區(qū)是發(fā)夾形成部分(當Scorpion引物未反應時)；FAM是熒光素染料；MR(甲基紅)是與尿嘧啶殘基附著的非熒光猝滅劑，HEG是復制阻斷六乙二醇單體。斜體序列是反向引物序列，粗體序列是結合反向引物真正的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)細胞色素b延伸產(chǎn)物的Scorpion引物。
用Mfold程序可以觀察該Scorpion引物的莖-環(huán)二級結構(參見圖6)，并且預測當其不與靶細胞色素b基因雜交時，其有-1.9kcal/mol的能量。然而，在延伸產(chǎn)物存在的情況下，因為Scorpion引物的探針序列以預測的-4.9kcal/mol能量結合延伸產(chǎn)物，所以發(fā)夾結構分離。這使猝滅劑與FAM染料分離，引起了例如通過ABI Prism 7700儀器可檢測的熒光發(fā)射。因此，與Scorpion莖-環(huán)比較，新合成鏈與Scorpion成分的退火是能量上有利的。
通過Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成Scorpion引物。在使用前，在500μl總體積重蒸餾無核酸酶的H2O中，稀釋引物到5μM。然后，在PCR中，進一步稀釋引物到500nM的終濃度。
實施例5對用于檢測和定量株系K3758中發(fā)現(xiàn)的F129L SNP的ARMS和Scorpion引物的用途的驗證在所有ARMS/ScorpionTMF129L SNP檢測測定法中，AmpliTaq Gold酶(Applied Biosystems)以1單位/25μl反應包含在反應混合物中。反應混合物還含有1x緩沖液(10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，3.5mM MgCl2，0.01％明膠)和100μM dNTPs(Amersham PharmaciaBiotech)。在ABI Prism 7700儀器中進行擴增用于連續(xù)熒光監(jiān)測。95℃，10分鐘進行最初循環(huán)，隨后通過95℃，15秒和60℃，45秒進行50輪循環(huán)。在所有循環(huán)的退火/延伸步驟期間檢測熒光。
通過利用各種濃度的質(zhì)粒DNA作為模板，首先驗證引物在這種分析中的用途。進行這個以檢查引物設計的特異性和靈敏性。如先前實施例2所述，將從兩個瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分離物擴增的部分野生型細胞色素b基因序列和含有F129L突變的相應序列段克隆到TA pCR2.1載體(Invitrogen)中。保存挑選用于Wizard Plus質(zhì)粒DNA制備(Promega)(見實施例2)的來源于每個克隆事件的10個轉(zhuǎn)化體的150μl細菌培養(yǎng)物，在進行這些制備前，4℃貯藏。序列分析后，注意到不含有與共有序列的序列差異的野生型和突變型質(zhì)粒DNA樣品。按照制造商的程序，挑選這些野生型和突變型質(zhì)粒DNA序列所來源的細菌培養(yǎng)物用于質(zhì)粒DNA大量制備(Qiagen)。定量由此得到的質(zhì)粒DNA，并且用無菌重蒸餾H2O稀釋到1μg/μl(2×1011分子/μl)的濃度。
在重蒸餾H2O中，進一步稀釋野生型和突變型質(zhì)粒DNA盒子到10pg/μl(或2×106分子/μl)的濃度，并且用其作為模板以驗證ARMS引物的特異性。在上述PCR條件下，對野生型和突變模板及沒有模板(只有水)的對照試驗每種ARMS引物。Pt129-1和Pt129-4引物優(yōu)選于Pt129-2和Pt129-3及Pt129-5和Pt129-6引物，因為重復兩次PCR產(chǎn)生了更一致的結果且更特異。在不適當(突變)模板上出現(xiàn)擴增前，野生型ARMS引物Pt129-1給出15.27循環(huán)的窗(window)(圖7)。在不適當(野生型)模板上出現(xiàn)擴增前，突變ARMS引物Pt129-4給出16.96循環(huán)的窗。
在選擇了用于點突變檢測的適合ARMS引物后，進一步驗證此測定法，這樣在用它測試生物樣品的L129突變存在前，充分理解了它的檢測靈敏性。第一驗證步驟在于確立對于選定的ARMS引物，是否特異性窗在野生型和突變型模板DNA濃度的6個數(shù)量級范圍內(nèi)變化。在1mg/ml濃度的牛血清白蛋白(BSA)(最少96％V級份粉末，Sigma A9647)中通過10倍稀釋度系列稀釋前述野生型和突變型質(zhì)粒DNA盒子。模板濃度覆蓋2×108分子/μl到2×102分子/μl的范圍。如上所述，用引物Pt129-1，Pt129-4和Pt129-S，在ARMS/Scorpion測定法中試驗兩個質(zhì)粒DNA盒子和沒有模板(只有水)的對照。
表18利用ARMS引物129-4(L129等位基因選擇性)來自于特異性窗試驗的結果

表19利用ARMS引物129-1(F129等位基因選擇性)來自于特異性窗試驗的結果

這些結果表明ARMS引物Pt129-1和Pt129-4不以相同Ct(循環(huán)閾值，熒光的改變增加超過上述背景水平時的PCR循環(huán)數(shù))值從它們各自正確的模板擴增，并且看起來該差異取決于質(zhì)粒DNA的濃度。還有對于引物Pt129-1，在測定法中試驗的模板DNA濃度范圍內(nèi)，正確和錯誤模板擴增之間的Ct不保持恒定。雖然這些起始ARMS引物確實顯示了一些必要特征，但是它們沒有提供理想測定法的基礎，因此決定用點突變上游的正向Scorpion引物聯(lián)合反向ARMS引物對重新設計測定法。
實施例6具有區(qū)別野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和株系K3758中發(fā)現(xiàn)的F129和L129等位基因能力的其它ARMS引物的設計利用根據(jù)實施例2獲得的野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和分離物K3758細胞色素b基因的序列，設計第二套特異性ARMS引物以檢測該F129L點突變的存在或缺乏基于野生型序列的六個反向ARMS引物
Pt129-C1 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC CA G 3’Pt129-C2 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC CA G 3’Pt129-C3 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC CA G 3’Pt129-C4 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC C T G 3’Pt129-C5 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC C T G 3’Pt129-C6 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC C T G 3’基于F129L突變的的十五個反向ARMS引物Pt129-A1 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC CA T 3’Pt129-A2 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC CA T 3’Pt129-A3 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC CA T 3’Pt129-A4 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC C T T 3’Pt129-A5 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC C T T 3’Pt129-A6 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA ACC C T T 3’Pt129-A7 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC CAC T 3’Pt129-A8 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC CAC T 3’Pt129-A9 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC CAC T 3’Pt129-A10 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC CCT T 3’Pt129-A11 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC CCT T 3’Pt129-A12 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC CCT T 3’Pt129-A13 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC CGT T 3’Pt129-A14 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC CGT T 3’Pt129-A15 5’ACC CCA AGG TAA TAC ATA AC CGT T 3’并設計點突變下游的兩個反向?qū)φ找颬i129-S4 5’TTG ACCCCA AGGTAATAC ATA ACCC 3’Pt129-S6 5’TTG ACCCCA AGGTAATAC ATA ACTC 3’在每個上述ARMS引物中，-1堿基(引物序列3’末端的堿基)對應于靶點突變位點。粗體顯示的堿基不同于野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)細胞色素b序列。在Pt129-C1和Pt129-A1引物中，-2位置從T變?yōu)锳堿基(在反向互補中)。在Pt129-C2和Pt129-A2引物中，-2位置從T變?yōu)镃堿基(在反向互補中)。在Pt129-C3和Pt129-A3引物中，-2位置從T變?yōu)镚堿基(在反向互補中)。在Pt129-C4和Pt129-A4引物中，-3位置從A變?yōu)門堿基(在反向互補中)。在Pt129-C5和Pt129-A5引物中，-3位置從A變?yōu)镃堿基(在反向互補中)。在Pt129-C6和Pt129-A6引物中，-3位置從A變?yōu)镚堿基(在反向互補中)。在Pt129-A7引物中，-5位置從C變?yōu)門堿基，-2位置從T變?yōu)镃堿基(在反向互補中)。在Pt129-A8引物中，-5位置從C變?yōu)锳堿基，-2位置從T變?yōu)镃堿基(在反向互補中)。在Pt129-A9引物中，-5位置從C變?yōu)镚堿基，-2位置從T變?yōu)镃堿基(在反向互補中)。在Pt129-A10引物中，-5位置從C變?yōu)門堿基，-3位置從A變?yōu)镃堿基(在反向互補中)。在Pt129-A11引物中，-5位置從C變?yōu)锳堿基，-3位置從A變?yōu)镃堿基(在反向互補中)。在Pt129-A12引物中，-5位置從C變?yōu)镚堿基，-3位置從A變?yōu)镃堿基(在反向互補中)。在Pt129-A13引物中，-5位置從C變?yōu)門堿基，-3位置從A變?yōu)镚堿基(在反向互補中)。在Pt129-A14引物中，-5位置從C變?yōu)锳堿基，-3位置從A變?yōu)镚堿基(在反向互補中)。在Pt129-A15引物中，-5位置從C變?yōu)镚堿基，-3位置從A變?yōu)镚堿基(在反向互補中)。對序列進行這些替代改變可使模板/引物雜合體去穩(wěn)定，使得任何引物更特異地針對相應的模板延伸。文獻中的例子已經(jīng)表明去穩(wěn)定ARMS引物降低了引物在錯誤模板上錯誤引發(fā)的風險(Newton等，Nucleic Acid Research 17(7)2503-2516 1989)。
通過Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成所有引物。在使用前，在每500μl總體積重蒸餾無核酸酶的H2O中，稀釋引物到5μM。然后，在PCR中，進一步稀釋引物到500nM的終濃度。
實施例7用在監(jiān)測瓜果腐霉(P.aphanidermatum)F129和L129等位基因狀態(tài)中的其它Scorpion引物的設計再一次利用根據(jù)實施例2獲得的野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和分離物K3758的細胞色素b基因的序列，通過向正向PCR引物中摻入檢測系統(tǒng)，設計ScorpionTM寡核苷酸以檢測野生型和L129等位基因的選擇性擴增，所述正向PCR引物經(jīng)設計可以與實施例3描述的ARMS SNP檢測和標準引物一起使用。用ARMS引物得到的擴增子是126bp長，用對照引物得到的擴增子是129bp長。
更具體地，用Oligo 5和MFold程序(Mfold使用Zucker的能量減小化方法預測RNA或DNA的最佳和次佳二級結構(Zucker，M.(1989)Science 244，48-52；SantaLucia，J.Jr.(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，1460-1465)設計Scorpion引物。
由此得到的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)Scorpion引物序列是 其中下劃線區(qū)是發(fā)夾形成部分(當Scorpion引物未反應時)；FAM是熒光素染料；MR(甲基紅)是與尿嘧啶殘基附著的非熒光猝滅劑，HEG是復制阻斷六乙二醇單體。斜體序列是正向引物序列，粗體序列是結合正向引物的真正瓜果腐霉(P.aphanidermatum)細胞色素b延伸產(chǎn)物的Scorpion序列。
用Mfold程序可以觀察該Scorpion引物的莖-環(huán)二級結構(參見圖9)，并且預測當其不與靶細胞色素b基因雜交時，其有-1.9kcal/mol的能量。然而，在延伸產(chǎn)物存在的情況下，因為Scorpion引物的探針序列以預測的-5.6kcal/mol能量雜交延伸產(chǎn)物，所以發(fā)夾結構分離。這使猝滅劑與FAM染料分離，引起了例如通過ABI Prism 7700儀器可檢測的熒光發(fā)射。因此，與Scorpion莖-環(huán)比較，新合成鏈與Scorpion成分的退火是能量上有利的。
通過Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成Scorpion引物。在使用前，在500μl總體積重蒸餾無核酸酶的H2O中，稀釋引物到5μM。然后，在PCR中，進一步稀釋引物到500nM的終濃度。
實施例8對用于檢測和定量株系K3758中發(fā)現(xiàn)的F129L SNP的ARMS和Scorpion引物的用途驗證在所有ARMS/ScorpionTMF129L SNP檢測測定法中，AmpliTaq Gold酶(Perkin-Elmer/ABI)以1單位/25μl反應包含在反應混合物中。反應混合物還含有1x緩沖液(10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，3.5mM MgCl2，0.01％明膠)和100μM dNTPs(Amersham PharmaciaBiotech)。在ABI Prism 7700儀器中進行擴增用于連續(xù)熒光監(jiān)測。95℃，10分鐘進行最初循環(huán)，隨后通過95℃，15秒和60℃，45秒進行50輪循環(huán)。在所有循環(huán)的退火/延伸步驟期間檢測熒光。
涉及驗證此測定法的第一步是測試ARMS引物在擴增期間區(qū)分F129(野生型)和L129(突變型)等位基因的潛能，在重蒸餾H2O中，將如實施例5所述的野生型和突變型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)細胞色素b質(zhì)粒DNA構建體稀釋到10pg/μl(或2×106分子/μl)的濃度，然后用其作為模板以驗證ARMS引物的選擇性。在上述PCR條件下，對野生型和突變型模板及在沒有模板(只有水)的對照中試驗每種ARMS引物。在下表20中概述了該結果。
表20對設計的ARMS引物的選擇性的驗證

這些結果表明L129等位基因選擇性(突變)引物Pt129-A14和引物Pt129-A15在對適當模板和不適當模板擴增之間給出了最大特異性窗(20.4循環(huán)，并且各自沒有不適當模板的擴增)。引物Pt129-A15不結合不適當模板，然而對正確模板的擴增非常晚，30個循環(huán)。因此引物Pt129-A14是優(yōu)選的L129等位基因選擇性(突變)ARMS引物，因為其在正確模板上有較早的Ct值。引物Pt129-C4是優(yōu)選的F129等位基因選擇性(野生型)ARMS引物，因為其不結合不適當模板。引物Pt129-S4是優(yōu)選的標準引物。因此，利用這些引物完成對測定法的驗證。
然而，即使模板在相同濃度，L129等位基因特異性(突變)引物Pt129-A14看來也比F129等位基因選擇性(野生型)引物Pt129-C4給出晚約5輪循環(huán)的Ct值。通過在一系列模板濃度下檢查引物間Ct值差異是否保持恒定進一步評估這個問題。
在選擇了用于點突變檢測的適合ARMS引物對后，在用測定法測試生物樣品的L129突變存在前，進一步驗證測定法以充分理解檢測的靈敏性。因此，進行的下一步研究是確定在模板DNA濃度的6個數(shù)量級范圍內(nèi)，對于選定的ARMS引物，Pt129-C4和Pt129-A14，特異性窗是否變化，及當兩個引物均擴增它們各自正確的模板時，在該模板DNA濃度范圍內(nèi)，是否F129和L129等位基因選擇性ARMS引物之間的Ct值差異保持恒定。在1mg/ml濃度牛血清白蛋白(BSA)(最少96％V級份粉末，Sigma A9647)中10倍稀釋度系列稀釋前述野生型和突變Cytb質(zhì)粒DNA構建體。模板濃度覆蓋2×108分子/μl到2×102分子/μ1的范圍。如上所述，利用每個濃度的兩個質(zhì)粒DNA盒子作為模板，及在沒有模板(只有水)的對照中，在測定法中測試ARMS引物Pt129-C4和Pt129-A14和標準引物Pt129-S4。
表21在質(zhì)粒DNA模板稀釋范圍中引物Pt129-A14的結果

表22在質(zhì)粒DNA模板稀釋范圍中引物Pt129-C4的結果

表23在質(zhì)粒DNA模板稀釋范圍中引物Pt129-S4的結果

這些結果表明對于大多數(shù)濃度的質(zhì)粒DNA模板，用L129等位基因選擇性(突變)引物，Pt129-A14對適當和不適當模板擴增之間的ΔCt約是18-20輪循環(huán)，但是當質(zhì)粒DNA模板濃度進-步減少時，觀察到對不適當模板的擴增中止。在整個模板濃度范圍中，F(xiàn)129等位基因選擇性(野生型)引物，Pt129-C4僅結合適當模板。因此，對于L129和F129等位基因選擇性引物Pt129-A14和Pt129-C4，在整個模板濃度范圍中，特異性窗是恒定的。
表24對于L129和F129等位基因選擇性引物，適當模板上的Ct值比較

相對于質(zhì)粒DNA模板濃度繪制每個等位基因選擇性引物的Ct(循環(huán)閾值)(圖10)。對于此兩個引物，標繪圖的斜率實際上是相同的，且R2(相關系數(shù))值也大約相同。在整個模板濃度范圍中，標繪圖也是平行的，表明不管模板DNA的濃度為何，引物間Ct值差異保持恒定。
相對于質(zhì)粒DNA模板濃度也繪制了在適當模板上L129和F129等位基因選擇性引物間的ΔCt(兩個Ct值間的差異)(圖11)。線的斜率少于0.1，表明在適當模板上，L129和F129等位基因選擇性引物之間的ΔCt不隨著模板DNA濃度變化。
結合它們的適合模板的兩個引物間的平均ΔCt是4.67。因此需要從L129等位基因選擇性引物和F129等位基因選擇性引物間計算的ΔCt中減去該值，以真實表示樣品中兩個等位基因的比例。
因此，L129等位基因選擇性引物，Pt129-A14和F129等位基因選擇性引物，Pt129-C4可以用在該測定法中以直接比較樣品中L129和F129等位基因的水平。
第二步驗證研究涉及測試選定的ARMS引物Pt129-C4和Pt129-A14的檢測靈敏性。將濃度2×107分子/μl的帶有L129等位基因的質(zhì)粒DNA稀釋到背景質(zhì)粒DNA中，所述背景質(zhì)粒DNA帶有F129等位基因，濃度是2×107分子/μl，以產(chǎn)生下列L129比F129的比率1∶1，1∶10，1∶100，1∶1,000，1∶10,000和1∶100,000。PCR中最終質(zhì)粒濃度是1×108分子/μl。如上所述，在測定法中，用引物Pt129-A14，Pt129-C4和Pt129-S4測試這些質(zhì)粒及野生型質(zhì)粒，突變質(zhì)粒和僅有水的對照。
表25來自于野生型和突變質(zhì)粒DNA對照模板的結果

如上所注意到的，引物Pt129-A14和Pt129-C4在它們正確的模板上沒有產(chǎn)生相同的Ct值，Ct值的該差值是27.33-23.03＝4.3。需要從峰實驗(spiking experiment)中計算的每個ΔCt中減去該值以得出樣品中每個等位基因比例的真實表示值。
表26顯示ARMS引物Pt129-A14和Pt129-C4的檢測靈敏性的結果

因此，該結果表明，在A ARMS引物(L129等位基因選擇性引物)結合不適當模板前，該測定法可以檢測以少于1∶100000的比率位于F129等位基因(C模板)背景中的L129等位基因(A模板)的水平(圖12)。
設計進行的第三步驗證研究在于測試是否ARMS引物Pt129-C4和Pt129-A14以相同的效率擴增。為了使ARMS/Scorpion測定法可靠，重要的是在模板DNA濃度范圍中選定的等位基因選擇性ARMS引物以近似相同效率擴增，所述模板DNA濃度范圍為此測定法中可能檢測到的濃度。這是因為兩個引物間的Ct差值直接對應于樣品中抗性等位基因的頻率。對此進行測試的一個方法是比較ΔCt如何隨著模板濃度變化。相對于ΔCt繪制l0g DNA輸入量，由此得到的斜率應該小于0.1。
為了檢查引物Pt129-A14和Pt129-C4的擴增效率，在約100倍的范圍中，通過2倍稀釋度系列稀釋突變野生型質(zhì)粒DNA的1∶10混合物(前述)。在濃度為1mg/ml的BSA中進行所有這些稀釋。如上所述，在ARMS/Scorpion測定法中，用引物Pt129-C4，Pt129-A14和Pt129-S4引物測試下列模板稀釋物(純的，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128)，僅有野生型和僅有突變型的質(zhì)粒DNA對照，和僅有水的對照。
表27來自于野生型和突變質(zhì)粒DNA對照模板的結果

引物Pt129-A14和Pt129-C4在適合模板上的Ct值的差值是22.6-19.07＝3.53。需要從相對效率試驗中計算的每個ΔCt中減去該差值以真實表示樣品中每個等位基因的比例。
表28相對效率試驗的結果，顯示對于每個模板濃度的ΔCt

相對于logDNA濃度繪制ΔCt，用Microsoft Excel計算趨勢線(圖13)。這顯示線的斜率是0.05，小于0.1，因此引物Pt129-A14和Pt129-C4以基本上相同的相對效率擴增。
驗證此測定法的第四步驟是研究是否宿主植物DNA(在本例中，多年生黑麥草(Lolium perenne)可以，例如由于含有可以偶然地作為PCR模板的序列而影響測定法。在收集和直接試驗的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)感染的葉片材料樣品中將存在多年生黑麥草(Loliumperenne)DNA。
為了該研究，用Qiagen Dneasy植物小量制備試劑盒，從多年生黑麥草(L.perenne)樣品(100mg)提取基因組DNA(首先，通過在Centriprep攪拌研磨機(mixer mill)中攪拌10分鐘，在含有鋼珠的1.5ml微量離心管中研磨該樣品)，在重蒸餾H2O中，進行5倍系列稀釋，以產(chǎn)生下列濃度“純的”(直接從小量制備試劑盒制備中獲得)，1∶5，1∶25和1∶125(植物DNA母液稀釋至H2O中)。也制備了1∶100和1∶10,000的L129等位基因∶F129等位基因質(zhì)粒DNA的兩種混合物(見上文)。這些母液與逐漸降低的植物材料背景混合產(chǎn)生下列PCR輸入物1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+純植物DNA，1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+1∶5植物DNA，1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+1∶25植物DNA，1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+1∶125植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+純植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+1∶5植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+1∶25植物DNA，1∶10,000L129等位基因∶F129等位基因+1∶125植物DNA。如上所述，在測定法中，用引物Pt129-C4，Pt129-A14和Pt129-S4測試所有這些輸入物及多年生黑麥草(L.perenne)DNA稀釋液，單獨的各種比率的L129等位基因∶F129等位基因質(zhì)粒DNA，2×107分子/μl濃度的野生型和突變型質(zhì)粒DNA和僅有水的對照。
表29野生型和突變型質(zhì)粒DNA對照

引物Pt129-A14和Pt129-C4在適當模板上的Ct值的差值是22.49-19.95＝2.54。需要從計算的每個ΔCt中減去該差值以得到樣品中每個等位基因比例的真實表示值。
表30評估宿主植物DNA(多年生黑麥草(L.perenne))對測定法性能影響的驗證試驗的結果

當在此測定法中試驗真菌質(zhì)粒DNA和多年生黑麥草(L.perenne)DNA的混合物時，與單獨試驗真菌質(zhì)粒DNA時比較，Ct值及因此觀察到的C％沒有一致的變化。因此，多年生黑麥草(L.perenne)DNA對測定法中抗藥性等位基因檢測的靈敏性沒有顯著的影響。
標準引物Pt129-S4和Scorpion引物能與多年生黑麥草(L.perenne)DNA相互作用以產(chǎn)生可檢測的PCR產(chǎn)物。然而，聯(lián)合Scorpion引物的L129或F129等位基因特異性引物都不能與多年生黑麥草(L.perenne)DNA相互作用。
在瓜果腐霉(P.aphanidermatum)樣品中多年生黑麥草(L.perenne)DNA的存在對L129或F129等位基因的擴增及由此估計的L129等位基因水平將不會有任何影響。
驗證的最后步驟是在生物樣品上試驗引物Pt129-C4、Pt129-A14和Pt129-S4?？梢杂米骺顾幮员O(jiān)測試驗的起始材料的生物樣品有多種不同的可能形式。這些生物樣品包括瓊脂平板上生長的菌絲體和瓜果腐霉(P.aphanidermatum)感染的草皮(多年生黑麥草(L.perenne)。為了試驗來自于瓊脂平板的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)樣品，向平板中加少量無菌重蒸餾H2O(約1-2ml)，用無菌一次性刮棒從瓊脂上刮下菌絲體。在1.5或2ml無菌微量離心管中收集菌絲體溶液，離心。如實施例2所述，棄去上清液，用FP120 FastprepTM儀器(AnachemLtd.，Anachem House，Charles Street，Luton，BedfordshireLU20EB，UK)或Spex CertiPrep 8000攪拌研磨機(Mixer Mill)(GlenCreston Ltd)研磨由此得到的菌絲體樣品，然后，用Qiagen DNeasy植物小量制備試劑盒進行基因組DNA制備，在實施例2中也描述了該制備?？商娲?，可以在1.5或2ml無菌微量離心管中收集100mg瓜果腐霉(P.aphanidermatum)感染的多年生黑麥草(L.perenne)草皮，以和上述菌絲體材料相似的方法研磨。然后，用Qiagen DNeasy植物小量制備試劑盒按照制造商的程序提取感染植物的總DNA。
在無菌重蒸餾H2O中，以1∶10和1∶100稀釋由此得到的瓜果腐霉(P.aphanidermatum)和/或瓜果腐霉(P.aphanidermatum)/多年生黑麥草(L.perenne)DNA制備物，如上所述，在ARMS/Scorpion測定法中測試這些模板稀釋液。用引物Pt129-A14，Pt129-C4和Pt129-S4測試每個模板稀釋液；也包含分別作為陽性和陰性對照的野生型和突變型質(zhì)粒DNA及僅有水的對照。
實施例9能在任何瓜果腐霉(P.aphanidermatum)分離物中檢測F129和L129等位基因的ARMS/Scorpions測定法的設計。
為了檢測能夠轉(zhuǎn)換F129為L129的其它單核苷酸多態(tài)性，可以利用能夠僅區(qū)別129密碼子第1位(即，在位置1是存在胸腺嘧啶還是胞嘧啶殘基)的有義ARMS寡對/反義Scorpion聯(lián)合。同樣地，能夠區(qū)別129密碼子的第3位的所有可能殘基，即胸腺嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤和鳥嘌呤殘基的反義ARMS寡對/有義Scorpion聯(lián)合可以檢測能引起L129介導的抗藥性的可替代的位置3置換。在聯(lián)合中，這些位置1和3的測定法也提供了評估雙突變水平的方法，所述雙突變可能引起F129到L129的轉(zhuǎn)換(密碼子CTA和CTG)。
有義ARMS寡對/反義Scorpion聯(lián)合可以利用前面及如實施例4中所述的Scorpion引物設計，其中在反向PCR引物上摻入檢測系統(tǒng)，此Scorpion引物與下面SNP檢測ARMS引物和對照引物聯(lián)合使用。
基于129密碼子第1位的胸腺嘧啶殘基的三個正向ARMS引物Pt129-7TTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC TPt129-8TTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC TPt129-9TTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC T基于129密碼子第1位的胞嘧啶殘基的三個正向ARMS引物Pt129-10 TTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC CPt129-11 TTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC CPt129-12 TTTTTATTTTAATGATGGCAACAGC C及設計的點突變上游的對照引物Pt129-S2 TATTTTTATTTTAATGATGCCAACAGC在每個上述ARMS引物中，-1堿基(引物序列3’末端堿基)對應于靶點突變位點。粗體顯示的堿基不同于野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)細胞色素b序列。在Pt129-7和Pt129-10引物中，-2位置從T變?yōu)锳。在Pt129-8和Pt129-11引物中，-2位置從T變?yōu)镚。在Pt129-9和Pt129-12引物中，-2位置從T變?yōu)镃。再有對序列進行這些改變可使模板/引物雜合體去穩(wěn)定，使得任何引物可以更特異地針對相應的模板延伸。當與實施例4中描述的反義Scorpion-起使用時，用ARMS引物得到的擴增子將是174bp長，用對照引物得到的擴增子將是176bp長。
為了利用反義ARMS寡對/有義Scorpion聯(lián)合檢測129密碼子位置3處的腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和鳥嘌呤殘基，前面實施例6中描述的有義Scorpion引物可以與下面的SNP檢測反義(反向)ARMS引物和對照引物聯(lián)合使用，其中在有義Scorpion引物中在有義(正向)PCR引物上摻入了檢測系統(tǒng)。
基于129密碼子位置3處胸腺嘧啶殘基的三個反向ARMS引物Pt129-13ACCCCAAGGTAATACATAACCCA APt129-14ACCCCAAGGTAATACATAACCCA APt129-15ACCCCAAGGTAATACATAACCCA A下面為基于129密碼子位置3處腺嘌呤殘基的反向ARMS引物Pt129-A14 ACCCCAAGGTAATACATAACAC TT下面為基于129密碼子位置3處胞嘧啶殘基的反向ARMS引物pt129-C4ACCCCAAGGTAATACATAACCC TG基于129密碼子位置3處鳥嘌呤殘基的三個反向ARMS引物Pt129-16ACCCCAAGGTAATACATAACCCA CPt129-17ACCCCAAGGTAATACATAACCCA CPt129-18ACCCCAAGGTAATACATAACCCA C
及設計的點突變下游的對照引物Pt129-S4TTGACCCCAAGGTAATACATAACCC在每個上述ARMS引物中，-1堿基(引物序列3’末端堿基)對應于靶點突變位點。粗體顯示的堿基不同于野生型瓜果腐霉(P.aphanidermatum)細胞色素b序列。在Pt129-13和Pt129-16引物中，-2位置從A變?yōu)門。在Pt129-14和Pt129-17引物中，-2位置從A變?yōu)镚。在Pt129-15和Pt129-18引物中，-2位置從A變?yōu)镃。在Pt129-C4引物中，-3位置從T變?yōu)锳。在Pt129-A14引物中，-3位置從T變?yōu)镃，-5位置從G變?yōu)門。對序列進行這些改變以使模板/引物雜合體去穩(wěn)定，使得任何引物更特異地針對相應的模板進行延伸。用上述有義Scorpion引物時，用ARMS引物得到的擴增子將是110bp長，用對照引物得到的擴增子將是113bp長。
通過Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成所有引物。在使用前，在每500μl總體積重蒸餾無核酸酶的H2O中，稀釋引物到5μM。然后，在PCR中，進一步稀釋引物到500nM的終濃度。
實施例10對Qo位點抑制性殺真菌劑顯示出降低敏感性的兩個新的葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)樣品的鑒定在2000年期間，從歐洲的田地收集約300份葡萄生單軸霉(P.viticola)樣品。在植物體內(nèi)(in planta)辯別劑量生物測定法中測試這些樣品以檢測對Qo位點抑制性殺真菌劑降低的敏感性，也在ARMS/Scorpion G143A定量PCR測定法中測試這些樣品(參見，公開的國際專利申請WO 00/66773)。已證實對QoI的抗藥性通常與143位置(根據(jù)釀酒酵母(S.cerevisiae)編號系統(tǒng))丙氨酸的存在有關。在密碼子143第二位置處鳥嘌呤到胞嘧啶的單核苷酸多態(tài)性引起了細胞色素b中143位置的這種甘氨酸到丙氨酸的改變；在此測定法中監(jiān)測SNP的水平。在該監(jiān)測程序期間，在植物辯別劑量生物測定中，發(fā)現(xiàn)了兩個樣品，I112和I116b，它們顯示了對QoI有降低的敏感性，但是在位置143的氨基酸僅僅是野生型的甘氨酸。我們對此作了進一步研究。
為了證實辯別劑量生物測定法中檢測到的對QoI的降低敏感性，對這些樣品進行植物體內(nèi)劑量反應生物測定。對生長在1.5”罐中的10到14日齡葡萄幼苗進行植物體內(nèi)劑量反應生物測定。在劑量反應生物測定中，從預備試驗中選擇6個級別的腈嘧菌酯(azoxystrobin)，它們最適合在劑量反應生物測定中顯示出腈嘧菌酯(azoxystrobin)敏感性的任何偏移(表31)。
表31用在植物體內(nèi)劑量反應生物測定中的腈嘧菌酯(azoxystrobin)級別

用于所有試驗中的腈嘧菌酯(azoxystrobin)制備物是P53，工業(yè)級粉末，具有＞97％腈嘧菌酯(azoxystrobin)的純度。所有試驗中保持其一致以排除化學純度或物理狀態(tài)差異引起的任何變化。每份樣品，每個腈嘧菌酯(azoxystrobin)級別用5株幼苗，對于沒有腈嘧菌酯(azoxystrobin)的對照用10株幼苗(僅用去離子水噴散)。
用Devilbiss噴槍以10psi噴散化學藥品至在每株幼苗第二片真葉(試驗葉片)的近軸表面上獲得最大滯留量，同時注意不斷地漩渦噴槍中的溶液以防止腈嘧菌酯(azoxystrobin)濃度的局部波動。然后，小心放置幼苗在生長室中(白天24℃，60％RH，4-50001ux；夜間17℃，95％RH；日長16小時)24小時。
此后，用樣品I112和I116b接種每片測試葉片。自從兩個樣品移出低溫保藏后，兩個樣品在3″葡萄樹上經(jīng)過了1輪繼代培養(yǎng)(圖14)。
用干燥的血細胞計數(shù)器(改進的Neubayer，深度0.1mm，1/400mm2Hawksley Crystallite，BS 748)將從3”葡萄樹獲得的每個樣品的接種物稀釋為每毫升5,000個孢子囊。
用Devilbiss噴槍以10psi接種樣品，至在每株幼苗試驗葉片的遠軸表面上獲得最大的滯留量，同時頻繁地漩渦噴槍中的懸浮液以避免孢子囊在底部聚集。在周圍環(huán)境室中孵育試驗幼苗24小時。然后，隨機選擇幼苗并放置在生長室中(白天24℃，60％RH，4-5000lux；夜間17℃，95％RH；日長16小時)6天，之后返回到周圍環(huán)境室另外24小時以刺激孢子形成。
幼苗第二次從周圍環(huán)境室移出后，直接對幼苗進行評估。疾病評估是基于孢子形成病斑和褪色所覆蓋的葉片百分面積，以5％的增量來記錄。給予具有單一小病斑的葉片2％的分數(shù)以表示沒有顯示出對病原體的完全控制。然后，用統(tǒng)計學程序AGSTAT分析數(shù)據(jù)。在分析中利用了OLS回歸和反正弦變換(arcsine trans formation)，計算并在下表32中示出了EC50和EC95值及它們各自的95％置信界限。
表32葡萄生單軸霉分離物I112和I1166的EC50和EC95值

兩個樣品I116B和I112都顯示了對腈嘧菌酯(azoxystrobin)有降低的敏感性，與敏感基線分離物比較，具有較高的EC50和EC95值。然后，在分子水平上進一步研究這兩個樣品以調(diào)查對腈嘧菌酯(azoxystrobin)具有降低的敏感性的機理。
實施例11
與野生型和以前證實的抗藥性分離物的細胞色素b基因比較，葡萄生單軸霉(P.viticola)樣品I112和I116b的細胞色素b基因的定向克隆和測序。
用下述方法進行葡萄生單軸霉(P.viticola)樣品I112和I116b細胞色素b基因的表征。
通過下面方法制備用于分析的葡萄生單軸霉(P.viticola)樣品I112和I116b。在玻璃燒杯中放置顯示出孢子形成霜霉病癥狀的葡萄樹葉片。然后向每個樣品加400ml去離子水，渦漩葉片以釋放孢子囊。通過兩層細棉布過濾由此得到的孢子囊懸浮液，然后傾倒入無菌塑料50ml通用試管，在臺式離心機(MSE，Centaur 2)中，以4000rpm離心約2分鐘。2分鐘后，在每個試管底部可觀察到孢子囊沉淀；傾析上清液，重新合并等同的沉淀物，并且在1ml無菌去離子水中重懸浮。然后，轉(zhuǎn)移孢子囊樣品到1.5ml無菌微量離心管中，在13000rpm，離心一分鐘。移出上清液，樣品置于-80℃?zhèn)溆谩?br> 根據(jù)具有下列修改的制造商的程序，用Qiagen DNeasy植物小量制備試劑盒(目錄號69014)從上述樣品分離基因組DNA。向每個樣品加400μl緩沖液AP1和4μl RNaseA溶液，重懸浮沉淀。然后轉(zhuǎn)移孢子囊溶液到無菌2ml微量離心管，加鋼珠，在Spex CertiPrep 8000攪拌研磨機(Mixer Mill)(Glen Creston Ltd)中攪拌該樣品10分鐘以研磨樣品。然后轉(zhuǎn)移上清液到1.5ml微量離心管中，通過QiagenDNeasy植物小量制備試劑盒操作程序的隨后步驟3-13完成DNA的制備，用2×100μl緩沖液AE進行最終基因組DNA洗脫。
為了PCR擴增細胞色素b基因，用無菌重蒸餾H2O對兩個基因組DNA制備物進行10倍系列稀釋，產(chǎn)生下列稀釋度1∶10，1∶100和1∶1000，所有這些都用作PCR的模板。
用引物對17/15，從分離物I112和I116b PCR擴增細胞色素b基因的“熱點”區(qū)。
引物17＝5’AAA TAA CGG TTG GTT AAT TCG 3’引物15＝5’TCT TAA AAT TGC ATA AAA AGG 3’
這些引物是葡萄生單軸霉(P.viticola)細胞色素b基因的特異引物，包含氨基酸73-283。除了位置292外，該區(qū)域包含科學文獻中已知的在模型生物體中賦予對QoI的抗藥性的所有氨基酸位置。
用Ready.To.GoTaq聚合酶PCR珠(Amersham Phamacia Biotech)建立PCR。對于每個PCR珠，加入10μl模板、2.5μl正向引物17、2.5μl反向引物15(兩種引物濃度都是10pmol/μl以產(chǎn)生1pmol/μl的終濃度)和10μl重蒸餾H2O以產(chǎn)生25μl的總反應體積。PCR循環(huán)條件如下在94℃起始溫育10分鐘；隨后94℃，45秒，52℃，45秒和72℃，1分鐘30秒進行30輪循環(huán)。為了結束PCR有72℃，10分鐘的最終延伸步驟。在1％TBE瓊脂糖凝膠上觀察PCR產(chǎn)物，在所有泳道(除了僅有水的對照外)中出現(xiàn)了期望大小(～600bp)的產(chǎn)物。
合并從每個樣品，即從1∶10，1∶100和1∶1000模板DNA稀釋物得到的三個PCR產(chǎn)物，用Invitrogen的TOPO TA克隆試劑盒(K4500-01)，按照制造商的說明，將這些混合物克隆入載體pCR2.1-TOPO中。每個樣品挑取16個菌落用于質(zhì)粒小量制備。在Qiagen Biorobot上進行小量制備。然后，用EcoRI消化質(zhì)粒DNAs，在1％TBE瓊脂糖凝膠上觀察消化產(chǎn)物以確定哪個樣品含有正確大小的插入片段。然后，用M13正向和反向引物測序每個樣品的具有期望大小插入片段的10個克隆(ABI377XL自動測序儀)。用適合的生物信息學軟件，Seqman，Editseq和Macaw分析序列數(shù)據(jù)。
然后，比較樣品I112和I116b的推導的細胞色素b基因序列與先前測定的已知野生型和抗藥性葡萄生單軸霉(P.viticola)的細胞色素b序列。在圖15和16中顯示了核苷酸和氨基酸比對，這些氨基酸序列已使用在Genetic Codes(NCBI分類學)Http//www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wprintgc？mode＝t中所述的“Mold，Protozoan and CoelenterateMitochondrial Code-Number 4”進行過預測。
該分析的關鍵點是●I112-與野生型序列比較，所有10個克隆的細胞色素b序列顯示了在密碼子129的第1位從T到C的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。其編碼129位置的氨基酸亮氨酸。所有克隆在位置143編碼野生型氨基酸，沒有其它點突變存在。
野生型129＝TTT(苯丙氨酸，F(xiàn))突變型129＝CTT(亮氨酸，L)●I116b-測序的10克隆中4個克隆是相同的-它們與在143位置編碼甘氨酸且在129位置編碼苯丙氨酸的已知野生型葡萄生單軸霉(P.viticola)序列相同。測序的10克隆中其它6個克隆也是相同的。所有這些在129位置編碼氨基酸亮氨酸。再一次，這是由于密碼子129第一位置從T到C的SNP引起。所有這6個克隆在位置143編碼野生型氨基酸甘氨酸，并且沒有其它點突變存在。
●在樣品I112和I116b中位置129處苯丙氨酸到亮氨酸的氨基酸改變可能與對嗜球果傘素的抗藥性有關，因為在植物體內(nèi)生物測定中，它們對腈嘧菌酯(azoxystrobin)顯示了最大劑量反應。
●在葡萄生單軸霉(P.viticola)中，第一次觀察到賦予F到L改變的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
●然而，以前，在瓜果腐霉(P.aphanidermatum)大田分離物中曾觀察到F129L氨基酸改變，且證明其與對Qo位點抑制性殺真菌劑的抗藥性有關(參見上文)。
●在這兩種病原體中，不同SNP引起了F129L氨基酸改變葡萄生單軸霉(P.viticola) TTT到CTT瓜果腐霉(P.aphanidermatum)TTC到TTA更詳細地考慮該結果，對于樣品I112，10個克隆中9個有同一序列，1個克隆由于2個堿基不同而有其它序列差異。再一次，這些差異可能是由于PCR引入的錯誤造成的。對于樣品I116b，具有同一序列的4個克隆中的1個克隆有其它序列差異，該差異為4個堿基不同，具有同一序列的6個克隆中的1個克隆有其它序列差異，該差異是10個堿基不同。這些差異是由于不清楚的測序痕跡引起的。這些顯示在圖f中。
實施例12能區(qū)別野生型葡萄生單軸霉(P.viticola)及I112和I116b樣品中發(fā)現(xiàn)的F129和L129等位基因的ARMS引物的設計利用根據(jù)實施例11獲得的野生型葡萄生單軸霉(P.viticola)及樣品I112和I116b細胞色素b基因的序列，設計各種特異性ARMS引物以檢測該F129L點突變的存在或缺乏基于野生型序列的六個反向ARMS引物PV129-T15’CCCAAGGCAAAACATAACCCATA A 3’PV129-T25’CCCAAGGCAAAACATAACCCATA A3’PV129-T35’CCCAAGGCAAAACATAACCCATA A 3’PV129-T45’CCCAAGGCAAAACATAACCCAT AA 3’PV129-T55’CCCAAGGCAAAACATAACCCAT AA 3’PV129-T65’CCCAAGGCAAAACATAACCCAT AA 3’基于F129L突變的六個反向ARMS引物PV129-C15’CCCAAGGCAAAACATAACCCATA G 3’PV129-C25’CCCAAGGCAAAACATAACCCATA G 3’PV129-C35’CCCAAGGCAAAACATAACCCATA G 3’PV129-C45’CCCAAGGCAAAACATAACCCAT AG 3’PV129-C55’CCCAAGGCAAAACATAACCCAT AG 3’PV129-C65’CCCAAGGCAAAACATAACCCAT AG 3’及從點突變下游設計的對照反向引物PV129-S 5’GTCCCCAAGGCAAAACATAACCCAT 3’在每個上述ARMS引物中，-1堿基(引物序列的3’末端堿基)對應于靶點突變位點。以粗體顯示的堿基不同于野生型葡萄生單軸霉(P.viticola)細胞色素b序列。在PV129-T1和PV129-C1引物中，-2位置從A變?yōu)門堿基(反向互補)。在PV129-T2和PV129-C2引物中，-2位置從A變?yōu)镃堿基(在反向互補中)。在PV129-T3和PV129-C3引物中，-2位置從A變?yōu)镚堿基(在反向互補中)。在PV129-T4和PV129-C4引物中，-3位置從A變?yōu)門堿基(在反向互補中)。在PV129-T5和PV129-C5引物中，-3位置從A變?yōu)镃堿基(在反向互補中)。在PV129-T6和PV129-C6引物中，-3位置從A變?yōu)镚堿基(在反向互補中)。如前述，對序列進行這些改變可使葡萄生單軸霉(P.viticola)細胞色素b基因模板/引物雜合體去穩(wěn)定，使得任何引物可以更特異地針對相應的模板進行延伸。文獻中的例子已經(jīng)表明去穩(wěn)定ARMS引物降低了引物在錯誤模板上錯誤引發(fā)的風險(Newton等，Nucleic AcidResearch 17 (7) 2503-2516 1989)。
通過Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成所有引物。在使用前，分別在500μl總體積重蒸餾無核酸酶的H2O中，稀釋引物到5μM。然后，在PCR中，進一步稀釋引物到500nM的終濃度。
實施例13用于監(jiān)測葡萄生單軸霉(P.viticola)的F129和L129等位基因狀態(tài)的Scorpion引物的設計再一次利用根據(jù)實施例11獲得的野生型葡萄生單軸霉(P.viticola)及樣品I112和I116b細胞色素b基因的序列，通過向正向PCR引物中摻入檢測系統(tǒng)設計ScorpionTM寡核苷酸以檢測野生型和L129等位基因的選擇性擴增，所述正向PCR引物經(jīng)設計與實施例12描述的ARMS SNP檢測和標準引物一起使用。用ARMS引物得到的擴增子是161bp長，用對照引物得到的擴增子是164bp長。
更具體地，用Oligo 5和MFold程序(Mfold用Zucker能量最小化方法預測RNA或DNA分子的最佳和次佳二級結構(Zucker，M.(1989)Science 244，48-52；SantaLucia，J.Jr.(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，1460-1465)設計Scorpion引物。
由此得到的葡萄生單軸霉(P.viticola)Scorpion引物序列是
其中下劃線區(qū)是發(fā)夾形成部分(當Scorpion引物未反應時)；FAM是熒光素染料；MR(甲基紅)是與尿嘧啶殘基附著的非熒光猝滅劑，HEG是復制阻斷六乙二醇單體。斜體序列是反向引物序列，粗體序列是結合反向引物的真正葡萄生單軸霉(P.viticola)細胞色素b延伸產(chǎn)物的Scorpion序列。
用Mfold程序可以觀察該Scorpion引物的莖-環(huán)二級結構(參見圖17)，并且預測當其不與靶細胞色素b基因雜交時，其有-2.3kcal/mol的能量。然而，在延伸產(chǎn)物存在的情況下，因為Scorpion引物的探針序列以預測的-5.1kcal/mol能量雜交延伸產(chǎn)物，所以發(fā)夾結構分離。這使猝滅劑與FAM染料分離，引起了例如通過ABI Prism7700儀器可檢測的熒光發(fā)射。因此，與Scorpion莖-環(huán)比較，新合成鏈與Scorpion成分的退火是能量上有利的。
通過Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成Scorpion引物。在使用前，在500μl總體積重蒸餾無核酸酶的H2O中，稀釋引物到5μM。然后，在PCR中，進一步稀釋引物到500nM的終濃度。
實施例14用于檢測和定量樣品I112和I116b中發(fā)現(xiàn)的F129L SNP的ARMS和Scorpion引物的用途的驗證在所有ARMS/ScorpionTMF129L SNP檢測測定法中，AmpliTaq Gold酶(Applied Biosystem)以1單位/25μl反應包含在反應混合物中。反應混合物還含有1x緩沖液(10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，3.5mM MgCl2，0.01％明膠)和100μM dNTP(Amersham Pharmacia Biotech)。在ABI 7700儀器中進行擴增用于連續(xù)熒光監(jiān)測。循環(huán)條件包括95℃，10分鐘的最初循環(huán)，隨后通過95℃，15秒和60℃，45秒進行50輪循環(huán)。在所有循環(huán)的退火/延伸步驟期間檢測熒光。
通過利用各種濃度的質(zhì)粒DNA作為模板，驗證ARMS引物在這種分析中的用途。進行該驗證以檢查引物設計的特異性和靈敏性。如先前實施例11所述，將部分野生型細胞色素b基因序列和從兩個葡萄生單軸霉(P.viticola)樣品擴增的含有F129L突變的相應序列段克隆到TA pCR2.1載體(Invitrogen)中。保存挑選用于Qiagen Biorobot質(zhì)粒DNA制備(Qiagen)的來源于每個克隆事件的10個轉(zhuǎn)化體的150ul細菌培養(yǎng)物，在進行這些制備前4℃貯藏。序列分析后，注意到野生型和突變質(zhì)粒DNA樣品不含有與共有序列的序列差異。按照制造商的程序，挑取這些野生型和突變質(zhì)粒DNA序列來源的細菌培養(yǎng)物用于質(zhì)粒DNA大量制備(Qiagen)。定量由此得到的質(zhì)粒DNA，并且用無菌重蒸餾H2O稀釋到1μg/μl(2×1011分子/μl)的濃度。
在重蒸餾H2O中，進一步稀釋野生型和突變細胞色素b質(zhì)粒DNA構建體到10pg/μl(2×106分子/μl)的濃度，并且用其作為模板以驗證ARMS引物的特異性。在上述PCR條件下，對野生型和突變質(zhì)粒DNA模板及沒有模板(只有水)的對照測試每種ARMS引物。在表33中給出了結果。
表33測試ARMS引物特異性的驗證試驗的結果，其中該ARMS引物經(jīng)設計擴增葡萄生單軸霉(P.viticola)的F129和L129等位基因。

F129選擇性ARMS引物PV129-Wt6在適當和不適當模板上擴增間產(chǎn)生了最大窗(ΔCt)，L129選擇性ARMS引物PV129-Mut5在適合和不適合模板上擴增間產(chǎn)生了第二最大窗(ΔCt)，但在正確模板上的最早Ct被選擇用于進一步分析。
選擇用于點突變檢測的野生型ARMS引物PV129-T6和突變ARMS引物PV129-C5后，在測定法用于測試生物樣品L129突變是否存在前，要進一步驗證該測定法以充分理解它的檢測敏感性。首先通過10倍稀釋系列的野生型(F129)和突變體(L129)質(zhì)粒DNA模板，試驗選定的ARMS引物對PV129-T6和PV129-C5以觀察特異性窗如何隨著模板濃度變化。在1mg/ml濃度的牛血清白蛋白(BSA)(V級份粉末最少96％，Sigma A9647)中通過10倍稀釋系列稀釋前述野生型和突變體質(zhì)粒DNA盒，所述10倍稀釋度系列跨越6個數(shù)量級范圍，包括2×108分子/μl到2×102分子/μl的濃度。如上所述，用選定的ARMS引物和對照引物，在ARMS/Scorpion測定中測試質(zhì)粒DNA模板和沒有模板(只要水)的對照。
在表34和35中概述了該結果。
表34在質(zhì)粒DNA模板系列稀釋中測試的F129選擇性ARMS引物，PV129-Wt6

表35在質(zhì)粒DNA模板系列稀釋中測試的L129選擇性ARMS引物，PV129-Mut5

對于F129和L129等位基因選擇性引物PV129-Wt6和PV129-Mut5，在整個模板濃度范圍中，特異性范圍是恒定的。
第二個驗證研究涉及試驗選定的F129和L129等位基因選擇性引物PV129-Wt6和PV129-Mut5的檢測敏感性。將濃度是2×107分子/μl，帶有L129等位基因的質(zhì)粒DNA稀釋到背景質(zhì)粒DNA中，所述背景質(zhì)粒DNA帶有F129等位基因，濃度恒定是2×107分子/μl，以產(chǎn)生L129比F129等位基因的下列比率1∶1，1∶10，1∶100，1∶1,000，1∶10,000和1∶100,000。PCR中最終質(zhì)粒濃度是1×108分子/μl。如上所述，在測定中用引物PV129-Wt6和PV129-Mut5檢測這些和野生型質(zhì)粒，突變體質(zhì)粒和僅有水的對照。結果如表36中所示。
表36顯示ARMS引物Pv129-wt6和Pv129-mut5檢測敏感性的結果

因此，該結果顯示，在引物Pv129-mut5(L129等位基因選擇性引物)結合不適合的模板前，該測定法可以檢測F129等位基因(野生型)背景中1∶10000比率的L129等位基因(突變體)的水平。
實施例15用在監(jiān)測葡萄生單軸霉(P.viticola)F129和L129等位基因狀態(tài)中的Scorpion引物設計的進一步嘗試當即使從高濃度質(zhì)粒DNA檢測PCR產(chǎn)物時，進行葡萄生單軸霉(P.viticola)中F129L SNP檢測的所有ARMS/Scorpion測定的結果顯示了低熒光。這在低濃度DNA模板的測定中可能引起不可靠的PCR產(chǎn)物的檢測。因此，重新設計Scorpion引物如下。
所得到的葡萄生單軸霉(P.viticola)Scorpion引物的序列是 其中下劃線區(qū)是發(fā)夾形成部分(當Scorpion引物沒有反應時)；FAM是熒光素染料；MR(甲基紅)是與尿嘧啶殘基附著的非熒光猝滅劑(non-fluorigenic quencher)，HEG是復制阻斷性六乙二醇單體。斜體序列是正向引物序列，粗體序列是結合正向引物的真實葡萄生單軸霉(P.viticola)細胞色素b延伸產(chǎn)物的Scorpion序列。
用Mfold程序可以顯示該Scorpion引物的莖環(huán)二級結構，并且預測當其不與靶細胞色素b基因雜交時，其有-1.3kcal/mol的能量。然而，在延伸產(chǎn)物存在的情況下，因為Scorpion引物的探針序列以預測的-4.5kcal/mol能量結合延伸產(chǎn)物，所以發(fā)夾結構分離。這使FAM染料從其猝滅劑分離，引起了例如通過ABI Prism 7700儀器可檢測的熒光發(fā)射。因此，與Scorpion莖環(huán)比較，Scorpion成分在新合成鏈上的退火是能量上有利的。
通過Oswel DNA服務公司(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成Scorpion引物。在使用前，在500μl總體積重蒸餾無核酸酶的H2O中，稀釋引物到5μM。然后，在PCRs中，進一步稀釋引物到500nM的終濃度。
實施例16用于葡萄生單軸霉(P.viticola)中F129L SNP檢測和定量的ARMS和Scorpion引物之用途的進一步驗證在下面的驗證研究中聯(lián)合使用實施例15中描述的Scorpion引物與前面實施例14中描述選定的ARMS引物以理解該測定法檢測的敏感性。首先，通過10倍稀釋系列的野生型(F129)和突變體(L129)質(zhì)粒DNA模板，試驗選定的ARMS引物對PV129-T6和PV129-C5以觀察特異性窗如何隨著模板濃度變化。在1mg/ml濃度的牛血清白蛋白(BSA)(V級份粉末最少96％，Sigma A9647)中通過10倍稀釋系列稀釋前述野生型和突變體質(zhì)粒DNA盒，所述10倍稀釋度系列跨越6個數(shù)量級范圍，包括2×108分子/μl到2×102分子/μl的濃度。如上所述，用選定的ARMS引物和對照引物，在ARMS/Scorpion測定中試驗質(zhì)粒DNA模板和沒有模板(只要水)的對照。在表37和38中概述了該結果。
表37用實施例15中設計的Scorpion引物，在質(zhì)粒DNA模板系列稀釋中試驗的L129 ARMS引物，PV129-Mut5

表38用實施例15中設計的Scorpion引物，在質(zhì)粒DNA模板系列稀釋中試驗的F129 ARMS引物，PV129-Wt6

對于F129和L129等位基因選擇性引物PV129-Wt6和PV129～Mut5，除了最低模板濃度外，在整個模板濃度范圍中，特異性范圍是恒定的。
第二個驗證研究涉及用實施例15中描述的Scorpion引物試驗選定的F129和L129等位基因選擇性引物PV129-Wt6和PV129-Mut5的檢測敏感性。如實施例14所述進行試驗，結果顯示在表39中。
表39顯示和實施例15中設計的Scorpion引物一起，ARMS引物Pv129-wt6和Pv129-mut5檢測的敏感性的結果

因此，該結果顯示，在引物Pv129-mut5(L129等位基因選擇性引物)結合不適合的模板前，該測定法可以檢測F129等位基因(野生型)背景中1∶10000比率的L129等位基因(突變體)的水平。
設計第三個驗證試驗以試驗是否優(yōu)選的ARMS引物以相同的效率擴增。確保擴增效率大約相等是重要的，因為兩個引物間Ct的差異直接對應于樣品中抗藥性等位基因的頻率。測試這一點的一個方法是比較ΔCt如何隨著模板濃度變化。對ΔCt繪制logDNA輸入值，由此得到的斜率應該小于0.1。這按實施例8所述進行。用F129和L129等位基因特異性引物PV129-Wt6和PV129-Mut5及實施例15中描述的Scorpion引物一起試驗模板稀釋液，使野生型和突變體質(zhì)粒DNA和僅有水的對照。
表40用ARMS引物Pv129-wt6和Pv129-mut5及實施例15中設計的Scorpion引物進行的相對效率試驗的結果

將Ct對logDNA模板濃度作圖，用Excel計算線的斜率。線的斜率小于0.1，因此ARMS引物PV129-mut5和PV129-wt6以大致相同的效率擴增(圖18)。
設計第四個驗證試驗以研究是否宿主植物DNA(這種情況下是葡萄樹DNA)，例如由于作為PCR模板，能影響測定。在收集和直接試驗感染葉片材料時在任何樣品中將存在葡萄樹DNA。
為了進行該研究，用Qiagen DNeasy植物小量制備試劑盒，從葡萄樹葉片樣品提取基因組DNA(首先，通過在Centriprep攪拌研磨機中攪拌10分鐘，在含有鋼珠的1.5ml微量離心管中研磨100mg材料)。在重蒸餾H2O中，以5倍系列稀釋由此得到的DNA，以產(chǎn)生下列濃度“純的”(因為直接從小量制備試劑盒制備中獲得)，1∶5，1∶25和1∶125(植物DNA以水稀釋)。也制備了1∶100和1∶10000的L129等位基因∶F129等位基因質(zhì)粒DNA的兩種混合物(如上所述)。這些母液與漸降的植物材料背景混合產(chǎn)生下列PCR輸入1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+純植物DNA，1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+1∶5植物DNA，1∶100 L129等位基因∶F129等位基因+1∶25植物DNA，1∶100L129等位基因∶F129等位基因+1∶125植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+純植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+1∶5植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+1∶25植物DNA，1∶10,000 L129等位基因∶F129等位基因+1∶125植物DNA。如上所述，在測定中用優(yōu)選的ARMS引物測試所有上述這些及植物稀釋液，單獨的L129等位基因∶F129等位基因質(zhì)粒DNA各比率，2×107分子/μl濃度的野生型和突變體質(zhì)粒DNA和僅有水的對照。
以與這個實施例中所述的驗證試驗描述的方式相似的方式分析該結果。
驗證的最后階段涉及在生物樣品上試驗ARMS引物PV129-mut5和PV129-wt6和對照引物。用在該實施例中的生物樣品是孢子囊團塊。從30片葡萄樹葉片樣品洗出孢子囊形成孢子囊懸浮液；離心，移出上清液，保留孢子囊沉淀。(葡萄生單軸霉(P.viticola)感染的葡萄樹葉片也可以用作起始生物材料)。也如實施例11所述，用SpexCertiPrep 8000攪拌研磨機(Mixer Mill)(Glen Creston Ltd)研磨100mg生物材料。然后，也如實施例11所述，按照制造商的程序，用Qiagen DNeasy植物小量制備試劑盒進行基因組DNA制備，在無菌重蒸餾H2O中，以1∶10和1∶100稀釋由此得到的基因組DNA，如上所述，在ARMS/Scorpion測定中試驗這些模板稀釋液。用ARMS引物PV129-mut5和PV129-wt6及對照引物試驗每個模板稀釋液；也包含分別作為陽性和陰性對照的野生型和突變體質(zhì)粒DNA及僅有水的對照。以和這個實施例中驗證試驗所述的方式相似的方式分析該結果。
實施例17能夠檢測任何葡萄生單軸霉(P.viticola)分離物中F129和L129等位基因的ARMS/Scorpions測定法的設計。
為了檢測能夠轉(zhuǎn)換F129為L129的其它單核苷酸多態(tài)性，可以利用能區(qū)別僅129密碼子位置1(即，在位置1是存在胸腺嘧啶還是胞嘧啶殘基)的有義ARMS寡核苷酸對(oligo pair)/反義Scorpion聯(lián)合。同樣地，能區(qū)別129密碼子位置3所有可能殘基，即胸腺嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤或鳥嘌呤殘基的反義ARMS寡核苷酸對/有義Scorpion聯(lián)合可以檢測可替代的位置3置換，其中所述置換能引起L129介導的抗性。這些位置1和3的測定法聯(lián)合起來也提供了評估雙突變水平的方法，所述雙突變可能引起F129到L129(密碼子CTA和CTG)轉(zhuǎn)換。
反義ARMS寡核苷酸對/有義Scorpion聯(lián)合可以利用前面實施例13中詳細描述的Scorpion引物設計，其中在與下面SNP檢測ARMS引物和對照引物聯(lián)合使用的正向PCR引物上摻入檢測系統(tǒng)。
基于129密碼子位置3胸腺嘧啶殘基的三個反向ARMS引物PV129-1TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA APV129-2TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA APV129-3TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA A基于129密碼子位置3腺嘌呤殘基的三個反向ARMS引物
PV129-4TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA TPV129-5TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA TPV129-6TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA T基于129密碼子位置3胞嘧啶殘基的三個反向ARMS引物PV129-7TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA GPV129-8TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA GPV129-9TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA G基于129密碼子位置3鳥嘌呤殘基的三個反向ARMS引物PV129-10 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA CPV129-11 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA CPV129-12 TCCCCAAGGCAAAACATAACCCA C及從點突變下游設計的對照引物PV129-S2 TTGTCCCCAAGGCAAAACATAACCC在每個上述ARMS引物中，-1堿基(引物序列3’末端)對應于靶點突變位點。粗體表示的堿基不同于野生型葡萄生單軸霉(P.viticola)細胞色素b序列。在PV129-1，PV129-4，PV129-7和PV129-10引物中，-2位置從A變?yōu)門。在PV129-2，PV129-5，PV129-8和PV129-11引物中，-2位置從A變?yōu)镚。在PV129-3，PV129-6，PV129-9和PV129-12引物中，-2位置從A變?yōu)镃。對序列進行這些改變以去穩(wěn)定模板/引物雜合體，使得任何引物延伸對相應的模板更特異。用ARMS引物得到的擴增子將是126bp長，用對照引物得到的擴增子將是129bp長。
通過Oswel DNA服務公司(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成所有引物。在使用前，分別在500μl總體積重蒸餾無核酸酶的H2O中，稀釋引物到5μM。然后，在PCRs中，進一步稀釋引物到500nM的終濃度。
為了利用有義ARMS寡核苷酸對/反義Scorpion聯(lián)合檢測129密碼子位置1的胸腺嘧啶或胞嘧啶殘基，下面詳述另一個Scorpion設計。再一次利用根據(jù)實施例11獲得的野生型葡萄生單軸霉(P.viticola)及樣品I112和I116b細胞色素b基因的序列，在反向PCR引物上摻入檢測系統(tǒng)，設計Scorpion寡核苷酸；然后Scorpion引物可以與SNP檢測ARMS引物和對照引物一起使用。
更具體地，用Oligo 5和MFold程序(Mfold利用Zucker的能量最小化方法預測RNA或DNA分子的最佳和次佳二級結構(Zucker，M.(1989)Science 244，48-52；SantaLucia，J.Jr.(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，1460-1465)設計Scorpion引物。
由此得到的葡萄生單軸霉(P.viticola)Scorpion引物的序列是 其中下劃線區(qū)是發(fā)夾形成部分(當Scorpion引物未反應時)；FAM是熒光素染料；MR(甲基紅)是與尿嘧啶殘基附著的非熒光猝滅劑，HEG是復制阻斷六乙二醇單體。斜體序列是反向引物序列，粗體序列是結合反向引物的真實葡萄生單軸霉(P.viticola)細胞色素b延伸產(chǎn)物的Scorpion序列。帶下劃線的粗體堿基參與部分發(fā)夾莖和結合反向引物之延伸產(chǎn)物的Scorpion序列。
用Mfold程序可以觀察該Scorpion引物的莖-環(huán)二級結構(參見圖19)，并且預測當其不與靶細胞色素b基因雜交時，其有-2.2kcal/mol的能量。然而，在延伸產(chǎn)物存在的情況下，因為Scorpion引物的探針序列以預測的-6.1kcal/mol能量結合延伸產(chǎn)物，所以發(fā)夾結構分離。這使FAM染料和其染料猝滅劑分離，引起了通過例如ABIPrism 7700儀器可檢測的熒光發(fā)射。因此，與Scorpion莖-環(huán)比較，Scorpion成分在新合成鏈上的退火是能量上有利的。
反義Scorpion引物可以與下面有義ARMS引物聯(lián)合使用以檢測129密碼子位置1的胸腺嘧啶或胞嘧啶殘基。
基于129密碼子位置1胸腺嘧啶殘基的三個正向ARMS引物PV129-13TTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC T
PV129-14TTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC TPV129-15TTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC T基于129密碼子位置1胞嘧啶殘基的三個正向ARMS引物PV129-16TTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC CPV129-17TTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC CPV129-18TTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC C和從點突變上游設計的對照引物PV129-S3TATTTTTATTTTAATGATGGCGACTGC在每個上述ARMS引物中，-1堿基(引物序列3’末端堿基)對應于靶點突變位點。粗體的堿基不同于野生型葡萄生單軸霉(P.viticola)細胞色素b序列。在PV129-13和PV129-16引物中，-2位置從A變?yōu)門。在PV129-14和PV129-17引物中，-2位置從A變?yōu)镃。在PV129-15和PV129-18引物中，-2位置從A變?yōu)镚。對序列進行這些改變以去穩(wěn)定模板/引物雜合體，使得任何引物延伸對相應的模板更特異。用ARMS引物得到的擴增子將是278bp長，用對照引物得到的擴增子將是280bp長。
通過Oswel DNA服務公司(Lab 5005，Medical and BiologicalSciences Building，Southampton)合成所有引物。在使用前，分別在500μl總體積重蒸餾無核酸酶的H2O中，稀釋引物到5μM。然后，在PCRs中，進一步稀釋引物到500nM的終濃度。
實施例18用于葡萄生單軸霉(P.viticola)中F129和L129等位基因檢測和定量的MGB(小溝結合劑)雜交測定的設計利用根據(jù)實施例11獲得的野生型葡萄生單軸霉(P.viticola)及樣品I112和I116b細胞色素b基因的序列，設計MGB雜交測定法以檢測在密碼子129第一位置的T到C點突變(SNP-多核苷酸多態(tài)性)，該突變編碼苯丙氨酸到亮氨酸的改變。該測定法利用點突變(SNP)上游的普通正向引物，點突變(SNP)下游的普通反向引物和覆蓋點突變(SNP)的兩個MGB探針，其中一個探針匹配野生型序列，一個探針匹配突變體序列。依據(jù)該設計標準用Primer Express vs1.5軟件設計該測定。
引物和探針序列如下正向引物5’CGGATCTTATATTACACCTAGAGAAGCTTT 3’反向引物5’TTGTCCCCAAGGCAAAACAT 3’突變體探針(L129等位基因特異性)5’AACCCATAA TGCAGTC 3’野生型探針(F129等位基因特異性)5’ACCCATAA TGCAGTCG 3’針對互補序列設計探針。以粗體和下劃線突出的堿基是點突變(SNP)。用熒光團FAM在5’末端標記突變體探針，用熒光團VIC在5’末端標記野生型探針。用MGB單位的附著修飾兩個探針的3’末端。通過Applied Biosystems(Kelvin Close，Birchwood Science ParkNorth，Warrington，Cheshire，WA3 7PB)合成引物和探針。
實施例19用于葡萄生單軸霉(P.viticola)中F129L SNP檢測和定量的MGB雜交測定的驗證第一個驗證試驗包括測試野生型和突變體特異性MGB探針對它們的正確DNA模板與它們的錯誤DNA模板相比的雜交特異性。用下面反應條件進行所有的MGB雜交測定反應中正向和反向引物最終濃度是900nM，反應中野生型或突變體MGB雜交探針的終濃度是200nM，以2×濃度提供Taqman通用PCR母混合物(master mix)，使用5μl DNA，用無核酸酶的H2O補充反應液達到25μl總體積。PCR循環(huán)條件如下50℃，2分鐘進行一輪循環(huán)，隨后95℃，10分鐘進行一輪循環(huán)，隨后95℃，15秒和60℃，1分鐘進行50輪循環(huán)。所有循環(huán)的退火/延伸步驟期間監(jiān)測熒光。
用含有部分細胞色素b基因的質(zhì)粒DNA構建體試驗野生型和突變體MGB探針的特異性，其中部分細胞色素b基因在129位置編碼野生型(F129等位基因)或突變體(L129等位基因)序列。如實施例14所述，制備上述這些。以2×108-2×102分子/μl的10倍稀釋度系列稀釋含有野生型(F129等位基因)細胞色素b基因序列的質(zhì)粒DNA和含有突變體(L129等位基因)細胞色素b基因序列的質(zhì)粒DNA。如上所述，在用野生型MGB探針的測定和用突變體MGB探針的測定中測試所有上述這些。也包括僅有水的對照。在表41和42中給出了結果。
表41在質(zhì)粒DNA模板系列稀釋中試驗的突變體MGB探針測定法

表42在質(zhì)粒DNA模板系列稀釋中試驗的野生型MGB探針測定法

這些結果表明在模板DNA濃度稀釋系列中，野生型或突變體MGB雜交探針都不結合它們的錯誤模板。
第二個驗證試驗研究了突變體MGB雜交探針和野生型MGB雜交探針的檢測敏感性。將濃度是2×107分子/μl、帶有L129等位基因(突變體)的質(zhì)粒DNA稀釋到背景質(zhì)粒DNA中，所述背景質(zhì)粒DNA帶有F129等位基因(野生型)，濃度恒定是2×107分子/μl，以產(chǎn)生L129比F129等位基因的下列比率1∶1，1∶10，1∶100，1∶1,000，1∶10,000和1∶100,000。PCR中最終質(zhì)粒濃度是1×108分子/μl。在用野生型MGB探針和突變體MGB探針的兩個測定中試驗上述這些及野生型質(zhì)粒、突變體質(zhì)粒和僅有水的對照。結果表示在表43中。
表43顯示野生型和突變體MGB探針測定法檢測敏感性的結果

該測定法的檢測敏感性僅僅是10個野生型(F129)等位基因背景中的一個突變體(F129)等位基因。聯(lián)合普通正向和反向引物對，利用TaqMan探針或TaqMan MGB探針用于突變檢測的雜交測定法能檢測真菌樣品中在5～10％水平的突變體等位基因。當需要檢測更較水平的突變體等位基因時，更優(yōu)選利用ARMS引物聯(lián)合適當?shù)臋z測系統(tǒng)即Scorpion引物。
實施例20對QoI位點抑制劑類殺真菌劑顯示了降低的敏感性的馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)分離物細胞色素b基因的表征還已經(jīng)表征了當在生物測定中試驗時對QoI位點抑制劑殺真菌劑顯示了降低的敏感性的兩個馬鈴薯早疫病鏈格孢(A.solani)分離物的細胞色素b基因。從這些分離物提取DNA，用由此得到的gDNA(基因組DNA)作為PCRs模板擴增細胞色素b基因。用下列引物正向引物5’CTG TTA TCT TTA TCT TAA TGA TGG3’反向引物5’GGA ATA GAT CTT AAT ATA GCA TAG 3’在下列條件下94℃，3分鐘進行一輪循環(huán)，隨后94℃45秒，58℃45秒和72℃1分鐘30秒進行30輪循環(huán)，隨后在72℃，10分鐘進行一輪循環(huán)，如前述進行PCRs。
通過凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物，用Invitrogen的TOPO TA克隆試劑盒克隆正確預測大小的PCR產(chǎn)物，并且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)中。如前所述，篩選轉(zhuǎn)化體大腸桿菌(E.coli)的菌落，繼代培養(yǎng)，通過小量制備制備質(zhì)粒DNA。測序質(zhì)粒DNAs(參見實施例11)，并用適合的生物信息學軟件(例如，Seqman，Editseq和Macaw)分析序列數(shù)據(jù)。推導出的兩個分離物的細胞色素b基因序列與已知的野生型細胞色素b系列(以前測定的)比較。核苷酸和氨基酸對齊表示在圖20和21中，用如在遺傳密碼(Genetic Codes)(NCBI分類學)Http//www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wprintgc？mode＝t中所述的“Mold，Protozoan and CoelenterateMitochondrial Code-Number 4”預測了氨基酸序列。
在第一個馬鈴薯早疫病鏈格孢(A.solani)樣品細胞色素b基因密碼子129的第一個位置觀察到了T到C突變(SNP)的存在。根據(jù)釀酒酵母(S.cerevisiae)編號系統(tǒng)，當與基線/親本樣品比較時，該突變在129位置引起了苯丙氨酸到亮氨酸的改變。第二個樣品(樣品2)在密碼子129也顯示了突變(SNP)的存在，但是這是在密碼子129第三個位置從C到A。根據(jù)釀酒酵母(S.cerevisiae)編號系統(tǒng)，這在位置129也引起了苯丙氨酸到亮氨酸的改變。生物測定中觀察到的這兩個樣品的每一個中對QoI位點抑制劑化合物的降低敏感性可能與位置129苯丙氨酸(F)到亮氨酸(L)的氨基酸改變有關。這是首次在馬鈴薯早疫病鏈格孢(A.solani)中觀察到賦予F到L氨基酸改變的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。也是首次在任何真菌物種檢測到細胞色素b密碼子129中兩個不同的SNPs，每個SNP編碼F到L的氨基酸改變。
權利要求
1.真菌細胞色素b基因中一個或多個突變的檢測方法，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中氨基酸置換，其中所述突變的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗性組中任何其它化合物的抗性，所述方法包括利用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測技術鑒定真菌核酸中所述突變的存在或缺乏。
2.如權利要求1所述的方法，用于檢測真菌細胞色素b基因中一個或多個突變，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸到亮氨酸的置換(F129L)，其中所述突變的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗性組中任何其它化合物的抗性，所述方法包括利用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測技術鑒定真菌核酸中所述突變的存在或缺乏。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括檢測PCR反應過程中產(chǎn)生的擴增子的存在，其中所述PCR反應包括在適當核苷三磷酸和聚合用試劑存在的情況下，用診斷引物接觸包含真菌核酸的試驗樣品，其中所述擴增子的檢測與所述核酸中所述突變的存在或缺乏直接相關。
4.如權利要求1或2所述的方法，其中所述方法利用等位基因選擇性雜交探針技術。
5.真菌細胞色素b基因中一個或多個核苷酸多態(tài)性的診斷方法，該方法包括在對應于如下三聯(lián)體中一個或多個堿基的位置確定編碼真菌細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌核酸的序列，該三聯(lián)體編碼真菌細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，并且通過參照該細胞色素b基因中一個或多個多態(tài)性，確定所述真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗性組中化合物的抗性狀態(tài)。
6.檢測真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗性組中任何其它化合物的抗性的方法，所述方法包括鑒定編碼真菌細胞色素b基因的真菌核酸中一個或多個突變的存在或缺乏，其中所述突變的存在引起了對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗性組中任何其它化合物的抗藥性，所述方法包括鑒定單核苷酸多態(tài)性的存在或缺乏，該單核苷酸多態(tài)性出現(xiàn)在對應于如下三聯(lián)體中一個或多個堿基的位置，該三聯(lián)體編碼真菌細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
7.如前述權利要求任一權利要求所述的方法，其中單核苷酸多態(tài)性突變出現(xiàn)在三聯(lián)體第一和/或第三個堿基，該三聯(lián)體編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
8.如前述權利要求任一權利要求所述的方法，其中單核苷酸多態(tài)性突變出現(xiàn)在三聯(lián)體第一或第三個堿基，該三聯(lián)體編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
9.如前述權利要求任一權利要求所述的方法，其中單核苷酸多態(tài)性突變出現(xiàn)在三聯(lián)體第三個堿基，該三聯(lián)體編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
10.如前述權利要求任一權利要求所述的方法，其中單核苷酸多態(tài)性突變出現(xiàn)在三聯(lián)體第一個堿基，該三聯(lián)體編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
11.編碼細胞色素b蛋白質(zhì)之全部或部分的真菌DNA序列，其中當與相應的編碼細胞色素b蛋白質(zhì)的野生型DNA序列對齊所述真菌DNA序列時，在對應于如下三聯(lián)體一個或多個堿基的DNA位置觀察到所述真菌DNA序列含有單核苷酸多態(tài)性突變，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，單核苷酸多態(tài)性突變引起了可替代的氨基酸對正常苯丙氨酸殘基的置換。
12.如權利要求11所述的真菌DNA序列，其中所述可替代的氨基酸是亮氨酸殘基。
13.如權利要求11或12所述的真菌DNA序列，獲自或可獲自真菌，所述真菌選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici)，禾白粉菌大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，蘋果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinulanecator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola，Cercospora arachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomyces carpophillum，Didymella bryoniae，煙草霜霉菌(Peronospora tabacina)，隱匿柄銹菌(Puccinia recondita)和堀病柄銹菌(Puccinia horiana)。
14.如權利要求13所述的真菌DNA序列，獲自或可獲自真菌，所述真菌選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?Erysiphe graminis f.sp.tritici)，禾白粉菌大麥?；?Erysiphe graminis f.sp.hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporiumsecalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，蘋果黑星菌(Venturiainaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinulanecator)，禾生刺盤孢(Colletotrichum graminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)，番茄粉孢(Oidium lycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillulataurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctoniasolani)，Mycosphaerella musicola和Cercospora arachidola。
15.真菌細胞色素b基因中一個或多個突變存在或缺乏的檢測方法，該突變在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置引起了編碼蛋白質(zhì)中苯丙氨酸殘基的置換，所述方法包括鑒定真菌核酸樣品中所述突變的存在或缺乏，其中任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測方法基于對應于如下三聯(lián)體一個或多個堿基的位置上游和/或下游約30到90個核苷酸的序列信息，該三聯(lián)體編碼野生型或突變體蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述的檢測方法基于對應于三聯(lián)體第一或第三個堿基的位置上游和/或下游約30到90個核苷酸的序列信息，該三聯(lián)體編碼野生型或突變體蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述的檢測方法基于對應于三聯(lián)體第三個堿基的位置上游和/或下游約30到90個核苷酸的序列信息，該三聯(lián)體編碼野生型或突變體蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
18.如權利要求16所述的方法，其中所述的檢測方法基于對應于三聯(lián)體第一個堿基的位置上游和/或下游約30到90個核苷酸的序列信息，該三聯(lián)體編碼野生型或突變體蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
19.能夠結合編碼野生型細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌核酸序列的等位基因特異性寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含識別編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的苯丙氨酸殘基的核酸序列的序列。
20.能夠結合編碼野生型細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌核酸序列的等位基因特異性寡核苷酸，所述真菌選自葡萄生單軸霉(Plasmoparaviticola)，禾白粉菌小麥?；?Erysiphe graminisf.sp.triticii)，禾白粉菌大麥?；?Erysiphe graminisf.sp.hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，Mycosphaerella musicola，Cercosporaarachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomycescarpophillum，Didymella bryoniae，煙草霜霉菌(Peronosporatabacina)，隱匿柄銹菌(Puccinia recondita)和堀病柄銹菌(Puccinia horiana)，其中所述的寡核苷酸包含識別編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的苯丙氨酸殘基的核酸序列的序列。
21.能夠結合編碼突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌核酸序列的等位基因特異性寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含識別核酸序列的序列，所述核酸序列編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，所述氨基酸選自異亮氨酸，亮氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，纈氨酸，酪氨酸，最優(yōu)選亮氨酸。
22.如權利要求21所述的等位基因特異性寡核苷酸，能夠結合編碼突變體細胞色素b蛋白質(zhì)的真菌核酸序列，所述真菌選自葡萄生單軸霉(Plasmopara viticola)，禾白粉菌小麥?；?Erysiphegraminis f.sp.tritici)，禾白粉菌大麥?；?Erysiphe graminisf.sp.hordei)，黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)，圓核腔菌(Pyrenophora teres)，禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)，蘋果黑星菌(Venturia inaequalis)，Mycosphaerella fijiensis var.difformis，蒼耳單絲殼菌(Sphaerotheca fuliginea)，葡萄白粉病鉤絲殼霉(Uncinula necator)，禾生刺盤孢(Colletotrichumgraminicola)，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)，盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichum gloeosporioides)，番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)，蔓延疫霉(Phytophthora infestans)，韃靼內(nèi)絲白粉菌(Leveillula taurica)，古巴假霜霉(Pseudoperonosporacubensis)，馬鈴薯早疫病鏈格孢(Alternaria solani)，茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)，Mycosphaerella musicola，Cercosporaarachidola，尖孢刺盤孢(Colletotrichum acutatum)，Wilsonomycescarpophillum，Didymella bryoniae，煙草霜霉菌(Peronosporatabacina)，隱匿柄銹菌(Puccinia recondita)和堀病柄銹菌(Puccinia horiana)，其中所述寡核苷酸包含識別核酸序列的序列，所述核酸序列編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，所述氨基酸選自異亮氨酸，亮氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，纈氨酸，酪氨酸，最優(yōu)選亮氨酸。
23.具有在對應于三聯(lián)體一個或多個堿基的DNA位置檢測野生型細胞色素b基因序列能力的等位基因特異性寡核苷酸探針，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
24.具有在對應于三聯(lián)體一個或多個堿基的DNA位置檢測真菌細胞色素b基因多態(tài)性能力的等位基因特異性寡核苷酸探針，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
25.如權利要求24所述的等位基因特異性寡核苷酸探針，具有在對應于三聯(lián)體第一和/或第三個堿基的DNA位置檢測真菌細胞色素b基因多態(tài)性的能力，該三聯(lián)體編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
26.如權利要求24或25所述的等位基因特異性寡核苷酸探針，具有在對應于三聯(lián)體第一或第三個堿基的DNA位置檢測真菌細胞色素b基因多態(tài)性的能力，該三聯(lián)體編碼在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
27.如權利要求24，25或26所述的等位基因特異性寡核苷酸探針，具有在對應于三聯(lián)體第三個堿基的DNA位置檢測真菌細胞色素b基因多態(tài)性的能力，該三聯(lián)體編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
28.如權利要求24，25或26所述的等位基因特異性寡核苷酸探針，具有在對應于三聯(lián)體第一個堿基的DNA位置檢測真菌細胞色素b基因多態(tài)性的能力，該三聯(lián)體編碼對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
29.具有在對應于三聯(lián)體一個或多個堿基的DNA位置檢測細胞色素b基因多態(tài)性的能力的等位基因特異性引物，該三聯(lián)體編碼蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
30.如權利要求29所述的等位基因特異性引物，具有在對應于三聯(lián)體第一和/或第三個堿基的DNA位置檢測細胞色素b基因多態(tài)性的能力，該三聯(lián)體編碼在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
31.如權利要求29或30所述的等位基因特異性引物，具有在對應于三聯(lián)體第一或第三個堿基的DNA位置檢測真菌細胞色素b基因多態(tài)性的能力，該三聯(lián)體編碼在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
32.如權利要求29，30或31所述的等位基因特異性引物，具有在對應于三聯(lián)體第三個堿基的DNA位置檢測真菌細胞色素b基因多態(tài)性的能力，該三聯(lián)體編碼在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
33.如權利要求29，30或31所述的等位基因特異性引物，具有在對應于三聯(lián)體第一個堿基的DNA位置檢測真菌細胞色素b基因多態(tài)性的能力，該三聯(lián)體編碼在對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸。
34.能夠在對應于三聯(lián)體第一和/或第三個堿基的位置結合含有突變體類型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與所述突變體形式真菌細胞色素b基因中存在的核苷酸對應，并且所述核苷酸的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗性組中任何其它化合物的抗性。
35.能夠在對應于三聯(lián)體第一或第三個堿基的位置結合含有突變體類型真菌細胞色素b核苷酸序列的模板的診斷引物，該三聯(lián)體編碼細胞色素b蛋白質(zhì)中對應于釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的氨基酸，其中引物最末端的3’核苷酸與所述突變體形式真菌細胞色素b基因中存在的核苷酸對應，并且所述核苷酸的存在引起了真菌對嗜球果傘素類似物或相同交叉抗性組中任何其它化合物的抗性。
36.用在權利要求1到10，15和/或16任一權利要求所述的方法中的試劑盒。
37.如權利要求36所述的診斷試劑盒，包含下列的一個或多個診斷、野生型、對照和普通寡核苷酸引物，適當?shù)暮塑杖姿?，例如dATP，dCTP，dGTP，dTTP，適當?shù)木酆厦负途彌_溶液。
38.如權利要求36所述的試劑盒，包括等位基因選擇性雜交探針和下列的一個或多個使得包含靶病原體細胞色素b基因中包括密碼子129的區(qū)域的DNA區(qū)段能夠選擇性擴增的寡核苷酸引物，所述靶病原體細胞色素b基因來自野生型和抗嗜球果傘素類似物或相同交叉抗性組中任何其它化合物的抗性分離物，診斷野生型(F129)和抗性(A129)選擇性雜交探針，適當?shù)暮塑杖姿?，例如dATP，dcTP，dGTP，dTTP，如前所述的適當聚合酶和緩沖溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用任何(或一種)單核苷酸多態(tài)性檢測技術，優(yōu)選利用等位基因特異性擴增技術如擴增受阻突變系統(tǒng)(ARMS)或優(yōu)選利用等位基因選擇性雜交探針技術如Molecular Beacons或TaqMan，檢測真菌中對應于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞色素b殘基129的位置的一個或多個細胞色素b突變的診斷方法，該細胞色素b突變引起了對嗜球果傘素類似物或相同的交叉抗藥性組中化合物的抗藥性。本發(fā)明也涉及用在本發(fā)明方法中的突變特異寡核苷酸，及含有這些寡核苷酸的診斷試劑盒。
文檔編號C07K14/795GK1496410SQ02806086
公開日2004年5月12日 申請日期2002年3月25日 優(yōu)先權日2001年4月2日
發(fā)明者J·M·伯布里奇, S·M·克里爾, C·P·斯坦格, J·D·溫達斯, J M 伯布里奇, 克里爾, 斯坦格, 溫達斯 申請人:辛根塔有限公司