專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞活力生產(chǎn)高水平細(xì)胞因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)抑制與細(xì)胞因子合成有關(guān)的凋亡過(guò)程在人細(xì)胞培養(yǎng)中提高細(xì)胞因子產(chǎn)量的組合物和方法，特別是在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)的條件下。
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背景技術(shù)：
由包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)病原體所致的感染引起宿主免疫系統(tǒng)的激活和多種分子如細(xì)胞因子的信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)多個(gè)支路的動(dòng)員。細(xì)胞因子是迅速增加的有效和多效多肽的集合體，作為局部和/或全身細(xì)胞間調(diào)節(jié)因子而起作用(見(jiàn)，如，Balkwill和Burke，1989；Wong和Clark，1988；和Clark和Kamen，1987.)。它們?cè)谠S多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如免疫性、炎癥和造血，并由包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的多種細(xì)胞類(lèi)型產(chǎn)生。至今，已經(jīng)鑒定了大量的細(xì)胞因子，包括干擾素類(lèi)(IFNs)、腫瘤壞死因子類(lèi)(TNFs)、白介素類(lèi)(ILs)、生長(zhǎng)因子類(lèi)如表皮生長(zhǎng)因子、和分化因子類(lèi)如集落刺激因子(CSF)。
一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞因子和大量其他具有藥用和工業(yè)用途的蛋白可通過(guò)從細(xì)胞培養(yǎng)中純化天然蛋白質(zhì)或在昆蟲(chóng)、微生物或人類(lèi)細(xì)胞中重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)而生產(chǎn)。天然的細(xì)胞因子和其他蛋白質(zhì)是優(yōu)選的，因?yàn)橐阎鼈兒刑囟ㄌ烊恍问郊?xì)胞因子或蛋白的完整組成部分，并具有正確的結(jié)構(gòu)。但是，這種天然形式的細(xì)胞因子和蛋白的生產(chǎn)是昂貴和耗費(fèi)時(shí)間的。
重組產(chǎn)生的細(xì)胞因子和其它蛋白質(zhì)的生產(chǎn)不太昂貴，但可能含有外源性抗原，引起用藥的受者產(chǎn)生免疫反應(yīng)，或由于與天然形式即糖基化形式的結(jié)構(gòu)差異而活性較低。一般來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生細(xì)胞因子和其他蛋白質(zhì)的本方法是基于下面這些因素的表達(dá)(i)在微生物系統(tǒng)中，不允許進(jìn)行蛋白質(zhì)天然折疊的適當(dāng)糖基化，或(ii)在人細(xì)胞中產(chǎn)生水平較低。
因此，增加天然細(xì)胞因子和其他蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，使其生產(chǎn)不太昂貴的方法將是有益的。
dsRNA激活的蛋白激酶(PKR)是指PI/eIF2激酶、DAI或dsRNA激活抑制劑dsI、p68(人)或p65(鼠)激酶，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其酶活性的激活需要與dsRNA、或呈現(xiàn)內(nèi)部dsRNA結(jié)構(gòu)的單鏈RNA結(jié)合，隨后自動(dòng)磷酸化(Galabru和Hovanessian，1987；Meurs，等人，1990)。PKR在許多有用的細(xì)胞因子的表達(dá)中起重要作用，包括干擾素類(lèi)，如美國(guó)專(zhuān)利第6,159,712號(hào)所描述的，在此特別引入以供參考。
最近的結(jié)果表明，PKR活性形式的表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)Fas受體而觸發(fā)凋亡(Donze，O.，等人.，1999)，也提示PKR可能具有腫瘤抑制劑和凋亡誘導(dǎo)劑的作用(見(jiàn)，如，Clemens和Bommer，1999；Koromilas，等人.，1992)。也見(jiàn)Yeung，M.C.，等人，1996；Yeung，M.，和Lau，A.S.，1998)。
總起來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明，可以期望在表達(dá)PKR的細(xì)胞系中抑制凋亡細(xì)胞的死亡，以便延長(zhǎng)細(xì)胞在細(xì)胞因子誘導(dǎo)期間的壽命，從而提高細(xì)胞中細(xì)胞因子和其他蛋白的產(chǎn)量。
發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明包括在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子的方法。
本發(fā)明提供了產(chǎn)生細(xì)胞因子的人細(xì)胞組合物，其中所述細(xì)胞的特征是表達(dá)抗凋亡蛋白的編碼序列，且其細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平是不表達(dá)抗凋亡蛋白的相應(yīng)親代細(xì)胞系表現(xiàn)的細(xì)胞因子產(chǎn)生水平的至少兩倍(2×)。
在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生人細(xì)胞組合物的方法，該細(xì)胞組合物顯示一種或多種選自以下細(xì)胞因子的活性、表達(dá)或產(chǎn)量增加干擾素-α(IFN-α)、干擾素-β(IFN-β)、干擾素-γ(IFN-γ)；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)；白介素-2(IL-2)；白介素-3(IL-3)；白介素-7(IL-7)；白介素-8(IL-8)；白介素-10(IL-10)；和白介素-12(IL-12)。
在這樣的產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞中表達(dá)的抗凋亡蛋白優(yōu)選包括修飾的或突變形式的eIF-2a、FADD、Bcl-Xs、BAK或BAX；抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-XL和相關(guān)的類(lèi)似物，特別是CrmA。
這種產(chǎn)生細(xì)胞因子的人細(xì)胞組合物可如此制備通過(guò)引入含有CrmA編碼序列和選擇性標(biāo)記物編碼核酸序列的第一個(gè)表達(dá)載體修飾能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子的親代人細(xì)胞系，并在篩選劑的存在下培養(yǎng)被修飾的細(xì)胞以選擇CrmA表達(dá)細(xì)胞。
在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，產(chǎn)生抗凋亡蛋白的細(xì)胞可進(jìn)一步(1)通過(guò)引發(fā)和/或誘導(dǎo)，以有效增強(qiáng)細(xì)胞因子產(chǎn)量的方式處理；或(2)通過(guò)引入第二個(gè)表達(dá)載體而被修飾，該載體含有細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子如PKR的編碼序列和編碼選擇性標(biāo)記物的核酸序列以選擇表達(dá)CrmA和PKR的細(xì)胞，然后進(jìn)行引發(fā)和/或誘導(dǎo)。
可通過(guò)將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與許多試劑中的任試劑接觸而實(shí)現(xiàn)而引發(fā)，如醋酸佛波豆蔻酯(PMA)或干擾素-β。誘導(dǎo)是指將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與微生物誘導(dǎo)劑接觸，如仙臺(tái)病毒、腦心肌炎病毒或單純皰疹病毒；或?qū)⒓?xì)胞與至少一種非微生物誘導(dǎo)劑接觸，該誘導(dǎo)劑選自poly(I)poly(C)(poly IC)，或poly r(I)poly r(C)(poly rIC)，肝素，硫酸葡聚糖，放線菌酮，放線菌素D，丁酸鈉，鈣離子載體和硫酸軟骨素。
通過(guò)抑制凋亡，本發(fā)明的細(xì)胞系組合物和方法增加了細(xì)胞因子的產(chǎn)量和/或增加了細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的時(shí)間。
當(dāng)結(jié)合閱讀本發(fā)明的下列詳細(xì)描述與附圖時(shí)，就會(huì)完全地理解本發(fā)明的這些和其他目的和特征。
附圖描述

圖1顯示了在超誘導(dǎo)和仙臺(tái)病毒進(jìn)行病毒誘導(dǎo)后，親代野生型(WT)和表達(dá)CrmA(CrmA-#2)的MG-63細(xì)胞采用亞丙基測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞活力的結(jié)果。
圖2顯示了在超誘導(dǎo)和仙臺(tái)病毒處理后親代野生型(WT)和表達(dá)(CrmA-#2)的MG-63細(xì)胞中β-干擾素的產(chǎn)量。
圖3顯示了在超誘導(dǎo)后表達(dá)(CrmA-#2)的MG-63細(xì)胞中0、2mM、4mM和8mM 2-氨基嘌呤(2-AP；PKR抑制劑)對(duì)β-干擾素產(chǎn)量的影響。
圖4A和4B顯示了分別用仙臺(tái)病毒和poly IC進(jìn)行細(xì)胞因子誘導(dǎo)后6A，A9和WT細(xì)胞系活力的百分比。
圖5A和5B顯示了分別用仙臺(tái)病毒和poly IC處理后6A，A9和WT細(xì)胞系中產(chǎn)生的α-干擾素水平。
發(fā)明的詳述I.定義如果沒(méi)有其他說(shuō)明，所有在此所使用的科技術(shù)語(yǔ)對(duì)于本發(fā)明領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員們來(lái)說(shuō)，具有相同的含義?？梢蕴貏e地指導(dǎo)醫(yī)生們?cè)赟ambrook等人，1989和Ausubel FM等人，1993中獲得本領(lǐng)域的術(shù)語(yǔ)和定義。可以理解的是本發(fā)明并不限制于所描述的特殊方法學(xué)、步驟和試劑，因?yàn)樗麄兪强梢宰兓摹?br> 在此所引用的所有出版物在此均特別引入以供參考，其目的是描述和公開(kāi)所可能使用的與本發(fā)明有關(guān)的組合物和方法學(xué)。
“異源”核酸構(gòu)建物或序列是它要被表達(dá)的細(xì)胞的非天然序列的一部分。就控制序列而言，異源性是指本質(zhì)上不能調(diào)控它正在調(diào)控的相同基因表達(dá)的一條控制序列(即啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)。一般來(lái)說(shuō)，異源核酸序列對(duì)于細(xì)胞或它們所存在的基因組的一部分來(lái)說(shuō)不是內(nèi)源性的，并已經(jīng)通過(guò)感染、轉(zhuǎn)染、微注射、電穿孔或類(lèi)似方法加入至細(xì)胞中。“異源”核酸構(gòu)建物可能含有一個(gè)控制序列/DNA編碼序列結(jié)合物，它與在天然細(xì)胞中所發(fā)現(xiàn)的控制序列/DNA編碼序列結(jié)合物相同或不同。
術(shù)語(yǔ)“載體”，如在此所使用的，是指設(shè)計(jì)用來(lái)在不同宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建物?！氨磉_(dá)載體”是指具有在外來(lái)細(xì)胞中摻入和表達(dá)外源DNA片段能力的載體。許多原核和真核表達(dá)載體可從商業(yè)渠道獲得。適當(dāng)表達(dá)載體的選擇是包含在本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員的知識(shí)范圍之內(nèi)的?？寺』虮磉_(dá)載體可包含其他的元件，如表達(dá)載體可具有兩個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，因此可以允許在兩個(gè)生物體中生存，如在人細(xì)胞中表達(dá)，在原核細(xì)胞宿主中克隆和擴(kuò)增。克隆和表達(dá)載體典型地含有一個(gè)選擇性標(biāo)記物。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“編碼選擇性標(biāo)記物的核酸序列”是指一個(gè)能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的核苷酸序列，其中選擇性標(biāo)記物的表達(dá)賦予了含有所表達(dá)基因的細(xì)胞在選擇性試劑的存在下生長(zhǎng)的能力。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指一個(gè)可引導(dǎo)下游基因直接轉(zhuǎn)錄的核酸序列。啟動(dòng)子一般適合于靶基因被表達(dá)的宿主細(xì)胞。啟動(dòng)子與其他轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控核酸序列一起(也稱(chēng)為“控制序列”)對(duì)于表達(dá)特定基因是必需的。一般來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列包括，但不限于，啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強(qiáng)子或激活子序列。啟動(dòng)子可以是結(jié)構(gòu)性的或誘導(dǎo)性的，可以是天然存在的，基因工程改造的或雜合的啟動(dòng)子。
術(shù)語(yǔ)“控制序列”是指在特殊宿主生物體中可操作連接的編碼序列所必須的DNA序列。適合原核細(xì)胞的控制序列，例如包括啟動(dòng)子，任選的操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。真核細(xì)胞已知可使用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“可操作性連接”涉及重組DNA構(gòu)建物或載體，其含義是重組DNA構(gòu)建物或載體的核苷酸組分可直接與另一個(gè)連接，以便操作性的控制所選擇的編碼序列。一般來(lái)說(shuō)，“可操作性連接”的DNA序列在分泌性引導(dǎo)子的情況下是連續(xù)的，并在可讀框中也是連續(xù)的。但是，增強(qiáng)子不一定是連續(xù)的。在合適的限制性位點(diǎn)上通過(guò)連接反應(yīng)進(jìn)行連接。如果這樣的位點(diǎn)不存在，可根據(jù)常規(guī)的方法使用合成的寡核苷酸接頭或連接子。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“基因”是指涉及產(chǎn)生多肽鏈的DNA片段，可包括或不包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，如5′不翻譯(5′UTR)或“引導(dǎo)”序列和3′UTR或“尾”序列，以及單個(gè)編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“序列同一性”是指采用序列排列程序進(jìn)行排列時(shí)，在兩個(gè)或多個(gè)排列序列之中的核酸或氨基酸序列同一性。
術(shù)語(yǔ)“同源性”在此與“同一性”交叉使用，是指當(dāng)采用序列排列程序進(jìn)行排列時(shí)，在兩個(gè)或多個(gè)排列的序列之間的核酸或氨基酸序列同一性的水平。如，在此所使用的，80％的同源性是指通過(guò)特定的算法確定的80％序列同一性，并且相應(yīng)地給定序列的同源物在給定長(zhǎng)度的序列上具有超過(guò)80％的序列同一性。序列同一性的實(shí)例水平如在此所描述的，包括但不限于，與PKR序列具有80，85，90或95％或更多的序列同一性。
用于確定兩個(gè)序列之間同一性的計(jì)算機(jī)程序的實(shí)例包括，但不限于，BLAST程序系列，如BLASTN，BLASTX，和TBLASTX，BLASTP和TBLASTN，可公共的在互聯(lián)網(wǎng)上在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/＂獲得。也見(jiàn)，Altschul，S.F.等人，1990和Altschul，S.F.等人，1997。
當(dāng)計(jì)算一條指定核酸序列與在GenBank DNA序列庫(kù)和其他公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列的相似性時(shí)，序列的檢索典型地是采用BLASTN程序來(lái)執(zhí)行。BLASTX程序優(yōu)選檢索在GenBank蛋白序列庫(kù)和其他公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)在所有可讀框中被翻譯為氨基酸序列的核酸序列。BLASTN和BLASTX的運(yùn)行采用缺省參數(shù)，開(kāi)放間隙補(bǔ)償系數(shù)為11.0，延伸間隙補(bǔ)償系數(shù)為1.0，并使用BLOSUM-62矩陣。[見(jiàn)Altschul等人，1997。]
為了確定在兩條或多條序列之間的“％同一性”，所選擇的序列的優(yōu)選排列使用如CLUSTAL-W程序的Mac Vector6.5版來(lái)執(zhí)行，采用缺省參數(shù)進(jìn)行操作，包括開(kāi)放間隙補(bǔ)償系數(shù)為10.0，延伸間隙補(bǔ)償系數(shù)為0.1，并使用BLOSUM 30相似性矩陣。
如果兩條序列可在中等至高等嚴(yán)格雜交和沖洗條件下互相特異性雜交，該核酸序列被認(rèn)為是與參考核酸序列“可選擇性雜交”。雜交條件是以核酸結(jié)合復(fù)合體或探針的變性溫度(Tm)為基礎(chǔ)的。如，“最大嚴(yán)格性”典型地發(fā)生在大約Tm-5℃(探針Tm下5°)；“高等嚴(yán)格性則在Tm下大約5-10°；“中等嚴(yán)格性”在Tm下大約10-20°；“低等嚴(yán)格性”在Tm下大約20-25°，最大嚴(yán)格性條件用來(lái)鑒定與雜交探針具有嚴(yán)格同一性或近似嚴(yán)格同一性的序列；同時(shí)高等嚴(yán)格性條件用來(lái)鑒定與探針具有80％或以上序列同一性的序列。
中等和高等嚴(yán)格性雜交條件在本領(lǐng)域是為人熟知的(見(jiàn)，如Sambrook等人，1989，第9和11章，和Ausubel，F(xiàn).M.等人，1993，在此特別合并作為參考文獻(xiàn))。高等嚴(yán)格性條件的實(shí)例包括在大約42℃，在50％甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt′s溶液，0.5％SDS和100μg/ml變性載體DNA中進(jìn)行雜交，然后在2×SSC和0.5％SDS室溫下沖洗兩次，在42℃在0.1×SSC和0.5％SDS中另外沖洗兩次。
如在此所使用的，“重組體”涉及細(xì)胞或載體，它們已經(jīng)通過(guò)引入異源核酸序列而被修飾，或細(xì)胞來(lái)自如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞可表達(dá)一些在細(xì)胞的天然形式(非重組體)的相同形式中未被發(fā)現(xiàn)的基因，或反之表達(dá)一些異常表達(dá)的天然基因，這些基因在人為的干預(yù)下表達(dá)或根本不表達(dá)。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”，“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)基因”就哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言，它們是指哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有非天然的(異源性)核酸序列，該序列被整合進(jìn)其基因組中，可維持兩代或更多代。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指在基因的核酸序列基礎(chǔ)上產(chǎn)生多肽的過(guò)程。該過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)”是指細(xì)胞因子調(diào)控因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，其產(chǎn)物包括前體RNA，mRNA；多肽，翻譯后加工多肽，及其衍生物，包括來(lái)自其他物種如鼠或猿酶的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子。
緊接著，術(shù)語(yǔ)“PKR表達(dá)”是指PKR編碼核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)物包括前體RNA，mRNA，多肽，翻譯后加工多肽，及其衍生物，并包括來(lái)自其他物種如鼠或猿酶的PKR。例如，PKR表達(dá)的分析包括自磷酸化測(cè)定和eIF2α磷酸化測(cè)定檢測(cè)PKR活性，Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)，Northern印跡分析和逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)PKR mRNA表達(dá)。
“選擇性剪接”的過(guò)程是從一種單一的基因產(chǎn)生多個(gè)多肽同型異構(gòu)體，并在基因轉(zhuǎn)錄的一些過(guò)程，但不是所有的過(guò)程中，涉及非連續(xù)外顯子的共同剪接。因此一個(gè)特別的外顯子可能與幾個(gè)可選擇的外顯子中的任何一個(gè)連接，形成信使RNA。選擇性剪接的mRNA可產(chǎn)生一些多肽(“剪接變異體”)，其中一些部分是相同的，而其他部分是不同的。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)活性”和“生物學(xué)上有活性的”是指在細(xì)胞系培養(yǎng)中由特殊蛋白產(chǎn)生的活性。應(yīng)該理解的是這樣蛋白的“生物學(xué)活性”可根據(jù)培養(yǎng)條件而有所變化，一般認(rèn)為是活性范圍。相應(yīng)地，蛋白的“生物學(xué)無(wú)活性”形式是指蛋白的一種形式，它被修飾的方式可干擾蛋白的天然活性。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的生物學(xué)活性”和“生物學(xué)上有活性的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子”是指與特殊細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子或細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的任何片斷，衍生物，或類(lèi)似物有關(guān)的任何生物學(xué)活性，如酶的活性等。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性的正常水平”和“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)的正常水平”是指在一個(gè)特殊類(lèi)型如一個(gè)特殊類(lèi)型的親代細(xì)胞系中未修飾，未誘導(dǎo)，未引發(fā)或未感染的細(xì)胞中測(cè)定的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性或表達(dá)的水平。應(yīng)該理解的是這樣“正常的”細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性或表達(dá)，被認(rèn)為是細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性或表達(dá)的一個(gè)范圍，一般在特定類(lèi)型的細(xì)胞中進(jìn)行觀察，該細(xì)胞并未用編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的載體轉(zhuǎn)染，是未受刺激的(未被誘導(dǎo)或引發(fā))和未被感染的。
然后，術(shù)語(yǔ)“PKR的生物學(xué)活性”和“生物學(xué)有活性的PKR”是指與PKR，或PKR的一個(gè)片斷，衍生物或類(lèi)似物有關(guān)的任何生物學(xué)活性，如酶活性，特別地包括涉及底物磷酸化的自磷酸化活性和激酶活性，這些底物如真核細(xì)胞翻譯起始因子2(elf-2)和轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB。
相似地，術(shù)語(yǔ)“PKR活性的正常水平”和“PKR表達(dá)的正常水平”是指測(cè)定在特殊類(lèi)型，如一種特殊細(xì)胞系的未刺激或未感染細(xì)胞中存在的PKR活性或表達(dá)的水平。應(yīng)該理解的是這樣“正常”的PKR活性或表達(dá)，被認(rèn)為是PKR活性或表達(dá)的一個(gè)范圍，一般在特定類(lèi)型的細(xì)胞中進(jìn)行觀察，該細(xì)胞并未用編碼PKR的載體轉(zhuǎn)染，是未受刺激的(未被誘導(dǎo)或引發(fā))和未被感染的。
“正常”細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性或表達(dá)的范圍可根據(jù)培養(yǎng)條件而有所變化。例如，U937細(xì)胞系具有PKR活性的正常范圍，與Vero或Namalwa細(xì)胞系的PKR活性的正常范圍不同。PKR的過(guò)度表達(dá)意味著其表達(dá)水平在PKR表達(dá)的正常范圍之上，一般在特定類(lèi)型的細(xì)胞中進(jìn)行觀察，該細(xì)胞未用編碼PKR的載體轉(zhuǎn)染，是未受刺激的(未被誘導(dǎo)或引發(fā)的)和未被感染的。相應(yīng)地，PKR的“過(guò)度表達(dá)”意味著PKR活性，表達(dá)或產(chǎn)量的范圍超過(guò)了一般在特定類(lèi)型細(xì)胞中所觀察到的范圍，該細(xì)胞未通過(guò)引入含有PKR編碼序列而被修飾以用來(lái)選擇PKR的過(guò)度表達(dá)，是未受刺激的(未被誘導(dǎo)或引發(fā)的)和未被感染的。
在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的過(guò)度表達(dá)是指在所應(yīng)用的特殊培養(yǎng)條件下，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性，表達(dá)或產(chǎn)量的水平較相同細(xì)胞系細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性，表達(dá)或產(chǎn)量的正常水平高至少150％(1.5倍或1.5×)，，優(yōu)選至少200％，300％或400％，或500％或更高。換言之，過(guò)度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系所表現(xiàn)的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子產(chǎn)量或表達(dá)的水平較在相同類(lèi)型細(xì)胞所表現(xiàn)的典型的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)或產(chǎn)量水平高至少1.5倍，優(yōu)選2倍(2×)，3倍(3×)，4倍(4×)，5倍(5×)或更高，后者細(xì)胞是未被選擇，修飾或以可有效引起細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)的方式處理的。
在一些情況下，在特殊培養(yǎng)條件下，過(guò)度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子如PKR的細(xì)胞系所表現(xiàn)的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)或產(chǎn)量的水平較在相同類(lèi)型細(xì)胞所表現(xiàn)的典型的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)或產(chǎn)量水平高10倍(10×)或更高，后者細(xì)胞是未被選擇或以可有效引起細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)的方式處理的。通過(guò)實(shí)例，術(shù)語(yǔ)“以有效引起PKR過(guò)度表達(dá)的方式處理”是指，將一種或多種PKR編碼序列(異源性或自體來(lái)源的)引入至細(xì)胞中，選擇，刺激(引發(fā)或引發(fā)和誘導(dǎo))和/或感染。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子的正常水平”和“蛋白的正常水平”，涉及活性，表達(dá)和產(chǎn)量，是指細(xì)胞因子或其他蛋白活性，表達(dá)或產(chǎn)量的水平，是在特殊類(lèi)型的細(xì)胞中檢測(cè)的，其中，該細(xì)胞未以可有效引起細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)的方式進(jìn)行處理。實(shí)例包括，未被選擇或未以可引起細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性，表達(dá)或產(chǎn)量增加的方式進(jìn)行處理的一個(gè)野生型細(xì)胞系和不含有所引入的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子編碼序列的細(xì)胞系。應(yīng)該理解的是，這樣“正?！钡募?xì)胞因子或其他蛋白的活性，表達(dá)或產(chǎn)量被認(rèn)為是在一個(gè)特定類(lèi)型細(xì)胞中所觀察到的典型的活性，表達(dá)或產(chǎn)量的范圍，可根據(jù)培養(yǎng)條件而發(fā)生變化。
相應(yīng)地，“正?！奔?xì)胞因子活性或表達(dá)的范圍可根據(jù)培養(yǎng)條件而變化。術(shù)語(yǔ)“增高的水平”和“在正常水平之上”就細(xì)胞因子或蛋白活性，表達(dá)或產(chǎn)量而言可以互相交換使用。術(shù)語(yǔ)是指在所使用的特殊培養(yǎng)條件下，細(xì)胞因子或蛋白活性，表達(dá)或產(chǎn)量的水平較相同細(xì)胞系的親代細(xì)胞所表現(xiàn)的細(xì)胞因子或蛋白活性，表達(dá)或產(chǎn)量水平高至少150％(1.5倍或1.5×)，優(yōu)選至少200％，300％或400％，或500％或更高，其中親代細(xì)胞未被選擇，修飾或用可有效引起細(xì)胞因子或蛋白活性，表達(dá)或產(chǎn)量增加的方式處理。在一些情況下，細(xì)胞因子或蛋白活性，表達(dá)或產(chǎn)量的增加是親代細(xì)胞系的10倍(10×)或更高。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“純化”和“分離”一般是指可從發(fā)現(xiàn)或產(chǎn)生的環(huán)境中的其他組分中分離的分子，多核苷酸或多肽。例如一個(gè)分離或純化的多核苷酸或多臺(tái)典型地可從發(fā)現(xiàn)或產(chǎn)生它們的環(huán)境中的75％或更多組分中分離出來(lái)。一個(gè)分離或純化的多核苷酸或多肽優(yōu)選從發(fā)現(xiàn)它們的環(huán)境的至少80％至85％和更優(yōu)選至少90％，95％或更多的組分中分離出來(lái)。例如，一個(gè)“純化”或“分離”的細(xì)胞因子是指，細(xì)胞因子從其被產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中至少75％或更多，優(yōu)選從至少80％至85％或更優(yōu)選從至少90％或更多的組分中被分離出來(lái)。
如在此所使用的術(shù)語(yǔ)“凋亡細(xì)胞死亡”，“程序性細(xì)胞死亡”和“凋亡”是指由于細(xì)胞事件中的復(fù)合級(jí)聯(lián)反應(yīng)或與之相關(guān)的任何細(xì)胞死亡，該事件發(fā)生在細(xì)胞分化的特殊時(shí)期，是對(duì)特異的刺激產(chǎn)生的反應(yīng)。凋亡細(xì)胞死亡的特征是細(xì)胞質(zhì)的固縮和瀕死細(xì)胞核染色質(zhì)的固縮。與該過(guò)程相關(guān)的是DNA碎裂成多個(gè)長(zhǎng)度為200的堿基對(duì)，RNA降解，以及蛋白水解，其形成方式不需要壞死細(xì)胞死亡時(shí)所見(jiàn)到的細(xì)胞迅速溶解。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“抑制凋亡細(xì)胞死亡”是指在培養(yǎng)細(xì)胞系以表達(dá)或產(chǎn)生細(xì)胞因子或其他蛋白的整個(gè)期間內(nèi)部分或全部抑制細(xì)胞死亡過(guò)程。這樣的抑制作用就在沒(méi)有被可有效抑制凋亡的方式修飾過(guò)的細(xì)胞系中所觀察到的凋亡細(xì)胞死亡的數(shù)量來(lái)說(shuō)，一般是指凋亡細(xì)胞死亡被減少至少20％，優(yōu)選至少50％和更優(yōu)選80％或更多。
在產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞系中，這樣的抑制作用就沒(méi)有被以可有效抑制凋亡的方式修飾過(guò)的過(guò)度表達(dá)PKR的細(xì)胞系中所觀察到的凋亡細(xì)胞死亡的數(shù)量來(lái)說(shuō)，一般是指凋亡細(xì)胞死亡的數(shù)量減少至少20％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選80％或更多。
上面所提到的關(guān)于細(xì)胞因子的定義也適用于采用本發(fā)明方法產(chǎn)生的“其他蛋白”，如CrmA，Bcl-2，Bcl-XL和相關(guān)的同源物。相應(yīng)地，CrmA，Bcl-2或Bcl-XL的“過(guò)度表達(dá)”分別表示CrmA，Bcl-2或Bcl-XL活性或表達(dá)的范圍，它們較沒(méi)有被編碼CrmA，Bcl-2或Bcl-XL的載體轉(zhuǎn)染和被刺激產(chǎn)生凋亡的特定類(lèi)型細(xì)胞所觀察的一般范圍高。
如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“修飾形式”，就與凋亡相關(guān)的蛋白而言，其實(shí)例為eIF-2α或eIF-2α，eIF-3，F(xiàn)ADD，Bcl-Xs，BAK，BAX，等，其含義是天然蛋白的衍生物或變異體形式。也就是，一個(gè)蛋白的“修飾形式”具有一個(gè)衍生多肽序列，該序列含有至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或插入，特別優(yōu)選具有氨基酸取代。氨基酸取代，插入或刪除可發(fā)生在多肽序列中的任何殘基上，可干擾蛋白的生物學(xué)活性。編碼變異體或衍生蛋白的相應(yīng)核酸序列被認(rèn)為是“突變”或“修飾形式”的基因或其編碼序列，它包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
II.細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生許多已知的因子涉及細(xì)胞如人類(lèi)細(xì)胞中細(xì)胞因子的誘導(dǎo)和/或表達(dá)增強(qiáng)。這些因子包括細(xì)胞因子和其他蛋白特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF-1、IRF-3和IRF-7)，細(xì)胞因子受體，核因子kB(NF-kB)，激活物蛋白-1(AP-1)，核因子IL-6(NF-IL6)，特別是PKR。
增強(qiáng)任何這些因子的表達(dá)或活性一般將引起較一種或多種編碼細(xì)胞因子的基因正常表達(dá)更高的表達(dá)。
PKR在此用作能調(diào)控細(xì)胞因子和其他蛋白表達(dá)的蛋白實(shí)例；但應(yīng)該理解的是其他細(xì)胞因子和蛋白增強(qiáng)因子(在此稱(chēng)為“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子”或“CRF”)可用來(lái)代替PKR，如(1)蛋白激酶C(PKC)誘導(dǎo)物，TNF-α，GM-CSF， EGF和PDGF，G-CSF，TGF， TNF-α或TNF-β，IL-1，IFNs(IFN-α，IFN-β，IFN-γ)或趨化因子(IL-8，巨噬細(xì)胞炎性蛋白[MIP-Ia&-Ib]和單核細(xì)胞趨化蛋白[MCPs])；(2)其他細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)因子如PMA，鈣離子載體，丁酸鈉或內(nèi)毒素；(3)poly IC，雙鏈RNA或病毒類(lèi)似物；(4)可激活PKR的細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)，包括熱休克，病原體感染，如病毒感染，或(5)可增強(qiáng)這樣一種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)從而引起細(xì)胞因子產(chǎn)生增加的任何因子。
A.PKRPKR是僅有的被鑒定的已知具有激酶活性的dsRNA結(jié)合蛋白，PKR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其酶的激活需要dsRNA結(jié)合和其后的自磷酸化(Meurs等人，1990；Feng GS等人，1992)。
PKR體內(nèi)最特征化的底物是真核起始因子(eIF-2a)的α亞單位，一旦被磷酸化，最終將抑制細(xì)胞和病毒蛋白的合成(Hershey，J.W.B.，1991)。當(dāng)被雙鏈RNA激活時(shí)，在體外PKR已經(jīng)被證明是磷酸化起始因子eIF-2α(Chong等人，1992)。PKR的這種特殊功能已經(jīng)被證明是介導(dǎo)IFN-α和IFN-β的抗病毒和抗增殖活性的機(jī)制之一。PKR的另外一個(gè)生物學(xué)功能被假定為信號(hào)轉(zhuǎn)換器，如IkB的磷酸化，可引起核因子kB(NF-kB)的激活和釋放(Kumar A等人，1994)。
以前證明PKR可介導(dǎo)干擾素(IFN)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活(Der D和LauAS，1995)。IFN可表現(xiàn)其生物學(xué)活性，與其同源受體結(jié)合，然后進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起IFN刺激基因((ISGs)的誘導(dǎo)。這樣的ISG被認(rèn)為至少通過(guò)兩種細(xì)胞內(nèi)通路介導(dǎo)IFN的生物學(xué)活性通過(guò)激活特異的核糖體和誘導(dǎo)IFN調(diào)控的雙鏈RNA激活激酶(PKR)。與這種觀察一致，通過(guò)用PKR的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞或表達(dá)PKR缺陷的突變體抑制內(nèi)源PKR活性，可引起IFN對(duì)病毒感染的誘導(dǎo)反應(yīng)消失(Der D和Lau AS，1995)。
總之，與PKR有關(guān)的有(1)對(duì)復(fù)合體受體系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(包括IFN，TNF和Fas)，(2)轉(zhuǎn)錄激活細(xì)胞因子基因，(3)啟動(dòng)凋亡，和(4)通過(guò)磷酸化eIF-2α抑制蛋白合成。PKR的其他活性包括(1)介導(dǎo)IFN-α和IFN-β的抗病毒和抗增殖活性，(2)未感染細(xì)胞對(duì)生理性應(yīng)激的反應(yīng)，和(3)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)(Clemens和Elia，1997；Zamanian-Daryou等人，1999)。
也已經(jīng)證明PKR可作為腫瘤抑制劑和凋亡誘導(dǎo)劑。(見(jiàn)，如Clemens MJ等，1999；Yeung，Lau等人，1996；Koromilas等人，1992)。最近的結(jié)果表明PKR活性形式的表達(dá)可引發(fā)凋亡，可能是通過(guò)上調(diào)Fas受體(Donze O，等人，1999)。
III.凋亡凋亡或程序性細(xì)胞死亡是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)部過(guò)程，是正常發(fā)育的中心部分，被嚴(yán)格地調(diào)控，對(duì)于發(fā)育，宿主的防御和抑制腫瘤形成都是很重要的。(其綜述見(jiàn)Orrenius 1995；Stellar 1995；Vaux 1993)。凋亡在胚胎的發(fā)育(Cohen 1992)，控制器官的形成(Nagata等人，1995；Vaux，1993)，在成體生命中保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面均可對(duì)生物體提供許多益處。一旦形成凋亡，細(xì)胞則經(jīng)歷新輪次的蛋白合成和多種形態(tài)學(xué)/生理學(xué)變化包括細(xì)胞質(zhì)固縮，核染色質(zhì)固縮，膜起泡，最終在核小體間連接部位發(fā)生DNA降解，產(chǎn)生DNA片段，為多個(gè)長(zhǎng)度為180的堿基對(duì)(bp)，檢測(cè)為特征性的寡核小體梯度(Levine AJ，1993)。瀕死的細(xì)胞最終碎裂成與膜結(jié)合的凋亡小體，可迅速被吞噬，被巨噬細(xì)胞或鄰近細(xì)胞消化。
凋亡的作用是一種防御機(jī)制，可去除不必要的和潛在危險(xiǎn)的細(xì)胞，包括病毒感染的細(xì)胞，自體免疫性疾病中的自反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，或惡性細(xì)胞(Oehm等人，1992；Yonehara等人，1989；Vaux，1993)。凋亡已經(jīng)被默認(rèn)為是盡量較少組織中由于頻繁與誘突變化學(xué)品接觸，致癌原或紫外線而產(chǎn)生的癌細(xì)胞發(fā)育危險(xiǎn)的一種方式。
對(duì)腫瘤的進(jìn)一步保護(hù)作用是對(duì)免疫系統(tǒng)激活反應(yīng)而產(chǎn)生的一種前炎性細(xì)胞因子TNF-α提供的。TNF-α可引發(fā)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的凋亡性死亡(Heller，1992，Yeung，1996)。
凋亡的失調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致發(fā)生疾病的過(guò)程(Thompson，1995)。相信這在疾病的發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，這些疾病包括癌癥，AIDS，缺血性中風(fēng)和神經(jīng)變性疾患。有證據(jù)表明抑制細(xì)胞死亡和不當(dāng)?shù)募?xì)胞死亡對(duì)宿主都是有害的，例如神經(jīng)變性疾病包括阿爾茲海姆病和帕金森病，它們都與神經(jīng)元的特殊亞型的過(guò)早死亡有關(guān)(Kosik KS，1992)。細(xì)胞凋亡的不當(dāng)抑制或內(nèi)在缺陷也顯示可導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化(Korsmeyer，1992)。
與凋亡相關(guān)的個(gè)別原癌基因在經(jīng)歷凋亡的過(guò)程中在細(xì)胞中被表達(dá)，據(jù)觀察控制原癌基因的表達(dá)可影響該過(guò)程。原癌基因的實(shí)例包括c-myc，F(xiàn)as(APO-1)，p53，和Bcl-2，另外還有其他基因如ced-3，ced-4，ced-9和Ice(Stellar，1995；Cohen，1993)。
A.PKR和TNF-α在凋亡中的作用TNF是原型的前炎性細(xì)胞因子，是由激活的免疫細(xì)胞在清除病原體，抗病毒活性和破壞腫瘤的過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性蛋白。但是體內(nèi)高水平的TNF-α是有害的，因?yàn)門(mén)NF-α可誘導(dǎo)代謝性障礙，消耗和抑制造血。在細(xì)胞水平，TNF-α可誘導(dǎo)產(chǎn)生超氧化物自由基，激活溶酶體酶(Larrick等人，1990；Liddil等人，1989)，通過(guò)激活核酸內(nèi)切酶斷裂DNA(Rubin等人，1988)，引起凋亡。
多種機(jī)制被用來(lái)解釋TNF-α相關(guān)的凋亡(Dressler等人，1992；Obeid等人，1993)。已經(jīng)顯示(1)TNF-α的處理可引起幾種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶包括PKR的激活；(2)TNF-α和PKR可動(dòng)員NF-kB；(3)PKR在TNF-α的信號(hào)通路中具有關(guān)鍵作用；(4)腫瘤抑制基因p53在TNF-α誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程中具有關(guān)鍵作用。(見(jiàn)，Guy等人，1992；VanLint等人，1992；Yeung和Lau等人，1996)。
凋亡的抑制或延緩本發(fā)明提供了通過(guò)抑制凋亡細(xì)胞死亡的過(guò)程在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中增強(qiáng)細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法。通過(guò)抑制凋亡，在此所描述的細(xì)胞系在培養(yǎng)中具有更長(zhǎng)的生命期，顯示細(xì)胞因子的生物合成增加和/或在細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的時(shí)間增加。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)中修飾細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子或其他蛋白產(chǎn)生的方法，其方式可有效地引起凋亡的抑制或延緩。如在此所描述的，發(fā)明人已經(jīng)觀察到一個(gè)細(xì)胞系的修飾可以能有效抑制或延緩凋亡的方式進(jìn)行，以及一次或多次進(jìn)一步的修飾，引發(fā)和誘導(dǎo)，這樣與在相同條件下沒(méi)有進(jìn)行修飾的親代細(xì)胞系相比，可以達(dá)到正常水平以上的細(xì)胞因子或其他蛋白產(chǎn)量。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生細(xì)胞因子或其他蛋白的方法，包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)染了一個(gè)表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，該載體含有一個(gè)可在宿主細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子，并與編碼一種蛋白的DNA序列可操作地相連，該蛋白的表達(dá)可有效抑制凋亡。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中抑制凋亡細(xì)胞死亡的過(guò)程可通過(guò)任何大量定向抑制凋亡的策略的任何一種來(lái)達(dá)到，包括(1)能夠抑制凋亡的蛋白的過(guò)度表達(dá)，其實(shí)例包括但不限于CrmA，Bcl-2a和Bcl-XL或其同源物，(2)抑制eIF2-α(GenBank登記號(hào)A457497)磷酸化，如通過(guò)eIF2-α的突變形式或真核翻譯起始因子(eIF-3)的過(guò)度表達(dá)，采用同源重組或位點(diǎn)定向誘變通過(guò)突變相應(yīng)的內(nèi)源基因而制備(因此可抑制PKR的下游底物)；(3)抑制內(nèi)源性FADD活性，如通過(guò)FADD突變形式的過(guò)度表達(dá)，采用同源重組或位點(diǎn)定向誘變通過(guò)突變內(nèi)源FADD基因而制備；或(4)使用占優(yōu)勢(shì)的突變體，采用同源重組或位點(diǎn)定向誘變通過(guò)突變一個(gè)內(nèi)源基因獲得Bcl-2a的一種或多種前凋亡體，如BAX(GenBank登記號(hào)L22473)，BAK(GenBank登記號(hào)BE221666)，和/或Bcl-Xs(GenBank登記號(hào)L20122)，或基因切除或刪除一種或多種BAX，BAK，和Bcl-Xs。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面，一個(gè)選擇基因，如CrmA，Bcl-2a，Bcl-XL或其同源物在宿主細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，可引起凋亡細(xì)胞死亡的抑制或延緩。在其他情況下，內(nèi)源基因表達(dá)的抑制可引起凋亡細(xì)胞死亡的抑制或延緩，可被許多方法所影響，這些方法包括但不限于內(nèi)源基因的突變，同源重組或位點(diǎn)定向誘變，基因刪除或基因切除或任何可有效導(dǎo)致靶基因失活或表達(dá)改變的方法。
細(xì)胞的死亡可通過(guò)用亞丙基(PI)對(duì)細(xì)胞染色而進(jìn)行檢測(cè)，或使用凋亡細(xì)胞死亡特異的測(cè)定法，如，用annexin V染色(Vermes等人，1995)。壞死的細(xì)胞死亡可通過(guò)評(píng)價(jià)細(xì)胞活力測(cè)定組合的結(jié)果，以及相應(yīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的顯微鏡觀察來(lái)與凋亡細(xì)胞死亡區(qū)分。
如上面所提到的，可通過(guò)增加本質(zhì)上與可阻斷凋亡過(guò)程相關(guān)的蛋白的表達(dá)來(lái)抑制凋亡。可以選擇地，也可以通過(guò)減少本質(zhì)上與加速凋亡過(guò)程的蛋白的表達(dá)來(lái)抑制凋亡，如通過(guò)以可有效表達(dá)這種蛋白的修飾或變異形式的方式來(lái)修飾細(xì)胞。
A.增強(qiáng)細(xì)胞因子反應(yīng)修飾因子A(CrmA)的表達(dá)痘病毒類(lèi)可編碼幾種細(xì)胞因子反應(yīng)修飾因子(Crm)蛋白，它們具有與許多對(duì)免疫反應(yīng)很重要的人類(lèi)蛋白同源的序列(Zhou Q等人，1997；Dbaibo GS等人，1998)。牛痘病毒細(xì)胞因子反應(yīng)修飾因子A(CrmA)可抑制絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶(Tewan，M等人，1995)，并已經(jīng)被證明是凋亡的一個(gè)有效抑制劑，其中凋亡的誘導(dǎo)是通過(guò)去除血清(Nicholson，D.W等人，1995)，F(xiàn)as或TNF受體的激活(Kostura，MJ等人，1989；Chinnaiyan，AM等人，1996)，或在原代雞神經(jīng)元培養(yǎng)中去除神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Orth，K等人，1996)。CrmA已經(jīng)顯示具有優(yōu)選的活性，可作為IL-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(Muzio，M等人，1996)，也顯示對(duì)在凋亡過(guò)程中參與的ICE家族的其他成員的蛋白分解酶活性有較低的有效抑制作用。(見(jiàn)，如Dbaibo GS等人，1998和Dbaibo GS等人，1997。)屬于IL-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)1家族的的蛋白酶被認(rèn)為是凋亡過(guò)程的中心，部分是根據(jù)以下的觀察結(jié)果當(dāng)這些蛋白酶以活性形式過(guò)度表達(dá)時(shí)凋亡被誘導(dǎo)(Miura，M等人，1993)；當(dāng)這些蛋白酶被特異抑制時(shí)，凋亡被抑制(Tewari，M等人，1995)。
神經(jīng)酰胺鞘氨酯最近被顯示在許多不同的系統(tǒng)中是一個(gè)有效的凋亡誘導(dǎo)物。(見(jiàn)，如Brenner B等人，1998和Wegenknecht B等人，1998)。另外，TNF-α，F(xiàn)as連接，去除血清，一些化學(xué)治療劑和γ-照射(所有這些據(jù)報(bào)道均可誘導(dǎo)凋亡)已經(jīng)顯示可增加神經(jīng)酰胺的細(xì)胞水平，表明神經(jīng)酰胺的生物學(xué)活性對(duì)于許多凋亡誘導(dǎo)物所共有的通路是普遍的(Jayadev，S等人，1995；Haimovitz-Friedman，A等人，1994；和Tepper，C.G等人，1995)。
來(lái)自Fas和TNF-α受體1的凋亡死亡信號(hào)已經(jīng)被觀察到通過(guò)FADD起作用，含有“致死功能區(qū)”的蛋白屬于信號(hào)分子的新家族，與TNF-α受體家族的成員有關(guān)。FADD的顯性失活突變體的表達(dá)顯示可抑制神經(jīng)酰胺的積累，ICE相關(guān)的蛋白酶的激活，和用Fas抗體處理后的凋亡。外源提供的神經(jīng)酰胺能夠繞過(guò)這種阻斷作用，產(chǎn)生凋亡(Chinnaiyan，A.M.等人，1996)。
用TNF-α處理后在MCF-7細(xì)胞中神經(jīng)酰胺的積累被觀察到可完全被CrmA抑制，表明CrmA可靶向作用于對(duì)TNF-α反應(yīng)而產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的上游凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。外源神經(jīng)酰胺顯示可通過(guò)CrmA繞過(guò)這種阻斷作用，并產(chǎn)生凋亡(Dbaibo等人，1997)。
相對(duì)比的是，Bcl-2可保護(hù)TNF-α和神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，但不干擾神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生，表明它進(jìn)一步作用于神經(jīng)酰胺通路的下游(Dbaibo等人，1997)。
B.增強(qiáng)Bcl-2，Bcl-XL或其同源物的表達(dá)Bcl-2家族成員已經(jīng)顯示可作為凋亡的抑制劑或促進(jìn)劑。Bcl-2是作為一條基因被發(fā)現(xiàn)的，其表達(dá)可通過(guò)在B細(xì)胞腫瘤中染色體轉(zhuǎn)位而增加(由Reed進(jìn)行了廣泛的綜述)。Bcl-2已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)濾泡性非何杰金氏淋巴瘤中是激活的，在其他惡性腫瘤中如前列腺癌中出現(xiàn)頻率較低。其激活在一些良性病變?nèi)鐬V泡性淋巴結(jié)和扁桃體增生中也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了。
在多種類(lèi)型細(xì)胞包括但不限于淋巴細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，神經(jīng)元和造血細(xì)胞，Bcl-2的表達(dá)已經(jīng)顯示可延緩或甚至阻止凋亡。相反地，Bcl-2在許多這些系統(tǒng)中的下調(diào)已經(jīng)顯示可促進(jìn)凋亡。Bcl-2是一個(gè)膜相關(guān)蛋白，典型地可在完整細(xì)胞的核包膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體上發(fā)現(xiàn)。
Bcl-2家族的基因產(chǎn)物一般涉及凋亡過(guò)程。Bcl-2a和Bcl-XL被認(rèn)為是抗凋亡蛋白(Boise和Thompson，1995；Schendel，1998)，以前對(duì)淋巴細(xì)胞和髓樣細(xì)胞的研究表明Bcl-2a在維持細(xì)胞生長(zhǎng)和防止細(xì)胞死亡方面具有一定作用(Cohen，1993)。另外，Bcl-2a在防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面具有明顯的作用(Garcia等人，1992)，可能是通過(guò)減少活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生(Kane等人，1993)。
許多細(xì)胞的活力依賴(lài)細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子的持續(xù)或間斷供應(yīng)。在缺乏這樣的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子的情況下，細(xì)胞發(fā)生凋亡。Bcl-2家族的蛋白是細(xì)胞因子所介導(dǎo)的凋亡過(guò)程所必須的。當(dāng)細(xì)胞因子被去除后，Bcl-2和Bcl-XL的過(guò)度表達(dá)已經(jīng)顯示可抑制凋亡。BAX和BAK的過(guò)度表達(dá)已經(jīng)顯示可抵消來(lái)自細(xì)胞因子受體的信號(hào)，并誘導(dǎo)凋亡。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例應(yīng)用中，過(guò)度表達(dá)Bcl-2的細(xì)胞可通過(guò)用一個(gè)pSV-2-Bcl2表達(dá)載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞系而產(chǎn)生(Reed等人，1988；Reed等人，1981)。過(guò)度表達(dá)Bcl-2的細(xì)胞被產(chǎn)生，選擇，并進(jìn)一步以可有效產(chǎn)生細(xì)胞因子或其他蛋白的方式被培養(yǎng)，然后培養(yǎng)物被分析細(xì)胞因子或蛋白的產(chǎn)量，進(jìn)一步在下面實(shí)例4中描述。
C.抑制eIF2-α磷酸化已證實(shí)，PKR在包括前單核細(xì)胞U937細(xì)胞的細(xì)胞中對(duì)TNF-誘導(dǎo)的和p53-介導(dǎo)的凋亡起重要的作用。(Yeung，M.C.，等人，1996；Yeung，M.，和Lau，A.S.，1998)。通過(guò)用PKR-反義或PKR-突變體的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U937細(xì)胞，抑制PKR活性，使細(xì)胞對(duì)TNF或內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有更大的抗性。由于eIF-2α是PKR的生理學(xué)底物，已經(jīng)表明它被PKR的磷酸化足以導(dǎo)致凋亡。
始終地，TNF-誘導(dǎo)的凋亡與eIF-2的α亞單位的磷酸化增加相關(guān)(Srivastave，等人，1998)。
如上所述，eIF-2α磷酸化后是抑制細(xì)胞和病毒蛋白合成的原因。通過(guò)因子磷酸化位點(diǎn)突變抑制PKR-介導(dǎo)的eIF-2α磷酸化后，提供了抑制PKR過(guò)度表達(dá)影響培養(yǎng)細(xì)胞系凋亡的方法。
在強(qiáng)病毒啟動(dòng)子的控制下，采用含eIF-2α修飾形式的編碼序列的載體，在淋巴細(xì)胞中表達(dá)了eIF-2α蛋白的變異體。表達(dá)修飾形式eIF-2a的細(xì)胞被產(chǎn)生、選擇和以有效地引起細(xì)胞因子或其它目的蛋白產(chǎn)生的方式進(jìn)一步培養(yǎng)，并分析細(xì)胞因子或其它目的蛋白的生物合成(數(shù)據(jù)未展示)。
D.抑制內(nèi)源性FADD活性Fas受體是TNF和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體超家族的成員(Stellar，1995)。在Fas配基與Fas受體結(jié)合后，通過(guò)直接的下游效應(yīng)器包括FADD、FLICE和TRADD，啟動(dòng)凋亡。FADD是具有致死功能區(qū)的胞漿蛋白，該功能區(qū)對(duì)于CD 95配基和TNF誘導(dǎo)的凋亡是至關(guān)重要的。
這些蛋白與其各自受體的結(jié)合引起caspase蛋白酶級(jí)聯(lián)的活化并加速凋亡。以往已經(jīng)證實(shí)，NIH-3T3細(xì)胞中，F(xiàn)as表達(dá)及隨后的凋亡是受PKR活性調(diào)節(jié)的(Donze，等人，1999)。在用PKR激酶活性缺陷的顯性失活突變體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，F(xiàn)as、TNFR-1、FADD(Fas伴隨的致死功能區(qū))、FLICE、Bad和BAX的表達(dá)被抑制，細(xì)胞對(duì)凋亡-誘導(dǎo)劑有抗性。另外，缺少FADD的小鼠成纖維細(xì)胞幾乎抵抗dsRNA-介導(dǎo)的細(xì)胞死亡(Balachandran，等人，1998)。
變異體、無(wú)功能的人和小鼠FADD基因產(chǎn)自野生型FADD基因(Chinnaiyen，等人，1995；Yeh，等人，1998)。突變體基因已被用于產(chǎn)生FADD活性缺陷的小鼠FADD-/-細(xì)胞，其結(jié)果對(duì)PKR-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有抗性(Balachandran，等人，1998)。結(jié)果提示，F(xiàn)as-介導(dǎo)的細(xì)胞死亡過(guò)程在表達(dá)修飾的FADD基因的細(xì)胞中被抑制或消除，使凋亡得到抑制，且此無(wú)活性形式FADD的抑制效果不被PKR活化所阻止。
為在實(shí)踐本發(fā)明中使用，突變的FADD cDNA序列被插入載體中，該載體在強(qiáng)病毒啟動(dòng)子的控制下有效地表達(dá)插入的片段。表達(dá)修飾形式FADD的細(xì)胞被產(chǎn)生、選擇、和以有效地引起細(xì)胞因子產(chǎn)生的方式進(jìn)一步培養(yǎng)，并分析細(xì)胞因子或其它目的蛋白的生物合成(數(shù)據(jù)未展示)。
E.抑制Bcl-2的前凋亡對(duì)應(yīng)物一般，BAX、BAK、Bcl-Xs和其它者是前凋亡蛋白(Boise和Thompson，1998)。BAX、BAK和Bcl-Xs的過(guò)度表達(dá)已顯示壓制了來(lái)自與細(xì)胞活力相關(guān)的細(xì)胞因子-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的信號(hào)，并引起凋亡。
突變的或變異體人BAX、BAK或Bcl-Xs cDNA序列可被插入到有效表達(dá)插入片段的載體中。于是，表達(dá)修飾形式人BAX、BAK或Bcl-Xs的細(xì)胞被產(chǎn)生、選擇和以有效地引起細(xì)胞因子或其它目的蛋白產(chǎn)生的方式進(jìn)一步培養(yǎng)，然后分析細(xì)胞因子或其它目的蛋白的生物合成(數(shù)據(jù)未展示)，如下所述。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在實(shí)踐本發(fā)明中所用的修飾的eIF-2a、FADD、Bcl-Xs、BAK或BAX蛋白是在自然中發(fā)現(xiàn)的其各自蛋白的衍生或變異體形式。即，衍生的多肽或蛋白含有至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或插入。氨基酸的取代、插入或刪除可發(fā)生在多肽或蛋白氨基酸序列中的任何殘基上，只要它干擾了蛋白的生物學(xué)活性。
這種天然蛋白的修飾或變異體的形式一般是通過(guò)對(duì)編碼eIF-2a、FADD、Bcl-Xs、BAK或BAK蛋白的核酸序列中的一種或多種核苷酸進(jìn)行位點(diǎn)特異的誘變而制備的，采用試劑盒或PCR誘變或本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)產(chǎn)生編碼修飾或變異體蛋白的DNA，此后在細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)重組形式的DNA。
位點(diǎn)特異的誘變提供了在編碼特定蛋白的DNA中引入一種或多種核苷酸序列改變的方法。位點(diǎn)特異的誘變技術(shù)通常為本領(lǐng)域已知，并典型地應(yīng)用一個(gè)可以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體。
應(yīng)當(dāng)理解，這里描述的天然蛋白的突變體、修飾或變異體形式可以通過(guò)適當(dāng)核酸序列的點(diǎn)或位點(diǎn)定向的誘變，或通過(guò)同源重組(敲入或敲除)實(shí)現(xiàn)靶基因或相應(yīng)蛋白功能或活性的抑制。
在一個(gè)作為舉例的方法中，編碼修飾的eIF-2a、FADD、Bcl-Xs、BAK或BAK蛋白的酵母和人型基因的cDNA序列，在啟動(dòng)子控制下被分別地插入表達(dá)載體中。啟動(dòng)子的范例包括結(jié)構(gòu)性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，其實(shí)例包括CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、EF-1α啟動(dòng)子、如所在描述的在tet-開(kāi)或tet-關(guān)系統(tǒng)中含tet反應(yīng)元件(TRE)的啟動(dòng)子(ClonTech and BASF)、β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和可以通過(guò)添加某些金屬鹽類(lèi)而上調(diào)的金屬硫因啟動(dòng)子。
當(dāng)變異體或突變體、無(wú)功能的人BAX、BAK或Bcl-Xs基因被摻入異源核酸構(gòu)建物中并用于產(chǎn)生分別缺少BAX、BAK或Bcl-Xs活性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí)，凋亡被抑制。這種生物學(xué)無(wú)活性形式的BAX、BAK或Bcl-Xs對(duì)凋亡的抑制作用，提供了阻止細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子如PKR對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞系中凋亡細(xì)胞死亡的過(guò)度表達(dá)的刺激作用的方法。
V.增強(qiáng)的細(xì)胞因子活性、表達(dá)或產(chǎn)生A.細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的過(guò)度表達(dá)在一個(gè)方法中，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)增強(qiáng)被用來(lái)增加細(xì)胞因子的活性、表達(dá)或產(chǎn)生。一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的表達(dá)高于正常構(gòu)成水平，或其中細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的表達(dá)可被誘導(dǎo)到高于正常水平的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，因此被用于生產(chǎn)細(xì)胞因子。
用于產(chǎn)生特定細(xì)胞因子的細(xì)胞可以從任何哺乳動(dòng)物來(lái)源過(guò)度表達(dá)一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子，如PKR。
例如，含PKR-編碼核酸序列的載體可被引入細(xì)胞，引起細(xì)胞PKR的過(guò)度表達(dá)。在這種載體中使用的編碼序列的范例包括但不限于，在GenBank登記號(hào)第M35663中發(fā)現(xiàn)的來(lái)自人p68 PKR基因的編碼序列，小鼠PKR基因，在兔網(wǎng)狀細(xì)胞或人外周血單核細(xì)胞中正常發(fā)現(xiàn)的PKR形式，和其它eIF-2-α激酶包括酵母GCN2和氯高鐵血紅素調(diào)節(jié)抑制子(Wek RC，1994)。在優(yōu)選的方法中，PKR的人p68激酶形式在人細(xì)胞系中過(guò)度表達(dá)。
在某些情況下，一種或多種過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子是天然型細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的突變體、變異體形式或類(lèi)似物，如，就PKR而言，非天然的蛋白激酶可以介導(dǎo)細(xì)胞因子的dsRNA活化和其它蛋白轉(zhuǎn)錄(通常通過(guò)修飾編碼天然PKR蛋白的基因而獲得)。通過(guò)表達(dá)，特定細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的突變體或變異體形式可具有增加的或減少的活性。
按照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在過(guò)度表達(dá)實(shí)例的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞中，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，可提高細(xì)胞的活力，引起細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加。(見(jiàn)實(shí)例1和4)特別關(guān)于PKR，PKR抑制子p53的抑制已經(jīng)顯示引起PKR活性的增強(qiáng)(Tan SL，等人，1998)?？蛇x擇地，去除血清和生長(zhǎng)因子如IL-3可被用于在細(xì)胞中誘導(dǎo)PKR活性，或者可通過(guò)調(diào)節(jié)因子增加PKR的表達(dá)，該調(diào)節(jié)因子與控制PKR-編碼核酸序列表達(dá)的啟動(dòng)子相互作用。關(guān)于內(nèi)源性PKR-編碼核酸序列的表達(dá)，調(diào)節(jié)因子的實(shí)例包括干擾素誘導(dǎo)的GAS元件、IL-6敏感的NF-IL6和APRF元件和KF-kB元件。(見(jiàn)，如，Jagus R.等人，1999和Williams BR，1999.)B.細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)細(xì)胞系的產(chǎn)生細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)或過(guò)度產(chǎn)生的細(xì)胞可以通過(guò)以下方法獲得(i)能夠表達(dá)一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的親代細(xì)胞系的有限稀釋克隆，篩選細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生，并選擇細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生至少增加2倍(2×)的亞克隆；或(ii)在有效地引起細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生至少增加2倍(2×)的條件下，通過(guò)將細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子-編碼核酸序列引入細(xì)胞以修飾能夠表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的親代細(xì)胞系。
隨之，PKR過(guò)度表達(dá)或過(guò)度產(chǎn)生的細(xì)胞可以通過(guò)以下方法獲得(i)能夠表達(dá)PKR的親代細(xì)胞系有限稀釋克隆，篩選PKR的活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生，并選擇PKR活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生至少增加2倍(2×)的亞克?。换?ii)在有效地引起PKR的活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生至少增加2倍(2×)的條件下，通過(guò)將PKR的編碼核酸序列引入細(xì)胞以修飾能夠表達(dá)PKR的親代細(xì)胞系，如共有的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)第09/657,881中所進(jìn)一步描述的，在此特別加入以供參考。
1.增加內(nèi)源性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了過(guò)度表達(dá)或過(guò)度產(chǎn)生內(nèi)源性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子編碼序列的天然細(xì)胞系，并用這種細(xì)胞系來(lái)產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子。
在此實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選的方面，過(guò)度表達(dá)或過(guò)度產(chǎn)生內(nèi)源性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的天然細(xì)胞系通過(guò)用抗凋亡基因和/或引發(fā)和/或誘導(dǎo)作用轉(zhuǎn)化細(xì)胞而被修飾，以增強(qiáng)細(xì)胞的細(xì)胞因子生成。
在實(shí)踐本方法中，能夠表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和一種或多種細(xì)胞因子的細(xì)胞系(這里是指＂親代細(xì)胞系＂)被鑒定，并采用本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行單細(xì)胞的有限稀釋克隆。通常，在96孔板內(nèi)亞克隆步驟至少進(jìn)行3次，優(yōu)選地至少5次，典型地5至10次。亞克隆采用典型地用于培養(yǎng)親代細(xì)胞系的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)以獲得大約0.3至0.5百萬(wàn)細(xì)胞/ml的群落。然后，采用本領(lǐng)域已知的用于特定細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的方法，通過(guò)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)錄(mRNA)和/或蛋白水平(Western印跡)和/或生物學(xué)活性，檢測(cè)亞克隆中細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。
作為實(shí)例，PKR活性的測(cè)定包括自磷酸化測(cè)定(Der等人，1995)，eIF2α磷酸化的測(cè)定(Zamanian-Daryoush，等人，1999)，激酶試驗(yàn)(通過(guò)PKR的免疫沉淀完成和激酶的體外測(cè)定(Zamanian-Daryoush，等人，2000)。
通常可應(yīng)用于分析細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)和/或產(chǎn)生的測(cè)定實(shí)例，包括蛋白測(cè)定如Western印跡，和mRNA檢測(cè)如RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、Northern印跡、斑點(diǎn)印跡，或采用根據(jù)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子-編碼核酸序列的適當(dāng)標(biāo)記探針進(jìn)行原位雜交。
細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)或產(chǎn)生的水平比親代細(xì)胞系高至少2倍(2×)，優(yōu)選地是3倍(3×)、4倍(4×)、5倍(5×)或更高的亞克隆被選擇。在某些情況下，這樣選擇的亞克隆具有比親代細(xì)胞系高10倍(10×)以上的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)或產(chǎn)生水平。
然后，選擇的亞克隆被修飾和/或以有效地引起細(xì)胞因子產(chǎn)生增加的方式處理。被修飾通常是指用抗凋亡基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞，而處理通常是指引發(fā)和/或誘導(dǎo)以增加細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，如下面進(jìn)一步詳述的。
2.細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子-編碼核酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)本發(fā)明還提供了用含細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子-編碼核酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。培養(yǎng)條件如溫度、pH等以前用于轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染前的親代細(xì)胞系，并為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所理解。
在一個(gè)方法中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系用表達(dá)載體被轉(zhuǎn)染，表達(dá)載體含有可操作地連接編碼PKR的DNA片段的啟動(dòng)子、或有生物學(xué)活性的啟動(dòng)子片段或在宿主細(xì)胞系中起作用的一種或多種(如，系列)增強(qiáng)子，以使PKR在細(xì)胞系中過(guò)度表達(dá)。
在此方法的一個(gè)優(yōu)選方面，細(xì)胞首選用含抗凋亡基因的載體被轉(zhuǎn)染，選擇并成功的轉(zhuǎn)化株被進(jìn)一步修飾以產(chǎn)生過(guò)度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞系。
細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的過(guò)度表達(dá)是指細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性高于正常水平。通常為了觀察未被用編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的載體轉(zhuǎn)染、未被引發(fā)或誘導(dǎo)和未被感染的相應(yīng)親代細(xì)胞系，典型地，＂正常的＂細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性或表達(dá)被報(bào)告為細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性或表達(dá)的范圍?？梢岳斫?，特定類(lèi)型細(xì)胞的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性范圍可依培養(yǎng)條件而有些不同。
高于正常的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)是指相應(yīng)親代細(xì)胞系的正常細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生或表達(dá)水平的至少150％，優(yōu)選地至少200％、300％或400％，更優(yōu)選地500％或以上。細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞系可以是結(jié)構(gòu)性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)或誘導(dǎo)性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)。
在一個(gè)優(yōu)選的方法中，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)細(xì)胞系可被誘導(dǎo)過(guò)度表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子，以調(diào)節(jié)可用于誘導(dǎo)細(xì)胞因子的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子水平。
C.細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加雖然細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)增強(qiáng)在這里被描述為增加細(xì)胞因子活性、表達(dá)或產(chǎn)生的方法，應(yīng)當(dāng)理解，為了增加細(xì)胞因子活性、表達(dá)或產(chǎn)生，不必要調(diào)節(jié)或直接地增加細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。
在一個(gè)可選擇的方法中，插入或不插入異源核酸構(gòu)建物都可以增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生，異源核酸構(gòu)建物編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子(如PKR、IRF-3、IRF-7、NF-KB或另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子)或編碼抗凋亡蛋白。在一個(gè)實(shí)例中，這是通過(guò)選擇抗凋亡蛋白表達(dá)增強(qiáng)的細(xì)胞系來(lái)實(shí)現(xiàn)的，如CrmA表達(dá)水平增強(qiáng)的細(xì)胞系，通過(guò)亞克隆選擇。這種細(xì)胞系可以在亞克隆選擇前或后通過(guò)引導(dǎo)編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的異源核酸構(gòu)建物而被修飾。
如這里詳述的，采用適當(dāng)?shù)姆椒▽W(xué)通過(guò)引發(fā)和/或誘導(dǎo)被處理的細(xì)胞具有細(xì)胞因子產(chǎn)生的增加。換言之，本發(fā)明包括了增加細(xì)胞因子活性、表達(dá)或產(chǎn)生的方法和合成物，但不包括增強(qiáng)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)的細(xì)胞選擇或修飾。但是應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)細(xì)胞在引起細(xì)胞因子產(chǎn)生增加的適當(dāng)條件下被引發(fā)和/或誘導(dǎo)時(shí)，可以發(fā)生這種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)的增強(qiáng)。
增加的或＂高于正常的＂細(xì)胞因子活性、產(chǎn)生或表達(dá)是指相應(yīng)親代細(xì)胞系所具有的細(xì)胞因子活性、產(chǎn)生或表達(dá)水平的至少150％，優(yōu)選地至少200％、300％或400％，更優(yōu)選地500％或以上。具有增加的或＂高于正常的＂細(xì)胞因子活性、產(chǎn)生或表達(dá)的細(xì)胞系可以是結(jié)構(gòu)性細(xì)胞因子表達(dá)或誘導(dǎo)性細(xì)胞因子表達(dá)。
VI.凋亡的抑制和細(xì)胞因子表達(dá)和產(chǎn)生的增加相似地，為了調(diào)節(jié)凋亡以及使細(xì)胞因子的產(chǎn)量達(dá)到最佳的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)，用于實(shí)踐本發(fā)明的細(xì)胞系可被誘導(dǎo)過(guò)度表達(dá)干擾凋亡過(guò)程的蛋白。
A.抑制凋亡通常，通過(guò)抑制細(xì)胞系中的凋亡可以增加細(xì)胞因子產(chǎn)生，該細(xì)胞系的特征是一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和一種或多種細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用第一個(gè)異源核酸構(gòu)建物或表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，它們?cè)诘谝粋€(gè)啟動(dòng)子的控制下在細(xì)胞中有效地表達(dá)能夠抑制凋亡的蛋白的編碼序列。能夠抑制凋亡的蛋白實(shí)例包括但不限于，CrmA、Bcl-2a、Bcl-XL、修飾形式的真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子2α(eIF-2α)或真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子(eIF-3)、修飾形式的Fas-相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)區(qū)(FADD)、修飾形式的Bcl-Xs、修飾形式的Bcl-2-同系拮抗劑/扼殺劑(BAK)和修飾形式的BAX，如Bcl-2a或Bcl-XL。
在此實(shí)施方案的一個(gè)方面，相同的細(xì)胞系以如下方式被修飾(i)有效地表達(dá)能夠抑制凋亡的蛋白(＂抗凋亡＂蛋白)的編碼序列；和(ii)有效地表達(dá)一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子如PKR的編碼序列。通常，編碼序列作為獨(dú)立的異源核酸構(gòu)建物被引入細(xì)胞。例如，第一個(gè)異源核酸構(gòu)建物或表達(dá)載體典型地會(huì)包括抗凋亡蛋白如CrmA的編碼序列、第一個(gè)啟動(dòng)子和第一個(gè)編碼可選擇標(biāo)記物的核酸序列。相似地，第二個(gè)異源核酸構(gòu)建物或表達(dá)載體典型地會(huì)包括一種或多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子如PKR的編碼序列、第二個(gè)啟動(dòng)子和第二個(gè)編碼可選擇標(biāo)記物的核酸序列。但是，兩個(gè)編碼序列都可以用單一載體被引入細(xì)胞。
在本發(fā)明這個(gè)方面的實(shí)踐中，細(xì)胞可以(1)用單一載體轉(zhuǎn)染，載體含編碼抗凋亡蛋白的第一個(gè)編碼序列、第一個(gè)啟動(dòng)子、第一個(gè)編碼可選擇標(biāo)記物的核酸序列和編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的第二個(gè)編碼序列、第二個(gè)啟動(dòng)子和第二個(gè)編碼可選擇標(biāo)記物的核酸序列；(2)用第一和第二個(gè)表達(dá)載體(如上所述)同時(shí)轉(zhuǎn)染；(3)用第一個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，然后用第二個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所選擇的細(xì)胞并選擇雙重轉(zhuǎn)化株；(4)用第一個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，僅選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；或(5)用第二個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，然后用第一個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所選擇的細(xì)胞并選擇雙重轉(zhuǎn)化株。
在優(yōu)選的方法中，按上面(1)-(5)的任何之一的描述制備的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系被引發(fā)和/或誘導(dǎo)以進(jìn)一步增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如下面進(jìn)一步描述的。
B.處理細(xì)胞以進(jìn)一步增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生在本發(fā)明的另一個(gè)方面，表達(dá)有效抑制凋亡的蛋白的細(xì)胞系以有效地引起細(xì)胞因子產(chǎn)生增加的方式被引發(fā)和/或處理(誘導(dǎo))。
在細(xì)胞系以有效地引起細(xì)胞因子產(chǎn)生增加的方式接受一種或多種選擇、修飾、引發(fā)和處理(誘導(dǎo))之前或之后，細(xì)胞系可以有效地抑制凋亡的方式被修飾。
在一個(gè)優(yōu)選的方法中，該方法包括(a)通過(guò)引導(dǎo)含抗凋亡蛋白編碼序列，如編碼CrmA的基因，的異源核酸構(gòu)建物進(jìn)入細(xì)胞系細(xì)胞，以有效地抑制凋亡的方式修飾能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞系，并進(jìn)一步通過(guò)引導(dǎo)外源細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的編碼核酸序列進(jìn)入細(xì)胞，以有效地表達(dá)因子的方式修飾細(xì)胞系，以及培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞系，該細(xì)胞系也表達(dá)抗凋亡基因；或(b)選擇過(guò)度表達(dá)內(nèi)源性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子編碼核酸序列的細(xì)胞，并培養(yǎng)該細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞系，進(jìn)一步通過(guò)引導(dǎo)含抗凋亡蛋白編碼序列，如編碼CrmA的基因，的異源核酸構(gòu)建物進(jìn)入細(xì)胞系的細(xì)胞，以有效地抑制凋亡的方式來(lái)修飾細(xì)胞系，以產(chǎn)生細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)同時(shí)表達(dá)抗凋亡基因的細(xì)胞系；或(d)選擇高水平表達(dá)內(nèi)源性抗凋亡基因如CrmA同系物的細(xì)胞；或(e)選擇高水平表達(dá)內(nèi)源性抗凋亡基因如CrmA同系物的細(xì)胞，并進(jìn)一步通過(guò)引導(dǎo)外源細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的編碼核酸序列進(jìn)入細(xì)胞，以有效地表達(dá)因子的方式修飾細(xì)胞系，培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)同時(shí)表達(dá)抗凋亡基因的細(xì)胞系；和/或(f)引發(fā)和/或誘導(dǎo)。
引發(fā)是一個(gè)熟知的現(xiàn)象，當(dāng)與處理或誘導(dǎo)一起應(yīng)用時(shí)，通過(guò)用引發(fā)劑預(yù)處理細(xì)胞引起一種或多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加。引發(fā)劑的實(shí)例包括但不限于，醋酸佛波醇豆蔻酯(PMA)和其它佛波醇酯類(lèi)，鈣粒子載體，干擾素-α，干擾素-γ，干擾素-β，G-CSF，GM-CSF， PDGF，TGF，EGF或趨化因子(IL-8，MCP或MIP)，丁酸鈉，內(nèi)毒素，激酶激活劑(如PKR、PACT的蛋白激活劑)，或轉(zhuǎn)錄激活劑(NF-KB，IRF類(lèi)包括IRF-3和LRF-7)。適合的引發(fā)劑濃度可在科學(xué)文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，如PMA濃度范圍5-50nM，優(yōu)選地大約10nM，是適合的。
誘導(dǎo)或處理是指在細(xì)胞培養(yǎng)中添加微生物(如病毒，細(xì)菌，或真菌)誘導(dǎo)劑，能夠作為誘導(dǎo)劑的微生物提取物(如內(nèi)毒素或含細(xì)菌胞壁的提取物)，或非微生物誘導(dǎo)劑。
非微生物誘導(dǎo)的方法實(shí)例包括但不限于，接觸雙鏈RNA(dsRNA)如poly(I)poly(C)或poly r(I)poly r(C)(polyIC)；接觸小分子如，聚陰離子，硫酸肝素葡聚糖，硫酸軟骨素，放線菌酮，放線菌素D，鈣離子載體或丁酸鈉；以及接觸細(xì)胞因子。
病毒誘導(dǎo)的方法實(shí)例包括但不限于，(1)接觸活病毒如，仙臺(tái)病毒，腦心肌炎病毒或單純皰疹病毒；(2)接觸上述滅活的病毒；或(3)接觸分離的雙鏈病毒RNA。此外，通過(guò)將已知刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生的特殊細(xì)胞因子加入某些細(xì)胞中可以產(chǎn)生或加強(qiáng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)。
添加誘導(dǎo)劑后，典型地，細(xì)胞被進(jìn)一步孵育直至達(dá)到所需的誘導(dǎo)水平并獲得分泌的細(xì)胞因子。在37℃孵育至少12-48小時(shí)，直至72-96小時(shí)一般是足夠的。
在本方法的一個(gè)應(yīng)用實(shí)例中，細(xì)胞用IFN-β引發(fā)大約24 hr，隨后接觸含polyIC和放線菌酮的培養(yǎng)基大約5hrs，在最后1小時(shí)內(nèi)加入放線菌素D至終濃度。
在本方法的另一個(gè)應(yīng)用實(shí)例中，細(xì)胞用IFN-β引發(fā)大約24hr，然后通過(guò)用病毒誘導(dǎo)劑如仙臺(tái)病毒(SV)處理大約1hr來(lái)誘導(dǎo)，隨后接觸含polyIC和放線菌酮的培養(yǎng)基大約5hrs，在最后1小時(shí)內(nèi)加入放線菌素D至終濃度。
實(shí)例1描述了表達(dá)CrmA的細(xì)胞系的產(chǎn)生，及其超誘導(dǎo)和病毒誘導(dǎo)。實(shí)例2描述了載體的實(shí)例，轉(zhuǎn)染方法和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞系的產(chǎn)生，該細(xì)胞系還表達(dá)抗凋亡蛋白，Bcl-XL，適合用于實(shí)踐本發(fā)明。實(shí)例3通過(guò)實(shí)例的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)細(xì)胞系和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)同時(shí)表達(dá)抗凋亡蛋白的細(xì)胞系描述了細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
VII.表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化A.表達(dá)載體作為實(shí)例，異源核酸構(gòu)建物或表達(dá)載體為產(chǎn)生表達(dá)CrmA，Bcl-XL和PKR的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系而制備(見(jiàn)實(shí)施例1和2)。特別地，從商業(yè)來(lái)源獲得能夠引入選擇的人細(xì)胞并在其中復(fù)制的適合質(zhì)?；蚱渌d體是載體構(gòu)建領(lǐng)域熟知的，其中的質(zhì)粒還可以裝配有可選擇的標(biāo)記物、插入位點(diǎn)和適合的調(diào)控元件如終止序列。質(zhì)?？梢杂谢驔](méi)有其自己的啟動(dòng)子，或啟動(dòng)子可以在標(biāo)準(zhǔn)載體中交換。
用于實(shí)踐本發(fā)明的異源核酸構(gòu)建物或表達(dá)載體包括單獨(dú)的抗凋亡蛋白編碼序列或與細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的編碼序列聯(lián)合。應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語(yǔ)＂抗凋亡蛋白＂可以指直接抑制凋亡的蛋白(如CrmA，Bcl-2a或Bcl-XL)或與凋亡相關(guān)的修飾形式的蛋白(如，修飾形式的真核細(xì)胞eIF-2α，eIF-3，F(xiàn)ADD，Bcl-Xs，BAK，或BAX如Bcl-2a或Bcl-XL)。
這種編碼序列的變異體形式、片段及其剪接變異體包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，載體可以包括獨(dú)立的編碼序列或聯(lián)合其他的編碼序列如融合蛋白或信號(hào)肽編碼序列。
用于實(shí)踐本發(fā)明的載體構(gòu)建采用本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員已知的切割、連接和細(xì)菌轉(zhuǎn)化標(biāo)準(zhǔn)方法。一般見(jiàn)于Maniatis，等人，1989；Ausubel，F(xiàn).M.，等人，1993；和Gelvin，S.B.，等人，1990，它們?nèi)吭诖颂貏e地合并為參考文獻(xiàn)。這里公開(kāi)的載體和方法適合于表達(dá)抗凋亡蛋白和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的編碼序列。任何載體都可以使用，只要它可復(fù)制并在它所引入的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可有活力的。大量適合的載體和啟動(dòng)子為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員已知，并可以從商業(yè)上獲得。用于人細(xì)胞的適合克隆和表達(dá)載體也被描述于Sambrook等人，1989，和Ausubel FM等人，1989，在此特別地合并為參考文獻(xiàn)。適當(dāng)?shù)腄NA序列可以通過(guò)各種方法插入質(zhì)粒或載體(在此合稱(chēng)為＂載體＂)中。通常，DNA序列通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法插入適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)中。此方法和相關(guān)的亞克隆方法相信在本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
本發(fā)明依賴(lài)于使用含編碼上面描述的一條或多條序列的核酸的異源核酸構(gòu)建物。該構(gòu)建物包含載體如質(zhì)?；虿《据d體，其中以正或反方向插入了本發(fā)明的序列。
載體典型地裝配有可選擇的標(biāo)記物、插入位點(diǎn)和適合的調(diào)控元件如終止序列。載體可含有對(duì)編碼序列在宿主細(xì)胞中(和/或在一般不表達(dá)修飾的可溶性蛋白抗原編碼序列的載體或宿主細(xì)胞環(huán)境中)的表達(dá)有作用的調(diào)節(jié)序列，包括例如，非編碼序列如內(nèi)含子和調(diào)控元件，即啟動(dòng)子和終止子元件或5′和/或3′非翻譯區(qū)，可操作地與編碼序列相連接。
啟動(dòng)子可以是結(jié)構(gòu)性的或誘導(dǎo)性的，可以是天然存在的、基因工程的或雜交的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的實(shí)例包括結(jié)構(gòu)性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，其實(shí)例是CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、EF-1α啟動(dòng)子、如所描述的在tet-on或tet-off系統(tǒng)中含tet反應(yīng)元件(TRE)的啟動(dòng)子(ClonTech和BASF)、β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和可以通過(guò)添加某些金屬鹽而上調(diào)的金屬硫因啟動(dòng)子。大量適合的載體和啟動(dòng)子為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員已知，可以從商業(yè)上獲得并被描述于Sambrook，等人，(見(jiàn)上)。
用于這種表達(dá)載體的可選擇標(biāo)記物通常是本領(lǐng)域已知的，準(zhǔn)確可選擇標(biāo)記物的選擇依賴(lài)于宿主細(xì)胞?？蛇x擇標(biāo)記物基因的實(shí)例編碼的蛋白使細(xì)胞對(duì)抗生素或其它毒素具有抗性，包括氨比西林、氨甲喋呤、四環(huán)素、新霉素(Southern和Berg，J.，1982)、霉酚酸(Mulligan和Berg，1980)、嘌呤霉素、zeomycin或潮霉素(Sugden等人，，1985)。
細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)的方法被轉(zhuǎn)染，包括電穿孔、磷酸鈣、DEAE葡聚糖、Iipofection或Lipofectamine處理，并在適合的抗生素中被選擇。采用重組DNA技術(shù)克隆和表達(dá)修飾形式天然蛋白的方法通常是本領(lǐng)域已知的，如Ausubel，等人，1992和Sambrook，等人，1989所描述的，在此特別地合并為參考文獻(xiàn)。
B.核酸編碼的序列按照本發(fā)明，編碼特定細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子(CRF)或抗凋亡蛋白(包括與凋亡相關(guān)的修飾形式的蛋白)的多核苷酸序列包括剪接變異體、片段、融合蛋白、修飾形式的蛋白或其功能相等物，在此合稱(chēng)為＂CRF-或抗凋亡蛋白-編碼核酸序列＂。
由于遺傳密碼固有的簡(jiǎn)并性，編碼實(shí)際上相同或功能上相等的氨基酸序列的其它核酸序列也可以用于克隆和表達(dá)CRT-或抗凋亡蛋白-編碼核酸序列。因此，對(duì)于特定的CRF-或抗凋亡蛋白-編碼核酸序列，應(yīng)當(dāng)理解作為遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果，可以產(chǎn)生編碼相同氨基酸序列的多個(gè)編碼序列。例如，三聯(lián)CGT編碼精氨酸。精氨酸可選擇地由CGA、CGC、CGG、AGA和AGG編碼。因此應(yīng)當(dāng)理解，這種編碼區(qū)的取代在本發(fā)明涵蓋的序列變異體范圍內(nèi)。任何和所有這些序列變異體可以按這里描述的相同的方法應(yīng)用于天然形式CRF-或抗凋亡蛋白的編碼核酸序列。
＂變異體＂CRF-或抗凋亡蛋白-編碼核酸序列可以編碼＂變異體＂CRF-或抗凋亡氨基酸序列，它改變了天然多肽序列的一種或多種氨基酸，它們都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。相似地，術(shù)語(yǔ)“修飾形式的”，相對(duì)于CRF-或抗凋亡蛋白，是指衍生的或變異體形式的天然CRF-或抗凋亡蛋白-編碼核酸序列或天然CRF-或抗凋亡氨基酸序列。典型地，“修飾形式的”天然CRF-或抗凋亡蛋白或蛋白的編碼序列，分別具有至少一個(gè)氨基酸或核酸取代、缺失或插入的衍生序列。
相似地，用于實(shí)踐本發(fā)明的多核苷酸包括，編碼天然CRF-或抗凋亡蛋白及其剪接變異體的序列，與蛋白編碼序列互補(bǔ)的序列，和CRF-或抗凋亡蛋白新片段的編碼多核苷酸。多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，包括信使RNA、合成的RNA和DNA、cDNA和基因組DNA。DNA可以是雙鏈的或單鏈的，如果是單鏈則可以是編碼鏈或非編碼(反義、互補(bǔ))鏈。
如本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員會(huì)理解的，在某些情況下產(chǎn)生具有非天然存在密碼子的核苷酸序列可以是有利的?？梢赃x擇特定真核細(xì)胞宿主優(yōu)選的密碼子(Murray，E.等人，1989)，例如，為了增加CRF-或抗凋亡蛋白表達(dá)的速率，或?yàn)榱水a(chǎn)生具有所需特性重組RNA轉(zhuǎn)錄體，如較天然存在序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄體更長(zhǎng)的半衰期。
因各種原因，天然CRF-或抗凋亡蛋白-編碼核苷酸序列可以被改造以改變編碼序列，包括但不限于，修飾克隆，處理和/或細(xì)胞表達(dá)CRF-或抗凋亡蛋白而發(fā)生的改變。
1.細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和抗凋亡蛋白在一個(gè)方法中，用于實(shí)踐本發(fā)明的異源核酸構(gòu)建物或表達(dá)載體包括需要活性形式的蛋白的編碼序列或凋亡蛋白的編碼序列，前者如細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子(CRF)的編碼序列，這里以PKR為例，后者在此以CrmA，Bcl-2或Bcl-XL為例。
在本發(fā)明的一個(gè)通用實(shí)施方案中，CRF或抗凋亡蛋白-編碼核酸序列與GenBank中發(fā)現(xiàn)的天然編碼序列具有至少70％，優(yōu)選地80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性。例如用于表達(dá)人PKR的編碼序列與GenBank登記號(hào)第M35663中發(fā)現(xiàn)的序列具有至少70％，優(yōu)選地80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性。
就細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子或抗凋亡蛋白-編碼核酸序列來(lái)說(shuō)，取代、插入或刪除可發(fā)生在序列中的任何殘基上，只要編碼的氨基酸序列保持天然細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子或抗凋亡蛋白的生物學(xué)活性。
B.細(xì)胞系的選擇若干能夠產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子或目的蛋白的已知細(xì)胞型的任何一種可以用在本發(fā)明的方法中。在本發(fā)明實(shí)踐中，選擇的細(xì)胞系以表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子和/或抗凋亡蛋白-編碼核酸序列的方式被修飾。能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子或其它蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的許多方法獲得，包括原代細(xì)胞系的分離或從商業(yè)來(lái)源獲得已經(jīng)建立的細(xì)胞系。
因此，本發(fā)明提供的細(xì)胞系含已接受一種或多種選擇、修飾、引發(fā)和誘導(dǎo)的細(xì)胞，相對(duì)于相應(yīng)的親代細(xì)胞系有效地引起細(xì)胞因子產(chǎn)生或表達(dá)的增加。
適合用于實(shí)踐本發(fā)明的細(xì)胞系實(shí)例包括但不限于，成纖維細(xì)胞或免疫細(xì)胞，B細(xì)胞(如，Namalwa，293，Raji)，單核的細(xì)胞(如，U937，THP-1)，T細(xì)胞；嗜中性粒細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，MRC-5細(xì)胞，WI-38細(xì)胞，F(xiàn)low 1000細(xì)胞，F(xiàn)low 4000細(xì)胞，F(xiàn)S-4，F(xiàn)S-7細(xì)胞，MG-63細(xì)胞，CCRF-SB細(xì)胞，CCRF-CEM，Jurkat細(xì)胞，WIL2細(xì)胞和T98G細(xì)胞。
對(duì)于實(shí)踐本發(fā)明，人細(xì)胞是優(yōu)選的。在本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用實(shí)例中，人細(xì)胞系如Namalwa以有效抑制凋亡的方式被修飾，并進(jìn)一步以有效引起細(xì)胞因子或其它蛋白產(chǎn)生增加的方式被修飾、引發(fā)和/或處理。可選擇地，細(xì)胞以有效抑制凋亡的方式被修飾并通過(guò)有限稀釋亞克隆以獲得表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的亞克隆而選擇細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，然后以有效引起細(xì)胞因子或其它蛋白產(chǎn)生增加的方式引發(fā)和/或處理亞克隆?？杀挥糜趯?shí)踐本發(fā)明的適合原代細(xì)胞型的實(shí)例包括但不限于，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系細(xì)胞包括T-和B-細(xì)胞，肥大細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，角化細(xì)胞，造骨細(xì)胞起源的細(xì)胞，黑素細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，血小板，各種其它免疫系統(tǒng)細(xì)胞，肺上皮細(xì)胞，胰腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和來(lái)自這些細(xì)胞類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞。修飾的、引發(fā)的和/或誘導(dǎo)的細(xì)胞在培養(yǎng)親代細(xì)胞系所用的條件下被培養(yǎng)。
通常，細(xì)胞在含生理鹽和營(yíng)養(yǎng)素的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如標(biāo)準(zhǔn)的RPMI，MEM，IMEM或DMEM，典型地補(bǔ)充有5-10％血清，如胎牛血清。培養(yǎng)條件也是標(biāo)準(zhǔn)的，如，培養(yǎng)物孵育在37℃固定或滾動(dòng)培養(yǎng)直至獲得所需的細(xì)胞因子表達(dá)或產(chǎn)生水平。在有效促進(jìn)細(xì)胞因子回收的條件下培養(yǎng)細(xì)胞包括但不限于，在血清和/或無(wú)蛋白培養(yǎng)或無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
優(yōu)選的特定細(xì)胞系的培養(yǎng)條件可在科學(xué)文獻(xiàn)中和/或從細(xì)胞系提供者如American Type Culture Collection(ATCC；＂http//www.atcc.org/＂)發(fā)現(xiàn)。原代細(xì)胞系，如成纖維細(xì)胞、B-細(xì)胞、T-細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、樹(shù)狀細(xì)胞和單核細(xì)胞，的優(yōu)選培養(yǎng)條件通常可在科學(xué)文獻(xiàn)中獲得，。
在本發(fā)明的進(jìn)一步應(yīng)用中，經(jīng)處理而抑制了凋亡的細(xì)胞包括通常用于表達(dá)特定重組細(xì)胞因子或目的蛋白的細(xì)胞系，其中細(xì)胞因子或目的蛋白的表達(dá)與細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子如PKR無(wú)關(guān)，如CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞。
VIII.細(xì)胞因子細(xì)胞因子通過(guò)與其同源的受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)活性，隨后通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致刺激多種生物化學(xué)過(guò)程。在某些情況下，這種受體的表達(dá)被特異的信號(hào)所調(diào)節(jié)，如細(xì)胞因子可能涉及正或負(fù)反饋環(huán)，從而調(diào)節(jié)相同或不同細(xì)胞因子的受體的表達(dá)。這種受體可以是產(chǎn)生細(xì)胞因子的同類(lèi)型細(xì)胞的或不同類(lèi)型細(xì)胞的。
細(xì)胞因子是用來(lái)介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的。通常，細(xì)胞因子的產(chǎn)生是短暫的并發(fā)生在引起mRNA轉(zhuǎn)錄體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄的短時(shí)間內(nèi)，mRNA轉(zhuǎn)錄體也是短暫存在的并受制于轉(zhuǎn)錄后控制機(jī)制。最近的研究表明，各種細(xì)胞因子使用共同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，＂Jak/STAT＂通路(Abbas，等人，1997)。
應(yīng)當(dāng)理解，細(xì)胞因子的細(xì)胞來(lái)源是每個(gè)獨(dú)立細(xì)胞因子的不同特性，它可能由多種不同類(lèi)型的細(xì)胞產(chǎn)生。此外，特定的細(xì)胞因子(1)可能對(duì)超過(guò)一個(gè)細(xì)胞類(lèi)型起作用，(2)對(duì)同一個(gè)細(xì)胞可能具有超過(guò)一個(gè)的作用，(3)可具有與其它細(xì)胞因子共同的活性，和(4)可影響其它細(xì)胞因子的合成或作用，如通過(guò)拮抗或協(xié)同其作用。
產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以是以下的一種或多種干擾素類(lèi)包括IFN-γ、IFN-α和IFN-β；腫瘤壞死因子(TNF)包括TNF-α、TNF-β和TNF可溶性受體(sTNF-R)；白介素(IL)包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11和IL-12；集落刺激因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；血管來(lái)源的因子類(lèi)包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；血小板衍生生長(zhǎng)因子1和2(PDGF1和2)；趨化因子包括調(diào)節(jié)的正?；罨疶-表達(dá)分泌的(RANTES)；巨噬細(xì)胞炎癥蛋白類(lèi)(MIP)如MIP-1α和MIP-2α；單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP)；抗血管發(fā)生因子包括血管抑素；內(nèi)皮抑素；白血病抑制因子(LIF)；睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；心臟營(yíng)養(yǎng)素和制瘤素包括制瘤素M。
本發(fā)明的方法還可用于增加能夠在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的許多蛋白中任一種的表達(dá)。蛋白的實(shí)例包括但不限于，胰島素、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、組織血漿酶原激活劑(TPA)、生長(zhǎng)激素和因子VIII。
細(xì)胞因子組的一個(gè)實(shí)例，干擾素類(lèi)(IFNs)對(duì)病毒感染或腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)起反應(yīng)而產(chǎn)生。這些糖蛋白類(lèi)在其抗病毒作用以外還具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性。自從1994年，IFNs在美國(guó)獲得了FDA批準(zhǔn)用于特定的臨床適應(yīng)癥。最近，兩個(gè)IFN-β制劑，一個(gè)在大腸桿菌中產(chǎn)生另一個(gè)在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中產(chǎn)生，已獲準(zhǔn)用于多發(fā)硬化患者。CHO細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)品已顯示除引起不需要的作用如大多數(shù)患者注射部位組織壞死外，可引起抗IFN抗體，并形成干擾素免疫復(fù)合物。另外的缺陷歸因于細(xì)菌產(chǎn)生的IFNs，包括引起抗體和IFN-α在各種疾病中的作用受限，它可能部分地是由于在重組制劑中缺少所有的亞型。以前的研究已顯示，由抗體形成反映出的排斥發(fā)生率在細(xì)菌產(chǎn)生的IFN可以高達(dá)20-38％，相比天然IFN-α僅有1.2％(Antonelli，等人，1991；Antonelli，等人，1997)。
本發(fā)明意圖提供改進(jìn)的產(chǎn)生細(xì)胞因子組合物的細(xì)胞系，它沒(méi)有不需要的副作用，如給患者用藥時(shí)引起免疫反應(yīng)，或由于不適當(dāng)?shù)奶腔蛟谥亟M制劑中缺少天然亞型的完全補(bǔ)充而限制了效果。
這里描述的方法有效地引起細(xì)胞因子產(chǎn)生的增加。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)胞系修飾、培養(yǎng)條件、引發(fā)和誘導(dǎo)的一種或多種聯(lián)合引起細(xì)胞因子產(chǎn)生的顯著增加，如，相對(duì)于沒(méi)有修飾、處理、引發(fā)或誘導(dǎo)細(xì)胞的相同細(xì)胞系，在相同的培養(yǎng)條件下所具有的細(xì)胞因子產(chǎn)生或表達(dá)水平，表現(xiàn)為增加至少200％(2倍或2×)、250％(2.5倍或2.5×)、300％(3倍或3×)、400％(4倍或4×)、500％(5倍或5×)，優(yōu)選地1000％(10倍或10×)或以上，如在此所描述的。在某些情況下，本發(fā)明的方法引起細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加100倍(100×)至1000倍(1000×)或以上。
IX.細(xì)胞因子或其它蛋白產(chǎn)生、分離和細(xì)胞因子純化的評(píng)價(jià)A.細(xì)胞因子或其它蛋白產(chǎn)生的評(píng)價(jià)為了評(píng)價(jià)已經(jīng)接受一種或多種的修飾、引發(fā)和/或誘導(dǎo)的細(xì)胞系對(duì)細(xì)胞因子或其它目的蛋白的表達(dá)，可以在蛋白水平、RNA水平或通過(guò)對(duì)要表達(dá)的單獨(dú)細(xì)胞因子或其它蛋白使用特殊的功能性生物檢驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。
作為實(shí)例，特定細(xì)胞因子的產(chǎn)生和/或表達(dá)可以在樣本中直接檢測(cè)，例如，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子的活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生。檢測(cè)包括定量mRNA轉(zhuǎn)錄的Northern印跡，點(diǎn)印跡(DNA或RNA分析)，RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，或采用適當(dāng)標(biāo)記探針(根據(jù)細(xì)胞因子的編碼核酸序列)的原位雜交和常規(guī)的Southern印跡。
可選擇地，蛋白的表達(dá)可以通過(guò)免疫學(xué)方法評(píng)價(jià)，如細(xì)胞、組織切片的免疫組化染色或組織培養(yǎng)基的免疫檢測(cè)，如通過(guò)Western印跡或ELISA。這種免疫檢測(cè)可被用來(lái)定性和定量地評(píng)價(jià)細(xì)胞因子或其它蛋白的表達(dá)。這些方法的細(xì)節(jié)為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員已知，且進(jìn)行這些方法的許多試劑可以從商業(yè)上獲得。
細(xì)胞因子或其它蛋白的純化形式典型地被用來(lái)產(chǎn)生對(duì)表達(dá)蛋白特異的單克隆或多克隆抗體，以用于各種免疫檢測(cè)(見(jiàn)如，Harlow等人，1988)。檢測(cè)的實(shí)例包括ELISA、競(jìng)爭(zhēng)性免疫檢測(cè)、放射免疫檢測(cè)、Western印跡、間接免疫熒光檢測(cè)等。通常，商業(yè)上獲得的抗體和/或試劑盒可用于定量的免疫檢測(cè)已知細(xì)胞因子或其它蛋白的表達(dá)水平，如實(shí)施例1中干擾素-β分析和實(shí)施例4中干擾素-α分析所舉例說(shuō)明的。
B.細(xì)胞因子的分離和純化通常，在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的細(xì)胞因子被分泌到培養(yǎng)基中，并可以被純化或分離，如通過(guò)從細(xì)胞培養(yǎng)基中去除不需要的成分。典型地，細(xì)胞因子被分餾以隔離具有所選擇特性的細(xì)胞因子如，與特殊結(jié)合劑如抗體或受體結(jié)合的親合性；或具有選擇的分子量范圍，或等電點(diǎn)范圍。
一旦獲得增加產(chǎn)生的特定細(xì)胞因子或其它蛋白，就從細(xì)胞培養(yǎng)中純化由此產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其它蛋白。適合這種純化的方法實(shí)例包括如下抗體親合性柱層析、離子交換層析；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂如DEAE上的層析；色譜焦聚；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；和采用如Sephadex G-75的凝膠過(guò)濾?？梢允褂玫鞍准兓母鞣N方法，這些方法為本領(lǐng)域已知并被描述于如Deutscher，1990；Scopes，1982.純化步驟的選擇將依賴(lài)于如，所用的生產(chǎn)過(guò)程的性質(zhì)和產(chǎn)生的特定細(xì)胞因子或蛋白。
上面描述了特殊的實(shí)施例，但是，本領(lǐng)域的普通專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白許多修飾是可以接受的，實(shí)施例僅為說(shuō)明的目的而提供，并不限制本發(fā)明，除非這樣指定。
在本說(shuō)明中引用的所有專(zhuān)利和參考文獻(xiàn)均在此引入以供參考。
實(shí)施例1轉(zhuǎn)基因CrmA-表達(dá)細(xì)胞系的制備和鑒定A.轉(zhuǎn)基因CrmA-表達(dá)細(xì)胞系的制備根據(jù)Huang等人，1997描述的載體基礎(chǔ)上，通過(guò)將CrmA的編碼序列在框架內(nèi)插入Mizushima和Negata(NAR 18，5322.1990)描述的pEF Bos載體中，而構(gòu)建pEF FLAG-crmA-puro表達(dá)載體。pEFFLAG-crmA-puro含有在強(qiáng)延伸因子1α(EF-1α)啟動(dòng)子控制下的編碼抗凋亡CrmA蛋白的全長(zhǎng)cDNA(GenBank登記號(hào)第M 14217；牛痘病毒白痘變異體(CPV-W2)(CrmA)基因，完整的編碼序列)，和在pGK啟動(dòng)子控制下的嘌呤霉素抗性基因。另外一個(gè)注意的特征是，N-末端FLAG抗原決定簇(Hopp等人，1988)的編碼序列被加入CrmA核酸序列中以幫助檢測(cè)表達(dá)CrmA的細(xì)胞系。
載體還包括(i)多腺苷信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列以加強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性；(ii)游離基因復(fù)制和簡(jiǎn)單載體挽救的SV40啟始點(diǎn)；(iii)在大腸桿菌中選擇和維持的氨比西林抗性基因和ColEl啟始點(diǎn)；和(iv)嘌呤霉素抗性標(biāo)記物(Puro)，使得用pEF FLAG-crmA-puro轉(zhuǎn)染后可以選擇和鑒定含質(zhì)粒的真核細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染前一天，MG-63細(xì)胞以每孔5×104被接種在6孔板中。在100μl無(wú)血清、蛋白或抗生素的Opti-MEM培養(yǎng)基中懸浮2μg pEFFLAG-crmA-puro質(zhì)粒DNA。Lipofectamine試劑(Gibco，10μl)用無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至100μl。接著輕輕混合兩個(gè)溶液，混合物在室溫孵育45min以形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。處理MG-63細(xì)胞前即刻，600μl無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基被加入到含DNA-脂質(zhì)體混合物的反應(yīng)試管中以獲得最終的轉(zhuǎn)染溶液。細(xì)胞用PBS沖洗，隨后添加最終DNA-脂質(zhì)體混合物并在37℃孵育4小時(shí)。然后添加1ml MEM-5％FBS，再孵育16hrs。輕輕抽吸以移出培養(yǎng)上清，并加入新鮮的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(加有5％FBS的MEM)。孵育48hr后，添加含選擇標(biāo)記物、geneticin(G418，500μg/ml)的新鮮培養(yǎng)基(MEM 5％FBS)，以用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體?？傊?，通過(guò)用500μg/ml G418(Gibco-BRL)選擇3-4周，獲得一批穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。
B.轉(zhuǎn)基因CrmA-表達(dá)細(xì)胞系的鑒定1.增加的細(xì)胞活力采用以下步驟，通過(guò)仙臺(tái)病毒(SV)誘導(dǎo)和超誘導(dǎo)(SI；Inoue I等人，1991)，野生型(WT)和CrmA-表達(dá)(CrmA-#2)的MG-63細(xì)胞被處理。
細(xì)胞以每孔2.5×104細(xì)胞的細(xì)胞密度被接種在24孔板上，隨后在37℃用5％CO2濃度孵育。孵育后，細(xì)胞用IFN-β(100IU/ml)引發(fā)24hr。然后，在每孔200μl添加2％胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)基中，通過(guò)添加1000血細(xì)胞凝集素單位的SV誘導(dǎo)細(xì)胞，孵育1小時(shí)，接著添加300μl含polyIC(100μg/ml)和放線菌酮(5μg/ml)的新鮮培養(yǎng)基，另外孵育5hrs。在最后1小時(shí)內(nèi)添加放線菌素D至4μg/ml的終濃度。誘導(dǎo)過(guò)程后，經(jīng)處理的細(xì)胞用PBS被沖洗3次以去除所有的誘導(dǎo)劑，并在含2％FBS的新鮮MEM中重懸浮。
野生型(WT)和不被仙臺(tái)病毒(SV)±或超誘導(dǎo)(SI)處理的CrmA-表達(dá)(CrmA-#2)MG-63細(xì)胞被用作對(duì)照(UT)。每型細(xì)胞的活力用標(biāo)準(zhǔn)的亞丙基FACS試驗(yàn)測(cè)定。如圖1所顯示的，CrmA的表達(dá)抑制了SV/SI-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，通過(guò)SV誘導(dǎo)和SI處理后20h CrmA-表達(dá)細(xì)胞的活力高達(dá)80％而顯示。相反，與相同條件接觸的野生型MG-63細(xì)胞僅有20％存活。
2.細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加孵育細(xì)胞20hrs，然后從每個(gè)孔中收集培養(yǎng)基并通過(guò)ELISA檢測(cè)干擾素-β(IFN-β)的產(chǎn)生。IFN-β的ELISA按供應(yīng)商所描述的方法進(jìn)行(人干擾素-βELISA試劑盒；由TFB，Inc.分裝，由FUJIREBIO，Inc.，Tokyo，Japan生產(chǎn))。如圖2所示，同MG-63野生型對(duì)應(yīng)者相比，CrmA#2 MG-63細(xì)胞產(chǎn)生顯著增多的IFN-β。
表達(dá)CrmA(CrmA-#2)的MG-63細(xì)胞在培養(yǎng)基中接受超誘導(dǎo)(SI)處理，培養(yǎng)基含0.2mM，4mM和8mM的核苷類(lèi)似物2-氨基嘌呤(2-AP)，是已知的PKR抑制劑。
引發(fā)前日，在37 5％CO2濃度下，通過(guò)在24孔板上以每孔2.5×104的密度接種細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行SI(超誘導(dǎo))處理。孵育后，細(xì)胞用IFN-β(100IU/ml)引發(fā)24hr，然后，添加500μl含polyIC(100μg/ml)和放線菌酮(5μg/ml)的新鮮培養(yǎng)基，另外孵育5hrs，在最后1小時(shí)內(nèi)添加放線菌素D至4μg/ml的終濃度。誘導(dǎo)過(guò)程后，經(jīng)處理的細(xì)胞用PBS被沖洗3次以去除所有的誘導(dǎo)劑，并在含2％FBS的新鮮MEM中重懸浮。
如圖3所示，2-AP以劑量依賴(lài)的方式抑制IFN-β的產(chǎn)生，證實(shí)PKR在調(diào)節(jié)IFN-β表達(dá)中發(fā)揮作用。
3.通過(guò)Western印跡分析Flag-CrmA蛋白的表達(dá)親代野生型細(xì)胞系(MG-63-WT)的細(xì)胞和如上所述制備的CrmA轉(zhuǎn)化體(MG-63-CrmA-#2)在100mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至100％融合。細(xì)胞在冷的磷酸緩沖鹽水(PBS)中被沖洗并用細(xì)胞刮刀收集在1.5ml微量離心管中。進(jìn)一步用PBS沖洗后，細(xì)胞在溶解緩沖液(10mM Tris-HCL[pH 7.5]，1％Triton X-100，0.25％SDS，50mM KCL，1mM二硫蘇糖醇，2mM MgCl2和1×蛋白抑制劑雞尾酒[Roche])中冰上孵育10min，然后以10,000g離心10min。溶解物上清被轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中，用BRL試劑盒按照廠商提供的規(guī)程檢測(cè)蛋白濃度。
含100μg蛋白的細(xì)胞溶解物被置于4-12％的NuPAGE Bis-TrisMOPS凝膠上接受電泳分離，其后凝膠被點(diǎn)樣在PVDF膜上。此膜進(jìn)一步在5％牛乳-PBS中印跡過(guò)夜并與1∶500稀釋的大鼠抗-Flag一抗接觸1小時(shí)，一抗由Dr.A Strasser(Royal Melbourne Hospital，Victoria，Australia)惠贈(zèng)。印跡膜用PBS-0.1％Tween-20沖洗3次，與抗大鼠HRP結(jié)合二抗(1∶2000)一起孵育1小時(shí)。用ECL檢測(cè)試劑(Amersham)檢查出現(xiàn)的Flag-CrmA蛋白。
每個(gè)用CrmA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞樣本顯示了高水平的Flag-CrmA表達(dá)，相反，親代野生型對(duì)照細(xì)胞(MG63-WT)顯示沒(méi)有表達(dá)。
實(shí)施例2PKR過(guò)度表達(dá)及表達(dá)PKR和抗凋亡蛋白的Namalwa細(xì)胞系A(chǔ).制備pEF-FLAG-Bcl-XLpEF-FLAG-Bcl-XL載體(Huang，等人，1997)含編碼抗凋亡Bcl-XL蛋白的全長(zhǎng)cDNA，可操作地連接在強(qiáng)延伸因子1α(EF-1α)啟動(dòng)子上。該載體另外的顯著特征是N-末端的FLAG抗原決定簇(Hopp等人，1988)，它加在Bcl-XL蛋白上以促成選擇表達(dá)高水平Bcl-XL的細(xì)胞系。
該載體還包括i)多腺苷信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列以增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性；ii)游離基因復(fù)制和簡(jiǎn)單載體挽救的SV40啟始點(diǎn)；(iii)在大腸桿菌中選擇和維持的氨比西林抗性基因和ColEl啟始點(diǎn)；和(iv)嘌呤霉素抗性標(biāo)記物(Puro)，使得用Bcl-XL和PKR轉(zhuǎn)染后可以選擇和鑒定含質(zhì)粒的真核細(xì)胞。
B.制備pcDNA-FLAG-PKRpcDNA-FLAG-PKR載體含編碼全長(zhǎng)人PKR分子(551個(gè)氨基酸；Meurs，等人，1990；GenBank登記號(hào)第NM002759)的cDNA，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)修飾以包含編碼MDYKDDDDK序列的N末端FLAG尾(Hopp等人，1988)，并被插入真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen)中，使得FLAG-PKR編碼序列在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
稱(chēng)為pcDNA-FLAG-PKR的載體含各種適合于PKR轉(zhuǎn)錄的特征，包括i)來(lái)自人CMV即刻早期基因的啟動(dòng)子序列，以高水平表達(dá)mRNA；ii)來(lái)自牛生長(zhǎng)激素(BGH)基因的多腺苷信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列，以增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性；iii)游離基因復(fù)制和簡(jiǎn)單載體挽救的SV40啟始點(diǎn)；iv)在大腸桿菌中選擇和維持的氨比西林抗性基因和ColEl啟始點(diǎn)；和v)G418抗性標(biāo)記物(Neo)，使得轉(zhuǎn)染后可以選擇和鑒定含質(zhì)粒的真核細(xì)胞。
第二個(gè)PKR載體叫做pTRE-PKR，通過(guò)將相同的PKR cDNA插入從Clontech獲得的pTRE質(zhì)粒的限制性/插入位點(diǎn)中而制備。pTRE質(zhì)粒與制備第一個(gè)描述的PKR載體中所用的pFLAG相似，但在用于控制插入基因的CMV啟動(dòng)子上游含有四環(huán)素-反應(yīng)元件。在實(shí)施例4中報(bào)道的研究中，TRE功能沒(méi)有發(fā)揮，因此兩個(gè)PKR載體在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的作用預(yù)期基本上是一樣的。
C.制備6A細(xì)胞系人B淋巴母細(xì)胞系Namalwa(WT)順序用質(zhì)粒pEF-FLAG-Bcl-XL和pcDNA-FLAG-PKR轉(zhuǎn)染。采用基因脈沖發(fā)生儀(Biorad)，用15μgpEF-FLAG-Bcl-XL質(zhì)粒在DMEM/F12(+10％FBS)中，通過(guò)對(duì)4×106指數(shù)生長(zhǎng)的Namalwa細(xì)胞進(jìn)行800μF 300V的電穿孔作用獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體。通過(guò)用2μg/ml的嘌呤霉素(Gibco-BRL)選擇3-4周，并用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀篩選Bcl-XL的表達(dá)獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的一批集落，如下所述。轉(zhuǎn)染體群被沖洗，用丙酮增加通透性，隨后用2μg/ml的小鼠抗FLAG M2單克隆抗體(IBI)、然后用藻紅蛋白結(jié)合的山羊抗小鼠IgG(1μg/ml；Becton-Dickinson)染色。用FACScan分析細(xì)胞，根據(jù)其前向和側(cè)向散射特性及Bcl-XL表達(dá)細(xì)胞的熒光密度水平來(lái)區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。然后用pcDNA-FLAG-PKR轉(zhuǎn)染高水平表達(dá)Bcl-XL的轉(zhuǎn)化體(Namalwa-Bcl-XL)。
采用基因脈沖發(fā)生儀(Biorad)，用15μg pcDNA-FLAG-PKR質(zhì)粒在DMEM/F12(+10％FBS)中，通過(guò)對(duì)4×106指數(shù)生長(zhǎng)的Namalwa-Bcl-XL細(xì)胞進(jìn)行800μF 300V的電穿孔作用獲得了穩(wěn)定的高水平表達(dá)Bcl-XL的轉(zhuǎn)染體。通過(guò)用2μg/ml的geneticin(G418，Gibco-BRL)選擇3-4周獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的一批集落。隨后通過(guò)有限稀釋克隆獲得克隆系，并通過(guò)Western印跡(Huang等人，1997)分析Bcl-XL和PKR的表達(dá)。用2μg/ml抗FLAG M2抗體后接山羊抗小鼠過(guò)氧化物酶結(jié)合體，以及ECL檢測(cè)(Amersham)鑒定蛋白。舉例的Bcl-XL和PKR陽(yáng)性細(xì)胞系叫做6A。
D.制備A9細(xì)胞系采用基因脈沖發(fā)生儀(Biorad)，用15μg pTRE-PKR質(zhì)粒在DMEM/F12(+10％FBS)中，通過(guò)對(duì)4×106指數(shù)生長(zhǎng)的Namalwa-Bcl-XL細(xì)胞進(jìn)行800μF 300V的電穿孔作用獲得了穩(wěn)定的高水平表達(dá)PKR的轉(zhuǎn)染體。通過(guò)用2μg/ml的geneticin(G418，Gibco-BRL)選擇3-4周獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的一批集落。隨后通過(guò)有限稀釋克隆獲得克隆系，并通過(guò)Western印跡(Huang等人，1997)分析PKR的表達(dá)。
實(shí)施例3鑒定表達(dá)Bcl-XL和PKR的轉(zhuǎn)基因Namalwa細(xì)胞系1.增加的細(xì)胞活力在過(guò)度表達(dá)PKR和誘導(dǎo)細(xì)胞因子的條件下，檢測(cè)野生型Namalwa細(xì)胞(WT)和來(lái)自實(shí)施例3的A9和6A細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞活力。特別地，PKR和Bcl-Xi雙轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(6A細(xì)胞系)、PKR轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(A9細(xì)胞系)和親代Namalwa細(xì)胞(WT)以2.5×105細(xì)胞/ml在添加有10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞用20mMPMA(引發(fā)劑)處理20hr，隨后用200μg/ml poly r(I)poly r(C)和10μg/ml DEAE葡聚糖(poly IC誘導(dǎo))處理72hr，或200HAU/I×106仙臺(tái)病毒細(xì)胞處理48hr。處理后，在FACScan上通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活力。
圖4A顯示，仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)后，細(xì)胞活力與PKR轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(A9細(xì)胞系)和親代Namalwa細(xì)胞(WT)相似，PKR和Bcl-XL雙轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(6A細(xì)胞系)觀察到有較大的活力。
圖4B顯示，poly IC誘導(dǎo)后，細(xì)胞活力與PKR和Bcl-XL雙轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(6A細(xì)胞系)和親代Namalwa細(xì)胞(WT)相似，PKR轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(A9細(xì)胞系)觀察到有較低的活力。
2.增加的干擾素-α表達(dá)在PKR過(guò)度產(chǎn)生的條件下，poly IC和仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞因子后，IFN-α產(chǎn)生的水平也在三個(gè)細(xì)胞系中進(jìn)行了分析。收集培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒(R&D Systems)供應(yīng)者提供的步驟通過(guò)ELISA分析IFN-α的水平。
在圖5A中顯示的結(jié)果表明，仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)后，由PKR和Bcl-XL雙轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(6A細(xì)胞系)產(chǎn)生的IFN-α表達(dá)，明顯超過(guò)PKR轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(A9細(xì)胞系)和親代Namalwa細(xì)胞(WT)產(chǎn)生的IFN-α。
在圖5B中顯示的結(jié)果表明，poly IC誘導(dǎo)后，PKR轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(A9細(xì)胞系)及PKR和Bcl-XL雙轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞(6A細(xì)胞系)產(chǎn)生的IFN-α表達(dá)，明顯超過(guò)親代Namalwa細(xì)胞(WT)產(chǎn)生的IFN-α。
從前面可以看到，本發(fā)明的各種目的和特征是如何實(shí)現(xiàn)的。本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員可以從前面的描述中理解，本發(fā)明的廣泛教導(dǎo)可以多種方式被實(shí)現(xiàn)。因此，雖然本發(fā)明與特殊實(shí)施方案及其實(shí)施例一起被描述，但發(fā)明的真正范圍不應(yīng)如此被限制。在不背離本發(fā)明范圍下可進(jìn)行各種改變和修飾，如附加權(quán)利要求書(shū)所定義的那樣。
權(quán)利要求
1.一種用來(lái)產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子的人類(lèi)細(xì)胞系，包括特征為表達(dá)一種抗凋亡蛋白的編碼序列的人類(lèi)細(xì)胞系，其細(xì)胞因子產(chǎn)量的水平是不表達(dá)抗凋亡蛋白編碼序列的相應(yīng)親代細(xì)胞系所具有的細(xì)胞因子產(chǎn)量水平的至少兩倍(2×)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系，其中所述的抗凋亡蛋白是CrmA。
3.一種用來(lái)產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子的人類(lèi)細(xì)胞系，通過(guò)以下的步驟制備獲取一個(gè)能夠產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子的親代人類(lèi)細(xì)胞系；通過(guò)將第一個(gè)表達(dá)載體引入所述細(xì)胞系的細(xì)胞而修飾細(xì)胞，該載體包含(i)可操作地連接于第一個(gè)啟動(dòng)子的CrmA編碼序列，和(ii)在人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)所必須的其他調(diào)控元件；和篩選和選擇表達(dá)CrmA的細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人類(lèi)細(xì)胞，其中所述的方法進(jìn)一步包括以有效導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)量增加的方式處理所述的表達(dá)CrmA的細(xì)胞，其中所述的轉(zhuǎn)化和處理的細(xì)胞系特征是，細(xì)胞因子產(chǎn)量水平是相應(yīng)的非轉(zhuǎn)化親代細(xì)胞系細(xì)胞因子產(chǎn)量水平的至少兩倍(2×)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的方法進(jìn)一步包括通過(guò)將第二個(gè)表達(dá)載體引入至所述細(xì)胞系的細(xì)胞中而修飾所述的細(xì)胞，該載體包含(i)可操作地連接于第二個(gè)啟動(dòng)子的PKR編碼序列；和(ii)在人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)所必須的其他調(diào)控元件，其中所述的第一個(gè)所述表達(dá)載體引入所述細(xì)胞是在所述第二個(gè)表達(dá)載體引入所述細(xì)胞之前或同時(shí)或之后，和篩選和選擇過(guò)度表達(dá)PKR的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的方法進(jìn)一步包括以有效導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)量增加的方式處理所述人類(lèi)細(xì)胞系的所述修飾細(xì)胞，其中所述的轉(zhuǎn)化和處理的細(xì)胞系特征是，細(xì)胞因子產(chǎn)量水平是相應(yīng)的非轉(zhuǎn)化親代細(xì)胞系的細(xì)胞因子產(chǎn)量水平的至少兩倍(2×)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的處理方法是指對(duì)所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行引發(fā)和誘導(dǎo)之一或兩者都進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的引發(fā)是指將所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞與醋酸佛波豆蔻酯(PMA)或β-干擾素接觸。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的誘導(dǎo)是指將所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞與微生物誘導(dǎo)劑接觸，該誘導(dǎo)劑選自仙臺(tái)病毒、腦心肌炎病毒和單純皰疹病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的微生物誘導(dǎo)劑是仙臺(tái)病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的誘導(dǎo)是指將所述細(xì)胞與至少一種非微生物誘導(dǎo)劑接觸，該誘導(dǎo)劑選自poly(I)poly(C)(poly IC)或poly r(I)poly r(C)(poly rIC)、肝素、硫酸葡聚糖、放線菌酮、放線菌素D、丁酸鈉、鈣離子載體和硫酸軟骨素。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的非微生物誘導(dǎo)劑是polyIC，放線菌酮和放線菌素D。
13.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的處理是指對(duì)所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行引發(fā)和誘導(dǎo)之一或兩者都進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的引發(fā)是指將所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞與醋酸佛波豆蔻酯(PMA)或β-干擾素接觸。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的誘導(dǎo)是指將所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞與微生物誘導(dǎo)劑接觸，該誘導(dǎo)劑選自仙臺(tái)病毒、腦心肌炎病毒和單純皰疹病毒。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的微生物誘導(dǎo)劑是仙臺(tái)病毒。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的誘導(dǎo)是指將所述的細(xì)胞與至少一種非微生物誘導(dǎo)劑接觸，該誘導(dǎo)劑選自poly(I)poly(C)(poly IC)或poly r(I)poly r(C)(poly rIC)、肝素、硫酸葡聚糖、放線菌酮、放線菌素D、丁酸鈉、鈣離子載體和硫酸軟骨素。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的非微生物誘導(dǎo)劑是polyIC，放線菌酮和放線菌素D。
19.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的親代人類(lèi)細(xì)胞系也能夠表達(dá)PKR，其中所述的方法進(jìn)一步包括篩選和選擇PKR活性、表達(dá)和/或產(chǎn)量至少增加兩倍(2×)的PKR過(guò)度表達(dá)細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的方法進(jìn)一步包括以有效導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)量增加的方式處理所述細(xì)胞系的所述表達(dá)CrmA和過(guò)度表達(dá)PKR的細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)化和處理的細(xì)胞系的特征是，細(xì)胞因子產(chǎn)量的水平是相應(yīng)的非轉(zhuǎn)化親代細(xì)胞系細(xì)胞因子產(chǎn)量水平的至少兩倍(2×)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的處理是指對(duì)所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行引發(fā)和誘導(dǎo)之一或兩者都進(jìn)行。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的引發(fā)是指將所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞與醋酸佛波豆蔻酯(PMA)或β-干擾素接觸。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的誘導(dǎo)是指將所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞與微生物誘導(dǎo)劑接觸，該誘導(dǎo)劑選自仙臺(tái)病毒、腦心肌炎病毒和單純皰疹病毒。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的微生物誘導(dǎo)劑是仙臺(tái)病毒。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的誘導(dǎo)是指將所述的細(xì)胞與至少一種非微生物誘導(dǎo)劑接觸，該誘導(dǎo)劑選自poly(I)poly(C)(poly IC)或poly r(I)poly r(C)(poly rIC)、肝素、硫酸葡聚糖、放線菌酮、放線菌素D、丁酸鈉、鈣離子載體和硫酸軟骨素。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的誘導(dǎo)是指將所述細(xì)胞與poly IC、放線菌酮和放線菌素D接觸。
27.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的第一個(gè)表達(dá)載體進(jìn)一步含有第一個(gè)選擇性標(biāo)記物的編碼核酸序列，所述CrmA表達(dá)細(xì)胞的篩選和選擇是指在含有選擇CrmA表達(dá)細(xì)胞的第一個(gè)選擇劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的修飾細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人類(lèi)細(xì)胞系，其中所述的第二個(gè)表達(dá)載體進(jìn)一步含有第二個(gè)選擇性標(biāo)記物的編碼核酸序列，其中所述過(guò)度表達(dá)PKR細(xì)胞的篩選和選擇是指在含有第二個(gè)選擇劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的修飾細(xì)胞，該選擇劑對(duì)所述第二個(gè)選擇性標(biāo)記物是特異的，以選擇過(guò)度表達(dá)PKR的細(xì)胞。
29.在人類(lèi)細(xì)胞系中產(chǎn)生一種或多種細(xì)胞因子的改良方法中，其改良意圖通過(guò)將親代人類(lèi)細(xì)胞系在下列一種或多種條件下進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)增加細(xì)胞活力和細(xì)胞因子的產(chǎn)量(i)修飾以有效導(dǎo)致抗凋亡蛋白的表達(dá)；(ii)修飾以有效導(dǎo)致細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的過(guò)度表達(dá)；(iii)引發(fā)；和(iv)誘導(dǎo)，其中細(xì)胞因子的產(chǎn)量是相應(yīng)的未轉(zhuǎn)化親代細(xì)胞系產(chǎn)量水平的至少兩倍(2×)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的修飾以有效導(dǎo)致抗凋亡蛋白表達(dá)是指，將第一個(gè)表達(dá)載體引入所述細(xì)胞系的細(xì)胞中，該載體包含(i)可操作地連接于第一個(gè)啟動(dòng)子的CrmA編碼序列，(ii)在人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)CrmA所必須的其他控制元件；并篩選和選擇表達(dá)CrmA的細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的第一個(gè)表達(dá)載體進(jìn)一步包含第一個(gè)選擇性標(biāo)記物的編碼核酸序列，其中所述的CrmA表達(dá)細(xì)胞的篩選和選擇是指在含有選擇CrmA表達(dá)細(xì)胞的第一個(gè)選擇劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的修飾細(xì)胞。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的修飾以有效導(dǎo)致細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過(guò)度表達(dá)是指，將第二個(gè)表達(dá)載體引入所述表達(dá)CrmA的細(xì)胞系的細(xì)胞中，該載體包含(i)可操作地連接于第二個(gè)啟動(dòng)子的PKR編碼序列；(ii)在人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)所必須的其他調(diào)控元件，其中所述的第一個(gè)所述表達(dá)載體引入所述細(xì)胞中在所述第二個(gè)表達(dá)載體引入所述細(xì)胞之前、同時(shí)或之后；并篩選和選擇過(guò)度表達(dá)PKR的細(xì)胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的第二個(gè)表達(dá)載體進(jìn)一步包含第二個(gè)選擇性標(biāo)記物的編碼核酸序列；其中所述PKR過(guò)度表達(dá)細(xì)胞的篩選和選擇是指，在含有第二個(gè)選擇劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的修飾細(xì)胞，該選擇劑對(duì)所述第二個(gè)選擇性標(biāo)記物是特異的以選擇過(guò)度表達(dá)PKR的細(xì)胞。
34.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的親代人類(lèi)細(xì)胞系也能夠表達(dá)PKR，其中所述的方法進(jìn)一步包括篩選和選擇PKR活性、表達(dá)和/或產(chǎn)量至少增加兩倍(2×)的PKR過(guò)度表達(dá)細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其所述的引發(fā)是指將細(xì)胞與醋酸佛波豆蔻酯(PMA)和β-干擾素之一或兩者接觸。
36.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)是指將細(xì)胞與微生物誘導(dǎo)劑接觸，該誘導(dǎo)劑選自仙臺(tái)病毒、腦心肌炎病毒和單純皰疹病毒。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的微生物誘導(dǎo)劑是仙臺(tái)病毒。
38.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)是指將細(xì)胞與至少一種非微生物誘導(dǎo)劑接觸，該誘導(dǎo)劑選自poly(I)poly(C)(polyIC)或poly r(I)poly r(C)(poly rIC)、肝素、硫酸葡聚糖、放線菌酮、放線菌素D、丁酸鈉、鈣離子載體和硫酸軟骨素。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的非微生物誘導(dǎo)劑是polyIC、放線菌酮和放線菌素D。
40.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的一種或多種細(xì)胞因子選自α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)、γ-干擾素(IFN-γ)；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)；白介素-2(IL-2)；白介素-3(IL-3)；白介素-7(IL-7)；白介素-8(IL-8)；白介素-10(IL-10)；和白介素-12(IL-12)。
全文摘要
本發(fā)明涉及在人細(xì)胞培養(yǎng)中提高細(xì)胞因子產(chǎn)量的組合物和方法，特別是在通過(guò)表達(dá)CrmA抑制凋亡細(xì)胞死亡的條件下。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1500142SQ02807230
公開(kāi)日2004年5月26日 申請(qǐng)日期2002年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月26日
發(fā)明者A·S·勞, N·奧西那, L·布郎寧, M·C·基弗, A S 勞, 基弗, 贍, 髂 申請(qǐng)人:基因特羅生物治療公司