專利名稱：埃-巴二氏病毒(ebv)腫瘤相關潛伏膜蛋白的胞外結構域的鑒定方法和與之反應的抗體試 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及埃-巴二氏病毒(EBV)編碼的膜蛋白的胞外表位的鑒定方法，涉及與所述表位反應的抗體試劑的篩選方法，涉及新的肽，包括埃-巴二氏病毒(EBV)編碼的潛伏和腫瘤相關膜蛋白的胞外結構域，涉及編碼所述肽的核苷酸序列，包含所述核苷酸序列的載體，涉及與所述胞外結構域反應的抗體試劑，和涉及所述肽、編碼所述肽的核苷酸序列和所述抗體試劑用于制備藥物的用途，特別是抗EBV驅動的惡性生長，用于抗埃-巴二氏病毒感染的接種和免疫治療，并且涉及所述抗體試劑用作用于體外和體內檢測EBV轉化(腫瘤)細胞診斷法的用途。此外，涉及提高這些肽和抗體試劑的診斷和治療功效的它們的修飾。
背景技術：
埃-巴二氏病毒(EBV)是普遍存在的人皰疹病毒，最初與伯基特氏淋巴瘤(BL)的非洲形式(地方性)相關發(fā)現這種病毒。接著也與鼻咽癌(NPC)相關發(fā)現了這種病毒，并且證明它是傳染性單核細胞增多癥(IM)的成因物質。兒童期早期通常發(fā)生感染，普遍導致亞臨床表現，偶爾伴隨輕度癥狀。但是，青春期或成年期的感染帶來特征在于外周中存在非典型淋巴細胞的IM的危險。這些大批淋巴細胞是T淋巴細胞；但是，它們中包括小部分受EBV感染的B淋巴細胞。B淋巴細胞感染也可以體外完成。這樣的細胞在培養(yǎng)物中變得被轉化并且無限增殖，并且被稱作″永生的″，″潛伏感染的″或者″生長轉化的″。迄今為止已知，被EBV感染的所有的個體生命中保持潛伏感染。這反映在整個生命中循環(huán)外周血淋巴細胞中持續(xù)存在少數EBV-基因組陽性的轉化B-細胞，并且口咽中連續(xù)而不是周期性脫落病毒。
大多數情況下，EBV感染導致淋巴增生性疾病，這些疾病可能暫時使人衰弱，但是總是良性的和自限性的。但是，在一些免疫抑制個體中，結果會不受控制地淋巴增生，導致完全惡性。主動免疫抑制個體發(fā)生這種情況，特別是接受環(huán)孢菌素A治療的接受器官或骨髓移植的個體，或者偶然地，在感染HIV個體的情況下，或者遺傳學上，受影響的攜帶XLP(x-連鎖淋巴增生綜合癥)基因的雄性的情況。在這些情況下，產生的惡性腫瘤來自EBV-感染的B細胞的多克隆增殖。另外，在這樣的患者中，在口腔毛狀粘膜白斑病病變中可檢查到病毒的不受控上皮復制。因此，免疫應答在EBV感染的控制中起著中心作用。
此外，在免疫活性個體中，EBV與惡性腫瘤正在生長的數目相關，它可以是淋巴或上皮來源的。例子是伯基特氏淋巴瘤(BL)，B-細胞非-何杰金氏淋巴瘤(B-NHL)，結節(jié)外T-/NK-細胞淋巴瘤(T/NK-NHL)，何杰金氏病(HD)，鼻咽癌(NPC))和胃腺癌(GC)(Baumforth等，J.Clin.Pathol.Mol.Pathol.(1999)52；307-322)。
很多年來，發(fā)生伯基特氏淋巴瘤(BL)的細胞系和EBV-轉化的外周血B-細胞，也稱作類淋巴母細胞系(LCL)，被認為是研究EBV-介導的轉化和癌發(fā)生的原型模型系統(tǒng)。最近幾年，已經測得原型病毒株B95-8的全DNA序列。對該序列的分析得出80個以上可讀框的鑒定(Baer等，Nature 310；207-211(1984))，已經體外和體內充分研究了它們的表達。
令人感興趣的是，在人惡性腫瘤中，這些基因中只有有限的一組被激活表達，稱之為潛伏基因轉錄物。主要地，在各種EBV-相關惡性腫瘤中發(fā)現了三種不同的潛伏基因轉錄模式。這些模式稱為潛伏I型，II型和III型。最新的數據表明存在使該分類系統(tǒng)復雜化的另外的轉錄物(zur Hausen等，Cancer Research，60(2000)；2745-2748和歐洲專利申請No.98200655.3)。
潛伏I型特征在于埃-巴二氏病毒核抗原1(EBNA-1；BKRF1)的表達和小的非編碼RNA的埃-巴二氏病毒早期RNA1和2(EBER-1和EBER-2)。最近，在表達潛伏I型模式的所有的細胞中發(fā)現了這些轉錄物中包括的數個小可讀框中新的一組具有潛在的蛋白質編碼能力的轉錄物(BARTs)。潛伏II型特征在于除了上述I型轉錄物之外另外的潛伏膜蛋白1(LMP-1；BNLF1)和LMP-2A/-2B(BNRF1)的表達。只有當病毒基因組是共價閉合的環(huán)形式時LMP2轉錄物才能夠被表達，因為這些轉錄物跨越病毒基因組上的末端重復，并且當病毒基因組是其線性″裂解″狀態(tài)時則不能形成。最近證明BARF1可讀框中編碼的跨膜蛋白在顯示潛伏I型或潛伏II型表型的EBV+上皮腫瘤中優(yōu)先表達(zurHausen等，Cancer Research，60(2000)；2745-2748和歐洲專利申請No.98200655.3)。潛伏III型特征在于除了II型編程轉錄物之外核抗原EBNA-2，EBNA-3A，EBNA-3B，EBNA-3C和EBNA-4(也分別稱作EBNA-2，-3，-4，-6和-5)的表達(Baumforth等，J.Clin.Pathol.Mol.Pathol.(1999)52；307-322，Cohen JI.New Engl.J.Med.(2000)343；481-492)。不同潛伏性相關轉錄程序的表達受宿主細胞參數的影響，如甲基化水平和細胞分化(Robertson KD，Curr.Top.Microbiol.Immunol.(2000)249；21-34)。近幾年，利用以RNA(逆)轉錄為基礎的技術或原位雜交和免疫組織化學染色技術，詳細確定了不同的潛伏型分布與各種EBV-相關惡性腫瘤的相關性。利用這些分析類型，體內在BL腫瘤細胞中和體外在分散的來自BL的細胞系中發(fā)現I型潛伏狀態(tài)(Baumforth等，J.Clin.Pathol.Mol.Pathol.(1999)52；307-322)。在免疫活性宿主的NPC，何杰金氏淋巴瘤的EBV-陽性體，T-/NK-細胞和B-細胞非-何杰金氏淋巴瘤(T-/NK-/B-NHL)和罕見胸腺和腮腺癌中發(fā)現II型潛伏狀態(tài)，而主要發(fā)生在無免疫應答個體中的前惡性腫瘤淋巴增殖和免疫母細胞雜交瘤以及在體外培養(yǎng)的大多數BL和LCL細胞系中發(fā)現III型潛伏狀態(tài)(Baumforth等，J.Clin.Pathol.Mol.Pathol.(1999)52；307-322)。在無免疫應答患者中還發(fā)現偶發(fā)性平滑肌肉瘤，其可以表達I型或II型模式。發(fā)現無免疫應答患者中EBV+上皮癌，如胃腺癌，鼻咽癌和罕見肝細胞癌表達I或II潛伏型，另外表達BARF1(zurHausen等，Cancer Research，60(2000)pp.2745-2748；Brink等，J.Clin.Microbiol.36(1998)pp.3461-3469和歐州專利申請No.98200655.3)。
因此，EBV-陽性腫瘤的特征在于病毒基因產物的激活表達，其中一些使得跨膜蛋白局限于腫瘤細胞的質膜。這些潛伏相關膜抗原是EBV+腫瘤細胞特異性識別的可能的靶物。
第一次感染宿主之后產生對EBV有效而終生的免疫應答。產生抗病毒結構成分(VCA和MA)和胞內核抗原(特別是EBNA)的抗體的效應B-細胞及與潛伏性III相關的核抗原(特別是EBNA3家族)及幾種與病毒基因表達裂解期相關的抗原反應的效應T-細胞在該應答中占優(yōu)勢。T-細胞靶物衍生自蛋白酶體復合物的消化作用和接著將小的肽片段轉運至MHC-I和MHC-II分子細胞表面之后EBV+細胞內部表達的蛋白質?？贵w抵抗從EBV-感染細胞釋放的完整的或片段蛋白質上構象和/或線性表位結構域。
認為識別潛伏-III特異性基因產物的T-細胞對于體內EBV+B-細胞潛在的贅疣的終生控制是非常重要的。認為抗MA復合體的抗體對于通過防止感染病毒體與EBV-受體即CD21結合的病毒中和是重要的。雖然在大多數EBV感染個體中可檢測到抗MA復合體的抗體，它們能介導體外清除MA表達病毒產生細胞，它們對體內EBV+腫瘤細胞根除的貢獻是零，因為EBV+腫瘤不表達MA。類似地，認為抗其它病毒結構蛋白質的抗體對于抗腫瘤免疫控制是沒有關系的。
為了誘導并保持抗體和T-細胞應答，吞噬細胞即所謂抗原呈遞細胞(APC′s)消化病毒抗原，所述細胞能在它們的細胞表面顯示這些抗原，或者是免疫復合體中捕獲的完整蛋白質(片段)的MHC-I/-II或者是I型，或者通過另外的表面受體。當遇到EBV抗原特異性T細胞或B細胞時，這些APC提供刺激性信號，導致產生效應B細胞和T細胞。
令人感興趣和令人驚奇的是，在EBV-感染的個體中幾乎檢測不到抵抗“非自身”潛伏性相關膜蛋白LMP1和LMP2的任何抗體或T-細胞反應性。因此這些蛋白質歸類為亞優(yōu)勢。迄今為止，還沒有人很詳細描述對BARF1蛋白質的應答。重要的是，迄今為止還沒有人描述過與在EBV-轉化的腫瘤細胞上表達的EBV編碼的潛伏性相關的膜抗原的推定的胞外域反應的(天然或體外產生的)抗體。
在具有如上所述抗優(yōu)勢抗原缺陷細胞免疫性的免疫缺陷患者中(特別是XLP-患者，移植物接受者和HIV-感染個體)，免疫系統(tǒng)不能根除表達潛伏性-III表型的EBV+B-細胞，因此使得它們不受控生長，常常導致惡性寡克隆和單克隆B-細胞腫瘤。
在非-無免疫應答(免疫活性)患者中，腫瘤形成過程(發(fā)病機理)復雜得多并且大半仍然沒有澄清，但是認為涉及直接生長刺激，免疫調節(jié)和這些細胞中表達的EBV基因產物誘導的編程性細胞死亡抗性，與失去調節(jié)的宿主細胞功能協(xié)同作用或者平行作用。
令人感興趣的是，免疫活性個體產生的腫瘤表達潛伏性I型或II型基因產物，而不表達潛伏性III型基因產物。雖然表達確定的″非自身″病毒基因產物(即與潛伏性-I/-II相關的蛋白質)，宿主免疫系統(tǒng)不根除這些腫瘤。這可能是這些腫瘤細胞上表達的潛伏型-I/-II基因產物的亞優(yōu)勢的直接結果，只是誘導次最優(yōu)的或不適當T-細胞免疫應答或者由于誘導局部T-細胞無效能，這是由于這些細胞分泌免疫調節(jié)物質，例如IL-10和LMP1(的片段)。或者，這可能是具有高水平編程性細胞死亡抗性的腫瘤細胞誘導和分泌的結果，例如上調A20/Bc1-2。
重要的是，攜帶EBV+腫瘤的免疫活性患者幾乎沒有明顯的與潛伏性相關的膜蛋白的T-細胞或抗體應答，雖然這些應答趨向于一定程度高于健康EBV攜帶者(Meij等，J.Infect.Dis.(1999)179；1108-1115和Frisan等，Blood(1995)86；1493-1501)。
因此，患有EBV+腫瘤的免疫活性患者不能對″非自身″腫瘤相關病毒基因產物產生有效免疫應答。腫瘤細胞誘導的免疫調節(jié)(抑制)和腫瘤細胞編程性細胞死亡抗性可以進一步使局部T-細胞免疫應答無效?？紤]到識別EBV+腫瘤細胞表面上表達的EBV特異分子(這里也稱作EBV-編碼的腫瘤相關的潛伏膜蛋白或者簡單地稱作EBV-編碼的膜蛋白)的抗體試劑應該更有效并且應該不受這些局部免疫逃避機理的影響。因此，長期以來，本領域感覺到鑒定這樣的EBV-編碼的膜蛋白的胞外域和抗所述結構域的抗體試劑的有效性需要開發(fā)抗EBV驅動的惡性腫瘤細胞生長的藥物和診斷法。
本領域描述了幾種EBV-編碼的腫瘤細胞相關膜蛋白；但是，還沒有證明這樣的膜蛋白包括胞外結構域，適合抗體相互作用。如上所述，還沒有人描述過抗這樣的結構域的抗體。首先以抗EBV轉化的B-細胞的T-細胞應答的功能分析為基礎懷疑確定的EBV編碼的腫瘤細胞相關的膜蛋白的存在，并且這些假設結構操作上定義為LYDMA(淋巴細胞確定的膜抗原)(Szigeti等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1984)81；4178-4182)。接著的研究表明LYDMA反應性大多確實來自細胞表面上MHC-I分子中呈遞的核抗原家族(特別是EBNA3家族)的肽片段(Burrows等，J.Exp.Med.(1990)171；345-349)。生物化學和分子分析和隨后的DNA測序研究表明存在至少兩種類型的潛伏性相關的膜蛋白，稱作LMP1和LMP2，后者以兩種形式存在，即LMP2A和LMP2B，LMP2B沒有LMP2A的前119個氨基酸(Rowe，Frontiers inBioscience(1999)4；346-371)。
編碼LMP1和LMP2的基因的序列分析表明這些蛋白質中存在幾個疏水性結構域，提示LMP1包含6個跨膜結構域，LMP2A和2B包含12個這樣的結構域(Rowe，Frontiers in Bioscience(1999)4；346-371)。
使用與LMP1和LMP2的提出的胞質區(qū)中的結構域反應的單克隆抗體，證明它們與EBV-感染細胞中的各種膜隔室締合。這些研究還表明，一同位于這些膜隔室中的LMP1和LMP2優(yōu)先在所謂包含微結構域或筏的鞘糖脂中(Clausse等，Virol.(1997)228；285-293)。
Khanna等(J.Exp.Med.176(1992)；169-176和Eur.J.Immunol.28(1998)；451-458)描述LMP1的肽片段是可能的HLA-相關抗原，并且歸因于對MHC介導的細胞免疫應答中所述片段的推定的作用。在細胞免疫應答中，自身和非自身蛋白質被表達并且胞內裂解成肽片段，并且與HLA復合，呈遞在細胞的外表面。這樣的片段不能被鑒定為觸發(fā)體液免疫應答的胞外表位，但是只是作為推定的HLA-相關表位發(fā)揮功能。Khanna等人沒有提示LMP1片段是否是LMP1的胞內，跨結構域或胞外部分。
第三種潛伏性相關膜蛋白最近被鑒定為在EBV基因組上BARF1可讀框中編碼，并且最早被描述為早期基因產物(Zhang等，J.Virol.(1988)62；1862-1869)。BARF1在EBV-相關癌中特異性表達并且在EBV-相關淋巴瘤中不表達(Zur Hausen等，上文，Brink等，上文，和歐洲專利申請98200655.3)。
對BARF1基因的結構幾乎沒有明確。最新數據表明N-末端單一跨膜結構域將BARF1固定在質膜中，并且可能也從細胞中分泌出來(Strockbine等，J.Virol.(1998)72；4015-4021)。包含與BARF1反應性的人血清可以介導清除BARF1-表達細胞，但是與這種清除活性相關的結構域還沒有被鑒定(Tanner JE，等，J.Infect.Dis.(1997)175；38-46)。
在LMP1，LMP2和BARF1的表征中，沒有考慮或證實這些蛋白質是否包含實際上從細胞膜突出的外部胞外環(huán)，并且抗這樣的推定的環(huán)抗體是否能產生也是未知的。
現在本發(fā)明第一次提供了EBV-轉化的哺乳動物細胞的細胞外表面上表達的埃-巴二氏病毒(EBV)編碼的膜蛋白的胞外表位的鑒定方法，包括步驟
A)提供EBV基因組的至少一個可讀框(ORF)的氨基酸序列，B)確定A)的氨基酸序列中包含的至少一個推定的胞外結構域，C)制備包括推定的B)的胞外結構域或者其部分的肽，該肽不包括全長ORF，D)制備能與C)的肽特異性結合的抗體試劑，E)使D)的抗體試劑與存活的EBV轉化的哺乳動物細胞反應，F)檢測抗體試劑與EBV轉化的哺乳動物細胞的細胞表面的特異性結合。
術語“胞外表位，在細胞外表面上表達”在這里定義是蛋白質的部分，當在天然蛋白質中存在時，它在細胞外表面呈現。因此認為所述表位是所述蛋白質的胞外部分，并且可能在觸發(fā)抗所述蛋白質的體液免疫應答中起著重要的作用，這與蛋白質片段相反，蛋白質片段可能在與HLA相關的細胞外表面呈現。后一種蛋白質片段，當在天然蛋白質中存在時，可以是蛋白質的胞內，跨膜或胞外部分，或者其組合。后面這些片段可能在細胞MHC介導的免疫應答中起作用。有關細胞和體液免疫應答途徑的綜述，參考Roitt，I.M.，Essential Immunology，第9版(1997)，Blackwell Science Inc.New York，USA，這里引作參考。
術語″蛋白質″包括單鏈多肽分子及其中各個構成多肽通過共價或非共價方式連接的多個多肽復合體。術語″肽″包括長度是兩個或多個氨基酸的肽，一般具有多于5，10或20個氨基酸。100個氨基酸以上的氨基序列稱作“蛋白質”。
LMP1，LMP2和BARF1的氨基酸序列在前面的研究中已經確定，并且容易從Genbank和Swiss-Prot數據庫(例如LMP1BAA00948；LMP2aAAA45884；BARF1CAA24809)獲得。
本領域技術人員能容易確定ORFs以及推定的胞外結構域，例如通過應用本領域公知的合適的計算機程序，例如GCG Wisconsin軟件包(Wisconsin大學，Genetics Computer Group Inc.U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research12387)中提供的程序。
很多制備肽的方法是本領域公知的；例如利用Fmoc化學利用固相肽合成儀(例如從Applied Biosystems，USA獲得的)，通過天然蛋白質的酶學或化學裂解，或者通過基因工程技術，能合成肽。根據本發(fā)明方法使用的肽可以包括推定的胞外結構域的完全序列或者其部分，只要能制備與所述肽部分特異性結合的抗體試劑(見下文)。此外，肽可以包含另外的序列，例如另外的氨基酸片段，使得肽與固相基質(例如樹脂，用于柱色譜)偶聯，或者可以與用于偶聯載體蛋白質(例如鏈霉抗生物素蛋白)的另外的小的分子(例如生物素)連接。
在本領域中具有特異性肽結合能力的抗體試劑的制備方法是公知的(參見Current Protocols in Immunology(編者J.E.Coligan等；Publ.J.Wiley & Sons，1992-2001，這里引作參考))。通過對幼稚的或產生特異性抗體的B-細胞進行篩選并且使其無限增殖，并且通過遺傳工程，例如通過利用這樣的B-細胞中包括的遺傳信息建立表達文庫，即通過克隆動物或人的所有組成成分并且在微生物中表達，或者通過完全人工構建這樣的文庫，用感興趣的蛋白質對動物包括人特異性免疫之后，可以制備抗體試劑。但是，作為第一步，優(yōu)選使用動物的多克隆抗血清，所述動物用針對在根據本發(fā)明方法的步驟D)中要制備的并且要在步驟E)中使用的抗體試劑的令人感興趣的肽免疫。
“特異性結合”在這種情況下指特異的表位-抗體獨特型相互作用，不包括非特異性蛋白質/蛋白質相互作用?？贵w試劑與包含確定氨基酸序列的肽的結合通過抗體上的“獨特位”介導。獨特位作為抗體分子的可變區(qū)中構象結構域而被包含，并且由所謂互補決定區(qū)的三維折疊而產生。認為通過形成抗體骨架結構的恒定區(qū)或側翼區(qū)的結合不是特異性的。因此，根據本發(fā)明的肽至少包括一個表位。術語表位和獨特位是本領域公知的；參考Roitt I.M.，上文。特異性結合的抗體試劑的篩選和分離方法以及特異性和非特異性結合的區(qū)分方法是本領域公知的，并且可以例如包括使特異性結合完整而非特異性結合取消的條件下的洗滌程序。
術語“抗體試劑”在本領域中一般都明白，并且指能特異性結合半抗原或表位的任何分子?？贵w分子由一般被稱作Fv-片段的抗原結合部分，稱作恒定區(qū)的結構部分，和通常稱作Fc-部分，也包括幾個恒定區(qū)的介導生物學功能的部分構成?？贵wFv-片段的抗原結合結構域由幾種構象確定的氨基酸序列構成，所述構象確定的氨基酸序列稱作互補決定區(qū)(CDR′s)，它們形成能與不同抗原分子相互作用的三維結構，抗原分子可以是半抗原，寡糖，寡核苷酸，寡肽，蛋白質或者其它分子。這樣的抗原-結合結構域能以各種各樣分子形式和復合體表達，同時保持它的抗原-結合性質。這樣的抗體，抗原-結合結構域或Fv-分子這里統(tǒng)稱作″抗體試劑″。
通過在抗體試劑能特異性結合存活的EBV轉化的細胞的細胞外表面上呈現的表位的條件下，使這樣獲得的抗體試劑，例如多克隆血清或者克隆的單一抗體或者其片段，體外優(yōu)選與存活的EBV轉化細胞反應，能監(jiān)測抗體試劑是否與EBV轉化的細胞的表面特異性結合。在本領域中，確定這樣的結合是否發(fā)生的的幾種方法是已知的；例如其中攜帶與其細胞外表面結合的抗體試劑的EBV轉化細胞被固定在懸浮液中或者顯微鏡載玻片上的原位染色技術。例如，可以使用對該抗體試劑特異性的并且與能目測的標記物偶聯的二抗來結合與EBV轉化細胞的細胞外表面結合的抗體試劑。對上述抗體試劑與EBV轉化細胞結合的檢測是所述肽為EBV感染細胞外表面上存在的一個表位的指征，因此鑒定為EBV編碼膜蛋白的胞外表位。
上述制備的抗體試劑因此能與EBV轉化細胞上的一個表位特異性結合。第二方面，本發(fā)明因此涉及選擇能與EBV轉化哺乳動物細胞外表面上表達的埃-巴二氏(EBV)編碼膜蛋白的胞外表位結合的抗體試劑的方法，包括步驟A)提供EBV基因組的至少一個可讀框(ORF)的氨基酸序列，B)確定A)的氨基酸序列中包含的至少一個推定的胞外結構域，C)制備包括B)的胞外結構域或者其部分的肽，該肽不包括全長ORF，D)制備能與C)的肽特異性結合的抗體試劑，E)使D)的抗體試劑與存活的EBV轉化哺乳動物細胞反應，F)檢測抗體試劑與EBV轉化的哺乳動物細胞的細胞表面的特異性結合。
G)選擇F)檢測的抗體試劑。
步驟A)-F)和上文對于表位的鑒定描述的一樣；抗感興趣的肽的抗體試劑能以多種不同抗體試劑的多克隆混合物存在，其中大部分對于制備的肽不是特異性的。能從抗體試劑制品篩選和分離特異性結合EBV編碼表位的抗體試劑。在本領域，從不同特異性的抗體試劑的混合物篩選和分離感興趣的抗體試劑的方法是公知的。
在優(yōu)選的實施方案中，制備和篩選單特異性抗體試劑(即與相同表位結合，但是結合強度會彼此不同或者彼此與該表位上不同的位點結合)，其中在上述步驟G)中包括步驟G1)用步驟C)的肽免疫動物，G2)制備包括抗體試劑的免疫動物的體液，G3)制備包括與所述基質結合的肽的固相親和基質，G4)使體液和基質接觸，G5)使來自體液的抗體試劑與所述基質結合的肽特異性結合，G6)分離與所述肽特異性結合的抗體試劑。
通過如上所述將感興趣的肽注射給動物，優(yōu)選哺乳動物，包括人，能夠實施對動物的免疫。當通過這樣的免疫法制備步驟D)中的抗體試劑時，步驟G1)和G2)一起與步驟D)一樣。免疫會產生多克隆抗血清，其包括至少一種對感興趣的肽(即上述表位)特異性的抗體。
如果，例如，從動物例如從兔或豚鼠或者甚至人制得作為多克隆血清的抗體試劑，能分離接受免疫的動物的B細胞，并且用于通過雜交瘤技術或者其改進技術制備單克隆抗體(Kohler和Milstein，Nature256(1975)495-497；van Meel等，J.Immunol.Meth.80(1985)267-276；Steenbakkers等，Human Antibodies andHybridomas4(1993)166-173；Schmidt等，J.Immunol.Meth.255(2001)93-102)。因此，在本發(fā)明另一個實施方案中，制備和篩選單克隆抗體，其中上述步驟G)包括步驟G1)用步驟C)的肽免疫動物，G2)從G1)接受免疫的動物提供生產抗體試劑的B細胞，G3)制備包括與所述基質結合的肽的固相親和基質，G4)使G2)的B細胞和基質接觸，G5)使B細胞與所述基質結合的肽特異性結合，G6)分離與所述肽特異性結合的B細胞。
步驟G1)中對動物，優(yōu)選哺乳動物，包括人的免疫得到產生與所述肽特異性結合的抗體的B-細胞，從接受免疫的動物的循環(huán)系統(tǒng)或者確定的淋巴器官即脾，淋巴結或骨髓能獲得所述B細胞。B細胞與合適的基質結合的方法以及其分離方法是本領域公知的。分離的B細胞能被用于使用上文提到的雜交瘤融合技術制備單克隆抗體。
在下面的步驟中，所述肽與用于柱色譜的固相基質例如樹脂或者例如本領域的磁珠的固體珠結合，肽與固體基質結合的方法是公知的。本領域技術人員也知道本領域可獲得的合適的基質。對于合適的結合，肽可以包括另外的氨基酸，例如賴氨酸殘基序列段，或者有利于肽與基質結合的其末端的間隔臂。
接受免疫的動物的體液例如腹水，全血或血清中能獲得多克隆抗體。
在下面的步驟中，在抗體能與結合了所述基質的肽結合的這樣的條件下，體液接觸步驟G2)的基質。術語“體液”也意在包括例如通過純化步驟獲得的包括來自所述體液的多克隆抗體的任何液體介質。能與基質上的肽特異性結合的抗體與之結合；通過選擇合適的結合條件，或者通過使抗體與之結合的基質進行洗滌程序，其中非特異抗體被洗掉，特異抗體保持與肽結合，來消除任何可能的非特異性結合。本領域技術人員能確定合適的結合條件和洗滌條件。
例如通過上面提到的洗滌程序，和/或通過將固體基質從結合或洗滌介質中回收，能方便地分離特異性結合了肽的抗體試劑。在基質包括磁珠的情況下，通過磁力能分離結合了基質的特異抗體；在第二個步驟中，能去除抗體和肽之間的結合，得到分離形式的特異抗體。在基質包括裝填在色譜柱中的樹脂的情況下，在第一步驟中從柱中洗出非特異抗體和其它成分；接著通過從柱子洗脫能分離抗體。
優(yōu)選地，從上面討論的EBV編碼的膜蛋白LMP1，LMP2和BARF1選擇根據本發(fā)明方法提供的ORFs，其氨基酸序列是本領域公知并且公開的(GenBank登記號LMP1BAA00948；LMP2aAAA45884；BARF1CAA24809，這里引作參考)。最優(yōu)選地，從選自下面的氨基酸序列中選擇推定的胞外域SEQ ID 1 (LMP 1，胞外環(huán)1)，SEQ ID 2 (LMP 1，胞外環(huán)2)，SEQ ID 3 (LMP 1，胞外環(huán)3)，SEQ ID 4 (LMP 2，胞外環(huán)1)，SEQ ID 5 (LMP 2，胞外環(huán)2)，SEQ ID 6 (LMP 2，胞外環(huán)3)，SEQ ID 7 (LMP 2，胞外環(huán)4)，
SEQ ID 8 (LMP2，胞外環(huán)5)，SEQ ID 9 (LMP2，胞外環(huán)6)，SEQ ID 10 (BARF1，SEQ40-79)，SEQ ID 11 (BARF1，SEQ80-154)，SEQ ID 12 (BARF1，SEQ155-188)和SEQ ID 13 (BARF1，SEQ188-221)。
使用上述序列發(fā)現，能選擇和分離對于所述肽特異性的抗體試劑，所述肽在EBV-轉化的哺乳動物細胞的細胞外表面上表達(參見實施例1-3)。因此，所述肽可以被鑒定為胞外EBV編碼的表位，并且能產生對所述表位特異性的抗體試劑。例如通過用位于疏水性的所述蛋白質的推定跨膜結構域之間的具有以LMP1和LMP2的已知的氨基酸序列部分為基礎的氨基酸序列的合成肽(即包括SEQ ID No.1-9任一個的肽)對兔子免疫，能產生多克隆抗體。此外，能使用包括BARF1的推定單一跨膜結構域的部分的合成肽(即包括SEQ ID No.10-13任一個的肽)。
在非常優(yōu)選的實施方案中，上述本發(fā)明方法的步驟C)的肽包括兩個半胱氨酸殘基，位于推定的胞外域或者其部分之間，所述半胱氨酸殘基被氧化，在所述半胱氨酸殘基之間形成S-S鍵。這樣的肽包括受限“強制(forced)環(huán)”形式的胞外域，模擬該結構域的天然構象，此時天然蛋白質部分在細胞膜中。能證明受限構象肽導致抗體試劑的改進的特異性結合，這樣改善抗體試劑的選擇和分離(參見例如實施例2-4)。肽也能包括另外的修飾作用，例如上文對于改善的與基質結合所討論的。
除了上述其中選擇和分離單特異性和單克隆抗體試劑的本發(fā)明實施方案之外，本發(fā)明具體而非常有益的實施方案提供通過使用表達文庫產生的對EBV編碼的膜蛋白的胞外表位特異性的單克隆抗體試劑，因此，本發(fā)明提供能結合在EBV-轉化的哺乳動物細胞的細胞外表面上表達的埃-巴二氏病毒(EBV)編碼膜蛋白的胞外表位的單克隆抗體試劑的制備方法，包括步驟1)提供包括哺乳動物遺傳物質的表達文庫，2)使根據權利要求1鑒定的肽接觸所述文庫，3)使肽與所述文庫的生物體結合，
4)分離肽與之特異性結合的生物體，5)制備分離的生物體的單一克隆，6)在表達哺乳動物遺傳物質的條件下培養(yǎng)5)的克隆，7)分離步驟6)的表達產物。
在本領域，合適的表達文庫的制備方法是公知的。表達文庫是確定的一組原核或真核細胞或生物，和感染所述細胞或生物的病毒，其被利用遺傳工程而加以改變而表達異源蛋白質序列例如抗體。例如，幾本公開出版物中描述了人抗體文庫的構建和通過噬菌體展示技術對反應性抗體試劑篩選，和重組人抗體和抗體片段的表達[McCafferty等，Nature(1990)，348552；Griffiths等，EMBO J.(1994)133245；Marks等，J.Mol.Biol.(1991)222581；de Boer等，Hum.Antibod.Hybridomas(1994)5，57-64；Vaughan等，Nature Biotech.(1996)14309；和de Haard等，J.Biol.Chem.(1999)27418218]?！安溉閯游镞z傳物質”在這里理解是與哺乳動物DNA或RNA序列的序列同源性至少60％，優(yōu)選至少80％，最優(yōu)選95-100％的至少50個，優(yōu)選至少100個核苷酸的序列段。因此，所述材料可以是例如合成來源的及從天然來源得到的。
通過使感興趣的即包括根據本發(fā)明上述方法鑒定的胞外域的肽與表達文庫接觸，實現肽與其表面上表達抗體試劑的文庫中的特異克隆結合。因此，肽可以與固相結合或者優(yōu)選與可選擇部分例如生物素部分提供，使得通過利用例如鏈霉抗生物素蛋白樹脂或鏈霉抗生物素蛋白-磁珠從文庫中分離與肽結合的克隆。但是，也可以使用本領域公知的用于從文庫中分離克隆的任何合適的技術(Steenbakkers等，HumanAntibodies and Hybridomas4(1993)166-173；Sawyer等，J.Immunol.Meth.204(1997)193-203；Hoogenboom HR，Tibtech15(1997)62-70；de Haard等，Clin Diagn Lab Immunol.1998年9月；5(5)636-44)；Hanes和Pluchthun，Curr Top MicrobiolImmunol.243(1999)107-22；Hoogenboom和Chames，Immunol.Today21(2000)371-378)。優(yōu)選地，對這樣分離的克隆檢查與衍生肽的蛋白質的結合能力，和/或與EBV-轉化的細胞的細胞外表面的結合能力，如上所述?？赡苄枰貜碗?結合和篩選循環(huán)來實現具有期望的肽-結合活性的克隆家族的富集。Hoogenboom等，Adv.DrugDeliv.Rev.31(1998)5-31。
在具體的實施方案中，如上所述，肽以受限形式存在。
通過本領域公知的技術能制備單一克隆。因此有吸引力的技術是通過限制稀釋克隆篩選結合克隆(群體)之后，通過對宿主細胞的限制稀釋培養(yǎng)能在群體中篩選各克隆，可以分離表達單一抗體的群體。在它們與EBV-轉化的細胞上呈遞的(受限)肽或者完整蛋白質表位代表的LMP1，LMP2和BARF1的胞外域結合時可以對這樣的各個克隆評價它們的表位結合特性。本領域技術人員知道合適的克隆分離技術。
可以在表達哺乳動物遺傳物質即編碼特異抗體基因的條件下培養(yǎng)這樣制備的克隆。所述培養(yǎng)條件是本領域公知的。[參見，例如Bothman和Pluchthun，Nature Biotech.16(1998)376-380；Shusta等，NatureBiotech.16(1998)773-777；Liang等，J.Immunol.Meth.247(2001)119-130]。通過分離的克隆的表達產物的分離能獲得抗體試劑，如果期望，根據本領域公知的方法進一步純化[參見，例如，CurrentProtocols in Immunology(編者J.E.Coligan等，PUBL.J.Wiley &Sons.1992-2001)]。
優(yōu)選地，上述方法中使用的表達文庫是包含至少109，優(yōu)選至少1012，最優(yōu)選大約1015種不同克隆的高多樣性文庫。本領域可獲得合適的高多樣性文庫；例如Vaughan等Nature Biotech.14(1996)309-314描述的單鏈抗體噬菌體文庫或者de Haard等，J.Biol.Chem.274(1999)18218-18230描述的人Fab片段。
通過使用利用高多樣性表達文庫(參見例如Hoogenboom和Chames，Immunol.Today(2000)，21卷8期，371-378頁綜述)制備的多克隆和單克隆抗體，能證明LMP1，LMP2和BARF1包括用于抗體試劑的EBV轉化細胞的細胞表面暴露的和可使用的胞外結構域，因此可能是特異治療方法的一個靶物(參見實施例3)。如實施例3所述，第一次篩選實驗使用有限多樣性抗體文庫，主要得到與篩選肽常見的s-s受限接頭結構反應的噬菌體克隆，不能篩選對單一選擇的LMP1，LMP2或BARF1肽結構有有限反應性的特異克隆。
在根據本發(fā)明的單克隆抗體試劑制備的非常吸引人的實施方案中，肽是存活的EBV轉化細胞外表面上表達的表位。因此，代替分離的肽，可以使用根據本發(fā)明鑒定的在它們的外表面表達一個或多個表位的存活的EBV轉化細胞。因此，本發(fā)明涉及能結合在EBV-轉化的哺乳動物細胞的細胞外表面上表達的埃-巴二氏病毒(EBV)編碼的膜蛋白的胞外表位的單克隆抗體試劑的制備方法，包括步驟1)提供包括哺乳動物遺傳物質的表達文庫，2)使根據本發(fā)明鑒定的在它們表面表達一個或多個肽表位的存活的EBV轉化的細胞接觸所述文庫，3)使細胞與所述文庫的生物體特異性結合，4)分離細胞與之特異性結合的生物體，5)制備分離的生物體的單一克隆，6)在表達哺乳動物遺傳物質的條件下培養(yǎng)5)的克隆，7)分離步驟6)的表達產物。
在該方法中，抗體噬菌體文庫與存活的EBV轉化B細胞接觸。結合的噬菌體被洗脫出，并且能進一步篩選與對照EBV陰性B-細胞的無反應。令人吃驚的是，這樣的噬菌體能與受限肽反應，而且還能較小程度與線性肽反應。從這些選擇的克隆中的一些獲得的可溶性Fab的免疫印跡分析表明與變性全長蛋白質的可檢測免疫反應信號。實施例4詳述該方法。
另一方面，本發(fā)明涉及包含至少109，優(yōu)選至少1012，最優(yōu)選大約1015不同克隆的高多樣性文庫用于制備能結合于EBV--轉化哺乳動物細胞的細胞外表面上表達的埃-巴二氏病毒(EBV)編碼的膜蛋白的胞外表位的單克隆抗體試劑的應用。令人吃驚的是，使用例如上文Haard等(1999)或de Boer等(1994)描述的擴大多樣性的人Fab噬菌體文庫，獲得與各個選擇的肽反應的多個噬菌體克隆，或者是受限形式或者是線性形式，并且也與包含選擇表位的完整蛋白質反應(參見實施例3)。
本發(fā)明還提供根據本發(fā)明任何上述方法可獲得的，能與EBV-轉化的哺乳動物細胞的細胞表面上表達的埃-巴二氏病毒(EBV)編碼的膜蛋白的胞外表位結合的抗體試劑。
本發(fā)明還涉及能與選自SEQ ID No.1-13的氨基酸序列，與和SEQID No.1-13的氨基酸序列之一有至少80％優(yōu)選90％更優(yōu)選95％或者更多同源性的氨基酸序列特異結合的抗體試劑。因此，本發(fā)明還涉及與具有本發(fā)明的SEQ ID No.1-13的任何肽的變體，同系物或衍生物特異性結合的抗體試劑，并且涉及編碼所述肽的核苷酸序列的變體，同系物或衍生物。
與本發(fā)明的氨基酸序列相關的術語″變體″或″衍生物″包括對序列的一個(或多個)氨基酸的取代，改變，修飾，置換，缺失或添加，條件是根據本發(fā)明的抗體試劑能特異性結合得到的氨基酸序列，優(yōu)選至少具有和序列表中列出的多肽相同的結合特異性。本發(fā)明包括這樣的變體和衍生物。
已經證明抗細胞膜中蛋白質的胞外域但是顯然從細胞表面排除的抗體試劑與靶細胞表面結合并且介導多種生物學性質(Glennie MJ和Johnson PWM.Immunol.Today(2000)21；403-410)。
結合時，這樣的抗體試劑可以誘導膜蛋白從細胞表面的聚集和內化或釋放。或者，與細胞表面結合的抗體試劑可以結合并激活補體級聯的成分，引起靶細胞溶解。類似地，細胞表面結合的抗體試劑可以結合″殺傷″-淋巴細胞上的Fc-受體并且接著激活導致靶細胞溶解的殺傷過程。此外，帶有毒素分子，放射性物質或者生物學應答修飾劑的抗體試劑可以對靶細胞引入特異改變。另外，可以在細胞毒性T-細胞和″殺傷″細胞的細胞表面分子中摻入抗體試劑，從而再次使這樣的細胞毒性殺傷細胞針對靶細胞。最后，在用于診斷目的的靶細胞檢測和觀測中可以使用帶有放射性標記或者其它示蹤劑分子的抗體試劑。
根據本發(fā)明的抗體試劑特別適合結合循環(huán)中的，人體內(腫瘤)組織中的和其它體外和體內可能含有EBV-感染細胞的生物學樣品中的EBV+(腫瘤)細胞。
根據本發(fā)明的抗體試劑特別適合檢測外周血中的，人(腫瘤)組織樣品中的和其薄切片中的陽性(EBV+)腫瘤細胞，用于使基因治療載體，″殺傷″淋巴細胞，放射性標記物，毒素和另外的生物學修飾劑定向于患者體內的和可能含有EBV-感染的(腫瘤)細胞的生物學樣品中的EBV+腫瘤細胞。
術語“抗體試劑”上面定義過。根據本發(fā)明，抗體還可以包括突變，例如缺失，添加和取代突變，只要這樣的突變的抗體試劑仍然能特異性結合上面提到的氨基酸序列之一。抗體試劑能被用于體內和體外結合EBV感染的細胞。
因此，本發(fā)明能鑒定作為觸發(fā)體液免疫應答的表位的EBV-編碼的膜蛋白LMP1，LMP2和BARF1的胞外域，并且能制備包括所述結構域的肽和抗所述胞外域的抗體試劑。
本發(fā)明在下面這方面涉及能被根據本發(fā)明鑒定的抗體試劑結合的分離的肽。通過定義，這樣的肽包括至少一個與所述抗體試劑相互作用的表位，優(yōu)選地，所述肽選自SEQ ID 1(LMP1，胞外環(huán)1)，SEQ ID 2(LMP1，胞外環(huán)2)，SEQ ID 3(LMP1，胞外環(huán)3)，SEQ ID 4(LMP2，胞外環(huán)1)，SEQ ID 5(LMP2，胞外環(huán)2)，SEQ ID 6(LMP2，胞外環(huán)3)，SEQ ID 7(LMP2，胞外環(huán)4)，SEQ ID 8(LMP2，胞外環(huán)5)，SEQ ID 9(LMP2，胞外環(huán)6)，SEQ ID 10 (BARF1，SEQ40-79)，SEQ ID 11 (BARF1，SEQ80-154)，SEQ ID 12 (BARF1，SEQ155-188)和SEQ ID 13 (BARF1，SEQ188-221)。
根據本發(fā)明的這些肽分別構成LMP1，LMP2和BARF1的胞外域，這在實施例1中證明。上述LMP1，LMP2和BARF1的氨基酸序列的編號和SWISS PROT或GENBANK DATABASE中使用的編號一樣。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及包括選自SEQ ID No.1-13的氨基酸序列的分離的肽或蛋白質，不是全長LMP1，LMP2或BARF1序列，也不是與之同源性90％或更多。這意味著SEQ ID No.1-13中的任一個編碼的氨基酸序列可以被例如摻入在非天然環(huán)境中，例如氨基酸序列側翼，沒有或只有部分存在于天然LMP1，LMP2或BARF1中所述序列的側翼。例如，本發(fā)明包括其中存在LMP1，LMP2或BARF1的胞外域的任一個的雜合蛋白質。這樣的雜合蛋白質可以被用作例如載體蛋白質，其能被用作主動免疫接種和免疫治療的免疫原(參見例如實施例2)。考慮到LMP1，LMP2和BARF1和它們衍生的亞分子肽結構域在人宿主EBV-感染中天然的幾乎沒有免疫原性(參見例如Meij等，上文)，使LMP1，LMP2和/或BARF1序列與載體序列偶聯是特異性免疫接種并且對免疫系統(tǒng)呈遞LMP1，LMP2和BARF1序列的有效工具，并且會刺激并改善對LMP1，LMP2和BARF1的特異免疫應答。使低內源免疫原性的蛋白質，其片段或確定的肽序列與載體蛋白質例如匙孔血藍蛋白，破傷風類毒素偶聯和/或與用于改進它們的免疫原性的佐劑例如弗氏佐劑，BCG或Alum(等)混合的方法是本領域公知的。
優(yōu)選地，本發(fā)明的肽或蛋白質包括少于100個氨基酸。
優(yōu)選地，本發(fā)明的肽或蛋白質分子包括具有比LMP1，LMP2和BARF1蛋白質的全長氨基酸序列少的氨基酸的序列，但是分別包含SEQ IDNo.1-3，4-9和10-13之一或多個。特別是對于LMP1，優(yōu)選缺失第一跨膜螺旋中存在的免疫抑制結構域LALLFWL的序列(Dukers等，J.Immunol.(2000)165；663-670)。
本發(fā)明還涉及包括與SEQ ID No.1-13的任何氨基酸序列有至少80％，優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％同源性的，但不是全長LMP1，LMP2或BARF1序列，也不是與之具有90％或更高同源性的氨基酸序列的肽或蛋白質。這樣的同源肽或蛋白質編碼本發(fā)明氨基酸序列的變體或衍生物。
應該可以理解，本發(fā)明中使用的氨基酸序列還包括從任何來源獲得的同源序列，例如相關的病毒/細菌蛋白質，細胞同源物和合成肽，以及其變體或衍生物。
在本發(fā)明中，考慮同源序列包括與這里的序列表中給出的氨基酸序列之一在至少5個，優(yōu)選8個，更優(yōu)選10個氨基酸的氨基酸水平上有至少80％，優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％或98％同一性的氨基酸序列。雖然也可以以相似性(即具有相似化學性質/功能的氨基酸殘基)考慮同源性，但是在本發(fā)明中，優(yōu)選以序列同一性表達同源性。
用眼能進行同源性比較，或者更通常情況下，借助容易獲得的序列比較程序。這些商業(yè)上可獲得的計算機程序能計算兩個或多個序列之間的百分同源性。
可以對連續(xù)序列計算百分同源性，即一個序列與另一個序列比對，并且一個序列中的氨基酸直接與另一個序列中的相應的氨基酸比較，一次比較一個殘基。這稱作“沒有空位的”比對。典型地，只對相對少數目的殘基進行這樣的沒有空位的比對(例如少于50個連續(xù)氨基酸)。
雖然這是非常簡單而一致的方法，但是它不能考慮到例如本來應當相同的一對序列，一處插入或缺失會引起下面的氨基酸殘基不在比對之內，因此當進行綜合比對時可能導致百分同源性大大降低。結果，設計的大多數序列比較方法產生最佳比對，考慮到可能的插入和缺失，沒有罰分不適當總同源性評分。通過在序列比對中插入“空位”嘗試將局部同源性最大化來實現。
但是，這些更復雜的方法對比對中存在的每一個空位分配“空位罰分”，這樣，對于相同數目的相同氨基酸，具有盡可能少的空位的序列比對-反映兩個相比較序列之間的較高相關性-達到比具有很多空位的那些更高的評分。一般使用“有密切關系空位值”，它對空位的存在罰去相對高的值，對空位中每一個下面的殘基罰去較小的分。這是最常使用的空位評分體系。高空位罰分當然產生優(yōu)化的與較少空位的比對。大多數比對程序使得空位罰分被修飾。但是，當使用這樣的軟件用于序列比較時優(yōu)選使用默認值。例如，當使用GCG WisconsinBestfit軟件包(上文)時，對于氨基酸序列的默認空位罰分對于一個空位是-12，對于每一個延伸是-4。
因此最大百分同源性的計算首先要求產生最佳比對，考慮到空位罰分。進行這樣的比對的合適的計算機程序是GCG Wisconsin Bestfit軟件包，上文。能進行序列比較的其它軟件的例子包括但不限于，BLAST軟件包(參見http//www.ncbi.nih.gov/BLAST/)，FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410；例如在FASTA可實現http//www.2.ebi.ac.uk.fasta3在線檢索)和比較工具程序組GENEWORKS。但是優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。
雖然能以同一性形式測量最后的同源性百分比，但是比對過程本身一般不以全-或無對比較為基礎。取而代之的是，一般使用帶比例的相似性評分矩陣，它以化學相似性或進化距離為基礎對各對比較評分。通常使用的這樣一種矩陣的例子是BLOSUM62矩陣-BLAST程序組的默認矩陣。GCG Wisconsin程序一般使用公共默認值或者自定義符號比較表，如果提供的話(詳情參見使用者手冊)。對GCG軟件包優(yōu)選使用公共默認值，或者在其它軟件情況下，使用默認矩陣，例如BLOSUM62。
一旦軟件產生一個最佳比對，就可能計算同源性％，優(yōu)選序列同一性％。作為序列比較的部分，軟件一般做這項工作，并且產生數字結果。
可以修飾LMP1，LMP2或BARF1的胞外域上的氨基酸序列用于本發(fā)明。一般情況下，進行保持序列結合特異性的修飾作用。可以進行氨基酸取代，例如1，2或3至10個取代，前提是被修飾序列保留與根據本發(fā)明的抗體試劑的結合特異性。氨基酸取代作用可以包括使用非天然存在的類似物，例如具有保守特征的類似物(見下表)，或D-氨基酸，或者側鏈修飾的氨基酸，合成修飾的氨基酸，例如提高治療性施用的多肽的血漿半壽期。
例如可以根據下表進行保守取代。第二欄中相同格中的氨基酸，優(yōu)選第三欄中同排中的氨基酸可以彼此取代
一般通過重組方法制備本發(fā)明中使用的肽，例如如上文Maniatis等所述。但是，也可以利用技術人員公知的技術例如固相合成法的合成法進行制備。本發(fā)明的肽還可以制成融合蛋白，例如有助于提取和純化。融合蛋白配偶體的例子包括谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA結合和/或轉錄激活結構域)和β-半乳糖苷酶。還可以方便地包括使得去除融合蛋白序列的融合蛋白配偶體和感興趣的肽序列之間的蛋白水解酶切位點。優(yōu)選地，融合蛋白不防礙感興趣序列的肽的結合特異性。
本發(fā)明的肽和抗體試劑可以是基本上分離的形式。要明白肽/抗體試劑可以與不干擾它想要的目的的載體或稀釋劑混合，而且認為是基本上分離的。本發(fā)明的肽或抗體試劑還可以是基本上純的形式，在這種情況下，制劑中一般包括所述肽或抗體試劑，其中制劑中90％以上，例如95％，98％或99％是本發(fā)明的肽或抗體試劑。
本發(fā)明還涉及純化的核酸序列，包括編碼選自SEQ ID nos.1-13的氨基酸序列，不編碼全長LMP1，LMP2或BARF1序列，并且與之同源性不是90％或更高的核酸序列。
當已知氨基酸序列時，技術人員能容易制備這樣的核酸序列。為了體內和體外制備抗體試劑，核酸能夠被用來容易體內和體外制備LMP1，LMP2和BARF1的胞外域的氨基酸序列。
本發(fā)明的多核苷酸包括編碼本發(fā)明序列的核酸序列。技術人員明白由于遺傳密碼簡并性的結果，各種不同的多核苷酸能編碼相同的多肽。另外，要明白技術人員可以利用常規(guī)技術進行核苷酸取代作用，這種取代作用不影響本發(fā)明多核苷酸編碼的肽序列，反映了任何特定宿主生物體中密碼子應用，在所述生物體中表達本發(fā)明的肽。
本發(fā)明的多核苷酸包括DNA或RNA，優(yōu)選DNA。它們可以是單鏈或雙鏈的。它們也可以是其中包括合成的或修飾的核苷酸的多核苷酸。本領域已知很多不同類型對寡核苷酸的修飾作用。這，些包括磷酸甲酯和硫代磷酸酯主鏈，在分子的3′和/或5′端加吖啶或多賴氨酸鏈。對于本發(fā)明的目的，要明白可以用本領域可獲得的任何方法修飾這里描述的多核苷酸。為了提高本發(fā)明多核苷酸的體內活性或存活時間，可以進行這樣的修飾作用。
根據本發(fā)明的核苷酸序列還包括其變體，同系物和衍生物；這些定義為與編碼具有SEQ ID nos.1-13的肽或者編碼與之至少80％，優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％同源的其變體或衍生肽的任何一個的核酸序列至少80％，優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％同源的核酸序列。
與本發(fā)明的核苷酸序列相關的術語″變體″，“同系物”或″衍生物″包括對序列的一個(或多個)核酸的取代，改變，修飾，置換，缺失或添加，條件是得到的核苷酸序列編碼根據本發(fā)明的抗體試劑能與之特異性結合的肽，優(yōu)選和序列表中列出的序列一樣至少具有相同的與所述抗體試劑的結合特異性。本發(fā)明包括這樣的變體和衍生物。
在本發(fā)明的多核苷酸是雙鏈的情況下，本發(fā)明包括雙螺旋的兩條鏈，或者是單獨的或者是組合的。在多核苷酸是單鏈的情況下，要明白這個多核苷酸的互補序列也包括在本發(fā)明的范圍內。
優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸序列(多核苷酸)被插入到重組的可復制的載體中。
術語′載體′是本領域公知的。載體可以用來在相容宿主細胞中復制核酸。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明通過將本發(fā)明的多核苷酸導入可復制載體，將載體導入相容宿主細胞，并且在載體復制的條件下培養(yǎng)宿主細胞，提供了制備本發(fā)明的多核苷酸的方法?？梢詮乃拗骷毎厥蛰d體。合適的宿主細胞包括細菌，例如大腸桿菌，酵母，哺乳動物細胞系和其它真核細胞系，例如CHO細胞。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸在載體中與調控序列可操作性連接，所述調控序列能提供宿主細胞表達編碼序列，即載體是表達載體。術語″可操作性連接″意思是描述的成分處于允許它們以它們想要的方式發(fā)揮功能的關系中。以這樣一種方式連接與編碼序列″可操作性連接″的調控序列，使得在與調控序列相容的條件下實現編碼序列的表達。
例如通過添加另外的轉錄調節(jié)元件使得調控序列指導的轉錄水平更加響應轉錄調控劑，可以來修飾調控序列。
如下所述，本發(fā)明的載體可以被轉化或轉染到合適的宿主細胞中，提供本發(fā)明蛋白質的表達。該方法包括在提供編碼蛋白質編碼序列的載體表達的條件下培養(yǎng)用如上所述表達載體轉化的宿主細胞，并且任選地回收表達的蛋白質。
載體可以是例如提供了復制起點，任選的所述多核苷酸表達的啟動子和任選的啟動子的調節(jié)物的質?；虿《据d體。載體可以包含一個或多個可選擇標記基因，例如細菌質粒情況下的氨芐青霉素抗性基因或者對于哺乳動物載體的新霉素抗性基因?？梢允褂幂d體例如來轉化宿主細胞。
與編碼本發(fā)明蛋白質的序列可操作性連接的調控序列包括啟動子/增強子和其他表達調控信號?？梢赃x擇這些調控序列使之與設計在其中使用表達載體的宿主細胞相容。術于啟動子是本領域公知的并且包括大小和復雜程度覆蓋最小啟動子至包括上游元件和增強子的啟動子的核酸區(qū)。
一般從在哺乳動物細胞中發(fā)揮功能的啟動子中選擇啟動子，但是可以使用原核啟動子和在其他真核細胞中發(fā)揮功能的啟動子。啟動子一般來自病毒或真核生物基因的啟動子序列。例如，它可以是來自其中發(fā)生表達的細胞的基因組。關于真核細胞啟動子，它們可以是以普遍存在的方式發(fā)揮功能的啟動子(例如a-肌動蛋白，b-肌動蛋白，微管蛋白的啟動子)或者，是組織特異性方式(例如丙酮酸激酶基因的啟動子)。特別優(yōu)選的是對上皮細胞特異性的組織特異性啟動子，例如人角蛋白啟動子序列，其特異性調節(jié)和誘導正在分化的上皮細胞中不同角蛋白亞種的表達(Caldwell等，J.Virol.(2000)74；1101-1113)，和對淋巴樣細胞特別是B-淋巴細胞特異性的啟動子，例如免疫球蛋白重鏈(例如Eμ)啟動子序列，它特異性調節(jié)和誘導正在分化的B-淋巴細胞中免疫球蛋白重鏈的表達(Longan和Longecker J.Gen.Virol.(2000)81；2245-2252)。它們也是響應特異性刺激的啟動子，例如結合類固醇激素受體的啟動子。也可以使用病毒啟動子，例如Moloney鼠白血病病毒長末端重復(MMLV LTR)啟動子，勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子或人巨細胞病毒(CMV)IE啟動子。
可以誘導啟動子使得在細胞壽命期間能調節(jié)異源基因的表達水平也是有利的?？烧T導意思是能調節(jié)使用啟動子獲得的表達水平。
另外，通過加上其他調節(jié)序列例如增強子序列，可以修飾這些啟動子中的任一個。也可以使用包括上述兩個或多個不同的啟動子的序列元件的嵌合啟動子。
使用根據本發(fā)明的載體，能將編碼上述胞外域之一的核酸序列帶進原核或真核來源的生物宿主細胞。所述核酸序列可以被插入宿主的基因組，或者以染色體外元件存在。
為了復制載體/多核苷酸和/或表達本發(fā)明的多核苷酸編碼的本發(fā)明的肽的目的，本發(fā)明的載體和多核苷酸可以被導入宿主細胞。雖然可以使用原核細胞作為宿主細胞產生本發(fā)明的肽，但是優(yōu)選使用真核細胞，例如酵母，昆蟲或哺乳動物細胞，特別是哺乳動物尤其是人細胞。
應用本領域公知的各種技術，例如轉染，轉化和電穿孔，可以將本發(fā)明的載體/多核苷酸導入合適的宿主細胞中。對動物施用本發(fā)明的載體/多核苷酸情況下，幾種技術是本領域公知的，例如用重組病毒載體例如逆轉錄病毒，單純皰疹病毒和腺病毒轉染，直接注射核酸和生物轉化。這樣一種宿主細胞可以表達編碼LMP1，LMP2或BARF1的胞外域，或者其部分的氨基酸序列，產生足夠量的包括所述結構域的所述結構域或蛋白質/肽，例如用于制備用于接種和免疫治療的免疫原，或者用于制備根據本發(fā)明的抗體試劑(見下文)。例如參見Gurunathan等，Ann.rev.Immunol.(2000)18；927-974。
可以在使表達本發(fā)明的肽的合適的條件下培養(yǎng)宿主細胞。本發(fā)明的肽的表達可以是組成型的，使得它們能連續(xù)產生，或者可誘導，要求刺激物引發(fā)表達。在可誘導表達情況下，當要求例如對培養(yǎng)基加入誘導劑物質，例如地塞米松或IPTG時能引發(fā)蛋白質產生。
通過各種各樣的本領域公知的技術能從宿主細胞提取本發(fā)明的肽，包括酶促，化學和/或滲透溶胞作用和物理破碎。
此外，本發(fā)明涉及用根據本發(fā)明的載體轉化的細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞，更優(yōu)選人細胞。術語′轉化′指將外來遺傳物質帶給宿主細胞的任何方法。使用原核宿主細胞，本領域一般使用術語′轉化′。但是，該術語還包括′轉染′，將外來遺傳物質帶給真核特別是哺乳動物細胞時，一般使用該術語。幾種已知的轉染技術例如包括使用轉染試劑的那些，可增強哺乳動物細胞對裸核酸構建體的攝入。這些試劑的例子包括陽離子試劑(例如磷酸鈣和DEAE-葡聚糖)和脂質轉染劑(例如lipofectamTM和transfectamTM)。典型地，核酸構建體與轉染試劑混合產生組合物。然而，應該理解，術語“轉化”和“轉染”也指用病毒，如EBV感染(哺乳動物)細胞的過程。
在特別的實施方案中，本發(fā)明涉及導向于表達LMP1，LMP2或BARF1的細胞的導向細胞的制備方法，包括步驟-用根據本發(fā)明的抗體試劑的遺傳信息轉染細胞；-在所述導向細胞表面表達所述抗體試劑。
這樣的導向細胞能結合表達LMP1，LMP2和/或BARF1的細胞。靶細胞例如能來自原代T-，NK(天然殺傷)-淋巴細胞(攜帶Fc-受體的殺傷細胞或巨噬細胞)，以提高或修飾它們的靶細胞結合特異性，而不喪失特異受體傳遞信號功能。通過將來自抗體試劑的遺傳信息摻入所述細胞中，翻譯，并且將翻譯產物摻入細胞表面結構中，這樣被修飾的T-/NK-細胞可能能改善識別，結合和特異消除原本弱識別的和沒有識別的腫瘤細胞(例子R.J.Bolhuis和J.W.Gratama，GeneTherapy(1998)51153，Willemsen等，Gene Therapy(2000)71369；Calogero等，J.Immunotherapy(2000)23393)。
與表達LMP1，LMP2和/或BARF1的EBV感染細胞結合時，導向細胞通過觸發(fā)例如其特異溶解EBV感染細胞的溶胞作用級聯而滅活受感染細胞。
在另一個有吸引力的實施方案中，本發(fā)明涉及導向于表達LMP1，LMP2或BARF1的細胞的導向病毒顆粒的制備方法，包括步驟-將根據權利要求1的抗體試劑的遺傳信息克隆到病毒基因組中-在所述病毒顆粒的病毒外殼上表達所述抗體。
使用抗體試劑在遺傳學上影響或改變當前用于基因治療途徑的病毒的受體結合特征，它提供了具有改進的與定義的靶細胞的被動穿透結合的特異性的這樣的病毒，從而改善它們的治療特異性和效力(參見，例如Dimitriev等，J.Virol.(2000)746875)。
在上述根據本發(fā)明的病毒系統(tǒng)中，病毒顆粒能結合在它們的細胞表面上表達LMP1，LMP2或BARF1的EBV感染細胞。這樣的病毒顆粒可以遺傳工程產生，它包括病毒顆粒結合和穿透EBV感染細胞時表達的毒素或任何其它生物活性分子的遺傳信息，導致LMP1，LMP2或BARF1表達細胞的特異感染。
因為抗體試劑特異結合EBV+腫瘤細胞，所以這樣一種試劑特別用作對攜帶EBV陽性腫瘤患者的診斷或治療劑。抗體試劑可以連接放射性標記(I131/125，锝，ea.)，毒素(蓖麻毒A，白喉毒素，ea.)，藥物前體或者事實上任何生物反應修飾劑(IL-12，IP9，ea.)，從而介導改進的標記物向靶細胞的遞送。這可以導致腫瘤細胞小病灶特異性增強的診斷可見性(例如當使用放射性標記時)或者消除靶細胞(例如當使用放射性標記或毒素時)或者吸引并激活免疫細胞或旁觀細胞接近靶細胞(例如當使用淋巴因子時)。(例子M.J.Glennie和P.W.M.Johnson，Immunol.Today(2000)21403，Van Spriel等，Immunol.Today(2000)21391；P.J.Hudson，Curr.Opinion Immunol.(1999)11548)；Helfrich等，J.Immunol.Meth.(2000)237131)。
根據本發(fā)明的肽，多核苷酸和抗體試劑能有利地特別在EBV感染治療的藥物中使用。根據本發(fā)明的肽能被用作藥物例如疫苗中的免疫原，即作為EBV感染治療的活性成分。對受試者施用這樣一種藥物時，所述受試者的免疫系統(tǒng)會產生抗這種肽的抗體，這種抗體也與EBV+細胞反應，所述細胞在它們的表面上表達包括所述肽序列的蛋白質。因此，能在藥物中使用根據本發(fā)明的多核苷酸，特別用于治療EBV-感染。對受試者施用時，能將多核苷酸轉錄和/或翻譯成根據本發(fā)明的肽，其如上所述提供免疫原。還有，能在藥物中使用根據本發(fā)明的抗體試劑，特別用于治療EBV-感染。在那種情況下，抗體試劑優(yōu)選偶聯毒素或者其它生物修飾劑。對EBV-感染患者施用抗體試劑時，所述毒素或者修飾劑能以特定方式與個體的EBV+細胞(即EBV+腫瘤細胞)偶聯，導致基本上只特異消除EBV+細胞。
本發(fā)明的肽，核酸序列和抗體試劑優(yōu)選可以與各種不同的成分混合，制備本發(fā)明的藥物組合物或診斷組合物或者藥物。優(yōu)選地，組合物與藥學可接受載體或稀釋劑聯合，制備藥物組合物(其可以人用或動物用)。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水。本發(fā)明的組合物可以直接注射施用?？梢耘渲平M合物，用于腸胃外，肌內，靜脈內，皮下，眼內或經皮施用。一般情況下，可以以0.01至30mg/kg體重的劑量，優(yōu)選0.1至10mg/kg，更優(yōu)選0.1至1mg/kg體重的劑量施用每一種抗體試劑。例如，在本領域，以375mg/m2體表面使用抗-CD20 rituximab，這等于大約10mg/kg體重(Yang等，Blood 96(2000)，4055-4063)和以1mg/kg使用抗-CD25 Daclizumab(Vicenti等，New Engl.J.Med.338(1998)，161-165)。
可以以裸核酸構建體，優(yōu)選進一步包括與宿主細胞基因組同源的側翼序列，直接施用編碼根據本發(fā)明的肽的多核苷酸/載體。當作為裸核酸施用多核苷酸/載體時，施用的核酸的量一般是1微克至10毫克，優(yōu)選100微克至1毫克。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸或載體與藥學可接受載體或稀釋劑聯合，制備藥物組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水?？梢耘渲平M合物，用于腸胃外，肌內，靜脈內，皮下，眼內或經皮施用。組合物或藥物中也可以摻入轉染試劑，例如上面討論的陽離子試劑。
描述的給藥途徑和劑量只是為了作為指導，因為技術人員能容易確定給藥的最佳途徑和對于任何具體患者和癥狀的劑量。
特別地，本發(fā)明涉及EBV感染細胞，尤其是EBV+惡性細胞和EBV介導的疾病的診斷方法，包括步驟-從懷疑攜帶所述疾病感染的細胞的個體取細胞樣品；-使抗體試劑接觸所述細胞；-使抗體試劑與所述細胞反應，形成與EBV感染的細胞結合的抗體試劑復合體；-檢測所述復合體的存在。
樣品包括體液，例如血液和分離的血白細胞制劑，腹水，腦脊髓液或胸膜液抽出物，其可以含有潛在的EBV-攜帶腫瘤細胞或者組織活組織檢查標本或者從中獲得的細胞。有利地，在分析步驟之前去除沒有結合的抗體，例如通過一次或多次洗滌步驟。根據本領域公知的技術進行是否存在復合體的分析，通過，例如應用公知的免疫熒光或免疫-酶染色技術，通過例如將染色的細胞旋轉放到載玻片上并且通過熒光顯微鏡分析它們，或者通過應用FACS-技術分析懸浮液中的染色細胞，或者通過原位應用免疫組織化學染色技術。
例如，通過患有各種EBV-相關癌癥和/或急性原發(fā)EBV-感染患者固定的和滲透化處理的腫瘤組織切片中間接抗-LMP1抗體染色，可以原位觀察血液中EBV+-腫瘤細胞或循環(huán)的EBV-感染細胞?；蛘撸肍ACS-分析，可以使用抗體試劑直接目測活細胞(參見，例如Jiwa等，J.Clin.Pathol.(1995)48438；Wagner等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.(1995)2696；Herzenberg等，Immunol.Today(2000)21；386)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及特異性消除來自體內的細胞表面上表達LMP1，LMP2或BARF1或者其部分的細胞的方法，包括步驟-從個體分離一定數目的細胞-使分離的細胞接觸根據本發(fā)明的抗體試劑-負選擇其細胞表面上表達LMP1，LMP2，或BARF1的細胞，其中其細胞表面上不表達LMP1，LMP2，或BARF1的細胞存活。用這種方法，不表達EBV特異細胞表面蛋白質的分離的細胞存活，并且從任何存在的EBV-陽性(腫瘤)細胞中′清除′。當要將存活細胞再移植給個體時，該方法是特別重要的。
負選擇細胞的方法是本領域公知的；抗體試劑可以例如與例如磁珠偶聯，一種溶胞功能，即介導與指導殺傷細胞到細胞表面的抗體試劑結合的細胞表面的補體沉積的功能。技術人員知道多種負選擇的其它方法，根據本發(fā)明的靶細胞的體外溫育也可以認為是接觸和選擇步驟的組合。將細胞進行溶胞作用是負選擇的優(yōu)選途徑。
上述方法可以被用于腫瘤細胞清除，并且當從個體分離骨髓細胞時是特別有用的，所述分離的骨髓細胞要在個體接受放療或化療之后再次移植給所述個體。根據本發(fā)明，通過與純化的抗體試劑溫育并且接著接觸補體或殺傷細胞，導致抗體試劑與它們的表面結合的那些細胞的特異消除，可以在對患者再次輸入之前從腫瘤細胞清除骨髓樣品(參見，例如Berkahn，J.Hematother，Stem Cell Res.(2000)9147；Schroder等，Clin.Cancer Res.(2000)62521)。
參照下面的附圖和實施例將進一步詳細說明本發(fā)明，實施例不是為了限制本發(fā)明范圍。


圖1是推定的LMPl的結構的示意圖；圖2是推定的LMP2的結構的示意圖；圖3A-D說明免疫之前和免疫之后(加強)(A，B)兔抗-LMP1環(huán)血清(1∶100)的和來自兔血清的純化的Ab′s(C，D)的LMP1肽-或純化的LMP1蛋白質-包被的ELISA中測定的抗體反應性；圖3E-F說明分別使用兔抗-LMP2環(huán)2和環(huán)5血清的類似分析的結果；圖3G-I說明用從BARF1序列衍生的不同的肽免疫免疫的豚鼠血清的反應性；圖4說明用來自用圖3中描述的相關肽免疫免疫的動物的不同的血清探測的全長LMP1(A)，LMP2(B)和BARF1-GST蛋白質(C)的免疫印跡；A1MoAb OT22CN抗-LMP1 N-末端(AA1-13)A2R-a-LMP1環(huán)3B1前血清B2K153抗-LMP2(SDS-PAGE純化的LMP2)B3-4 &B5-6K154 & K155如B1-2B7抗-LMP2環(huán)5前血清B8抗-LMP2環(huán)5 B9-10與LMP2環(huán)2類似。
C4前血清C5GP-抗-BARF1-N-末端C6前血清C7GP-抗-BARF1-中部C8前血清C9GP-抗-BARF1-C-末端C10兔抗-BARF1-GST圖5給出顯微鏡觀察(200x)，說明使用抗-LMP1抗體試劑的丙酮固定的和滲透化的JY-細胞的特征性LMP1-特異染色；圖6給出柱形圖，說明用第3輪和4輪(參見實施例3)的不同的LMP1-環(huán)-1，-2，-3特異肽選擇的各個噬菌體-Ab克隆(每個柱形之下指明的)的肽ELISA的結果；圖7說明使用LMP1-環(huán)-1和環(huán)-3肽第三輪選擇之后獲得的各個克隆的DNA指紋分析的結果；圖8說明使用純化的LMP1作為抗原的ECL-蛋白質印跡分析，分析可溶性人噬菌體產生的Fab′s；1道和2道分別代表陰性對照和陽性對照反應，是用不相關的和抗-LMP1-特異性單克隆抗體獲得的。3-13道說明對于一些可溶性噬菌體Fab′s(#3，4，5，6，7，10)，在全長LMP1預期大小處檢測到弱的反應帶。
圖9給出圖表，說明在JY-細胞上篩選之后誘導的噬菌體集落的肽-ELISA反應性。
實施例一般方法參考雖然一般來說這里提到的技術都是本領域公知的，但是可以特別參考Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，Inc.。
實施例1具有推定的胞外定位的LMP1，LMP2和BARF1衍生的肽的設計在Genbank或Swiss-Prot數據庫中檢索LMP1，LMP2和BARF1的氨基酸序列。
目的在于確定和證明天然感染和轉化的(腫瘤)細胞中表達的這些蛋白質上胞外域的存在。
因此，作為第一步，我們使用從編碼LMP1，LMP2和BARF1蛋白質的DNA來源的氨基酸序列，并且應用GCG蛋白質分析程序(上文)通過疏水性分析確定推定的跨膜結構域的位置。
這項分析表明LMP1包含大約20個氨基酸的親水性N-末端，接著6個疏水性結構域，形成6個重復的推定的膜內螺旋，它們通過三個短的胞內帶電荷的序列連接，和三個推定的胞外域，稱作LMP1環(huán)-1，-2和-3(圖1)，然后接著是親水性C-末端，含氨基酸186-386。
包含被暗示6個膜交叉的12個推定的跨膜結構域膜隔開的親水性N-和C-末端序列并且?guī)в?個胞外域的LMP2被稱作LMP2環(huán)1-6(圖2)。
對BARF1基因的分析揭示一個具有潛在的信號序列的短的N-末端結構域，接著是一個單一的短的疏水性結構域和一個大的C-末端結構域，它是具有大的和可能的糖基化胞外域的″經典″I-型跨膜蛋白的特征。
對于可能模擬胞外LMP1和LMP2環(huán)的肽的選擇和合成，有下面兩個策略1.對于LMP1根據Seq.ID1-3，對于LMP2根據Seq.ID 4-9，制備線性肽，包括相應于各個環(huán)，每一側帶有推定形成膜固定α-螺旋的起點的兩個疏水性氨基酸的推定的胞外氨基酸的全部。
2.利用上面定義的線性肽的序列制備結構受限環(huán)肽，但是每一側帶有另外的半胱氨酸殘基側鏈，其在合成之后被氧化形成共價S-S鍵，由此強制肽形成環(huán)結構。
進一步合成各種肽，在N-末端有和沒有另外的1-3個賴氨酸殘基序列段，以有利于使用戊二醛與載體蛋白質共價偶聯，或者有利于有或沒有有利于肽與固定化鏈霉抗生物素蛋白的偶聯的可裂解接頭的生物素殘基的共價偶聯。
圖1和2中分別圖示說明了LMP1的環(huán)-3和LMP2的環(huán)5的合成策略的例子。
對于BARF1特異肽合成，序列選自在至少一個脯氨酸殘基上插入幾個帶電荷的氨基酸的Seq.ID10，12和13，其聯合增強了選擇的序列的表面可能性。
實施例2通過用設計的推定的胞外域-特異性肽免疫而制備與LMP1，LMP2和BARF1蛋白質的推定的胞外域反應的抗體試劑并且證明EBV-轉化細胞系中這些胞外域的存在沒有天然EBV-感染的轉化的(腫瘤)細胞的外表面上LMP1，LMP2和BARF1結構域存在和易接近的直接證據。
因此，我們目的首先是發(fā)明特異試劑，它會確定這樣的結構域并且會證實這些結構域的功能可達性。
方法應用fMoc化學使用固相肽合成儀(Applied Biosystems，USA)制備肽。從樹脂上酸裂解之后，用二乙基醚反覆洗滌肽并且通過RP-HPLC(Beckman System Gold)純化。當適當時，通過氧化巰基而使肽環(huán)化。最后將肽冷凍干燥并且以1-10mg等份在4℃下貯存。
通過緩慢加熱至50℃將純化的肽溶解于二甲亞砜(DMSO)中，濃度是10mg/ml，并且在用于兔或豚鼠免疫之前在鹽水中1∶10稀釋。對于每一次免疫，將200微克肽與15微升的2，5％戊二醛和1.2mg純化的匙孔血藍蛋白(KLH)或0.5mg破傷風類毒素(TTd)在避光室溫下(RT)溫育至少1小時(h)。用60微升穩(wěn)定緩沖液(1M甘氨酸，pH8.0)RT避光反應1小時終止偶聯。向1ml最終體積加入PBS并且與等體積弗氏佐劑混合。
該制劑用于皮下注射對動物免疫(表1)。
表1實施例中使用的動物血清一覽表
K＝兔，Gp＝豚鼠，N＝N-末端，M＝中部，C＝C-末端，TTd＝破傷風類毒素，KLH＝匙孔血藍蛋白，FC(I)A＝弗氏(In)完全佐劑結果
1.肽免疫動物血清中抗LMP1，LMP2和BARF1的推定的胞外域的多克隆抗體試劑從用各種肽第三次免疫接種之后的兔獲得前血清和血清(表1)。應用ELISA測試，使用對固相包被的純化的LMP1蛋白質或LMP1環(huán)肽(圖3A-D)和通過使用來自EBV+RAJI細胞和EBV-RAMOS細胞的提取物的免疫印跡(圖4A)，對血清和來自這些血清的蛋白質A純化的抗體試劑(Ab′s)檢測LMP1-蛋白質和LMP1環(huán)-肽特異反應性。這些方法與Meij等J.Infect.Dis.(1999)1791108-1115描述的類似。
使用肽-ELISA，第三次免疫之后可見清晰的特異性抗體應答，沒有見到不同環(huán)與各個超免疫血清之間的交叉反應性(圖3A-D)。
抗LMP1環(huán)1的反應比抗LMP1環(huán)3的弱，這可以由這樣的事實解釋代表環(huán)1的肽比代表環(huán)3的肽小。在蛋白質-A瓊脂糖凝膠(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上純化Ab′s之后，看到抗這些肽的更高的反應性(圖3C-D)。
來自接受免疫的兔的Ab′s還識別來自桿狀病毒表達系統(tǒng)的純化的重組LMP1(Meij等，J.Virol.Meth.(2000)90193-204)。使用純化的Ab′s，抗LMP1環(huán)1的反應比抗環(huán)3的弱，這與使用肽-ELISA發(fā)現的類似。
如圖4所示，通過蛋白質印跡免疫染色來分析來自完整全長LMP1，LMP2和BARF1肽免疫動物的血清中Ab′ s的反應性。對桿狀病毒-SF9昆蟲細胞系統(tǒng)中表達的LMP1，LMP2蛋白質(Meij等，1999)和大腸桿菌中表達的GST-BARF1融合蛋白(沒有公開數據)的部分純化提取物組成的印跡施加抗原。
使用純化的與LMP1環(huán)1和3反應的Ab′s的免疫印跡分析顯示合適的62kD位置有清晰的泳帶(圖4A)，從而證明它們與全長蛋白質結合。
類似地，通過用LMP2衍生的環(huán)2和環(huán)5肽對兔免疫接種來產生LMP2環(huán)特異性抗體試劑。得到的血清和其中含有的Ab′s在ELISA和免疫印跡中表明LMP2和LMP2環(huán)特異反應性(圖3 E-F和4B)。
類似地，通過用代表推定的胞外域的BARF1-衍生的肽對豚鼠免疫接種制備BARF1特異Ab′s(圖3G，H，I和4C)。
這些研究結果表明，用LMP1環(huán)-1，-2，-3，LMP2環(huán)-2，-5和各種BARF1衍生的肽免疫接種得到與各個環(huán)-肽以及全長LMP1，LMP2和BARF1蛋白質特異性反應的抗體試劑。
2.固定的JY細胞中或者沒有固定的存活JY細胞中LMP1和LMP2的染色讓EBV JY細胞，即B95-8感染和人原代外周血B-細胞轉化產生的人B-細胞系生長至對數期，用PBS洗滌并且移至載玻片上，接著用冷的丙酮固定。
為了揭示這些細胞中存在LMP1和LMP2，并且為了證明抗-LMP1和抗-LMP2環(huán)Ab′s與EBV+細胞中的天然蛋白質結合，固定的細胞與抗環(huán)Ab′s或者與LMP1和LMP2的胞內結構域反應的對照Ab′s的合適的稀釋物溫育，洗滌，并且通過與HRP偶聯的二抗和DAB染色來目測觀察結合的抗體。
LMP1染色的例子如圖5A所示，它表明LMP1的異源染色特征，已知其在胞內和質膜中聚集。還有，各個細胞的不同染色是特征性的但是還沒有人解釋。
為了證明用推定的LMP1，LMP2或BARF1的胞外域對動物免疫接種產生的Ab試劑是否確實與存活的EBV-轉化腫瘤細胞的外表面反應，并且從而證明這些推定的胞外域的存在和可及性，對存活的EBV+JY和EBV-RAMOS細胞間接進行免疫熒光染色。該方法與Middeldorp等J.Virology(1985)54240-244所述類似。使JY和Ramos細胞生長至對數期并且在4℃下在Hank′s緩沖液中洗滌并且與抗血清或純化的在冰冷的Hank′s溶液中合適稀釋的Ab′s在融化的冰上溫育1小時，用冰冷卻的鹽水洗滌并且與在Hank′s溶液中稀釋的豬-抗-兔-FITC溫育并且再次洗滌。利用細胞離心將染色的細胞移旋轉至載玻片上，用1∶1的冰冷的沒有水的丙酮/甲醇的混合物固定，并且通過熒光顯微鏡分析。
發(fā)現抗LMP1環(huán)3的抗體在JY細胞質膜周圍清晰的有亮輝的斑片狀邊緣，并且在RAMOS細胞周圍沒有反應。對LMP1環(huán)1的染色在JY-細胞上相對弱一些(沒有給出數據)。可能的是，對于環(huán)1的較低強度染色是由于Ab′s抗環(huán)1的較低免疫應答或者降低的親和性。
對于抗-LMP2環(huán)2和抗-LMP2環(huán)5抗血清獲得類似結果。
這些結果第一次證明EBV轉化細胞例如JY的表面上LMP1和LMP2衍生的環(huán)序列的存在和可及性。
3.應用補體溶胞作用抗-環(huán)Ab′s對靶細胞溶胞作用的誘導根據Middeldorp等J.Infectious Diseases(1986)15348-55所述，在標準補體依賴性51Cr釋放試驗中使用純化的抗LMP1環(huán)1和3的Ab′s。
JY和Ramos細胞生長至對數期并且在沒有血清的新鮮培養(yǎng)基中洗滌。在培養(yǎng)基中以合適的稀釋度加入兔抗血清或純化的Ab′s等份，緊接著是從沒有免疫的SPF-兔新鮮獲得的血清，以提供補體來源。通過加入1％Triton X-100代替兔補體，由兔抗-β2微球蛋白(DAKO，Denmark)構成正對照，來自所有的被分析兔的免疫前血清構成負對照，來測定最大溶胞作用。
這些實驗的結果證明來自接受免疫的動物的血清中抗LMP1環(huán)3的Ab′s毫無疑問能介導表達LMP1的JY細胞的溶胞作用。使用抗環(huán)3的Ab′s和補體使得RAMOS-細胞不易溶胞。
對于抗環(huán)1的Ab′s，結果只是陽性邊界，可能與獲得的低Ab-滴度有關。
這些結果證明抗-LMP1，LMP2和BARF1環(huán)-肽特異性抗體試劑確定和識別細胞表面暴露的來自天然蛋白質的結構域，并且能介導表達這些結構域的細胞的溶胞作用。
總之，這些結果還證明，用LMP1，LMP2(和BARF1)的推定的胞外域的合成的肽特異免疫能誘導抗這些蛋白質細胞表面暴露的區(qū)的免疫應答，并且這樣的應答能介導暴露這些結構域的細胞的溶胞。
實施例3通過使用合成的環(huán)-結構域特異性肽的噬菌體展示篩選制備與來自人噬菌體抗體文庫的LMP1，LMP2或BARF1的推定的胞外結構域反應的人抗體試劑用Kohler和Milstein的動物免疫和雜交瘤細胞融合技術制備小鼠和/或大鼠單克隆抗體是公知的。但是，該方法不容易產生人單克隆抗體，而人單克隆抗體是優(yōu)選的用于體內(來自體內)的治療應用的抗體試劑。因為LMP1，LMP2和BARF1蛋白質在人體內幾乎不是免疫原性的(Meij等，1999)，不能向前進行對LMP1，LMP2和BARF1的胞外域特異性的人抗體的產生。
因此，通過利用實施例1和2中描述的新的特異性構建的(現在沒有確定的)胞外結構域肽，來在表達在噬菌體表面上展示的作為單鏈抗體或者作為Fab片段的人抗體全部的噬菌體抗體文庫中的特異性人抗體反應性，我們嘗試了另一種方法。
只證實了用LMP1-衍生的試劑的選擇。
方法a.文庫構建對于這項研究，我們使用了Vaughan等(上文)描述的單鏈抗體噬菌體文庫或者Haard等(上文)描述的人Fab片段文庫。所述文庫是所謂的表達文庫，例如，含有多至1015種不同的噬菌體(克隆)，每一種含有人基因組的不同片段。
為了篩選LMP1-，LMP2-和BARF1-反應噬菌體，我們使用了和實施例1-2中描述的并且如圖1和2所示的類似的肽合成策略。
使用線性或環(huán)狀受限肽。所有的肽包含生物素部分，其通過可裂解接頭與肽的N-末端連接，使得在鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠上螯合之后表位-選擇的肽-結合噬菌體釋放。
表2中給出了與該實施例相關的肽。
表2為了噬菌體篩選目的在該項研究中使用LMP1衍生的肽(B95-8原型LMP1衍生的AA序列)b.使用合成肽對LMP1環(huán)1-3反應噬菌體的篩選，選擇，和表征對于從隨機噬菌體庫中選擇性淘選LMP1-環(huán)肽結合噬菌體，RT下將LMP1環(huán)1，2和3的生物素化肽在鏈霉抗生物素蛋白-磁珠(Dynall，Norway)上固定30分鐘。使用3％奶粉(Marvel)和10％ DMSO在PBS中將非特異性結合位點封閉1小時。在這期間還在室溫下將噬菌體與3％ Marvel和10％ DMSO在PBS中溫育1小時。1小時之后，一起加入噬菌體和鏈霉抗生物素蛋白-磁珠(有或沒有固定化的肽)，并且在室溫下溫育1小時。接著用PBS將磁珠沖洗10次，并且通過加入50mM DTT水溶液洗脫特異性結合的噬菌體10分鐘，減少可裂解的S-S接頭。
第三輪和第四輪選擇之后，從經選擇的噬菌體群中分離46個單獨的噬菌體克隆，對其進行篩選，用于制備與相應的肽或全長LMP1蛋白質反應的噬菌體-結合的或可溶性Fab′s(參見實施例2中ELISA和免疫印跡分析方法)。
如McCafferty等(Nature(1990)，348552)，Griffiths等(EMBOJ.1994133245)，Marks等(J.Mol.Biol.(1991)222581)；Vaughan等，Nature Biotech.(1996)14309-314和de Haard等J.Biol.Chem.274(1999)；18218-18230所述進行指紋分析，噬菌體制備和可溶性Fab′s制備。
結論1.使用合成肽作為抗原在人Fab噬菌體文庫中篩選抗LMP1的胞外部分(環(huán)1，2和3)的Ab-反應性在第一組實驗中，使用Vaughan描述的單鏈抗體文庫來選擇具有LMP1-環(huán)肽-結合活性的噬菌體。
雖然發(fā)現了不顯示與鏈霉抗生物素蛋白對照平板任何結合的特異環(huán)-肽結合噬菌體，詳細的分析表明所有的肽結合噬菌體表現出對選擇程序中使用的不同的各個環(huán)化受限肽的相似反應性。使用這些肽的線性化形式沒有看到反應。因此得出結論，這些肽中的共有結構，S-S鍵和鄰接的賴氨酸基團(見表2)，負責與各個噬菌體的一般結合。事實上，帶有相似3-賴氨酸S-S受限接頭的不相關的肽證實所選擇的噬菌體的種屬特征。另外的篩選沒有揭示任何肽-特異性結合。
從這些實驗得出結論，Vaughan型文庫或者產生具有不充分結合特征的ScAb′s或者包含太少的Ab-多樣性，不能快速提供LMP1環(huán)-肽特異性結合劑的來源，接著我們變換使用如de Haard等(1999)所述具有擴展的多樣性的人Fab噬菌體文庫。
下面詳細描述使用人Fab文庫的新的選擇。
由于疏水性肽的低溶解性，在10％ DMSO，3％ Marvel的PBS溶液中進行噬菌體與肽的結合。
從前面的實驗清楚地看到10％ DMSO的存在不影響噬菌體存活(沒有給出數據)。
對于LMP1-環(huán)-1，進行三輪選擇，對于環(huán)-2和-3，進行四輪選擇。
表3總結了不同輪選擇的結果。
表3使用LMP1-衍生的環(huán)-特異性合成肽的噬菌體選擇不同輪的結果。
從表3清除地看到，第三輪選擇發(fā)生顯著的富集，再多輪選擇不導致更多富集。
從第3和4輪，得到46個集落并且誘導噬菌體產生。接著，在肽-包被的ELISA中分析含有噬菌體的培養(yǎng)基，檢查與各種肽或者作為對照物的鏈霉抗生物素蛋白的特異性。
通過分析它們與沒有對它們選擇的其它肽的結合，對不同選擇獲得的噬菌體集落測定交叉反應性。
圖6中給出了總的ELISA結果。從圖6清楚地看到，選擇的噬菌體對選擇肽表現出高特異性，并且與其它肽沒有交叉結合，與鏈霉抗生物素蛋白也沒有交叉結合。從環(huán)-2和環(huán)-3實施例可見與線性環(huán)肽反應的一些噬菌體克隆還可能顯示與S-S環(huán)受限肽的反應性，認為它更密切地模擬了LMP1中天然環(huán)結構。
因此，這些實驗證明，使用代表LMP1，LMP2和BARF1的胞外域的具體設計的環(huán)肽能從足夠大的隨機抗體噬菌體文庫特異選擇人抗體試劑。
2.選擇的噬菌體對表達的人抗體試劑的表征圖7說明對選擇的各個挑選的克隆I的代表性DNA-限制性酶切分析，以確定用不同的肽選擇的噬菌體克隆之間克隆型差異。
結果表明不同的選擇的噬菌體群中及其之間能觀察到不同的指紋(克隆型)，但是如果沒有碰到相同的克隆型，則與相同的環(huán)反應的噬菌體集落中肽是類似的。這最可能反映如果沒有與肽抗原結合的相同的抗體獨特位結構時相似的噬菌體的獨立分離。
例如在與LMP1環(huán)1反應的噬菌體中，各分離的克隆1，2和4表現出非常類似的指紋圖案，而克隆6和9及克隆5和10彼此之間具有類似的克隆型，但是它們彼此之間明顯不同而且與克隆1，2和4明顯不同?？寺?和7和11顯示與以前命名的不同，但是所有的克隆類似地與LMP1環(huán)1肽反應。
類似地，用LMP1環(huán)3肽選擇的克隆3，6，7，8，9和13表現出十分類似，但是與克隆1，4，5，10(等)比有不同的指紋標記。
表4總結了第三輪之后從選擇的LMP1環(huán)1-3特異性克隆的總的回收。
表4第三輪不同的LMP1-特異性噬菌體選擇的總的特征結果總之，DNA指紋分析揭示，使用LMP1環(huán)-1肽選擇，得到8個不同克隆型的14個克隆。對LMP1環(huán)-2選擇，得到僅具有兩個克隆型的41個克隆，對LMP1環(huán)-3選擇，得到14個不同克隆型的29個克隆。
從表4清楚地看到，抗環(huán)2反應的噬菌體的多樣性低。只檢測到2個不同的指紋?？紤]到環(huán)2是所有的肽中最短的，這可以解釋低多樣性。在環(huán)2反應噬菌體克隆中，分析的6/6(100％)也與環(huán)化環(huán)2反應這一發(fā)現進一步支持這一觀點。
與LMP1環(huán)3反應的噬菌體的多樣性最高，這與該環(huán)尺度較大并且環(huán)的中部存在兩個大的色氨酸殘基非常吻合。在不同的克隆的有限評價中，3/6(50％)環(huán)3選擇的噬菌體克隆還表現出與環(huán)3的環(huán)受限肽的反應性。
結果證明，從隨機抗體文庫可以選擇不同的克隆型，它獨特地表明與LMP1，LMP2或BARF1的特異胞外域的確定的反應性。
3.作為可溶性Fab抗體試劑的噬菌體-抗體試劑的表達因為噬菌體結合的抗體試劑與未來的治療應用不相容，因此需要獲得保留原來抗原-結合特異性的純化的抗體試劑。
因此，為了分析來自選擇的噬菌體克隆的可溶性Fab-試劑(Fab′s)的可能的產物，通過大腸桿菌中噬菌體蛋白質表達的IPTG介導的誘導對不同克隆分析Fab蛋白質產物。
通過肽ELISA，對用這種方法從不同的環(huán)-肽篩選的噬菌體(如表4所示)制備的Fab′s分析與如圖8所示完整LMP1蛋白質的反應性(數據沒有給出)。
圖8說明免疫印跡分析，它表明可溶性Fab′s與純化的全長LMP1(弱的)反應性。
來自不同的噬菌體克隆的幾種可溶性Fab′s具有抗全長LMP1蛋白質的反應性。
對于環(huán)3反應噬菌體，ELISA證明10/14(71％)遺傳學不同的克隆產生可溶性Fab′s，它有抗環(huán)狀環(huán)3肽的反應性，并且證明與LMP1蛋白質的可檢測反應。
考慮到在優(yōu)化表達的Fab′s的重折疊或者優(yōu)化在不產生可溶性Fab′s的克隆中表達這方面還沒有人努力過。
還有，挑選使用環(huán)2和3第四輪選擇得到的產生噬菌體的集落并分析。產生特異性Fab′s并且與第三輪相比較在第四輪中的噬菌體中沒有主要ELISA-反應性或遺傳學差異。
這些結果證明，從使用設計的肽選擇的噬菌體抗體群，能制備具有對天然全長蛋白質LMP1，LMP2和BARF1的確定的和特定的反應性的可溶性人抗體試劑。
來自實施例3的總的結果證明，使用具體設計的從LMP1，LMP2和BARF1的推定的胞外域衍生的環(huán)-結構域肽，能從抗體所有組成成分的基因克隆產生的隨機抗體文庫篩選不同的人抗體試劑。結果還證明這樣的抗體試劑能被表達并且以可溶形式產生，與一般文庫成分分離，并且這樣的抗體試劑能特異結合完整的全長蛋白質。
實施例4使用表達LMP1天然形式的完整和存活的EBV-轉化類淋巴母細胞JY細胞從人抗體噬菌體文庫選擇與LMP1的胞外域反應的人Fab抗體試劑作為與LMP1，LMP2和BARF1的天然胞外域反應的人抗體試劑設計中替代的或另外的選擇步驟，通過直接結合EBV-感染的和轉化的(腫瘤)細胞，可以選擇人噬菌體抗體。
因此，我們目的在于，通過接著用完整的存活的EBV-轉化B-細胞選擇，通過分析環(huán)-特異肽反應性人抗體噬菌體的特異富集，證明這種可能性。
在實施例3的結果的基礎上，該實施例只給出了LMP1-特異性數據。
方法使用JY細胞對噬菌體的篩選和選擇3*106JY-細胞/毫升置于含有10％FCS和2％Marvel的PBS中，并且在恒速攪拌下在RT下溫育30分鐘。同時，噬菌體在含有10％FCS和2％Marvel的PBS中在RT下溫育30分鐘。接著將細胞以500xg離心5分鐘，并且將細胞沉淀在恒速攪拌下在RT下與噬菌體混合1小時。將細胞離心并且用PBS洗滌10x。洗滌之后將細胞重新懸浮于600微升的水中，并且通過向細胞中加入600微升的三乙胺(TEA)來洗脫噬菌體，并且在RT下溫育5分鐘。通過向懸浮液中加入600微升1M TRIS-HCl(pH＝7，4)將TEA中和。通過以1000xg離心5分鐘分離細胞碎屑和噬菌體。在進一步使用之前在4℃下貯存含有選擇的噬菌體的上清液。
結果為了選擇與JY細胞的表面上表達的天然LMP1反應的噬菌體，使用來自對合成肽第二輪選擇的噬菌體群。這些噬菌體表明沒有顯著富集，如表3所示。
表5總結了對于對LMP1環(huán)-1，-2和-3特異肽預選擇的噬菌體群的下面輪次的選擇的結果。
表5對JY-細胞噬菌體篩選的結果對于LMP1環(huán)1和環(huán)3，第四輪之后發(fā)現好的富集，但是對于環(huán)2沒有發(fā)現富集。
這是預見到的，因為環(huán)2是最小的肽(蛋白質部分)，并且對肽的選擇還給出最低水平的富集(表3)。
從對JY細胞的第四輪選擇，從環(huán)1和環(huán)3噬菌體獲得96個集落，誘導噬菌體產生，并且接著使用生物素-NHS-標記肽在肽ELISA中分析。
對于LMP1環(huán)-1，8/96 JY-選擇的噬菌體有抗環(huán)-1肽的反應性。對于LMP1環(huán)-3，28/96 JY-選擇的噬菌體有抗環(huán)-3肽的反應性，并且?guī)讉€還有抗環(huán)-3環(huán)肽的反應性。
圖9給出這些ELISA結果的實施例。
對于環(huán)2，沒有發(fā)現預期的特異噬菌體，因為第四輪選擇之后沒有發(fā)現富集。
一般情況下，與使用肽噬菌體選擇之后的應答相比較，肽的ELISA反應性較低(參見實施例3)。
與對LMP1環(huán)1，2和3衍生的肽結構域直接篩選的噬菌體的結合親和性相比，存活的JY細胞的表面上表達的天然LMP1篩選的噬菌體的肽-結合親和性被降低。這可能與合成肽和全長膜相關蛋白中天然環(huán)結構域之間的構象的小的變化有關。
與LMP1環(huán)1和/或環(huán)3肽反應的噬菌體的進一步分析表明很多噬菌體集落具有不同的指紋，這一點在前面對于肽選擇的噬菌體發(fā)現過，并且如實施例3所示。
這些數據總結在表6中。
表6對JY細胞選擇的總結。
*第五輪選擇之后的結果。
這些數據表明，通過對EBV-轉化細胞的表面上表達的天然LMP1，LMP2或BARF1的噬菌體選擇能制備人抗體試劑。
序列表<110>賽托-巴爾股份有限公司<120>埃-巴二氏病毒(EBV)腫瘤相關潛伏膜蛋白的胞外結構域的鑒定方法和與之反應的抗體試劑的選擇方法<130>EBV表位-賽托-巴爾股份有限公司<140>
<141>
<150>EP 01200321.6<151>2001-01-30<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>12<212>PRT<213>埃-巴二氏病毒<400>1Val Met Ser Asp Trp Thr Gly Gly Ala Leu Leu Val1 5 10<210>2<211>11<212>PRT<213>埃-巴二氏病毒<400>2Ala Leu Trp Asn Leu His Gly Gln Ala Leu Phe1 5 10<210>3<211>12
<212>PRT<213>埃-巴二氏病毒<400>3Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp1 5 10<210>4<211>11<212>PRT<213>埃-巴二氏病毒<400>4Ala Ala Ser Cys Phe Thr Ala Ser Val Ser Thr1 5 10<210>5<211>20<212>PRT<213>埃-巴二氏病毒<400>5Leu Thr Trp Arg Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu Leu Phe Ala1 5 10 15Leu Leu Ala Ala20<210>6<211>9<212>PRT<213>埃-巴二氏病毒<400>6Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu Gly Ala1 5
<210>7<211>8<212>PRT<213>埃-巴二氏病毒<400>7Leu Gly Thr Leu Asn Leu Thr Met1 5<210>8<211>18<212>PRT<213>埃-巴二氏病毒<400>8Leu Gln Thr Asn Phe Lys Ser Leu Ser Ser Thr Glu Phe Ile Pro Asn1 5 10 15Leu Phe<210>9<211>11<212>PRT<213>埃-巴二氏病毒<400>9Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp Ile1 5 10<210>10<211>40<212>PRT<213>埃-巴二氏病毒
<400>10Leu Gly Pro Glu Ile Glu Val Ser Trp Phe Lys Leu Gly Pro Gly Glu1 5 10 15Glu Gln Val Leu Ile Gly Arg Met His His Asp Val Ile Phe Ile Glu20 25 30Trp Pro Phe Arg Gly Phe Phe Asp35 40<210>11<211>75<212>PRT<213>埃-巴二氏病毒<400>11Ile His Arg Ser Ala Asn Thr Phe Phe Leu Val Val Thr Ala Ala Asn1 5 10 15Ile Ser His Asp Gly Asn Tyr Leu Cys Arg Met Lys Leu Gly Glu Thr20 25 30Glu Val Thr Lys Gln Glu His Leu Ser Val Val Lys Pro Leu Thr Leu35 40 45Ser Val His Ser Glu Arg Ser Gln Phe Pro Asp Phe Ser Val Leu Thr50 55 60Val Thr Cys Thr Val Asn Ala Phe Pro His Pro65 70 75<210>12<211>34<212>PRT<213>埃-巴二氏病毒<400>12His Val Gln Trp Leu Met Pro Glu Gly Val Glu Pro Ala Pro Thr Ala1 5 10 15
Ala Asn Gly Gly Val Met Lys Glu Lys Asp Gly Ser Leu Ser Val Ala20 25 30Val Asp<210>13<211>33<212>PRT<213>埃-巴二氏病毒<400>13Leu Ser Leu Pro Lys Pro Trp His Leu Pro Val Thr Cys Val Gly Lys1 5 10 15Asn Asp Lys Glu Glu Ala His Gly Val Tyr Val Ser Gly Tyr Leu Ser20 25 30Gln
權利要求
1.EBV-轉化的哺乳動物細胞的細胞外表面上表達的埃-巴二氏病毒(EBV)編碼的膜蛋白的胞外表位的鑒定方法，包括步驟A)提供EBV基因組的至少一個可讀框(ORF)的氨基酸序列，B)確定A)的氨基酸序列中包含的至少一個推定的胞外結構域，C)制備包括推定的B)的胞外結構域或者其部分的肽，該肽不包括全長0RF，D)制備能與C)的肽特異性結合的抗體試劑，E)使D)的抗體試劑與存活的EBV轉化的哺乳動物細胞反應，F)檢測抗體試劑與EBV轉化的哺乳動物細胞的細胞表面的特異性結合。
2.能與EBV轉化的哺乳動物細胞的細胞外表面上表達的埃-巴二氏(EBV)編碼的膜蛋白的胞外表位結合的抗體試劑的選擇方法，包括步驟A)提供EBV基因組的至少一個可讀框(ORF)的氨基酸序列，B)確定A)的氨基酸序列中包含的至少一個推定的胞外結構域，C)制備包括B)的胞外結構域或者其部分的肽，該肽不包括全長ORF，D)制備能與C)的肽特異性結合的抗體試劑，E)使D)的抗體試劑與存活的EBV轉化的哺乳動物細胞反應，F)檢測抗體試劑與EBV轉化的哺乳動物細胞的細胞表面的特異性結合，G)選擇F)檢測的抗體試劑。
3.根據權利要求2的方法，其中步驟G)中包括步驟G1)用步驟C)的肽免疫動物，G2)制備包括抗體試劑的免疫動物的體液，G3)制備包括與所述基質結合的肽的固相親和基質，G4)使體液和基質接觸，G5)使來自體液的抗體試劑與所述基質結合的肽特異性結合，G6)分離與所述肽特異性結合的抗體試劑。
4.根據權利要求2的方法，其中步驟G)中包括步驟G1)用步驟C)的肽免疫動物，G2)從G1)的接受免疫的動物提供生產抗體試劑的B細胞，G3)制備包括與所述基質結合的肽的固相親和基質，G4)使G2)的B細胞和基質接觸，G5)使B細胞與所述基質結合的肽特異性結合，G6)分離與所述肽特異性結合的B細胞。
5.根據前面權利要求任一項的方法，其中胞外域選自選自下面的氨基酸序列SEQ ID 1 (LMP1，胞外環(huán)1)，SEQ ID 2 (LMP1，胞外環(huán)2)，SEQ ID 3 (LMP1，胞外環(huán)3)，SEQ ID 4 (LMP2，胞外環(huán)1)，SEQ ID 5 (LMP2，胞外環(huán)2)，SEQ ID 6 (LMP2，胞外環(huán)3)，SEQ ID 7 (LMP2，胞外環(huán)4)，SEQ ID 8 (LMP2，胞外環(huán)5)，SEQ ID 9 (LMP2，胞外環(huán)6)，SEQ ID 10(BARF1，SEQ40-79)，SEQ ID 11(BARF1，SEQ80-154)，SEQ ID 12(BARF1，SEQ155-188)和SEQ ID 13(BARF1，SEQ188-221)。
6.根據前面權利要求任一項的方法，其中步驟C)的肽包括兩個半胱氨酸殘基，位于推定的胞外域或者其部分之間，所述半胱氨酸殘基被氧化，在所述半胱氨酸殘基之間形成S-S鍵。
7.能結合在EBV-轉化的哺乳動物細胞的細胞外表面上表達的埃-巴二氏病毒(EBV)編碼的膜蛋白的胞外表位的單克隆抗體試劑的制備方法，包括步驟1)提供包括哺乳動物遺傳物質的表達文庫，2)使根據權利要求1鑒定的肽接觸所述文庫，3)使肽與所述文庫的生物體特異性結合，4)分離肽與之特異性結合的生物體，5)制備分離的生物體的單一克隆，6)在表達哺乳動物遺傳物質的條件下培養(yǎng)5)的克隆，7)分離步驟6)的表達產物。
8.能結合在EBV-轉化的哺乳動物細胞的細胞外表面上表達的埃-巴二氏病毒(EBV)編碼的膜蛋白的胞外表位的單克隆抗體試劑的制備方法，包括步驟1)提供包括哺乳動物遺傳物質的表達文庫，2)使根據權利要求1鑒定的在它們表面表達一個或多個肽表位的存活的EBV轉化的細胞接觸所述文庫，3)使細胞與所述文庫的生物體特異性結合，4)分離細胞與之特異性結合的生物體，5)制備分離的生物體的單一克隆，6)在表達哺乳動物遺傳物質的條件下培養(yǎng)5)的克隆，7)分離步驟6)的表達產物。
9.根據權利要求7或8的方法，其中表達文庫是包含至少109，優(yōu)選至少1012，最優(yōu)選大約1015個不同克隆的高多樣性文庫。
10.包含至少109，優(yōu)選至少1012，最優(yōu)選大約1015個不同克隆的高多樣性文庫用于制備能結合在EBV-轉化的哺乳動物細胞的細胞外表面上表達的埃-巴二氏病毒(EBV)編碼的膜蛋白的胞外表位的單克隆抗體試劑的用途。
11.根據權利要求2-7的任一項的方法可獲得的抗體試劑，它能結合在EBV-轉化的哺乳動物細胞的細胞表面上表達的埃-巴二氏病毒(EBV)編碼的膜蛋白的胞外表位。
12.能與選自SEQ ID No.1-13的氨基酸序列特異性結合的抗體試劑。
13.能與和SEQ ID No.1-13的氨基酸序列之一具有至少80％，優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％或者更多同源性的氨基酸序列特異性結合的抗體試劑。
14.分離的肽，包括在EBV-轉化的哺乳動物細胞的細胞外表面上表達的埃-巴二氏病毒(EBV)編碼的膜蛋白的胞外表位，選自SEQ ID 1 (LMP1，胞外環(huán)1)，SEQ ID 2 (LMP1，胞外環(huán)2)，SEQ ID 3 (LMP1，胞外環(huán)3)，SEQ ID 4 (LMP2，胞外環(huán)1)，SEQ ID 5 (LMP2，胞外環(huán)2)，SEQ ID 6 (LMP2，胞外環(huán)3)，SEQ ID 7 (LMP2，胞外環(huán)4)，SEQ ID 8 (LMP2，胞外環(huán)5)，SEQ ID 9 (LMP2，胞外環(huán)6)，SEQ ID 10(BARF1，SEQ40-79)，SEQ ID 11(BARF1，SEQ80-154)，SEQ ID 12(BARF1，SEQ155-188)和SEQ ID 13(BARF1，SEQ188-221)。
15.分離的肽或蛋白質，包括選自SEQ ID nos.1-13的氨基酸序列，不是全長LMP1，LMP2或BARF1序列，也不是與之有90％或更高同源性。
16.根據權利要求15的肽或蛋白質，包括少于100個氨基酸。
17.肽或蛋白質，包括與SEQ ID nos.1-13的氨基酸序列的任意一個有至少80％，優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％同源性的氨基酸序列，不是全長LMP1，LMP2或BARF1序列，也不是與之有90％或更高同源性。
18.純化的核酸序列，包含編碼根據權利要求14-17的任一項的肽或蛋白質的核酸序列。
19.純化的核酸序列，包含與根據權利要求18的核酸序列至少80％，優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％同源的核酸序列。
20.核酸載體，包含根據權利要求18或19的核酸序列。
21.根據權利要求20的核酸載體，其中氨基酸編碼與啟動子可操作性連接的核酸序列，在所述載體可以增殖的宿主生物體中發(fā)揮功能。
22.用核酸序列轉化的細胞，包含根據權利要求18-21任一項的核酸序列。
23.導向于表達LMP1，LMP2或BARF1的細胞的導向細胞的制備方法，包括步驟-用根據權利要求11-13任一項的抗體試劑的遺傳信息轉染細胞；-在所述導向細胞表面表達所述抗體試劑。
24.導向于表達LMP1，LMP2或BARF1的細胞的導向病毒顆粒的制備方法，包括步驟-將根據權利要求11-13任一項的抗體試劑的遺傳信息克隆到病毒基因組中-在所述病毒顆粒的病毒外殼上表達所述抗體。
25.根據權利要求11-13任一項的抗體試劑，用作攜帶EBV陽性腫瘤的患者的診斷試劑或治療試劑。
26.根據權利要求11-13任一項的抗體試劑，根據權利要求14-17任一項的肽，或根據權利要求18-19任一項的核酸序列用于制備藥物特別是用于治療EBV感染的藥物的用途。
27.EBV感染的細胞，尤其是EBV+惡性細胞和EBV介導的疾病的診斷方法，包括步驟-從懷疑攜帶所述疾病感染的細胞的個體獲取細胞樣品；-使根據權利要求9-11任一項的抗體試劑接觸所述細胞；-使抗體試劑與所述細胞反應，形成與EBV感染的細胞結合的抗體試劑的復合體；-檢測所述復合體的存在。
28.特異性消除來自體內的細胞表面上表達LMP1，LMP2或BARF1或者其部分的細胞的方法，包括步驟-從個體分離一定數目的細胞，-使分離的細胞接觸根據權利要求9或11任一項的抗體試劑，-負選擇細胞表面上表達LMP1，LMP2，或BARF1或者其部分的細胞，-其中細胞表面上不表達LMP1，LMP2，或BARF1的細胞存活。
29.根據權利要求28的方法，其中將存活細胞再移植給個體。
30.根據權利要求28或29的方法，其中從骨髓分離細胞。
全文摘要
本發(fā)明描述了在EBV－轉化的哺乳動物細胞的細胞外表面上表達的埃－巴二氏病毒(EBV)編碼的膜蛋白的胞外表位的鑒定方法，對所述表位特異性的抗體試劑的篩選和制備方法，以及包含埃－巴二氏病毒編碼的腫瘤細胞相關膜蛋白的胞外結構域的肽，所述肽用于免疫和治療接種以誘導與所述結構域反應的抗體和T－細胞的用途，所述抗體試劑用于制備導向細胞，腫瘤細胞清除，以及用作診斷和抗EBV－介導的惡性細胞生長的藥物的用途。
文檔編號C07K16/08GK1526072SQ02807469
公開日2004年9月1日 申請日期2002年1月30日 優(yōu)先權日2001年1月30日
發(fā)明者J·M·米德爾多普, J M 米德爾多普 申請人:賽托-巴爾股份有限公司