專利名稱：用于細(xì)胞靶向和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的融合蛋白及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及選擇性靶向細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的物質(zhì)組成和方法。本發(fā)明涉及選擇性靶向細(xì)胞以使細(xì)胞死亡的物質(zhì)組成和方法。
背景技術(shù)：
最近，鑒定出西尼羅病毒(WNV)的核蛋白具有誘導(dǎo)它所存在的細(xì)胞凋亡的能力。這個(gè)發(fā)現(xiàn)在PCT專利(申請(qǐng)?zhí)朠CT/US01/31355)中有描述，收錄于此作為參考文獻(xiàn)。
同樣的，已經(jīng)鑒定出艾滋病病毒(HIV)附屬蛋白Vpr能阻滯細(xì)胞循環(huán)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這個(gè)發(fā)現(xiàn)在PCT專利(申請(qǐng)?zhí)朠CT/US01/10028)中有描述，收錄于此作為參考文獻(xiàn)。
除了這些蛋白外，已知其它蛋白，例如半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
找到一種能將細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白的活性成份引入到有效成份中從而消除特異細(xì)胞的藥物組合物和方法是很有必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了包含一個(gè)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白組份和一個(gè)細(xì)胞靶向組份的融合蛋白。
本發(fā)明提供了能靶向細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的物質(zhì)組成和方法。本發(fā)明描述了誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，該方法包括用一定量的含一個(gè)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白組份和一個(gè)細(xì)胞靶向組份的融合蛋白接觸細(xì)胞的步驟。融合蛋白按能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的有效劑量來給藥。
本發(fā)明提供了包含一個(gè)蛋白酶組份和一個(gè)細(xì)胞靶向組份的融合蛋白。
本發(fā)明提供了能靶向細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的物質(zhì)組成和方法。本發(fā)明描述了誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，該方法包括用一定量的含一個(gè)蛋白酶組份和一個(gè)細(xì)胞靶向組份的融合蛋白接觸細(xì)胞的步驟。融合蛋白按能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的有效劑量來給藥。
具體實(shí)施例本文中，術(shù)語“細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白”和“AIP”可交換使用，意思是指當(dāng)存在于某一細(xì)胞中時(shí)，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白或其片段。
本文中，術(shù)語“蛋白酶組份”的意思是指融合蛋白的組份，是仍保持作為蛋白酶功能的或能被轉(zhuǎn)換成活性蛋白酶的蛋白酶序列或片段。
本文中，關(guān)于細(xì)胞死亡或凋亡的術(shù)語“誘導(dǎo)”是指引發(fā)細(xì)胞死亡事件的行為，包括引發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的部分凋亡途徑的細(xì)胞事件的行為。
本文中，術(shù)語“凋亡”是指真核細(xì)胞死亡的形式，該死亡形式與壞死相區(qū)別，它包括細(xì)胞骨架斷裂，細(xì)胞質(zhì)收縮與濃縮，磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞膜外表面表達(dá)和起泡，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)合泡或凋亡小體的形成。細(xì)胞凋亡的綜述見Utz & Anderson，2000，生死選擇通過信號(hào)分子的蛋白酶水解調(diào)節(jié)凋亡，細(xì)胞死亡分化，7589-602(Utz & Anderson，2000，Life and death decisionregulation of apoptosis by proteolysis of signaling molecules，Cell Death Differ.，7589-602)。
在本文所特指的及附加的權(quán)利要求中，除非其內(nèi)容有另外的詳細(xì)說明，單數(shù)形式“一個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。因此，比如，“一個(gè)細(xì)胞”就包括了兩個(gè)或更多細(xì)胞的混合物。
本文中，關(guān)于衣殼蛋白或其功能性片段的短語“誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的有效劑量”和“誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的有效水平”意思是指能有效引發(fā)殺死細(xì)胞事件的與細(xì)胞接觸的衣殼蛋白或其功能性片段的量，或表達(dá)于細(xì)胞中的衣殼蛋白或其功能性片段的水平。
本文中，術(shù)語“蛋白”是指不限于最小長(zhǎng)度的氨基酸殘基的聚合物。多肽、肽、寡肽、二聚體、多聚體和類似物均包括在該定義中。完整蛋白及其片段也都包括在此定義中。該術(shù)語也包括蛋白的表達(dá)后修飾形式，包括但不限于糖基化、乙?；?、磷酸化等。
本文中，“可注射的藥物組合物”是指可用于病人的無菌、無熱源和無任何微粒的制藥上可接受的組合物。見Remington’s藥物科學(xué)，第18版，Gennaro編輯，Mack出版公司，Easton，PA，1990，美國(guó)(Remington’s PharmaceuticalSciences，18thEd.，Gennaro ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990 andU.S.A.)。
本文中，“制藥學(xué)可接受的載體”包括任何本身對(duì)接受藥物組合物的個(gè)體不導(dǎo)致有害效果的載體。例如，一個(gè)“制藥學(xué)可接受的載體”應(yīng)該不導(dǎo)致對(duì)接受者有害的抗體的產(chǎn)生。合適的“制藥學(xué)可接受的載體”為專業(yè)人士所知，并在前述的Remington’s藥物科學(xué)(Remington’s pharmaceutical Sciences)一書中有描述。
本文中，“過度增生細(xì)胞”是指在不適當(dāng)?shù)幕蚍钦５臅r(shí)間或地點(diǎn)生長(zhǎng)、分化或增生的細(xì)胞，包括那些本應(yīng)該處于G0期或靜止?fàn)顟B(tài)的卻進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞。例如，腫瘤細(xì)胞就包括在“過度增生細(xì)胞”里。具有“過度增生細(xì)胞”特性或與之相關(guān)的疾病或狀況包括癌癥、自身免疫、非惡性生長(zhǎng)和牛皮癬。
本文中，“治療”包括改善和/或消除具過度增生細(xì)胞特性或與之相關(guān)的疾病或狀況。
本文中，“個(gè)體”是指能用本發(fā)明的藥物組合物治療的人和非人類動(dòng)物。
本文中，“給藥”包括但不限于腫瘤內(nèi)注射、經(jīng)皮膚的、腸胃外的、皮下的、肌肉內(nèi)的、口服和局部傳遞等方法。
本文中，關(guān)于藥物組合物給藥時(shí)用的“腫瘤內(nèi)注射”是指將藥物組合物直接注射進(jìn)入腫瘤位點(diǎn)。
本發(fā)明來源于對(duì)WNV衣殼蛋白(Cp)在腫瘤衍生細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)活性、HIV附屬蛋白Vpr具類似活性、線粒體蛋白AIF和多種其它內(nèi)源蛋白如半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶家族具凋亡誘導(dǎo)活性的發(fā)現(xiàn)。已發(fā)現(xiàn)存在于細(xì)胞中的這些AIPs能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。AIPs的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)活性使其能用于殺死快速生長(zhǎng)的細(xì)胞，包括癌細(xì)胞和與自體免疫疾病有關(guān)的免疫細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供含有一個(gè)與靶向組份相連接AIP組份的融合蛋白，該靶向組份是一個(gè)將靶向破壞的細(xì)胞類型所表達(dá)蛋白的特異配體。該配體可以是一天然配體、一種抗體或其片段、或特異結(jié)合于細(xì)胞蛋白的另一類型的分子。
根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供含有一個(gè)與靶向組份相連接蛋白酶組份的融合蛋白，該靶向組份是一個(gè)將靶向破壞的細(xì)胞類型所表達(dá)蛋白的特異配體。該配體可以是一天然配體、一種抗體或其片段、或特異結(jié)合于細(xì)胞蛋白的另一類型的分子?？膳e例的蛋白酶是抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)。
根據(jù)靶向破壞的細(xì)胞類型來分，融合蛋白可用于治療多種疾病。例如，如果配體靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞表達(dá)蛋白，該融合蛋白可用于治療癌癥、減少或消除腫瘤。如果配體靶向結(jié)合特定的免疫細(xì)胞表達(dá)蛋白，該融合蛋白可用于治療自體免疫疾病。類似的，通過細(xì)胞的選擇性消除可治療其它疾病。
在一些具體實(shí)例中，配體可為一種已知靶細(xì)胞蛋白的配體?？膳e例的配體包括特異于共刺激分子、細(xì)胞因子(細(xì)胞因子受體的配體)、生長(zhǎng)因子(生長(zhǎng)因子受體的配體)和趨化因子(趨化因子受體的配體)的配體。其它配體可以是抗體，包括特異結(jié)合于靶細(xì)胞蛋白如v-erb-b2成紅細(xì)胞白血病病毒致癌基因同源體2(erbB2)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、fms相關(guān)酪氨酸激酶3(Flt-3)；細(xì)胞因子受體；生長(zhǎng)因子受體和趨化因子受體的重組抗體和抗體片段。可舉例的配體有CD28和細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)都是CD80的天然配體；CD28也是CD86的天然配體；CD40的天然配體是CD40L；誘導(dǎo)性協(xié)同刺激分子配體(ICOSL)的天然配體是誘導(dǎo)性協(xié)同刺激分子(ICOS)；細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)的天然配體是白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-3(LFA-3)；淋巴細(xì)胞活化誘導(dǎo)受體(41BB)的天然配體是41BBL；單核細(xì)胞克隆刺激因子受體(MCSFR)的天然配體是單核細(xì)胞克隆刺激因子(MCSF)；游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)的天然配體是FL3L；CC趨化因子受體2(CCR2)、CC趨化因子受體2(CCR3)和CC趨化因子受體2(CCR5)的天然配體是單核細(xì)胞趨化肽-3(MCP-3)和正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(RANTES)。人致炎細(xì)胞因子包括結(jié)合于白介素-1(IL-1)受體的IL-1α和結(jié)合于組織壞死因子(TNF)受體的TNF-α和TNF-β。Th1細(xì)胞因子包括白介素-2(IL-2)、白介素-15(IL-15)和白介素-18(IL-18)，Th2細(xì)胞因子包括結(jié)合于各自受體的白介素-4(IL-4)，白介素-5(IL-5)和白介素-10(IL-10)。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是另一個(gè)根據(jù)本發(fā)明可用于靶向細(xì)胞的因子。
融合蛋白可在AIP組份和配體組份之間或在蛋白酶組份和配體組份之間包含有一個(gè)蛋白酶切割位點(diǎn)?？膳e例的切割位點(diǎn)是能被已知存在于靶向消除細(xì)胞中的蛋白酶所識(shí)別的切割位點(diǎn)。
本發(fā)明的實(shí)施使用專業(yè)領(lǐng)域的傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在書中均有具體描述。見，如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1998)Sambrook et al.，eds.，Molecular CloningA Laboratory Manual(2nded.)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY(1998)；Ausubel等，分子生物學(xué)通用手冊(cè)，John Wiley和Sons，紐約(2000)Ausubel et al.，eds.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY(2000)；Glover，DNA克隆實(shí)用方法，卷I和IIGlover，ed.，DNA CloningA Practical Approach，Vols.I & II；Colowick和Kaplan，酶學(xué)方法，學(xué)術(shù)出版社Colowick & Kaplan，eds.，Methods in Enzymology，Academic Press；Weir和Blackwell，免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，卷I-IV，Blackwell科學(xué)出版社(1986)Weir & Blackwell，eds.，Handbookof Experimental Immunology，Vols.I-IV，Blackwell Scientific Pubs.(1986)；Fields，Knipe和Howley，病毒領(lǐng)域(第三版)，卷I和II，Lippincott Williams和Wilkins出版社，(1996)Fields，Knipe，& Howley，eds.，F(xiàn)ields Virology(3rded.)Vols.I & II，Lippincott Williams & Wilkins Pubs.(1996)；Coligan等，免疫學(xué)通用手冊(cè)，John Wiley和Sons，紐約，(2000)Coligan et al.，eds.，CurrentProtocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York，NY(2000)，收錄在此均作為參考文獻(xiàn)。
對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白功能性片段的鑒定可按常規(guī)方法進(jìn)行并獲得衣殼蛋白。同樣，配體的鑒定也可按常規(guī)方法進(jìn)行。包含活性AIP組份和活性配體組份的融合蛋白的構(gòu)建工作可以完成。專業(yè)人士能容易的鑒定融合蛋白是否靶向細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
本發(fā)明的治療用途包括使用融合蛋白通過選擇性靶向細(xì)胞并誘導(dǎo)其凋亡來治療與過度增生細(xì)胞相關(guān)的疾病，比如癌癥或牛皮癬和自體免疫疾病。本發(fā)明包含該融合蛋白的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物特別有用于具實(shí)體瘤特性的癌癥。刺激過度增生細(xì)胞凋亡的能力為破壞過度增生細(xì)胞從而減少腫瘤提供了一種方法。在癌癥和牛皮癬這樣的具有不適當(dāng)?shù)募?xì)胞過度增生特性的疾病中，該藥物組合物可用于通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來停止過度增生從而進(jìn)行的疾病治療。
WNV衣殼蛋白或其功能性片段可用上述易得有效的起始材料按常規(guī)方法生產(chǎn)。編碼WNV衣殼蛋白的核苷酸序列和蛋白的氨基酸序列一樣都是已知的。一系列的WNV分離物的全基因組在GenBank中公布和獲得，包括分離物2741(登記號(hào)為AF206518)，NY99-火烈鳥382-99株(登記號(hào)為AF196835)和登記號(hào)為M12294的分離物。收錄于此的各項(xiàng)均作為參考文獻(xiàn)。有許多關(guān)于WNV基因組序列信息的公開資料和與GenBank中序列信息相關(guān)的引用文獻(xiàn)。每一條這些參考文獻(xiàn)，包括公開可獲得的序列信息均收錄于此作為參考文獻(xiàn)。
衣殼蛋白的序列信息和其它黃病毒族病毒的核苷酸序列也可在GenBank中查到。作為非限制實(shí)例，GenBank中提供的病毒株和分離物的全基因組序列包括JEV(登記號(hào)為M18370，D90194和D90195)、SLEV(登記號(hào)為M16614)、YFV(登記號(hào)為AF 094612，U17067，U17066，U54798，U21055，U21056和X03700)、DENV(登記號(hào)為M23027，U88536和U88537)、BVDV(登記號(hào)為M31182)和HCV(登記號(hào)為AF207773和AF207774)，均收錄于此作為參考文獻(xiàn)。其它AIP序列，例如HIV Vpr和多種半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶的序列都是已知的。Vpr的氨基酸序列在美國(guó)1993年12月15日申請(qǐng)的系列號(hào)為08/167,608的專利中公開，收錄于此作為參考文獻(xiàn)。鑒定Vpr蛋白特異作用并停止細(xì)胞周期的區(qū)域的數(shù)據(jù)在1997年8月14日申請(qǐng)的臨時(shí)申請(qǐng)專利60/055,754中有描述，收錄于此作為參考文獻(xiàn)。
具普通專業(yè)技能的技術(shù)人員可以使用商業(yè)化的表達(dá)載體和系統(tǒng)或用已知的方法和易得有效的起始材料制成的載體生產(chǎn)融合蛋白。表達(dá)系統(tǒng)包含均對(duì)多種宿主是易得有效并為專業(yè)已知的必需的控制序列，比如啟動(dòng)子和多聚腺苷酸信號(hào)和優(yōu)選的增強(qiáng)子。見，例如，分子生物學(xué)通用方法，John Wiley和Sons，紐約(2000)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY(2000)。因此，目的蛋白可在原核和真核系統(tǒng)中制備，產(chǎn)生一系列的蛋白加工形式。
盡管Bacillus Subtilis和Psedomonas等系統(tǒng)也很有用，但使用最普通的原核系統(tǒng)仍為E.coli。原核系統(tǒng)適用的控制序列包括組成和誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，包括但不限于lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子；雜合啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子、λ噬菌體P1啟動(dòng)子。一般來說，在這些宿主中生產(chǎn)的異源蛋白可為融合或成熟形式。當(dāng)目的序列以成熟蛋白的形式產(chǎn)生時(shí)，生產(chǎn)的序列前可能加入了一不需有效除去的甲硫氨酸。因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)時(shí)，本發(fā)明權(quán)利要求的多肽和蛋白的序列前可以有一N末端Met。此外，也可構(gòu)建一個(gè)在多肽編碼序列前加入一個(gè)能使蛋白分泌的可操作的信號(hào)肽序列的構(gòu)建物。當(dāng)在原核宿主中以這種方式生產(chǎn)時(shí)，信號(hào)肽序列在分泌中除去。
現(xiàn)在，廣泛類型的真核宿主也能用于生產(chǎn)重組異源蛋白。像在大腸桿菌中一樣，真核宿主也可以用生產(chǎn)目的蛋白的表達(dá)系統(tǒng)直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但需提供更為通用的信號(hào)肽序列以有效地分泌蛋白。真核系統(tǒng)的額外的優(yōu)點(diǎn)是它們能加工存在于高等生物編碼蛋白基因組序列中的內(nèi)含子。真核系統(tǒng)也提供多種能導(dǎo)致例如糖基化、C末端酰胺化、某些氨基酸殘基氧化或衍生化、構(gòu)象控制等的加工機(jī)制。
通常使用的真核系統(tǒng)包括但不限于酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳細(xì)胞、鳥細(xì)胞和高等植物細(xì)胞?？刹僮鞯倪m合這些宿主細(xì)胞類型的啟動(dòng)子是有效的。終止序列和增強(qiáng)子序列比如桿狀病毒多面體啟動(dòng)子也是有效的。如上所述，啟動(dòng)子可以是組成的或誘導(dǎo)的，例如，在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中，鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子能通過加入重金屬離子來誘導(dǎo)。
構(gòu)建適合目的宿主的表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)節(jié)是專業(yè)技術(shù)人員所知的。對(duì)于重組生產(chǎn)的蛋白而言，其DNA編碼序列與選擇的表達(dá)載體進(jìn)行適當(dāng)?shù)南噙B，并轉(zhuǎn)化到合適的宿主中，宿主在能表達(dá)異源蛋白的條件下培養(yǎng)和保存。本發(fā)明中蛋白的生產(chǎn)是按適合的已知專業(yè)方法，通過裂解細(xì)胞或者從培養(yǎng)液中回收的。
具有普通專業(yè)技能的技術(shù)人員能用熟知的技術(shù)分離這些表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的融合蛋白。
除了用重組技術(shù)生產(chǎn)這些蛋白外，自動(dòng)氨基酸合成儀也可應(yīng)用于融合蛋白的生產(chǎn)。值得進(jìn)一步注意的是，如果此處蛋白是合成的，非基因編碼的氨基酸置換也是可行的?？商鎿Q的殘基包括，例如，分子式為H2N(CH2)nCOOH(n＝2-6)的氨基酸。這些中性、非極性氨基酸有肌氨酸(Sar)，t-丁基丙氨酸(t-BuAla)，t-丁基甘氨酸(t-BuGly)，N-甲基異亮氨酸(N-MeIle)，和正亮氨酸(NIue)。例如，能替換Trp，Tyr或Phe的苯甘氨酸，是芳香族中性氨基酸；瓜氨酸(Cit)和甲硫氨酸亞砜(MSO)是中性極性氨基酸；環(huán)乙基丙氨酸(Cha)是中性非極性氨基酸，半胱磺酸(Cya)是酸性氨基酸，鳥氨酸(Orn)是堿性氨基酸。脯氨酸殘基的構(gòu)象賦予特性可通過被羥脯氨酸(Hyp)替換一個(gè)或更多殘基而得知。
用于治療自體免疫疾病和以細(xì)胞過度增生為特性的疾病的藥物組合物包括融合蛋白和一個(gè)可藥用的載體或佐劑，專業(yè)人員可根據(jù)所選擇的給藥模式來選擇制成該藥物組合物的方式。合適的藥用載體見該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)參考書Remington的藥物科學(xué)(同上)(Remington’s Pharmaceutical Sciences)。
任何給藥途徑的一個(gè)普遍要求是有效并且施用方便。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)例中，藥物組合物是通過注射的方式給藥。在一個(gè)首選的具體實(shí)例中，藥物組合物是通過腫瘤內(nèi)注射的方式給藥。其它給藥方式包括但不限于表皮滲透、經(jīng)過皮膚、皮下、腹膜內(nèi)、粘膜或一般持續(xù)性給藥。
針對(duì)腸胃外的給藥方式，黃病毒衣殼蛋白或其功能性片段能被制成例如溶液、懸浮液、乳劑或與藥用腸胃外賦形劑相關(guān)聯(lián)的凍干粉末。例如，這種賦形劑可為水、鹽水、Ringer式溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白；也可以使用脂質(zhì)體和非水性賦形劑，例如脂肪油。賦形劑或凍干粉末可包含保持滲透壓(如氯化鈉，甘露醇)和化學(xué)穩(wěn)定性(如緩沖液和防腐劑)的添加物。制劑用通用技術(shù)進(jìn)行無菌處理。例如，一個(gè)通過注射給藥的腸胃外藥用成份可按活性成份占1.5％的質(zhì)量比溶于0.9％氯化鈉溶液中來制備。
雖然個(gè)體需求的劑量是可變化的，但專業(yè)領(lǐng)域包括了制劑有效用量?jī)?yōu)化范圍的鑒定方法。人們也能很容易的從動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果來進(jìn)行推斷Katocs等，Remington的藥物科學(xué)，第27章，18版，Gennaro編輯，Mack出版社，伊斯頓，賓夕法尼亞州，1990(Katocs et al.，Chapter 27 InRemington’sPharmaceutical Sciences，18th Ed.，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990)。一般來說，專業(yè)技術(shù)人員可根據(jù)一些因素來調(diào)整制劑有效用量所需的劑量，這些因素包括受藥者的年齡、健康狀況、身體條件、體重、疾病或障礙的類型和程度、治療頻率、并行治療的性質(zhì)、如果需要，還會(huì)包括預(yù)期效果的性質(zhì)和范圍Nies等，Goodman和Gilman的治療的藥物基礎(chǔ)，第3章，第9版，Hardman等編輯，McGraw-Hill，紐約，NY，1996(Nies et al.，Chapter3 InGoodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，9thEd.，Hardman et al.，eds.，McGraw-Hill，New York，NY，1996)。通常，融合蛋白每日劑量在大約1μg～100mg每公斤體重。較合適劑量一般為0.5-50mg每公斤每天，優(yōu)選為1-10mg每公斤每天，每天1-6次或持續(xù)釋放的給藥方式能有效的獲得預(yù)期效果。
本發(fā)明中的藥物組合物可按單份劑量或多份劑量的方式給藥。本發(fā)明的藥物組合物也可按單獨(dú)的治療藥劑或與其它治療藥劑結(jié)合的方式給藥。本發(fā)明的治療方法也可以與傳統(tǒng)治療結(jié)合，按順序或同時(shí)施用。
含融合蛋白的藥物組合物可按任何能使活性藥劑到達(dá)受藥者體內(nèi)藥劑作用位點(diǎn)的方式給藥。因?yàn)榈鞍滓钥诜o藥時(shí)容易被消化分解，因此通常使用腸道外給藥方式，即靜脈注射、皮下注射、肌肉內(nèi)注射以優(yōu)化吸收。此外，本發(fā)明的藥物組合物可在過度增生位點(diǎn)或其附近進(jìn)行注射。例如，施用方式可為直接注射進(jìn)入實(shí)體瘤團(tuán)塊或其直接鄰近的組織。如果治療的個(gè)體患牛皮癬，融合蛋白可用一可藥用的局部載體制成制劑，該制劑可作為如霜、露或藥膏的形式局部施用。
實(shí)例下列有登記號(hào)和參考文獻(xiàn)的序列在此可作為參考。
西尼羅病毒AF202541 HNY1999株西尼羅病毒NC001563 全基因組HIV VprVPR AJ404325 vpr，gag，pol，vif，vpu，env和nefVPR AF316862 vif，vpr(喀麥隆分離物)VPR AF325763 vif，vpr(南非分離物)AIFAIF XM010246 也稱為“程序性細(xì)胞死亡8”或“PDCD8”AIF NM004208TAPTAP AF009510 也被稱為TAP相關(guān)蛋白
TAP AF314222 選擇性拼接TAP AB010639 TAP相關(guān)蛋白2巨噬細(xì)胞集落刺激因子登記號(hào)AAA59572Cerretti，D.P.等，分子免疫學(xué)，25(8)，761-770(1988)Cerretti，D.P.et al.，Mol.Immunol.25(8)，761-770(1988)登記號(hào)AAB51235Visvader，J.和Verma，I.M.，分子細(xì)胞生物學(xué)，9(3)，1336-1341(1989)Visvader，J.and Verma，I.M.，Mol.Cell.Biol.9(3)，1336-1341(1989)登記號(hào)P09603wong等，科學(xué)，235(4795)，1504-1508(1987)wong et al.，Science 235(4795)，1504-1508(1987)Cerretti等，分子免疫學(xué)，25(8)761-770(1988)Cerretti et al.，Mol.Immuno.25(8)761-770(1988)Kawasaki等，科學(xué)，230(4723)291-296(1985)Kawasaki et al.，Science，230(4723)291-296(1985)趨化因子(C-C motif)受體5登記號(hào)4502639Raport，C.J.等，生物化學(xué)雜志，271(29)，17161-17166(1996)Raport，C.J.et al.，J.Biol.Chem.271(29)，17161-17166(1996)單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-3)登記號(hào)CAA50407Minty，A.等，歐洲細(xì)胞因子網(wǎng)刊，4(2)，99-110(1993)Minty，A.et al.，Eur.Cytokine Netw.4(2)，99-110(1993)登記號(hào)AAC03538pFLT3fms相關(guān)酪氨酸激酶3登記號(hào)4758396Small，D.等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，91，459-463(1994)Small，D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，459-463(1994)

登記號(hào)P36888Small，D等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，91，459-463(1994)Small，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，459-463(1994)pFLT3LGfms相關(guān)酪氨酸激酶3配體登記號(hào)45037514-1BB登記號(hào)AAA53133Alderson，M.R.等，歐洲免疫學(xué)雜志，24(9)，2219-2227(1994)Alderson，M.R.etal.，Eur.J.Immunol.24(9)，2219-2227(1994)4-1BBL登記號(hào)P41273Alderson，M.R.等，歐洲免疫學(xué)雜志，24(9)，2219-2227(1994)Alderson，M.R.etal.，Eur.J.Immunol.24(9)，2219-2227(1994)RANTES登記號(hào)BAA76939Liu，H.等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，96(8)，4581-4585(1999)Liu，H.et al.，PNASU.S.A.96(8)，4581-4585(1999)登記號(hào)1065018登記號(hào)XM012656登記號(hào)NM002985CCR1/MIP1R登記號(hào)P32246Neote，K.等，細(xì)胞，72(3)415-425(1993)Neote，K.et al.，Cell，72(3)415-425(1993)Gao，J.L.等，實(shí)驗(yàn)藥物雜志，177(5)1421-1427(1993)Gao，J.L.et al.，J.Exp.Med.177(5)1421-1427(1993)Nomura，H.等，國(guó)際免疫學(xué)，5(10)1239-1249(1993)Nomura，H.et al.，Int.immunol.5(10)1239-1249(1993)

CCR5登記號(hào)P56493Kuhmann，S.E.等，病毒學(xué)雜志，71(11)8642-8656(1997)Kuhmann，S.E.et al.，J.Virol.71(11)8642-8656(1997)Murayama，Y.等Murayama，Y.et al.，CCR2登記號(hào)P41597Charo，I.F.等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，91(7)2752-2756(1994)Charo，I.F.et al.，PNAS，U.S.A.91(7)2752-2756(1994)Yamagami，S.等，生物化學(xué)生物物理學(xué)研究交流，202(2)1156-1162(1994)Yamagami，S.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，202(2)1156-1162(1994)Wong，L.M.等，生物化學(xué)雜志，272(2)1038-1045(1997)Wong，L.M.et al.，J.Biol.Chem.，272(2)1038-1045(1997)CCR3登記號(hào)P51677Combadiere，C.等，生物化學(xué)雜志，270(28)16491-16494(1995)Combadiere，C.et al.，J.Biol.Chem.，270(28)16491-16494(1995)Combadiere，C.等，生物化學(xué)雜志，270 30235(1995)Combadiere，C.et al.，J.Biol.Chem.，270 30235(1995)Dougherty，B.L.等，實(shí)驗(yàn)藥物雜志，183(5)2349-2354(1996)Dougherty，B.L.etal.，J.Exp.Med.183(5)2349-2354(1996)CD40配體登記號(hào)P29965Graf，D等，歐洲免疫學(xué)雜志，22(12)3191-3194(1992)Graf，D.et al.，Eur.J.Immunol.22(12)3191-3194(1992)Hollenbaugh，D.等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志，11(12)4313-4321(1992)Hollenbaugh，D.et al.，Embo.J.11(12)43 13-4321(1992)Spriggs，M.K.等，細(xì)胞，72 291-300(1993)Spriggs，M.K.et al，Cell，72 291-300(1993)Spriggs，M.K.等，實(shí)驗(yàn)藥物雜志，176(6)1543-1550(1992)Spriggs，M.K.et al.，J.Exp.Med.176(6)1543-1550(1992)Gauchat等，F(xiàn)ebs通訊，315(3)259-266(1993)Gauchat et al.，F(xiàn)ebs.Lett.315(3)259-266(1993)CD86登記號(hào)5901920Azuma等，自然，366(6450)76-79(1993)Azuma et al.，Nature 366(6450)76-79(1993)Reeves等，哺乳動(dòng)物基因組，8(8)581-582(1997)Reeves et al.，Mamm.Genome 8(8)581-582(1997)CD80登記號(hào)4885123Selvakumar等，免疫遺傳學(xué)，36(3)175-181(1992)Selvakumar et al.，Immunogenetic 36(3)175-181(1992)Freeman等，血液，79(2)489-494(1992)Freeman et al.，Blood 79(2)489-494(1992)CD40登記號(hào)4507581Stamenkovic等，歐洲分子生物學(xué)雜志，8(5)1403-1410(1989)Stamenkovicet al.，Embo.J.8(5)1403-1410(1989)LFA-3登記號(hào)BAA05922ICAM1登記號(hào)AAB51145CD28登記號(hào)5453611Lee等，免疫學(xué)雜志，145(1)344-352(1990)Lee et al.，J.Immunol.145(1)344-352(1990)

人IL-1α的核苷酸和氨基酸序列是已知的，見Telford等，(1986)核酸研究，149955-99Telford et al.，(1986)Nucl.Acids Res.149955-9963，F(xiàn)urutani等，(1985)核酸研究，143167-3179Furutani et al.，(1986)Nuci.Acids Res.143167-3179，March，等(1985)自然，315641-64March et al.，(1985)Nature，315641-647和登記號(hào)為Swissprot PO1583的序列，收錄于此作為參考文獻(xiàn)。
人IL-2的核苷酸和氨基酸序列是已知的，見Holbrook等，(1984)美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，811634-1638Holbrook et al.，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811634-1638，F(xiàn)ujita等，(1983)美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，807473-74Fujita et al.，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，807473-7441，F(xiàn)use等，(1984)核酸研究，129323-93Fuse et al.，(1984)Nucl.Acids Res.129323-9331，Taniguchi等，(1983)自然，302305-310Taniguchi等，(1983)自然，302302-310，Maeda等，(1983)生物化學(xué)生物物理研究交流，1151040-104Maeda等，(1983)Biochem.Biophys.Res.Comm.1151040-1047，Devos等，(1983)核酸研究，114307-432Devos et al.，Nucl.Acids Res.(1983)114307-4323和登記號(hào)為Swissprot PO1585的序列，收錄于此作為參考文獻(xiàn)。
人IL-4的核苷酸和氨基酸序列是已知的，見Arai等，(1989)免疫學(xué)雜志，142274-28Arai et al.，(1989)J.Immunol.142274-282，Otsuka等，(1987)核酸研究，15333-34Otsuka et al.，(1987)Nucl.Acids Res.15333-344，Yokota等，(1986)美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，835894-5898Yokota etal.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，835894-5898，Noma等，(1984)自然，319640-64Noma et al.，(1984)Nature，319640-646，Lee等，(1986)美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，832061-20Lee et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，832061-2063和登記代碼為Swissprot 05112(鼠IL-4的登記號(hào)為Swissprot07750)的序列，收錄于此作為參考文獻(xiàn)。
人IL-5的核苷酸和氨基酸序列是已知的，見Campbell等，(1987)美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，846629-663Campbell et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，846629-6633，Tanabe等，(1987)生物化學(xué)雜志，26216580-1658Tanabeet al.，(1987)J.Biol.Chem.26216580-16584，Campbell等，(1988)歐洲生物化學(xué)雜志，174345-3Campbell et al.，(1988)Eur.J.Biochem.174345-352，Azuma等，(1986)核酸研究，149149-9158Azuma et al.，(1986)Nucl.Acids Res.149149-9158，Yokota等，(1986)美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，847388-739Yokota et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847388-7392和登記號(hào)為Swissprot PO5113的序列，收錄于此作為參考文獻(xiàn)。
人IL-10的核苷酸和氨基酸序列是已知的，見Viera等，(1991)美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，881172-11Viera et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，881172-1176和登記號(hào)為SwissprotP22301的序列。
人IL-15的核苷酸和氨基酸序列是已知的，見Grabstein等，(1994)科學(xué)，264965-968Grabstein et al.，(1994)Science，264965-968和登記號(hào)為Swissprot U03099的序列，收錄于此作為參考文獻(xiàn)。
人IL-18核苷酸和氨基酸序列是已知的，見Ushio等，(1996)免疫學(xué)雜志，1564274-4279Ushio et al.，(1996)J.Immunol.1564274-4279和登記號(hào)為D49950的序列，收錄于此作為參考文獻(xiàn)。
人TNF-α的核苷酸和氨基酸序列是已知的，見Pennica，(1984)自然，312724-729Pennica，(1984)Nature，312724-729和登記號(hào)為SwissprotPO1375的序列，收錄于此作為參考文獻(xiàn)。
人TNF-β的核苷酸和氨基酸序列是已知的，見Gray，(1984)自然，312721-72Gray，(1984)Nature，312721-724和登記號(hào)為Swissprot PO1374的序列，收錄于此作為參考文獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一個(gè)包含AIP組份和配體組份的融合蛋白。
2.權(quán)利要求1所述的融合蛋白中AIP組份來源于WNV衣殼蛋白，HIVVpr，或半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶
3.權(quán)利要求1所述的融合蛋白中配體是一個(gè)天然的配體。
4.權(quán)利要求3所述的融合蛋白中配體是一個(gè)天然的配體，是從含共刺激分子配體、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的小組中選擇出來的。
5.權(quán)利要求4所述的融合蛋白中配體是一個(gè)天然的配體，是從含F(xiàn)lt-3配體、IL-15或RANTES的小組中選擇出來的。
6.權(quán)利要求1所述的融合蛋白中配體是一個(gè)抗體。
7.權(quán)利要求6所述的融合蛋白中配體是一個(gè)抗體片段。
8.權(quán)利要求1所述的融合蛋白中配體是一個(gè)與共刺激分子、細(xì)胞因子受體、趨化因子受體、生長(zhǎng)因子受體、原癌基因產(chǎn)物和癌細(xì)胞標(biāo)記結(jié)合的抗體。
9.權(quán)利要求1所述的融合蛋白中配體是一個(gè)與erbB2蛋白、PSMA蛋白和Flt-3結(jié)合的抗體。
10.消除細(xì)胞的方法包括用權(quán)利要求1所述的融合蛋白接觸細(xì)胞。
11.在個(gè)體中消除細(xì)胞的方法包含給上述個(gè)體施用權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
12.融合蛋白包含一個(gè)蛋白酶組份和一個(gè)配體組份。
13.權(quán)利要求12所述的融合蛋白中蛋白酶組份是TAP或其一個(gè)片段。
14.權(quán)利要求12所述的融合蛋白中配體是一個(gè)天然的配體。
15.權(quán)利要求14所述的融合蛋白中配體是一個(gè)天然的配體，是從含共刺激分子配體、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的小組中選擇出來的。
16.權(quán)利要求15所述的融合蛋白中配體是一個(gè)天然的配體，是從含F(xiàn)lt-3配體、IL-15或RANTES的小組中選擇出來的。
17.權(quán)利要求12所述的融合蛋白中配體是一個(gè)抗體。
18.權(quán)利要求17所述的融合蛋白中配體是一個(gè)抗體片段。
19.權(quán)利要求12中所述的融合蛋白中配體是一個(gè)與共刺激分子、細(xì)胞因子受體、趨化因子受體、生長(zhǎng)因子受體、原癌基因產(chǎn)物和癌細(xì)胞標(biāo)記物結(jié)合的抗體。
20.權(quán)利要求12所述的融合蛋白中配體是一個(gè)與erbB2蛋白、PSMA蛋白和Flt-3結(jié)合的抗體。
21.消除細(xì)胞的方法包括用權(quán)利要求12所述的融合蛋白接觸細(xì)胞。
22.在個(gè)體中消除細(xì)胞的方法包含給上述個(gè)體施用權(quán)利要求12所述的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了由細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白組份和細(xì)胞靶向組份組成的融合蛋白。本發(fā)明公開了由蛋白酶組份和細(xì)胞靶向組份組成的融合蛋白。本發(fā)明公開了能靶向細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的物質(zhì)組成和方法。
文檔編號(hào)C07K16/28GK1531552SQ02807666
公開日2004年9月22日 申請(qǐng)日期2002年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月25日
發(fā)明者維尼爾·大衛(wèi)·B, 維尼爾 大衛(wèi) B 申請(qǐng)人:賓西法尼亞大學(xué)托管人