專利名稱：標(biāo)記試劑,合成該試劑的方法以及檢測生物分子的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用來標(biāo)記生物分子的新型試劑，涉及合成所述標(biāo)記的方法以及涉及標(biāo)記生物分子的應(yīng)用，尤其在用核酸探針診斷的領(lǐng)域。
現(xiàn)有技術(shù)的描述現(xiàn)有技術(shù)顯示了各種用于標(biāo)記核苷酸、寡核苷酸或核酸的方法。
第一種方法包括將標(biāo)記附到堿基上，無論后者是天然的堿基或是經(jīng)修飾的堿基。第二種方法將標(biāo)記附到糖上，同樣，無論后者是天然的糖或是經(jīng)修飾的糖。第三種方法將標(biāo)記附到磷酸上。
在堿基上標(biāo)記特別用于通過直接摻入標(biāo)記的核苷酸來標(biāo)記核酸。
在糖上標(biāo)記通常在用化學(xué)合成制備核探針的情況下使用。
在磷酸上標(biāo)記也被用于在化學(xué)合成寡核苷酸時引入已被功能化的臂和標(biāo)記。
事實上，精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠標(biāo)記核苷酸、核苷酸類似物或核酸，傾向于在堿基或糖上進行這種附著，這樣更加方便且更利于選擇。這也是為什么許多文獻，如EP-A-0,329,198，EP-A-0,302,175，EP-A-0,097,373，EP-A-0,063,879，US-A-5,449,767，US-A-5,328,824，WO-A-93/16094，DE-A-3,910,151，EP-A-0,567,841都把研究放在堿基上，而EP-A-0,286,898研究了糖。
與使堿基或糖功能化的技術(shù)相比，將標(biāo)記附到磷酸上是一項比較復(fù)雜的技術(shù)，尤其是由于磷酸的低反應(yīng)性它已較少使用(參見，例如，Jencks W.P.等，J.Amer.Chem.Soc.，82，1778-1785，1960)。同時，可參見O’Donnel和McLaughlin的綜述(“用于核酸結(jié)構(gòu)分析的報道基因”，216-243頁，收錄在《生物有機化學(xué)核酸》(“Bioorganic ChemistryNucleic Acids”)，Hecht S.M.編，牛津大學(xué)出版社，1996)涉及將探針引入寡核苷酸片段的方法，核苷酸間磷酸二酯的有效烷基化被認(rèn)為是不可能的。
專利申請WO 99/65926描述了標(biāo)記合成的或天然的核糖核酸(RNA)的方法，它包括片段化RNA和在末端磷酸的水平上進行標(biāo)記。該文獻描述了許多可與片段化一起用于標(biāo)記的官能團，如羥基、胺、肼、烷氧基胺、烷基鹵和芐基型的烷基鹵官能團，尤其是5’-(溴甲基)熒光素衍生物。這些官能團能夠標(biāo)記核酸，但必需與片段化步驟結(jié)合以進行有效標(biāo)記，因為這種標(biāo)記發(fā)生在片段化時釋放的磷酸上。此外，必需加入相對于RNA的大量過量的標(biāo)記試劑以獲得有效的標(biāo)記，這就導(dǎo)致了過量標(biāo)記產(chǎn)生的背景噪音的問題。最后，該方法對雙鏈DNA不能有效工作。
因此需要有新的標(biāo)記試劑，從標(biāo)記領(lǐng)域的觀點來看這種試劑是有效的，它在標(biāo)記位點的水平上是特異的，且特別地，它不會影響通過氫鍵形成雙螺旋時所涉及的堿基的雜交特性，它可用于DNA和RNA，最后，它可用來標(biāo)記天然來源的或通過酶擴增制備的核苷酸，寡核苷酸或核酸。
發(fā)明概述本發(fā)明描述了新型標(biāo)記，所述標(biāo)記可滿足上述情況，且可將重氮甲基官能團用作標(biāo)記的反應(yīng)官能團。
所述重氮甲基官能團(式-C(N2)-)已被用于磷酸基團的烷基化，但存在許多問題。一方面，所述重氮衍生物本身通常是不穩(wěn)定的，故將這些標(biāo)記試劑用于標(biāo)記試劑盒就會產(chǎn)生問題，另一方面，偶合產(chǎn)物是不穩(wěn)定的，因此，如果標(biāo)記產(chǎn)物被用來檢測任何樣品中靶生物分子的存在情況，就不能使用這種方法。
最后，帶有重氮甲基官能團的衍生物不溶于水，因此在和僅溶于水或含水緩沖液且在水或含水緩沖液中穩(wěn)定的生物分子偶合時就要采用兩相條件，但這些條件會降低反應(yīng)速度從而影響偶合效率。
本發(fā)明的新型標(biāo)記試劑可解決這些問題。
根據(jù)第一個實施方案，本發(fā)明描述了對溫度穩(wěn)定的式(0)的標(biāo)記試劑 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于1，和
●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
根據(jù)第二個實施方案，本發(fā)明描述了對溫度穩(wěn)定的式(1)的標(biāo)記試劑 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，和●-Y-X表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
有利地是，根據(jù)第二個實施方案的第一個變化，所述對溫度穩(wěn)定的試劑如式(2)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，和●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
有利地是，根據(jù)第二個實施方案的第二個變化，所述對溫度穩(wěn)定的試劑如式(3)所示
其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，和●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
有利地是，根據(jù)第二個實施方案的第三個變化，所述對溫度穩(wěn)定的試劑如式(4)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
有利地是，根據(jù)第一個實施方案的第一個變化，所述對溫度穩(wěn)定的試劑如式(21)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，是0-2之間的整數(shù)，優(yōu)選等于0或1，和●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
有利地是，根據(jù)第一個實施方案的第二個變化，所述對溫度穩(wěn)定的試劑如式(22)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是0-2之間的整數(shù)，優(yōu)選等于0或1，和●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
有利地是，根據(jù)第一個實施方案的第三個變化，所述對溫度穩(wěn)定的試劑如式(23)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是0-2之間的整數(shù)，優(yōu)選等于0或1，和●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
在上述結(jié)構(gòu)式(0)-(4)和(21)-(23)中，R3和R4分別表示H，NO2，OCH3，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2是有利的。
因此，按照如第二個實施方案的第三個變化(式(4))優(yōu)選地化合物如式(4’)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，和●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)。
類似地，優(yōu)選地如第二個實施方案的第一個變化(式(2))所述的化合物如式(2’)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，和●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)。有利地是，在式(2’)中，帶有重氮甲基官能團的取代基在鄰位或間位。類似地，按照第一個實施方案的第一個變化(式(21))優(yōu)選地化合物如式(24)所示 其中
●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，和●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是0-2之間的整數(shù)，優(yōu)選等于0或1。
表述“多聚體結(jié)構(gòu)”是指由化學(xué)或生物合成子的重復(fù)單位形成的聚合物。一個例子如下面實施例34.2所述。許多可用于本發(fā)明的這種結(jié)構(gòu)的變體是已知的，例如●線性聚合物(EP-A-0,561,722，EP-A-0,669,991)，●支鏈聚合物(WO-A-01/92361)。
●顆粒(EP-A-0 827 552)，●樹狀聚體(dendrimer)(US-A-4,507,466；US-A-4,568,737；US-A-6,083,708)，●多核苷酸，和●多肽。
表述“可檢測標(biāo)記”是指至少一種能夠直接或間接產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記。這些標(biāo)記的非限制性例子有●產(chǎn)生例如可通過比色法、熒光、發(fā)光檢測的信號的酶，如辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，●生色團，如熒光、發(fā)光或著色化合物，●具有電子密度的基團，所述電子密度可通過電子顯微鏡檢測，或通過其電學(xué)特性，如電導(dǎo)率、電流分析、電量法、阻抗檢測，●可檢測基團，例如，其分子大小足以使其物理和/或化學(xué)特性產(chǎn)生可檢測的修飾，這種檢測可通過光學(xué)方法如衍射、表面胞質(zhì)基因組共振、表面變異、接觸角變化進行，或通過物理方法如原子力光譜、隧道效應(yīng)進行，●放射性分子，如32P，35S或125I。
優(yōu)選地，所述標(biāo)記標(biāo)記不是放射性標(biāo)記以避免表面與這些標(biāo)記有關(guān)的安全問題。
在本發(fā)明一個特別的實施方案中，所述標(biāo)記可通過電化學(xué)方法檢測，特別地，所述標(biāo)記是鐵絡(luò)合物如二茂鐵的衍生物。
也可使用間接系統(tǒng)，如，例如能夠和抗配體反應(yīng)的配體。所述配體/抗配體對是精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，例如，有以下的對生物素/鏈霉抗生物素蛋白，半抗原/抗體，抗原/抗體，肽/抗體，糖/凝集素，多核苷酸/多核苷酸的互補鏈。在此情況中，它是帶有重氮甲基反應(yīng)官能團的配體。所述抗配體可通過上述標(biāo)記直接檢測，或者其自身可通過其它配體/抗配體對檢測。這種疊加系統(tǒng)(stackingsystem)在實施例中例舉。
間接系統(tǒng)的另一個例子利用了配體和抗配體之間的特定的共價鍵，例如甲基酮和烷氧基胺。這種系統(tǒng)的例子描述在專利申請WO-A-00/40590和WO-A-98/05766中。某些情況下，這些間接檢測系統(tǒng)會導(dǎo)致信號放大，如可參看在先專利申請WO-A-00/07982，WO-A-01/92361和WO-A-95/08000以了解用聚合物進行化學(xué)放大的例子，或參閱專利申請WO-A-01/44506以了解疊加化學(xué)放大系統(tǒng)(stackingchemical amplification system)。
在信號放大的特別實施方案中，標(biāo)記試劑上至少有兩個標(biāo)記。
特別地，可按照本發(fā)明進行信號放大的試劑有以下式(5)的R2-(L)n-結(jié)構(gòu) 其中●R2表示可檢測標(biāo)記，●m是1-100之間的整數(shù)，優(yōu)選1-20之間，和●p是1-10之間的整數(shù)，優(yōu)選2-6之間，最優(yōu)選是4。
采用結(jié)構(gòu)R2-(L)n與采用上述式(0)-(4)和(21)-(23)沒有差別。
另一個優(yōu)選地用于信號放大的標(biāo)記試劑如式(6)所示 其中●R2表示可檢測標(biāo)記，●R3表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
有利地是，用于信號放大的試劑如式(7)所示 其中●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●R3表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，優(yōu)選R3表示H，NO2，OCH3，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2或-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，和●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)。再一個優(yōu)選地用于信號放大的標(biāo)記試劑如式(25)所示 其中●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●R3表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于1，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
在本發(fā)明優(yōu)選地實施方案中，所述示蹤劑是低位阻的熒光化合物，如熒光素，丹酰，IR類型的生色團(Li-COR Inc.，Lincoln NE，USA)，花青衍生物如Cy5和Cy3(Randolph J.B.等，Nucleic Acid Res.，25(14)，2923-2929頁，1997)，尤其是Cy5衍生物，或者所述示蹤劑是低位阻的半抗原，如生物素或樅烯(abietane)衍生物(參見申請WO-A-00/07982)。術(shù)語低位阻是指分子量小于1000g/mol。
就熒光團而論，優(yōu)選使用激發(fā)波長大于450nm的熒光團，優(yōu)選大于600nm。
如果所述示蹤劑是不會通過其自身產(chǎn)生信號的半抗原，如生物素，則檢測是通過識別如上述標(biāo)記的抗配體進行的。在與熒光化合物如熒光素偶合的生物素、鏈霉抗生物素蛋白或抗-生物素抗體的情況下，則優(yōu)選使用Cy5或藻紅蛋白。就樅烯而論，則可使用專利申請WO-A-00/07982所述的單克隆抗體。
特別地，本發(fā)明的標(biāo)記試劑溶于極性溶劑如DMF，DMSO，CH3CN，THF，DMA(二甲基乙酰胺)，NMP(N-甲基吡咯酮)，DME(二甲氧基乙烷)。
優(yōu)選地，所述標(biāo)記試劑溶于DMSO或水。
表述水-可混溶的溶劑是指可與體積比至少為5％的水或含有鹽的含水緩沖液混溶的溶劑。
有利地是，在上式中，臂L包含乙二醇或聚乙二醇基元(motif)以增加試劑在水中的溶解度。
A是包含至少一個乙烯型的雙鍵的連接臂，它能使重氮甲基官能團和芳環(huán)共軛。連接臂A的作用是將重氮甲基官能團與該環(huán)隔離以降低位阻，從而保持重氮甲基官能團的穩(wěn)定性。表述“共軛”是指芳環(huán)上的電子沿著連接臂A的碳鏈離域.例如，臂A可有以下結(jié)構(gòu) 或 或 其中●v是1-10之間的整數(shù)，優(yōu)選v是1或2，和●R10是H或烷基，優(yōu)選R10是H，甲基或乙基。
因此，這些試劑可結(jié)合在生物分子的均勻相中，所述均勻相主要包括含水溶液，即含有至少50％的水。
表述“生物分子”是指含有至少一個能夠與感興趣的靶生物分子反應(yīng)的識別位點的化合物。生物分子的例子有核酸、抗原、抗體、多肽、蛋白質(zhì)和半抗原。
術(shù)語“核酸”是指一系列至少有兩個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，它任選含有至少一個經(jīng)修飾的核苷酸，如至少一個含有經(jīng)修飾的堿基、如肌苷、5-甲基脫氧胞苷、5-二甲基氨基脫氧尿苷、脫氧尿苷、2、6-二氨基嘌呤、5-溴脫氧尿苷、或其它經(jīng)修飾的可進行雜交的堿基的核苷酸。也可在核苷酸間連鍵水平如硫代磷酸，H-磷酸，烷基磷酸；主鏈水平如α-寡核苷酸(FR 2 607 507)或PNAs(M.Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，114，1895-1897，1992)或2’-O-烷基核糖上修飾這種多核苷酸。所述核酸可以是天然或合成的寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖體RNA、信使RNA、轉(zhuǎn)移RNA，用酶擴增技術(shù)獲得的核酸，如●PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，描述在專利US-A-4,683,195，US-A-4,683,202和US-A-4,800,159中，及其RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)衍生物，尤其是如專利EP-B-0,569,272所述的一步模式，●LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，描述在如專利申請EP-A-0,201,184中，●RCR(修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，描述在專利申請WO-A-90/01069，●3SR(自動維持序列復(fù)制)，見專利申請WO-A-90/06995，●NASBA(基于核酸序列的擴增)，見專利申請WO-A-91/02818，和●TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增)，見專利US-A-5,399,491。
因此，術(shù)語擴增子被用來定義用酶擴增技術(shù)產(chǎn)生的核酸。
這些修飾可以相互結(jié)合，只要核酸中至少有一個磷酸。
表述“多肽”是指一系列至少兩個氨基酸。
表述“氨基酸”是指●編碼蛋白質(zhì)的一級氨基酸，●酶作用后產(chǎn)生的氨基酸，如反-4-羥脯氨酸，●天然的但不存在于蛋白質(zhì)中的氨基酸，如正纈氨酸，N-甲基-L-亮氨酸，staline(參見Hunt S.，《氨基酸的化學(xué)和生物化學(xué)》(Chemistry和Biochemistry of the amino acids)，Barett G.C.編，Chapman和Hall，London，1985)，和●用化學(xué)官能團保護的氨基酸，所述官能團可用于在固相支持物或在液相中合成，以及非天然的氨基酸。
術(shù)語“半抗原”是指非免疫原性化合物，即其自身無法通過產(chǎn)生抗體促進免疫反應(yīng)，但能夠被通過在已知條件下免疫動物，尤其是用半抗原-蛋白質(zhì)共軛物進行免疫而得到的抗體識別的化合物。這些化合物的分子量通常小于3000Da，更多情況下小于2000Da，例如，可以是糖基化的肽、代謝物、維生素、激素、前列腺、毒素或各種藥物、核苷和核苷酸。
術(shù)語“抗體”包括多克隆或單克隆抗體，通過遺傳重組獲得的抗體以及抗體片段，如Fab或F(ab’)2片段。
術(shù)語“抗原”是指能夠產(chǎn)生抗體的化合物。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括全蛋白質(zhì)和雜蛋白，如核蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金屬蛋白和糖蛋白，纖維狀或球狀的，以其特有的構(gòu)象形式。
有利地是，所述生物分子含有磷酸基團，即至少具有以下一種基元的基團
或 它可以天然存在于生物分子中，或者可通過化學(xué)修飾或酶修飾將其引入生物分子?；瘜W(xué)修飾蛋白質(zhì)的例子表示在《蛋白質(zhì)共軛和交聯(lián)的化學(xué)》(“Chemistry ofprotein conjugation和cross linking”)，S.S.Wong，CRC Press，1991。
優(yōu)選地，所述生物分子是核酸。
本發(fā)明的一些有利的試劑是a)式(8)的試劑 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是含有至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，和●n是等于0或1的整數(shù)。
b)式(9)的試劑 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是含有至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，和●n等于0或1的整數(shù)。
c)式(10)的試劑
其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是含有至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，和●n等于0或1的整數(shù)。
優(yōu)選地，所述標(biāo)記試劑有以下結(jié)構(gòu)a)式(11) 其中R1表示甲基或苯基，b)式(12) 其中R1表示甲基或苯基，c)式(13) 其中R1表示甲基或苯基。
本發(fā)明其它優(yōu)選地試劑具有以下結(jié)構(gòu)a)式(14)
其中●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是含有至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，和●n等于0或1的整數(shù)，b)式(26) 其中●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于1，和L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)。
c)式(15) 其中●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是含有至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，和●n是等于0或1的整數(shù)。
d)式(27)
其中●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于1，和●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)。
不考慮試劑的變體或?qū)嵤├?，L可包含單元-(O-CH2-CH2)-，該單元重復(fù)1-10次，優(yōu)選重復(fù)1-10次，更優(yōu)選重復(fù)2-5次。
本發(fā)明的另一個目的是描述用來合成一種標(biāo)記試劑以及幾種標(biāo)記試劑的方法，這些試劑對溫度穩(wěn)定，且能夠用所述方法獲得，該方法包括以下步驟a)得到式(16a)的衍生物 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R6，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●R6表示COOH，COOM，NH2，OH或SH，M＝烷基，尤其是甲基或乙基，和●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于0或1的整數(shù)，b)得到具有與R6互補的反應(yīng)官能團R7的標(biāo)記或標(biāo)記前體，c)在至少一種偶聯(lián)劑存在時，使所述標(biāo)記或標(biāo)記前體的互補官能團與式(16a)的衍生物的官能團R6反應(yīng)以形成共價鍵，d)使肼或肼衍生物與酮或醛官能團反應(yīng)以形成腙，和e)用合適的方法將腙轉(zhuǎn)化成重氮甲基官能團。
如果官能團R6是COOH或COOM，互補官能團R7是NH2。
如果官能團R6是NH2，互補官能團R7是COOH。
如果官能團R6是OH，互補官能團R7選自烷基鹵，磺酸鹽，甲苯磺酸鹽。
如果官能團R6是SH，互補官能團R7選自烷基鹵，馬來酰亞胺。
所述合成方法的一個變體包括以下步驟a)得到式(16a)的衍生物 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R6，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●R6表示COOH，COOM，NH2，OH或SH，其中M＝烷基，尤其是甲基或乙基，和●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于0或1的整數(shù)，b)得到具有至少兩個相同或不同的反應(yīng)官能團R8的連接臂L，第一個官能團R8與R6互補，第二個官能團R8與R7互補，此外，得到具有反應(yīng)官能團R7的標(biāo)記或標(biāo)記前體，c)在至少一種偶聯(lián)劑存在時，使連接臂L的第一個反應(yīng)官能團R8與式(16a)的衍生物反應(yīng)以形成共價鍵，然后在至少一種偶聯(lián)劑存在時，使連接臂L的第二個反應(yīng)官能團R8與標(biāo)記或標(biāo)記前體反應(yīng)以形成共價鍵，d)使肼或肼衍生物與酮或醛官能團反應(yīng)以形成腙，和e)用合適的方法將腙轉(zhuǎn)化成重氮甲基官能團。
在這個特例中，所述方法包括一個額外步驟，該步驟中，連接臂L是在與標(biāo)記或標(biāo)記前體反應(yīng)之前加到化合物(16a)上的。此時，連接臂L至少帶有與R6互補的第一個反應(yīng)官能團R8，以與化合物(16a)的臂L偶合，和至少帶有第二個官能團R8，以使標(biāo)記或標(biāo)記前體與連接臂L偶合，根據(jù)偶合策略和化合物(16a)和標(biāo)記或標(biāo)記前體各自攜帶的反應(yīng)官能團R6和R7，臂L所帶的兩個官能團可以是相同或不同的。
如果官能團R6和/或官能團R7是COOH或COOM，則第一個和/或第二個互補官能團R8是NH2。
如果官能團R6和/或官能團R7是NH2，則第一個和/或第二個互補官能團R8是COOH。
如果官能團R6和/或官能團R7是OH，則第一個和/或第二個互補官能團R8獨立選自烷基鹵、磺酸鹽、甲苯磺酸鹽。
如果官能團R6和/或官能團R7是SH，則第一個和/或第二個互補官能團R8獨立選自烷基鹵、馬來酰亞胺。
如果R6是OH或SH，則所述偶聯(lián)劑是堿，如氫氧化鉀或碳酸鉀或有機堿。
如果R6是COOH或NH2，則偶聯(lián)劑選自，例如用于肽合成的偶聯(lián)劑?？蓞⒖糓.Bodansky的《肽化學(xué)-實用教科書》“Peptide Chemistry，a practicaltextbook”)，Springer Verlag出版，柏林，1988，第5章，55-73頁。
表述“肼衍生物”是指具有NH2-NH-官能團的分子。這種衍生物的例子有甲苯磺酰肼。
腙到重氮甲基的轉(zhuǎn)化是用常規(guī)方法進行的，尤其是用MnO2氧化。
其它可用的方法如X.Creary，《有機合成》(Organic Syntheses)，Wiley紐約，Coll.第7卷，438-443頁，1990；H.Zollinger，《重氮基化學(xué)II》(DiazoChemistry II)，VCH，Weinheim，34-47頁，1995；T.L.Holton和H.Shechter，J.Org.Chem.，60，4725-4729，1995所述。
就使用甲苯磺酰肼衍生物而論，該方法描述在X.Creary，《有機合成》(Organic Synthesis)；Wiley紐約，Coll.第7卷，438-443頁，1990。
在任何方法的一個特別實施例中，所述方法包括●保護化合物(16a)的酮或醛官能團的額外步驟(如果R1是H)，和●將所述酮或醛官能團去保護的額外的后續(xù)步驟。
例如，這種保護是用縮醛基團實現(xiàn)的。去保護是通過合適的方法進行的，如對縮醛基團可在酸性介質(zhì)中進行。精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)化合物確定在合成的那個階段進行保護和去保護步驟。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，描述了合成一種和幾種標(biāo)記試劑的方法，所述標(biāo)記試劑對溫度穩(wěn)定，且能夠用所述方法獲得，該方法包括以下步驟a)得到式(16)的衍生物
其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R6，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，和●R6表示COOH，NH2，OH或SH。
b)得到具有與R6互補的反應(yīng)官能團R7的標(biāo)記或標(biāo)記前體，c)在至少一種偶聯(lián)劑存在時，使所述標(biāo)記或標(biāo)記前體的互補官能團與式(16a)的衍生物的官能團R6反應(yīng)以形成共價鍵，d)使肼或它的一個衍生物與酮或醛官能團反應(yīng)以形成腙，和e)用合適的方法將腙轉(zhuǎn)化成重氮甲基官能團。
如果官能團R6是COOH，則互補官能團R7是NH2。
如果官能團R6是NH2，則互補官能團R7是COOH。
如果官能團R6是OH，則互補官能團R7選自烷基鹵、磺酸鹽、甲苯磺酸鹽。
如果官能團R6是SH，則互補官能團R7選自烷基鹵，馬來酰亞胺。
如果R6是OH或SH，則偶聯(lián)劑是堿，如氫氧化鉀或碳酸鉀。
如果R6是COOH或NH2，則偶聯(lián)劑選自，例如用于肽合成的偶聯(lián)劑。可參考M.Bodansky的《肽化學(xué)-實用教科書》，Springer Verlag出版，柏林，1988，第5章，55-73頁。
表述“肼衍生物”是指具有NH2-NH-官能團的分子。這種衍生物的例子有甲苯磺酰肼。
腙到重氮甲基的轉(zhuǎn)化是用常規(guī)方法進行的，尤其是用MnO2氧化。
其它可用的方法如X.Creary，《有機合成，Wiley紐約，Coll.第7卷，438-443頁，1990；H.Zollinger，《重氮基化學(xué)II》，VCH，Weinheim，34-47頁，1995；T.L.Holton和H.Shechter，J.Org.Chem.，60，4725-4729，1995所述。
就使用甲苯磺酰肼衍生物而論，該方法描述在X.Creary，《有機合成》Wiley紐約，Coll.第7卷，438-443頁，1990。
本發(fā)明優(yōu)選地方法包括以下步驟a)得到式(17)的衍生物
其中R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，b)得到具有羧酸官能團的標(biāo)記或標(biāo)記前體，c)在至少一種偶聯(lián)劑存在時，使所述標(biāo)記或標(biāo)記前體的羧基官能團與式(17)的衍生物的伯胺官能團反應(yīng)以形成酰胺鍵，d)使肼與式(17)的衍生物的酮或醛官能團反應(yīng)以形成腙，和e)在MnO2存在時將所述腙氧化成重氮甲基官能團。
在所有上述方法中，有利地是，烷基是直鏈或支鏈C1-C4基團，芳基是任選取代的苯基。
優(yōu)選地，R4是甲基或苯基，這就是說，式(17)的衍生物是在鄰、間或?qū)ξ槐话啡〈囊阴１交蚨郊淄?br> 根據(jù)所需的最終產(chǎn)物，衍生物(17)的胺官能團位于鄰、間或?qū)ξ?，?yōu)選在鄰位或間位。
如上所述，所述偶聯(lián)劑特別選自用于肽合成的偶聯(lián)劑，例如，當(dāng)堿如N-甲基嗎啉存在時為iBuOCOCl。
表述“標(biāo)記前體”是指至少有一個被任選保護的反應(yīng)官能團的化合物，所述反應(yīng)官能團不同于重氮甲基官能團且與所述隨后可被附上標(biāo)記的官能團相容，即在該方法的任一步驟后尤其是在MnO2的氧化步驟之前。特別地，所述標(biāo)記前體可包含連接臂L。下面給出了在信號放大中使用標(biāo)記前體的方法，但采用精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的各種保護基團其它變體是可能的。
就是信號放大而論，合成方法是類似的。所述標(biāo)記前體具有下式(18)所示的結(jié)構(gòu)。
其中，GP1和GP2表示兩個保護胺官能團的基團，它們是相同或不同的，且p是1-10之間的整數(shù)，優(yōu)選2-6，最好是4。有利地是，GP1和GP2是不同的以便能加入一些基元，解釋如下。
可用于本發(fā)明的保護基團GP1或GP2的例子表示在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，《有機合成中的保護基團》(Protective Groups in Organic Synthesis)，第二版，John Wiley和Sons，紐約，1991，優(yōu)選通常用于肽合成的那些，如Boc(叔-丁氧基羰基)，F(xiàn)moc(9-芴基亞甲氧基羰基)，Cbz(羧芐基)或Alloc(烯丙氧基羰基)。
特別地，GP1和GP2分別是保護基團Boc和Fmoc。
這種是有羧基官能團的前體和式(17)的衍生物之間的反應(yīng)是在偶聯(lián)劑存在下進行的以形成酰胺鍵。在常規(guī)條件下將這兩個保護基團之一去保護后，例如用堿如哌啶將Fmoc去保護，釋放的胺官能團被用來偶合另一個式(18)的分子。如必要該過程被重復(fù)多次以得到多個被保護基團(如Boc官能團)保護的NH2官能團。加入的基元在1和100之間，優(yōu)選在1-20之間。
使肼與苯基酮衍生物的酮官能團反應(yīng)以形成腙，然后在MnO2存在時將其氧化以形成重氮甲基殘基。然后，將帶有Boc基團的胺官能團去保護后，將示蹤劑，如用N-羥基琥珀酰亞胺基活化的生物素，與胺官能團偶合以得到具有如式(5)所示單元R2-(L)n-的試劑。
本發(fā)明的另一個目的是描述標(biāo)記生物分子，尤其是核酸的方法，以及用該方法獲得的產(chǎn)物，所述方法包括使生物分子和本發(fā)明的標(biāo)記試劑在基本上為含水均勻溶液的溶液中接觸。
表述“基本上為含水溶液”是指至少含50％水的溶液。該溶液優(yōu)選含有像緩沖溶液那樣的鹽。
表述“均勻溶液”是指單相溶液，如水/DMSO溶液，而不是兩相溶液，如水/氯仿溶液。
標(biāo)記反應(yīng)的特定條件根據(jù)生物分子和標(biāo)記而不同。就核酸而言，則pH在5-8之間可有效進行標(biāo)記。特別地，pH在5.5-7.0之間對本發(fā)明的所有試劑都是優(yōu)選地。用式(11)的試劑，則標(biāo)記的pH范圍就較寬。對該試劑，pH在3-8之間就足以得到良好的標(biāo)記。
特別地，標(biāo)記和片段化單鏈或雙鏈核酸的方法包括以任何次序的以下步驟-將所述核酸片段化，-通過選自式(19)的化合物將一個標(biāo)記附到至少一個片段上 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，和●Z包括一個可檢測標(biāo)記，所述試劑主要和所述片段的至少一個磷酸共價偶合。
選擇根Z和/或R1以穩(wěn)定重氮甲基官能團，這就是說Z或R1這兩個基團中至少有一個具有苯基核。
標(biāo)記試劑和核酸之間的鍵是共價的，但前面已描述過，尤其在疊加系統(tǒng)或者在標(biāo)記是間接可檢測的情況下可使用非共價相互作用。因此，術(shù)語“附著”包括這些不同的可能性。
優(yōu)選地，所述標(biāo)記試劑選自式(20)的化合物 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，和●Z選自 或 或 或 其中■R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，和■-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
在按照式(19)的特定實施方案中，Z具有以下結(jié)構(gòu) 此時，如果R1是H，標(biāo)記試劑是1-芘基重氮甲烷(PDAM)。
盡管這種標(biāo)記是熒光的，其激發(fā)波長與核酸的激發(fā)波長很接近。用直接抗芘基元的單克隆抗體進行間接檢測是優(yōu)選地。產(chǎn)生這種抗體的方法是精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的(參見，如專利申請WO-A-00/07982)。
本發(fā)明的其它新型試劑由式(1)-(27)描述，能夠用本發(fā)明的合成方法獲得的試劑也是優(yōu)選地用于上述片段化和標(biāo)記方法的試劑。
所述標(biāo)記和片段化方法特別適用于被標(biāo)記的核酸要與許多核酸，尤其是寡核苷酸雜交的情況，所述核酸附著在固相支持物的預(yù)定位置上以形成DNA芯片。表述“DNA芯片”是指小的固相支持物，其上在預(yù)定的位置上附有許多捕獲探針。實際上，附到固相支持物上的核酸的密度在雜交時可造成高的空間約束，且所述片段化可改進這種雜交步驟。這些DNA芯片的例子表示在以下出版物中，例如，G.Ramsay，Nature Biotechnology，16，40-44頁，1998；F.Ginot，Human Mutation，10，1-10頁1997；J.Cheng等，Molecular diagnosis，1(3)，183-200頁，1996；T.Livache等，Nucleic Acid Research，22(15)，2915-2921頁，1994；J.Cheng等，Nature Biotechnology，16，541-546頁，1998。
所述片段化和標(biāo)記是在一個步驟或在兩個步驟中進行的，且標(biāo)記可在片段化之前、之后或與其同時進行。
優(yōu)選地，標(biāo)記和片段化是同時進行的，即這兩個步驟必需的試劑和，例如核酸，被同時放在基本上含水的均勻溶液中。尤其是在化學(xué)或酶片段化的情況下。在用物理方法進行機械片段化時，標(biāo)記和片段化可同時進行，意指物理方法被同時用于至少含有核酸和標(biāo)記試劑的基本上含水的均勻溶液。
核酸的片段化是用酶、化學(xué)或物理途徑進行的。
例如，通過酶途徑片段化核酸是通過核酸酶進行的。
例如，通過物理途徑片段化核酸是通過超聲處理解法或放射法進行的。
如果核酸是RNA，通過化學(xué)途徑片段化是通過常規(guī)的方法進行的(參見，如Oivanen M.等，Chem.Rev.，98，961-990，1998)。
G.Pratviel等在Adv.Org.Chem.，45，251-312頁，1998或G.Pratviel等在Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，34，746-769頁，1995綜述中描述了金屬絡(luò)合物可用于DNA或RNA的片段化。
在第一個實施方案中，RNA的化學(xué)片段化是用組合的金屬陽離子或用化學(xué)催化劑進行的。此時，金屬陽離子是Mg2+，Sr2+，Ba2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+，Ni2+，Ru3+，Ce3+，Eu3+，Tb3+，Tm3+，Yb3+或Lu3+離子，化學(xué)催化劑包括咪唑，或取代的類似物，如N-甲基咪唑，或任何與RNA親合的化學(xué)分子且?guī)в羞溥蚝嘶蛉〈念愃莆?。采用金屬的片段化條件描述在專利申請WO-A-99/65926中。有利地是，金屬是Mg2+，Mn2+，Zn2+，Tb3+或Ce3+，優(yōu)選Mg2+，Mn2+，Zn2+。
用濃度在2-100mM之間的金屬陽離子如Mn++，濃度在2-100mM之間的咪唑可得到有效的片段化條件。
用濃度在3-15mM之間的金屬陽離子如Mn++和濃度在20-50mM之間，尤其是30mM的咪唑可得到特別有效的片段化條件。
反應(yīng)pH應(yīng)在5和8之間。有利地是，pH在5.5和6.5之間，優(yōu)選pH為6。因此，pH為6對用RNA進行標(biāo)記和片段化非常有利(參見上面對標(biāo)記的討論)。
在第二個實施方案中， RNA的化學(xué)片段化是通過聚胺如精胺、腐胺或尸胺的作用進行的。濃度為5-100mM可進行片段化。后者完全來自10mM聚胺。
在第三個實施方案中，RNA的化學(xué)片段化是通過人工核酸酶的作用進行的(參見G.Pratviel等，Adv.Inorg.Chem.，45，251-312頁，1998；D.S.Sigman等Chem.Rev.，93，2295-2316頁，1993)，如和金屬陽離子如鐵、銅或鋅結(jié)合的1，10-菲咯啉。這些陽離子分別獲自FeSO4或CuCl2或ZnCl2溶液。濃度在2-50mM之間，尤其是4-10mM之間的1，10-菲咯啉被用于RNA的片段化。
通過化學(xué)途徑片段化DNA是通過使核酸與產(chǎn)生脫堿基位點的化學(xué)方法接觸的。脫堿基位點的形成來自連接2-脫氧核糖和核堿基的N-糖苷鍵的切割。它包括對嘌呤(鳥嘌呤，腺嘌呤)損失的或?qū)︵奏?胞嘧啶，胸腺嘧啶)的脫嘧啶作用。
這種脫嘌呤作用是在生理條件(pH7.4，37℃)下自發(fā)產(chǎn)生的，但反應(yīng)速度非常低，為每秒3×10-11脫嘌呤作用，即不足以進行片段化。為增加反應(yīng)速度，使用了烷基化劑，它使N-糖苷鍵脆弱，或使用酶如DNA糖基化酶，尤其是尿嘧啶DNA糖基化酶。
通過脫嘌呤或脫嘧啶作用獲得的脫堿基位點很不穩(wěn)定。室溫下，在堿性介質(zhì)中獲得了在這一位點水平上的片段化。在酸性介質(zhì)中，高溫也可加速這種片段化。用能夠引發(fā)β-消除現(xiàn)象的分子也能加速片段化。
片段化的優(yōu)選實施例是用酸性pH獲得的，即pH小于5。優(yōu)選地pH是3。
pH3的甲酸鈉緩沖液可有效片段化本發(fā)明的片段。這種緩沖液適合于一步標(biāo)記條件，這將在實施例中證實。更加有利的是，可用酸性介質(zhì)(HCl，碳酸鹽，H2SO4)。
在本發(fā)明特別地實施方案中，出于進一步提高片段化的目的，所述脫氧核糖核酸含有至少一個經(jīng)修飾的更易于產(chǎn)生脫堿基位點的堿基。
可使用各種經(jīng)修飾的堿基、如N7-烷基嘌呤、N3-烷基嘌呤、O6-烷基嘌呤、8-溴代嘌呤、8-硫代嘌呤、8-烷基硫代嘌呤、8-疊氮嘌呤或8-烷基磺酰嘌呤。
當(dāng)要標(biāo)記的核酸是通過酶擴增技術(shù)如PCR產(chǎn)生時，使用8-溴代嘌呤可在擴增時進行有效的摻入，相對而言，這可簡化本發(fā)明的片段化和標(biāo)記的方法，同時保持酶擴增步驟極好的敏感性。
本發(fā)明描述了標(biāo)記的生物分子，尤其是能夠用本發(fā)明任一方法獲得的標(biāo)記的核酸。
本發(fā)明還涉及用來檢測生物分子，尤其是含有本發(fā)明標(biāo)記試劑的靶核酸的試劑盒。根據(jù)試劑盒的應(yīng)用，可在試劑盒中加入其它成分，如溶胞方法(微生物和/或細(xì)胞)和/或濃縮方法(如二氧化硅或磁性顆粒)和/或酶催化擴增方法。
本發(fā)明涉及如上定義的標(biāo)記的生物分子，尤其是標(biāo)記的核酸的應(yīng)用，它被作為探針以檢測靶生物分子，尤其是靶核酸。
本發(fā)明還涉及上述核酸的應(yīng)用，它被作為可與捕獲探針結(jié)合的標(biāo)記的靶。
為檢測和/或量化和/或純化靶生物分子，所述標(biāo)記的生物分子能夠與靶生物分子形成復(fù)合物。例如，為檢測核酸類型的靶分子，標(biāo)記的核酸應(yīng)與靶充分互補，以根據(jù)反應(yīng)條件，尤其是溫度或反應(yīng)介質(zhì)的鹽度，進行特異地雜交。
出于研究和在制藥工業(yè)中篩選藥物、診斷傳染性疾病或遺傳疾病或食品或工業(yè)控制的目的，所述檢測方法被用于測序、信使RNA表達序型分析或突變的篩選。
診斷領(lǐng)域，尤其是傳染性疾病(例如AIDS或肺結(jié)核)的趨勢是降低靈敏度水平以檢測樣品中的單個分子，血液或尿液或腦脊液類型的液體樣品可以有幾個毫升。只有當(dāng)所有步驟，從取樣到得出結(jié)果都是最優(yōu)化的，才可得到此靈敏度水平。本發(fā)明的各種方法可以沒有困難地實現(xiàn)這種最優(yōu)化，因為本發(fā)明的試劑、方法和過程可廣泛用于各種生物分子。特別地，當(dāng)需要采用酶擴增步驟以得到必需的靈敏度時(病毒或細(xì)菌感染，如HIV，HCV或肺結(jié)核)，本發(fā)明所述的標(biāo)記和/或片段化方法不會影響擴增技術(shù)的靈敏度，因為它不必替代酶擴增技術(shù)中所用的脫氧核糖核苷酸，或者因為摻入的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸不會改變靈敏度。
本發(fā)明所述的化學(xué)移植方法的特征在于其反應(yīng)性和特異性，描述如下●在第一個實施方案中，所述化學(xué)移植方法被用于核酸共價附著于固相支持物上。
●在該方法的第一個變化中，重氮甲基官能團的前體，如上述酮或肼，在化學(xué)合成時被引入，且重氮甲基官能團在第二步中被引入核酸上。
●在該方法第二個優(yōu)選地變化中，重氮甲基官能團被引入所述固相支持物，且核酸通過核酸的磷酸，尤其是末端(5’或3’)磷酸，附到固相支持物上。
在核酸的3’或5’端引入磷酸是熟知的(參見《寡核苷酸和類似物的方案、合成和特性》(“Protocols for Oligonucleotides and Analogs，Synthesis andProperties”)由S.Agrawal出版，Humana Press，Totowa，New Jersey)。
在這種固相支持物的一個特實施例中，帶有配體，尤其是半抗原如生物素或樅烯的標(biāo)記試劑被附到固相支持物上，該固相支持物上已經(jīng)共價附著或吸附了抗配體，如鏈霉抗生物素蛋白或如抗體。這些固相支持物是精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，且可在商業(yè)上獲得(例如微量滴定平板-鏈霉抗生物素蛋白或乳膠-鏈霉抗生物素蛋白)。此時，標(biāo)記的作用不再是進行檢測，而且要使標(biāo)記試劑附到固相支持物上。然后重氮甲基官能團就可與核酸反應(yīng)。這種試劑的例子是式(11)、(12)、(13)的衍生物或PDAM衍生物，它們可被用來制造這種固相支持物?？捎脝慰寺】贵w技術(shù)來制備抗大量標(biāo)記如熒光素或Cy5的衍生物的抗體。利用制備固相支持物的間接模式，不必太困難，精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員就可使用帶有本發(fā)明標(biāo)記試劑的固相支持物，其中配體/抗配體反應(yīng)被用來使重氮甲基官能團附到固相支持物上。
固相支持物的第二個實施方案涉及特殊的支持物如乳膠?？捎貌煌木酆戏磻?yīng)模式從帶有重氮甲基官能團或優(yōu)選一個官能團的可聚合官能團單體制備帶有重氮甲基官能團的顆粒，優(yōu)選一個官能團是在重氮甲基官能團的前體，如醛或酮，尤其是●在間歇反應(yīng)器中進行的聚合反應(yīng)在與其它成分反應(yīng)開始之前將單體引入此反應(yīng)器，隨后不必再加入。由于單體反應(yīng)性差異，該方法通常會導(dǎo)致成分漂變。產(chǎn)生成分與轉(zhuǎn)化率函數(shù)大不相同的大分子可證明這一點。該方法對于在表面引入不是非常有效，因為大部分功能性單體都有在顆粒內(nèi)部或以水溶性聚合物形式流失的危險。當(dāng)用具有極性性質(zhì)的單體分批進行共聚反應(yīng)時，可得到較大量的小顆粒，但轉(zhuǎn)化率有限。這種行為與高水溶性單體有關(guān)，并且是由于均相成核機制占優(yōu)勢造成的。
●半連續(xù)聚合至少部分單體是在反應(yīng)開始和結(jié)束之間被引入反應(yīng)器的。此添加可以固定速度或根據(jù)給定分布進行。目的是控制單體混合物的加入以得到有受控組成(控制界面的組成)的共聚物；因此常有添加條件，這樣聚合反應(yīng)的速度高于添加的速度。
●噴射加成聚合(Shot addition polymerization)一旦聚合反應(yīng)在進行中，或在堿性單體存在時，只有功能性單體以受模的方式引入受控的系統(tǒng)。因此，操作的成功取決于共聚動力學(xué)的現(xiàn)有知識。這是促進表面摻入的有效方法。實驗條件(添加時的轉(zhuǎn)化程度，組成以及單體混合物的濃度)的選擇能夠使表面產(chǎn)率最優(yōu)化。
●接種聚合(Seed polymerization)它包括在含有乳膠的已經(jīng)構(gòu)成并完全定性的系統(tǒng)中加入功能性單體。所述功能性單體可單獨加入或與作為種子的堿性單體的混合物加入，加入可一步或半連續(xù)進行。
接種聚合、噴射加成聚合和半連續(xù)聚合技術(shù)是優(yōu)選地，因為它們在表面最大限度地引入了帶有重氮甲基官能團前體的衍生物。帶有醛官能團的顆粒的例子如B.Charleux等，Die Makromolecular Chem.，193，187頁和205頁，1992或在專利EP-B-0,350,407中所述。
本發(fā)明的另一個目的是描述式(30)的對溫度穩(wěn)定的結(jié)合中間體 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R15表示親核或親電子的反應(yīng)官能團，尤其是COOH，NH2，SH，OH，O-NH2，烷基酮，醛，異氰酸鹽，異硫氰酸鹽，馬來酰亞胺，烷基鹵，活化的酯，甲苯磺酸鹽，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R15-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于1，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
本發(fā)明優(yōu)選地結(jié)合中間體如式(30a)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R15表示親核或親電子的反應(yīng)官能團，尤其是COOH，NH2，SH，OH，O-NH2，烷基酮，醛，異氰酸鹽，異硫氰酸鹽，馬來酰亞胺，烷基鹵，N-羥基琥珀酰亞胺酯，甲苯磺酸鹽，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，
●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于1，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
固相支持物的第三個實施方案包括得到帶有第一親核或親電子反應(yīng)官能團的固相支持物，如NH2，SH，OH，O-NH2，烷基酮，醛，異氰酸鹽，異硫氰酸鹽，馬來酰亞胺，烷基鹵，N-羥基琥珀酰亞胺酯，甲苯磺酸鹽，然后與上述式(30)或(30a)的結(jié)合中間體反應(yīng)，其官能團R15與固相支持物的第一反應(yīng)官能團互補。固相支持物和結(jié)合中間體之間的反應(yīng)任選發(fā)生在偶聯(lián)劑存在時以形成共價鍵。
根據(jù)上述不同的實施方案，這種固相支持物至少含有重氮甲基官能團，尤其是間接附有本發(fā)明標(biāo)記試劑的固相支持物，這也是本發(fā)明的一個主題，以及含有核酸的固相支持物，所述核酸通過重氮甲基官能團附到固相支持物上。
這種固相支持物的第一個應(yīng)用是制造DNA芯片。已有固相支持物上不連續(xù)位置和預(yù)定位置分布核酸的方法。
專利US-A-6,110,426提出了用毛細(xì)管生產(chǎn)這些DNA芯片的方法，所述毛細(xì)管與固體表面接觸以輸送受控體積的液體。在毛細(xì)管末端和固相支持物之間發(fā)生有效接觸，這樣滴液就可由毛細(xì)管存放。同樣，專利US-A-6,083,763描述了一套在裝置中滑行的毛細(xì)管以補償其高度的差異。它們與由特定寡核苷酸的毛細(xì)管放置的平整表面接觸。
專利US-A-6,083,762涉及分布滴液的系統(tǒng)，所述滴液含有與壓電換能器偶聯(lián)的微分配器，以將體積小于1納升的滴液射到固體表面。對毛細(xì)管臂施加熱源以形成噴射出預(yù)定體積溶液的泡也可得到類似的結(jié)果(見T.Okamoto等，NatureBiotechnology，18，438-441頁，2000)。
重氮甲基官能團可將核酸共價移植到支持物上。尤其與吸附相比，移植是簡單的，連接是穩(wěn)定的，且與末端磷酸有關(guān)的反應(yīng)的選擇性使得能夠?qū)⒑怂岫ㄏ蚺己系焦滔嘀С治锷?，這樣就減小了位阻以利于隨后的雜交步驟。
本發(fā)明固相支持物的第二個應(yīng)用是核酸純化。
就純化而論，純化是直接(帶有重氮甲基官能團的固相支持物與待純化的核酸反應(yīng))或間接的(將捕獲的核酸附到固相支持物上。)。這些捕獲的核酸與將被捕獲以便以所需的特異性程度與其雜交的靶充分互補，且“捕獲的核酸/固相支持物”復(fù)合物使靶核酸純化。
固相支持物優(yōu)選為分散形式以作為乳膠顆粒用于純化，如磁性顆粒。
表述“純化步驟”是指將微生物的核酸和在溶胞階段釋放的細(xì)胞組分分離，所述溶胞發(fā)生在核酸純化之前。這些溶胞階段是熟知的。例如，作為指導(dǎo)可用專利申請中描述的溶胞方法-WO-A-00/60049，關(guān)于超聲溶胞，-WO-A-00/05338，關(guān)于磁性溶胞和機械溶胞相結(jié)合，-WO-A-99/53304，關(guān)于電溶胞，以及-WO-A-99/15621，關(guān)于機械溶胞。
精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠用其它熟知的溶胞方法，如熱休克或滲透休克(osmotic shock)或用離液劑如胍鹽處理(專利US-A-5,234,809)。
這個步驟通常可濃縮核酸。例如，可用使用磁性顆粒(見關(guān)于此主題的專利US-A-4,672,040和US-A-5,750,338)，并通過洗滌步驟純化核酸，所述核酸已經(jīng)附到這些磁性顆粒上。如果還需要隨后擴增所述核酸，這種純化核酸的步驟特別有利。關(guān)于這些磁性顆粒的一個特別有利的實施方案描述在專利申請WO-A-97/45202和WO-A-99/35500中。
這里使用的術(shù)語“固相支持物”包括所有可附著核酸的物質(zhì)?？蓪⒑铣刹牧匣蛱烊徊牧先芜x地化學(xué)修飾，作為固相支持物，尤其是以多糖如纖維素為基質(zhì)的材料，如紙、纖維素衍生物如醋酸纖維素和硝基纖維素或葡聚糖；聚合物，共聚物，尤其是基于苯乙烯型單體的，天然纖維如棉花，以及合成纖維如尼龍；無機物質(zhì)，如二氧化硅、石英、玻璃、陶瓷；乳膠；磁性顆粒；金屬衍生物，凝膠等。固相支持體的形式可以是微量滴定平板、膜、顆粒或用玻璃或硅或衍生物制成的基本上呈平面的板。
本發(fā)明最后涉及捕獲核酸的方法，所述方法包括以下步驟●得到其上直接或間接附有至少一種含有重氮甲基官能團的分子的固相支持物，●將可能含有游離核酸的生物樣品與其接觸，和●洗滌分子共價附著到至少一種核酸上的固相支持物。
在申請人于2001年5月4日提交的注冊號為FR01/06039號的另一項專利申請以及與本發(fā)明同日提交的其國際延期申請中可找到其它信息。
附圖簡述附圖和實施例代表了特定的實施方案，而不是要限制本發(fā)明的范圍。


圖1表示本發(fā)明所用各種試劑的結(jié)構(gòu)式及其縮寫(o-表示鄰位，m-表示間位，p-表示對位)。
圖2A-2I表示通過毛細(xì)管電泳分析得到的作為各種試劑的共價偶合與時間函數(shù)的分布圖，所述試劑在尿苷3’-單磷酸(3’-UMP)上帶有重氮甲基官能團，如實施例6.1所述●圖2A，PDAM，●圖2B，2毫摩每升(mM)DPDAM，●圖2C，20mM DPDAM，●圖2D，PMDAM，●圖2E，NPDAM，●圖2F，BioDPDAM，●圖2G，間-BioPMDAM，●圖2H，對-BioPMDAM，●圖2I，鄰-BioPMDAM。
圖3A-3D表示通過毛細(xì)管電泳分析得到的作為時間的函數(shù)的間-BioPMDAM與四種(4)核苷酸3’-磷酸反應(yīng)的分布圖，如實施例6.2所述●圖3A，核糖核苷酸序列中的3’-CMP，●圖3B，核糖核苷酸序列中的3’-AMP，●圖3C，核糖核苷酸序列中的3’-GMP，和●圖3D，脫氧核糖核苷酸序列中的3’-TMP。
圖4表示通過毛細(xì)管電泳分析得到的作為時間函數(shù)的間-BioPMDAM與二核苷酸5’-ApUp反應(yīng)的分布圖，如實施例6.3所述。
圖5A-5D表示間-BioPMDAM試劑和四種(4)核糖核苷酸3’-單磷酸間各種結(jié)合物的D2O的質(zhì)子NMR譜，如實施例6.4所述●圖5A，3’-GMP，●圖5B，3’-AMP，●圖5C，3’-CMP，和●圖5D，3’-UMP。
圖6表示合成標(biāo)記試劑的流程，所述標(biāo)記試劑帶有兩種(2)生物素，用于信號的化學(xué)放大。
圖7表示酸介質(zhì)中通過形成脫堿基位點的片段化機制。
圖8顯示，根據(jù)實施例16.1，酸性pH時各種修飾的核苷，核苷(8-溴-2’-脫氧腺苷(8-BrdA)和5-溴-2’-脫氧胞苷(5-BrdC)以及四種(4)天然核苷(dA，dC，dG和dT)的降解動力學(xué)。結(jié)果是以相對于以分鐘表示的反應(yīng)時間(x-軸)，起始核苷的百分水解(y-軸)形式表示的。
圖9表示，根據(jù)實施例19.2，在60℃，作為時間函數(shù)的PDAM試劑對合成的寡脫氧核苷酸(ODN)5’-磷酸的標(biāo)記動力學(xué)。結(jié)果是以相對于以分鐘(min)表示的反應(yīng)時間(x-軸)的百分標(biāo)記形式表示的。。
圖10表示，根據(jù)實施例19.3，作為反應(yīng)溫度函數(shù)的百分標(biāo)記。結(jié)果如圖10所示，y-軸表示百分標(biāo)記，x-軸表示以℃的反應(yīng)溫度。
圖11表示用商業(yè)試劑5-硝基香草醛合成式(4’)的試劑的途徑。通過形成腙然后腙與MnO2氧化使醛官能團能得到重氮甲基官能團。
優(yōu)選實施方案的描述實施例1用生物素合成試劑一般合成流程 實施例1.1間-BioPMDAM的合成●化合物生物素間-乙酰苯1a將D-生物素(1.0克(g)，4.1毫摩爾(mmol)溶于45毫升(ml)熱的無水DMF。將混合物在氬氣下冷卻至0℃，然后連續(xù)加入N-甲基嗎啉(590微升(μl)，5.33mmol)和異丁基氯甲酸酯(840μl，6.60mmol)。將混合物攪拌30分鐘(min)，然后加入溶于10ml DMF的3-氨基乙酰苯(824mg，6.10mmol)和N-甲基嗎啉(480μl，4.35mmol)。將溶液在0℃攪拌2小時(h)，然后蒸發(fā)至干。x將殘余物溶于3ml MeOH，然后加入50ml水。過濾所得沉淀，用水、CH2Cl2和醚洗滌以得到1.2g(80％)粗產(chǎn)品1a。從MeOH-H2O對中重結(jié)晶得到白色粉末狀的1a(1.01g，70％)。
熔點145℃。-IR(KBr)3280，2931，2857，1691，1590，1540，1487，1434，1298，1266cm-1.-1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝1.3-1.7(m，6H)；2.33(t，J＝8Hz，2H)；2.55(s，3H)；2.58；(d，J＝12Hz，1H)；2.83(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.13(m，1H)；4.15(m，1H)；4.31(m，1H)；6.34(s，1H)；6.41(s，1H)；7.44(t，J＝8Hz，1H)；7.64(d，J＝8Hz，1H)；7.85(d，J＝8Hz，1H)；8.17(s，1H)；10.05(s，1H).-MS(FAB/甘油)，m/z362[M+H]+。
●化合物間-腙2a將1a溶液(500mg，1.38mmol)和溶于無水乙醇(8ml)的肼一水合物溶液(200μl，4.15mmol)加熱回流2h。冷卻至室溫后，濾出白色沉淀，用水洗滌，然后用醚洗滌并干燥。由此得到385mg(74％)白色粉末狀的產(chǎn)物2a。
熔點185℃。-IR(KBr)3298，2931，2857，1698，1665，1626，1541，1494，1470，1446，1330，1265cm-1.-1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝1.3-1.7(m，6H)；1.98(s，3H)；2.26(t，J＝8Hz，2H)；2.56(d，J＝12Hz，1H)；2.81(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.11(m，1H)；4.13(m，1H)；4.29(m，1H)；6.39(s，3H)；6.42(s，1H)；7.22(m，2H)；7.50(d，J＝8Hz，1H)；7.84(s，1H)；9.82(s，1H).-MS(FAB/甘油)，m/z376[M+H]+。
●化合物間-重氮甲烷3a將2a(180mg，0.48mmol)溶于2ml DMF。然后加入MnO2(340mg，3.9mmol)。在室溫攪拌30分鐘后，將此混合物通過燒結(jié)的漏斗過濾，漏斗中裝有硅藻土(厚度0.5cm)和3粉狀分子篩(0.5cm)。將反應(yīng)混合物濃縮至體積約為0.5ml，然后加入5ml醚。過濾所得沉淀，用水洗滌然后干燥。得到粉紅色粉末狀的化合物3a(170mg，95％)。
熔點160℃。-IR(KBr)3278，2935，2859，2038，1704，1666，1605，1577，1536，1458，1430，1263cm-1.-1H NMR(300MHz)δ＝1.3-1.7(m，6H)；2.11(s，3H)；2.28(t，J＝8Hz，2H)；2.57(d，J＝12Hz，1H)；2.81(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.11(m，1H)；4.13(m，1H)；4.29(m，1H)；6.33(s，1H)；6.41(s，1H)；6.60(m，1H)；7.25(m，3H)；9.84(s，1H)。
實施例1.2對-BioPMDAM的合成●化合物生物素對-乙酰苯1b
將D-生物素(1.0g，4.1mmol)溶于45ml熱的無水DMF。將混合物在氬氣下冷卻至0℃，然后連續(xù)加入N-甲基嗎啉(590μl，5.33mmol)和異丁基氯甲酸酯(840μl，6.60mmol)。將混合物攪拌30min，然后加入4-氨基乙酰苯(824mg，6.10mmol)。將溶液在0℃攪拌2h，然后蒸發(fā)至干。將殘余物溶于50ml水。過濾所得沉淀，用水洗滌，然后用50ml熱MeOH洗滌。在加熱的同時將白色沉淀溶于DMF，然后過濾所得溶液并用MeOH洗滌?；厥諡V液并蒸發(fā)至干得到888mg1b(2.46mmol，60％)。
熔點260℃。-IR(KBr)3260，2930，2358，1706，1673，1610，1526，1401，1380，1322，1257，1150cm-1.-1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝8.82(s，1H，NH-CO)；7.57(d，2H，J＝9Hz，Ar-H)；6.83(d，2H，J＝9Hz，Ar-H)；6.40(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.32(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.28(m，1H，CH2-CH-NH)；4.12(m，1H，CH-CH-NH)；3.11(m，1H，CH-S)；2.80和2.55(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.35(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；2.10(s，3H，CH3)；1.60-1.34(m，6H，(CH2)3)。
●化合物對-腙2b將化合物1b(870mg，2.4 mmol)溶于熱的乙醇(99％，8ml)，然后加入肼一水合物(995μl，19.5mmol)。將此溶液加熱回流3h。過濾所得白色沉淀并用冰水洗滌。由此得到820mg(90％)白色粉末狀的產(chǎn)物2b。
熔點305℃。-IR(KBr)3281，3183，2930，2857，1698，1658，1593，1521，1459，1401，1325，1263，1187cm-1.-1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝9.68(s，1H，NH-CO)；7.52(s，4H，J＝9Hz，Ar-H)；6.43(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.21(s，2H，NH2)；4.29(m，1H，CH2-CH-NH)；4.12(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.81和2.56(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.32(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.97(s，3H，CH3)；1.63-1.36(m，6H，(CH2)3)。
●化合物對-重氮甲烷3b將2b(200mg，0.53mmol)溶于10ml DMF。然后加入800mg MnO2。攪拌10分鐘后將混合物通過硅藻土(0.5cm)-分子篩(0.5cm，粉末狀)混合層過濾。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，然后用醚洗滌并干燥。得到粉色粉末狀的化合物3b(190mg，96％)。
熔點180℃(dec.).-IR(KBr)3257，2930，2857，2032，1698，1597，1524，1510，1455，1404，1307，1259，1180cm-1.-1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.18(s，1H，NH-CO)；7.88(d，2H，J＝6Hz，Ar-H)；7.7(d，2H，J＝6Hz，Ar-H)；6.41(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.34(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.28(m，1H，CH2-CH-NH)；4.12(m，1H，CH-CH-NH)；3.11(m，1H，CH-S)；2.80和2.55(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.35(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；2.10(s，3H，CH3)；1.60-1.34(m，6H，(CH2)3)。
實施例1.3鄰-BioPMDAM的合成●化合物生物素鄰-乙酰苯1c將D-生物素(1.0g，4.1mmol)溶于45ml熱的無水DMF。將混合物在氬氣下冷卻至0℃，然后連續(xù)加入N-甲基嗎啉(590μl，5.33mmol)和異丁基氯甲酸酯(840μl，6.60mmol)。將混合物攪拌30min，然后加入2-氨基乙酰苯(824mg，6.10mmol)。將溶液在室溫攪拌3小時30分鐘，然后蒸發(fā)至于。將殘余物溶于50ml水。過濾所得沉淀，用水洗滌，然后用50ml熱MeOH洗滌。過濾所得沉淀并用水洗滌。將產(chǎn)物溶于熱的MeOH并加水再沉淀以進行重結(jié)晶。將沉淀物過濾，用水洗滌，然后用醚洗滌以得到1.1g(2.95 mmol，72％)粗產(chǎn)品1c。
熔點150℃。-IR(KBr)3248，2930，2857，2359，1691，1669，1651，1582，1528，1448，1354，1310，1245，1161cm-1.-1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝11.24(s，1H，NH-CO)；8.33(d，1H，J＝8.5Hz，Ar-H)；7.97(d，2H，J＝8Hz，Ar-H)；7.57(t，1H，J＝7Hz，Ar-H)；7.18(t，1H，J＝7Hz，Ar-H)；6.44(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.30(m，1H，CH2-CH-NH)；4.14(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.80和2.55(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.61(s，3H，CH3)；2.37(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.62-1.38(m，6H，(CH2)3)。
●化合物鄰-腙2c將化合物1c(500mg，1.38mmol)溶于熱的乙醇(99％，8ml)，然后加入肼一水合物(572μl，11.1mmol)。將溶液加熱回流50分鐘。將溶液蒸發(fā)至干。過濾所得白色沉淀，用水洗滌然后用醚干燥。由此得到416mg(11.1mmol，80％)白色粉末狀的產(chǎn)物2c。
熔點161℃。-IR(KBr)3412，3240，2930，2857，2351，1706，1677，1604，1590，1531，1463，1444，1372，1303，1270，1169cm-1.-1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝11.97(s，1H，NH-CO)；8.35(d，1H，J＝8Hz，Ar-H)；7.45(d，1H，J＝7Hz，Ar-H)；7.19(t，1H，J＝7.5Hz，Ar-H)；7.04(t，1H，J＝7Hz，Ar-H)；6.61(s，2H，NH2)；6.42(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.32(m，1H，CH2-CH-NH)；4.14(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.81和2.56(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12 Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.31(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；2.09(s，3H，CH3)；1.63-1.36(m，6H，(CH2)3)。
●化合物鄰-重氮甲烷3c將2c(200mg，0.53mmol)溶于10ml DMF。然后加入800mg MnO2。攪拌15分鐘后將混合物通過硅藻土(0.5cm)-分子篩(0.5cm，粉末狀)混合層過濾。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，然后用醚洗滌并干燥。得到粉紅色粉末狀的化合物3c(130mg，65％)。
熔點110℃。-IR(KBr)3248，2930，2857，2367，2342，2038，1699，1521，1456cm-1.-1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ＝9.37(s，1H，NH-CO)；7.26-7.00(m，4H，Ar-H)；6.43(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.30(m，1H，CH2-CH-NH)；4.15(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.82和2.54(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.24(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；2.12(s，3H，CH3)；1.63-1.37(m，6H，(CH2)3)。
實施例1.4間-BioDPDAM的合成●化合物間-偶合物1d將D-生物素(500mg，2.05mmol)溶于23ml熱的無水DMF。將混合物在氬氣下冷卻至0℃，然后連續(xù)加入N-甲基嗎啉(295μl，2.67mmol)和異丁基氯甲酸酯(420μl，3.28mmol)。將混合物攪拌30min，然后加入溶于7ml DMF的3-氨基二苯甲酮(605mg，3.07mmol)和N-甲基嗎啉(240μl，2.17mmol)。將溶液在0℃攪拌2h，然后蒸發(fā)至干。將殘余物溶于1mlMeOH，然后加入25ml水。過濾所得沉淀，用水洗滌，然后用醚洗滌，得到810mg(93％)粗產(chǎn)品1d。從MeOH-H2O對重結(jié)晶得到白色粉末狀的1d(630mg，72％)。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.10(s，1H，NH-CO)；8-7.39(m，9H，Ar-H)；6.43(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.27(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.84和2.55(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.31(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.59-1.36(m，6H，(CH2)3)。
●化合物間-腙2d將1d(350mg，0.83mmol)溶于5.5ml無水乙醇，然后加入肼一水合物(140μl，2.48mmol)。將溶液加熱回流過夜。蒸發(fā)后將產(chǎn)物溶于1ml乙醇和水。將白色沉淀重結(jié)晶將其溶于最小量的熱乙醇，然后加入水直至有輕微混濁出現(xiàn)。冷卻后，用水洗滌所得沉淀然后用醚干燥。得到264mg(73％)白色粉末狀的產(chǎn)物2d。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝9.99(s，1H，NH-CO)；9.80(s，2H，NH2)；7.54-6.88(m，9H，Ar-H)；6.26(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.21(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.28(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.78和2.59(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.27(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.57-1.36(m，6H，(CH2)3)。
●化合物間-重氮二苯基3d將3d(500mg，0.53mmol)溶于1ml THE。然后加入80mg活化的MnO2。在室溫攪拌5分鐘后，將混合物通過硅藻土(0.5cm)-分子篩(0.5cm，粉末狀)混合層過濾。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干。得到紫色油狀的化合物3d(47mg，100％)。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝9.95(s，1H，NH-CO)；7.60-6.9(m，9H，Ar-H)；6.42(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.28(m，1H，CH2-CH-NH)；4.14(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.83和2.59(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.27(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.58-1.35(m，6H，(CH2)3)。
實施例2用Cy5標(biāo)記的試劑Cy5PMDAM
●化合物2-[4-(N-乙酰基-N-苯基氨基)丁-1，3-二烯基]-1，2，3，3-四甲基[3H]碘咯碘化物(indolium iodide)6將乙酸酐(75ml)中的丙醛二(苯基亞胺)單鹽酸5(18.3g，70.0mmol)，NaOAc(9.0g，110mmol)和1，2，3，3-四甲基[3H]碘咯碘化物4(4.25g；14.1mmol)的混合物在110℃加熱20分鐘。冷卻后，加入醚(350ml)，然后將沉淀的棕色固體過濾，用醚洗滌(3×100ml)。將固體溶于150ml CH2Cl2，過濾(除去無機鹽)然后蒸發(fā)得到棕色固體(6.0g，90％)。
1H NMR(CDCl3)δ＝8.64(d，1H，J＝12Hz，1-H)；8.14(t，1H，J＝16，12Hz，3-H)；7.63-7.19(m，9H)；6.90(d，1H，J＝15Hz，4-H)；5.82(t，1H，J＝12，13Hz，2-H)；4.06(s，3H，NCH3)；2.16(s，3H，-COCH3)；1.74(s，6H，CH3)。
●化合物1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基[3H]碘咯溴化物92，3，3-三甲基吲哚7(10.0g，62.8mmol)和6-溴己酸8(12.3g，62.8mmol)在沒有溶劑時混合并于110℃在氬氣下加熱12小時。用乙酸乙酯洗滌紫紅色糊狀反應(yīng)混合物(2×60ml，用刮刀將此糊狀物搗碎并倒出上清液)，然后用丙酮洗滌(50ml，糊狀物凝固)。濾出粉紅色固體然后在真空下干燥(16.0g；73％)。
●化合物Cy5COOH 10將乙酸酐(35ml)中所述碘化物6(6.0g，12.7mmol)，溴化物9(4.5g，12.7mmol)和NaOAc(2.6g，32mmol)的混合物在110℃加熱20分鐘。冷卻后，加入醚(150ml)，過濾沉淀物并用醚洗滌(3×50ml)。將固體溶于100ml CH2Cl2，過濾并在SiO2柱(洗脫液MeOH 5-10％/CH2Cl2)上通過層析純化。得到3.4g(44％)。
1H NMR(CDCl3)δ＝8.03(t，2H，J＝10，11Hz，2-H，4-H)；7.38-6.91(m，9H，Ar-H，3-H)；6.41(d，1H，J＝14Hz，1-H)；6.31(d，1H，J＝13Hz，5-H)；4.07(t，2H，J＝7，7Hz，α-CH2)；3.68(s，3H，NCH3)；2.47(t，2H，J＝7，7Hz，ε-CH2)；1.71(m，18H，CH3，β，γ和δ-CH2)。
●3-氨基乙酰苯與Cy5COOH 10(產(chǎn)物11)偶合的化合物在溶于12mlCH2Cl2的Cy5COOH 10(1.19g，1.9mmol)溶液中加入N-甲基嗎啉(360μl，3.2mmol)。用冰浴冷卻此溶液，然后加入異丁基氯甲酸酯(480μl，3.7mmol)。攪拌5分鐘后，加入3-氨基乙酰苯(488mg，3.6mmol)。將混合物在室溫攪拌3h。加入250ml醚，得到糊狀固體。攪拌后，將固體至于圓底燒瓶底部并倒去上清液。再加入50ml醚并用刮刀將介質(zhì)搗碎以得到固體。將后者過濾，用水、醚洗滌，然后在真空下干燥。然后將產(chǎn)物(碘化物)溶于乙醇，通過安珀萊特(amberlite)IRA900(Cl-；15g)柱。將回收的乙醇溶液蒸發(fā)至干，然后通過SiO2柱。得到0.93g(77％)藍色固體。
●化合物Cy5-腙12在溶于5ml無水乙醇的乙酰苯11溶液(0.93g，1.46mmol)中加入肼一水合物(180μl，3.1mmol)并在室溫攪拌7h。加入50ml醚，將沉淀過濾并用醚洗滌。將粗產(chǎn)品溶于50ml CH2Cl2，將溶液過濾然后濃縮至10ml。加入100ml醚沉淀產(chǎn)物，過濾，用醚洗滌然后在真空下干燥。得到540mg產(chǎn)物12(57％)。
●化合物Cy5PMDAM 12a在溶于2ml DMF的100mg腙12溶液中加入300mg MnO2，然后將混合物劇烈攪拌10min。將上清液通過硅藻土層過濾并用DMF(3×500μl)洗滌。加入50ml醚，用刮刀將沉積的油狀物搗碎，然后倒去上清液。用25ml醚重復(fù)洗滌三次并將所得所得固體過濾并干燥。得到65mg(65％)產(chǎn)物12a。產(chǎn)物的純度約為80-85％(1H NMR)。
實施例3合成其它試劑實施例3.1對-硝基苯基重氮甲烷(NPDAM)的合成4-硝基苯甲醛腙是在商業(yè)上獲得的(參考目錄28，118-2，Aldrich，F(xiàn)rance)。
將600mg(3.64mmol)這種產(chǎn)物溶于9ml THF。溶液持續(xù)攪拌5分鐘，然后小心加入1.26g(4當(dāng)量，14.56mmol)MnO2。將混合物攪拌10分鐘，然后過濾。將濾液回收并蒸發(fā)至干。用戊烷洗滌后，得到亮橙色粉末狀的化合物對-硝基苯基重氮甲烷，產(chǎn)率為79％(468mg，2.87mmol)。
熔點80-82℃。-1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝8.11(d，2H，J＝9Hz，Ar-H3)；7.18(d，2H，J＝9Hz，Ar-H2)；6.06(s，1H，CH1-N2)。
實施例3.2苯基甲基重氮甲烷(PMDAM)的合成乙酰苯腙將乙酰苯(2.0g，16mmol)稀釋在16ml無水乙醇中，然后加入肼(2.3ml，48mmol)。將混合物加熱至回流溫度。2h后，將溶劑蒸發(fā)并將殘余物溶于醚(150ml)。用水(100ml)洗滌介質(zhì)。在Na2SO4上干燥后，蒸發(fā)去醚。得到淡黃色油狀物(1.5g，11mmol，69％)。
苯基甲基重氮甲烷(PMDAM)將腙(150mg，1.1mmol)溶于3ml THF。加入MnO2(480mg，5.5mmol)。介質(zhì)在室溫攪拌30min。介質(zhì)變?yōu)榧t色。過濾并蒸發(fā)去溶劑。得到紅色油狀物(145mg，100％)。該試劑無需純化即可使用。
實施例3.3二苯基重氮甲烷(DPDAM)的合成二苯甲酮腙是從商業(yè)上獲得的(參考目錄B 960-2 Aldrich，F(xiàn)rance)。
將196mg(1.0mmol)物質(zhì)溶于5ml THF。加入435mg(5當(dāng)量，5.0mmol)MnO2，混合物攪拌10分鐘，然后過濾。將回收的濾液蒸發(fā)至干。得到193mg(0.99mmol)。該試劑無需純化即可使用。
實施例3.4NVDAM的合成 按照上述步驟從6-硝基藜蘆醛(Aldrich，reference 27，960-9)進行合成。
實施例4從NPDAM合成生物素化的衍生物 按照上述ME Wall等的方法制備2-氨基-4-硝基苯甲醛衍生物。
重氮甲烷NPDAM的制備與上述實施例3.1是相同的。
實施例5制備DNA和RNA核酸實施例5.1制備DNA擴增子采用羅氏(Roche)的Fast Start Kit，0.2mM脫氧核糖核苷酸(d-ATP，d-CTP，d-GTP，d-TTP)，0.3μM引物和0.4μl酶，通過PCR從16S結(jié)核分枝桿菌(分枝桿菌bacterium tuberculosis)基因組DNA靶標(biāo)(以10E+4份拷貝作為起始靶標(biāo))產(chǎn)生了DNA擴增子。
PCR參數(shù)如下-95℃4分鐘，然后循環(huán)35次(95℃30秒；55℃30秒；72℃30秒)，然后4℃。
通過瓊脂糖凝膠電泳(1.5％，TBE 0.5X)定性分析擴增子。加樣體積為5μl，在100伏(V)下遷移20min。用溴化乙錠染色后在UV燈下觀察PCR產(chǎn)物。
培養(yǎng)條件、分枝桿菌的提取和引物的擴增專利WO-A-99/65926中描述。
實施例5.2制備轉(zhuǎn)錄的RNAs用Ambion的MEGAscript試劑盒從PCR靶標(biāo)(結(jié)核分枝桿菌16S RNA片段)進行轉(zhuǎn)錄7.5mM核苷酸(ATP，CTP，GTP和UTP)和2μl酶(RNA聚合酶)。在37℃溫育3小時(h)。PCR的擴增引物帶有T3或T7聚合酶啟動子，該啟動子如申請WO-A-99/65926中所述或如J.Clin.Microbiol.37(1)，49-55頁，1999文章中所述，可進行轉(zhuǎn)錄。
用瓊脂糖凝膠電泳(1.5％，TBE 0.5X)分析轉(zhuǎn)錄物。加樣體積為5μl并在100V下遷移20min。用溴化乙錠染色后在UV燈下觀察PCR產(chǎn)物。
用其它擴增技術(shù)如NASBA或TMA可得到與本發(fā)明觀點相同的結(jié)果，這些技術(shù)可直接產(chǎn)生RNA擴增子。
實施例6標(biāo)記試劑在樣品核苷酸上的反應(yīng)性標(biāo)記試劑的合成描述在實施例1-4中。本發(fā)明所述的PDAM是商業(yè)上獲得的(參考目錄P1405，Molecular Probes，Eugene，OR)。
實施例6.1單體UMP3’-磷酸的標(biāo)記研究帶有重氮甲基官能團的標(biāo)記試劑的反應(yīng)性以控制反應(yīng)的特異性。
開發(fā)的方法包括在以下標(biāo)準(zhǔn)條件下在典型化合物3’-UMP(尿苷3’-單磷酸，參考目錄U1126 Sigma)上通過毛細(xì)管電泳來研究這種反應(yīng)性3’-UMP 0.04mM；H3BO32.0mM；2.0mM標(biāo)記[和合適的有機溶劑(THF，AcOEt或DMSO)一起加入]；溶劑H2O-CH3CN-有機溶劑(比例1/3/1)。
將此溶液分成250μl的十份，加熱至60℃。一定時間后，用250μl二氯甲烷處理每份溶液。攪拌后，除去有機相(下相)。重復(fù)該操作兩次以上。離心(5min，每分鐘5000轉(zhuǎn))后，通過毛細(xì)管電泳分析含水相。毛細(xì)管電泳(CE)條件如下用Beckman P/ACE 5000設(shè)備進行CE分析。使用未經(jīng)處理的熔融二氧化硅毛細(xì)管(75μm×50cm)。施加電壓為30kV(正極)，且毛細(xì)管的溫度保持在23℃。在254nm記錄電泳圖。用NaOH溶液調(diào)節(jié)硼酸的pH并通過0.2μm濾器過濾以制備硼酸鹽緩沖液(0.1M，pH8.3)。在壓力(0.5psi，5sec)下注射樣品。每次分析前在壓力下(20psi)連續(xù)通入NaOH溶液(0.1M，2min)，水(2min)和硼酸鹽緩沖液(2min)以使毛細(xì)管再生。
如圖所示，通過在0-4小時之間改變反應(yīng)時間來進行反應(yīng)，結(jié)果表示所用試劑濃度的圖2A-2I中所測試的各個試劑。
在各幅電泳圖上都標(biāo)出了反應(yīng)時間。
對所有測試的試劑，只得到了單烷基化產(chǎn)物，這證明了反應(yīng)的特異性。
因此可比較峰高度以計算反應(yīng)性，即試劑和3’-UMP的發(fā)生一半反應(yīng)的時間，結(jié)果列在下面的表1中(標(biāo)準(zhǔn)條件如上所述) *對o-BioPMDAM估計了反應(yīng)性，因為在標(biāo)記試劑濃度為2mM的條件下，反應(yīng)在5分鐘內(nèi)完成。因此圖2I使用的濃度為0.2mM。
表1試劑的反應(yīng)性(半反應(yīng)時間)需要注意的是，由于對于所有被測試劑反應(yīng)是非常特異的且不會產(chǎn)生副產(chǎn)品。因此可增加標(biāo)記試劑的濃度而不會影響標(biāo)記的選擇性。
因此，對于DPDAM試劑，如果濃度增加至20mM(見圖2C)，則反應(yīng)性(半反應(yīng)時間)為2小時。用BioDPDAM(圖2F)得到了相同的結(jié)果，當(dāng)濃度為30mM時反應(yīng)性為45分鐘。
實施例6.2各種核苷酸3’-單磷酸的測試為避免任何解釋錯誤，用其它核苷酸3’-單磷酸對作為重要例子的間-BioPMDAM標(biāo)記進行了額外的研究。
測試的核苷酸如下3’-AMP(參考目錄85，194-9 Aldrich)，3’-GMP(參考目錄151214，ICN)，3’-CMP(參考目錄C1133，Sigma)，3’-TMP(脫氧核糖系列)(參考目錄T1008，Sigma)。用不同核苷酸獲得的電泳圖顯示在圖3A-3D中。圖3A中顯示的反應(yīng)時間與圖3B-3D中的反應(yīng)時間是相同的。
無論起始核苷酸是(核糖或脫氧核糖系列)，在60℃130分鐘時只形成且完全形成了烷基化產(chǎn)物。值得注意的是，在鳥嘌呤(最容易和常規(guī)的烷基化劑反應(yīng)的堿基)的情況下，只觀察到被磷酸烷基化的產(chǎn)物，這證明了該反應(yīng)的很高選擇性。
該研究還可證明反應(yīng)速度不取決于作為底物的核苷酸的性質(zhì)。
實施例6.3二核苷酸的研究用間-BioPMDAM進行二核苷酸ApUp(參考目錄A4298，Sigma)的烷基化以證實朝相于對苷酸核間磷酸的末端磷酸反應(yīng)的選擇性。如圖4所示，通過電泳監(jiān)控反應(yīng)。電泳條件是實施例6.1已經(jīng)描述的標(biāo)準(zhǔn)條件。
觀察到只形成了一種產(chǎn)物，這顯示了朝相對于核苷酸間磷酸的末端磷酸的間-BioPMDAM試劑有良好的選擇性。
實施例6.44具有核苷酸3′-單磷酸的加合物的鑒定為確保所得產(chǎn)物確由磷酸的烷基化產(chǎn)生，用間-BioPMDAM試劑合成了單磷酸3’-UMP，3’-CMP，3’-GMP和3’-AMP的加合物。所述烷基化反應(yīng)是在下述制備規(guī)模上進行的。所得加合物的產(chǎn)率為70％，是純的，然后通過質(zhì)子或磷NMR研究。
制備方法將3’-UMP(二鈉鹽形式，9.3mg，21.1μmol)溶于2ml 0.1M H3BO3水溶液，然后連續(xù)加入2ml CH3CN，6ml MeOH和間-BioPMDAM試劑(75mg；0.20mmol)。反應(yīng)在室溫下進行2.5h。通過毛細(xì)管電泳監(jiān)控反應(yīng)。加入3ml水，然后用CH2Cl2萃取除去多余的試劑。蒸發(fā)去含水相。將殘余物溶于小量的水并通過反相硅膠柱(Lichroprep RP-18，Merck；洗脫液MeOH/H2O(20/80))純化。得到10g(69％)3’-UMP的加合物。
圖5A-5D顯示了3’-NMP(N＝G，U，C，A)加合物的質(zhì)子NMR譜。通過二維1H/1HNMR實驗(COSY)鑒定加合物。對每個加合物得到了比例為1/1的兩種非對映異構(gòu)體。
在0ppm(300MHz，D2O)附近磷NMR只有一個峰。
這些實驗證明該反應(yīng)確實是特異的，因為只觀察到一種加合物且標(biāo)記確實是對磷進行的。這些堿基沒有發(fā)生烷基化副反應(yīng)。因此，標(biāo)記產(chǎn)物特別適合雜交步驟。
實施例7穩(wěn)定性研究實施例7.1標(biāo)記試劑對溫度的穩(wěn)定性上述實施例6.1的表中所描述的所有重氮甲烷衍生物以固體狀態(tài)在-20℃冰箱中保存至少3個月其反應(yīng)性不會喪失。
兩種試劑NPDAM和間-BioPMDAM在室溫放置于實驗臺上的穩(wěn)定性用1H NMR確定。我們發(fā)現(xiàn)將NPDAM放置于無特別預(yù)防的實驗臺上1個月也不會分解。而間-BioPMDAM在實驗臺上放置25天就會分解約50％。
標(biāo)記試劑對溫度的穩(wěn)定性是一個基本特征。事實上，這種試劑在工業(yè)應(yīng)用上的最終目的是標(biāo)記試劑盒。在-20℃至少15天內(nèi)，最好是1個月內(nèi)就不穩(wěn)定的試劑是沒有市場前景的。即使在-110℃下儲存和運輸，-110℃和-20℃的穩(wěn)定性存在相互關(guān)系，這就是為什么在-20℃下要穩(wěn)定15天，最好是1個月是工業(yè)上的最低限度。在-110℃以上，從使用者和制造商的角度看實驗室缺乏必要的冷凍設(shè)備(冰箱)，并且從制造商的角度看也沒有一種簡單的干冰方法運輸這些試劑。
至于室溫下的穩(wěn)定性，穩(wěn)定數(shù)小時，最好是1天就足以使使用者進行標(biāo)記。
實施例7.2各種核苷酸3′-UMP標(biāo)記結(jié)合物的水解我們測試了[3’-UMP-標(biāo)記]結(jié)合物在堿性介質(zhì)中的穩(wěn)定性。水解機制可用以下方式表示
用以下方法合成使用的各種結(jié)合物，以通過間-BioPMDAM對單磷酸3’-UMP(核糖核苷酸序列)的烷基化。
用3’-UMP測試的各種標(biāo)記試劑是●間-BioPMDAM，●鄰-BioPMDAM，●對-BioPMDAM，●DPDAM，和●PDAM。
步驟在DMSO中制備20mM標(biāo)記試劑溶液。
為進行反應(yīng)，加入以下物質(zhì)-20μl該溶液，-40μl 1N NaOH，-10μl濃度為40mM的參照產(chǎn)物，和-130μl H2O。
將此溶液加熱至60℃并在精確時間取樣。
對樣品進行以下處理-10μl加熱溶液，-40μl 0.5M H3BO3，和-150μl H2O。
對每種樣品，取15μl這種最終溶液進行毛細(xì)管電泳。
通過毛細(xì)管電泳測定水解反應(yīng)的速度，研究結(jié)合物數(shù)量的減少作為時間的函數(shù)(測量峰的表面積，與內(nèi)標(biāo)物3，5-二氨基苯甲酸或萘甲酸相比)。
用這種方法，我們可比較各種結(jié)合物的穩(wěn)定性。
結(jié)果如表2所示
表2反應(yīng)性(與核苷酸3’-UMP-標(biāo)記結(jié)合的試劑的半反應(yīng)期)因此，我們發(fā)現(xiàn)與間-BioPMDAM結(jié)合的半衰期為197min，這比對-BioPMDAM衍生物高25倍，比DPDAM衍生物高7倍，比鄰-BioPMDAM衍生物高4倍。
鄰位和對位衍生物比結(jié)合物更穩(wěn)定，在診斷測試時可進行更好的檢測。
實施例8用間-bioPMDAM衍生物(3a)標(biāo)記轉(zhuǎn)錄的RNA標(biāo)記 間-bioPMDAM(3a)間-bioPMDAM衍生物(3a)是按實施例1.1所述的反應(yīng)流程得到的。RNA靶是按照實施例5.2所述的方法通過PCR后轉(zhuǎn)錄(post-PCR transcription)制得的。
在50μl含有RNA轉(zhuǎn)錄物的溶液中加入9μl純水(Sigma)，9μl 0.1M咪唑和9μl 1M MnCl2。咪唑和MnCl2的濃度分別為6mM和60mM。加入含有RNA靶的溶液和片段化所需的緩沖液，以及3μl間-bioPMDAM(3a)(100mM，溶于DMSO)，然后溫育。間-bioPMDAM標(biāo)記的最終濃度為2mM。用純水將此溶液調(diào)至150μl后，將反應(yīng)混合物勻漿并在60℃溫育30分鐘。溫育30分鐘并加入EDTA后(最終為100mM)，用供應(yīng)商提供的緩沖液和方法，在QIAVACTM柱(Qiagen，Hilden，Germany)上純化以除去過量的標(biāo)記。
雜交經(jīng)過片段化期間的標(biāo)記步驟后，將得到的片段在DNA芯片上雜交，該芯片是設(shè)計用于分析結(jié)核分枝桿菌16S RNA的“Genbank”M20940序列的213-215區(qū)域。這種DNA芯片在A.Troesch等，J.Clin.Microbiol.，37(1)49-55，1999中有描述。
雜交步驟是在流體站(Affymetrix，Santa Clara，CA)上進行的，所用的雜交方法和緩沖液見A.Troesch等，J.Clin.Microbiol.，37(1)49-55，1999。需附加步驟以使生物素顯色(間接檢測)。
引入用藻紅蛋白和Cy5標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(激發(fā)波長分別為488nm和650nm)以顯示在DNA芯片表面與捕獲探針雜交的生物素化的片段。如下條件300μl純水；300μl 100mM的Tris緩沖液(pH7/1 M NaCl/0.05％Tween/0.005％消泡劑)；6μl BSA(50 mg/ml)；6μl標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(200μg/ml)。采用的組分的參考目錄是·鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白參考目錄R0438，Dako，Denmark，·鏈霉抗生物素蛋白-CY5參考目錄C0050，Dako，Denmark，·消泡劑參考目錄M5-575，Ultra Additives Inc.，以及·Tween參見P-7949，Sigma。
DNA芯片的閱讀標(biāo)記和雜交后，DNA芯片表面發(fā)射的熒光以及信號強度和同源性百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)用Affymetrix所提供的閱讀系統(tǒng)及軟件(GeneChipInstrument System和GeneChipInformation System，Santa Clara CA)進行閱讀。
閱讀系統(tǒng)所提供的信號強度和背景噪音強度用rfu(相對熒光單位)表示。同源性百分?jǐn)?shù)以參考序列為基準(zhǔn)，在此情況中是指結(jié)核分枝桿菌序列。
以平均強度所表示的信號(I)、背景噪音(B)和同源性百分?jǐn)?shù)(％)的結(jié)果列于表2。
一般來說，同源性百分?jǐn)?shù)大于90％被認(rèn)為是滿意的結(jié)果，雖然大于95％的結(jié)果也常常出現(xiàn)。在95％以上，值就不再指明，因為這在分枝桿菌DNA芯片的例子中是沒有意義的。高強度、低背景噪音是在下面的例子中所看到的第二個結(jié)果。在所有的結(jié)果中，背景噪音B是由平均強度I推算出來的。
表3標(biāo)記和雜交后DNA芯片表面發(fā)射的熒光讀數(shù)用兩種標(biāo)記，同源性比例大于95％。以rfu表示的信號強度大于那些用標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記技術(shù)得到的值。
這些結(jié)果顯示，在片段化RNA轉(zhuǎn)錄物時用間-bioPMDAM衍生物進行標(biāo)記反應(yīng)可在DNA芯片上產(chǎn)生可檢測的足夠標(biāo)記的片段。因此，重氮甲基官能團可使生物素標(biāo)記引入RNA轉(zhuǎn)錄物的序列。這一反應(yīng)沒有改變生物素-鏈霉抗生物素蛋白相互作用的性質(zhì)。實際上，無論是用熒光團藻紅蛋白或是Cy5，強度水平和信噪比(I/B)都很好。采用這一技術(shù)可根據(jù)用途使用不同的熒光團，甚至在兩種不同波長下進行檢測(參見，如Nature Genetics 14卷，441-447頁，1996)。
實施例9用間-bioPMDAM衍生物進行標(biāo)記的條件的最佳化實施例9.1片段化鹽(MnCl2)濃度的最佳化用不同濃度的MnCl2按實施例8所述的方法標(biāo)記RNA轉(zhuǎn)錄物。
雜交和閱讀按實施例8所描述的方法進行。
標(biāo)記結(jié)果顯示，用低濃度的MnCl2得到了高的強度。
MnCl20mM，強度I3857rfu，同源性93.5％，MnCl25mM，強度I3031rfu，同源性93.5％，和MnCl210mM，強度I2471rfu，同源性94.1％。
在不同MnCl2濃度下分析RNA轉(zhuǎn)錄物的片段化顯示，對于金屬來說，通過在60℃溫育，5mM時片段化總是有效的。
這顯示，在最佳的標(biāo)記和片段化條件下用標(biāo)記試劑可得到非常好的標(biāo)記結(jié)果。
實施例9.2咪唑濃度的最佳化在4個含有50μl RNA轉(zhuǎn)錄物(16S分枝桿菌)溶液的試管中加入4.5μl或18μl或36μl咪唑(1M，溶于純水)，以使最終濃度分別為30，120和240mM。然后加入3μl間-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO)，并用純水將總體積調(diào)至150μl。
在60℃將4個試管中的溶液渦漩攪拌且溫育10分鐘。
純化將四種標(biāo)記反應(yīng)溶液在QIAVACTM柱上純化以除去多余的標(biāo)記。
雜交和閱讀步驟如實施例8所述(鏈霉抗生物素蛋白藻紅蛋白檢測)。
以信號強度表示的結(jié)果如下咪唑30mM 強度3600rfu，咪唑120mM 強度1600rfu，和咪唑240mM 強度1400rfu。
從標(biāo)記強度看，用30mM咪唑得到了最好的結(jié)果。可能高濃度(120和240mM)產(chǎn)生過量的片段化，因此，產(chǎn)生較短的片段。
該結(jié)果還顯示，基于重氮甲基官能團的標(biāo)記的化學(xué)機理可最優(yōu)化，并使其適合標(biāo)記條件和要標(biāo)記的靶。
實施例9.3間-bioPMDAM標(biāo)記濃度的影響在6個含有50μ RNA轉(zhuǎn)錄物(實施例5.2)溶液的試管中加入4.5μl咪唑(1M，溶于純水)和體積分別為0.38；0.75；1.5；3；4.5和7.5μl的間-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO)。用純水將總體積調(diào)至150μl。
在60℃將溶液渦漩攪拌且溫育10分鐘。
雜交和閱讀步驟如實施例8所述。
結(jié)果列于表4
表4標(biāo)記結(jié)果的總結(jié)，它是bioPMDAM標(biāo)記濃度的函數(shù)。在DNA芯片上用鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白(PE)和鏈霉抗生物素蛋白-Cy5(Cy5)進行觀察。
從2mM間-bioPMDAM可見，同源性百分?jǐn)?shù)和標(biāo)記強度好。這和用生物素和用帶有藻紅蛋白的鏈霉抗生物素蛋白，以及用與Cy5連接的鏈霉抗生物素蛋白觀察到的結(jié)果是一樣的。超過此濃度，信號的增強和同源性百分?jǐn)?shù)不受影響。
實施例9.4標(biāo)記后純化步驟的省略為省去純化步驟，在DNA芯片上用不同的標(biāo)記反應(yīng)體積進行雜交，未事先純化。
在片段化時，在50μl RNA轉(zhuǎn)錄物(實施例5.2)溶液中加入標(biāo)記緩沖液，然后將混合物在60℃溫育30分鐘。片段化時的標(biāo)記條件為30mM咪唑(4.5μl咪唑溶液，1M，溶于純水)，10mM MnCl2(1.5μl氯化錳溶液，1M，溶于純水)和2mM間-BioPMDAM(3μl 100mM溶液，溶于無水DMSO)。
溫育后，將不同體積的標(biāo)記溶液在DNA芯片上雜交，事先未進行任何純化。雜交方法如上所述。引入用藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白以顯示在DNA芯片表面與捕獲探針雜交的生物素化的片段(激發(fā)波長488nm)，條件如實施例8所述。
還按照Affymetrix提供的方法檢測藻紅蛋白標(biāo)記并分析結(jié)果，該方法描述在實施例8中。
結(jié)果列于表5。
注*標(biāo)記后將標(biāo)記反應(yīng)物的總體積在柱上純化表5標(biāo)記后純化步驟的省略這些結(jié)果顯示，如果所有反應(yīng)物體積沒有雜交，使用2mM間-BioPMDAM可省略純化步驟。使用20μl在DNA芯片上雜交，從同源性百分?jǐn)?shù)和信號強度看，所得結(jié)果可與用采用純化步驟的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得的結(jié)果相比。
用沒有金屬(MnCl2)的標(biāo)記方法獲得了相同的結(jié)果，列于表6。信號較強。
表6在沒有MnCl2時標(biāo)記后純化步驟的省略這些結(jié)果顯示，使用片段化試劑而不是金屬可避免沉淀問題和高背景噪音。
在實施例9.4中，所用RNA轉(zhuǎn)錄物被降解了，這解釋了信號的減弱，但用參照物可進行比較。
實施例10可用來標(biāo)記RNA的其它片段化試劑實施例10.1使用多胺鏈為解決鹽存在時標(biāo)記產(chǎn)量的減少問題，我們使用了“生源的”多胺，精胺作為片段化試劑。實際上，已知這種多胺鏈用于其與核酸的磷酸相互作用。
將50μl RNA轉(zhuǎn)錄物(實施例5.2)和各種濃度的精胺(參考目錄13275-0010，Acros，F(xiàn)R，0.5M儲備溶液pH7.5)以及2mM間-BioPMDAM(3μl 100mM BioPMDAM溶液，溶于無水DMSO)在60℃溫育30分鐘，最終體積為150μl。
按照實施例8所述的方法在DNA芯片上進行純化、雜交和檢測(鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白檢測)。
標(biāo)記結(jié)果列于表7
表7精胺用作片段化試劑以精胺作為片段化試劑在片段化時進行標(biāo)記，同源性百分?jǐn)?shù)和信號強度是令人滿意的。因此可在用帶有重氮甲基官能團的標(biāo)記試劑進行標(biāo)記時，多胺鏈可用來片段化RNA靶。
實施例10.2使用菲咯啉衍生物實驗1在5μl RNA轉(zhuǎn)錄物中加入20μl菲咯啉-FeSO4(參考目錄P1929，Sigma，25mM)和2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO)。將體積調(diào)至100μl。試管在95℃溫育60min。
實驗2在5μl RNA轉(zhuǎn)錄物中加入3μl咪唑pH9.5(1M，溶于純水)，0.5μlMnCl2和2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO)。將體積調(diào)至100μl。試管在60℃溫育10min。
兩種情況下，都在DNA芯片上對樣品進行雜交、檢測和分析。
如上所述，引入與熒光團、藻紅蛋白偶合的鏈霉抗生物素蛋白以顯示在DNA芯片表面與捕獲探針雜交的生物素化的片段(激發(fā)波長488nm)。
表8使用菲咯啉衍生物以菲咯啉作為片段化試劑獲得的結(jié)果，如表8所示，高于用使用金屬和咪唑的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得的結(jié)果。
還可使用與Fe++之外其它金屬絡(luò)合的其它菲咯啉衍生物，如Cu++，Zn++等。
實施例11在兩個步驟中用間-bioPMDAM標(biāo)記并片段化RNA在片段化緩沖液30mM咪唑和10mM MnCl2存在時，將按實施例5.2所述方法獲得的50μlRNA轉(zhuǎn)錄物溶液在60℃溫育30分鐘。然后加入間-bioPMDAM衍生物，時最終濃度為2mM，并在60℃再溫育5min。
在雜交前，按照上述方法(實施例8)將標(biāo)記的RNA片段在柱上純化。
表9在兩個步驟中用間-bioPMDAM標(biāo)記并片段化RNA這里，按照表9，在進行比較時應(yīng)考慮強度和I/B比，因為用方法1(片段化，然后標(biāo)記)所得信號太強。觀察到閱讀器的飽和現(xiàn)象，這會導(dǎo)致較低的同源性百分?jǐn)?shù)(81％)，而用參照方法獲得的同源性百分?jǐn)?shù)為91.9％。
然而，該實施例顯示，片段化和標(biāo)記步驟是可以分離的。
實施例12放大信號以用間-bioPMDAM試劑標(biāo)記RNA此方法的目的是放大熒光信號，這是通過在每個間-bioPMDAM分子中引入幾個熒光團實現(xiàn)的。
標(biāo)記反應(yīng)在5μl轉(zhuǎn)錄物(分枝桿菌16S)中加入89μl純水(Sigma)，30μl咪唑(1M，溶于純水)，1μl MnCl2(1M，溶于純水)和2μl間-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO)。
試管渦漩攪拌，然后在60℃溫育10分鐘。
然后按照實施例8所述的方法進行柱純化并在DNA芯片上進行雜交。
未放大信號將鏈霉抗生物素蛋白(用藻紅蛋白PE標(biāo)記)和標(biāo)記試劑間-bioPMDAM相互作用以顯示生物素化的片段。在DNA芯片上加入鏈霉抗生物素蛋白時方法如實施例8所述。
放大信號第一步附上鏈霉抗生物素蛋白(300μl純水，300μl 100mM Tris緩沖液pH7/1M NaCl/0.05％ Tween/0.005％消泡劑；6μlBSA，50mg/ml；4μl鏈霉抗生物素蛋白，1.5mg/ml)。
第二步附上生物素化的抗-鏈霉抗生物素蛋白抗體(300μl純水，300μl100mM Tris緩沖液pH7/1M NaCl/0.05％ Tween/0.005％消泡劑；6μlBSA，50mg/ml；3μl生物素化的抗-鏈霉抗生物素蛋白抗體，1mg/ml)。
第三步附上用藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(300μl純水，300μl100mM Tris緩沖液pH7/1M NaCl/0.05％ Tween/0.005％消泡劑；6μlBSA，50mg/ml；6μl用藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白，300μg/ml)。
然后在上述步驟中使用生物素化的抗-鏈霉抗生物素蛋白參考目錄216-065-084，Jackson Immuno Research。
按照實施例8所述的方法閱讀DNA芯片上的信號。結(jié)果以同源性百分?jǐn)?shù)和標(biāo)記強度表示，列于表10
表10放大信號以用間-bioPMDAM試劑標(biāo)記RNA信號的放大顯著地改善了檢測的靈敏度。
實施例13用對-bioPMDAM(3b)和鄰-bioPMDAM(3c)衍生物標(biāo)記RNA在片段化RNA轉(zhuǎn)錄物時，在標(biāo)記方法中評價兩種按實施例1.2和1.3所述方法制備的試劑。
按實施例5.2所述方法獲得RNA轉(zhuǎn)錄物。
標(biāo)記、雜交、引入用藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白以及純化方法如實施例8所述。
結(jié)果列于表11
表11用對-bioPMDAM和鄰-bioPMDAM標(biāo)記RNA這些結(jié)果顯示，鄰位和對位的取代對標(biāo)記強度和同源性百分?jǐn)?shù)也有有用的效果。
實施例14用BioDPDAM衍生物(3d)標(biāo)記RNA轉(zhuǎn)錄物按實施例1.4所述的方法制備BioDPDAM衍生物(3d)。
按實施例5.2所述的方法獲得RNA轉(zhuǎn)錄物。
與間-BioPMDAM試劑相比，標(biāo)記和片段化方法是在表12所述的條件下(反應(yīng)體積100μl)在一個步驟中完成的。
雜交、引入用藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白以及純化方法如實施例8所述。
結(jié)果列于表所
Im＝咪唑表12用BioDPDAM(3d)標(biāo)記RNA轉(zhuǎn)錄物衍生物3d對在磷酸上標(biāo)記RNA有良好的結(jié)果。這一結(jié)果顯示，取代基(如苯基)可用來調(diào)節(jié)帶有重氮甲基官能團的標(biāo)記的反應(yīng)性和穩(wěn)定性。
實施例15用Cy5-PMDAM衍生物(12a)標(biāo)記RNA
Cy5-PMDAM(12a)按實施例2所述的方法制備標(biāo)記Cy5-PMDAM(12a)。
在各種片段化和標(biāo)記條件下，用Cy5-PMDAM標(biāo)記5μl RNA轉(zhuǎn)錄物(實施例5.2)。常規(guī)條件如下●最終反應(yīng)體積100μl，●30mM咪唑pH8(3μl 1M儲備溶液)，●5mM MnCl2(6μl 0.1M儲備溶液)，和●3mM Cy5-PMDAM(3μl 100mM儲備溶液溶于無水DMSO)。
在第一個實驗中，在片段化期間在一個步驟中進行標(biāo)記。
在第二個實驗中，標(biāo)記和片段化是在兩個步驟中完成的片段化之后進行標(biāo)記。
與MnCl2一起溫育后，加入20μl 0.5M EDTA溶液以中和鹽。
若在一個步驟中進行標(biāo)記和片段化，則在60℃溫育30min。對于第二個實驗，其中標(biāo)記和片段化是在兩個步驟中進行的，對每個步驟使用15min溫育。
按實施例8所述的方法將標(biāo)記的片段純化、雜交并檢測。不同之處僅在于，在雜交步驟中不需要加入標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白，因為標(biāo)記是通過合適的閱讀器(GMS 418陣列掃描儀，Affymetrix，Santa Clara，CA)直接檢測的。
標(biāo)記結(jié)果列于表13
表13用Cy5-PMDAM衍生物標(biāo)記RNA轉(zhuǎn)錄物從標(biāo)記強度和同源性百分?jǐn)?shù)來看，用標(biāo)記試劑(12a)在RNA轉(zhuǎn)錄物的磷酸上標(biāo)記有非常滿意的結(jié)果。
值得一提的是，用這種標(biāo)記得到的信號背景噪聲比非常令人滿意。實際上，花青衍生物的激發(fā)和發(fā)射波長遠(yuǎn)不同于那些生物分子。
這些結(jié)果還顯示，重氮甲基官能團可在核酸的磷酸水平引入生物素以外的標(biāo)記。
實施例16DNA片段化的研究實施例16.1各種核苷在酸性介質(zhì)中的水解研究的目的是證明天然核苷、修飾核苷以及嘌呤核苷和嘧啶核苷之間在酸性pH條件下穩(wěn)定性的差異。此研究也可以使我們通過考慮DNA的堿基組成而更好地控制其片段化。
2種修飾核苷，8-溴-2’-脫氧腺苷(8-BrdA)和5-溴-2’-脫氧胞苷(5-BrdC)以及4種天然核苷(dA，dC，dG和dT)用于此研究中。
每種核苷取50nmol在95℃、pH為3的50mM甲酸鹽中溫育，溫育時間從0到45min。真空干燥后加入20μl純水，取10nmol樣品用反相HPLC分析。結(jié)果以起始核苷的水解百分率(y軸)與以分鐘計的溫育時間(x軸)的關(guān)系表示，見圖8。
圖8的曲線顯示，腺苷在8位上用溴原子修飾使此核苷沒有天然核苷穩(wěn)定。然而，結(jié)果顯示在使用的條件下，去嘌呤作用要遠(yuǎn)大于去嘧啶作用。
此研究表明去嘌呤作用或去嘧啶作用使DNA片段化可以通過優(yōu)化水解的條件或通過摻入比天然堿基穩(wěn)定性低的修飾堿基或者在摻入后可以被修飾和水解的堿基來控制。
實施例16.2摻入修飾核苷酸或其他物質(zhì)的雙鏈DNA的片段化以16S結(jié)核分枝桿菌基因組DNA靶(10+4個起始拷貝)，用Roche的Fast Start試劑盒，加入0.2mM 4種脫氧核糖核苷酸(d-ATP，d-CTP，d-GTP，d-TTP)，0.3μM引物和0.4μl酶平行進行3組PCR擴增。
PCR參數(shù)與實施例5相同。
第一組PCR所用的條件為所謂的天然PCR。
第二組PCR所用的條件加以修改，以得到加入30％8Br-dATP后的PCR產(chǎn)物。這可以通過引0.2mM d-CTP，d-GTP和d-TTP來實現(xiàn)。還引入0.14mM d-ATP和0.06mM的8-BrdATP。(8-BrdATP是市場上買到的(參考目錄N-2005-1，TriLinkBiotechnologies，San Diego CA)。
第三組PCR所用的條件加以修改，人得到加入50％8Br-dATP后的PCR產(chǎn)物。這可以通過引入0.2mM d-CTP，d-GTP和d-TTP來實現(xiàn)。還引入0.1mM d-ATP和0.1mM 8-BrdATP。
這些擴增子的單獨片段化研究在上述條件下進行50mM甲酸鈉，pH為3，95℃。
PCR產(chǎn)物的分析用溴化乙啶染色的變性聚丙烯酰胺凝膠(8％聚丙烯酰胺，7M尿素，1×TBE)進行。
在pH3的50mM甲酸鈉中95℃溫育15min后，沒有觀察到三個PCR產(chǎn)物之間有差異。在所有情況下觀察到PCR擴增子的完全片段化。
PCR擴增子的去嘌呤作用也可以在不同的pH值、不同的溫度和不同的溫育時間下進行。在上述的條件下進行凝膠分析表明，pH3時僅在95℃溫育10min后片段化就完成了。在此pH條件下，60℃溫育30min也可以完成片段化。
在pH4時，即使在95℃也需要30min的溫育才能完成DNA擴增子的片段化。這一結(jié)果非常重要，說明在酸性pH條件下產(chǎn)生的脫堿基位點是不穩(wěn)定的，因而不經(jīng)過特別的處理也會導(dǎo)致DNA鏈的片段化。
實施例17以兩個步驟用間-bioPMDAM衍生物(3a)標(biāo)記和片段化DNA按照實施例1.1描述的反應(yīng)流程獲得間-bioPMDAM衍生物(3a)。
按照實施例5.1描述的方案用PCR擴增制備DNA擴增子。
標(biāo)記將10μl PCR產(chǎn)物，38μl純水(Sigma)和50μl甲酸鈉(100mM，溶于純水中)在pH3時混和，混合物60℃溫育30min。然后加入2μl間-bioPMDAM(100mM溶于DMSO中)。溶液旋渦攪拌，然后60℃再溫育15min。
試驗作兩份進行以便能在凝膠上分析DNA的片段化，并通過DNA芯片的雜交和閱讀來分析標(biāo)記的效率。
純化純化用QIAQUICKTM柱(核苷酸去除試劑盒，Qiagen，Hilden，Germany)進行。所用的純化方案是廠家推薦的。
純化后，洗脫物轉(zhuǎn)到一個含有400μl雜交緩沖液(1.75ml 20×SSPE；2.9ml5M甜萊堿；290μl 0.1M DTAB；10μl消泡劑30％)的干凈試管中。這些物質(zhì)的參考目錄如下·甜菜堿參考目錄B-2754 Sigma，和·DTAB參考目錄D-5047 Sigma。
溶液旋渦攪拌，95℃溫育10min以分離在片段化期間的標(biāo)記步驟(變性步驟)中沒有分開的DNA雙鏈分開。然后在DNA芯片上雜交前將試管浸在0℃的冰-水中。
在DNA芯片上雜交經(jīng)過片段化期間的標(biāo)記步驟后，將得到的片段在DNA芯片上雜交，該芯片是設(shè)計用于分析結(jié)核分枝桿菌16S RNA的“Genbank”M20940序列的213-215區(qū)域的。這種DNA芯片在A.Troesch等，J.Clin.Microbiol.，37(1)49-55，1999中有描述。
雜交步驟是在流體站(Affymetrix，Santa Clara，CA)上進行的，所用的雜交方法和緩沖液見A.Troesch等，J.Clin.Microbiol.，37(1)49-55，1999。需附加步驟以使生物素顯色(間接檢測)。
雜交是通過結(jié)合標(biāo)記藻紅蛋白(PE)的鏈霉抗生物素蛋白顯示的，PE與間-BioPMDAM上的生物素相互作用，反應(yīng)條件如下300μl純水；300μl的100mM Tris緩沖液(pH7/1M NaCl/0.05％Tween/0.005％消泡劑)；6μl BSA(50mg/ml)；6μl鏈霉抗生物素蛋白-PE(300μg/ml)。這些物質(zhì)的參考目錄·鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白參考目錄R0438，Dako，Denmark，·鏈霉抗生物素蛋白-CY5參考目錄C0050，Dako，Denmark，·消泡劑參考目錄M5-575，Ultra Additives Inc.，以及·Tween參考目錄P-7949，Sigma。
DNA芯片的閱讀標(biāo)記和雜交后，DNA芯片表面發(fā)射的熒光以及信號強度和同源性百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)用Affymetrix所提供的閱讀系統(tǒng)及其軟件(GeneChipInstrument System和GeneChipInformation System，Santa Clara CA)進行閱讀。
閱讀系統(tǒng)所提供的信號強度和背景噪音強度用rfu(相對熒光單位)表示。同源性百分?jǐn)?shù)以參考序列為基準(zhǔn)，在此情況中是指結(jié)核分枝桿菌序列。
以平均強度所表示的信號(I)、背景噪音(B)和同源性百分?jǐn)?shù)(％)的結(jié)果列于表2。
一般來說，同源性百分?jǐn)?shù)大于90％被認(rèn)為是滿意的結(jié)果，雖然大于95％的結(jié)果也常常出現(xiàn)。在95％以上，值就不再指明，因為這在分支枝桿菌DNA芯片的例子中是沒有意義的。高強度、低背景噪音是在下面的例子中所看到的第二個結(jié)果。在所有的結(jié)果中，背景噪音B是由平均強度I推算出來的。
聚丙烯凝膠分析打算在凝膠上分析的樣品在真空下干燥，加入10μl純水和10μl 2×藍甲酰胺。
電泳是用8％丙烯酰胺凝膠，緩沖液是1×TBE，150V遷移1小時。
酸性pH用于DNA的片段化。事實上，在此pH下，去嘌呤現(xiàn)象會產(chǎn)生極不穩(wěn)定的脫堿基位點，導(dǎo)致DNA序列在高溫下迅速片段化。這種類型的片段化產(chǎn)生DNA-5’磷酸片段。
凝膠分析表明，PCR擴增子在60℃的甲酸鹽緩沖液(50mM，pH3)中溫育30min可以使這些擴增子完全片段化。這就使我們可以評價在間-bioPMDAM標(biāo)記存在的情況下DNA擴增子片段化期間的標(biāo)記效果。
DNA擴增子片段化期間的標(biāo)記結(jié)果以同源性百分?jǐn)?shù)、信號及背景噪音的強度表示列于表14中。
表14以同源性百分?jǐn)?shù)、信號(I)及背景噪音(B)的強度表示的DNA擴增子的標(biāo)記和片段化本實施例說明本發(fā)明的試劑可用于標(biāo)記以兩步法酶擴增產(chǎn)生的DNA片段。也可用于標(biāo)記非擴增的天然DNA。
實施例18用Cy5-PMDAM衍生物(12a)的標(biāo)記DNA用合成的DNA片段評估具有新型標(biāo)記物的DNA標(biāo)記效果，這種新型標(biāo)記物攜帶重氮甲基功能基團。
標(biāo)記試劑Cy5-PMDAM(12a)是根據(jù)實施例2所描述的方法制備的。
按照所謂的亞磷酰胺方法制備一種20mer的寡脫氧核糖核苷酸(ODN)。用標(biāo)準(zhǔn)磷酸化試劑將一個磷酸引入到5’末端，該磷酸化試劑與亞磷酰胺化學(xué)一致。這種ODN的序列包括DNA的所有天然堿基(ODN的序列5’-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3’)。這個序列與所謂的“模型”DNA芯片的捕獲序列互補，DNA芯片的捕獲序列是根據(jù)Affymetirx的技術(shù)合成的。這種DNA芯片含有捕獲探針，該探針在序列上是一致的，并顯示芯片表面上的方格式。讀取此DNA芯片可以，根據(jù)強度而不是同源性的結(jié)果得到標(biāo)記性能的信息。
標(biāo)記將10μl的Cy5-PMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到50pmol的ODN中。最終的體積是100μl。均漿后60℃溫育30min。
純化和閱讀為了去除多余的標(biāo)記試劑，按照實施例17的方法進行純化。DNA芯片的閱讀是按照實施例17的方法進行的。
結(jié)果在DNA芯片上讀取的平均標(biāo)記強度(I)是16644rfu，背景噪音(B)是450rfu。
這一強度水平是很高的，說明標(biāo)記試劑Cy5-PMDAM(12a)完全適合于標(biāo)記磷酸基團上的DNA片段。
實施例19用PDAM試劑標(biāo)記和片段化DNA實施例19.1用1-芘基疊氮甲烷(PDAM)標(biāo)記 1-芘基疊氮甲烷PDAM從Molecular Probes(Eugene，OR)獲得，并溶于無水DMSO中。
兩種20mer的ODN用作DNA模型一種20mer的ODN含有5’-羥基，同樣的20mer的ODN在5’末端帶有一個磷酸。ODN的序列在實施例10中描述。標(biāo)記反應(yīng)在含有50％DMSO和1.5mM 1-芘基疊氮甲烷(PDAM)的混合物中進行，60℃反應(yīng)30min或1h。
標(biāo)記效率用薄層色譜(正相)評價，洗脫液為異丙醇/氨/水(60/10/30)。30min后，在ODN 5’-磷酸上的偶合反應(yīng)完成。獲得部分偶合到ODN 5’-羥基上的時間需要1h，就是說大約50％。
實施例6的結(jié)果在20個堿基的模型序列上得到證實，即末端磷酸上攜帶疊氮甲基功能基團的試劑最優(yōu)先標(biāo)記。在核苷酸內(nèi)磷酸上標(biāo)記是方便的，因為通過在核酸片段上引入多個標(biāo)記物可導(dǎo)致敏感性升高。這就使核酸與互補序列雜交時具有良好的敏感性，同時保持良好的雜交特異性。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以通過優(yōu)化反應(yīng)的條件來控制標(biāo)記的特異性，例如通過改變標(biāo)記試劑的種類，反應(yīng)時間和溫度以達到只在末端磷酸上標(biāo)記的目的。
實施例19.2用PDAM進行標(biāo)記反應(yīng)的動力學(xué)研究
本研究用20mer ODN 5’-磷酸在上述條件下進行，反應(yīng)時間加以改變。標(biāo)記效率通過反相高效液相色譜(HPLC)進行分析，條件如下5μm，220×4.6mm的反相色譜柱Spheri-5 RP-18(Perkin Elmer)。緩沖液和洗脫梯度如下·緩沖液A0.1M TEAA；緩沖液B＝50％緩沖液A+50％CH3CN，以及·梯度從10％到50％的緩沖液B，30min，1ml/min，室溫。
結(jié)果見圖9，其中x軸是以分鐘表示的反應(yīng)時間，y軸是標(biāo)記百分?jǐn)?shù)。
60℃僅溫育10min產(chǎn)率就接近90％。
實施例11.3溫度對PDAM標(biāo)記的影響用20mer ODN 5’-磷酸在上述條件下進行標(biāo)記，溫育溫度加以改變，溫育時間都是10min。
標(biāo)記產(chǎn)率通過反相HPLC進行分析。
結(jié)果見圖10，其中y軸是標(biāo)記百分?jǐn)?shù)，x軸是以℃表示的反應(yīng)溫度。
非常重要的是，即使在室溫(25℃)也觀察到有ODN的標(biāo)記。25℃溫育10分鐘后，標(biāo)記的產(chǎn)率大約為25％。溫度高于50℃，得到的產(chǎn)率大于80％。
這說明用攜帶疊氮甲基功能基團的試劑標(biāo)記DNA是有效的和靈活的。
實施例20用標(biāo)記試劑間-bioPMDAM(3a)標(biāo)記和片段化PCR擴增得到的DNA擴增子間-bioPMDAM(3a)衍生物是按照實施例1.1描述的反應(yīng)流程制備的。
DNA擴增子是按照實施例5.1描述的方法通過PCR擴增制備的。
實施例20.1經(jīng)片段化和未經(jīng)片段化標(biāo)記效果的比較a在片段化條件下的標(biāo)記將50μl甲酸鈉(pH3，50mM)和2μl間-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR產(chǎn)物中。體積調(diào)整到100μl。溶液在60℃溫育30min。
b未經(jīng)片段化的標(biāo)記將2μl間-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR產(chǎn)物中。體積調(diào)整到100μl。溶液在60℃溫育30min。
其他方法與實施例17相同。
結(jié)果
表15經(jīng)片段化和未經(jīng)片段化標(biāo)記效果的比較表15中的結(jié)果說明未片段化的平均強度與背景噪音處于同一水平(500rfu)。而片段化后得到的標(biāo)記效果(大約4000rfu)大大高于未片段化的，并且具有很好的同源性百分?jǐn)?shù)。因此兩個步驟結(jié)合確實可以明顯改善大于100核苷酸長的核酸的檢測。
實施例20.2在DNA芯片上雜交前變性的影響分別在兩個試管中平行進行兩個標(biāo)記反應(yīng)，方法如下將50μl甲酸鈉緩沖液(pH3，50mM)和2μl間-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR產(chǎn)物中?？傮w積調(diào)整到100μl，溶液在60℃溫育30min。
在色譜柱上純化后(實施例17)，第一管所得到的溶液在95℃溫育10min(為了使開DNA雙鏈不成對)，然后將試管浸在0℃的冰-水中直到在DNA芯片上雜交。
第二管所得到的溶液不預(yù)先變性而直接在DNA芯片上雜交。
與DNA芯片表面的捕獲探針雜交的生物素化的片段通過引入標(biāo)記PE的鏈霉抗生物素蛋白顯示，反應(yīng)條件如實施例17所描述。
結(jié)果
表16在DNA芯片上雜交前變性的影響所得到的結(jié)果列在表16中，雜交前變性所得到的結(jié)果要高于未變性的。這說明DNA變性是必需的，以得到良好的強度水平。通過脫堿基位點進行片段化是一種促進雙鏈DNA變性的方式，可以增強DNA與捕獲探針雜交的能力。
為了檢驗其他標(biāo)記試劑和考慮到用上述各種條件所得到的結(jié)果，我們設(shè)計了一個參考試驗方案，采用甲酸鈉緩沖液(pH3，50mM)片段化以及雜交前變性步驟。
實施例21以一步方案用生物素化的試劑標(biāo)記和片段化PCR擴增子按照實施例1.1，1.2和1.3描述的方案制備間-bioPMDAM、鄰-bioPMDAM和對-bioPMDAM。它們都溶于無水DMSO中，濃度為100mM。
方案與上述實施例20.2所描述的相同(經(jīng)過雜交前變性后一步標(biāo)記和片段化)。
結(jié)果
表17以一步方案用生物素化的試劑標(biāo)記和片段化PCR擴增子用優(yōu)化的方案以一個步驟進行片段化和標(biāo)記得到極佳的結(jié)果，含有活性疊氮甲基功能基團的各種標(biāo)記試劑所得到的結(jié)果都很好，如表17中所示。
實施例22用BioDPDAM標(biāo)記和片段化DNA按照實施例5.1所描述的方法通過PCR擴增制備DNA擴增子。
標(biāo)記試劑的合成見實施例1的描述。
方案與實施例20.2所述的相同，包括在雜交前95℃變性。
結(jié)果
表18用BioDPDAM標(biāo)記和片段化DNA表18描述的結(jié)果說明，用與苯基同樣重要的基團取代也可優(yōu)化攜帶疊氮甲烷功能基團標(biāo)記試劑的反應(yīng)性。
實施例23用5-(溴甲基)熒光素標(biāo)記和片段化DNA按照實施例5.1所描述的方法通過PCR擴增制備DNA擴增子。
將50μl甲酸鈉(pH3，50mM)和2μl 5-(溴甲基)熒光素(Molecular probes，Eugene，OR)(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR產(chǎn)物中。體積調(diào)整到100μl，溶液在60℃溫育30min。
純化條件與實施例17的相同。變性步驟按實施例20.2描述的方案進行。
雜交和閱讀的其他條件與文獻A.Troesch等，J.Clin.Microbiol.，37(1)49-55，1999描述的相同。熒光素可以在閱讀器上直接檢測。
表19用5-(溴甲基)熒光素標(biāo)記和片段化DNA表19中的結(jié)果說明，通過產(chǎn)生脫堿基位點的DNA片段化完全適合于攜帶活性鹵烷基功能基團的標(biāo)記試劑。試驗以一個步驟進行(片段化和標(biāo)記)，但是標(biāo)記的強度比用攜帶疊氮甲基功能基團的標(biāo)記物要低。
實施例24在另一種衍生于菲咯啉的化學(xué)片段化試劑存在的情況下標(biāo)記和片段化DNA擴增子按照實施例5.1所描述的方法通過PCR擴增制備DNA擴增子。使用的兩種類型的條件條件a將20μl菲咯啉-FeSO4和2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR產(chǎn)物中?？傮w積調(diào)整到100μl，混合物在95℃溫育60min。
條件b將50μl甲酸鈉緩沖液(pH3，100mM溶于純水中)和2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR產(chǎn)物中?？傮w積調(diào)整到100μl，混合物在95℃溫育60min。
其他條件與實施例17相同。
表20在菲咯啉存在的情況下標(biāo)記和片段化DNA擴增兩種片段化的條件都得到了滿意的結(jié)果，如表20所示。
最好的結(jié)果是用酸性pH下片段化的條件(b)得到的。
實施例25通過摻入d-UTP-熒光素標(biāo)記的PCR擴增子的片段化標(biāo)記核苷酸的摻入按照下面的方案進行PCR擴增以產(chǎn)生有熒光素標(biāo)記的PCR擴增子(標(biāo)記在堿基上)。
以16S結(jié)核分枝桿菌基因組DNA靶(10+4拷貝)為起始，用Roche的Fast Start試劑盒，加入0.2mM的脫氧核糖核苷酸d-ATP、d-CTP和d-GTP，以及0.14mM d-TTP和0.06mM dUTP-12-熒光素，0.3μM的引物和0.4μl的酶。標(biāo)記核苷酸占其天然同源物d-UTP的30％。這個比例一般用于通過摻入標(biāo)記核苷來標(biāo)記擴增子的反應(yīng)。
dUTP-12-熒光素是從Roche Diagnostics購買的，參考目錄1373242，Mannheim，Germany。
PCR的參數(shù)與實施例5相同。
a.用30％dUTP-12-熒光素標(biāo)記的PCR擴增子的片段化將50μl甲酸鈉緩沖液(pH3，50mM)加入到10μl PCR產(chǎn)物中。體積調(diào)整到100μl，溶液在60℃溫育30min。
b.含30％dUTP-12-熒光素的PCR擴增子片段化期間的標(biāo)記將50μl甲酸鈉緩沖液(pH3，50mM)和2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR產(chǎn)物中。體積調(diào)整到100μl，然后將溶液在60℃溫育30min。這個試驗與參考方案一致，因此有可能通過省去由于擴增步驟造成的易差性來比較各種標(biāo)記策略。
所有試驗組在色譜柱上的純化步驟和變性步驟都在95℃進行，如實施例17所述。
方案(a1)d-UTP-12-熒光素標(biāo)記的擴增子經(jīng)片段化得到的核酸(條件a)在DNA芯片上雜交，首先通過直接讀取熒光素發(fā)射的熒光信號檢測，如實施例15所描述的。
方案(a2)信號放大步驟用于提高標(biāo)記的敏感性。信號的放大通過在雜交步驟期間摻入生物素活化的抗熒光素抗體(參考目錄216-065-084，Jackson ImmunoResearch)進行，然后加入PE標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白，所用的連續(xù)條件如下·300μl純水，·300μl 100mM Tris緩沖液pH7/1M NaCl/0.05％Tween/0.005％消泡劑，2.4μlBSA(50mg/ml)，1.2μl生物素化的抗熒光素抗體(1mg/ml)，·300μl純水，以及·300μl 100mM Tris緩沖液pH7/1M NaCl/0.05％ Tween/0.005％消泡劑；6μlBSA(50mg/ml)；6μl鏈霉抗生物素蛋白-PE(300μg/ml)。
在本方案中，熒光素是作為半抗原(可用標(biāo)記抗體間接檢測的示蹤劑)而不是熒光團。
方案(b)
在DNA芯片上雜交的生物素化的片段(條件b)通過引入標(biāo)記PE的鏈霉抗生物素蛋白顯示，所用條件如下·300μl純水，和·300μl 100mM Tris緩沖液pH7/1M NaCl/0.05％ Tween/0.005％消泡劑；6μlBSA(50mg/ml)，6μl標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(300μg/ml)。
標(biāo)記和雜交后DNA芯片表面發(fā)射的熒光以及信號強度和同源性百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)用Affymetrix所提供的閱讀系統(tǒng)及軟件(GeneChip Instrument System和GeneChipInformation System，Santa Clara CA)進行閱讀。在此需要注意的是，所用的閱讀系統(tǒng)含有兩個過濾裝置，因此可以直接檢測·按照方案a1或其他方法僅標(biāo)記d-UTP-熒光素的擴增子檢測熒光素·如果擴增子按照下列方法標(biāo)記則檢測PE—按照方案a2用d-UTP-熒光素標(biāo)記信號的放大，或—按照方案b在片段化期間用間-bioPMDAM標(biāo)記。
在兩種情況下顯示都是用PE進行的，使用過濾器可以省去熒光素產(chǎn)生的信號，確保被檢測到的是PE信號。
結(jié)果
*Flu＝熒光素，PE＝藻紅蛋白表21通過摻入d-UTP-熒光素標(biāo)記的PCR擴增子的片段化上面表21所顯示的結(jié)果表明，利用產(chǎn)生脫堿基位點的方法進行的化學(xué)片段化適合于DNA擴增子的酶促標(biāo)記，標(biāo)記可在片段化前進行。
通過酶促摻入熒光團得到的信號強度水平和同源性百分?jǐn)?shù)要低于在片段化期間用含有疊氮甲基功能基團的標(biāo)記試劑如間-bioPMDAM(條件b)標(biāo)記得到的信號強度水平和同源性百分?jǐn)?shù)。
為到與用-bioPMDAM衍生物標(biāo)記得到的信號強度水平就需要信號放大步驟(條件a2)。這表明疊氮甲基活性功能基團的效率確實與傳統(tǒng)的摻入修飾堿基如d-UTP-熒光素(參見方案(b))所達到的效率相對應(yīng)。
實施例26用超聲法使雙鏈DNA片段化用實施例5.1所描述的方法得到DNA擴增子。在標(biāo)記物存在和缺失的情況下用超聲法將這些擴增子片段化。
a.超聲期間標(biāo)記DNA擴增子將2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR產(chǎn)物中。用純水將體積調(diào)整到100μl，pH調(diào)節(jié)到6.5?；旌衔镌诔暼萜?頻率35kHz，型號T460-H，Bioblock，F(xiàn)rance)浴中6O℃溫育30min。
b.在PCR擴增子的化學(xué)片段化期間標(biāo)記(一步法參考方案)將50μl甲酸鈉緩沖液(pH3，50mM)和2μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR產(chǎn)物中。體積調(diào)整到100μl，溶液在60℃溫育30min。
試驗從兩份平行進行以便能在凝膠上分析DNA的片段化，并通過DNA芯片的雜交和閱讀來分析標(biāo)記的效率，如上面所描述的(實施例17有關(guān)PE的檢測)。
凝膠分析分析采用溴化乙啶染色的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(8％聚丙烯酰胺，7 M尿素，1×TBE)。
凝膠分析表明經(jīng)過60℃超聲處理后DNA擴增子已經(jīng)被片段化。
結(jié)果
表22用超聲法便雙鏈DNA片段化表22的結(jié)果說明，在超聲期間的標(biāo)記(條件a)是令人滿意的。這說明通過超聲將DNA進行物理片段化適合于用攜帶疊氮甲基功能基團的標(biāo)記試劑標(biāo)記。
本試驗中出現(xiàn)弱的標(biāo)記結(jié)果可能是由于超聲的作用下導(dǎo)致標(biāo)記物降解。而通過酸性pH的作用產(chǎn)生脫堿基位點的片段化則結(jié)果更好。
實施例27以一步法標(biāo)記、片段化及變性DNA按照實施例5.1所描述的方法通過PCR擴增制備DNA擴增子。
兩種標(biāo)記反應(yīng)如下a.在95℃下以一步法標(biāo)記、片段化和變性將50μl甲酸鈉緩沖液(pH3，50mM)和2μl間-BioPMDAM標(biāo)記物(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR產(chǎn)物中。終體積調(diào)整到100μl，溶液在95℃溫育30min。本試驗中反應(yīng)混合液不經(jīng)過預(yù)先純化就在DNA芯片上雜交。
b.60℃下標(biāo)記和片段化將50μl甲酸鈉緩沖液(pH3，50mM)和2μl間-BioPMDAM標(biāo)記物(3d)(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR產(chǎn)物中。終體積調(diào)整到100μl，溶液在60℃溫育30min。然后反應(yīng)混和液按照上面所描述的方法純化。本試驗中在DNA芯片上雜交前，按照實施例20.2描述的方法使片段變性。
結(jié)果
表23以一步法標(biāo)記、片段化及變性DNA實施例20.2證明了變性對于雙鏈DNA檢測敏感性的重要性。表23中的結(jié)果表明，用通過產(chǎn)生脫堿基位點的片段化方法，DNA的標(biāo)記、片段化和變性可以在一步中完成，從簡易性及節(jié)約操作者時間的觀點來看這是一個值得注意的改進，并且不會影響檢測的敏感性。
4-羧基苯甲醛的保護4-羧基苯甲醛是從市場上購買的。將其(3g；20mmol)溶于含有三甲基甲硅烷基氯(10g；92mmol)的100ml MeOH溶液中。混合物在室溫攪拌40h。蒸發(fā)后分離白色固體為4-甲氧基羧基苯甲醛24，用NMR鑒定，然后用于下一步的反應(yīng)。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝10.07(s，1H，-CHO)；8.17(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)，7.92(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；3.93(s，3H，CO-O-CH2)。
4-甲氧基羰基苯甲醛的保護在有Dowex 50WX8-100(1g)的情況下，4-甲氧基羰基苯甲醛(3.35g；20mmol)用三甲基原甲酸酯(4.8g；40mmol)溶解?；旌衔镌诨亓飨录訜?h，然后過濾并蒸發(fā)。經(jīng)過重結(jié)晶試驗后，NMR分析表明反應(yīng)是不完全的，因此重新在30ml MeOH，30ml CH(Ome)3和1g Dowex 50WX8-100中室溫下反應(yīng)。然后過濾和蒸發(fā)得到3.55g(16.89mmol，84％)的產(chǎn)物25。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.01(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.50(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；5.41(s，1H，CH)；3.93(s，3H，-CO-O-CH3)；3.29(s，6H，-O-CH3)。
化合物26化合物25(3.1g；14.8mmol)溶于16ml(73mmol)4，7，10-三噁-1，13-三癸二胺中。溶液在140-150℃加熱2h。然后將混合物溶于100ml DCM(二氯甲烷或CH2Cl2)，用10ml水洗滌6次。有機相通過MgSO2干燥，然后蒸發(fā)直到獲得油性物。將這種油性物用傾瀉法連續(xù)用戊烷洗滌3次，然后用DCM和水抽提。經(jīng)過MgSO2干燥和蒸發(fā)后分離出產(chǎn)物26，產(chǎn)率為63％(9.27mmol)。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.78(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.46(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；5.39(s，1H，CH)；3.62-3.47(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5‘，13’和H3‘)；3.29(s，6H，-O-CH3)；2.72(m，2H，H15’)1.87(m，2H，H4’)；1.64(m，2H，H14’)；1.30(寬s，2H，NH2)。
生物素化的化合物27將生物素(500mg；2.05mmol)懸浮于10ml DMF中，然后加入365mg(2.25mmol)CDI。溶液在室溫下持續(xù)攪拌30min。將化合物26(900mg；2.26mmol)溶于1ml DMF中，然后一點一點地加到上述溶液中?；旌衔镌谑覝爻掷m(xù)攪拌1h。蒸發(fā)后通過急驟層析純化，所用的色譜柱為20mm直徑，洗脫液為250ml MeOH-DCM 6％，然后是200ml MeOH-DCM 7％，最后是200ml MeOH-DCM 8％。產(chǎn)物27的相應(yīng)組分混和后蒸發(fā)至干，得到1.00g油性物，產(chǎn)率約為50％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝9.50(寬s，1H，NH咪唑)；7.80(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.64(s，1H，H咪唑)；7.46(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5和1H，NH2‘)；7.05(S，2H，H咪唑)；6.76(t，1H，NH16)，6.20(寬s，1H，NHB1)；5.44(寬s，1H，NHB3)；5.37(s.1H，CH)；4.42(m，1H，HB6a)；4.24(m，1H，HB3a)；3.59-3.44(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3’)；3.29(m，8H，H15’和2-O-CH3)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.66(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.13(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.85(m，2H，H4’)；1.66(m，2H，H14’)；1.40-1.37(m，6H，HB7，B8， B9)。
醛化合物28乙縮醛27溶于50ml氯仿中，然后加入20ml 2N HCl。兩相混和物劇烈攪拌15min。有機相回收，用無水NaHCO3干燥。過濾并蒸發(fā)后得到膏狀化合物28(495mg；0.855mmol)，根據(jù)生物素計算總產(chǎn)率為42％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝10.05(s，1H，CHO)；7.98(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.92(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.58(t，1H，NH2)；6.46(t，1H，NH16)，6.02(寬s，1H，NHB1)；5.19(寬s，1H，NHB3)；4.46(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；3.66-3.56(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.50-3.29(m，4H，H3’，13’)；3.28(m，2H，H15’)；2.95(m，1H，HB4)；2.84和2.71(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.15(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.89(m，2H，H4’)；1.72-1.63(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.23(m，2H，HB8)。
腙化合物29將醛化合物18(495mg；0.855mmol)溶于10ml無水乙醇中。加入肼(350μl；7.20mmol)，然后將反應(yīng)混合物在回流下加熱1h。蒸發(fā)后得到的油性物溶于無水乙醇中以便再次蒸發(fā)。用戊烷研磨后得到泡狀物。膏狀產(chǎn)物29(511mg；0.862mmol)的產(chǎn)率為100％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.76(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.72(s，1H，CH)；7.56(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.34(t.1H，NH2’)；6.45(t，1H，NH16)；5.98(寬s，1H，NHB1)；5.78(寬s，2H，NH2)；5.18(寬s，1H，NHB3)；4.44(m，1H，HB6a)；4.26(m，1H，HB3a)；3.62-3.56(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.48-3.45(m，4H，H3’，13’)；3.27(m，2H，H15’)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.68(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.11(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.86(m，2H，H4’)；1.72-1.59(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.21(m，2H，HB8)。
重氮基化合物30將腙化合物29(357mg；0.602mmol)溶于17.5ml DMF中，然后加入MnO2(700mg；7.7mmol)。室溫下攪拌12min后，將混合物用含有硅藻土(厚度2cm)和3(0.5cm)粉狀分子篩的微孔過濾。反應(yīng)混合物蒸發(fā)到干燥。得到的殘留油性物用乙醚連續(xù)洗三次。得到淡粉紅色固體化合物30(290mg，0.491mmol)，產(chǎn)率為82％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝8.28(t，1H，NH2’)；7.77(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.74(t，1H，NH16’)；7.00(d，2H.J＝8HZ，Ar-H3，5)；6.38(寬S，1H，NHB1)，6.32(寬s，1H，NHB3)；5.80(s，1H，CH-N2)；4.27(m，1H，HB6a)；4.11(m，1H，HB3a)；3.51-3.44(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.37(m，2H，H15’)；3.32(m，4H，H3’，13’)；3.05(m，1H，HB4)；2.79和2.58(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.02(t，2H，J＝8HZ，HB10)；1.69(m，2H，H4’)；1.59-1.48(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.25(m，2H，HB8)。
化合物30的反應(yīng)性用尿嘧啶3’-單磷酸測試，用毛細(xì)管電泳監(jiān)測。分析條件與實施例6.1相同。結(jié)果顯示化合物的半衰期是45分鐘。試劑在-20℃下至少可以穩(wěn)定1個月。
實施例29用標(biāo)記試劑對-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記和片段化DNA擴增子這種類型的分子，也就是攜帶基于聚乙二醇連接臂的PDAM衍生物的主要優(yōu)點是其可以使疊氮功能基團和生物素保持分離，因而增加了溶解性，并且在最后的分析中這些分子的反應(yīng)性得到提高。
對-Bio-EG3-PDAM衍生物30是按照實施例28描述的反應(yīng)流程得到的。DNA擴增子是按照實施例5.1描述的方法制備的。兩種標(biāo)記反應(yīng)方法如下。
a.用對-Bio-EG3-PDAM試劑標(biāo)記將10μl對-Bio-EG3-PDAM(100 mM，溶于DMSO中)和77μl無DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR產(chǎn)物中。溶液是均勻的，沒有沉淀。將溶液在95℃溫育10min，然后加入3μl 0.1M HCl，溶液于95℃溫育10min。
其余方法與實施例8相同。
b.用間-BioPMDAM試劑標(biāo)記將10μl間-Bio-EG3-PDAM(100mM，溶于DMSO中)和77μl無DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR產(chǎn)物中。這種產(chǎn)物的合成在實施例1.1中已經(jīng)提及。溶液出現(xiàn)輕微沉淀。將溶液在95℃溫育10min，然后加入3μl 0.1M HCl，溶液于95℃溫育10min。
其余方法與實施例8相同。
結(jié)果
表24用對-Bio-EG3-PDAM和間-BioPMDAM標(biāo)記和片段化DNA擴增子的比較研究表24中得到的信號強度是很滿意的，同源性百分?jǐn)?shù)是高的。結(jié)果說明將聚乙二醇臂引入到疊氮標(biāo)記分子上可以增加試劑的水相溶解度。因此試驗均一。而且溶解度的增加可以提高標(biāo)記物的反應(yīng)性。
實施例30其他含有基于聚乙二醇連接臂的PDAM衍生物的合成實施例30.1間-Bio-EG3-PDAM的合成
合成流程 化合物683-氨基苯乙酮(14.5g，107mmol)溶于50ml無水DMF中。加入琥珀酐(10.7g，107mmol)，混合物在室溫下通氬氣持續(xù)攪拌。6h后將溶液抽真空濃縮，加入50ml甲醇。得到的沉淀物過濾并用甲醇和乙醚洗滌。得到粉末狀的19.4g(81％)產(chǎn)物68，其顏色為米色。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝2.5-2.6(m，7H)；7.45(t，1H)；7.64(d，1H)；7.83(d，1H)；8.19(s，1H)；10.16(S，1H)；12.12(s，1H)。
化合物69在氬氣下將5.07g(22 mmol)化合物68溶于10ml無水DMF中?；旌衔镏糜诒希尤?.00g(32mmol)羰基二咪唑。20min后，緩慢加入20ml(94.6mmol)4，7，10-三噁十三烷二胺(EG3)。室溫反應(yīng)3小時后，將DMF蒸發(fā)掉，殘留物收集到100mlCH2Cl2中。用飽和NaHCO3和水抽提，然后用無水Na2SO4干燥有機相，蒸發(fā)溶劑。由此得到4.34g(46％)產(chǎn)物69。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝1.59(m，2H)；1.87(m，2H)；2.16(S，3H)；2.40(m，2H)；2.55(m，2H)；3.08(m，2H)；3.45(m，16H)；7.30(t，1H)；7.42(d，1H)；7.70(d，1H)；7.83(t，1H)；7.97(s，1H)；10.00(s，1H)。
生物素化的化合物70在氬氣下將D-生物素(1.0g，4.1mmol)溶于10ml無水DMF中?；旌衔镌诒侠鋮s，加入溶于10ml無水DMF中的羧基二咪唑(CDI)(0.665g，4.1mmol)。15min后，加入溶于2ml無水DMF中的化合物69(1.8g，4.1mmol)。在35℃反應(yīng)3h，然后蒸發(fā)DMF，殘留物收集到100ml CH2Cl2中。用飽和NaHCO3和水抽提，然后用無水Na2SO4干燥有機相，蒸發(fā)溶劑。產(chǎn)物的NMR特征表明所得到的是產(chǎn)物70和游離EG3的混合物。在繼續(xù)合成前進行另一純化步驟。
按照實施例1描述的方法兩個合成步驟后得到最終的化合物間-Bio-EG3-PMDAM。
本合成方法的優(yōu)點有兩個。其一，只需兩步就得到產(chǎn)物69；這個產(chǎn)物可用作疊氮基的前體通過末端的胺基連接到不同性質(zhì)的可檢測分子上。這個基團也可以將化合物69嫁接到固相支持物上。其二，化合物71與間-Bio-PMDAM(我們的參照分子)具有相同的活性中心，這有利于分析優(yōu)先連接于乙烯甘油(EG3)臂的內(nèi)含物。
本試劑在-20℃下至少穩(wěn)定1個月。
實施例30.2間-Bio-EG4-PMDAM的合成合成流程
3-硝基苯乙酮13的保護將33g(0.20mol)3-硝基苯乙酮溶于400ml甲苯中，然后加入40ml(0.717mol)乙二醇和600mg(3.15mmol)對-甲苯磺酸(PTSA)。置于Dean Stark系統(tǒng)中。溶液在130℃加熱3h。溶液的溫度降到室溫后，加入400ml乙酸乙酯，然后用8ml飽和NaHCO3溶液洗滌。有機相用MgSO4干燥。蒸發(fā)后得到淺黃色固體13(39.72g；0.190mol)，產(chǎn)率為95％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.11(t，1H，J＝8Hz.Ar-H)；6.87-6.78(m，2H，Ar-H)；6.59(dd，1H，J＝6.5Hz，Ar-H)；4.00(m，2H，H2c乙縮醛)；3.79(m，2H，H2c乙縮醛)；1.61(S，3H，CH3)。
胺14的制備將化合物13(39.7g；0.190mol)溶于500ml乙醇中，然后加入1g 10％的附在碳上的鈀?；旌衔锛訜嵋允蛊渫耆芙?，然后使溶液降到室溫。抽真空后將溶液置于H2下，持續(xù)劇烈攪拌5h。然后將溶液在熱的狀態(tài)下過濾并蒸發(fā)。產(chǎn)物14用戊烷洗滌，分離出固體形式的產(chǎn)物(34g；0.189mol)，產(chǎn)率為99％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.14(t，1H，J＝8Hz，Ar-H)；6.85(m，2H，J＝7.5Hz，Ar-H)；6.79(s，1H，Ar-H)；6.59(dd，1H，J＝6.5Hz，Ar-H)；4.00(m，2H，H2c乙縮醛)；3.77(m，2H，H2c乙縮醛)；1.61(S.3H，CH3)。
溴化的化合物15胺14(12.3g；68.7mmol)和三乙胺(7g；69mmol)在氬氣下溶于150ml DCM。在-5℃下滴加溶于150ml DCM中的13.8g(60mmol)溴乙酰溴溶液。在添加結(jié)束時加入100ml 1N NaHCO3水溶液。有機相用NaHCO3水溶液連續(xù)洗滌兩次并用MgSO4干燥。蒸發(fā)至干后得到22.6g褐色油性物就是化合物15，用于下一步的反應(yīng)。1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.29(寬s，1H，NH)；7.62(dt，1H4，J＝5Hz，Ar-H)；7.47(s，1H，Ar-H2)；7.38-7.19(m，2H，Ar-H5，6)；4.00(m，2H，Br-CH2)；3.75(m.4H，H2C-H2c乙縮醛)；1.61(s，3H，CH3)。
乙醇化合物16氫化鈉(3.3g；82.5mmol)用戊烷洗滌三次，然后懸浮于150ml THF中，在室溫下加入四乙二醇(50ml；0.29mol)。溶液持續(xù)攪拌15min，然后冷卻到-5℃。
將化合物15預(yù)先滴加稀釋到25ml THF中?；旌衔锍掷m(xù)攪拌30min以使其降到室溫。將溶液濃縮到100ml，然后用500ml CHCl3中稀釋。有機相用250ml 1N的NaHCO3水溶液連續(xù)洗滌三次，然后蒸發(fā)前用MgSO4干燥。產(chǎn)物在二氧化硅柱(柱直徑65mm)上通過急驟層析純化，洗脫液為1.5 1 MeOH-DCM 5％，然后是500ml MeOH-DCM 7％，最后是500ml MeOH-DCM 10％。化合物16相應(yīng)的組分混和在一起蒸發(fā)至干，得到17.4g(42.1mmol)產(chǎn)物，產(chǎn)率為61％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.86(寬s，1H，NH)；7.71(d，1H，J＝7.5Hz，Ar-H4)；7.51(s，1H，Ar-H2)；7.29-7.24(m，2H，Ar-H5，6)；4.09(m，2H，CO-CH2-O)；3.99(m，2H，H2c乙縮醛)；3.72-3.53(m，20H，O-CH2-CH2-O，H2c乙縮醛和HO-CH2)；1.61(s，3H，CH3)。
甲苯磺酸鹽化合物17將乙醇16(4.13g；10.0mmol)溶于5ml吡啶中。然后在室溫下加入2.0g(10.5mmol)甲苯磺酰氯?；旌臀镌跉鍤庀聰嚢?0h。溶液用100ml DCM稀釋，有機相用20ml 1N的NaHCO3水溶液洗滌三次，然后在與甲苯共蒸發(fā)前用MgSO4干燥。產(chǎn)物通過急驟層析純化，色譜柱直徑50mm，洗脫液為500ml MeOH-DCM 2％，然后是500mlMeOH-DCM 3％，最后是500ml MeOH-DCM 4％。產(chǎn)物17的相應(yīng)組分混和后蒸發(fā)至干，得到3.68g(6.48mmol)油性物，產(chǎn)率約為65％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.86(寬s，1H，NH)；7.76(d，4H，J＝5.5Hz，Ar-H甲苯磺酰)；7.60(d，1H，J＝7.5Hz，Ar-H4)；7.50(s，1H，Ar-H2)；7.32-7.22(m，2H，Ar-H5，6)；4.10(m，2H，CO-CH2-O)；4.00(m，2H，H2C乙縮醛)；3.73-3.54(m，20H，O-CH2-CH2-O，H2c乙縮醛和HO-CH2)；2.42(s，3H，Ar-CH3)；1.61(s，3H，CH3)。
鄰苯二甲酰亞胺化合物18甲苯磺酸鹽化合物17(3.68g；6.48mmol)用1.52g(10.0mmol)DBU(1，8-疊氮二環(huán)[5.4，0]十一碳烯)溶解，然后加入鄰苯二甲酰亞胺(1.47g；10mmol)。所得到的溶液在85-90℃加熱17h，然后蒸發(fā)。產(chǎn)物在二氧化硅柱(柱直徑65mm)上通過急驟層析純化，洗脫液為11丙酮-DCM 15％，然后是1l丙酮-DCM 20％。化合物18相應(yīng)的組分混和在一起蒸發(fā)至干，得到3.15g(5.8mmol)產(chǎn)物，產(chǎn)率為90％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.73(寬S，1H，NH)；7.79(m，2H，Ar-H鄰苯(phtha))；7.99(m，2H，Ar-H鄰苯(phtha)和Ar-H4)；7.49(s，1H，Ar-H2)；7.27-7.18(m，2H，Ar-H5，6)；4.10(m，2H，CO-CH2-O)；4.00(m，2H，H2c乙縮醛)；3.69-3.56(m，20H，O-CH2-CH2-O，H2c乙縮醛和N鄰苯(phtha)-CH2)；1.61(s，3H，CH3)。
胺化合物19產(chǎn)物18在75-80℃回流下加熱溶于20ml無水乙醇中。然后加入肼(1.07ml；22.1mmol)，混合物持續(xù)攪拌1h 15min。沉淀物在燒結(jié)玻璃上過濾并蒸發(fā)掉乙醇相。然后用DCM洗滌白色沉淀物并蒸發(fā)掉DCM相。得到的黃色油性物(2.3g；5.57mmol)直接用于下一步的反應(yīng)，即使含有咪唑也可以在隨后的乙縮醛去保護步驟中去除。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.83(寬s，1H，NH)；7.69(d，1H，J＝7.5HZ，Ar-H4)；7.51(s，1H，Ar-H2)；7.30-7.19(m，2H，Ar-H5，6)；4.10(m，2H，CO-CH2-O)；4.00(m，2H，H2c乙縮醛)；3.69-3.56(m，20H，O-CH2-CH2-O，H2c乙縮醛和H2N-CH2)；1.61(s，3H，CH3)。
生物素化的化合物20將D-生物素(1.05g；4.32mmol)溶于10ml無水DMF中。在氬氣下加入790mg(4.87mmol)羰基二咪唑(CDI)。攪拌10min后加入稀釋在5ml DMF中的胺19。溶液持續(xù)攪拌40min，然后在通過急驟層析純化前蒸發(fā)。
所用色譜柱直徑為50mm，洗脫液為500ml MeOH-DCM 5％，然后是500ml MeOH-DCM10％，最后是500ml MeOH-DCM 15％?；衔?0相應(yīng)的組分混和在一起蒸發(fā)至于，得到黃色油性物(1.66g；2.6mmol)。
根據(jù)NMR譜可知，得到的黃色油性物(2.4g)含有重量約為30％的咪唑。由此可以推斷出產(chǎn)物20的產(chǎn)率相對于起始生物素約60％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.80(寬s，1H，NH)；7.66(m，3H，Ar-H4和H咪唑)；7.54(s，1H，Ar-H2)；7.28-7.24(m，2H，Ar-H5，6)；7.07(s，2H，H咪唑)，6.59(t，1H，NH15’)；6.06(寬s，1H，NHB1)；5.19(寬s，1H，NHB3)；4.45(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；4.10(s，2H，H3’)，4.00(m，2H，H2c乙縮醛)；3.75-3.49(m，18H，O-CH2-CH2-O和H2c乙縮醛)；3.36(m，2H，H14’)；3.09(m，1H，HB4)；2.85和2.66(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.16(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.61(S，3H，CH3)；1.59-1.3(m，6H，HB9，B8，B7)。
酮化合物21將乙縮醛化合物20溶于80ml氯仿中，然后加入30ml 2N HCl。混合物持續(xù)劇烈攪拌45min。有機相回收然后用無水NaHCO3干燥。過濾后將溶液蒸發(fā)，得到的油性物用戊烷洗滌，得到產(chǎn)物21(1.48g；2.48mmol)，產(chǎn)率為99％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.99(寬s，1H，NH)；8.07(s，1H，Ar-H2)；7.98(d，2H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.66(d，2H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.42(t，2H，J＝8Hz，Ar-H5)；6.38(t，1H，NH15’)；5.78(寬s，1H，NHB1)；4.96(寬s，1H，NHB3)；4.47(m，1H，HB6a)；4.29(m，1H，HB3a)；4.13(s，2H，H3’)；3.76-3.37(m，16H，O-CH2-CH2-O)；3.32(m，2H，H14’)；3.11(m，1H，HB4)；2.89和2.75(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.59(s，3H，CH3)；2.16(t，2H，J＝8 Hz，HB10)；1.64-1.40(m，6H，HB9，B8，B7)。
腙化合物22將酮化合物21溶于20ml無水乙醇中?；旌衔镌?5-80℃回流加熱。然后加入肼(816μl；16.81mmol)，混合物持續(xù)攪拌3h。過濾后將混合物蒸發(fā)至干，殘留物重新溶于乙醇中直到出現(xiàn)厚的白色泡沫。在第二個例子中，將此泡沫溶于50ml氯仿中，然后加入20ml飽和的NaHCO3溶液。混合物充分洗滌后回收有機相。用無水Na2CO2干燥，過濾蒸發(fā)至干后得到新的黏性泡沫。后者就是產(chǎn)物22(842mg；1.38mmol)，產(chǎn)率為66％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.81(寬s，1H，NH)；8.82(s，1H，Ar-H2)；7.64(d，2H.J＝8Hz，Ar-H4)；7.32(m，4H，Ar-H5，6)；6.43(t，1H，NH15’)；5.89(寬s，1H，NHB1)；5.46(寬s，2H，NH2)；4.99(寬s，1H，NHB3)；4.44(m，1H，HB6A)；4.27(m，1H，HB3a)；4.11(s，2H，H3’)；3.70-3.37(m，16H，O-CH2-CH2-O)；3.32(m，2H，H14’)；3.08(m，1H，HB4)；2.87和2.67(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.11(m，5H，CH3和HB10)；1.64-1.40(m，6H，HB9，B8，B7)。
疊氮化合物23將腙化合物22(100mg；0.164mmol)在氬氣下溶于1ml DMF中。加入80mg活化的MnO2，混合物持續(xù)劇烈攪拌30min?；旌衔锿ㄟ^含硅藻土(3cm)-粉狀分子篩(1cm)復(fù)合層過濾。然后將溶液蒸發(fā)至干。在蒸發(fā)結(jié)束時得到的油性物磨碎直到得到粉紅色粉末，該粉末就是化合物23(78mg；0.128mmol；78％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝9.60(寬s，1H，NH)；7.89(S，1H，Ar-H2)；7.76(t，1H，NH15’)；7.35-7.25(m，4H，Ar-H5，6)；6.64(d，2H，J＝8Hz，Ar-H4)；6.36(寬s，1H，NHB1)；6.32(寬s，1H，NHB3)；4.28(m，1H，HB6a)；4.08(m，1H，HB3a)；4.06(s，2H，H3’)；3.55-3.31(m，16H，O-CH2-CH2-O)；3.17(m，2H，H14’)；3.08(m，1H，HB4)；2.80和2.59(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.13(m，5H，CH3)；2.13(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.99-1.30(m，6H，HB9，B8，B7)。
檢測化合物23在尿嘧啶3’-單磷酸上的反應(yīng)性，并用毛細(xì)管電泳監(jiān)測。分析條件與實施例6.1一致。結(jié)果顯示其半衰期是30min。
該試劑在-20℃的穩(wěn)定性大于1個月。
實施例30.3對-Bio-EG3-PMDAM的合成合成流程
·4-乙酰苯甲酸的保護將4-乙酰苯甲酸(1g；6.1mmol)溶于含5ml MeOH的三甲基甲硅烷基氯化物溶液(TMSCl，10g；92mmol)中。
混合物90℃加熱過夜。蒸發(fā)后得到白色固體化合物31(1.21g；5.75mmol)。通過NMR鑒定其特征并用于下一步的反應(yīng)。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.08(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.59(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；3,18(s，6H，-O-CH3)；1.53(s，3H，CH3)。
化合物32在有Dowex 50WX8-100(0.3g)的情況下，將化合物31(1.21g；5.75mmol)溶于5ml三甲基原甲酸酯中。混合物60℃加熱過夜，然后過濾蒸發(fā)得到化合物32(1.19g；5.3mmol)，產(chǎn)率為87％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.00(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.54(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；3.89(s，1H，CO-O-CH3)；3.16(8，6H，-O-CH3)；1.51(s，3H，CH3)。
化合物33
將化合物32(1.17g；5.22mmol)溶于5ml(22.7mmol)4，7，10-三噁-1，13-十三烷二胺中。得到的溶液140℃加熱4h。然后將混合物溶于30ml DCM中，用10ml水洗滌三次。有機相用MgSO4干燥，然后蒸發(fā)直到得到油性產(chǎn)物33(1.44g；3.49mmol)，產(chǎn)率為67％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.76(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.51(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；3.62-3.47(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3’)；3.15(s，6H，-O-CH3)；2.73(m，2H，H15’)1.88(m，2H，H4’)；1.65(m，2H，H14’)；1.38(寬s，2H，NH2)。
生物素化的化合物34將生物素(780mg；3.19mmol)懸浮于13ml DMF中。然后加入590mg(3.60mmol)CDI。溶液在室溫持續(xù)攪拌30min?；衔?3溶于1ml DMF中，然后將前面的溶液一點一點的加入。得到的混合物在室溫持續(xù)攪拌1h。蒸發(fā)DMF后，通過急驟層析純化，色譜柱直徑為35mm，洗脫液為500ml MeOH-DCM 6％，然后是250mlMeOH-DCM 8％，最后是250ml MeOH-DCM 8％。產(chǎn)物34相應(yīng)的組分混和后蒸發(fā)至干，得到1.05g油性物，產(chǎn)率約為30％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.49(寬s，1H，NH咪唑)；7.79(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.66(s，1H，H咪唑)；7.50(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.38(t，1H，NH2’)；7.11(S，2H，H咪唑)；6.67(t，1H，NH16’)；5.99(寬s，1H，NHB1)；5.15(寬s，1H，NHB3)；4.46(m，1H，HB6A)；4.27(m，1H，HB3a)；3.61-3.45(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3’)；3.28(m，2H，H15’)；3.15(s，6H，-OCH3)；2.85(m，1H，HB4)；2.85和2.69(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5 Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.14(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.86(m，2H，H4’)；1.69(m，2H，H14’)；1.49(s，3H，CH3)；1.42-1.39(m，6H，HB7，B8，B9)。
化合物35乙縮醛34溶于45ml氯仿中，然后加入10ml 2NHCl。兩相混合物劇烈攪拌5min?；厥沼袡C相，用無水NaHCO2干燥。過濾、蒸發(fā)后得到淡黃色固體狀態(tài)的化合物35(504mg；0.87mmol)，按照生物素計算總產(chǎn)率為27％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.97(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.91(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.51(t，1H，NH2‘)；6.50(t，1H，NH16’)，6.05(寬s，1H，NHB1)；5.23(寬s，1H，NHB3)；4.45(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；3.62-3.56(m，10H，H7’， 8’，10’，11’和H5’)；3.48-3.46(m，4H，H3’，13’)；3.27(m，2H，H15’)；3.10(m，1H，HB4)；2.85和2.71(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.60(s，3H，CH3)；2.14(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.89(m，2H，H4’)；1.72-1.61(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.40(m，2H，HB8)。
腙化合物36將酮化合物35(500mg；0.864mmol)溶于11ml無水乙醇中。加入肼(335μl；6.911mmol)，然后將反應(yīng)混合物回流加熱1h。蒸發(fā)后得到的油性物溶于無水乙醇中以便再次蒸發(fā)。得到黏性泡沫狀產(chǎn)36物(488mg；0.823mmol)，產(chǎn)率為95％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.76(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.67(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.29(t，1H，NH2’)；6.46(t，1H，NH16’)，5.98(寬s，1H，NHB1)；5.55(寬s，2H，NH2)；5.14(寬s，1H，NHB3)；4.45(m，1H，HB6a)；4.24(m，1H，HB3a)；3.62-3.51(m，10H，H7’，，8’，10’，11’和H5’)；3.47-3.45(m，4H，H3’，13’)；3.27(m，2H，H15’)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.69(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.11(t，2H，J＝8Hz，HB10和s，3H，CH3)，1.86(m，2H，H4’)；1.72-1.59(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.21(m，2H，HB8)。
疊氮化合物37將腙化合物36(200mg；0.337mmol)溶于5ml DMF中。加入MnO2(450mg；5.17mmol)。室溫下攪拌15min后，將混合物通過含有硅藻土(厚度2cm)和3(0.5cm)粉末狀分子篩的微孔過濾。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干。得到的殘留油性物用乙醚連續(xù)洗三次，直到得到粉末狀物質(zhì)。得到的化合物37(290mg，0.491mmol)呈粉紅色固體狀態(tài)，產(chǎn)率為93％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝8.33(t，1H，NH2’)；7.83(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2.6)；7.73(t，1H，NH16’)；6.98(d，2H，J＝8 Hz，Ar-H3，5)；6.39(寬s，1H，NHB1)；6.33(寬s，1H，NHB3)；4.30(m，1H，HB6a)；4.12(m，1H，HB3a)；3.51-3.45(m，16H，H7’，8’，10’，11’和H5’和H15’和H3’，13’)；3.07(m，1H，HB4)；2.79和2.58(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5 Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.14(s，3H，CH3)；2.04(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.77(m，2H，H4’)；1.62-1.48(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.31(m，2H，HB8)。
檢測化合物37在尿嘧啶3’-單磷酸上的反應(yīng)性，并用毛細(xì)管電泳監(jiān)測。分析條件與實施例6.1一致。結(jié)果顯示其半衰期是60min。
該試劑在-20℃的穩(wěn)定性至少為1個月。
實施例30.4間-Bio-EG3-PDAM的合成合成流程
甲基-3-甲酰苯甲酸鹽38的保護將Dowex 50WX8-100樹脂(2g)溶于25ml MeOH和25ml三甲基原甲酸酯中，持續(xù)攪拌15min。潷析后用20ml MeOH連續(xù)洗滌樹脂兩次。然后將樹脂置于100mlMeOH內(nèi)，然后加入50ml CH(OMe)3和7.12g(43.4mmol)甲基-3-甲酰苯甲酸鹽。溶液持續(xù)攪拌15min，然后在蒸發(fā)前用折疊的濾紙過濾。分離出淡黃色液體狀產(chǎn)物39(9g；43.1mmol)，產(chǎn)率為99％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.10(s，H，Ar-H2)；7.9(d，H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.63(d，H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.42(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；5.40(s，1H，CH)；3.90(s，3H，-CO-O-CH3)；3.31(s，6H，-O-CH3)。
化合物40將化合物39(2g；9.5mmol)溶于10.4ml(47.6mmol)4，7，10-三噁-1，13-三烷二胺中。得到的溶液在165℃加熱2h。然后將混合物溶于80 ml DCM中，用20ml水洗滌4次。用MgSO4干燥和蒸發(fā)后分離出產(chǎn)物40(2.27g；5.69mmol)，產(chǎn)率為60％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.84(s，H，Ar-H2)；7.75(d，H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.53(d，H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.39(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；5.38(s，1H，CH)；3.64-3.43(m.14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3‘)；3.29(s，6H，-O-CH3)；2.72(m，2H，H15’)；1.87(m，2H，H4’)；1.64(m，2H，H14’)；1.30(寬s，2H，NH2)。
生物素化的化合物41將D-生物素數(shù)(344mg；1.40mmol)懸浮于4ml DMF中。然后加入250mg(1.54mmol)CDI。溶液在室溫持續(xù)攪拌30min。化合物40(616mg；1.54mmol)溶于2ml DMF中，然后將前面的溶液一點一點的加入。得到的混合物在室溫下持續(xù)攪拌50min。蒸發(fā)后，通過急驟層析純化，色譜柱直徑為30mm，所用洗脫液為750ml MeOH-DCM10％，然后是250ml MeOH-DCM 15％。產(chǎn)物41相應(yīng)的組分混和后蒸發(fā)至干，得到740mg油性物，產(chǎn)率約為50％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.87(s，H，Ar-H2)；7.78(d，H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.65(s，1H，H咪唑)；7.53(d，H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.39(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；7.07(s，2H，H咪唑)；6.65(t，1H，NH16’)；5.95(寬s，1H，NHB1)；5.38(s，1H，CH)；5.15(寬s，1H，NHB3)；4.43(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；3.59-3.44(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3’)；3.29(m，8H，H15’和2-O-CH3)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.66(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.13(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.85(m，2H，H4’)；1.66(m，2H，H14.)；1.40-1.37(m，6H，HB7，B8， B9)。
醛化合物42將乙縮醛化合物41溶于20ml氯仿中，然后加入5ml 2N HCl。兩相混合物持續(xù)劇烈攪拌15min。有機相回收然后用無水NaHCO3干燥。過濾后將溶液蒸發(fā)，得到淡黃色油性狀的化合物42(593mg；1.02mmol)，按照生物素計算在產(chǎn)率為87％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝10.04(s，1H，CHO)；8.34(s，H，Ar-H2)；8.16(d，H，J＝8 Hz，Ar-H4)；7.96(d，H，J＝8 Hz，Ar-H6)；7.72(t，1H，NH2’)；7.39(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；6.51(t，1H，NH16’)；6.00(寬s，1H，NHB1)；5.30(寬s，1H，NHB3)；4.46(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；3.66-3.56(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.50-3.29(m，4H，H3’，13’)；3.28(m，2H，H15’)；2.95(m，1H，HB4)；2.84和2.71(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12 Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.15(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.89(m，2H，H4’)；1.72-1.63(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.23(m，2H，HB8)。
腙化合物43將醛化合物42(593mg；1.02mmol)溶于10ml無水乙醇中。加入肼(400μl；8.19mmol)，然后將反應(yīng)混合物回流加熱50min。蒸發(fā)后得到的黃色油性物用乙醚磨碎直到得到米色粉末狀產(chǎn)物43(404mg；0.68mmol)，產(chǎn)率為66％。通過急驟層析純化，色譜柱直徑為15mm，上樣量為150mg(0.253mmol)，洗脫液為200mlMeOH-DCM 20％。各組分混和后蒸發(fā)至干，得到144mg產(chǎn)物43，產(chǎn)率為76％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.95(s，H，Ar-H2)；8.16(d，H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.76(s，1H，CH)；7.96(d，H，J＝8HZ，Ar-H6)；7.38(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；6.45(t，1H，NH16’)；5.98(寬s，1H，NHB1)；5.72(寬s，2H，NH2)；5.18(寬s，1H，NHB3)；4.44(m，1H，HB6a)；4.26(m，1H，HB3a)；3.62-3.56(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.48-3.45(m，4H，H3’，13’)；3.27(m，2H，H15’)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.68(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.11(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.86(m，2H，H4’)；1.72-1.59(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.21(m，2H，HB8)。
疊氮化合物44將腙化合物43(100mg；0.187mmol)溶于4ml DMF中。加入MnO2(200mg；2.3mmol)。室溫攪拌13min后將混合物通過含有硅藻土(厚度2cm)和3(0.5cm)粉末狀分子篩的微孔過濾。反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干。得到的殘留油性物用乙醚連續(xù)洗三次，得到橙色固體化合物44(290mg，0.491mmol)呈粉紅色固體狀，產(chǎn)率為83％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝8.39(t，1H，NH2’)；7.78(t，1H，NH16’)；7.39-7.34(m，Ar-H)；7.09(d，Ar-H)；6.38(寬s，1H，NHB1)；6.32(寬s，1H，NHB3)；5.78(s，1H，CH-N2)；4.27(m，1H，HB6a)；4.11(m，1H，HB3A)；3.51-3.44(m，10H，H7’，8’， 10’，11’和H5’)；3.37(m，2H，H15)；3.32(m，4H，H3’，13’)；3.05(m，1H，HB4)；2.79和2.58(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.02(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.69(m，2H，H4’)；1.59-1.48(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.25(m，2H，HB8)。
產(chǎn)物在-20℃下穩(wěn)定性大于1個月。
實施例31對-Cy5-EG3-PDAM的合成如實施例2己提及的，生物素可以被其他標(biāo)記物如Cy5替代。本實施例說明PDAM攜帶的疊氮功能基團也可以通過一個聚乙二醇連接臂連接到這種Cy5標(biāo)記物上。
合成流程反荷離子I-不在結(jié)構(gòu)式46，47，50’和51中表示。
2-[4-(N-乙酰基-N-苯基氨基)丁-1，3-二烯]-1，2，3，3-四甲基[3H]碘咯碘化物47將溶于乙酸酐(50ml)的丙醛二(苯基亞氨基)一-氫氯化物45(13g；50.2mmol)、NaOAc(6.0g；69.7mmol)和1，2，3，3-四甲基[3H]碘咯碘化物46(3.01g；10mmol)的混合物在100℃精確加熱20min。冷卻后加入乙醚(350ml)，然后將沉淀的棕色固體過濾，用乙醚(3×100ml)洗滌。固體重新溶于150ml CH2Cl2中，過濾(去除有機鹽)，然后用350ml乙醚沉淀得到棕色固體(3.54g，54％)。
1H NMR(CDCl3)δ＝8.64(d；1H；J＝12Hz；1-H)；8.14(t；1H；J＝16；12Hz；3-H)；7.63-7.19(m；9H)；6.90(d；1H；J＝15Hz；4-H)；5.82(t；1H；J＝12；13Hz；2-H)；4.06(s；3H；NCH3)；(2.16(s；3H；-COCH3)；1.74(s；6H；CH3)。
1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基[3H]碘咯碘化物502，3，3-三甲基吲哚48(10.0g；62.8mmol)和6-溴己酸49(12.3g；62.8mmol)不加溶劑混和，在氬氣下110℃加熱12h。紫紅色的漿糊狀混合物用乙酸乙酯(2×60ml，漿糊狀物質(zhì)用刮刀研磨，傾析出上清液)洗滌，然后用丙酮(50ml，漿糊狀物固化)洗滌。將粉紅色固體過濾并在真空下干燥(16.0g；73％)。
Cy5COOH化合物51溶于乙酸酐(11ml)中的碘化物47(2.5g；5.3mmol)、溴50(1.87g；5.3mmol)和NaOAc(1.08g；12.1mmol)的混合物在120℃加熱25min。冷卻后加入乙醚(200ml)，沉淀物過濾并用乙醚(3×50ml)洗滌。與產(chǎn)物50’對應(yīng)的固體溶于100ml CH2Cl2中，然后蒸發(fā)。然后將其溶于15ml醋酸中，120℃攪拌30min。加入200ml乙醚并在燒結(jié)玻璃上過濾后得到與產(chǎn)物51相應(yīng)的沉淀物(2.71g；4.44mmol)，產(chǎn)率為84％。
1H NMR(CDCl3)δ＝8.03(t；2H；J＝10；11Hz，2-H，4-H)；7.38-6.91(m；9H；Ar-H，3-H)；6.41(d；1H；J＝14Hz；1-H)；6.31(d；1H；J＝13Hz；5-H)；4.07(t；2H，J＝7；7Hz；α-CH2)；3.68(s；3H；NCH3)；2.47(t；2H，J＝7；7 Hz；ε-CH2)；1.71(m；18H；CH3，β，γ和δ-CH2)。
化合物26與Cy5COOH 51的偶合(產(chǎn)物52)N-甲基嗎啉(NMM，405μl，3.68mmol)加入到溶于15ml CH2Cl2的Cy5COOH 51(1.5g；2.46mmol)溶液中。溶液在冰浴中冷卻，放置于氬氣下，然后加入異丁基氯甲酸鹽(494μl，3.81mmol)。攪拌10min后，加入稀釋于8ml CH2Cl2中的胺26(1.86mg；4.67mmol)。混合物在室溫持續(xù)攪拌1h 30min。加入20ml CH2Cl2，混合物用25ml的NaHCO3(1N)連續(xù)洗滌3次。用Na2CO3干燥后，過濾溶液以回收蒸發(fā)的二氯甲烷相。
通過急驟層析純化，色譜柱直徑為45mm，20ml組分。洗脫液為MeOH-DCM 10％。產(chǎn)物52相應(yīng)的組分混和后蒸發(fā)至干得到藍色固體，將其溶于CH2Cl2。然后沉淀產(chǎn)物52，用乙醚洗滌后得到藍色產(chǎn)物(1.45g；1.77mmol)，產(chǎn)率為72％。
將產(chǎn)物52(磺化物)溶于54ml甲醇中，然后通過安珀萊特IRA900柱(Cl-；15g)?；厥盏募状既芤赫舭l(fā)至干后得到黏性油狀物，將其重新溶于CH2Cl2中。蒸發(fā)后可以得到產(chǎn)物52’，產(chǎn)率為87％。
醛53乙縮醛化合物52’溶于10ml DCM中，然后加入10ml 2N HCl。溶液劇烈攪拌3h 30min。加入20ml DCM后，回收二氯甲烷相，然后用NaHCO2干燥。蒸發(fā)后得到的產(chǎn)物用乙醚洗滌，得到醛53(1.18g；1.46mmol)，產(chǎn)率為90％。
腙54將醛化合物53(200mg；0.247mmol)溶于1ml無水乙醇中，加入一水合肼(15.6μl；0.321mmol)，溶液在室溫攪拌30min。加入8ml乙醚；混合物通過潷析用乙醚連續(xù)洗滌三次，然后在真空下干燥。得到172mg肼54(0.209mmol；85％產(chǎn)率)，儲存在冰箱中。
疊氮55將100mg MnO2加入到溶于2ml DMF中的20mg(0.243mmol)腙化合物54溶液中，混合物在室溫氬氣下劇烈攪拌5min。懸液通過一層硅藻土(厚度2cm)和3(0.5cm)粉末狀分子篩過濾，然后用DMF洗滌。溶液蒸發(fā)后殘留物用乙醚磨碎，干燥得到的固體，得到18mg(0.185mmol；76％)疊氮55。
試劑在-20℃下穩(wěn)定性大于1個月。
實施例32間-氟-EG3-PMDAM的合成如實施例23和25已提及的，生物素可以被其他標(biāo)記物替代。本實施例說明PDAM攜帶的疊氮功能基團也可以通過一個聚乙二醇連接臂連接到這種熒光標(biāo)記物上。
合成流程
化合物72在通氬氣條件下將異硫氰酸熒光素(250mg，0.64mmol)溶于1.6ml含2％吡啶的無水DMF中。然后加入溶于1.6ml無水DMF中的產(chǎn)物69(0.356g，0.81mmol)。混合物在室溫反應(yīng)3.5h，然后蒸發(fā)DMF，殘留物溶于25ml水中。然后用50ml CH2Cl2抽提三次，蒸發(fā)水相。得到255mg(48％)產(chǎn)物72。
間-氟-EG3-腙-甲苯磺?；衔?5在回流下將化合物72(255mg，0.31mmol)溶于1.5ml乙醇中。加入溶于1.5ml乙醇中的對-甲苯磺酰-肼(69.2mg，0.37mmol)，混合物反應(yīng)6h。將混合物蒸發(fā)至干，固體用CH2Cl2，水和乙醚洗滌。得到18.5mg(74％)橙色粉末狀產(chǎn)物75。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝1.6-1.8(m，4H)；2.13(s，1H)；2.28(s，1H)；2.36(s，1H)；2.80(m，1H)；3.07(m，2H)；3.46(m，12H)；6.5-6.7(m，6H)；7.1-8.3(m，9H)。
間-氟-EG3-PMDAM化合物74將腙75(176mg，0.18mmol)溶于720μl 10％ KOH(含無水甲醇)溶液中。溶液在回流下保持3h。溶液冷卻后出現(xiàn)沉淀，過濾溶液并蒸發(fā)至干。殘留物用乙醚洗滌并干燥。
NMR分析結(jié)果表明，在2.36和2.13ppm(對應(yīng)于甲苯磺酰和腙的甲基)處信號消失，而在1.96ppm(對應(yīng)于疊氮的甲基)處出現(xiàn)一個峰。
實施例33制備疊氮甲基中間體以進行隨后的標(biāo)記不用攜帶標(biāo)記物R2的疊氮甲基標(biāo)記試劑直接標(biāo)記而是分兩個階段間接標(biāo)記可能更有利。在這種情況下，含有疊氮甲基官能團的標(biāo)記試劑是被預(yù)先功能化了的，就是說其也含有能隨后與直接或間接標(biāo)記物反應(yīng)的化學(xué)官能團。預(yù)先功能化可以通過將一個活性的共價官能團引入到標(biāo)記試劑中，該標(biāo)記試劑可以與直接或間接標(biāo)記物的抗活性共價官能團反應(yīng)。這些官能團包括親電子的有機化學(xué)官能團和親核的有機化學(xué)官能團，或者相反。
這種標(biāo)記策略的一個實施例在下面流程圖中說明。
其中除了疊氮官能團外，標(biāo)記試劑還含有一個親電子或親核的官能團W1，該基團能與含有官能團W2的標(biāo)記物R2反應(yīng)，W2與W1互補。
例如，如果W1是甲基酮或醛官能團，W2就是烷氧胺官能團。
在一種標(biāo)記生物分子如核酸的方法中，先將核酸與含有疊氮甲基官能團的標(biāo)記試劑接觸，然后標(biāo)記物W2-R2通過官能團W1與核酸反應(yīng)。
例如，這些用途之一是擴增一段核酸序列的方法或信號放大的方法。這種類型的標(biāo)記的其他信息見專利申請WO-A-98/05766，其優(yōu)先申請日為1996年8月2日，以及專利申請WO-A-00/40590，其優(yōu)先申請日為1999年1月5日。
實施例33.1MeCO-PMDAM的合成合成流程
產(chǎn)物85，其合成方法已在本實施例中描述，可以使其通過疊氮甲基官能團與磷酸基團的反應(yīng)性來標(biāo)記天然核酸，因此可以引入甲基酮官能團，該基團隨后用于引入一種具有烷氧胺基團的可檢測分子(熒光素，生物素)。
該合成是基于化學(xué)中常用的已知方法。起始材料與標(biāo)記物71和74合成所用的材料相同。第一步包括用芴甲基甲酸酯(Fmoc，99)保護末端胺。選擇這個保護基團是基于其穩(wěn)定性和裂解條件。

用前面使用的方法(間-氟-EG3-PMDAM實施例)形成保護的腙82后，末端胺在溫和堿性條件下去保護以確保腙的穩(wěn)定性。甲基乙酰乙酸用于產(chǎn)生甲基酮官能團，通過末端胺的乙酰化反應(yīng)(見化合物26和36的形成)。疊氮甲基的形成是按照述方法進行的。
實施例33.2H2NO-PMDAM的合成合成流程 產(chǎn)物88，其合成方法已在本實施例中描述，可以使其通過疊氮甲基功能基團與磷酸基團的反應(yīng)性來標(biāo)記天然核酸，因此可以引入烷氧氨基官能團，該基團隨后可用于引入一種具有甲基酮基團的可檢測分子(熒光素，生物素)。
本合成方法是基于前面所述的合成模式，就是說使用前體69；使用Fmoc保護胺以及使用甲苯磺酰保護腙。烷氧胺基官能團(化合物86)的引入是用Fmoc功能基團(E.Trévisiol Thesis，LEDSS Grenoble，1999)來保護羧基甲氧基胺(市售的)發(fā)生的。最后去保護(化合物88)的條件是溫和的，并且在疊氮甲基形成后立即進行。
實施例34PDAM衍生物的制備以放大信號實施例34.1雙-生物素化標(biāo)記物如[Bio-EG3]2-PDAM的合成合成流程 三里基1，3，5-苯三羧酸鹽56還原成乙醇57
將三酯56(12.6g；50.0mmol)溶于100ml THF中，然后在室溫加入1.1g(50.5mmol)LiBH4。紅色溶液在氬氣下40-45℃加熱1h。冷卻后(冰上)，通過加入水(200ml)和2N HCl(30ml)小心地破壞多余的氫化物(釋放出氫氣)。觀察到顏色變成淡黃色。溶液用CH2Cl2提取(100ml，然后50ml三次)，有機相用無水NaHCO3洗滌，用MgSO4干燥，然后蒸發(fā)溶劑直到獲得油性物(11.1g)。通過急驟層析在硅色譜柱(直徑＝40mm，洗脫液乙酸乙酯/環(huán)己烷＝1/1)上純化得到乙醇57(6.38g，57％)。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.53(t，1H，J＝2Hz)；8.18(d，2H，J＝2Hz)；4.76(s，2H)；3.91(s，6H)，2.30(s，1H)。
乙醇57氧化成醛58將乙醇57(5.86g；26.1mmol)溶于100ml THF中，然后在室溫用超過5min的時間緩慢加入40.0g MnO2。溶液在氬氣下持續(xù)攪拌過夜。溶液通過具有一層硅藻土545的布氏漏斗過濾，用CH2Cl2洗滌，然后蒸發(fā)溶劑。粗固體(4.4g)通過急驟層析在硅色譜柱(直徑＝50mm，洗脫液乙酸乙酯/環(huán)己烷＝3/7)純化。得到3.44g(59％)醛化合物58。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝10.11(s，1H)；8.89(t，1H，J＝1Hz)；8.69(d，2H，J＝1Hz)；3.98(s，6H)。
乙縮醛59的形成將醛58(3.21g；14.4mmol)溶于30ml甲醇中，然后加入6.0ml TMSC1。溶液在室溫氬氣下持續(xù)攪拌1h。溶液用200ml CH2Cl2稀釋，加入1M NaHCO3(100ml)攪拌(小心CO2散發(fā))。兩相分離，用CH2Cl2(25ml)提取水相三次，有機相混和，用MgSO4干燥，然后蒸發(fā)溶劑。得到3.55g(92％)乙縮醛59。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.63(t，1H，J＝2Hz)；8.29(d，2H，J＝2Hz)；5.45(s，2H)；3.93(s，6H)；3.32(s，6H)。
二酯59水解成二酸60二酯59(3.18g；11.9mmol)溶于10ml THF中，然后加入溶于10ml甲醇中的KOH(2.0g，丸狀占85％)溶液中。置于室溫15min后蒸發(fā)溶劑。殘留物溶于水(50ml)中。加入磷酸(大約2.5ml，85％)將pH調(diào)整到3，白色沉淀物在燒結(jié)玻璃(#3)上過濾，用水洗滌并在真空下干燥。得到2.59g(91％)二酸60。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝8.43(t，1H，J＝1Hz)；8.15(d，2H，J＝1Hz)；5.53(s，1H)；3.27(s，6H)。
三氟乙酰胺62二胺61(66g；0.30mol)溶于250ml CH2Cl2中，然后滴加乙酰三氟乙酸鹽(11.8ml，0.10mol)，在10℃氬氣下邊攪拌邊加入，滴加時間超過5min。在室溫靜置15min后將溶液轉(zhuǎn)移到分離漏斗中，用水(3×100ml)洗滌，用MgSO4干燥，然后蒸發(fā)溶劑。得到的單酰胺62的純度大約為85％(19F NMR確定)。將化合物儲存在-20℃，不經(jīng)純化就可以使用。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝3.5-3.6(m，12H)；3.42(t，2H，J＝6Hz)；2.75(t，2H，J＝6Hz)；1.81(量化態(tài)(quantiplet)，2H，J＝6Hz)；1.67(量化態(tài)，2H，J＝6Hz)；1.30(寬s，2H)。
19F NMR(190MHz，CDCl3)δ＝-76.3。
化合物63將羰基二咪唑(CDI，6.32g，80％，31.2mmol)加入到溶于50ml DMF中的D-生物素(6.39 g；26.2mmol)懸液中?；旌衔镌?5-60℃氬氣下邊攪拌邊加熱30min。加入的物質(zhì)一開始完全溶解，然后聚集成一團白色固體沉淀物(CO2散發(fā)出)。在5mlCH2Cl2的幫助下加入胺(油性)以便漂洗?；旌衔镌?5-60℃加熱3h。在真空(＜1mmHg)下蒸發(fā)DMF，殘留物用CH2Cl2(700ml)和2N HCl(100 ml)攪拌。兩相通過一層硅藻土545過濾后分離，水相用CH2Cl2(15×100ml)抽提，有機相混和，用無水NaHCO3和MgSO4干燥，然后蒸發(fā)溶劑。油性殘留物用150ml乙醚研磨獲得懸液。粘性固體難以過濾。將上清液傾析掉，然后用乙醚重復(fù)洗滌。真空干燥后得到9.13g(64％)化合物63。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝3.5-3.6(m，12H)；3.42(t，2H，J＝6Hz)；2.75(t，2H，J＝6Hz)；1.81(量化態(tài)，2H，J＝6Hz)；1.67(量化態(tài)，2H，J＝6Hz)；1.30(寬s，2H)。
化合物64將溶于氨水(100ml，22％含水)中的化合物63加入到一個250ml帶有隔膜的圓底燒瓶中于55-60℃加熱2h。冷卻后蒸發(fā)溶劑。殘留物溶于甲醇(20ml)中，通過Dowex 21K陰離子樹脂的柱[高度12cm×直徑35mm，通過預(yù)先用1N NaOH(1.51)，然后是水(1.51)，最后是甲醇(1.51)洗滌得到OH-型]。不含三氟乙酸鹽離子的化合物64和200ml甲醇一起通過柱為第一組分。將其蒸發(fā)后殘留物用50ml乙醚研磨并將上清傾析掉，然后用乙醚重復(fù)洗滌5次。干燥后得到化合物64(6.43g，86％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝6.77(t，1H，J＝4Hz)；6.32(s，1H)；5.52(s，1H)4.45(m，1H)；4.28(m，1H)，3.50-3.68(m，12H)；3.30(m，2H)，3.11(m，1H)；2.86(dd，1H，J＝13和5Hz)，2.75(t，2H，J＝13Hz)，2.68(d，1H，J＝13Hz)；2.16(t，2H，J＝7Hz)；1.60-1.85(m，8H)；1.41(m，2H)。2-乙縮醛65將羰基二咪唑(225mg，90％，1.25mmol)加入到溶于二氯乙烷(5ml)的二酸60(120mg；0.500mmol)懸液中，混合物在55-60℃加熱30min，在氬氣下攪拌。加入胺64(550mg；1.23mmol)，溶液在55-60℃加熱6h。蒸發(fā)后殘留物通過硅柱(直徑25mm，洗脫液甲醇15-30％溶于CH2Cl2中)。得到413mg(75％)化合物65。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.34(s，1H)；8.06(s，2H)；7.87(m，2H)；6.85(m，2H)；6.60(s，2H)；5.93(s，2H)5.40(s，1H)；4.45(m，2H)；4.27(m，2H)，3.43-3.68(m，24H)；3.31(s，6H)；3.25(m，4H)，3.08(m，2H)；2.83(dd，2H，J＝13和5Hz)，2.70(t，2H，J＝13Hz)；2.13(t，4H，J＝7Hz)；1.89(五重態(tài)，4H，J＝7Hz)；1.55-1.70(m，12H)；1.37(m，4H)。2-醛66將溶于35ml甲醇中的乙縮醛65(413mg；0.376mmol)用2N HCl(0.5ml)處理。蒸發(fā)后用乙醚洗滌，得到醛66(0.37g，90％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝10.11(s，1H)；8.82(t，2H，J＝6Hz)；8.62(s，1H)，8.47(s，2H)；7.73(t，2H，J＝5Hz)；4.30(m，2H)；4.11(m，2H)，3.30-3.60(m，24H)；3.06(m，6H)；2.80(dd，2H，J＝12和5Hz)，2.56(t，2H，J＝12Hz)；2.03(t，4H，J＝7Hz)；1.78(五重態(tài)，4H，J＝7Hz)；1.35-1.60(m，12H)；1.28(m，4H)。2-PDAM 67按照制備疊氮甲烷(實施例1)的方法將醛66轉(zhuǎn)化成疊氮甲烷67。
該試劑在-20℃的穩(wěn)定性大于1個月。
實施例34.2間-Bio7-EG3-PMDAM的合成合成流程
EG3-苯乙酮化合物76將3，6，9-三噁-1，11-十一烷二酸(EG3，12.64ml，74mmol)在氬氣下溶于80ml無水DMF中，在冰浴中冷卻。將二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，11.45g，55.5mmol)溶于無水20ml DMF中，然后緩慢加到上述溶液中。30min后加入3-氨基苯乙酮(5.0g，37mmol)，反應(yīng)在室溫氬氣下進行1h。然后在真空下蒸發(fā)DMF，加入70ml CH2Cl2。過濾溶液并用3×25ml 1％乙酸抽提。將水相混和，并用25ml CH2Cl2洗滌。有機相混和，用無水硫酸鈉干燥并蒸發(fā)至干。產(chǎn)物從MeOHHaO對重結(jié)晶。因此得到8.74g(70％)產(chǎn)物76。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝2.55(s，3H)；3.5-3.7(m，8H)；4.0(s，2H)；4.1(s，2H)；7.45(t，1H)；7.65(d，1H)；7.90(d，2H)；8.2(s，1H)；9.8(s，1H)。
(NH2)7-EG3-苯乙酮化合物77將產(chǎn)物76(120mg，0.35mmol)在氬氣下溶于15ml無水DMF中，在冰上冷卻，然后加入DCC(110mg，0.53mmol)。30min后，將此溶液緩慢加到一種市售的樹狀聚體“星暴PAMAM樹狀聚體，第一代”(Aldrich，St Quentin Fallavier)(1g，0.71mmol，溶于5ml甲醇中)溶液表面，劇烈攪拌。反應(yīng)在室溫進行1h，蒸發(fā)混合液。殘留物收集到10ml CH2Cl2中，用30ml 1％的乙酸抽提兩次。
Biot7-EG3-苯乙酮化合物78將D-生物素(1.73g，7.08mmol)在氬氣下溶于80ml無水DMF中，溶液在冰上冷卻。連續(xù)加入N-甲基嗎啉(NMM，856μl，7.7mmol)和異丁基氯甲酸酯(1022μl，7.7mmol)。30min后加入產(chǎn)物77(1.13g，0.7mmol，溶于5ml甲醇中)，反應(yīng)在冰上置于氬氣下進行3h。混合物在真空下濃縮到50ml，然后加入100ml CH2Cl2。過濾后得到的沉淀物用乙醚洗滌，在真空下干燥，得到1.3g白色粉末狀的產(chǎn)物78。
Biot7-EG3-腙化合物79在回流下將化合物78(300mg，0.09mmol)溶于10ml無水乙醇中。加入一水合肼(20ml，0.40mmol)，反應(yīng)在回流下進行3小時。冷卻后沉淀形成，將沉淀過濾，用乙醚洗滌并在真空下干燥。由此得到109mg(36％)白色粉末狀的產(chǎn)物79。
Biot7-EG3-PMDAM化合物80將腙79(100mg，0.03mmol)在70℃溶于5ml的無水DMF中?；旌弦航档绞覝睾蠹尤隡nO2(31mg，0.36mmol)。反應(yīng)進行10min，用含有硅藻土(0.5cm)和粉末狀分子篩(0.5cm)的燒結(jié)玻璃過濾去除氧化鎂。濾液蒸發(fā)干燥，用乙醚洗滌并在真空下干燥。由此得到78mg(78％)產(chǎn)物80。
樹狀聚體是一種樹枝狀分子，在末端具有幾種活性基團如胺，羧基，羥基等(綜述參見Newcome等，(1996)《樹狀分子原理、合成、展望》(Dendritic Molecules；Concept，Syntheses，Perspectives).VCH Ed.，Weinheim，Germany)。這些分子的合成現(xiàn)在很容易控制，許多樹狀聚體已由化學(xué)制造企業(yè)推上了市場。選擇PAMAM(sigma-Aldrich)是基于其穩(wěn)定性、溶解性和柔韌性，因為在市場上有好幾種具有不同末端數(shù)目和類型的這類分子。通過“PAMAM第一代”可以在每個疊氮甲基基團上添加7種標(biāo)記物的分子(以一個合成步驟)。
實施例35用間-BioPMDAM以兩步標(biāo)記和片段化DNA擴增子DNA擴增子是按照實施例5.1描述的方法制備的。兩種標(biāo)記反應(yīng)方法如下。
a.標(biāo)記和片段化以兩步進行將10μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和77μl無DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR產(chǎn)物中。溶液在95℃溫育10min，然后加入3μl 0.1M HCl，溶液于95℃溫育10min。
b.標(biāo)記和片段化以一步進行將10μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)、5μl 0.1 M的HCl和75μl無DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR產(chǎn)物中。溶液在60℃溫育30min。其余方法與實施例17相同。
結(jié)果
表25以兩個不同的步驟和以一個步驟進行標(biāo)記和片段化的比較研究如表25所示，用一個步驟的方案所得到的結(jié)果是令人滿意的，而分兩步進行標(biāo)記和片段化效果更好。這個實施例說明，標(biāo)記和裂解步驟可以分開以便根據(jù)所用的靶位提高標(biāo)記效率。
實施例36在不同的反應(yīng)體系中進行DNA擴增子的標(biāo)記和片段化DNA擴增子是按照實施例5.1描述的方法制備的。三種標(biāo)記反應(yīng)方法如下。
a.在250μl反應(yīng)體系中標(biāo)記和片段化將75μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和102.5μl無DNA酶/RNA酶的水加入到50μl PCR產(chǎn)物中。溶液在95℃溫育25min，然后加入22.5μl 0.1M HCl，溶液于95℃溫育5min。
b.在200μl反應(yīng)體系中標(biāo)記和片段化將75μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和52.5μl無DNA酶/RNA酶的水加入到50μl PCR產(chǎn)物中。溶液在95℃溫育25min，然后加入22.5μl 0.1M HCl，溶液于95℃溫育5min。
c.在150μl反應(yīng)體系中標(biāo)記和片段化將75μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和2.5μl無DNA酶/RNA酶的水加入到50μl PCR產(chǎn)物中。溶液在95℃溫育25min，然后加入22.5μl 0.1M HCl，溶液于95℃溫育5min。
其余試驗方法與實施例17相同。
結(jié)果
表26按照不同的反應(yīng)體系標(biāo)記和片段化從信號和同源性百分?jǐn)?shù)來看，所有方案得到的結(jié)果都是很滿意的。而且盡管反應(yīng)體系從150μl變化到250μl，所得到的結(jié)果是相似的。本實施例說明標(biāo)記方案的反應(yīng)體系具靈活性，可以接受不同體積的體系，尤其是不同體積的擴增產(chǎn)物。
實施例37采用片段化前進行純化的方案和采用片段化后進行純化的方案的比較DNA擴增子是按照實施例5.1描述的方法制備的。兩種標(biāo)記反應(yīng)方法如下。
a.標(biāo)記、純化，然后片段化DNA擴增子將10μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和80μl無DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR產(chǎn)物中。溶液在95℃溫育10min。純化按照實施例17描述的方法進行。在純化后標(biāo)記的擴增子溶液中加入6μl 0.1M HCl，溶液于95℃溫育10min。加入400μl在95℃預(yù)熱10min的雜交緩沖液。雜交緩沖液的組成和其余的方案與實施例17相同。
b.標(biāo)記、片段化，然后純化DNA擴增子將10μl間-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和77μl無DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR產(chǎn)物中。溶液在95℃溫育10min。然后加入3μl 0.1M HCl，溶液再于95℃溫育10min。其余的方案與實施例17相同。
結(jié)果
表27采用片段化前進行純化的方案和采用片段化后進行純化的方案的比較表27中所顯示的結(jié)果說明，純化步驟可以在標(biāo)記和片段化步驟之間進行。而且在標(biāo)記和片段化步驟之間進行純化可以使在裂解期間進行變性以及將所有標(biāo)記的擴增子片段雜交到芯片上成為可能。
實施例382-硝基-對-BioPDAM的合成合成流程 醛基的保護將5g(25.5mmol)2，4-二硝基苯乙醛溶于250ml甲苯中，加入20ml乙二醇和150mg對-甲苯磺酸?；旌弦涸诨亓飨录訜?，水在Dean-Stark系統(tǒng)中回收6h?；旌衔镉?50ml EtOAc和100ml水處理。溶液用乙酸乙酯抽提兩次，有機相用MgSO4干燥，然后蒸發(fā)。得到產(chǎn)物100相應(yīng)的油性物，用于下一步的反應(yīng)。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.70(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；8.44(dd，1Haro，J＝2Hz，J＝6Hz，H5)；8.02(d，1Haro，J＝8Hz，H6)；6.49(s，1H，CH)；4.12-4.06(m，4H，CH2-CH2)。
二硝基衍生物100的還原保護的2，4-二氮硝基苯乙醛(6.4g；25.5mmol)溶于乙醇-水混合液(6/1)中，然后加入二倍當(dāng)量的無水Na2S(12.3g；51.1mmol)。反應(yīng)混合物加熱30min。蒸發(fā)，然后用二氯甲烷抽提。干燥并過濾后將反應(yīng)介質(zhì)蒸發(fā)以獲得油性物，產(chǎn)物在硅柱上直接純化(環(huán)己烷/乙酸乙酯60/40)。得到化合物101，產(chǎn)率為45％化合物101熔點58-60℃.1H NMR(200MHz，CDCl3)7.49(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.09(d，1Haro，J＝2Hz，H6)；6.80(dd，1Haro，J＝2Hz，J＝6Hz，H5)；6.27(s，1H，CH)；3.99-3.97(m，4H，CH2-CH2)。
與生物素偶合將D-生物素(1.0g；4.1mmol)溶于20ml無水DMF和600μl N-甲基嗎啉中。在氬氣下加入異丁基氯甲酸酯(700μl；5.5mmol)，同時在冰浴上冷卻?；旌衔锍掷m(xù)攪拌5min，然后加入1g(4.75mmol)化合物101和500μl N-甲基嗎啉。溶液在室溫持續(xù)攪拌4h，然后蒸發(fā)至干。得到的油性物直接通過硅柱，洗脫溶劑為MeOH-DCM7％，然后是MeOH-DCM10％。得到產(chǎn)物102(1.1g；2.52mmol)，產(chǎn)率為62％。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.40(s，1H，NH-CO)；8.31(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.77(dd，1Haro，J＝2Hz，J＝6Hz，H5)；7.68(d，1Haro，J＝2Hz，H6)；6.43(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.36(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.23(s，1H，CH)；4.28(m，1H，CH2-CH-NH)；4.14(m，1H，CH-CH-NH)；3.92(s，4H，CH2-CH2)；3.12(m，1H，CH-S)；2.85和2.76(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.29(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.61-1.39(m，6H，(CH2)3)。
乙縮醛的去保護將產(chǎn)物102(768mg；1.76nnnol)懸浮于25ml THF中。加入4ml的2N H2SO4后全部溶解?；旌衔锍掷m(xù)攪拌2h。蒸發(fā)后在燒結(jié)玻璃用水漂洗和洗滌。得到黃色粉末狀的化合物103(694mg)，產(chǎn)率為90％。
熔點165℃.1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.69(s，1H，NH-CO)；10.09(s，H，CHO)；8.43(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.91(s，2Haro，H5和H6)；6.42(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.35(寬s，1H，NH-CO-NH)；δ＝6.23(s，1H，CH)；4.29(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.84和2.78(ABX系統(tǒng).2H，2JAB＝5 Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.29(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.61-1.39(m，6H，(CH2)3)。
腙104的形成將醛103懸浮于乙醇中，懸液加熱到80℃。加入肼時全部溶解，溶液立刻變成橙色。5min后沉淀形成。混合物邊攪拌邊加熱1h。在燒結(jié)玻璃上過濾后將沉淀物干燥。得到產(chǎn)物104(700mg；690mmol)，產(chǎn)率為98％。
熔點169℃.1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.31(s，1H，NH-CO)；8.31(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.96(s，H，CHO)；7.87(d，1Haro，J＝2Hz，H6)；7.68(dd，1Haro，J＝2Hz，J＝6Hz，H5)；7.31(s，2H，NH2)；6.42(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.34(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.29(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.84和2.78(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.29(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.61-1.39(m，6H，(CH2)3)。
疊氮105的形成將化合物104(200mg；0.492mmol)溶于8ml DMF中。加入400mg MnO2?；旌衔飫×覕嚢?0min。在含有硅藻土(厚度2cm)和粉末狀分子篩3(0.5cm)的微孔上過濾。蒸發(fā)至干后用乙醚洗滌。混和物再于微孔上過濾。得到橙色粉末狀化合物105(180mg；0.445mmol)，產(chǎn)率為98％。
熔點155℃.1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ＝10.21(s，1H，NH-CO)；8.60(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.77(d，1Harro，J＝6Hz，H5)；7.22(d，1Haro，J＝6Hz，H6)；6.60(s，H，CH-N)；6.41(寬s，1H，NH-CO-NH)；6.33(寬s，1H，NH-CO-NH)；4.29(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.84和2.78(ABX系統(tǒng)，2H，2JAB＝5 Hz，3JAX＝12 Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.29(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.61-1.39(m，6H，(CH2)3)。
化合物105的反應(yīng)性用尿嘧啶3’-單磷酸測試，用毛細(xì)管電泳監(jiān)測。分析條件與實施例6.1相同。結(jié)果顯示化合物的半衰期是45分鐘。試劑在-20℃的穩(wěn)定性大于1個月。
實施例39用2-硝基-對-BioPDAM衍生物標(biāo)記RNA按照實施例38所描述的方法制備2-硝基-對-BioPDAM衍生物。按照實施例5.2描述的方法得到RNA轉(zhuǎn)錄物。標(biāo)記和片段化方法是在表28所述的條件下用2-硝基-對-BioPDAM試劑以一個步驟進行。兩種標(biāo)記反應(yīng)如下a.用2-硝基-對-BioPDAM試劑標(biāo)記將2μl 2-硝基-對-BioPDAM(100mM，溶于DMSO中)、3μl咪唑(1M，溶于水)、5μl MnCl2和85μl無DNA酶/RNA酶的水加入到10μl轉(zhuǎn)錄物中。溶液在60℃溫育30min。
其余方案與實施例8相同。
b.用間-bioPMDAM試劑標(biāo)記將2μl間-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)、3μl咪唑(1M，溶于水中)、5μl MnCl2和85μl無DNA酶/RNA酶的水加入到10μl轉(zhuǎn)錄物中。溶液在60℃溫育30min。
其余方案與實施例8相同。
結(jié)果
表28用2-硝基-對-BioPDAM衍生物和間-bioPMDAM衍生物標(biāo)記RNA的比較研究從表28可見，2-硝基-對-BioPDAM衍生物對RNA有良好的標(biāo)記效果?？捎美缦趸娜〈鶃碚{(diào)節(jié)帶有重氮甲基官能團的標(biāo)記的反應(yīng)性和穩(wěn)定性。
實施例40用標(biāo)記試劑2-硝基-對-BioPDAM標(biāo)記和片段化DNA擴增子按照實施例38所描述的反應(yīng)流程得到2-硝基-對-BioPDAM衍生物。按照實施例5.1描述的方法用PCR擴增制備DNA擴增子。兩種標(biāo)記反應(yīng)如下a.用2-硝基-對-BioPDAM試劑標(biāo)記將2μl 2-硝基-對-BioPDAM(100mM，溶于DMSO中)、5μl 0.1M HCl和83μl無DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR產(chǎn)物中。溶液在60℃溫育30min。
b.用間-bioPMDAM試劑標(biāo)記將2μl間-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)、5μl 0.1M HCl和83μl無DNA酶和RNA酶的水加入到10μl PCR產(chǎn)物中。溶液在60℃溫育30min。
其余方案與實施例17相同。
結(jié)果
表29用2-硝基-對-BioPDAM衍生物和間-bioPMDAM衍生物標(biāo)記DNA的比較研究從標(biāo)記強度和同源性百分?jǐn)?shù)來看，用2-硝基-對-BioPDAM試劑標(biāo)記DNA是有利的。
實施例41在疊氮甲基功能基團和苯核之間插入雙鍵，使DAM遠(yuǎn)離，以及特別適用合于這種遠(yuǎn)離的分子的合成本實施例的目的在于使芳香族結(jié)構(gòu)的疊氮甲基(DAM)功能基團遠(yuǎn)離以便在磷酸的烷基化時以及標(biāo)記核酸與其互補序列雜交時最大限度地減少位阻效應(yīng)。
合成流程 為了3-羥基丁醛反應(yīng)以形成(對-甲氧羰基)苯乙烯基甲基酮89，用乙酰乙酸乙酯提高亞甲基質(zhì)子的酸性，從而促進甲?；墓?，隨后消除H2O(通過雙鍵與芳香環(huán)的結(jié)合而促進)，以及由于堿性介質(zhì)而水解去羧基化。本合成的其他步驟與其他實施例相似。
終產(chǎn)物對-Bio-EG3-SMDAM 90在疊氮甲基核芳香環(huán)之間多了兩個碳原子，這就限制了可能的位阻問題，通過與芳香系統(tǒng)連接從而保持疊氮甲基的穩(wěn)定性。
實施例42攜帶疊氮基團的固相支持體上核酸的捕獲與檢測研究了攜帶疊氮甲基基團的樹脂的反應(yīng)性來確定其與核酸結(jié)合的能力。
4-(重氮甲基)苯氧基甲基聚苯乙烯(參考上當(dāng)17338，F(xiàn)luka)是一種樹脂，已有文獻描述了它和羧基，尤其是蛋白質(zhì)上的羧基結(jié)合的能力(G.Bhalay，A.R.Dunstan.Tetrahedron Lett.39，7803，1998)，但是沒有描述其與DNA分子結(jié)合的能力。我們檢測了用這種試劑捕獲核酸的能力，通過比色試驗來觀察。
本實驗是用HLA-DR寡-檢測試劑盒(oligo-detection kit)(參考目錄33202，bioMerieux，F(xiàn)rance，基本原理見專利EP 549 776-B1描述)中的一部分試劑進行的，該試劑盒可以檢測在微孔板上通過PCR擴增的核酸，用比色方法讀取數(shù)據(jù)。根據(jù)所描述的實驗，通過PCR產(chǎn)生的核酸同時與檢測的樹脂和對-Bio-EG3-PDAM分子反應(yīng)，對-Bio-EG3-PDAM的合成在實施例20中已提及。如果DNA與兩個化合物上的疊氮甲基功能基團反應(yīng)，經(jīng)過洗滌和去除未共價結(jié)合的分子以后，用包括與鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合的酶的比色反應(yīng)就可以觀察到結(jié)果。鏈霉抗生物素蛋白與辣根過氧化物酶結(jié)合，可以將鄰苯二胺分子(試劑盒的Color 1試劑)分解成可在492nm波長處被檢測到的化合物。
實施例42.1DNA的捕獲與檢測將50μl按照實施例5.1描述的方法擴增的PCR產(chǎn)物加到400μl純水(Sigma)和5μl對-Bio-EG3-PDAM混合物中，然后加入10mg樹脂，在60℃溫育30min。然后用500μl PBS Tween緩沖液(試劑盒的Color 0 HLA試劑，PBS pH7.0；1％ Tween，0.2g/l BND；0.01g/l Ciproflaxacin)洗滌。然后將樹脂重懸于100μl PBS Tween和250μl添加以1/10000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白HRP(S-911，MOLECULAR PROBES，EUGENE，OR，USA)的鏈霉抗生物素蛋白雜交緩沖液(PBS pH7.0 0.5％ TWEEN)中。反應(yīng)混合物在室溫溫育30min。然后用500μl PBS Tween緩沖液洗滌樹脂三次，在顯色試劑(1 Color 1片，鄰-苯二胺鹽酸，稀釋在5ml Color 2緩沖液中，100mM磷酸鈉，50mM檸檬酸，0.03％ H2O2)存在的情況下于室溫溫育。在暗處溫育20min后，用50μl H2SO4(1.8N Color 3試劑)終止反應(yīng)。上清液用移液管吸出放到微孔板中，讀取反應(yīng)介質(zhì)在492nm處的吸光度。
實施例42.2無核酸對照將10mg樹脂加入到添加5μl對-Bio-EG3-PDAM的425μl純水(Sigma)中，60℃溫育30min。然后用500μl PBS緩沖液洗滌樹脂。樣品的處理方式與實施例42.1描述的方法相同。
實施例42.3與無靶進行的PCR對照10mg樹脂在添加5μl對-Bio-EG3-PDAM和50μl PCR產(chǎn)物的400μl純水中，60℃溫育30min，PCR用25μl體積的純水代替基因組DNA的體積進行。然后用500μl PBS緩沖液洗滌樹脂。樣品的處理方式與實施例42.1描述的方法相同。
實施例42.4與無顯色分子的PCR對照
10mg樹脂加入到含有50μl PCR產(chǎn)物的400μl純水中，60℃溫育30min。然后用500μl PBS Tween緩沖液洗滌樹脂。樣品的處理方式與實施例42.1描述的方法相同。
實施例42.5與非捕獲的核酸對照將10mg樹脂加入到添加5μl對-Bio-EG3-PDAM的400μl純水中，60℃溫育30min。然后用500μl PBS Tween緩沖液(試劑盒的Color 0 HLA試劑，PBS pH7.0；1％ Tween，0.2g/l BND；0.01g/l Ciproflaxacin)洗滌樹脂。然后將樹脂懸浮于100μl PBSTween和250μl添加以1/10000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白HRP的鏈霉抗生物素蛋白雜交緩沖液中。加入50μl按如下方法制備的DNA制劑。
將5μl對-Bio-EG3-PDAM和70μl純水加入到25μl按照實施例5.1描述的方法通過PCR制備的DNA中?；旌弦涸?0℃溫育30min，然后用QIAquick柱(NucleotideRemoval Kit，Qiagen，Hilden，Germany)按照廠商提供的方案去除多余的標(biāo)記物，最后洗脫體積為50μl。
反應(yīng)混合物在室溫溫育30min，然后按照實施例42.1描述的方法處理。
結(jié)果
表30攜帶疊氮甲基基團的樹脂的反應(yīng)性研究在表30中，高比色值說明了在反應(yīng)介質(zhì)中有高濃度的酶，相應(yīng)的就會大量存在攜帶生物素衍生物的核酸。對照組說明信號不是由于DNA非特異吸附到小珠上，不是與樹脂上的-Bio-EG3-PDAM反應(yīng)，也不是與樹脂上的鏈霉抗生物素蛋白HRP吸附，而是由于存在被共價捕獲并用對-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記的DNA。
實施例43標(biāo)記PCR產(chǎn)物以使其被捕獲和在微孔板上檢測本實施例所要證實的是僅用一種類型的攜帶疊氮甲基功能基團的分子就可能標(biāo)記DNA分子，從而以一步在微孔板上捕獲和檢測這種核酸分子。
本試驗用HLA-DR寡-檢測試劑盒(參考目錄33202，bioMérieux)中的一部分試劑進行，用比色讀數(shù)檢測微孔板上通過PCR擴增的核酸。根據(jù)所描述的試驗，對-Bio-EG3-PDAM與通過PCR產(chǎn)生的核酸反應(yīng)，對-Bio-EG3-PDAM的合成在實施例28中已經(jīng)有描述。DNA與分子的疊氮甲基反應(yīng)，因此在其磷酸基團上被嫁接上生物素。有可能通過在微孔板上溫育來捕獲核酸，微孔板上吸附有鏈霉抗生物素蛋白分子，然后通過比色反應(yīng)觀察。所用的檢測試劑也是鏈霉抗生物素蛋白分子，它可以與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合。在使用的條件下，過氧化物酶可以將鄰苯二胺分子(試劑盒的Color 1試劑)分解成可在492nm波長處被檢測到的化合物。
實施例43.1在微孔板上捕獲和檢測來源于PCR反應(yīng)的DNA將10μl用PCR擴增得到的DNA加入到添加10μl對-Bio-EG3-PDAM的80μl純水(Sigma)中，60℃溫育30min。標(biāo)記后，DNA用QIAquick柱(Nucleotide RemovalKit，Qiagen，Hilden，Germany)按照廠商推薦的方法純化，將最終洗脫物溶于0μlEB緩沖液(10mM Tris EDTA，pH8.5)中。將20μl這種洗脫液稀釋到180μl添加以1/10000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白HRP(S-911，Molecular Probes，Eugene，OR，USA)的PEG緩沖液(0.1M NaPO3；0.5M NaCl；0.65％ Tween 20；0.14mg/ml鮭精DNA(Gibco)；2％ PEG 4000)中。在鏈霉抗生物素蛋白包被的Combiplate 8(參考目錄95029263，Labsystem，Helsinki，F(xiàn)inland)的孔中或Maxisorb條帶(Maxisorbstrip)(Nunc，Denmark)的對照孔中加入100μl上述制備，37℃溫育1小時。
實施例43.2對照組的制備對照樣品同時按照下列方式制備A.無DNA的標(biāo)記對照將添加10μl對-Bio-EG3-PDAM的90μl純水(Sigma)在60℃溫育30min。然后反應(yīng)混合物按照實施例43.1所述的相似方法處理。
B.無標(biāo)記物的標(biāo)記對照將10μl按照實施例5.1描述的方法通過PCR擴增得到的DNA加入到90μl純水中，60℃溫育30min。然后將反應(yīng)混合物按照實施例34.1描述的相似方法處理。然后將所有的條帶用100μl PBS Tween緩沖液(試劑盒的Color 0 HLA試劑，PBS pH7.0；1％ Tween，0.2g/l BND；0.01g/l Ciproflaxacin)洗滌三次，加入100μl顯色試劑(1 Color 1片，鄰苯二胺鹽酸，稀釋到5ml Color 2緩沖液中，100mM磷酸鈉，50mM檸檬酸，0.03％ H2O2)，在暗處溫育20min就顯示鏈霉抗生物素蛋白HRP的存在，然后用50μl H2SO2(1.8N Color 3試劑)終止反應(yīng)。然后測量反應(yīng)介質(zhì)在492nm處的吸光度。
結(jié)果
表31用對-Bio-EGB-PDAM捕獲的標(biāo)記DNA的檢測表31中的結(jié)果表明，用對-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記的DNA在微孔板上通過一步就可以捕獲和檢測。如對照組所提示的，對照組的信號只是由于DNA而產(chǎn)生的，不是由核酸對微孔板壁的非特異吸附產(chǎn)生的，也不是來自于核酸與鏈霉抗生物素蛋白的非特異結(jié)合，或者鏈霉抗生物素蛋白HRP與非標(biāo)記DNA或微孔板塑料的非特異反應(yīng)。
實施例44雙標(biāo)記PCR產(chǎn)物以使其在微孔板類的固相支持物上捕獲和檢測本實施例所描述的是用兩種攜帶疊氮甲基官能團的分子在一個步驟中標(biāo)記DNA分子，以便于其在微孔板上捕獲和檢測。
試驗所用的一部分試劑來自于HLA-DR寡-檢測試劑盒，通過簡單的比色讀數(shù)來檢測微孔板上由PCR擴增的核酸。在上下文所描述的試驗中1-芘基重氮甲烷(PDAM)和對-Bio-EG3-PDAM同時與PCR產(chǎn)生的核酸反應(yīng)。
如果DNA與兩個化合物的疊氮甲基官能團反應(yīng)，DNA就能結(jié)合到攜帶抗-芘抗體的支持物上，就有可用一種與辣根過氧化物酶結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白分子來顯示它。該酶作為一種顯色劑可以將鄰-苯二胺分子分解成可在492nm波長處被檢測的化合物。
實施例44.1DNA的雙標(biāo)記和在微孔板上檢測將抗芘抗體吸附到8-孔Maxisorp條帶上，室溫下溫育過夜。每孔加入100μl溶液，該溶液是將1.1μl抗芘抗體稀釋到100μl碳酸氫鹽緩沖液(0.05M pH9.6)中。這種所謂的兔抗芘抗體(參考目錄YSRT-AHP236)可以從Accurate Chemical &Scientific(Westbury，New York，USA)購買到。當(dāng)然也可以用市場上可買到的抗體來進行本試驗，與本實施例所得到的結(jié)果相比沒有分歧的結(jié)果。
將按照實施例5.1描述的方法通過PCR擴增得到的10μl DNA加入到40μl純水(Sigma)、10μl對-Bio-EG3-PDAM、2μl PDAM(P-1405，1-芘基重氮甲烷，MolecularProbes，Eugene，OR，USA)和38μl DMSO中，60℃溫育30min進行標(biāo)記。
標(biāo)記后，DNA用QIAquick試劑盒(QIAGEN)純化，最后的洗脫物溶于50μl EB緩沖液(10mM Tris EDTA，pH8.5)中。將20μl此洗脫物稀釋到添加以1/10000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白HRP(S-911，MOLECULAR PROBES，EUGENE，OR，USA)的180μl PEG緩沖液(0.1M NaPO3；0.5M NaCl；0.65％ Tween 20；0.14mg/ml鮭精DNA(Gibco)；2％ PEG 4000)中。然后將100μl此制備液加入到吸附的Maxisorp條帶孔或非吸附對照孔中，37℃溫育1h。
實施例44.2對照組的制備對照樣品同時按照下列方式制備A.單獨用對-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記的對照將按照實施例5.1描述的方法通過PCR擴增得到的10μl DNA加入到添加10μl對-Bio-EG3-PDAM的90μl純水中，60℃溫育30min進行標(biāo)記。標(biāo)記完成后，DNA用QIAquick試劑盒純化，最后的洗脫物溶于50μl EB緩沖液中。將20μl此洗脫物稀釋到添加以1/10000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白HRP的180μl PEG緩沖液中。然后將100μl此制備液加入到吸附的Maxisorp條帶孔或非吸附對照孔中，37℃溫育1h。
B.單獨用PDAM標(biāo)記的對照將按照實施例5.1描述的方法通過PCR擴增得到的10μl DNA加入到添加2μl PDAM和38μl DMSO的90μl純水中，60℃溫育30min進行標(biāo)記。標(biāo)記后，DNA用QIAquick試劑盒純化，最后的洗脫物溶于50μl EB緩沖液中。將20μl此洗脫物稀釋到添加以1/10000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白HRP的180μl PEG緩沖液中。然后將100μl此制備液加入到吸附的Maxisorp條帶孔或非吸附對照孔中，37℃溫育1h。
C.無標(biāo)記對照將按照實施例5.1描述的方法通過PCR拉增得到的10μl DNA加入到100μl純水中，60℃溫育30min進行標(biāo)記。標(biāo)記后，DNA用QIAquick試劑盒純化，最后的洗脫物溶于50μl EB緩沖液中。將20μl此洗脫物稀釋到添加以1/10000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白HRP的180μl PEG緩沖液中。然后將100μl此制備液加入到吸附的Maxisorp條帶孔或非吸附對照孔中，37℃溫育1h。
所述條帶用100μl PBS Tween緩沖液(Color 0)洗滌三次，然后通過加入100μl顯色試劑(Color 2)在暗處溫育20min就顯示鏈霉抗生物素蛋白HRP的存在，用50μlH2SO2(Color 3)終止反應(yīng)。然后測量反應(yīng)介質(zhì)在492nm處的吸光度。
結(jié)果
表32用PDAM和對-Bio-EG3-PDAM雙標(biāo)記DNA
表32的結(jié)果清楚地表明大信號來自于被孔壁中抗芘抗體捕獲的及同時被連接的鏈霉抗生物素蛋白HRP標(biāo)記的DNA。如對照組中沒有信號所示，這種對標(biāo)記的DNA特異的檢測不是由于DNA的非特異性吸附或鏈霉抗生物素蛋白HRP與塑料的非特異吸附，或酶與捕獲的DNA的非特異結(jié)合。因此本實施例說明在一個步驟中進行雙標(biāo)記DNA是可能的，這種雙標(biāo)記用于同時捕獲和檢測DNA也是可能的。
實施例45標(biāo)記PCR產(chǎn)物的同時用互補核酸探針捕獲和標(biāo)記本實施例在于證明采用與DNA上的磷酸基團反應(yīng)的疊氮甲基官能團特異性地檢測DNA是可能的，所述DNA被捕獲在固相表面上。
本試驗用HLA-DR寡-檢測試劑盒(參考目錄33202，bioMérieux，F(xiàn)rance)的一部分試劑進行，用比色讀數(shù)檢測微孔板上通過PCR擴增的核酸。在上下文描述的試驗中，對-Bio-EG3-PDAM與通過PCR產(chǎn)生的核酸反應(yīng)。DNA與分子的疊氮甲基官能團反應(yīng)，因此在其磷酸基團上被嫁接上生物素。因而有可能通過在微孔板上溫育來捕獲核酸，微孔板上吸附有鏈霉抗生物素蛋白分子，然后用一個含有與捕獲序列互補的寡核苷酸的探針來顯示DNA，該探針與辣根過氧化物酶結(jié)合，該酶可以將鄰苯二胺分子(試劑盒的Color 1試劑)分解成可在492nm波長處被檢測到的化合物。
實施例45.1在微孔板上捕獲和特異性檢測DNA將用PCR擴增得到的10μl DNA與20μl對-Bio-EG3-PDAM在60℃溫育30min以雙份進行標(biāo)記。標(biāo)記后，DNA用QIAquick柱(Nucleotide Removal試劑盒，Qiagen，Hilden，Germany)按照廠商推薦的方法純化，將最終洗脫物溶于50μl EB緩沖液(10mM Tris EDTA，pH8.5)中。將85μl這種洗脫液用8.5μl試劑R4(2N NaOH)在室溫下變性培養(yǎng)5min，然后溶液用8.5μl試劑R5(2N乙酸)中和?；旌衔镏屑尤?50μl雜交緩沖液(R6-10mM Tris-HCl，pH7.0，0.2g/l BND，0.01g/l Ciproflaxacin)和85μl檢測寡核苷酸(R7-4mM磷酸鈉，1mM磷酸鉀，pH7.0，0.1％牛血清白蛋白，0.5％酚)。將100μl上述制備液置于試劑盒提供的Strip R1的陽性對照孔(被擴增基因的共有序列捕獲)上，或鏈霉抗生物素蛋白包被的Combiplate 8平板(參考目錄95029263，Labsystem，Helsinki，F(xiàn)inland)的孔上，或者對照Maxisorb平板(Nunc，Denmark)的孔上。
平行試驗中，同樣的雜交反應(yīng)是用EB緩沖液10倍和100稀釋DNA制備液以測試該技術(shù)的靈敏度。
實施例45.2對照組的制備對照樣品同時按照下列方式制備
A.比較HLA-DR試劑盒將按照實施例5.1描述的方法用PCR擴增得到的10μl DNA與20μl對-Bio-EG3-PDAM在60℃溫育30min。標(biāo)記后，DNA用QIAquick柱純化，將最終洗脫物溶于50μl EB緩沖液中。將45μl洗脫液用4.5μl試劑R4在室溫下變性5min，然后溶液用4.5μl試劑R5中和?；旌衔镏屑尤?50μl雜交緩沖液R6和45μl檢測寡核苷酸。將100μl上述制備液置于試劑盒提供的Strip R1的陽性對照孔(與擴增基因的共有序列雜交)上，或鏈霉抗生物素蛋白Combiplate 8平板上，或者對照Maxisorb平板上。
B.存不與特異性探針雜交的DN上講行雜交將按照實施例5.1描述的方法用PCR擴增得到的10μl DNA與20μl對-Bio-EG3-PDAM在60℃溫育30min。樣品的其他處理方法與上面實施例A描述的步驟相同。
C.無DNA對照將10μl試劑R6(雜交緩沖液)和100μl試劑R7(檢測寡核苷酸)置于試劑盒提供的Strip R1的陽性對照孔上，或鏈霉抗生物素蛋白平板上，或者Maxisorb對照平板上。
將上述試驗中所有條帶在37℃溫育1h 30min，然后用100μl PBS Tween緩沖液(試劑盒的Color 0 HLA試劑)洗滌三次，加入100μl顯色試劑(Color 2試劑，PBS pH7.0；1％ Tween，0.2g/l BND；0.01g/l Ciproflaxacin)在暗處溫育20min顯示特異性檢測探針的存在，然后用50μl H2SO2(1.8N Color 3試劑)終止反應(yīng)。然后測量反應(yīng)介質(zhì)在492nm處的吸光度。
結(jié)果
NA＝?jīng)]有表33在微孔板上特異性檢測PCR得到的DNA
表33的結(jié)果顯示靶的極好的擴增有可能使其用于診斷。本實施例說明在磷酸基團上的標(biāo)記可以使DNA被捕獲且不會阻礙其特異性雜交。
實施例46細(xì)菌裂解物來源的DNA的捕獲和擴增以及用對-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記本實施例說明用基于疊氮甲基官能團對核酸上磷酸基的反應(yīng)性的捕獲有可能捕獲的擴增細(xì)菌DNA。
在本實施例中，細(xì)菌裂解物中含有的核酸用對-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記，然后被捕獲到鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠上。利用磁珠可以通過磁性使核酸固定，以便在連續(xù)洗滌過程中除去反應(yīng)介質(zhì)中存在的細(xì)胞殘留物，去除這些殘留物是必需的，因為它們可抑制隨后進行的PCR擴增。
擴增產(chǎn)物可以通過DNA芯片分析。
細(xì)菌DNA是通過裂解結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物中的細(xì)胞獲得的。裂解是用機械裂解進行的。準(zhǔn)確的說是用超聲法進行的，所處理的液體樣品中含有玻璃珠。這種方法中關(guān)于磁珠的部分已由專利申請WO-A-99/15621的申請人描述，超聲法在專利申請WO-A-00/60049中也有描述。超聲法也可用液體浴進行。
但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知的其他方法也可使用，如專利US-A-5,902,746以及專利申請WO-A-98/54306和WO-A-00/05338所描述的方法。所有這些方法的工業(yè)產(chǎn)權(quán)都屬于專利申請人。
細(xì)菌DNA的定量用Picogreen(P-7589；Molecular Probes.Eugene，OR，USA)按照廠商提供的說明書進行，濃度為107拷貝/μl。
將10μl裂解物與20μl對-Bio-EG3-PDAM混和，在60℃溫育30min。作為平行對照，將10μl裂解物加入到20μl純水(Sigma)中在相同條件下溫育。
然后用QIAquick柱(Nucleotide Removal Kit，Qiagen，Hilden，Germany)純化反應(yīng)介質(zhì)。純化方法是廠商推薦的。最終的洗脫物體積為50μl。
然后將標(biāo)記的DNA片段捕獲到Dynal磁珠(Dynabeads M-280鏈霉抗生物素蛋白；參考目錄112.05；Dynal Biotech ASA，Oslo，Norway)上，其制備方法如下90μl Dynal珠用200μl純水(Sigma)洗滌兩次，然后收集到200μl PEG緩沖液(0.1M NaPO4，pH7，0.5M NaCl；0.65％ Tween 20；0.14ml鯡精DNA(參考目錄15634-017，GibcoBRL)；2％ PEG 4000)，在37℃溫育30min。然后用200μl含0.5％Tween的1×PBS緩沖液洗滌兩次，最后收集到90μl相同緩沖液中。
10μl標(biāo)記或未標(biāo)記的DNA洗脫物與40μl PEG緩沖液和2.5μl如上所述制備的磁珠在室溫溫育5min。
然后用200μl含0.5％ Tween的1×PBS緩沖液洗滌磁珠三次，收集到200μl水中，60℃溫育20min，然后再用200μl PBS Tween洗滌四次。最后將磁珠收集到25μl水中，按照實施例5.1描述的方法進行PCR。進行兩個反應(yīng)對照，一個是25μl純水，另一個是2.5μl制備的磁珠，在與生物樣品相同的條件下洗滌，收集到25μl水中。
結(jié)果PCR產(chǎn)物用Picogreen(P-7589；Molecular Probes，Eugene，OR，USA)按照廠商所提供的說明書定量。該方法基于所用的分子(Picogreen)只有在定位到DNA分子內(nèi)部(嵌入到兩個堿基之間)時才能變成熒光的特征。由于這種嵌入具有很高的特異性，并且因為所產(chǎn)生的熒光信號與介質(zhì)中存在的DNA量成正比，因此可以用這種方式很精確地分析樣品中存在的DNA濃度。檢測到的信號用rfu(相對熒光單位)表示。
凝膠分析PCR的結(jié)果顯示，在用對-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記的基因組DNA制備的樣品中，在凝膠的預(yù)期位置上出現(xiàn)一條單一的特異性條帶。當(dāng)用非標(biāo)記基因組DNA進行PCR時就檢測不到該條帶。用Picogreen進行DNA定量有可能確定從捕獲在磁珠上的基團組DNA中生產(chǎn)的DNA。
表34從細(xì)菌裂解物中通過PCR產(chǎn)生的DNA的定量以及通過對-Bio-EG3-PDAM的捕獲和純化按照實施例8描述的方法在DNA芯片上分析有可能確定下面表35中所示的擴增的特異性。
表35用對-Bio-EG3-PDAM捕獲和純化的靶的特異性檢測本實施例說明制備生物樣品以擴增其所含有的核酸是可能的，所用的捕獲技術(shù)是基于疊氮甲基官能團對磷酸基團的反應(yīng)性。
實施例47連續(xù)擴增兩個來源于捕獲在固相支持物上的細(xì)菌DNA的基因本實施例說明利用疊氮甲基官能團對磷酸基團的反應(yīng)性對捕獲的不同的靶DNA擴增幾次是可能的。
在本實施例中，細(xì)菌裂解物中含有的核酸用對-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記，然后被捕獲到鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠上。利用磁珠可以通過磁性使核酸固定，以便在連續(xù)洗滌過程中除去反應(yīng)介質(zhì)中存在的細(xì)胞殘留物，去除這些殘留物是必需的，因為它們可抑制隨后進行的PCR擴增。這些擴增發(fā)生在基因組DNA中存在的兩個不同的基因上，分別命名為16S和rpoB。采用與DNA芯片分析這兩個基因。
按照實施例46所描述的方法通過裂解結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物中的細(xì)胞獲得細(xì)菌DNA。細(xì)菌DNA的定量用Picogreen按照廠商提供的說明書進行，濃度為107拷貝/1μl。
將10μl裂解物與20μl對-Bio-EG3-PDAM混和，在60℃溫育30min。作為平行對照，將10μl裂解物加入到20μl純水(Sigma)中在相同條件下溫育。
然后用QIAquick柱(Nucleotide Removal Kit，Qiagen，Hilden，Germany)純化反應(yīng)介質(zhì)。純化方法是廠商推薦的。最終的洗脫物體積為50μl。
然后將標(biāo)記的DNA片段捕獲到Dynal磁珠上，其制備方法如下90μl Dynal珠用200μl純水(Sigma)洗滌兩次，然后收集到200μl PEG緩沖液(0.1M NaPO4，pH7，0.5M NaCl；0.65％ Tween 20；0.14ml鮭精DNA(GibcoBRL)；2％ PEG 4000)，在37℃溫育30min。然后用200μl含0.5％ Tween 20的1×PBS緩沖液洗滌兩次，最后收集到90μl相同緩沖液中。
10μl標(biāo)記或未標(biāo)記的DNA洗脫物與40μl PEG緩沖液和2.5μl如上所述制備的磁珠在室溫下溫育5min。
然后用200μl含0.5％ Tween的1×PBS緩沖液洗滌磁珠三次，然后收集到200μl水中，60℃溫育20min，然后再用200μl PBS Tween洗滌四次。最后將磁珠收集到25μl水中，按照實施例5.1描述的方法進行PCR。進行兩個反應(yīng)對照，一個是25μl純水(Sigma)，另一個是2.5μl制備的磁珠，在與生物樣品相同的條件下洗滌，收集到25μl水中。
擴增以后，收集反應(yīng)介質(zhì)，將磁珠分離，用150μl含0.5 Tween的1×PBS洗滌，然后重懸于25μl純水(Sigma)中。另外一個擴增是在磁珠上進行的，但在有引物的情況下用于擴增rpoB基因。
對照組的擴增是用非捕獲的基因組DNA，與兩個擴增系統(tǒng)(rpo和16S)平行進行。結(jié)果所得到的PCR產(chǎn)物用DNA芯片按照實施例8描述的方法分析。
表36DNA芯片分析經(jīng)過連續(xù)PCR擴增或不連續(xù)擴增得到的DNA擴增子凝膠分析PCR的結(jié)果顯示，在用-Bio-EG3-PDAM標(biāo)記的基因組DNA制備的樣品中，在凝膠的預(yù)期位置上出現(xiàn)一條單一的特異性條帶。在用非標(biāo)記基因組DNA進行PCR時就檢測不到該條帶。
如上面表36所顯示的用DNA芯片進行分析可能確定兩次連續(xù)擴增的特異性，因而能夠從固定在固相支持物上的DNA中連續(xù)擴增幾個基因，從而有可能避免開發(fā)多重系統(tǒng)(multiplex systems)，這種系統(tǒng)常常會降低核酸擴增的敏感性和效率。
實施例48在攜帶疊氮甲基基團的尼龍膜上捕獲和擴增DNA將尼龍膜活化以使其攜帶疊氮甲基基團，用于捕獲細(xì)菌DNA，目的是通過PCR擴增DNA。
實施例48.1Biodyne C濾膜的修飾合成流程
化合物68將3’-氨基苯乙酮(14.5g，107mmol)溶于50ml無水DMF中。加入琥珀酐(10.7g，107mmol)，混合物在室溫氬氣下續(xù)攪拌。6h后溶液在真空下縮，然后加入50ml甲醇。過濾后得到的沉淀物用甲醇和乙醚洗滌。由此19.4g(81％)在色粉末狀產(chǎn)物68。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝2.5-2.6(m，7H)；7.45(t，1H)；7.64(d，1H)；7.83(d，1H)；8.19(s，1H)；10.16(s，1H)；12.12(s，1H)。
化合物69將5.07g(22 mmol)化合物68在氬氣下溶于10ml無水DMF中。溶液置于冰上，然后加入5.00g(32mmol)羰基二咪唑。20分鐘后緩慢加入20ml(94.6mmol)4，7，10-三噁十三烷二胺(EG3)。在室溫下反應(yīng)3h后蒸發(fā)DMF，殘留物收集到100ml CH2Cl2中。用飽和NaHCO3和H2O提取，然后用無水Na2SO4干燥有機相，蒸發(fā)溶劑。由此得到4.34g(46％)產(chǎn)物69。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝1.59(m，2H)；1.87(m，2H)；2.16(s，3H)；2.40(m，2H)；2.55(m，2H)；3.08(m，2H)；3.45(m，16H)；7.30(t，1H)；7.42(d，1H)；7.70(d，1H)；7.83(t，1H)；7.97(s，1H)；10.00(s，1H)。
化合物91在一張Biodyne C濾膜(參考目錄60314；Pall Gelman Laboratory；Ann Arbor；Michigan；USA)上剪出一個4cm2的矩形，放入一個瓶子中，使之與3ml含有0.97g(6mmol)羰基二咪唑(CDI)的無水DMF接觸，瓶子置于冰上，氬氣下劇烈攪拌。20min后將溶液去掉，濾膜用DMF洗滌。然后加入3ml含0.53g產(chǎn)物68(1mmol)的無水DMF，在室溫下反應(yīng)過夜。然后去掉溶液，濾膜用乙醇漂洗，在真空下干燥并在氬氣下保存。
化合物92將修飾的濾膜91置于97ml一水合肼(2mmol)和4ml無水乙醇的溶液中。溶液回流5h。溶液冷卻后用水、乙醇和乙醚洗滌濾膜，真空下干燥然后置于氬氣下。然后加入4ml無水DMF和86mg MnO2(1mmol)，混合物劇烈攪拌使之反應(yīng)。20min后將溶液棄掉，濾膜用DMF和乙醚漂洗。疊氮甲基修飾的濾膜92于氬氣下貯存于-19到-31℃。
實施例48.2生物學(xué)試驗將活化的膜剪成2mm2的小片，與25μl結(jié)核分枝桿菌裂解物和375μl純水(Sigma)一起在室溫下培養(yǎng)30min，所用的細(xì)菌裂解物是通過機械裂解制備的，其方法和最終濃度與實施例46相同。
然后將膜置于100ml洗滌緩沖液(5％甲酰胺(Sigma)，1×SSPE(Perbio)，0.01％Triton X-100)中在65℃溫育60min以去除吸附到膜上的非特異性核酸，然后在擴增前將膜儲存在1ml純水中。
按照實施例5.1.1所描述的進行PCR，反應(yīng)體積用足夠量的純水調(diào)整。
平行對照的設(shè)置按照與上面一樣的過程進行，所用的膜沒有核酸共價結(jié)合。
·非修飾Biodyne C膜(膜A)，·按照描述的方法化學(xué)修飾Biodyne膜，但不用無水DMF和MnO2處理；此對照有可能確定在無疊氮甲基基團的情況下膜的特性(膜B)，以及·Biodyne C膜不進行修飾，但是用無水DMF和MnO2劇烈攪拌20min處理，此對照有可能確定這種處理步驟不會改變DNA對膜的吸附(膜C)。
為了檢驗對膜的處理不會抑制PCR，同時用另外三個膜A，B和C的小片與25μl細(xì)菌裂解物進行擴增(管A’，B’和C’)。
PCR產(chǎn)物用Picogreen按照廠商提供的說明書進行定量。
結(jié)果
表37從捕獲在固相支持物上的細(xì)菌裂解物的DNA經(jīng)PCR得到的DNA的定量表37的這些結(jié)果說明，將從裂解液得到的核酸通過疊氮化學(xué)方法共價捕獲在固相支持物上是可能的。觀察到擴增不是由于DNA與膜的非特異吸附。另一方面，用PCR進行的對照觀察到膜不會抑制擴增反應(yīng)。
為了檢測膜上擴增產(chǎn)物的性質(zhì)，擴增產(chǎn)物按照上述的方法通過DNA芯片分析。
權(quán)利要求
1.對溫度穩(wěn)定的式(0)的標(biāo)記試劑 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n等于0或1的整數(shù)，●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是0-2之間的整數(shù)，優(yōu)選等于0或1，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
2.如權(quán)利要求1所述的式(1)的標(biāo)記試劑 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
3.如權(quán)利要求1和2所述的式(2)的試劑 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，和●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
4.如權(quán)利要求1和2所述的式(3)的試劑 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，和●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
5.如權(quán)利要求1和2所述的式(4)的試劑 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，和●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
6.如權(quán)利要求1所述的式(21)的試劑 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于1，和●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，
7.如權(quán)利要求1所述的式(22)的試劑 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于1，和●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，
8.如權(quán)利要求1所述的式(23)的試劑 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于1，和●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，
9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的試劑，其中，R3和R4分別表示H，NO2，OCH3，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2。
10.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的式(2’)的試劑 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，和●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，
11.如權(quán)利要求1或6所述的式(24)的試劑 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，和●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是0-2之間的整數(shù)，優(yōu)選等于0或1。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的試劑，其中，結(jié)構(gòu)R2-(L)n-如式(5) 其中●R2表示可檢測標(biāo)記，●m是1-100之間的整數(shù)，和●p是1-10之間的整數(shù)。
13.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的式(6)的試劑 其中●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●R3表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
14.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的式(25)的試劑 其中●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●R3表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于1，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
15.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的式(14)的試劑 其中●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，和●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)。
16.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的式(26)的試劑 其中●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于1，和●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)。
17.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的式(15)的試劑 其中●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)。
18.如權(quán)利要求1-6所述的式(27)的試劑 其中●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于1，和●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項所述的試劑，其特征在于，L包含單元-(O-CH2-H2)-，該單元重復(fù)1-10次，優(yōu)選重復(fù)1-10次，更優(yōu)選重復(fù)2-5次。
20.合成如權(quán)利要求1-19中任一項所述標(biāo)記試劑的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a)得到式(16a)的衍生物 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R6，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●R6表示COOH，COOM，NH2，OH或SH，其中M＝烷基，尤其是甲基或乙基，和●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于0或1的整數(shù)，b)得到具有與R6互補的反應(yīng)官能團R7的標(biāo)記或標(biāo)記前體，c)在至少一種偶聯(lián)劑存在時，使所述標(biāo)記或標(biāo)記前體的互補官能團與式(16a)的衍生物的官能團R6反應(yīng)以形成共價鍵，d)使肼或它的一個衍生物與酮或醛官能團反應(yīng)以形成腙，和e)用合適的方法將腙轉(zhuǎn)化成重氮甲基官能團。
21.合成如權(quán)利要求1-19中任一項所述標(biāo)記試劑的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a)得到式(16a)的衍生物 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R6，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●R6表示COOH，COOM，NH2，OH或SH，其中M＝烷基，尤其是甲基或乙基，和●A是包含至少一個共價雙鍵的連接臂，它能使重氮官能團和芳環(huán)共軛，u是等于0或1的整數(shù)，b)得到具有至少兩個相同或不同的反應(yīng)官能團R8的連接臂L，第一個官能團R8與R6互補，第二個官能團R8與R7互補，此外，得到具有反應(yīng)官能團R7的標(biāo)記或標(biāo)記前體，c)在至少一種偶聯(lián)劑存在時，使連接臂L的第一個反應(yīng)官能團R8與式(16a)的衍生物反應(yīng)以形成共價鍵，然后在至少一種偶聯(lián)劑存在時，使連接臂L的第二個反應(yīng)官能團R8與標(biāo)記或標(biāo)記前體反應(yīng)以形成共價鍵，d)使肼或它的一個衍生物與酮或醛官能團反應(yīng)以形成腙，和e)用合適的方法將腙轉(zhuǎn)化成重氮甲基官能團。
22.如權(quán)利要求20或21所述的合成方法，它包含●包括保護化合物(16a)的酮或醛官能團的額外步驟，和●將所述酮或醛官能團去保護的額外的后續(xù)步驟。
23.如權(quán)利要求20所述的合成方法，它包括進行以下步驟a)得到式(16)的衍生物 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R6，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，和●R6表示COOH，NH2，OH或SH。b)得到具有與R6互補的反應(yīng)官能團R7的標(biāo)記或標(biāo)記前體，c)在至少一種偶聯(lián)劑存在時，使所述標(biāo)記或標(biāo)記前體的互補官能團與式(16)的衍生物的官能團R6反應(yīng)以形成共價鍵，d)使肼或它的一個衍生物與酮或醛官能團反應(yīng)以形成腙，和e)用合適的方法將腙轉(zhuǎn)化成重氮甲基官能團。
24.合成如權(quán)利要求10所述的標(biāo)記試劑的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a)得到式(17)的衍生物 其中R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，b)得到具有羧酸官能團的標(biāo)記或標(biāo)記前體，c)在至少一種偶聯(lián)劑存在時，使所述標(biāo)記或標(biāo)記前體的羧基官能團與式(17)的衍生物的伯胺官能團反應(yīng)以形成酰胺鍵，d)使肼與式(17)的衍生物的酮或醛官能團反應(yīng)以形成腙，和e)在MnO2存在時氧化所述腙以形成重氮甲基官能團。
25.標(biāo)記生物分子，尤其是核酸的方法，其特征在于，所述方法包括使生物分子與權(quán)利要求1-19任一所述的試劑在基本上是含水緩沖液的均勻溶液中接觸。
26.用權(quán)利要求25所述的方法可獲得的標(biāo)記的生物分子。
27.標(biāo)記并片段化單鏈或雙鏈核酸的方法，其特征在于，所述方法包括任何順序的以下步驟-將所述核酸片段化，-通過選自式(19)的化合物將一個標(biāo)記附到至少一個片段上 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，和●Z包括可檢測標(biāo)記，所述試劑主要和所述片段的至少一個磷酸共價偶合。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述標(biāo)記試劑選自式(20)的化合物 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一個可檢測標(biāo)記或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)連在一起的可檢測標(biāo)記，●L是包含至少兩個共價鍵的線性連續(xù)的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，和●Z選自 或 或 或 其中■R3和R4分別表示H，NO2，Cl，Br，F(xiàn)，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，和■-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，Z是
30.如權(quán)利要求27-29中任一項所述的方法，其中，所述片段化和標(biāo)記在兩個步驟中進行。
31.如權(quán)利要求27-29中任一項所述的方法，其中，所述片段化和標(biāo)記在一個步驟中進行。
32.如權(quán)利要求27-31中任一項所述的方法，其中，所述標(biāo)記是在基本上是含水的均勻溶液中進行的。
33.如權(quán)利要求27-32中任一項所述的方法，其中，所述片段化是通過酶，物理或化學(xué)途徑進行的。
34.能夠用權(quán)利要求27-33中任一所述方法獲得的標(biāo)記的核酸。
35.用來檢測靶核酸的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求34所述的標(biāo)記的核酸。
36.其上附有權(quán)利要求1-19中任一項所述試劑的固相支持物。
37.捕獲核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟●得到其上直接或間接附有至少一個含有重氮甲基官能團的分子的固相支持物，●使可能含有游離核酸的生物樣品與其接觸，和●將固相支持物上共價結(jié)合了至少一個核酸的一個或多個分子洗去。
全文摘要
本發(fā)明涉及對溫度穩(wěn)定的標(biāo)記試劑，它具有以下結(jié)構(gòu)如圖其中·R
文檔編號C07H21/04GK1518536SQ02812490
公開日2004年8月4日 申請日期2002年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月4日
發(fā)明者C·鮑格特, J·洛姆, A·拉揚, M·柯特拉, E·特里維希奧, L·梅諾, E·博納門德茲, C 鮑格特, 乩, 擅諾倫, 鏤 ０ 申請人:比奧·麥利尤股份有限公司, 約瑟夫福理埃大學(xué)(格勒諾布爾1), 國家科學(xué)研究中心, 比奧 麥利尤股份有限公司