專利名稱：人血清白蛋白的純化的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2001年6月13日提交的專利USSN 60/297,884的優(yōu)先權(quán)。此處該專利作為參考文獻(xiàn)引用。
背景技術(shù)：
在血液中，血清白蛋白是含量最多的蛋白質(zhì)之一。血液中它們具有例如脂肪酸之類疏水分子的載體的作用，并且與有機(jī)分子結(jié)合將其隔離直至可將其清除，起到澄清劑的作用。由于它們?cè)谘褐泻控S富，血清白蛋白是決定血液性質(zhì)，尤其是血清性質(zhì)的主要決定因素。
第二次世界大戰(zhàn)中，人們認(rèn)識(shí)到可以將hSA(人血清白蛋白)配制成生理性適用溶液來(lái)制成人類血液的代用品(人造血液)，用來(lái)補(bǔ)償創(chuàng)傷或外科手術(shù)造成的失血。參見(jiàn)Cohn et al.(1946)，J.Amer.Chem.Soc.68459-75。實(shí)際上，由于人體可以迅速地補(bǔ)充喪失的血細(xì)胞并且不會(huì)出現(xiàn)血型相容性的問(wèn)題，大多數(shù)情況下這種人造血液都是理想的血液替代品。此外，hSA溶液比真正的血液具有遠(yuǎn)遠(yuǎn)更長(zhǎng)的保質(zhì)期。然而由于血液中hSA的含量高，即使生產(chǎn)極少量的人造血液也需要高度純化的大量hSA。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中hSA的重組生產(chǎn)非常吸引人，因?yàn)榭梢匝杆購(gòu)闹蝎@得大量的蛋白質(zhì)，因此就有可能大批量地生產(chǎn)人造血液。令人遺憾的是，重組生產(chǎn)的hSA不能直接使用首先除了將hSA從宿主樣品中存在的其他分子如脂類、小分子物質(zhì)、蛋白質(zhì)和病毒病原體中提純，還必須從宿主動(dòng)物的血清白蛋白中將其純化。其次，目前從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物源獲得的樣品中著手生產(chǎn)人造血液級(jí)hSA的工序即費(fèi)時(shí)又昂貴。至少部分原因是適合作轉(zhuǎn)基因宿主的動(dòng)物中存在與之高度相似的血清白蛋白，將hSA從中分離存在相當(dāng)難度。因而盡管在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中重組生產(chǎn)hSA具有產(chǎn)生大量純凈hSA和人造血液的潛力，其可行性受到經(jīng)濟(jì)因素的限制。
發(fā)明概述本發(fā)明部分基于一種可區(qū)分人血清白蛋白(hSA)和宿主細(xì)胞血清白蛋白的分離方法的發(fā)現(xiàn)，宿主細(xì)胞可以是例如來(lái)自于轉(zhuǎn)基因乳制品動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。hSA的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)會(huì)形成同時(shí)含有hSA和動(dòng)物內(nèi)源血清白蛋白的產(chǎn)品。然而，通常必須獲得純化的hSA，其中不含雜質(zhì)，尤其是非人類動(dòng)物來(lái)源的血清白蛋白。從獲自于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，比如轉(zhuǎn)基因乳制品動(dòng)物的樣品中將hSA純化，這個(gè)過(guò)程可能由于此類動(dòng)物血清白蛋白和hSA高度的同源性而復(fù)雜化。舉例來(lái)說(shuō)hSA和牛血清白蛋白(BSA)非常相似。令人驚喜的是已發(fā)現(xiàn)使用一種方案可以適當(dāng)和有效地從宿主細(xì)胞血清白蛋白中純化轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的hSA，該方案包括澄清含有hSA和內(nèi)源血清白蛋白的樣品，用選擇性結(jié)合hSA的樹脂進(jìn)行親和層析，待蛋白質(zhì)從親和柱上洗脫后將hSA結(jié)晶。
因此，從一方面來(lái)看，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種從含有hSA和宿主血清白蛋白的樣品中純化人血清白蛋白(hSA)的方法，該方法包括從宿主細(xì)胞獲得含有hSA和宿主血清白蛋白的樣品；上樣到結(jié)合hSA的親和柱，例如，與宿主血清白蛋白相比該柱與hSA有更強(qiáng)的結(jié)合親和力；將結(jié)合的hSA從親和柱上洗脫下來(lái)；并且將洗脫的hSA結(jié)晶。
一些實(shí)施方案中樣品獲自于轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物。該動(dòng)物可為哺乳動(dòng)物，比如有蹄類動(dòng)物(如牛，山羊、或綿羊)、豬、小鼠或者兔。樣品可以從例如哺乳動(dòng)物的乳汁、血液或者組織(例如組織勻漿)中獲得。其他實(shí)施方案中，樣品從鳥類如雞、火雞、鴨子、野雞或者鴕鳥中獲得。舉例來(lái)說(shuō)，樣品可以獲自鳥類的卵、血液或者組織(例如組織勻漿)。優(yōu)選實(shí)施方案中，所選動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，且樣品為乳汁。
其他實(shí)施方案中，樣品為培養(yǎng)的細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞、魚類細(xì)胞或者昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)基。一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)的細(xì)胞為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)的細(xì)胞可包含轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因包含在合適調(diào)控元件控制下的編碼hSA的核酸序列。
一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的樣品為通過(guò)例如離心之類標(biāo)準(zhǔn)脫脂質(zhì)程序進(jìn)行脫脂的乳汁。
在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的乳汁(例如脫脂質(zhì)乳汁)樣品經(jīng)過(guò)了除酪蛋白處理。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)降低乳汁的pH值形成包含酪蛋白的重沉淀物可以將乳汁中酪蛋白的水平降至最低。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)加酸將乳汁的pH值降低，例如向乳汁中加稀乙酸之類的稀酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中乳汁的pH值降至約4.2至4.8。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)過(guò)濾除去乳汁中酪蛋白的重沉淀物，例如使用切向流微過(guò)濾法。其他實(shí)施方案中，從乳汁中通過(guò)離心除去酪蛋白的重沉淀物。在另一些其他實(shí)施方案中，不使用酸性沉淀酪蛋白，通過(guò)切向流過(guò)濾將酪蛋白從樣品中除去。
一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的樣品可以是已除凈酪蛋白的脫脂質(zhì)乳汁。此處該樣品稱為“澄清的乳汁樣品”。
澄清的hSA樣品可以進(jìn)行親和層析或者在此之前再進(jìn)行一道或更多道純化程序。一些實(shí)施方案中純化的hSA樣品存在于適于親和柱上樣的鹽緩沖液中。例如，鹽緩沖液可以包含例如pH為8.5的250mM NaCl以及低濃度的非離子去垢劑。
一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括使用與hSA樣品(例如澄清的hSA樣品)中的hSA蛋白質(zhì)結(jié)合的親和柱，其中親和柱包含合成樹脂。在Prometic Biosciences Blue SA柱中發(fā)現(xiàn)適于結(jié)合hSA的人造樹脂，該柱使用染料活性藍(lán)2(Reactive Blue 2)的修飾體作為親和配基。在優(yōu)選實(shí)施方案中，親和柱，例如合成樹脂親和柱，基本不和hSA樣品中多數(shù)甚至大多數(shù)非hSA蛋白質(zhì)結(jié)合(例如乳清蛋白質(zhì))。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，親和柱，例如合成樹脂親和柱，與非人血清白蛋白的親和力，例如牛血清白蛋白之類的哺乳動(dòng)物血清白蛋白，比其與hSA的親和力低。
在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括使用與hSA樣品(例如澄清hSA樣品)中hSA蛋白質(zhì)結(jié)合的親和柱，其中親和柱配基和hSA間的作用可被脂肪酸分子破壞。優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酸分子為辛酸鹽。
一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括將hSA樣品(例如澄清hSA樣品)加到柱上后對(duì)親和柱進(jìn)行清洗。優(yōu)選實(shí)施方案中，清洗緩沖液與上樣緩沖液相同。合適的清洗緩沖液包含例如pH為8.5的250mM NaCl以及低濃度的非離子去垢劑。
一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括使用洗脫緩沖液將與親和柱結(jié)合的hSA蛋白質(zhì)洗脫，從而制得親和純化的hSA樣品，其中洗脫緩沖液基本不引起與親和柱結(jié)合的非血清白蛋白蛋白質(zhì)的洗脫。使用Prometic Biosciences Blue SA柱時(shí)，合適的緩沖液可由磷酸鹽緩沖液和與親和柱上親和配基競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合hSA的脂肪酸分子組成。一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液包含約pH為6.0的20-50mM磷酸鹽溶液。一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液包含脂肪酸辛酸鹽，如濃度約為20mM。
一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括將親和純化所得hSA樣品再上樣到親和柱，清洗結(jié)合hSA的親和柱并且洗脫結(jié)合在親和柱上的hSA，從而獲得兩次親和純化的hSA樣品。在其他一些實(shí)施方案中，親和純化后的hSA樣品可以不止一次再上樣到親和柱，例如三次純化的hSA樣品。
之后親和純化的hSA樣品可以進(jìn)行結(jié)晶或者在結(jié)晶之前再進(jìn)行一道或多道額外的純化程序。
一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括向樣品中加入結(jié)晶劑將親和純化的hSA樣品(例如通過(guò)一次或兩次親和純化的hSA樣品)結(jié)晶。許多結(jié)晶劑都可以加入hSA溶液作為結(jié)晶引發(fā)劑，其包括聚乙二醇(PEG)、硫酸銨和/或磷酸鹽。優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)晶劑為磷酸鹽溶液。在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，作為結(jié)晶劑的磷酸鹽加入樣品中至最終濃度為2.7至2.8M磷酸鹽。一些實(shí)施方案中，結(jié)晶劑中還包含與hSA結(jié)合的脂肪酸分子，例如辛酸鹽。優(yōu)選方案中，通過(guò)例如過(guò)濾的方法將結(jié)晶的hSA蛋白質(zhì)從結(jié)晶溶液(即母液)中分離出來(lái)，用緩沖液清洗，并且用適當(dāng)?shù)娜軇?例如水)再次溶解。其他實(shí)施方案中，結(jié)晶的hSA蛋白質(zhì)可以通過(guò)例如使用一種溶劑或風(fēng)干的方法進(jìn)行干燥。干燥后的hSA蛋白質(zhì)晶體便可進(jìn)行儲(chǔ)存，比如在室溫儲(chǔ)存以長(zhǎng)期使用，并可隨意運(yùn)輸。一些實(shí)施方案中，干燥后的結(jié)晶hSA可再溶于適當(dāng)?shù)娜軇?例如水)。
另一方面，本發(fā)明的特點(diǎn)是一種將hSA從其他不同物種的血清白蛋白相分離的方法。該方法包括獲得還含有其他物種血清白蛋白的hSA樣品；將hSA樣品上樣到親和柱，相對(duì)于與其他物種血清白蛋白的結(jié)合，該親和柱對(duì)hSA具有更高的結(jié)合親和力；將hSA從親和柱上洗脫；并且將洗脫的hSA進(jìn)行結(jié)晶。
一些實(shí)施方案中，樣品從非人類動(dòng)物上獲得。該動(dòng)物可以是哺乳動(dòng)物，例如有蹄類動(dòng)物(例如牛、山羊或綿羊)、豬或者兔。樣品可以從例如哺乳動(dòng)物的乳汁、血液或者組織(例如組織勻漿)中獲得。其他實(shí)施方案中，樣品從鳥類如雞、火雞、鴨子、野雞或者鴕鳥中獲得。舉例來(lái)說(shuō)，樣品可獲自鳥類的卵、血液或者組織(例如組織勻漿)。優(yōu)選實(shí)施方案中，該動(dòng)物為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。優(yōu)選實(shí)施方案中，該動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，且樣品為乳汁，例如從轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中獲得的乳汁。
其他實(shí)施方案中，樣品為培養(yǎng)的細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞、魚類細(xì)胞或者昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)的細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。舉例來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)的細(xì)胞可含有在合適調(diào)控元件控制下的編碼hSA的核酸序列的轉(zhuǎn)基因。
一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的樣品為通過(guò)例如離心之類標(biāo)準(zhǔn)脫脂質(zhì)程序已除去脂質(zhì)的乳汁。
在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的樣品為經(jīng)過(guò)除酪蛋白處理的乳汁(例如脫脂乳汁)。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)降低乳汁的pH值形成包含酪蛋白的重沉淀物可以將乳汁中酪蛋白去除。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)加酸將乳汁的pH值降低，例如向乳汁中加稀乙酸之類的稀酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中乳汁的pH值降至約4.2至4.8。在一些實(shí)施方案中，從乳汁中通過(guò)過(guò)濾除去酪蛋白的重沉淀物，例如使用切向流微過(guò)濾法。其他實(shí)施方案中，從乳汁中通過(guò)離心除去酪蛋白的重沉淀物。在另一些其他實(shí)施方案中，不使用酸性沉淀酪蛋白，通過(guò)切向流過(guò)濾將酪蛋白從樣品中除去。
一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的樣品可以是已去除酪蛋白的脫脂質(zhì)乳汁。此處該樣品稱為“澄清的乳汁樣品”。
優(yōu)選的實(shí)施方案中，將hSA樣品上樣至親和柱，從親和柱上洗脫和/或按此處描述將其結(jié)晶。
另一方面，該發(fā)明包括一種包含hSA和非人類哺乳動(dòng)物血清白蛋白的組合物，其中非人類哺乳動(dòng)物的血清白蛋白的濃度低于5、4、3、2或者1ppm。優(yōu)選實(shí)施方案中，hSA和非人類哺乳動(dòng)物的血清白蛋白的比例低于1∶1,000、1∶10,000、1∶100,000。
附圖簡(jiǎn)述

圖1描繪的是一種具有染料配基的層析樹脂，包括染料活性藍(lán)2，該染料已知與血清白蛋白結(jié)合。R基團(tuán)可以由數(shù)種不同化合物，例如-NH-C6H4-(間位)SO3H，-NH-C6H4-(鄰位)SO3H，或者其混合物取代。載體為瓊脂糖。
發(fā)明詳述脫脂乳汁通過(guò)離心之類標(biāo)準(zhǔn)脫脂質(zhì)程序?qū)@自轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳汁樣品進(jìn)行脫脂。此處“脫脂質(zhì)乳汁”這個(gè)術(shù)語(yǔ)指的是撇去脂皮的乳汁。其他已知的方法包括將乳汁撇脂皮和/或沉淀方法來(lái)獲得脫脂質(zhì)樣品，參見(jiàn)例如H.E.Swaisgood，Developments in Dairy Chemistry，IChemistry of Milk Protein，Applied Science Publishers，NY，1982.
從樣品中去除酪蛋白本發(fā)明方法包括減少乳汁樣品，例如脫脂質(zhì)乳汁樣品中酪蛋白水平。優(yōu)選，在與進(jìn)行該步驟之前樣品中酪蛋白的水平相比，該步驟能使樣品中酪蛋白的水平至少降低70％、80％、90％、95％甚至更多。
使用本領(lǐng)域熟知的不同方法可以減少樣品中的酪蛋白水平。舉例來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)酸沉淀減少樣品的酪蛋白水平。優(yōu)選該酸為稀酸?？捎糜诔恋順悠分欣业鞍椎乃嵊欣缫宜?、硫酸以及磷酸。優(yōu)選該酸為乙酸。通過(guò)向樣品中加入酸，樣品的pH值降至約4.0至5.5、約4.1至5.2、約4.2至5.0或約4.2至4.8。酸化的樣品然后即可進(jìn)行離心或者切向流過(guò)濾來(lái)除去已沉淀的酪蛋白。在如U.S.專利號(hào)4,644,056中對(duì)酸沉淀酪蛋白有進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
可使用標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)式離心機(jī)在約2500至500×G的條件下進(jìn)行離心。另外，可以使用例如Alfa Laval或者Westphalia連續(xù)流盤疊離心機(jī)進(jìn)行離心。這些后面所說(shuō)的離心機(jī)尤其適于進(jìn)行大量離心。
酸化的樣品可進(jìn)行切向流過(guò)濾，將樣品通過(guò)帶有足夠孔徑濾膜的橫向流動(dòng)濾器，可至少擋住沉淀的酪蛋白的一部分(“滯留物”)，同時(shí)讓含有hSA的樣品(“滲透物”或者“濾出液”)通過(guò)該濾膜。在切向流過(guò)濾中，要過(guò)濾的樣品與膜狀濾器平行流動(dòng)，且濾出液穿過(guò)濾器。優(yōu)選，膜為一層空心纖維濾筒，孔徑大小平均約為0.08至1.2μm。市面上可購(gòu)得的膜孔徑平均為約0.1至1.2μm。舉例來(lái)說(shuō)，優(yōu)選實(shí)施方案中可使用Ceramem 0.2μm陶瓷塊。其他實(shí)施方案中，空心纖維濾筒為A/G Technologies 750K截流空心纖維。切向流過(guò)濾法的實(shí)例可在如U.S.專利號(hào)4,644,056中找到。
其他實(shí)施方案中，可以不將樣品酸化而將樣品酪蛋白水平降低。舉例來(lái)說(shuō)，可以將樣品通過(guò)U.S.專利號(hào)6,268,487中所闡述的切向流微過(guò)濾法處理。
不管樣品在進(jìn)行切向流過(guò)濾之前酸化與否，至少一部分的酪蛋白會(huì)被膜所滯留，而大部分的hSA仍留在濾出液中。優(yōu)選條件下，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％甚至樣品中更多的hSA在經(jīng)過(guò)切向流過(guò)濾后會(huì)保留在濾出液中。該濾出液隨后可用于下一步對(duì)hSA進(jìn)行純化。
親和層析可以用多種途徑進(jìn)行親和層析，并可使用化學(xué)合成樹脂(例如染料配基樹脂)或者蛋白質(zhì)偶聯(lián)樹脂(例如抗體偶聯(lián)樹脂)。參見(jiàn)例G.Hermanson等人，Immobilized Affinity Ligand Techniques，NewYorkAcademic Press 1992。當(dāng)決定選用何種樹脂純化如hSA之類的目的蛋白質(zhì)時(shí)，需要考慮的關(guān)鍵參數(shù)包括制造親和柱的成本、柱的可測(cè)量性、柱的瞬時(shí)質(zhì)量(temporal quality)(即在重復(fù)使用后用柱純化所得產(chǎn)物的質(zhì)量)。蛋白偶聯(lián)樹脂(例如抗體偶聯(lián)或者肽結(jié)合區(qū)域偶聯(lián)樹脂)對(duì)目的分子具有高的結(jié)合特異性，通常其結(jié)合常數(shù)可達(dá)到約10-7至10-10M，但是受限于其成本、可測(cè)量性以及壽命。另外，有時(shí)目的蛋白質(zhì)一旦結(jié)合到蛋白質(zhì)偶聯(lián)樹脂上后，處理程序上如果不破壞樹脂則難以將目的蛋白質(zhì)回收?；瘜W(xué)合成樹脂往往比蛋白質(zhì)偶聯(lián)樹脂價(jià)格低廉，更易擴(kuò)大規(guī)模，壽命更長(zhǎng)，但往往特異性較低，其結(jié)合常數(shù)約為10-5至10-9M。
在本發(fā)明方法中使用的親和柱可包括化學(xué)合成樹脂或蛋白質(zhì)偶聯(lián)樹脂。優(yōu)選，親和柱包括化學(xué)合成樹脂。化學(xué)合成樹脂的配基和hSA的親和力至少要達(dá)到10-5M，且更優(yōu)選至少達(dá)到10-6M，甚至達(dá)到10-7M或更低值。適于在本發(fā)明方法中使用的柱為Cibacron Blue 3GA柱，該產(chǎn)品在市面上廣為出售，具有如圖1所示的結(jié)構(gòu)，其中R基團(tuán)為以下結(jié)構(gòu)的混合物-NH-C6H4-(間位)SO3H，和-NH-C6H4-(鄰位)SO3H。另一適于本發(fā)明方法的柱為Prometic Biosciences Blue SA柱，該產(chǎn)品為染料配基柱家族中的一員，具有如圖1所示的樹脂結(jié)構(gòu)。一方面來(lái)看，染料配基柱為Cibacron Blue 3GA柱的變體之一，其中的R基團(tuán)不是混合物而是單一的-NH-C6H4-(間位)SO3H或者-NH-C6H4-(鄰位)SO3H成分。優(yōu)選，化學(xué)合成樹脂與hSA的親和力比它與其他血清白蛋白親和力高至少2、5、10、20、50甚至100倍，其他血清白蛋白例如BSA一類的非人類哺乳動(dòng)物血清白蛋白。
適合將含hSA的樣品上到親和柱的上樣緩沖液取決于特定的柱。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到對(duì)于任何特定柱均有多種適于hSA樣品上樣的緩沖液。對(duì)Prometic Biosciences Blue SA柱優(yōu)選的上樣緩沖液包括如pH為8-9的50至250mM鹽(例如NaCl或KCl)，以及低濃度的非離子去垢劑(例如0.01％至0.1％聚山梨醇酯20，即Tween 20)。澄清的hSA樣品在加到柱上之前優(yōu)選進(jìn)行滲濾(diafilter)，將澄清的hSA樣品的緩沖液替換成合適的柱上樣緩沖液。澄清的hSA樣品還可以進(jìn)行過(guò)濾以增加樣品中hSA蛋白質(zhì)的濃度。
合適的柱清洗緩沖液基本上與適用的上樣緩沖液相同(比如等同于)。清洗緩沖液中存在的去垢劑(例如聚山梨醇酯20)有助于從柱(例如Prometic Biosciences Blue SA柱)上除去非人血清白蛋白(例如BSA)，而hSA和柱的結(jié)合不受影響。
類似地，將hSA從與之結(jié)合的柱上洗脫的洗脫緩沖液依賴于柱的原本屬性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，同樣也存在多種不同的洗脫緩沖液適合從特定的與hSA結(jié)合的柱上將其洗脫。對(duì)于PrometicBiosciences Blue SA柱來(lái)說(shuō)，合適的洗脫緩沖液包括如pH為5至7的30至50mM磷酸鹽(例如磷酸鉀和磷酸鈉的混合物)，優(yōu)選pH值為5.5至6.5，以及10-30mM辛酸鹽。其他脂肪酸分子可以用來(lái)代替辛酸鹽，包括如，短鏈、中等鏈或者長(zhǎng)鏈脂肪酸，例如硬脂酸鹽、月桂酸鹽、豆蔻酸鹽和油酸鹽。優(yōu)選，和其他結(jié)合在柱上的非血清白蛋白蛋白質(zhì)(例如，血蛋白，乳蛋白，或組培培養(yǎng)蛋白質(zhì))相比，特定洗脫緩沖液洗脫hSA更容易，洗脫力是前者的2、5、10、20、50、100甚至更高倍。
如上面所討論的，蛋白質(zhì)偶聯(lián)親和柱也可以用于本發(fā)明方法。將hSA從含有其他非人類血清白蛋白(例如，非人類血清白蛋白如BSA)樣品中純化的典型蛋白質(zhì)偶聯(lián)親和柱含有重組的白蛋白結(jié)合區(qū)(ABD)蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)固定在交聯(lián)的瓊脂糖樹脂上。重組的白蛋白結(jié)合區(qū)蛋白質(zhì)在Johansson等人，J.Mol.Biol.1997，266859-865中有描述。優(yōu)選條件下，ABD柱對(duì)hSA的親和力至少比對(duì)其他血清白蛋白的親和力強(qiáng)10、20、50、100、500甚至1000倍，其他血清白蛋白如非人類哺乳動(dòng)物血清白蛋白，例如BSA。
適用于ABD偶聯(lián)柱的平衡和清洗緩沖液可包括如pH4.5至6.5的10-50mM乙酸鹽，優(yōu)選pH值為約5.0至6.0，以及50-250mM鹽，優(yōu)選濃度為100-150mM?？砂柠}有如NaCl或KCl。上樣之前，澄清的hSA樣品應(yīng)調(diào)節(jié)到pH為4.5至6.5，優(yōu)選pH值為5.0至6.0。可通過(guò)加酸(例如稀硫酸或磷酸)完成，或者根據(jù)hSA樣品的pH值，用堿調(diào)節(jié)(例如稀NaOH)或通過(guò)緩沖液交換(例如滲濾)將緩沖液換成平衡和沖洗緩沖液。該澄清的hSA樣品在上樣到柱上之前還可進(jìn)行過(guò)濾以增加hSA蛋白質(zhì)的濃度。使用低pH緩沖液，比如pH值為2.3至2.8，優(yōu)選2.5左右，可以將hSA從ABD偶聯(lián)柱上洗脫。洗脫緩沖液可包括25至100mM甘氨酸或者0.2至1.0M乙酸。優(yōu)選，所用洗脫緩沖液洗脫hSA比洗脫結(jié)合在柱上非血清白蛋白容易2、5、10、20、50、100甚至更多倍。
優(yōu)選，洗脫液中至少能回收加到親和柱上的樣品中的hSA的85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％甚至更多。類似地，優(yōu)選洗脫液中非hSA蛋白質(zhì)雜質(zhì)的濃度降低為加到親和柱上的hSA樣品中的五分之一、十分之一、一百分之一、一千分之一甚至更低。此類雜質(zhì)包括非hSA血液蛋白質(zhì)(例如凝固蛋白質(zhì)、脫輔基脂蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子)、乳汁蛋白質(zhì)(例如非人類哺乳動(dòng)物血清白蛋白(如BSA)、β-乳球蛋白、α-乳球蛋白以及例如IgG之類的抗體)、卵蛋白(例如溶菌酶)或者為條件細(xì)胞培養(yǎng)基中的常見(jiàn)蛋白質(zhì)(例如BSA或生長(zhǎng)因子)。
作為本發(fā)明方法的一部分親和層析步驟可選重復(fù)。這種情況下過(guò)一次柱的洗脫液只要進(jìn)行滲濾將洗脫緩沖液換成合適的柱上樣緩沖液。滲濾之前洗脫液可選進(jìn)行過(guò)濾以減少樣品中脂肪酸的量并濃縮hSA。在本發(fā)明方法中重復(fù)親和層析步驟時(shí)可使用多個(gè)親和柱。舉例來(lái)說(shuō)，可將化學(xué)合成樹脂柱(例如Cibacron Blue 3GA柱或PrometicBiosciences Blue SA柱)和蛋白質(zhì)偶聯(lián)柱(例如ABD柱)結(jié)合使用。柱的使用順序并不重要，不過(guò)優(yōu)選先使用化學(xué)合成樹脂柱以盡量延長(zhǎng)蛋白質(zhì)偶聯(lián)柱的使用壽命。
一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括連續(xù)進(jìn)行親和層析，例如在模擬移動(dòng)床系統(tǒng)上進(jìn)行。
結(jié)晶此處所用“結(jié)晶的hSA”指的是hSA區(qū)別于其不定型固體狀態(tài)的晶體固體狀態(tài)。晶體的特征在于具有晶格結(jié)構(gòu)、特征晶型，以及諸如折射率這樣的光學(xué)特性?？梢酝ㄟ^(guò)以下方法測(cè)定hSA是否為晶體光學(xué)顯微技術(shù)、電子顯微技術(shù)、x-射線粉末衍射、固體核磁共振(NMR)或者偏振光顯微技術(shù)。顯微技術(shù)除了可以用來(lái)測(cè)定晶體以單晶或多晶形式存在以外，還可以測(cè)定晶體長(zhǎng)度、直徑、寬度、大小和形狀。
可以通過(guò)向含有hSA的溶液(例如親和純化的hSA樣品)中加入鹽、PEG和/或者有機(jī)溶劑來(lái)形成hSA晶體?？捎脕?lái)結(jié)晶hSA的無(wú)機(jī)鹽包括硫酸銨、氯化鈉、氯化鉀、磷酸鈉(例如磷酸氫二鈉和/或磷酸二氫鈉)、磷酸鉀(例如，磷酸二氫鉀和/或偏磷酸鉀)或者其混合物。用于結(jié)晶hSA的無(wú)機(jī)鹽優(yōu)選磷酸鈉和/或磷酸鉀。可以同無(wú)機(jī)鹽一起向hSA樣品中加入脂肪酸分子(例如辛酸鹽或其他中等鏈或長(zhǎng)鏈脂肪酸)促進(jìn)結(jié)晶。舉例來(lái)說(shuō)，在5-15℃時(shí)向hSA樣品中逐漸加入含有pH為6.2的4M磷酸鹽(4M NaH2PO4和4M K2HPO4按70∶30體積比的混合物)和1至3mM辛酸鹽的溶液。磷酸鹽終濃度達(dá)到約2.7M至2.8M時(shí)hSA的結(jié)晶開(kāi)始形成。
優(yōu)選，在結(jié)晶樣品中的hSA至少有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％甚至更多得到回收，例如在重新溶解的樣品中。另外，優(yōu)選，結(jié)晶的hSA樣品中非hSA蛋白質(zhì)濃度在重新溶解后減少1、2、3、4、5、10、20甚至更多倍。此類雜質(zhì)包括非hSA血液蛋白質(zhì)(例如凝固蛋白質(zhì)、脫輔基脂蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子)、乳汁蛋白質(zhì)(例如非人類哺乳動(dòng)物血清白蛋白(如BSA)、β-乳球蛋白、α-乳球蛋白以及例如IgG之類的抗體)、卵蛋白(例如溶菌酶)或者為條件細(xì)胞培養(yǎng)基中的常見(jiàn)蛋白質(zhì)(例如BSA或生長(zhǎng)因子)。
hSA晶體可以從母液中分離，比如使用漏斗(例如布氏漏斗或同類裝置)，并用如pH為6.2的2.8M磷酸鹽緩沖液清洗。分離出的hSA晶體可以干燥并儲(chǔ)藏。或者將分離出的hSA晶體再溶解在合適的溶劑中，比如水或者適用于腸胃外用藥的稀鹽溶液(例如NaCl)。
儲(chǔ)存在純化過(guò)程中不同時(shí)刻均可將純化的hSA進(jìn)行過(guò)濾(例如無(wú)菌過(guò)濾)并且在無(wú)菌容器中儲(chǔ)存。儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)(數(shù)日或數(shù)月)，而且便于運(yùn)輸。舉例來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)澄清(即去除脂質(zhì)以及其他步驟，就如乳汁脫脂和脫酪蛋白)、親和柱純化、結(jié)晶，或用活性炭處理hSA之后進(jìn)行儲(chǔ)存。
腸胃外制劑按此處描述所制備的hSA樣品可以結(jié)合到藥物組合物中。此類組合物的特點(diǎn)是包含hSA和藥用載體。此處的術(shù)語(yǔ)“藥用載體”包括溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑以及諸如此類與藥物施用相兼容的物質(zhì)。藥物組合物中也可以結(jié)合補(bǔ)充的活性成分。
藥物組合物的設(shè)計(jì)要與其施用的預(yù)期途徑相兼容。對(duì)hSA優(yōu)選的施用途徑為腸胃外施用。用于腸胃外應(yīng)用的溶液或懸浮液可包括以下組分滅菌稀釋劑諸如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘氨酸、丙二醇或者其他合成溶劑；抗細(xì)菌劑如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液可為乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽以及諸如氯化鈉或葡萄糖之類調(diào)節(jié)張力的試劑?？梢酝ㄟ^(guò)如鹽酸或氫氧化鈉之類的酸或堿調(diào)節(jié)pH值。腸胃外制劑可用安瓿瓶、一次性注射器或者玻璃質(zhì)或塑料質(zhì)的多劑量藥瓶封裝。
將腸胃外組合物配制成劑量單位形式更利于方便施用和劑量統(tǒng)一化。此處所用劑量單位形式指的是適合治療對(duì)象使用的單元?jiǎng)┝康奈锢愍?dú)立單位；每單位包含據(jù)計(jì)算可產(chǎn)生預(yù)期療效并與必需藥物載體相連的預(yù)定量的hSA。
實(shí)施例實(shí)施例1從轉(zhuǎn)基因牛乳汁中純化hSA從含有重組hSA產(chǎn)物的去脂質(zhì)(脫脂)轉(zhuǎn)基因乳汁開(kāi)始，用乙酸(10-15％)將產(chǎn)物流酸化至pH4.2至4.8以沉淀酪蛋白。用切向流微過(guò)濾除去沉淀的酪蛋白，使用標(biāo)準(zhǔn)TFF系統(tǒng)，其帶有包括Ceramem0.2μm陶瓷塊或A/G Technologies 750K截流空心纖維的濾筒。
產(chǎn)物使用Prometic Biosciences Blue SA柱進(jìn)行親和層析純化。上樣/清洗緩沖條件含有pH8-9的50-250mM離子強(qiáng)度的NaCl以及低濃度聚山梨醇酯20(Tween 20)。產(chǎn)物用含有10-30mM辛酸鹽pH為5.5-6.5的20-50mM磷酸鹽緩沖液洗脫。
在批量反應(yīng)箱中進(jìn)行產(chǎn)物結(jié)晶，在5-15℃控制加入pH為6.2的4M磷酸鹽(4M NaH2PO4和4M K2HPO4按70∶30體積比的混合物)和1至3mM辛酸鹽，至磷酸鹽終濃度為2.7-2.8M。使用布氏漏斗過(guò)濾將晶體與母液分離，用2.8M磷酸鹽緩沖液清洗，按前面所述方法制備并重新溶解于水。結(jié)果如下表格1所示。
表格1
通過(guò)個(gè)別蛋白質(zhì)ELISA分析進(jìn)行純度測(cè)定。
ppm-百萬(wàn)分之(每克hSA中雜質(zhì)的微克量)BSA-牛血清白蛋白BLG-β-乳球蛋白ALA-α-乳清蛋白IgG-γ-球蛋白G實(shí)施例2使用兩種不同親和柱純化hSA從含有重組hSA產(chǎn)物的去脂質(zhì)(脫脂)轉(zhuǎn)基因乳汁開(kāi)始，樣品按實(shí)施例1中所述方法酸沉淀酪蛋白而澄清。隨后按前面所述進(jìn)行染料配基親和層析。
最后，對(duì)染料配基親和純化的洗脫液進(jìn)行ABD蛋白質(zhì)配基層析。使用的ABD柱平衡和清洗緩沖液含有pH5.0-6.0的10-50mM乙酸以及100-150mM NaCl。上樣至ABD柱之前，加入烯酸將hSA樣品pH值調(diào)節(jié)至5.0-6.0。使用pH為2.5的25-100mM甘氨酸緩沖液將hSA洗脫。純化結(jié)果如表格2所示。
表格2工序 代表性步驟hSA產(chǎn)量 ppm bSAppm IgG澄清的樣品流 99％ 2×1041×104染料配基層析 95％ 30030ABD蛋白質(zhì)配基層析 95％ 3 3此處引用的出版物和專利的內(nèi)容歸入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種從含有人血清白蛋白(hSA)和宿主細(xì)胞血清白蛋白的樣品中純化hSA的方法，包括從宿主細(xì)胞獲得含有hSA和宿主細(xì)胞血清白蛋白的樣品；上樣至親和柱，該親和柱結(jié)合hSA的親和力高于與宿主細(xì)胞的血清白蛋白的結(jié)合親和力；從親和柱上洗脫結(jié)合的hSA；和將洗脫下的hSA結(jié)晶。
2.權(quán)利要求1中所述方法，其中樣品從轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物中獲得。
3.權(quán)利要求2中所述方法，其中動(dòng)物選自牛、綿羊、山羊、豬、小鼠和兔。
4.權(quán)利要求2中所述方法，其中樣品從哺乳動(dòng)物的乳汁、血液或組織中獲得。
5.權(quán)利要求1中所述方法，其中樣品為用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
6.權(quán)利要求2中所述方法，其中樣品獲自其乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)hSA的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳汁。
7.權(quán)利要求6中所述方法，其中方法還包含將乳汁樣品脫脂質(zhì)。
8.權(quán)利要求6中所述方法，其中方法還包含對(duì)乳汁樣品進(jìn)行除酪蛋白處理。
9.權(quán)利要求8中所述方法，其中通過(guò)酸沉淀、離心或切向流過(guò)濾去除酪蛋白。
10.權(quán)利要求6中所述方法，其中樣品為澄清的乳汁樣品。
11.權(quán)利要求10中所述方法，其中澄清的乳汁樣品在鹽緩沖液中。
12.權(quán)利要求11中所述方法，其中鹽緩沖液包含pH為8.5的250mMNaCl和低濃度的非離子去垢劑。
13.權(quán)利要求11中所述方法，其中親和柱包含合成配基樹脂。
14.權(quán)利要求13中所述方法，其中合成配基樹脂使用染料活性藍(lán)2或者被修飾的染料活性藍(lán)2作為配基。
15.權(quán)利要求1中所述方法，其中與其結(jié)合hSA的親和力相比，該親和柱與宿主細(xì)胞血清白蛋白基本不結(jié)合。
16.權(quán)利要求1中所述方法，還包含上樣到柱上后對(duì)親和柱進(jìn)行清洗。
17.權(quán)利要求16中所述方法，其中清洗緩沖液包含pH為8.5的250mM NaCl以及低濃度的非離子去垢劑。
18.權(quán)利要求1中所述方法，其中使用洗脫緩沖液將hSA從親和柱上洗脫下來(lái)，該緩沖液基本不引起結(jié)合親和柱的非血清白蛋白蛋白質(zhì)的洗脫。
19.權(quán)利要求18中所述方法，其中洗脫緩沖液包含磷酸緩沖液和與柱上親和配基競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合hSA的脂肪酸分子。
20.權(quán)利要求19中所述方法，其中洗脫緩沖液包含pH約為6.0的20-50mM磷酸。
21.權(quán)利要求19中所述方法，其中脂肪酸分子為辛酸鹽。
22.權(quán)利要求1中所述方法，還包含將親和純化的hSA樣品上樣到親和柱或是第二根親和柱，清洗結(jié)合hSA的親和柱并且洗脫親和柱上結(jié)合的hSA，從而獲得兩次親和純化的hSA樣品。
23.權(quán)利要求1中所述方法，其中通過(guò)向樣品中加入結(jié)晶劑使結(jié)合的hSA結(jié)晶。
24.權(quán)利要求23中所述方法，其中結(jié)晶劑選自聚乙二醇(PEG)、硫酸銨、磷酸鹽或其混合物。
25.權(quán)利要求23中所述方法，其中結(jié)晶劑為磷酸鹽，且加至終濃度為2.7至2.8M。
26.權(quán)利要求23中所述方法，其中結(jié)晶劑還包含與hSA結(jié)合的脂肪酸分子。
27.權(quán)利要求27中所述方法，其中脂肪酸分子為辛酸鹽。
28.權(quán)利要求1中所述方法，其中從結(jié)晶溶液中將結(jié)晶的hSA分離出來(lái)。
29.包含按權(quán)利要求1中所述方法制成的hSA的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及從生產(chǎn)人血清白蛋白(hSA)的宿主細(xì)胞的內(nèi)源血清白蛋白中純化hSA的方法。該方法包括提供含hSA及宿主細(xì)胞的血清白蛋白的樣品，將樣品上樣到親和柱上，該柱結(jié)合hSA的親和力大于其結(jié)合宿主細(xì)胞血清白蛋白的親和力，從親和柱上洗脫結(jié)合的hSA，并將洗脫的hSA結(jié)晶，本發(fā)明還涉及包含由本發(fā)明的方法生產(chǎn)的hSA的組合物。
文檔編號(hào)C07K14/765GK1525977SQ02813703
公開(kāi)日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2002年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月13日
發(fā)明者S·富爾頓, S 富爾頓 申請(qǐng)人:陶洛斯Hsa有限責(zé)任公司