專利名稱：心血管安全測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及心血管安全測定領(lǐng)域，和提供篩選試驗(yàn)化合物在受試驗(yàn)者中誘發(fā)心臟毒性能力用的測定方法與試劑盒。所述測定方法與試劑盒基于下述發(fā)現(xiàn)可利用阿司咪唑與HERG鉀通道的相互作用，以在新的治療劑和其它試劑的開發(fā)過程中預(yù)計(jì)化合物的潛在心臟毒性。在化合物庫的高通量篩選中，本發(fā)明尤其有利。
背景技術(shù)：
證據(jù)表明數(shù)種藥物可延長心臟的復(fù)極化(因此以表面心電圖的QT間期形式測量)到潛在地威脅生命的心室心律不齊的程度，例如可出現(xiàn)尖端扭轉(zhuǎn)(TdP)(torsades de pointes)，尤其在過劑量或藥代動(dòng)力學(xué)相互作用的情況下。
在有或無TdP情況下，所報(bào)道的誘發(fā)QT間期延長的藥物數(shù)量持續(xù)增加(W.Haverkamp等(2000)Cardiovascular Research 47，219-233)。已經(jīng)牽涉到多至50種臨床可獲得的或仍在研究的非-心血管藥物和心血管非-抗-心律不齊藥物。許多藥物，既有老的，也有新的，已從市場上撤回或具有它們的銷售限制。關(guān)心的是從這些藥物上市到最初意識到它們與QT間期延長和/或TdP有關(guān)的時(shí)間間隔，通常以年為單位來測量。因此，在新的治療劑和/或其它試劑開發(fā)的早期階段，在人類中初次使用之前，研究任何新的化學(xué)物質(zhì)的這一潛在副作用將是有益的。
本發(fā)明開發(fā)的新型治療劑的關(guān)鍵組分由化合物庫的高通量篩選(HTS)組成。藥物公司已建立了結(jié)構(gòu)不同的化合物的大型集合，它充當(dāng)藥物靶向先導(dǎo)鑒定程序的起始點(diǎn)。典型的公司化合物集合現(xiàn)包括100000至1000000種不同的化學(xué)物質(zhì)。盡管數(shù)年前，認(rèn)為每天和每次測定數(shù)千種化合物的用量是足夠的，但當(dāng)今藥物公司旨在具有每周測試數(shù)以十萬計(jì)的化合物的超高通量的篩選技術(shù)。在涉及篩選形式的典型HTS中，在多-孔微量滴定板，如96、384或1536個(gè)孔的板中進(jìn)行測定。使用這些板有助于自動(dòng)化，如自動(dòng)的試劑分配器和自動(dòng)虹吸儀的使用。此外，為了降低周期時(shí)間、成本和生物化學(xué)物質(zhì)的原料如重組蛋白質(zhì)，對于在測定方法中測試的各化合物，優(yōu)選在室溫下，使用單一的測量，進(jìn)行HTS有關(guān)的篩選。
先導(dǎo)評價(jià)方法中的決定性標(biāo)準(zhǔn)將是早期識別它們與QT延長和/或TdP有關(guān)的可能性。然而，目前沒有評價(jià)心臟毒性可獲得的可靠、快速容易篩選方法，其中所述方法可對付在目前推廣使用的HTS技術(shù)中鑒定的許多化合物。本發(fā)明的目的是通過提供測定和試劑盒來解決本領(lǐng)域的該問題，其中所述測定與試劑盒基于下述發(fā)現(xiàn)可利用阿司咪唑與HERG鉀通道的相互作用，以預(yù)計(jì)在新的治療劑和其它試劑的開發(fā)過程中化合物的心臟毒性。
目前可獲得的體外模型包括異源表達(dá)系統(tǒng)、解聚的細(xì)胞、分離的組織和分離的完整(蘭根朵夫灌注的)心臟。在所有模型中，通過使用雙電極電壓鉗記錄，測量離子電流(DasscalN.(1987)Crit.Rev.Biochem.22，341-356)，或使用微電極或共焦顯微鏡(Dall`Asta V.等(1997)Exp.Cell Research 231，260-268)，測量膜電勢的膜片鉗記錄(Zhou Z等(1998)Biophysical Journal74，230-241)，從而評價(jià)鉀電流受阻的效果。鑒于實(shí)驗(yàn)程序的復(fù)雜性、慢的周期時(shí)間、原料的性質(zhì)(即分離的組織及其解聚細(xì)胞)和試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，在HTS篩選中不能使用前述方法。
本發(fā)明者令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可使用利用標(biāo)記的阿司咪唑作為HERG通道的特異配體的結(jié)合測定方法，來預(yù)計(jì)化合物與QT延長和/或TdP的潛在關(guān)系。這一結(jié)合測定方法解決了前述問題，并且可在HTS有關(guān)的篩選形式中推廣使用。
Chadwick C.等已描述了類似的測定方法(Chadwick C等，(1993)Circulation Research 72，707-714)，其中已鑒定[3H]-多非利特作為心臟延遲整流器K+-通道的特異放射配體。這篇文章進(jìn)一步證明了多非利特的置換與許多抗心律不齊化合物的鉀通道阻斷活性之間具有良好的關(guān)聯(lián)。這一結(jié)合測定有助于在分子水平上表征藥物-通道的相互作用。
在這一測定中，已由二溴前體，通過3H-交換制備標(biāo)記的多非利特，從而在每個(gè)分子上摻入2個(gè)3H-標(biāo)記。每個(gè)分子上3H-標(biāo)記的數(shù)量與結(jié)合測定的敏感性之間存在直接的關(guān)聯(lián)。本發(fā)明提供相對以上方法的改進(jìn)結(jié)合測定，因?yàn)樵谂c[33H]-碘化甲烷反應(yīng)中使用去甲阿司咪唑前體導(dǎo)致在每分子的阿司咪唑中摻入3個(gè)3H-標(biāo)記。由此獲得的放射配體的比活性比[3H]-多非利特的比活性高1.5-2倍。
此外，在HTS有關(guān)的篩選形式中不可能使用多非利特測定，因?yàn)閺某赡晷坌噪嗍笾蟹蛛x的心室肌細(xì)胞必須在分離的6小時(shí)內(nèi)使用。另外，僅36％分離的細(xì)胞是能存活的和可在結(jié)合測定中使用。為了在HTS有關(guān)的篩選中使用，起始材料應(yīng)當(dāng)可容易且足量地獲得。本發(fā)明解決了該問題，因?yàn)槭褂昧朔€(wěn)定表達(dá)HERG鉀通道的HEK293細(xì)胞的膜制備物。所述細(xì)胞可足量地維持在溫育物中，從而避免了需要并供應(yīng)動(dòng)物模型，并且由于在結(jié)合測定中使用細(xì)胞膜，所以可在-80℃下，在結(jié)合測定現(xiàn)成的等分試樣中儲存后者，用于隨后使用。Chadwick等所述的多非利特結(jié)合測定的進(jìn)一步的缺點(diǎn)是與溫育程序有關(guān)。由于使用可存活的肌細(xì)胞，所以必須在34℃的生理溫度下進(jìn)行溫育。若要在HTS有關(guān)的篩選形式中進(jìn)行的話，后者毫無疑問增加了測定的成本、可能的周期時(shí)間和復(fù)雜性。本發(fā)明解決該問題，因?yàn)榱钊梭@奇地證明，可在室溫下溫育膜制備物。特別地鑒于Zhoe Z.等，Zhou Z.等(1998)Biophysical Journal 74，230-241的研究，其中得出結(jié)論，對于HERG，所測量的動(dòng)力學(xué)特性顯著依賴于溫度，當(dāng)在生理溫度，即35℃下進(jìn)行研究時(shí)，在數(shù)個(gè)報(bào)告中觀察到的差別減少。
以下將描述本發(fā)明的這一和其它方面。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種篩選試驗(yàn)化合物在受試驗(yàn)者中誘發(fā)心臟毒性能力用的測定方法。該方法包括用參考化合物和試驗(yàn)化合物溫育含HERG或其片段的原料，其時(shí)間足以使參考化合物與HERG多肽通道結(jié)合和試驗(yàn)化合物與HERG多肽通道結(jié)合，并測量試驗(yàn)化合物對結(jié)合于HERG的參考化合物數(shù)量的影響。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，測定方法包括用標(biāo)記的參考化合物溫育細(xì)胞，優(yōu)選HEK293細(xì)胞的膜制備物，其中所述細(xì)胞在其表面上表達(dá)含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段的HERG多肽通道，其中所述標(biāo)記的參考化合物是在受試驗(yàn)者中能誘發(fā)心律不齊的藥物，優(yōu)選所述標(biāo)記的參考化合物是[3H]-阿司咪唑。與試驗(yàn)化合物一起溫育，并測量試驗(yàn)化合物對結(jié)合到HERG多肽通道上的參考化合物的數(shù)量的影響。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，測量裝置由從溫育混合物中除去未結(jié)合的標(biāo)記的參考化合物的分離裝置；和檢測標(biāo)記的參考化合物用的裝置組成，其中后者優(yōu)選包括由使用閃爍計(jì)數(shù)的放射標(biāo)記測量裝置組成。
本發(fā)明進(jìn)一步提供篩選化合物在受試驗(yàn)者中誘發(fā)心臟毒性能力用的高通量的測定方法，該測定方法包括a)使細(xì)胞的膜制備物與標(biāo)記的參考化合物接觸，其時(shí)間足以使參考化合物與HERG多肽通道結(jié)合，其中所述細(xì)胞在其表面上表達(dá)具有與SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段；b)使細(xì)胞的膜制備物與步驟a)的標(biāo)記的參考化合物以及試驗(yàn)化合物接觸，其時(shí)間足以使參考化合物與HERG多肽通道結(jié)合和試驗(yàn)化合物與HERG多肽通道結(jié)合，其中所述細(xì)胞在其表面上表達(dá)具有與SEQ IDNO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段；c)測量步驟a)中結(jié)合到HERG通道上的標(biāo)記的參考化合物的數(shù)量；d)測量步驟b)中結(jié)合到HERG通道上的標(biāo)記的參考化合物的數(shù)量；和e)比較步驟a)中測量的結(jié)合到HERG通道上的標(biāo)記的參考化合物的數(shù)量和步驟b)中測量的結(jié)合到HERG多肽通道上的標(biāo)記的參考化合物的數(shù)量。
在高通量篩選測定方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，膜制備物來自于細(xì)胞，優(yōu)選HEK293細(xì)胞，該細(xì)胞在其表面上表達(dá)由SEQ ID NO2組成的氨基酸序列編碼的HERG多肽通道。在高通量篩選測定方法的進(jìn)一步實(shí)施方案中，標(biāo)記的參考化合物是阿司咪唑，優(yōu)選[3H]-阿司咪唑。
本發(fā)明也包括篩選化合物在受試驗(yàn)者中誘發(fā)心臟毒性能力用的試劑盒，以及在本發(fā)明的測定方法中，包括多核苷酸、多肽和合適的參考化合物在內(nèi)的試劑的用途。
附圖簡述

圖1A示出了[3H]-阿司咪唑與用HERG通道cDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的細(xì)胞的膜制備物的飽和結(jié)合。TB表示所測量的總的結(jié)合，NSB表示所測量的非特異結(jié)合，SB表示所測量的特異結(jié)合。
圖1B示出了飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)的斯卡查德圖。根據(jù)擬合線，可用3260±900fmol/mg蛋白質(zhì)(n＝11)的Bmax(最大結(jié)合)確定3.07±2.26nM(n＝11)的KD。
圖2示出了與電生理膜片鉗數(shù)據(jù)相比，42個(gè)參考化合物的結(jié)合親和力?？色@得0.87的Spearman秩相關(guān)系數(shù)。
詳細(xì)說明本發(fā)明涉及心血管安全測定領(lǐng)域，并提供篩選試驗(yàn)化合物在受試驗(yàn)者中誘發(fā)心臟毒性能力用的測定方法與試劑盒。所述測定方法與試劑盒基于下述發(fā)現(xiàn)可利用阿司咪唑與HERG鉀通道的相互作用，以預(yù)計(jì)在新的治療劑和其它試劑的開發(fā)過程中化合物的心臟毒性。在化合物庫的高通量篩選中，本發(fā)明尤其有利。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，篩選試驗(yàn)化合物的測定方法包括a)用i)參考化合物，ii)試驗(yàn)化合物溫育含HERG或其片段的原料；和b)測量試驗(yàn)化合物對結(jié)合到HERG上的參考化合物的數(shù)量。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，使用測定方法，以評價(jià)在受試驗(yàn)者中試驗(yàn)化合物誘發(fā)心律不齊的能力。
此處所使用的術(shù)語“試驗(yàn)化合物”是指在化學(xué)上定義的分子，其中在本發(fā)明的測定方法中評價(jià)該分子誘發(fā)心律不齊的能力。試驗(yàn)化合物包括，但不限于藥物、配體(天然或合成)、多肽、肽、肽模擬物、多糖、糖、糖蛋白、核酸、多核苷酸和小的有機(jī)分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，試驗(yàn)化合物包括已有的化合物庫。在另一實(shí)施方案中，試驗(yàn)化合物包括新型的化合物庫。
此處所使用的術(shù)語“參考化合物”是指能在受試驗(yàn)者中誘發(fā)心臟毒性的藥物。參考化合物包括，但不限于阿司咪唑、特非那定、紅霉素、斯氟沙星(sparfloxain)、普羅布考、特羅地林和舍吲哚。
此處所使用的術(shù)語“HERG”是指Human Ether-a-go-go-RelatedGene通道。它是延遲整流器(rectifier)鉀通道，在許多細(xì)胞類型中，所述通道在控制作用電勢復(fù)極化方面起重要作用。最初從人類海馬中克隆出HERG，它在心臟中被強(qiáng)烈地表達(dá)。本發(fā)明的HERG多肽包括分離并純化的蛋白質(zhì)或其片段，所述蛋白質(zhì)具有與SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的HERG多肽通道具有含SEQ ID NO2氨基酸序列的氨基酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的HERG多肽由SEQ ID NO2組成。
所定義的序列和片段的變體也形成本發(fā)明的一部分。變體包括通過保守氨基酸改變，來改變母體序列的那些，其中“保守氨基酸改變”是指基于一些氨基酸的可取代性被公認(rèn)的領(lǐng)域，在沒有影響母體分子生物活性情況下，置換母體序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(參見例如M.Dayhoff，In Atlas of Protein Sequence andStructure，Vol.5，Supp.3，p345-352，1987)。進(jìn)一步的變體是其中以任何組合方式取代、缺失或添加數(shù)個(gè)、5-10、1-5或1-2個(gè)氨基酸的變體。
比較兩種或多種序列的同一性或相似性的方法是本領(lǐng)域公知的。因此，可使用例如，在Winconsin序列分析軟年包，9.1版本(DevreuxJ.等，Nucleic acid Res.，12，387-395，1984)中獲得的程序，例如BESTFIT和GAP程序，來確定兩種多核苷酸之間的同一性％以及兩種多肽序列之間的同一性％和相似性％。BESTFIT利用Smith和Waterman的“局部同源性”算法(J.Mol.Biol.，147，195-197，1981)，并發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)序列之間相似性的最好單一區(qū)域。BESTFIT更適于比較長度不同的兩種多核苷酸或兩種多肽，該程序假定較短的序列表示較長的部分。相比之下，根據(jù)Neddlemen和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.，48，443-453，1970)，GAP比對兩個(gè)序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“最大的相似性”。GAP更適于比對長度接近相同的序列，預(yù)期整個(gè)長度內(nèi)比對。優(yōu)選地，在各程序內(nèi)使用的參數(shù)“空位權(quán)重”和“長度權(quán)重”，對于多核苷酸序列來說，分別為50和3，對于多肽序列來說，分別為12和4。優(yōu)選地，當(dāng)最佳地比對被比較的兩個(gè)序列時(shí)，確定同一性％和相似性％。確定序列間同一性和/或相似性的其它程序也是本領(lǐng)域已知的，例如BLAST系列程序(Altschul S F等，Nucleic AcidsRes.，253389-3402，1997)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到可通過多種重組DNA技術(shù)，其中包括例如雜交、聚合物酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增或DNA的從頭合成，獲得本發(fā)明的多肽，即HERG多肽通道(參見例如T.Maniatis等，MolecularCloningA Laboratory Manual，2d Ed.，Chap14(1989))。因此，本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案提供在本發(fā)明的測定方法或試劑盒中編碼HERG多肽或其片段的分離并純化的多核苷酸的應(yīng)用。本發(fā)明另一實(shí)施方案提供含SEQ ID NO1的多核苷酸序列的編碼HERG多肽通道或其片段的分離并純化的多核苷酸的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案提供由SEQ IDNO1的多核苷酸序列組成的編碼HERG多肽通道的分離并純化的多核苷酸的應(yīng)用。
術(shù)語“其片段”描述一段或亞區(qū)域的蛋白質(zhì)或多核苷酸分子，其序列在此處被公開，以便所述片段包括在母體蛋白質(zhì)內(nèi)相鄰的5個(gè)或更多個(gè)氨基酸，或以便所述片段包括在母體多核苷酸內(nèi)相鄰的15個(gè)或更多個(gè)核苷酸。術(shù)語“其片段”擬包括“功能片段”，其中分離的片段、段或亞-區(qū)域包括在功能上不同的區(qū)域，如受體蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)或磷酰化位點(diǎn)?？赏ㄟ^克隆技術(shù)，或作為可供替代的剪接技術(shù)的天然產(chǎn)物，來生產(chǎn)功能片段。
此處所使用的“分離的”是指已從體內(nèi)環(huán)境中分離出所討論的多核苷酸、蛋白質(zhì)和多肽或其各自的片段，以便熟練的技術(shù)人員可操作它的事實(shí)，例如，但不限于測序、限制消化、定點(diǎn)誘變，和亞克隆至核酸片段的表達(dá)載體，以及獲得提供產(chǎn)生多克隆抗體、單克隆抗體、氨基酸測序和肽消化機(jī)會(huì)的大量蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。因此，此處所述的核酸可以以完整細(xì)胞或以細(xì)胞溶菌液或以部分、基本上或完全純化的形式存在。
當(dāng)多肽從環(huán)境污染物中純化而來時(shí)，認(rèn)為它是“純化的”。因此，當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)方法從細(xì)胞組分中純化時(shí)，從細(xì)胞中分離的多肽被認(rèn)為基本上是純化的，而當(dāng)由它的化學(xué)前體純化時(shí)，化學(xué)合成的多肽序列被認(rèn)為是基本上純化的。“基本上純的”蛋白質(zhì)或核酸將典型地包括樣品的至少85％，其中優(yōu)選更大的百分?jǐn)?shù)。確定蛋白質(zhì)或核酸分子純度的一種方法是在基質(zhì)如聚丙烯酰胺或瓊脂中電泳制備物。通過在染色之后單一條帶的外觀來證明純度。評價(jià)純度的其它方法包括色譜法和分析離心。
此處所使用的術(shù)語“足以使得結(jié)合的時(shí)間”是指產(chǎn)生結(jié)合到HERG多肽通道上的可檢測量的標(biāo)記的參考化合物所需要的時(shí)間。產(chǎn)生這一可檢測量所需要的時(shí)間將隨測定體系而變化。基于測定體系，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道足以產(chǎn)生結(jié)合到HERG多肽通道上的可檢測量的標(biāo)記的參考化合物所需要的時(shí)間。
測定方法可按照許多形式設(shè)計(jì)本發(fā)明的測定方法，其中所述形式在篩選結(jié)合多肽通道用的化合物領(lǐng)域中通常是公知的。
本發(fā)明的測定方法有利地利用事實(shí)可利用阿司咪唑與HERG鉀通道的相互作用，以預(yù)計(jì)在新的治療劑和其它試劑的開發(fā)過程中化合物的心臟毒性。
因此，本發(fā)明提供篩選試驗(yàn)化合物的測定方法，該測定方法包括a)用i)參考化合物，ii)試驗(yàn)化合物溫育含HERG或其片段的原料，和b)測量試驗(yàn)化合物對結(jié)合到HERG上的參考化合物數(shù)量的影響。
在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中，含HERG的原料是分離并純化的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)編碼與SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG或其片段。
在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案中，含HERG的原料是分離并純化的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)編碼含SEQ ID NO2氨基酸序列的HERG或其片段。
在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，含HERG的原料是在其表面上表達(dá)HERG多肽通道或其片段的細(xì)胞。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，含HERG的原料是在其表面上表達(dá)HERG多肽通道或其片段的細(xì)胞的膜制備物。
在本發(fā)明可供替代的實(shí)施方案中，參考化合物是能在受試驗(yàn)者誘發(fā)心臟毒性的化合物，它優(yōu)選選自阿司咪唑、特非那定、紅霉素、斯氟沙星、普羅布考、特羅地林和舍吲哚。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，參考化合物是阿司咪唑。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供測定方法，其中標(biāo)記，優(yōu)選放射性標(biāo)記參考化合物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，篩選試驗(yàn)化合物在受試驗(yàn)者中誘發(fā)心臟毒性能力的測定方法包括a)用i)[3H]阿司咪唑，ii)待測試的化合物，溫育在其表面上表達(dá)由SEQ ID NO2組成的氨基酸序列編碼的HERG多肽通道的細(xì)胞的膜制備物；并測量試驗(yàn)化合物對結(jié)合到HERG上的參考化合物的數(shù)量的影響。使用參考化合物的標(biāo)記，來測量這一效果，其中尤其可使用閃爍計(jì)數(shù)法測量所述標(biāo)記。
本發(fā)明的測定方法的具體實(shí)施方案包括篩選試驗(yàn)化合物的高產(chǎn)量測定方法，所述測定方法包括a)使細(xì)胞的膜制備物與標(biāo)記的參考化合物接觸，其時(shí)間足以使參考化合物與HERG多肽通道結(jié)合，其中所述細(xì)胞在其表面上表達(dá)具有與SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段；b)使細(xì)胞的膜制備物與步驟a)的標(biāo)記的參考化合物以及試驗(yàn)化合物接觸，其時(shí)間足以使參考化合物與HERG多肽通道結(jié)合和試驗(yàn)化合物與HERG多肽通道結(jié)合，其中所述細(xì)胞在其表面上表達(dá)具有與SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段；c)測量步驟a)中結(jié)合到HERG通道上的標(biāo)記的參考化合物的數(shù)量；d)測量步驟b)中結(jié)合到HERG通道上的標(biāo)記的參考化合物的數(shù)量；和e)比較步驟a)中測量的結(jié)合到HERG通道上的標(biāo)記的參考化合物的數(shù)量和步驟b)中測量的結(jié)合到HERG多肽通道上的標(biāo)記的參考化合物的數(shù)量。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，高通量篩選測定方法的膜制備物由在其表面上表達(dá)含SEQ ID NO2氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段的細(xì)胞的膜制備物組成。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，高通量篩選測定方法的膜制備物由細(xì)胞，優(yōu)選HEK293細(xì)胞的膜制備物組成，所述細(xì)胞在其表面上表達(dá)由SEQ ID NO2的氨基酸序列組成的HERG多肽通道。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，在高通量篩選測定方法中的標(biāo)記的參考化合物由[3H]-標(biāo)記的阿司咪唑組成?？捎绕涫褂瞄W爍計(jì)數(shù)測量所述標(biāo)記。
在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方案中，提供了一種篩選試驗(yàn)化合物的高通量親近檢測(proximity detection)測定方法，該測定方法包括i)能參與親近檢測測定方法的用第一種標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的HERG；ii)能參與親近檢測測定方法的用第二種標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的參考化合物；iii)使步驟i)的HERG和步驟ii)的參考化合物與試驗(yàn)化合物一起接觸，其時(shí)間足以使參考化合物與HERG結(jié)合以及試驗(yàn)化合物與HERG結(jié)合；和iv)當(dāng)HERG和參考化合物相互作用時(shí)，通過第一種標(biāo)記與第二種標(biāo)記的親近，來檢測步驟i)的HERG和步驟ii)的參考化合物之間的相互作用。
由HERG與參考化合物的相互作用引起的第一種標(biāo)記與第二種標(biāo)記的親近導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測的信號。這可例如通過閃爍親近測定(SPA)體系來實(shí)現(xiàn)，在該體系中，標(biāo)記之一是適用于SPA的放射性標(biāo)記，而另一標(biāo)記是包含在固相內(nèi)的熒光增白劑。當(dāng)標(biāo)記的HERG蛋白質(zhì)與標(biāo)記的參考化合物相互作用時(shí)，可檢測的信號是發(fā)射出的光能，這引起放射性標(biāo)記足夠接近熒光增白劑。在US4568649中公開了閃爍親近測定技術(shù)。
或者，可檢測的信號可以是在已有的信號輸出，例如熒光中的變量。熒光共振能量傳遞(FRET)是基于這一原理工作的方法，且Tsien R.等(Tsien R.等(1993)Trends Cell Biol.3242-245)描述過它。它使用兩種不同的熒光分子、供體和受體，以便當(dāng)這些彼此足夠接近時(shí)，供體分子的熒光被受體分子吸收，并發(fā)射出另一波長的光。因此，當(dāng)在兩個(gè)分子如HERG和參考化合物之間存在相互作用時(shí)，它們各自用這些熒光分子之一標(biāo)記，產(chǎn)生可檢測的信號。
通過以上所述的這種親近測定方法，可以以單一的步驟進(jìn)行本發(fā)明的篩選測定方法，即不需分離步驟，以便使用分離方法如過濾，從溫育混合物中除去過量的標(biāo)記的參考化合物。
在高通量的親近檢測測定方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，用包含在固相內(nèi)的熒光增白劑，如包被的閃爍親近測定珠來標(biāo)記HERG，和用放射性標(biāo)記來標(biāo)記參考化合物，優(yōu)選地，參考化合物是放射性標(biāo)記的式(III)的阿司咪唑。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，阿司咪唑與HERG的結(jié)合也可用于基于結(jié)構(gòu)或合理設(shè)計(jì)影響前述結(jié)合的化合物的方法，這是通過a)用阿司咪唑探測HERG多肽通道的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)；b)鑒定在HERG多肽通道的結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的接觸原子，其中所述HERG多肽通道在結(jié)合過程中與阿司咪唑相互作用；c)設(shè)計(jì)與(b)中鑒定的原子相互作用，從而影響HERG-阿司咪唑相互作用的試驗(yàn)化合物；和d)使所述設(shè)計(jì)的試驗(yàn)化合物與含HERG或其片段的原料接觸，以測量所述化合物影響結(jié)合到HERG上的標(biāo)記的阿司咪唑數(shù)量的能力。
將進(jìn)一步理解這通常是一種疊接(iterative)方法。
試劑盒本發(fā)明也提供可在上述測定方法中使用的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括a)含HERG的原料；b)參考化合物。
在第一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括含HERG的原料，所述原料選自i)分離并純化的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)編碼具有與SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG或其片段；ii)分離并純化的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)編碼含SEQ ID NO2氨基酸序列的HERG或其片段；iii)在其表面上表達(dá)HERG多肽通道或其片段的細(xì)胞；或iv)在其表面上表達(dá)HERG多肽通道或其片段的細(xì)胞的膜制備物。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，試劑盒包括參考化合物，所述參考化合物選自阿司咪唑、特非那定、紅霉素、斯氟沙星、普羅布考、特羅地林和舍吲哚。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，參考化合物是阿司咪唑。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供試劑盒，其中標(biāo)記，優(yōu)選放射性標(biāo)記參考化合物。
在具體的實(shí)施方案中，分離并純化的HERG多肽通道結(jié)合到固體載體上，優(yōu)選結(jié)合到含固體支持物的熒光增白劑，如涂布的閃爍親近珠上。
因此，在具體的實(shí)施方案中，試劑盒包括a)結(jié)合到固體支持物上的分離并純化的HERG多肽通道或其片段，和b)標(biāo)記的參考化合物。優(yōu)選地，這一具體實(shí)施方案由試劑盒組成，該試劑盒包括a)由SEQ IDNO2的氨基酸序列組成的分離并純化的HERG多肽通道，所述HERG多肽通道被結(jié)合到含固體支持物的熒光增白劑上；和b)放射性標(biāo)記的參考化合物，優(yōu)選[3H]-標(biāo)記的阿司咪唑。
在另一具體實(shí)施方案中，試劑盒包括；a)細(xì)胞，優(yōu)選HEK293細(xì)胞的膜制備物，所述細(xì)胞在其表面上表達(dá)由SEQ ID NO2的氨基酸序列組成的HERG多肽通道；b)[3H]-標(biāo)記的阿司咪唑；和c)測量結(jié)合到HERG上的標(biāo)記的參考化合物數(shù)量的裝置。
測量裝置由分離裝置和檢測標(biāo)記的參考化合物的裝置組成，其中分離裝置用于從溫育混合物中除去過量未結(jié)合的標(biāo)記參考化合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道從溫育混合物中除去過量未結(jié)合的標(biāo)記參考化合物用的分離裝置。所述分離裝置包括，但不限于磁珠、離心技術(shù)和過濾技術(shù)。檢測標(biāo)記的參考化合物的裝置將取決于所使用的標(biāo)記。所述標(biāo)記可以是熒光或放射性標(biāo)記。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道根據(jù)所使用的標(biāo)記而變化的檢測裝置。
在具體的實(shí)施方案中，分離裝置由GF/B過濾器(WhatmanInc.，Clifton，N.J.)組成。在另一具體的實(shí)施方案中，檢測裝置由在Topcount內(nèi)的閃爍計(jì)數(shù)(Packard，Meriden，CT)組成。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步包括進(jìn)行測定用的儀器和/或多孔板。
參考下述實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)將更好地理解本發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，這些僅僅是本發(fā)明的例舉，在隨后的權(quán)利要求中更充分地描述本發(fā)明的范圍。另外，在整個(gè)說明書中，引用各種公開出版物。這些公開出版物披露的內(nèi)容在此通過參考引入本申請中，以便更充分地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。
實(shí)施例1DNA構(gòu)建體和HEK293細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染將HERG cDNA(Genbank Accession No.U04270(SEQ ID NOI1))亞克隆至pcDNA3載體(Invitrogen)的bamHI/EcoRI位點(diǎn)。這一載體含有CMV啟動(dòng)子和SV40啟動(dòng)子，它們分別驅(qū)動(dòng)插入的cDNA(HERG)和抗新霉素基因的表達(dá)。通過磷酸鈣沉淀方法(Gibco)或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺方法(Gibco)，用這一構(gòu)建體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。在800μg/ml遺傳霉素(G418；Gibco)中選擇15-20天之后，用克隆量筒收集單一的集落，并測試HERG電流。在補(bǔ)加有10％胎牛血清和400μg/ml遺傳霉素的最小基本溫育基(MEM)中溫育穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
為了電生理研究，通過胰蛋白酶消化，從溫育皿中采集細(xì)胞，用標(biāo)準(zhǔn)的MEM溫育基洗滌兩次，并在用聚-L-賴氨酸涂布的小溫育皿中播種。在板上1-2天之后，在細(xì)胞上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例2用HERG鉀通道穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的膜制備物使用HERG通道cDNA穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞在富含10％胎牛血清和抗生素的DMEM溫育基內(nèi)生長。使用Ultraturrax均化器，在Tris-HCl 50mM pH7.4中均化收集的細(xì)胞，并在Sorvall離心機(jī)內(nèi)，在23500×g下離心均化物。通過再-均化和再-離心洗滌細(xì)胞膜一次。將膜懸浮在Tris-HCl 50mM pH7.4中，等分試樣，并在-80℃下儲存。
實(shí)施例3放射性標(biāo)記阿司咪唑
攪拌在48％氫溴酸水溶液(80ml)內(nèi)的4.6g阿司咪唑(I)(10mmol)的溶液，并回流2小時(shí)。使反應(yīng)混合物冷卻到室溫，過濾所形成的沉淀，并用水洗滌。將固體溶解在N，N-二甲基甲酰胺(20ml)和水(20ml)的混合物中，在攪拌下，通過緩慢引入濃氫氧化銨的水溶液使混合物成堿性。然后加入水(100ml)和攪拌混合物1小時(shí)。過濾掉沉淀并在空氣中干燥18小時(shí)，得到去甲阿司咪唑(II)。
從這一用量中取出一部分，并通過制備型HPLC，在HypersylODS(5μm)結(jié)合相的不銹鋼柱(7.1mmID×300mm)上分批徹底純化，得到不含阿司咪唑的去甲阿司咪唑。在282nm處檢測，并在4.0ml/min的流速下，用乙腈-水-二異丙胺(56∶44∶0.2，v/v)進(jìn)行洗脫。
將HPLC純化的去甲阿司咪唑(II)(26.7mg，60μmol)級分溶解在N，N-二甲基甲酰胺(1.0ml)中。向該溶液中加入1N氫氧化鈉水溶液(60μl，60μmol)。在室溫下攪拌混合物25分鐘，并逐滴加入到[33H]-碘代甲烷(370MBq)在甲苯內(nèi)的預(yù)冷卻溶液(-78℃)中。旋流反應(yīng)混合物，然后在沒有冷卻的情況下靜置3小時(shí)。在40℃的水浴中，在吸氣壓力下，將甲苯從反應(yīng)混合物中蒸發(fā)掉，并如上所述通過制備型HPLC，分批純化殘留物。合并含級分的產(chǎn)品，并用甲醇提取到70ml，得到總放射性為198MBq和比活性為3.14TBq/mmol(85Ci/mmol)的[3H]-阿司咪唑(III)。
實(shí)施例4放射配體結(jié)合測定方法解凍膜，并在溫育緩沖液(Hepes 10nM pH7.4，40mM KCl，20mMKH2PO4，5mM MgCl2，0.5mm KHCO3，10mM葡萄糖，50mM谷氨酸鹽，20mM天冬氨酸鹽，14mM庚酸，1mM EGTA，0.1％BSA)中再-均化，并且在有或無競爭劑下，在25℃下，用[3H]-阿司咪唑溫育20-100μg蛋白質(zhì)，接著使用Filtermatel96采集器(Packard，Meriden，CT)，在GF/B過濾器上快速過濾。用冰冷的漂洗緩沖液(Tris-HCl 25mMpH7.4，130mM NaCl，5.5mM KCl，5mM葡萄糖，0.8mM MgCl2，50μm CaCl2，0.1％BSA)徹底漂洗過濾器。通過在Topcount(Packard，Meriden，CT)內(nèi)的閃爍計(jì)數(shù)測定過濾器結(jié)合的放射性，以每分鐘的計(jì)數(shù)(cpm)表達(dá)結(jié)果。
最初，研究包括緩沖液、放射配體和要測定非特異結(jié)合的化合物在內(nèi)的各種參數(shù)，以便選擇最佳的條件。
在飽和結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，用膜來溫育濃度增加的[3H]-阿司咪唑，再-懸浮在緩沖液中。在10μM R66204存在下測量非特異結(jié)合(圖1)。
通過比較22種參考化合物的結(jié)合親和力和電生理數(shù)據(jù)，研究在溫育緩沖液內(nèi)存在的BSA和/或環(huán)糊精的影響，以及在實(shí)驗(yàn)之前化合物的各種添加方式的影響。將化合物溶解在DMSO中，并使用MultiprobeII移液器(Pachard，Meriden，CT)，進(jìn)一步在相同的溶劑中稀釋。在所有的實(shí)驗(yàn)中，最終的DMSO濃度為1％。根據(jù)這一分析得出，可直接從由DMSO儲液添加化合物。通過添加BSA和/或環(huán)糊精試圖增加化合物的溶解度沒有顯著改進(jìn)相關(guān)性。
實(shí)施例5完整細(xì)胞的電壓鉗技術(shù)(膜片鉗)溶液浴液包含150NaCl，4KCl，5葡萄糖，10HEPES，1.8CaCl2和1MgCl2(使用NaOH，pH7.4)(單位mM)。移取的溶液包含120KCl，5EGTA，10HEPES，4MgATP，0.5CaCl2和2MgCl2(使用KOH，pH7.2)(單位mM)。將化合物溶解在DMSO中，獲得10-2M或10-1M的儲液。對照(＝浴液+DMSO)和實(shí)驗(yàn)溶液(＝浴液+DMSO+待測試的化合物)包含0.3％，0.1％或0.03％的DMSO。使用Y-管體系，將試驗(yàn)和對照溶液施加到研究的細(xì)胞上，從而使得在研究的細(xì)胞附近可快速改變?nèi)芤?小于0.5秒)。
電生理測量將含表達(dá)HERG的附著HEK293細(xì)胞的溫育皿固定在膜片鉗塔(Patch Clamp Tower)的臺面上。使用反相顯微鏡觀察細(xì)胞。在室溫下用浴液持續(xù)灌注溫育皿。
使用水平的Flaming/Brown微型移液管拉制器，在沒有進(jìn)一步的火焰-拋光情況下，從硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管中拉制膜片移液管。當(dāng)用移液填充時(shí)，所使用的微電極的輸入電阻為1.5至3MΩ。
使用膜片箝術(shù)，通過EPC-9膜片鉗放大器，在不同的膜電勢下測量細(xì)胞的膜電流。使用程序Pulse和Pulsefit(HEKA)，DataAccess(Bruxton)和Igor(Wavemetrics)獲得并分析數(shù)據(jù)。電流信號被低通過濾和隨后數(shù)字化。在密封之前，電校正液體接界電勢。在膜破裂之后，使用EPC-9膜片鉗放大器，補(bǔ)償細(xì)胞的電容和串聯(lián)電阻。
保持電勢為-80mV。HERG電流(K+-選擇的外向電流)測定為在-40mV到2秒的去極化之后的+60mV下的最大尾電流。脈沖周期速度為15秒。在各試驗(yàn)脈沖之前，得到從保持電勢到-60mV的短脈沖(0.5秒)，以測定漏泄電流。在確定完整細(xì)胞的結(jié)構(gòu)之后，允許5分鐘的平衡時(shí)間段，用移取的溶液內(nèi)部灌注細(xì)胞。之后，給出5分鐘的試驗(yàn)脈沖，在控制條件下定量確定HERG電流。在持續(xù)脈沖程序的同時(shí)，將灌注由對照溶液變化為含藥物的溶液。在施加藥物5分鐘之后測量藥物的效果。對于每個(gè)細(xì)胞測試藥物的1-3種濃度(累積施加)。
測量的參數(shù)分析HERG電流測定為從-80mV的保持電勢開始，在-40mV到2秒的去極化之后的+60mV下的最大尾電流。
在對照溶液存在下測量的最初5分鐘內(nèi)，HERG-介導(dǎo)的膜K+電流的振幅隨時(shí)間逐漸降低(減少)。為了精確地定量化合物的阻斷程度，必須考慮到這種K+電流的持續(xù)減少。因此，在對照溶液內(nèi)，在最初的5分鐘的時(shí)間段內(nèi)，K+電流的時(shí)間曲線(在-40mV下測量)按指數(shù)擬合，并外推實(shí)驗(yàn)的其余部分。若沒有給定藥物，這些外推得到電流的估計(jì)振幅。為了測定化合物的阻斷程度，通過用各次測量的電流振幅除以在同一時(shí)間點(diǎn)處擬合的電流值，來計(jì)算測量的電流比。
實(shí)施例6結(jié)合測定的藥理學(xué)評價(jià)為了進(jìn)行結(jié)合測定的藥理學(xué)評價(jià)，在8種濃度下測試322種化合物抑制[3H]-阿司咪唑結(jié)合到HERG通道上的能力，和通過非線性回歸分析計(jì)算pIC50-值。若獲得pIC50-值，則比較結(jié)合和膜片鉗的效力的秩(Spearman)。
若在膜片鉗分析中，僅在＜4種濃度下測試了化合物，則根據(jù)下述標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)合和膜片鉗數(shù)據(jù)的分?jǐn)?shù)歸類分?jǐn)?shù)1pIC50＜6或在10-6M或更高濃度下，阻斷率＜50％分?jǐn)?shù)2pIC50為6至8或在10-6和10-8M之間，阻斷率＜50％分?jǐn)?shù)3pIC50＞8或在10-8M或更低濃度下，阻斷率＞50％42種參考化合物從HERG通道中置換[3H]-阿司咪唑結(jié)合的效力的秩與快速激活的延遲整流器K+電流的功能性阻斷的電生理數(shù)據(jù)非常相關(guān)(rsp＝0.87)(圖2)。
對于測試的94％化合物來說，結(jié)合數(shù)據(jù)與膜片鉗數(shù)據(jù)相關(guān)。在2％的化合物中，結(jié)合測定得分高于膜片鉗測定，而對于其余的4％來說，情況相反，即膜片鉗測定得分高于結(jié)合測定。
根據(jù)結(jié)合數(shù)據(jù)與電生理數(shù)據(jù)的這種良好相關(guān)性，可得出結(jié)論，可使用放射配體結(jié)合測定作為主要的篩選工具，用于預(yù)測潛在的心臟毒性副作用。
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1.一種篩選試驗(yàn)化合物的測定方法，該測定方法包括a)用i)參考化合物，ii)試驗(yàn)化合物溫育含HERG或其片段的原料；和b)測量試驗(yàn)化合物對結(jié)合到HERG上的參考化合物數(shù)量的影響。
2.一種用于篩選試驗(yàn)化合物在受試驗(yàn)者中誘發(fā)心臟毒性能力的測定方法，該測定方法包括a)用i)參考化合物，ii)試驗(yàn)化合物溫育含HERG或其片段的原料；和b)測量試驗(yàn)化合物對結(jié)合到HERG上的參考化合物數(shù)量的影響。
3.一種用于篩選試驗(yàn)化合物在受試驗(yàn)者中誘發(fā)心律不齊的能力的測定方法，該測定方法包括a)用i)參考化合物，ii)試驗(yàn)化合物溫育含HERG或其片段的原料；和b)測量試驗(yàn)化合物對結(jié)合到HERG上的參考化合物數(shù)量的影響。
4.權(quán)利要求1-3之一的測定方法，其中含HERG的原料選自i)分離并純化的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)編碼具有與SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG或其片段；ii)分離并純化的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)編碼含SEQ ID NO2的氨基酸序列的HERG或其片段；iii)在其表面上表達(dá)HERG多肽通道或其片段的細(xì)胞；或iv)在其表面上表達(dá)HERG多肽通道或其片段的細(xì)胞的膜制備物。
5.權(quán)利要求1-3之一的測定方法，其中含HERG的原料是在其表面上表達(dá)由SEQ ID NO2組成的HERG多肽通道的細(xì)胞的膜制備物。
6.權(quán)利要求1-3之一的測定方法，其中參考化合物能在受試驗(yàn)者誘發(fā)心臟毒性。
7.權(quán)利要求1-3之一的測定方法，其中參考化合物選自阿司咪唑、特非那定、紅霉素、斯氟沙星、普羅布考、特羅地林和舍吲哚。
8.權(quán)利要求1-3之一的測定方法，其中參考化合物是阿司咪唑。
9.權(quán)利要求1-3之一的測定方法，其中參考化合物被標(biāo)記。
10.權(quán)利要求9的測定方法，其中參考化合物被放射性標(biāo)記。
11.權(quán)利要求10的測定方法，其中參考化合物是[3H]-阿司咪唑。
12.式(III)的放射性標(biāo)記的阿司咪唑
13.權(quán)利要求12的放射性標(biāo)記的阿司咪唑的制備方法，其特征在于a)使用合適的試劑如48％的氫溴酸水溶液，使式(I)的阿司咪唑去甲基化；和 b)任選地在反應(yīng)惰性溶劑中，和在堿存在下，使式(II)的中間體與[3H]-碘代甲烷(CT3I)反應(yīng)，
14.篩選試驗(yàn)化合物的高通量測定方法，該測定方法包括a)使細(xì)胞的膜制備物與標(biāo)記的參考化合物接觸，其時(shí)間足以使參考化合物與HERG多肽通道結(jié)合，其中所述細(xì)胞在其表面上表達(dá)具有與SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段；b)使細(xì)胞的膜制備物與步驟a)的標(biāo)記的參考化合物以及試驗(yàn)化合物接觸，其時(shí)間足以使參考化合物與HERG多肽通道結(jié)合和試驗(yàn)化合物與HERG多肽通道結(jié)合，其中所述細(xì)胞在其表面上表達(dá)具有與SEQ IDNO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段；c)測量步驟a)中結(jié)合到HERG通道上的標(biāo)記的參考化合物的數(shù)量；d)測量步驟b)中結(jié)合到HERG通道上的標(biāo)記的參考化合物的數(shù)量；和e)比較步驟a)中測量的結(jié)合到HERG通道上的標(biāo)記的參考化合物的數(shù)量和步驟b)中測量的結(jié)合到HERG多肽通道上的標(biāo)記的參考化合物的數(shù)量。
15.一種用于篩選試驗(yàn)化合物的高通量親近檢測測定方法，該測定方法包括i)用能參與親近檢測測定方法的第一種標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的HERG；ii)用能參與親近檢測測定方法的第二種標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記的參考化合物；iii)使步驟i)的HERG和步驟ii)的參考化合物與試驗(yàn)化合物一起接觸，其時(shí)間足以使參考化合物與HERG結(jié)合以及試驗(yàn)化合物與HERG結(jié)合；和iv)當(dāng)HERG和參考化合物相互作用時(shí)，通過第一種標(biāo)記與第二種標(biāo)記的親近，來檢測步驟i)的HERG和步驟ii)的參考化合物之間的相互作用。
16.一種試劑盒，它包括a)含HERG的原料；b)參考化合物。
17.權(quán)利要求16的試劑盒，其中含HERG的原料選自i)分離并純化的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)編碼具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG或其片段；ii)分離并純化的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)編碼含SEQ ID NO2的氨基酸序列的HERG或其片段；iii)在其表面上表達(dá)HERG多肽通道或其片段的細(xì)胞；或iv)在其表面上表達(dá)HERG多肽通道或其片段的細(xì)胞的膜制備物。
18.權(quán)利要求16的試劑盒，其中含HERG的原料是結(jié)合到固體支持物上的分離并純化的HERG多肽通道或其片段。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其中固體支持物是含固體支持物的熒光增白劑。
20.權(quán)利要求16的試劑盒，其中含HERG的原料由細(xì)胞的膜制備物組成，所述細(xì)胞在其表面上表達(dá)由SEQ ID NO2組成的氨基酸序列編碼的HERG多肽通道。
21.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述細(xì)胞是HEK293細(xì)胞。
22.權(quán)利要求16-21之一的試劑盒，其中參考化合物選自阿司咪唑、特非那定、紅霉素、斯氟沙星、普羅布考、特羅地林和舍吲哚。
23.權(quán)利要求16-21之一的試劑盒，其中參考化合物被標(biāo)記。
24.權(quán)利要求23的試劑盒，其中參考化合物被放射性標(biāo)記。
25.權(quán)利要求24的試劑盒，其中參考化合物是[H3]-阿司咪唑。
26.權(quán)利要求23的試劑盒，任選地包括從溫育混合物中除去過量未結(jié)合的標(biāo)記的參考化合物的裝置。
27.權(quán)利要求23的試劑盒，其中分離裝置由GF/B過濾器組成。
28.分離并純化的蛋白質(zhì)在權(quán)利要求1-3之一的測定方法中的用途，其中所述蛋白質(zhì)編碼含SEQ ID NO2的氨基酸序列的HERG或其片段。
29.分離并純化的多核苷酸在權(quán)利要求1-3之一的測定方法中的用途，其中所述多核苷酸編碼含SEQ ID NO1的核酸序列的HERG或其片段。
30.在其表面上表達(dá)含SEQ ID NO2的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段的細(xì)胞在權(quán)利要求1-3之一的測定方法中的用途。
31.在其表面上表達(dá)含SEQ ID NO2的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段的細(xì)胞的膜制備物在權(quán)利要求1-3之一的測定方法中的用途。
32.在其表面上表達(dá)由SEQ ID NO2的氨基酸序列編碼的HERG多肽通道的細(xì)胞的膜制備物在權(quán)利要求1-3之一的測定方法中的用途。
33.阿司咪唑在權(quán)利要求1-3之一的測定方法中的用途。
34.標(biāo)記的阿司咪唑在權(quán)利要求1-3之一的測定方法中的用途。
35.放射性標(biāo)記的阿司咪唑在權(quán)利要求1-3之一的測定方法中的用途。
36.[H3]-阿司咪唑在權(quán)利要求1-3之一的測定方法中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及篩選試驗(yàn)化合物在受試驗(yàn)者中誘發(fā)心臟毒性能力用的測定方法與試劑盒。所述測定方法與試劑盒基于下述發(fā)現(xiàn)可利用阿司咪唑與HERG鉀通道的相互作用，以在新的治療劑和其它試劑的開發(fā)過程中預(yù)計(jì)化合物的潛在心臟毒性。
文檔編號C07K14/435GK1541334SQ02813995
公開日2004年10月27日 申請日期2002年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月13日
發(fā)明者G·I·C·M·海倫, C·G·M·詹森, M·R·朱爾扎克, H·P·M·M·范阿索夫, G I C M 海倫, M M 范阿索夫, M 詹森, 朱爾扎克 申請人:詹森藥業(yè)有限公司