專利名稱：因子viii的分離的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及用于從血液或者重組來源分離凝血因子的方法和裝置，尤其是從血漿中分離因子VIII的方法和裝置。
背景技術(shù)：
人因子VIII(FVIII)是一種結(jié)合了von Willebrand因子(vWF)在血漿(0.1μg/mL)中循環(huán)的265kDa糖蛋白。糖蛋白對(duì)引起其激活和破壞的蛋白酶解加工高度敏感，從而調(diào)節(jié)其在凝固級(jí)聯(lián)(血液凝固)中作為輔因子的作用。激活的FVIII(FVllla)是激活凝血因子X到因子Xa的輔因子。FVIII的缺乏可能導(dǎo)致出血紊亂的血友病A。
來自血漿的FVIII平均工業(yè)產(chǎn)量為每升血漿140到270國際單位(IU)(1IU是在1mL混合血漿中發(fā)現(xiàn)的FVIII活性的平均量＝0.2μg)。FVIII傳統(tǒng)純化的第一步通常是冷凍沉淀(傳統(tǒng)科恩級(jí)分分離法)產(chǎn)率40-50％的FVIII。含有FVIII的冷沉淀物利用色譜法，通常是免疫親和以及離子交換進(jìn)行處理。在每個(gè)加工步驟將FVIII減至損失最少目的是提高產(chǎn)量，因?yàn)槟壳昂线mFVIII的供應(yīng)是不足的。HemasureDenmark A/S已經(jīng)發(fā)展了以求克服目前血漿傳統(tǒng)科恩級(jí)分分離法存在問題的技術(shù)。Hemasure使用大容量凝膠過濾步驟代替從前的冷凍沉淀步驟，據(jù)報(bào)道提供了產(chǎn)率為60-70％的FVIII，整個(gè)過程產(chǎn)生200 IUFVIII/升血漿，J.Dam，Downstream，vol.31，P.65(Dec.1999)。雖然這個(gè)方法產(chǎn)量提高，但是在加工中仍然有FVIII的大量損失。重組產(chǎn)品是FVIII的另一來源，但是這個(gè)來源尚未代替從天然來源獲得的FVIII。目前的純化方案耗時(shí)，引起FVIII的大量損失，并且不能在對(duì)FVIII活性或者產(chǎn)量無不利影響的情況下充分去除病原體，尤其是病毒。
據(jù)報(bào)道有數(shù)千個(gè)不同蛋白共存在血漿中。從這些復(fù)雜混合物中獲得特定蛋白可能很難，特別是如果特定蛋白在其分離狀態(tài)必須保持其生物活性的情況下。目前，很難從血漿中以合理量提純或者分離高產(chǎn)率的FVIII。例如，對(duì)于具有平均蛋白濃度70mg/mL的血漿而言，F(xiàn)VIII(～0.1μg/mL)僅僅大約占總血漿蛋白的0.00014％。在血漿或者重組來源存在這樣低濃度的FVIII通常需要大量血漿或者其它來源以獲得合理的市售產(chǎn)量。因此，生產(chǎn)費(fèi)用增加并且通常需要工序的減少。
FVIII是一種在血漿中相對(duì)不穩(wěn)定的蛋白。因此，應(yīng)用于FVIII分離的標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)難以得到用于獲取大量有生物活性FVIII的方法。當(dāng)前的方法包括在純化方案的最后用穩(wěn)定劑，最常用的是人白蛋白穩(wěn)定FVIII制備物。但是，在純化過程的最后添加可能已來不及保護(hù)分離的FVIII活性。用蔗糖制成的“Kogenate-F”，一種重組FVIII(rFVIII)治療產(chǎn)品可以免除向制備物添加人白蛋白的需要。
FVIII制備物的病毒污染也是一個(gè)潛在問題。通常，溶劑表面活性劑(SD)，巴氏滅菌法，亞甲基藍(lán)(MB)和UV處理或者它們的組合用來使FVIII制備物中的病毒失活。但是，傳統(tǒng)病毒去除步驟通常引起FVIII的損失或者失活。
發(fā)明概述本申請(qǐng)涉及利用基于膜的電泳分離系統(tǒng)分離功能活性因子VIII的多種方法和裝置。
一方面，這些方法利用含有分離膜的電泳裝置建立在至少兩種限制膜之間的第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積。一種或者多種穩(wěn)定劑被添加到樣品和/或一個(gè)隙間體積中。第一個(gè)隙間體積的溶劑維持FVIII在需要的電荷狀態(tài)。在第一個(gè)和第二次隙間體積之間施加電壓使在分離膜一側(cè)的FVIII與分離膜另一側(cè)的不需要的分子分割開來。
第一方面，本發(fā)明提供了一種從樣品獲得因子VIII(FVIII)的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量不同于所述FVIII的分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向一種或者多種樣品，第一個(gè)隙間體積，或者第二個(gè)隙間體積提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇一種具有限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓，其中含有FVIII的終產(chǎn)物位于分離膜的一側(cè)，而不需要的分子基本上位于分離膜的另一側(cè)；以及(e)繼續(xù)步驟(d)直到需要量的FVIII位于分離膜的一側(cè)。
第二方面，本發(fā)明提供了從樣品中獲得因子VIII(FVIII)的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中的FVIII遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積形成含有FVIII的終產(chǎn)物，而不需要的分子基本上被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；以及(e)繼續(xù)步驟(d)直到需要量的FVIII遷移進(jìn)入第二個(gè)隙間體積。
第三方面，本發(fā)明提供了用于從樣品中獲得因子VIII(FVIII)的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量小于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中除FVIII以外的樣品組分遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而FVIII基本上被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積并且保持在第一個(gè)隙間體積中作為終產(chǎn)物；以及(e)繼續(xù)步驟(d)直到樣品中需要量的組分從第一個(gè)隙間體積去除，而FVIII保持在第一個(gè)隙間體積中。
優(yōu)選地，樣品為血漿或者其部分，冷沉淀物或者其部分，重組FVIII來源，或者其組合或者混合物。
優(yōu)選地，穩(wěn)定劑為一種或者多種緩沖成分，改變摩爾濃度的組分，蛋白，氨基酸，或者糖。穩(wěn)定劑可能是一種或者多種山梨糖醇，鹽，甘油，諸如蔗糖、乳糖和葡聚糖/葡萄糖的糖，甘氨酸，凝膠，乙酸鉀，疊氮化物，或者蛋白酶抑制劑。穩(wěn)定劑優(yōu)選為白蛋白，氨基酸的混合物、蔗糖，或者它們的混合物。
優(yōu)選地，白蛋白的應(yīng)用濃度為至少大約2mg/mL(2g/L)，氨基酸混合物的應(yīng)用濃度為至少大約0.01g/mL(10g/L)，蔗糖的應(yīng)用濃度為至少大約1％(10g/L)。更優(yōu)選地，白蛋白的應(yīng)用濃度為至少大約10mg/mL(10g/L)，氨基酸混合物的應(yīng)用濃度為大約0.05g/mL(50g/L)，蔗糖的應(yīng)用濃度為大約5％(50g/L)。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(c)利用一種緩沖液以使FVIII具有凈負(fù)電荷。更優(yōu)選地，步驟(c)利用pH在6.5-7.0之間的緩沖液。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，緩沖液為MES/組氨酸，pH6.5，分離膜的截留分子量為大約1500kDa，而限制膜的截留分子量為大約5kDa。
終產(chǎn)物FVIII優(yōu)選保持至少大約40％的比活性。終產(chǎn)物FVIII的比活性優(yōu)選為至少大約60％。更優(yōu)選地，終產(chǎn)物FVIII的比活性大于大約75％。
本發(fā)明尤其適于含有一種重組體(rFVIII)的細(xì)胞上清液或者細(xì)胞裂解產(chǎn)物的處理樣品。
第四方面，本發(fā)明提供了從含F(xiàn)VIII樣品中分離毒素、病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII和毒素、病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；
(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中的FVIII遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積形成終產(chǎn)物，而不需要的分子和毒素、病原體或傳染性介質(zhì)污染物被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；以及(e)繼續(xù)步驟(d)直到需要量的FVIII移向第二個(gè)隙間體積。
第五方面，本發(fā)明提供一種從含F(xiàn)VIII和毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的樣品中分離毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII和毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中的FVIII遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積形成含有FVIII的終產(chǎn)物，而不需要的分子被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；(e)繼續(xù)步驟(d)直到需要量的FVIII移向第二個(gè)隙間體積；(f)將從步驟(e)獲得的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(g)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑使FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(h)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使在第一個(gè)隙間體積的FVIII遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；以及(i)繼續(xù)步驟(h)直到需要量的FVIII移向第二個(gè)隙間體積。
第六方面，本發(fā)明提供一種從含F(xiàn)VIII樣品中分離毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII和毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量小于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中除FVIII以外的樣品組分遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而FVIII被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積并且保持在第一個(gè)隙間體積作為終產(chǎn)物；(e)繼續(xù)步驟(d)直到樣品中需要量的組分從第一個(gè)隙間體積去除，而FVIII保持在第一個(gè)隙間體積；(f)將從步驟(e)獲得的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(g)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑以使FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(h)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使在第一個(gè)隙間體積中的FVIII遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；以及(i)繼續(xù)步驟(h)直到需要量的FVIII移向第二個(gè)隙間體積。
第七方面，本發(fā)明提供一種從含F(xiàn)VIII樣品中分離毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII和毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中的FVIII通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積形成含F(xiàn)VIII的終產(chǎn)物，而不需要的分子基本上被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；(e)繼續(xù)步驟(d)直到需要量的FVIII移向第二個(gè)隙間體積；(f)將從步驟(e)獲得的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(g)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑以使毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物具有需要的電荷狀態(tài)；(h)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使在第一個(gè)隙間體積中的毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而FVIII被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；(i)繼續(xù)步驟(h)直到在第一個(gè)隙間體積中有需要量的FVIII。
第八方面，本發(fā)明提供一種獲得基本上不含毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的FVIII的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII和毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量小于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中除FVIII以外的樣品組分通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而FVIII被基本上阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積并保持在第一個(gè)隙間體積中作為終產(chǎn)物；(e)繼續(xù)步驟(d)直到樣品中需要量的組分從第一個(gè)隙間體積去除，且FVIII保持在第一個(gè)隙間體積；(f)將含有毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的FVIII放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(g)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑以使毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物具有需要的電荷狀態(tài)；(h)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使在第一個(gè)隙間體積中的毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而FVIII被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；以及(i)繼續(xù)步驟(h)直到在第一個(gè)隙間體積中有需要量的FVIII。
優(yōu)選地，毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)選自內(nèi)毒素，朊病毒，病毒，細(xì)菌，真菌，酵母，原生動(dòng)物或者其混合物。
一種優(yōu)選的形式，病原體或者傳染性介質(zhì)為病毒。
權(quán)利要求的這些及其他特征根據(jù)以下本申請(qǐng)的詳細(xì)描述與附圖一起將得以理解。


圖1為利用基于膜的電泳分離系統(tǒng)分離功能性活性因子VIII的方法的框圖；圖2示例了FVIII抗原(FVIIIAg)在電泳系統(tǒng)的S1中在不同pH值條件下隨時(shí)間的遷移；圖3示例了FVIIIAg在電泳系統(tǒng)的S2中在不同pH值條件下隨時(shí)間的遷移；圖4顯示了用小鼠抗-人FVIII作為探針的高度純化產(chǎn)物FVIII的等電聚焦Western印跡。結(jié)果表明由此來源的FVIII的真實(shí)pI 6.2，顯示在多種pH值條件下的遷移結(jié)果；圖5示例了FVIIIAg在電泳裝置的S1和S2中利用白蛋白作為電泳緩沖液中穩(wěn)定劑(白蛋白的終濃度為10mg/mL)的遷移；圖6示例了FVIIIAg在電泳裝置的S1和S2中利用Synthamin17作為電泳緩沖液中穩(wěn)定劑(Synthamin17的終濃度為0.05g/mL)的遷移；圖7示例了FVIIIAg在電泳裝置的S1和S2中利用Synthamin17作為電泳緩沖液中穩(wěn)定劑(Synthamin17的終濃度為0.025g/mL)的遷移；圖8示例了FVIIIAg在電泳裝置的S1中在不同pH值條件下利用純血漿作為起始材料的遷移；圖9為豬細(xì)小病毒(PPV)的等電聚焦(IEF)印跡，其中泳道1為用麗春紅S染料染色的pI標(biāo)記，泳道2為用麗春紅S染料染色的PPV制備物，泳道3為用小鼠抗-豬細(xì)小病毒病毒探測的PPV制備物；圖10為顯示在電泳期間隨時(shí)間從PPV污染物分離FVIII的圖；圖11顯示當(dāng)rFVIII峰(spike)進(jìn)入MES/Bis-Tris pH6.5的緩沖液時(shí)，在基于膜的電泳裝置的S1和S2中rFVIII的活性。沒有施加電壓通過分離裝置；圖12顯示在整個(gè)基于膜的電泳分離期間從S1向S2轉(zhuǎn)移的rFVIII活性的水平。三個(gè)不同濃度的蔗糖和一種濃度的白蛋白作為穩(wěn)定劑進(jìn)行試驗(yàn)。最佳穩(wěn)定劑為5％的蔗糖，比兩種較小濃度的蔗糖有助于保持更高的活性；圖13顯示當(dāng)三個(gè)組合的穩(wěn)定劑如上所述被應(yīng)用時(shí)，來自基于膜的電泳裝置的S2最終回收的rFVIII活性。5％蔗糖穩(wěn)定劑被證實(shí)比較低的蔗糖濃度更好；圖14顯示在利用基于膜的電泳裝置純化rFVIII過程中，原材料和終產(chǎn)物的SDS PAGE凝膠電泳。泳道5含有純化rFVIII產(chǎn)品，其完全不含白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白及其他低分子量污染物。泳道7和8包含從S1去除的污染物；以及圖15為在基于膜的電泳分離中蛋白濃度與時(shí)間的圖。隨著分離過程中雜質(zhì)水平的降低，觀察到FVIII比活性的顯著提高。
發(fā)明的詳細(xì)說明利用基于膜的電泳分離系統(tǒng)根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求分離功能性活性因子VIII的優(yōu)選實(shí)施方案非限制性詳細(xì)描述如下。這些實(shí)施方案還可能代替分離天然FVIII或者rFVIII傳統(tǒng)純化方案中的一個(gè)或多個(gè)步驟。
圖1表示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面從樣品獲得FVIII方法的方框圖。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品可為血漿或者其部分，冷沉淀物或者其部分，重組FVIII來源，或者其組合或者混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，樣品可能是含有一種重組體(rFVIII)的細(xì)胞上清液或者細(xì)胞溶解產(chǎn)物。但是，其它含有FVIII的樣品，也就是說適于以膜為基礎(chǔ)的電泳的樣品可根據(jù)本發(fā)明的方法加以應(yīng)用。
框100描述了將含有FVIII的樣品放置在電泳裝置的隙間體積中。合適的電泳裝置包括具有確定孔徑的分離膜，其截留分子量不同于FVIII分子量。分離膜可能是具有限定截留分子量的電泳分離膜。例如，截留分子量可大于FVIII分子量或者等于或者可能低于FVIII分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，電泳分離膜的截留分子量從大約1kDa到大約2000kDa。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道其它截留分子量可以根據(jù)樣品中其它分子，諸如污染物，鹽，或者穩(wěn)定劑的分子量加以應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離膜含有聚丙烯酰胺。但是，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，其它膜化學(xué)產(chǎn)品或者組分可被使用。分離膜位于電場區(qū)。
位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間的限制膜形成了它們之間的第一個(gè)隙間體積。位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間的第二個(gè)限制膜形成了它們之間的第二個(gè)隙間體積。僅僅為了方便起見，第一個(gè)隙間體積或者液流被稱作液流1(S1)，而第二個(gè)隙間體積或者液流被稱作液流2(S2)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，形成第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積的限制膜以位于裝置電極區(qū)域之間的盒或者彈夾形式提供。在另一個(gè)實(shí)施方案中，盒的構(gòu)造優(yōu)選為有分離膜位于第一個(gè)和第二個(gè)限制膜之間的室從而形成需要的隙間體積。在一些實(shí)施方案中，盒或者彈夾可從適合含有或者接收盒的電泳裝置中移走。其它含有分離膜和限制膜形成隙間體積的膜構(gòu)造也在本發(fā)明權(quán)利要求考慮的范圍內(nèi)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第一個(gè)和第二個(gè)限制膜由聚丙烯酰胺形成。但是，其他膜化學(xué)產(chǎn)品可用于形成合適的限制膜并且在本領(lǐng)域是公知的。通常，限制膜的截留分子量小于分離膜分子量。在一些實(shí)施方案中，限制膜的截留分子量介于1kDa到大約1000kDa之間。但是，其它截留分子量也可被應(yīng)用。限制膜截留分子量的選擇將依靠被加工的樣品以及被除去大分子的尺寸。限制膜可能具有相同的截留分子量或者不同的截留分子量，形成不對(duì)稱的排列。
一個(gè)實(shí)施方案采用在陰極區(qū)域包括陰極，在陽極區(qū)域包括陽極的電泳裝置，陽極與陰極相對(duì)配置以便適合于在陰極和陽極之間施加電壓后在它們之間的電場區(qū)產(chǎn)生電場，分離膜位于電場區(qū)，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域以及分離膜之間，以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域以及分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積，給陰極區(qū)域，陽極區(qū)域以及至少一個(gè)第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積提供溶劑的裝置，在選擇的一個(gè)第一個(gè)以及第二個(gè)隙間體積中提供樣品組成的系統(tǒng)，其中通過施加電壓，一種選擇的分離產(chǎn)物就從樣品組成中通過至少一個(gè)膜被除去，并且提供給其它的第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積或者陰極或者陽極區(qū)域。陰極區(qū)域和陽極區(qū)域通過任一合適的泵送裝置被供給合適的溶劑或者緩沖溶液。待加工的樣品通過任一合適的泵送裝置直接供給第一個(gè)或者第二個(gè)隙間體積。第一個(gè)電極優(yōu)選地為陰極，第二電極優(yōu)選地為陽極。根據(jù)待處理的樣品以及應(yīng)用溶劑或者緩沖液的pH值，構(gòu)造可以轉(zhuǎn)換，其中第一個(gè)電極為陽極，第二電極為陰極。
在一個(gè)合適的裝置中，區(qū)域和隙間體積的構(gòu)造使得各個(gè)流體/緩沖液和樣品溶液流動(dòng)形成液流。以這種方式，大體積可被迅速和有效地加工。溶液通常通過合適的泵送裝置從各個(gè)儲(chǔ)液槽遷移或者循環(huán)通過區(qū)域和體積。例如，蠕動(dòng)泵可被用作移動(dòng)樣品，緩沖液或者流體的泵送裝置。
在另一個(gè)合適的裝置中，附加的裝置除去在電泳裝置中產(chǎn)生的熱。例如，樣品和流體穿過熱交換器散去由裝置在電泳期間產(chǎn)生的熱。作為另一個(gè)例子，電極緩沖液，其它緩沖液，和樣品溶液由任一合適的裝置冷卻以限制化合物在分離過程中的失活并且保持應(yīng)用中裝置要求的溫度。
在一種合適的電泳裝置中，電極之間的距離對(duì)于樣品組分穿過膜的分離或者遷移有影響。電極之間距離越短，組分的電泳遷移越快。大約6mm的距離已經(jīng)被認(rèn)為適于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的裝置。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到更窄的距離也可能合適。對(duì)于大規(guī)模而言，距離將依賴于用與樣品，緩沖液和分離產(chǎn)品的分離膜數(shù)目和種類，電泳槽的大小和體積。優(yōu)選距離約為大約6mm到大約10cm。距離也將與施加到裝置上的電壓有關(guān)。
電場的作用基于公式e＝V/d(e＝電場，V＝電壓，d＝距離)。因此，電極之間的距離越小，分離越快。優(yōu)選地，電極之間的距離能縮小以增加電場強(qiáng)度，從而進(jìn)一步改進(jìn)通過膜的遷移率。
樣品/緩沖液/流體的流速對(duì)組分的分離有影響。每分鐘毫升數(shù)直到每小時(shí)升數(shù)的速率根據(jù)所述裝置的構(gòu)造和待分離樣品被采用。例如，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的儀器而言，優(yōu)選的流速為大約20±5mL/分鐘。但是，從大約0mL/分鐘到大約50,000mL/分鐘的流速也已被用于多種分離方式。根據(jù)泵送裝置和電泳裝置尺寸，最大流速甚至更高。其它流速也可被應(yīng)用。流速的選擇依賴于遷移的產(chǎn)品，遷移效率，位于其它裝置的前和后，并且由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定。
施加電壓和/或電流的選擇或者實(shí)施根據(jù)分離的不同而不同。通常應(yīng)用高達(dá)數(shù)千伏的電壓，但是電壓變化和選擇將依靠裝置的構(gòu)造，緩沖液和待分離的樣品。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的儀器而言，優(yōu)選的電壓為大約250V。但是，根據(jù)遷移，效率，放大的規(guī)模，尤其是方法，使用大約0V到5000V的電壓。根據(jù)裝置和待處理的樣品，也可考慮更高電壓。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易確定選擇合適電壓。
任選地，電壓可能周期性停止和反向引起已進(jìn)入膜的成分返回到其來自的體積或者液流，而基本上不引起任一已經(jīng)完全通過膜的成分通過膜返回。
電壓的反向是一種選擇但是另一個(gè)替代法是靜態(tài)期。靜態(tài)(沒有施加電壓的時(shí)間)是一種可選擇的步驟，可代替或者被包括在可選擇電位反向前或后。這種靜態(tài)技術(shù)通常可被用于特定的分離裝置作為反向電壓的替代法或者附加。
在另一個(gè)合適的裝置和方法中，在含有任一分離化合物或者分子的至少一種體積或者液流中收集溶液并且用合適的溶劑替換以保證電泳可以以有效的方式繼續(xù)進(jìn)行。合適的裝置也可適合于容納大體積的通過量以及不同的分離構(gòu)造。盡管上述多種電泳裝置根據(jù)本發(fā)明的權(quán)利要求可分離天然或者重組因子VIII，但是本領(lǐng)域公知的其它基于膜的電泳裝置也是合適的。
參考圖1的框110，根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求實(shí)施的方法給樣品和/或隙間體積提供了一種或者多種穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑有助于保持分離FVIII的生物活性。例如，緩沖成分，改變摩爾濃度的組分，蛋白，氨基酸，糖或者其組合可被作為穩(wěn)定劑添加。作為其它實(shí)例，山梨糖醇，鹽，甘油，蔗糖，乳糖，葡聚糖/葡萄糖，甘氨酸，凝膠，乙酸鉀，疊氮化物，Synthamin17(Baxter公司)和蛋白酶抑制劑根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求也可用作穩(wěn)定劑。其它用于FVIII的合適穩(wěn)定劑是本領(lǐng)域公知的，也可被使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白，氨基酸的混合物，蔗糖及其混合物被用作穩(wěn)定劑。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白的應(yīng)用濃度為至少大約2mg/mL(2g/L)，氨基酸混合物的應(yīng)用濃度為至少大約0.01g/mL(10g/L)，蔗糖的應(yīng)用濃度至少為大約1％(10g/L)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，白蛋白的應(yīng)用濃度為大約10mg/mL(10g/L)，氨基酸混合物的應(yīng)用濃度為大約0.05g/mL(50g/L)，蔗糖的應(yīng)用濃度為大約5％(50g/L)。應(yīng)該認(rèn)識(shí)到穩(wěn)定劑可以作為原材料的一部分添加或者在電泳分離以前或者期間被加到樣品中。例如，一種或者多種穩(wěn)定劑被添加到樣品和/或含有FVIII的終產(chǎn)物液流中。
框120選擇具有一pH的溶劑以使FVIII具有需要的電荷狀態(tài)。根據(jù)溶劑，F(xiàn)VIII被保持在正，負(fù)，或者中性電荷狀態(tài)。例如，選擇pH值大于FVIII pI值的緩沖液保持FVIII在負(fù)電荷狀態(tài)。選擇pH值小于FVIII pI值的緩沖液保持FVIII在正電荷狀態(tài)。pH值等于FVIII pI值的緩沖液保持FVIII在中性電荷狀態(tài)。在一個(gè)實(shí)施方案中，pH值在6.5到7.0之間的緩沖液導(dǎo)致FVIII具有凈負(fù)電荷。在一個(gè)實(shí)施方案中，聯(lián)合使用pH值6.5(MES/組氨酸)，1500kDa的分離膜和5kDa的限制膜。很顯然，也可選擇使用其它緩沖液。選擇保持FVIII在需要電荷狀態(tài)的緩沖液對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。
框130在第一個(gè)和第二次隙間體積之間施加電壓，其中含有FVIII的終產(chǎn)物位于分離膜的一側(cè)，而不需要的分子基本上位于分離膜的另一側(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，終產(chǎn)物FVIII保持至少大約40％的比活性。優(yōu)選地，比活性為至少大約60％，更優(yōu)選的比活性大于大約75％。比活性可以被計(jì)算為獲得的μg FVIII或者獲得的mg總蛋白。
框140保持在框130施加的電壓，直到需要量的終產(chǎn)物FVIII位于分離膜的一側(cè)，而不需要的分子基本上位于分離膜的另一側(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，獲得的市售量天然FVIII或者rFVIII具有至少大約28％的回收率和至少大約40％的活性。但是，利用本發(fā)明權(quán)利要求中描述的方法，其它回收率和活性也是可能的。
例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，將含有FVIII的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于位于電場區(qū)中的FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積。向樣品和/或第二個(gè)隙間體積提供一種或者多種穩(wěn)定劑。為第一個(gè)隙間體積選擇一限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)。在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓，使第一個(gè)隙間體積中的FVIII遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積并形成含F(xiàn)VIII的終產(chǎn)物，而不需要的分子基本上被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積。施加電壓直到需要量的FVIII遷移到第二個(gè)隙間體積。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將含有FVIII的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量小于位于電場區(qū)中的FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積。向樣品和/或第二隙間體積提供一種或者多種穩(wěn)定劑。選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)。在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中除FVIII以外的樣品組分遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而FVIII基本上被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積并且保持在第一個(gè)隙間體積中作為終產(chǎn)物。維持施加的電壓，直到樣品中需要量的組分從第一個(gè)隙間體積去除，而FVIII保持在第一個(gè)隙間體積中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將樣品放置于第一個(gè)隙間體積中，向電極區(qū)域和第二個(gè)隙間體積提供緩沖液或者溶劑，向電場區(qū)施加電壓使得樣品中至少一個(gè)組分移向陰極區(qū)域的緩沖液/溶劑或者在第二個(gè)隙間體積中的緩沖液/溶劑。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白隙間體積的順序可被轉(zhuǎn)換，其中將樣品處置于第二個(gè)隙間體積中，向電極區(qū)域和第一個(gè)隙間體積提供緩沖液或者溶劑，向電場區(qū)施加電壓引起樣品中至少一種組分移向陽極區(qū)域的緩沖液或者第一個(gè)隙間體積中的緩沖液。權(quán)利要求也考慮將樣品放置在一個(gè)(或者兩個(gè))電泳區(qū)域并且在施加電壓期間獲得遷移進(jìn)入一個(gè)或者多個(gè)隙間體積。
獲得的FVIII也可基本上不含樣品中的毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染。例如，可能除去的一些毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)包括內(nèi)毒素，朊病毒，病毒，細(xì)菌，真菌，酵母或原生動(dòng)物。但是，其它毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)也可由根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求的方法被除去。
在一個(gè)實(shí)施方案中，含有FVIH(和毒素，病原體，或者傳染性介質(zhì)污染物)的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于位于電場區(qū)中的FVIII分子量；第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積；第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積。向樣品和/或第二個(gè)隙間體積提供一種或者多種穩(wěn)定劑。選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)。在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積樣品中的FVIII遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積形成終產(chǎn)物，而不需要的分子和毒素，病原體，或者傳染性介質(zhì)污染物基本上被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積。保持施加電壓直到期望量的FVIII被遷移向第二個(gè)隙間體積并且相對(duì)不含毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物。
在另一個(gè)除去毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)的實(shí)施方案中，獲得來自框140作為終產(chǎn)物的樣品FVIII。該樣品可含有在圖1所述的過程中未被除去的毒素，病原體或傳染性介質(zhì)。將獲自框140的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于位于電場區(qū)中的FVIII的量分子；第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積；第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積。選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)。在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積樣品中的FVIII遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物基本上被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積。保持施加的電壓直到期望量的FVIII遷移到第二隙間體積，并相對(duì)不含毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物。
在另一個(gè)除去毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)的實(shí)施方案中，獲得樣品FVIII作為來自框140的終產(chǎn)物，并放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于位于電場區(qū)中的毒素，病原體或傳染性介質(zhì)的分子量；第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積；第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積。選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有限定pH的溶劑使得毒素，病原體或傳染性介質(zhì)污染物具有需要的電荷狀態(tài)。在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積樣品中的毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而FVIII基本上被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積。保持外加電壓直到第一隙間體積中的期望量的FVIII相對(duì)不含毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物。
為了幫助理解本發(fā)明，包括了以下實(shí)施例并且描述了一系列試驗(yàn)的結(jié)果。以下與本發(fā)明有關(guān)的實(shí)施例不應(yīng)解釋為具體限制本申請(qǐng)，不管是公知的還是后面發(fā)展的，本申請(qǐng)的這種變化落入此處描述和要求保護(hù)的本申請(qǐng)的范圍。
定義術(shù)語“FVIII活性”是指樣品按IU/mL標(biāo)準(zhǔn)血漿測定的FVIII活性。
術(shù)語“FVIII比活性”是指樣品按IU/mL測定的FVIII活性，作為分別以IU/mL或者mg/mL表示FVIII抗原總蛋白的量的函數(shù)。
術(shù)語“液流1(S1)”是指代表第一個(gè)隙間體積，其中樣品在液流中提供給電泳裝置。
在說明書中使用的術(shù)語“液流2(S2)”表示第二個(gè)隙間體積，其中物質(zhì)從第一個(gè)隙間體積遷移通過分離膜到電泳裝置的液流。
在電泳裝置中當(dāng)?shù)谝粋€(gè)電極為陰極以及第二個(gè)電極為陽極，并且如此施加電流時(shí)，使用術(shù)語“正向極性”。
當(dāng)電極為反向使得第一個(gè)電極變成陽極而第二個(gè)電極變成陰極時(shí)使用術(shù)語“反向電極”。
分析方法聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)PAGE用于測量在電泳期間組分的遷移。標(biāo)準(zhǔn)PAGE方法按照以下說明實(shí)施。
試劑10×SDS甘氨酸電泳緩沖液(Gradipore Limited，澳大利亞)，利用Milli-Q水稀釋1×待用；1×SDS甘氨酸電泳緩沖液(29gTrizma堿，144g甘氨酸，10g SDS，用RO水補(bǔ)足到10L)；10×TBE II電泳緩沖液(Gradipore)，利用Milli-Q水稀釋到1×待用；1×TBE II電泳緩沖液(10.8g Trizma堿，5.5g硼酸，0.75g EDTA，用RO水補(bǔ)足到1.0L)；2×SDS樣品緩沖液(4.0mL，10％(w/v)SDS電泳級(jí)，2.0mL甘油，1.0mL 0.1％(w/v)溴酚藍(lán)，2.5mL 0.5M Tris-HCl，pH6.8，用RO水補(bǔ)足直至10mL)；2×天然樣品緩沖液(10％(v/v)10×TBE II，20％(v/v)PEG200，0.1g/L的二甲苯腈藍(lán)，0.1g/L溴酚藍(lán)，以RO水補(bǔ)足到100％)；考馬斯藍(lán)染料(GradipureTM，Gradipore Limited)。注解含有甲醇6％乙酸溶液用于脫色。
分子量標(biāo)記(推薦保存在-20℃)SDS PAGE(例如Sigma寬范圍)；天然的PAGE(例如Gradipore天然標(biāo)記)；蛋白質(zhì)印跡(例如彩色/彩條標(biāo)記)。
非還原樣品的SDS PAGE為了制備用于電泳的樣品，2×SDS樣品緩沖液以1∶1比率(通常50μL/50μL)添加到微滴定板或者1.5mL的小管中。樣品在大約100℃溫育5分鐘。將凝膠盒夾到凝膠板上，使得孔朝內(nèi)，并且放入電泳槽中。如果在凝膠板上只跑一個(gè)膠條，空白盒或者塑料板夾到凝膠板的另一側(cè)。
充足的1×SDS甘氨酸電泳緩沖液倒入凝膠板的內(nèi)槽中覆蓋住樣品孔。將外槽填充到凝膠盒上方大約中間水平。利用移液吸管，樣品孔用電泳緩沖液沖洗除去氣泡并且替代任一存液緩沖液和殘余的聚丙烯酰胺。
微孔裝有最少5μL的標(biāo)記物和制備的樣品(最大40μL)。在電泳槽上加蓋并且連接導(dǎo)線到電源之后，凝膠在150V電泳90分鐘。電泳結(jié)束后，在染色或者進(jìn)行第二個(gè)程序(例如，蛋白印跡)以前盡快從槽中取出凝膠。
凝膠染色和脫色打開凝膠盒取出凝膠放入容器或者可密封的塑料袋中。用自來水充分沖洗凝膠，并從容器中排水。添加考馬斯藍(lán)染料(大約100mLGradipureTM，Gradipore Limited，澳大利亞)并且密封容器或者袋子。主要條帶在10分鐘內(nèi)可見但是為了獲得最大強(qiáng)度，需要染色過夜。為了凝膠脫色，染料從容器中排干。
容器和凝膠用自來水沖洗除去殘余染料。6％的乙酸(大約100mL)倒入容器并密封。脫色足夠長時(shí)間以達(dá)到期望的脫色水平(通常12小時(shí))。一旦達(dá)到期望的水平，排出乙酸并且用自來水沖洗凝膠。
原材料和終產(chǎn)物在4-20％ SDS-PAGE igelsTM(GradiporeLimited，澳大利亞)進(jìn)行電泳。利用GradipureTM考馬斯藍(lán)染料(GradiporeLimited，澳大利亞)染色并用6％乙酸脫色。
等電聚焦(IEF)IEF用于確定組分的等電點(diǎn)有助于設(shè)計(jì)電泳分離條件。標(biāo)準(zhǔn)IEF方法按照以下說明實(shí)施。
試劑NovexIEF凝膠用于pI確定并證實(shí)純化產(chǎn)物的同工型。NovexIEF凝膠為5％的聚丙烯酰胺，非變性，并且不含尿素。PH值3-10的凝膠PI的性能范圍為3.5-8.5。
推薦的緩沖液pH3-10 IEF凝膠(NovexIEF樣品緩沖液，pH3-10(2×)25mL，目錄號(hào)LC5311；NovexIEF陰極緩沖液，pH3-10(10×)125mL，目錄號(hào)LC5310；NovexIEF陽極緩沖液，(50×)100mL，目錄號(hào)LC5300；IEF陰極緩沖液(1×工作液)在使用前真空脫氣10分鐘或者用惰性氣體洗滌1分鐘。
固定液17.3g磺基水楊酸，57.3g TCA，去離子水充滿到500mL，IEF，pH3-7目錄號(hào)LC5371(2×)，2.0mL 10×陰極緩沖液(3-7)，3.0mL甘油，蒸餾水添加到10.0mL，陰極緩沖液，商品目錄號(hào)LC5370(10×)，5.8g賴氨酸(游離堿)，蒸餾水添加到100mL，陽極緩沖液，商品目錄號(hào)LC5300(50×)，4.7g磷酸(85％)，蒸餾水添加到100mL。1×陽極緩沖液pH應(yīng)該為大約2.4。1×陰極緩沖液pH應(yīng)該為大約10.1。
操作流程通過添加一部分樣品到一部分NovexIEF樣品緩沖液(2×)并且充分混合而制備樣品。
NovexIEF陰極緩沖液(10×)用去離子水在使用之前稀釋1∶9，并且IEF陰極緩沖液(1×工作液)僅在使用之前真空脫氣10分鐘，或者用氮?dú)饣蛘吆庀礈?分鐘。這就降低了在凝膠電泳期間從溶解的二氧化碳中形成氣泡的可能性。上面緩沖液槽充滿適當(dāng)量的陰極緩沖液。
NovexIEF陽極緩沖液(50×)用去離子水在使用之前稀釋為1∶49，并且適當(dāng)量的陽極緩沖液倒入下面緩沖液槽。
將適當(dāng)體積的樣品上樣到已被NovexIEF陰極緩沖液充滿的孔中。
根據(jù)下列電泳條件進(jìn)行凝膠電泳100V恒定-1小時(shí)，200V恒定-1小時(shí)，500V恒定-30分鐘，近似的電流起始在5mA/凝膠并且終止在6mA/凝膠。電泳時(shí)間為大約2.5小時(shí)。
電泳后，凝膠從凝膠盒移出并且固定在固定液(參見上面配方)中30分鐘。這個(gè)步驟對(duì)固定蛋白質(zhì)和除去兩性電解質(zhì)很重要。否則可能產(chǎn)生強(qiáng)背景。
凝膠放置在染色液(0.1％Coomassie R-250)并振動(dòng)5分鐘。凝膠用1×脫色液或者NovexGel-ClearTM脫色直到獲得需要的清晰度。所有固定，著色和脫色的進(jìn)行都伴隨著溫和振動(dòng)。
在IEF凝膠上以兩個(gè)不同的稀釋度電泳純化的FVIII。IEF凝膠印跡到硝酸纖維上，所述硝化纖維用小鼠抗-人FVIII初級(jí)抗體檢測。共軛結(jié)合HRP的次級(jí)抗體用來探測初級(jí)抗體并利用4CN展開。豬細(xì)小病毒(PPV)的等電點(diǎn)也通過IEF如下闡述確定。
Synthamin 17Synthamin 17為14種L-氨基酸靜脈注射液，濃度為0.1g/mL，可以從Baxter獲得。這種溶液被用作合成氨基酸的來源。沒有電解質(zhì)的每1000mL Synthamin 17(氨基酸)(10％)靜脈注射劑含有下表中列舉的組分

大約1.5mmol/L偏亞硫酸氫鈉(Sodium Metabisulphine)BP作為穩(wěn)定劑添加。
實(shí)驗(yàn)流程和結(jié)果從純化來源鑒定FVIII下列實(shí)驗(yàn)確定了適用于FVIII在電泳系統(tǒng)中遷移的pH。在試驗(yàn)緩沖液中大約100IU/mL的FVIII用作起始材料。將5.0-7.0的pH范圍和大孔徑分離膜(500-1000kDa)加以研究是根據(jù)電荷而非大小使FVIII遷移。保持FVIII的穩(wěn)定性限制試驗(yàn)到這個(gè)pH范圍。FVIII遷移和活性的分析利用生色試驗(yàn)進(jìn)行并且FVIII比活性可以表示為每μgFVIII的FVIII活性(IU)的量。根據(jù)引用/理論P(yáng)I和大小(kDa)假設(shè)產(chǎn)物中其它蛋白質(zhì)的遷移。
pH7.1和pH7.3的緩沖液(Hepes/咪唑(Imidizole))的分離利用5-800-5kDa的膜構(gòu)造(第一個(gè)限制膜-分離膜-第二個(gè)限制膜)。pH6.7緩沖液(Hepes/咪唑)的分離利用5-1000-5kDa的膜構(gòu)造。pH6.5緩沖液(MES/組氨酸)和pH5.0(GABA/乙酸)的分離利用5-1500-5kDa膜構(gòu)造。利用大孔徑膜在一個(gè)pH范圍內(nèi)FVIII濃縮物的結(jié)果圖2顯示了FVIII抗原(FVIIIAg)在不同pH條件下在電泳系統(tǒng)S1中的遷移。這些結(jié)果表明大多數(shù)FVIIIAg在第一個(gè)30分之內(nèi)在正向極性試驗(yàn)的每個(gè)pH條件下遷移出S1，表明沒有試驗(yàn)的pH值等于FVIII的pI值即，在所有試驗(yàn)pH值條件下，F(xiàn)VIII保持一種電荷狀態(tài)。
圖3顯示了FVIIIAg在不同pH條件下在電泳系統(tǒng)S2中的遷移。這些結(jié)果表明FVIIIAg在pH6.7，7.3和7.5的條件下，在S2中檢測到低水平，而在pH5.0時(shí)根本沒有。在pH6.5，F(xiàn)VIIIAg在S2中檢測到顯著水平。
因此，在pH＞6.5時(shí)，F(xiàn)VIII為負(fù)電荷(-ve)并且在正向極性下移出S1并移入S2。S2中FVIII的缺乏可被解釋為或者FVIII被阻塞或者與分離膜結(jié)合或者FVIII強(qiáng)烈?guī)щ姴⑶遗c較低的或者第二個(gè)限制膜結(jié)合。在pH5.0，F(xiàn)VIII從S1移出但是沒有出現(xiàn)在S2中，顯示在這個(gè)pH，在正向極性下，F(xiàn)VIII帶正電荷(+ve)遷移到頂上部或者第一個(gè)限制膜。
雖然保持FVIIIAg在系統(tǒng)中很重要，但沒有存在抗原，活性水平就不能被檢測到。如果實(shí)驗(yàn)條件包括在pH6.5的緩沖液(MES/組氨酸)，5-1500-5kDa的膜構(gòu)造，30分收集，靜態(tài)和反轉(zhuǎn)(2分)共2小時(shí)，試驗(yàn)(在30分鐘間隔)證明在2小時(shí)FVIII抗原回收率總共為90.3％(US＝4.78％，S2＝85.52％)，因此表明在分離自始至終保持了功能活性。每個(gè)S2部分的比活性列舉在表1中。
表1.在pH6.5，以S10％表示的FVIII抗原回收率和比活性

在pH6.5，59.19％的FVIII轉(zhuǎn)移到S230產(chǎn)量。在制備物中大多數(shù)穩(wěn)定白蛋白也遷移到S2。S230樣品中FVIII的高度穩(wěn)定(87.2％)可能是由于在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)也收集白蛋白的原因。收集FVIII的剩余S2部分活性水平顯著減少是由于大多數(shù)穩(wěn)定白蛋白收集在第一部分(S230)的原因。
FVIII濃縮物PI的計(jì)算人FVIII的理論pI為6.97，由它的氨基酸序列計(jì)算而來。經(jīng)常這些理論P(yáng)I計(jì)算與通過上述FVIII結(jié)果顯示的生物學(xué)實(shí)體不相關(guān)。如果FVIII的PI實(shí)際上為6.97，將不會(huì)在pH6.5時(shí)、正向極性條件下被遷移到S2。上述結(jié)果表明來自試驗(yàn)制備物的FVIII的PI在5.0＜6.5之間。
為了補(bǔ)充電泳分離試驗(yàn)，利用等電聚焦(IEF)計(jì)算FVIII的pI值。圖4顯示用小鼠抗-人FVIII探測的FVIII等電點(diǎn)聚焦蛋白質(zhì)印跡。結(jié)果表明FVIII的pI為6.2，這支持了在上述多種pH值條件下產(chǎn)生的電泳遷移結(jié)果。
FVIII濃縮物的穩(wěn)定劑這些試驗(yàn)突出了FVIII分子的不穩(wěn)定性并且穩(wěn)定劑對(duì)于FVIII遷移和活性有正面影響。
蛋白下列試驗(yàn)證實(shí)恒定白蛋白濃度可以在利用本發(fā)明方法分離期間傳遞給FVIII分子。
試驗(yàn)1分離條件pH6.5(MES/組氨酸)緩沖液，5-1500-5kDa盒式構(gòu)造，30分鐘收集，靜態(tài)和反轉(zhuǎn)共2小時(shí)。在電泳收集FVIII后，補(bǔ)充S2緩沖液含有終濃度為10mg/mL的人白蛋白。
圖5顯示FVIIIAg在裝置S1和S2中的遷移，利用人白蛋白作為S2中補(bǔ)充緩沖液(終濃度10mg/mL)的穩(wěn)定劑。
表2在利用人白蛋白作為S2補(bǔ)充緩沖液穩(wěn)定劑(終濃度10mg/mL)的試驗(yàn)中以S10％表示的FVIII抗原回收率和比活性。

添加人白蛋白到S2緩沖液中對(duì)于在電泳裝置中保持FVIII的活性具有積極影響。加入白蛋白對(duì)于(S230)FVIII比活性的穩(wěn)定效應(yīng)在第一個(gè)S2收集時(shí)間不明顯，因?yàn)樗袕钠鹗疾牧限D(zhuǎn)入S2的白蛋白。由于穩(wěn)定白蛋白的添加，剩余S2的收獲具有提高的比活性，這與不含有穩(wěn)定白蛋白的平行試驗(yàn)形成鮮明對(duì)比(結(jié)果顯示在表2)。
因此，添加白蛋白到S2電泳緩沖液證明穩(wěn)定劑可以在純化/分離過程中添加給系統(tǒng)，并且可以對(duì)保持FVIII的比活性具有積極影響。
氨基酸下列試驗(yàn)顯示氨基酸可有效地用作穩(wěn)定劑。這個(gè)實(shí)驗(yàn)流程包括使用具有大限制膜(35-500-35kDa)的盒式構(gòu)造。這種構(gòu)造能夠適度地使電泳緩沖液中所含的氨基酸恒定循環(huán)通過S1，S2和緩沖液流。
試驗(yàn)2分離條件pH6.5(MES/組氨酸)緩沖液和Synthamin17(1∶1比率，Synthamin17終濃度為0.05g/mL)，35-1500-35kDa盒式構(gòu)造，利用30分鐘收集，靜態(tài)和反轉(zhuǎn)共2小時(shí)。由于Synthamin17的影響，緩沖液的最終pH為6.2。
圖6顯示FVIIIAg在電泳裝置S1和S2中的遷移，利用Synthamin17作為電泳緩沖液的穩(wěn)定劑(終濃度0.05g/mL)。Synthamin17不僅影響緩沖液的最終pH也影響電流，其在500mA是一個(gè)限制因素。在整個(gè)試驗(yàn)時(shí)期，這些條件產(chǎn)生低電壓，大約40V(表3)。在120分，總共20.16％的FVIII保持在S1中，具有83.39％的起始活性。在30分鐘以及60分鐘收集的FVIII活性保持證明Synthamin 17對(duì)于保持FVIII活性具有積極影響。在低壓條件下，可以預(yù)期在制備物中的白蛋白非常慢地遷移到S2，因此可能存在于S1中作為FVIII的穩(wěn)定劑。
表3在利用Synthamin17作為電泳緩沖液穩(wěn)定劑(終濃度0.05g/mL)的試驗(yàn)中以S10％表示的FVIII抗原回收率和比活性。

試驗(yàn)3分離條件pH6.5(MES/組氨酸)緩沖液和Synthamin17(3∶1比率，Synthamin17終濃度為0.025g/mL)，35-1500-35kDa盒式構(gòu)造，30分鐘收集，靜態(tài)和反轉(zhuǎn)共2小時(shí)。由于Synthamin17的影響，緩沖液的最終pH為6.42。
圖6顯示FVIIIAg在電泳裝置S1和S2中的遷移，利用Synthamin17作為電泳緩沖液的穩(wěn)定劑(終濃度0.025g/mL)。
表4在利用Synthamin17作為電泳緩沖液穩(wěn)定劑(終濃度0.025g/mL)的試驗(yàn)中以S10％表示的FVIII抗原回收率和比活性。

利用較低濃度的Synthamin17(0.025g/mL)也對(duì)于電流有顯著的影響，其在500mA是限制因素。在整個(gè)試驗(yàn)時(shí)期內(nèi)這些條件產(chǎn)生大約70V的低電壓。這個(gè)試驗(yàn)較高的pH與試驗(yàn)1(上面描述的)相比在FVIII上產(chǎn)生更多電荷，使更多FVIII遷移到S2(分別10.26％以及32.6％)。這個(gè)濃度的Synthamin17對(duì)于FVIII活性的影響是積極的，即使S160的結(jié)果不正常。
糖如下實(shí)驗(yàn)所示，糖也可以作為FVIII穩(wěn)定劑的一種替代來源。來自血漿的FVIII的表征純血漿用作FVIII的來源?？梢灶A(yù)期FVIII分子會(huì)與血漿起始材料中的vWf結(jié)合起來形成大復(fù)合物。由于這個(gè)原因，可以預(yù)期vWf-FVIII復(fù)合物將保持在S1中，而污染的血漿蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入S2中。將5.5-7.3的pH范圍與1000kDa的分離膜結(jié)合加以研究。保持FVIII的穩(wěn)定性限制試驗(yàn)到這個(gè)pH范圍。FVIII遷移和活性分析利用生色試驗(yàn)進(jìn)行并且FVIII比活性可以表示為目的樣品中每μgFVIII的FVIII活性(IU)的量。
在一定pH范圍內(nèi)FVIII純血漿的結(jié)果圖8顯示FVIIIAg在電泳裝置S1中各種pH值條件下，利用純血漿作為起始材料的遷移。所有分析的pH值中，沒有記錄到FVIIIAg轉(zhuǎn)入S2中。
表5FVIIIAg在S1中各種pH值條件下在Gradiflow中純血漿試驗(yàn)以S10％表示的分布圖。

上述表5的結(jié)果說明來自人純血漿的FVIII在系統(tǒng)中的遷移并且pH6.9為該階段合適的電泳條件，在60分鐘保持起始FVIII的65.15％。在這些條件下，第一個(gè)30分鐘觀察到25％的損失且第二個(gè)30分鐘又觀察到10％的損失。FVIII可能非特異性結(jié)合到膜上。這種結(jié)合通過加入PBS沖洗，靜置，添加Tween20在緩沖液和/或稀釋起始材料可得以降低。
表6FVIII抗原在pH6.9利用來自血漿的FVIII作為起始材料的回收率和比活性，以S10％表示

表6說明在pH6.9來自純血漿的FVIII比活性回收率。因?yàn)镕VIII會(huì)與血漿中的vWf結(jié)合，活性的損失可能是由于血漿在分離裝置中循環(huán)期間它的激活以及隨后在凝固級(jí)聯(lián)中的失活造成的。
沒有計(jì)算含有FVIII的S1樣品總蛋白，但是SDS-PAGE顯示大部分血漿蛋白質(zhì)在這些條件下仍保持在S1中。
用豬細(xì)小病毒(PPV)鑒定FVIIIPPV用來證明利用本發(fā)明方法從FVIII去除病毒污染物。
計(jì)算PPV pI為了在基于電荷的清除率或者去除率中使用病毒pI值，需要確定PPV的pI值。首先利用等電聚焦(IEF)計(jì)算PPV的pI。
圖9為PPV的IEF印跡，其中泳道1為用麗春紅S染料染色的pI標(biāo)記，泳道2為用麗春紅S染料染色的PPV制備物，泳道3為用小鼠抗豬細(xì)小病毒探測的PPV制備物。這些結(jié)果表明PPV的pI范圍為5.1到6.0。在泳道3的其它三條帶不與小鼠抗-細(xì)小病毒抗體反應(yīng)，因此不代表PPV的任一pI指示。
圖10顯示通過本發(fā)明權(quán)利要求的方法從FVIII去除PPV的結(jié)果。當(dāng)利用血漿作為FVIII的來源時(shí)，病毒載量通過保持FVIII在S1中并且使得病毒遷移通過膜進(jìn)入S2而減少。在分離期間，F(xiàn)VIII-比活性被保持，這是由于因子與vWf結(jié)合起來，而PPV減少到低于起始載量的1％。
重組因子VIII(rFVIII)的純化上述實(shí)驗(yàn)表明基于膜的電泳方法可被用于從濃縮冷凍干燥來源以及正常混合血漿中分離FVIII。以下試驗(yàn)說明從重組來源純化FVIII。rRFVIII蛋白從污染的細(xì)胞培養(yǎng)基蛋白進(jìn)行純化。
rFVIII峰進(jìn)入電泳裝置的S1產(chǎn)生每毫升溶液大約10IU的rFVIII活性。最初的試驗(yàn)使用大孔徑(LPS)膜＞1500K以及pH6.5的MES/Bis-Tris緩沖液。這些條件使rFVIII遷移越過膜而且仍然保持rFVIII的活性形式。
當(dāng)rFVIII放入不含穩(wěn)定劑的標(biāo)準(zhǔn)MES/Bis-Tris緩沖液，并且循環(huán)在電泳裝置中時(shí)，rFVIII的活性水平迅速下降。即使沒有施加電壓通過分離部件，在一個(gè)小時(shí)循環(huán)之后僅僅留存15％的rFVIII活性(圖11)。較低的活性可能是由于緩沖液對(duì)于rFVIII分子保持功能不是最佳的。
當(dāng)越過分離部件施加電壓時(shí)，在S1中的活性水平也急劇下降并且在S2中發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)rFVIII活性。當(dāng)施加電壓時(shí)，全部rFVIII活性在兩小時(shí)之內(nèi)不能從S1和S2檢測到。由于在S2中發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)活性水平，已經(jīng)確定在轉(zhuǎn)移之后收集對(duì)捕獲活性rFVIII是有益處的。
圖11顯示在儀器中的緩沖液和/或條件對(duì)rFVIII分子有害。幾乎所有的rFVIII活性到兩小時(shí)分離結(jié)束之時(shí)就消失了。為了測試是否是緩沖液或者儀器引起功能活性的損失，使用兩種不同穩(wěn)定劑，人血清白蛋白(HSA)和蔗糖。通常HAS一直用于穩(wěn)定FVIII。由于這些蛋白可能被病原體污染的問題，人工穩(wěn)定劑為優(yōu)選的形式。蔗糖已經(jīng)用作替代的穩(wěn)定劑。
當(dāng)利用10mg/mL HSA(1％w/v)作為穩(wěn)定劑時(shí)，rFVIII活性可能得以保持并且能在電泳裝置中從S1遷移到S2，同時(shí)極少損失活性。被轉(zhuǎn)移到S2的rFVIII產(chǎn)品在30，60和120分鐘收集，以便在這個(gè)液流中的rFVIII很少遭受連續(xù)通過電泳裝置的劇烈運(yùn)動(dòng)。平均92％的起始活性可從S1轉(zhuǎn)移并收集在S2中(圖12)。
當(dāng)用蔗糖作為穩(wěn)定劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)0.11％蔗糖保持的rFVIII活性高于沒有穩(wěn)定劑的情況。但是仍然喪失大量活性。如果這個(gè)水平增加到1.1％，可能回收更高的活性。1.1％的蔗糖濃度不能穩(wěn)定rFVIII以及白蛋白。由于用0.1％和1.1％的蔗糖濃度均觀察到劑量反應(yīng)，使用5％的蔗糖濃度(圖13)。當(dāng)5％的蔗糖用作穩(wěn)定劑時(shí)，活性的保持好于用白蛋白觀察到的結(jié)果。利用更高濃度的蔗糖能夠使96％的rFVIII活性在60分鐘內(nèi)從S1轉(zhuǎn)移到S2。
瓶裝蔗糖穩(wěn)定的rFVIII產(chǎn)品包括僅僅1.1％的蔗糖，因?yàn)樵谳^高水平可能對(duì)病人有害。1.1％的蔗糖在利用電泳裝置分離期間發(fā)現(xiàn)不能充分穩(wěn)定rFVIII，因此需要更高濃度。在分離FVIII期間使用這種高濃度的蔗糖可在純化方案結(jié)束時(shí)降低。
從細(xì)胞培養(yǎng)上清液純化rFVIII的方案已被開發(fā)出來并模仿從CHO細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)的rFVIII。等份的細(xì)胞培養(yǎng)上清液和10％的蔗糖合并產(chǎn)生合適的起始材料，并且rFVIII峰進(jìn)入上清液產(chǎn)生大約10IU/mL的濃度。
該純化方案使用pH6.5 MES/組氨酸緩沖液和5％的蔗糖。用A～500kDa的分離膜進(jìn)行大小分離，其中大rFVIII分子(265kDa)保持在S1中，而所有較小蛋白諸如白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)移到S2中。較高濃度的蔗糖(5％)有助于保持rFVIII活性，而幾乎所有的污染蛋白被除去(圖14)。在30分鐘，當(dāng)大多數(shù)的污染物已經(jīng)除去時(shí)，保留79％的活性。在60分鐘，獲得保持至少65％生物活性的更純產(chǎn)品(圖15)。
圖15顯示的SDS PAGE凝膠分離顯示幾乎所有的污染物在電泳開始時(shí)從存在于S1、富含蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到S2，而活性分析證明rFVIII保留在S1中(圖14)。在聚丙烯酰胺凝膠泳道5上可見的終產(chǎn)物僅僅包括一條位于凝膠最上端的蛋白條帶。
rFVIII-峰的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液包括390μg/mL的蛋白，通過Bradford總蛋白分析測量，并且利用本發(fā)明的電泳法純化后，終產(chǎn)物包括僅僅16μg/ML的蛋白。因?yàn)楫a(chǎn)品變得更純，以IU/μg總蛋白表示的比活性急劇增加(圖15)。大于96％的雜質(zhì)被移到S2，留下純化的重組FVIII在S1中。利用考馬斯染色SDS PAGE進(jìn)行分析。
這個(gè)純化過程在多方面得以進(jìn)一步改進(jìn)。為了在一個(gè)步驟中達(dá)到純化和病毒清除的目的，從任一生物負(fù)荷量轉(zhuǎn)移rFVIII越過分離膜進(jìn)行分配受到利用大孔徑分離膜以及大約500kDa膜作為第二個(gè)限制膜的影響。這會(huì)使rFVIII分子遠(yuǎn)離所有大分子量蛋白污染物以及病毒和朊病毒，而所有與RFVIII一起轉(zhuǎn)移的較低分子量蛋白將進(jìn)一步通過～500kDa的限制膜遷移進(jìn)入緩沖液流。優(yōu)化緩沖液pH以及組成的其它嘗試在本領(lǐng)域是很容易了解的，并且也應(yīng)在純化過程中提高rFVIII分子的穩(wěn)定性。
根據(jù)本發(fā)明方法發(fā)現(xiàn)，蔗糖為rFVIII的極好非蛋白類穩(wěn)定劑。蔗糖產(chǎn)生的劑量反應(yīng)在于使用濃度越高，活力保持越好。試驗(yàn)0.1，1.1，和5％的蔗糖濃度，其中5％的蔗糖濃度產(chǎn)生對(duì)于rFVIII的最好穩(wěn)定效應(yīng)。
此外，根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求的電泳法已經(jīng)顯示為從細(xì)胞培養(yǎng)上清液提純r(jià)FVIII的極好方法。大于96％的雜質(zhì)從細(xì)胞培養(yǎng)上清液除去并且保持良好的FVIII活性。發(fā)現(xiàn)rFVIII產(chǎn)品的比活性在純化期間顯著增加，并且SDS PAGE顯示產(chǎn)品為單條帶純度。整個(gè)分離非常迅速，在60分鐘產(chǎn)生終產(chǎn)物，防止了高度不穩(wěn)定rFVIII分子損失重要的功能。
在整個(gè)說明書中，除非上下文另有需要，單詞“包括”，或者變化諸如“包含”或者“含有”，可被理解為暗指包括描述的部件，整體，或者步驟，或者部件，整體或者步驟的組，然而并非排除任一其它部件，整體或者步驟，或者部件，整體或者步驟的組。
包括在本說明書中任一討論的文獻(xiàn)，論文，材料，裝置，物品等等只是為了提供本發(fā)明的上下文的目的。不能認(rèn)為任一或者所有這些主題形成現(xiàn)有技術(shù)的部分基礎(chǔ)或者是為與本領(lǐng)域相關(guān)領(lǐng)域普通常識(shí)，因?yàn)樵诒景l(fā)明每個(gè)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前已經(jīng)在澳大利亞存在。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白本發(fā)明可進(jìn)行如具體實(shí)施方案所示的多種變化和/或修改，只要不離開廣泛描述的本發(fā)明的精神或者范圍。因此本發(fā)明實(shí)施方案在全部方面應(yīng)視為說明性而非限制性的目的。
權(quán)利要求
1.一種從樣品獲得因子VIII(FVIII)的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量不同于所述FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向一種或者多種樣品，第一個(gè)隙間體積，或者第二個(gè)隙間體積提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇一種具有限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓，其中含有FVIII的終產(chǎn)物位于分離膜的一側(cè)，而不需要的分子基本上位于分離膜的另一側(cè)；以及(e)繼續(xù)步驟(d)直到需要量的FVIII位于分離膜的一側(cè)。
2.一種從樣品中獲得因子VIII(FVIII)的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中的FVIII遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積形成含有FVIII的終產(chǎn)物，而不需要的分子基本上被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；以及(e)繼續(xù)步驟(d)直到需要量的FVIII移向第二個(gè)隙間體積。
3.一種從樣品中獲得因子VIII(FVIH)的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量小于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中除FVIII以外的樣品組分遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而FVIII基本上被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積并且保持在第一個(gè)隙間體積中作為終產(chǎn)物；以及(e)繼續(xù)步驟(d)直到樣品中需要量的組分從第一個(gè)隙間體積去除，而FVIII保持在第一個(gè)隙間體積中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1，2或者3的方法，其中樣品為血漿或者其部分，冷沉淀物或者其部分，重組FVIII來源，或其組合或者它們的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1，2或者3的方法，其中穩(wěn)定劑為一種或者多種緩沖成分，改變摩爾濃度的組分，蛋白，氨基酸，或者糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1，2或者3的方法，其中穩(wěn)定劑選自山梨糖醇，鹽，甘油，諸如蔗糖、乳糖和葡聚糖/葡萄糖的糖，甘氨酸，凝膠，乙酸鉀，疊氮化物，或者蛋白酶抑制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中穩(wěn)定劑為白蛋白，氨基酸的混合物，蔗糖，或者它們的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中白蛋白的應(yīng)用濃度為至少大約2mg/mL(2g/L)，氨基酸混合物的應(yīng)用濃度為至少大約0.01g/mL(10g/L)，以及蔗糖的應(yīng)用濃度為至少大約1％(10g/L)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中白蛋白的應(yīng)用濃度為大約10mg/mL(10g/L)，氨基酸混合物的應(yīng)用濃度為大約0.05g/mL(50g/L)，以及蔗糖的應(yīng)用濃度為大約5％(50g/L)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1，2或者3的方法，其中步驟(c)利用一種緩沖液以使FVIII具有凈負(fù)電荷。
11.根據(jù)權(quán)利要求1，2或者3的方法，其中步驟(c)利用pH在6.5-7.0之間的緩沖液。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中緩沖液為MES/組氨酸，pH6.5，分離膜的截留分子量為大約1500kDa，而限制膜的截留分子量為大約5kDa。
13.根據(jù)權(quán)利要求1，2或者3的方法，其中終產(chǎn)物FVIII保持至少大約40％的比活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中終產(chǎn)物FVIII的比活性為至少大約60％。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中終產(chǎn)物FVIII的比活性大于大約75％。
16.根據(jù)權(quán)利要求1，2或者3的方法，其中樣品為含有一種重組體(rFVIII)的細(xì)胞上清液或者細(xì)胞裂解產(chǎn)物。
17.一種從含有FVIII的樣品中分離毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII和毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中的FVIII遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積形成終產(chǎn)物，而不需要的分子和毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；以及(e)繼續(xù)步驟(d)直到需要量的FVIII移向第二個(gè)隙間體積。
18.一種從含有FVIII和毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的樣品中分離毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII和毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中的FVIII遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積形成含有FVIII的終產(chǎn)物，而不需要的分子被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；(e)繼續(xù)步驟(d)直到需要量的FVIII移向第二個(gè)隙間體積；(f)將從步驟(e)獲得的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(g)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑以使FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(h)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使在第一個(gè)隙間體積中的FVIII遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；以及(i)繼續(xù)步驟(h)直到需要量的FVIII移向第二個(gè)隙間體積。
19.一種從含有FVIII的樣品中分離毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII和毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量小于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中除FVIII以外的樣品組分遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而FVIII被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積并且保持在第一個(gè)隙間體積作為終產(chǎn)物；(e)繼續(xù)步驟(d)直到樣品中需要量的組分從第一個(gè)隙間體積去除，而FVIII保持在第一個(gè)隙間體積；(f)將從步驟(e)獲得的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(g)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑以使FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(h)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使在第一個(gè)隙間體積中的FVIII遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；以及(i)繼續(xù)步驟(h)直到需要量的FVIII移向第二個(gè)隙間體積。
20.一種從含有FVIII的樣品中分離毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII和毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有限定pH的溶劑使得FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中的FVIII通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積形成含有FVIII的終產(chǎn)物，而不需要的分子基本上被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；(e)繼續(xù)步驟(d)直到需要量的FVIII移向第二個(gè)隙間體積；(f)將從步驟(e)獲得的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(g)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑以使毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物具有需要的電荷狀態(tài)；(h)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使在第一個(gè)隙間體積中的毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而FVIII被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；以及(i)繼續(xù)步驟(h)直到在第一個(gè)隙間體積中有需要量的FVIII。
21.一種獲得基本上不含毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的FVIII的方法，所述方法包括(a)將含有FVIII和毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物的樣品放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的電泳裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量小于FVIII分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(b)向樣品和第二隙間體積中的任一個(gè)或兩個(gè)提供一種或者多種穩(wěn)定劑；(c)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑以使FVIII具有需要的電荷狀態(tài)；(d)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在第一個(gè)隙間體積中除FVIII以外的樣品組分通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而FVIII基本上被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積并保持在第一個(gè)隙間體積中作為終產(chǎn)物；(e)繼續(xù)步驟(d)直到樣品中需要量的組分從第一個(gè)隙間體積去除，而FVIII保持在第一個(gè)隙間體積；(f)將FVIII連同毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物放置在包括分離膜，第一個(gè)限制膜和第二個(gè)限制膜的裝置的第一個(gè)隙間體積中，所述分離膜具有確定的孔徑，其截留分子量大于毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物分子量，第一個(gè)限制膜位于第一個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第一個(gè)隙間體積，第二個(gè)限制膜位于第二個(gè)電極區(qū)域和分離膜之間以便形成它們之間的第二個(gè)隙間體積；(g)選擇用于第一個(gè)隙間體積、具有一pH的溶劑以使毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物具有需要的電荷狀態(tài)；(h)在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使在第一個(gè)隙間體積中的毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)污染物遷移通過分離膜進(jìn)入第二個(gè)隙間體積，而FVIII被阻止進(jìn)入第二個(gè)隙間體積；以及(i)繼續(xù)步驟(h)直到在第一個(gè)隙間體積中有需要量的FVIII。
22.根據(jù)權(quán)利要求17，18，19，20或者21的方法，其中毒素，病原體或者傳染性介質(zhì)選自內(nèi)毒素，朊病毒，病毒，細(xì)菌，真菌，酵母和原生動(dòng)物。
23.根據(jù)權(quán)利要求17，18，19，20或者21的方法，其中病原體或者傳染性介質(zhì)為病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用含有分離膜的基于膜的分離系統(tǒng)以在至少兩個(gè)限制膜之間建立第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積來分離功能活性因子VIII的方法。將一種或者多種穩(wěn)定劑加入到樣品和/或隙間體積中。第一個(gè)隙間體積中的溶劑保持FVIII在需要的電荷狀態(tài)。在第一個(gè)和第二個(gè)隙間體積之間施加電壓使得在分離膜的一側(cè)的FVIII與在分離膜另一側(cè)的不需要的分子分隔開。這些方法也可用作傳統(tǒng)分離天然或者重組FVIII純化方案中一個(gè)或多個(gè)步驟的替代。
文檔編號(hào)C07K1/26GK1538973SQ02814117
公開日2004年10月20日 申請(qǐng)日期2002年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月13日
發(fā)明者伊麗莎白·西布魯克, 托馬斯·諾曼·特頓, 布倫頓·康蘭, 康蘭, 諾曼 特頓, 伊麗莎白 西布魯克 申請(qǐng)人:格拉迪普有限公司