專(zhuān)利名稱(chēng)：編碼可誘導(dǎo)抗病毒效應(yīng)的蛋白質(zhì)的嵌合鏈的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域及制藥工業(yè)，特別涉及獲得嵌合核苷酸鏈，將其引入表達(dá)載體時(shí)可產(chǎn)生能夠引發(fā)血清特異性體液免疫應(yīng)答并防止登革(Dengue)病毒-此時(shí)開(kāi)始引述為DEN-感染的蛋白質(zhì)，避免可導(dǎo)致出血及該類(lèi)型病理所述臨床并發(fā)癥的血清特異性病毒免疫擴(kuò)增的效應(yīng)。
現(xiàn)有技術(shù)登革病毒(DEN)是包膜病毒，其脂質(zhì)膜包含其三種結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)中的兩種包膜蛋白質(zhì)(E)和膜蛋白質(zhì)(M)。E蛋白質(zhì)覆蓋由第3種結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)-核心蛋白質(zhì)-組成的20面體(icosaedric)核殼。該病毒屬于黃病毒(Flaviviridae)家族，存在4種不同的血清型。由屬于覆蚊亞屬(Stegomia)家族的蚊子埃及伊蚊(Aedes aegypti)傳播給人。據(jù)認(rèn)為該病毒在人體中產(chǎn)生的疾病是良性，被描述為登革熱(Dengue Fever，DF)或典型性登革(Classical Dengue)，直至出現(xiàn)了更為嚴(yán)重的形式，有時(shí)甚至致命，其特征在于出血性發(fā)熱和休克，命名為出血性登革熱及登革休克綜合癥(Hemorrhagic Dengue Fever andDengue Shock Syndrome，HDF/DSS)(Hammon WMc.New hemorrhagicfever in children in the Philippines and Thailand.Trans AssocPhysicians 1960；73140-155)。已經(jīng)進(jìn)行的若干流行病學(xué)研究證明，兩種不同病毒血清型的連續(xù)感染是危險(xiǎn)因素(KouríGP，Guzmán MG，Brave JR.Why dengue hemorrhagic fever in Cuba)2.An integralanalysis.Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1987；72821-823)?？捎擅庖邚?qiáng)化解釋這種現(xiàn)象，即通過(guò)靶細(xì)胞(單核細(xì)胞)的Fc受體進(jìn)入細(xì)胞的病毒-抗體復(fù)合物增多，從而增加病毒感染(halstead SB.Pathogenesis of denguechallenges to molecular biology.Science 1988；239476-481)。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)了不同技術(shù)產(chǎn)生減毒活疫苗，但由于它們能夠恢復(fù)毒力、病毒性互相干擾以及基因組間重組，目前這些疫苗發(fā)揮可能的作用尚有許多未解決問(wèn)題。另外，可以獲得重組抗原，作為亞單位疫苗的可能組分(Feighny，R.，Borrous，J.和Putnak R.Dengue type-2 virusenvelope protein made using recombinant baculovirus protectsmice against virus challenge.Am.J.Trop.Med.Hyg.1994.50(3).322-328；Deubel，V.，Staropoli，I.，Megret，F(xiàn).等人，Affinity-purified dengue-2 virus envelope glycoproteininduces neutralizing antibodies and protective immunity inmice. Vaccine.1997.15，1946-1954)。
該病毒的主要抗原是包膜蛋白質(zhì)DENe。該蛋白質(zhì)是病毒表面的主要成分，據(jù)認(rèn)為介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體結(jié)合(A Heinz FX，Berge R，TumaW等人.A topological and functional model of epitopes on thestructural glycoprotein of tick-borne encephalitis virusdefined by monoclonal antibodies.Virology.1983；126525)。該蛋白質(zhì)與蜱傳腦炎病毒(tick borne encephalitis virus，TBE)具有結(jié)構(gòu)同源性(Rey，F(xiàn).A.，Heinz，F(xiàn).X.，Mandl，C.等人.Theenvelope glycoprotein from tick borne encephalitis virus at 2A°resolution.Nature 1995；375291-298)，各血清型之間也具有結(jié)構(gòu)保守性。
昆蟲(chóng)細(xì)胞利用桿狀病毒系統(tǒng)為載體，構(gòu)成了表達(dá)不同異源基因最常用的系統(tǒng)之一。這些載體已經(jīng)用于表達(dá)幾種日本腦炎病毒(Encephalitis Japanese virus，JEV)的結(jié)構(gòu)性與非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)DEN-1、DEN-2和DEN-4(Matsuura Y，Miyamoto M，Soto T等人.Characterization of japanese encephalitis virus envelopeprotein expressed by recombinant baculoviruses.Virology 1989；173677-682；Deubel V，Bordier M，Megret F等人.Processing，secretion and immunoreactivity of carboxy terminally truncateddengue-2 envelope proteins expressed in insect cell byrecombinant baculoviruses.Virology 1991；180440-447；PutnakR，F(xiàn)eighny R，Burrous J等人.Dengue 1 virus envelopeglycoprotein gene expressed in recombinant baculovirus elicitvirus neutralization antibodies in mice and protects them fromvirus challenge.Am J Trop Med Hyg 1991；45159-167；FeighnyR，Burrous J，Putnak R.Dengue type 2 virus envelope proteinmade using recombinant baculovirus protects mice against viruschallenge.Am J Trop Med Hyg 1994；50322-328)。使用的另一系統(tǒng)是表達(dá)E蛋白質(zhì)不同變體的黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)細(xì)胞(PCT/US96/07627)。盡管使用這些系統(tǒng)所表達(dá)的蛋白質(zhì)獲得了適當(dāng)?shù)墓δ苄苑磻?yīng)，但這意味著開(kāi)發(fā)放大生產(chǎn)工藝的高額費(fèi)用；因此，酵母表達(dá)已經(jīng)成為生產(chǎn)黃病毒重組結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)的另選方案。然而，就巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)的DENe蛋白質(zhì)而言(PCT/US96/07627；Sugrue R.J.，F(xiàn)u H.，Howe J.，Chan Y.Expressionof the Dengue virus structural proteins in Pichia pastoris leadsto the generation of virus-like particles.J Virol.1997.78，1861-1866)，分泌型或細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平均低，妨礙純化過(guò)程。
同時(shí)，在細(xì)菌中獲得了DENe蛋白質(zhì)的幾種變體。其中之一是與大腸桿菌(E.coli)色氨酸代謝蛋白質(zhì)融合(TrpE)的JEV E蛋白質(zhì)的C末端部分。該蛋白質(zhì)產(chǎn)生為包涵體，可使用免疫檢測(cè)技術(shù)由中和單克隆抗體(Mabs)識(shí)別。然而該蛋白質(zhì)的純制劑不能產(chǎn)生中和抗體并防護(hù)病毒性攻擊(Mason P.W.，Zogel M.V.，Semproni A.R.等人.Theantigenic structure of dengue type 1 virus envelope and NS1protein expressed in E.coli.J Gen Virol.1990.712107-2114)。此外，制備了另一構(gòu)建體(Srivastava A.K.，Morita K.，Matsuo S.等人.Japanese encephalitis virus fusion protein with proteinA expressed in E.coli confers protection in mice.MicrobiolImmunol.1991.35863-870)，其中包含與E蛋白質(zhì)C末端片段融合的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aurius)蛋白A，后接JEV非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)的N末端片段NS1。在此情況下的融合蛋白質(zhì)可溶，便于通過(guò)親和層析純化。利用該純化蛋白質(zhì)免疫小鼠，得到高中和抗體滴度，也抑制血細(xì)胞凝集并防護(hù)JEV的病毒性攻擊。使用與金黃色葡萄球菌蛋白A融合的DEN-2的DENe區(qū)，獲得了類(lèi)似結(jié)果(Srivastava A.K.，Putnak R.J.，Warren R.L.，Hoke C.H.Mice immunized witha dengue type 2 virus E and NS1 fusion protein made inEscherichia coli are protected against lethal dengue virusinfection.Vaccine.1995.131251-1258)；然而，由于存在與人免疫球蛋白G(IgG)具有高親和力的蛋白A，這些制劑不可能用于人體。
最后，已經(jīng)報(bào)道了名為MBP-DomB的融合蛋白質(zhì)，其包含DEN-2 DENe蛋白質(zhì)B結(jié)構(gòu)域和大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(maltose bindingprotein，MBP)(Simmons M.，Nelson W.M.，Wu S.J.，Hayes C.G.Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengueenvelope B domain fusion protein against dengue 2 virusinfection in mice.Am J Trop Med Hyg.1998.58655-662)。該蛋白質(zhì)變體在小鼠中具有免疫源性，可激發(fā)中和抗體。
在我們的情況中，本發(fā)明有賴(lài)于獲得嵌合序列，例如第一種情況，DENe蛋白質(zhì)的一個(gè)區(qū)域的編碼序列與腦膜炎球菌(Neisseriameningitidis)具有脫氫酶活性的突變蛋白質(zhì)(MDH)的N末端片段相連；第二種情況，DENe蛋白質(zhì)的一個(gè)區(qū)域的編碼序列與MDH蛋白質(zhì)完整基因的不同位置相連，以及第三種情況，兩種不同病毒血清型的DENe蛋白質(zhì)的兩個(gè)片段與MDH蛋白質(zhì)相同編碼基因融合產(chǎn)生嵌合序列。將這些嵌合鏈插入合適的載體，可在細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生不溶性嵌合蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可激發(fā)高水平的抗DEN中和抗體，是病毒性血細(xì)胞凝集的抑制劑，并保護(hù)免疫小鼠抵抗病毒攻擊。
針對(duì)上述蛋白質(zhì)的不溶性，實(shí)現(xiàn)了容易放大的體外折疊方法、表達(dá)和純化方法，優(yōu)于Simmons等人，1998所用方法。另一方面，利用這些蛋白質(zhì)免疫小鼠產(chǎn)生抗體，在中和、抑制血細(xì)胞凝集以及ELISA水平證明了抗體的血清型特異性，所用劑量低于Simmons等人，1998所使用的。以上事實(shí)構(gòu)成了有關(guān)大腸桿菌表達(dá)能夠刺激功能性免疫應(yīng)答的不溶性DENe蛋白質(zhì)的第一份報(bào)告。
此外，鑒于利用二聚體變體所獲得的結(jié)果，有可能利用相同分子產(chǎn)生針對(duì)兩種不同病毒血清型的血清型特異性抗體，能夠中和病毒感染并保護(hù)小鼠抵抗病毒攻擊。
在EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索MDH蛋白質(zhì)與其它序列的同源性，顯示其前110個(gè)氨基酸與二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的E2酶以及α-酮戊二酸脫氫酶(α-cetoglutarate dehydrogenase))的硫辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域區(qū)和柔性鉸鏈高度相似，該蛋白質(zhì)的其余部分與所述復(fù)合物的E3酶硫辛酰胺脫氫酶(LPDH)高度相似(Stephens，P.E；H.M.Darlinson和J.R.Guest.，1983.The Pyruvate dehydrogenasecomplex of E.coli.Eur.J.Biochem.133155-162。
另一方面，還發(fā)現(xiàn)原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary BiliaryCirrhosis，PBC)患者產(chǎn)生特異性針對(duì)這些蛋白質(zhì)共有的硫辛酸結(jié)合位點(diǎn)的抗線(xiàn)粒體自身抗體(Gershwin ME，Mackay IR，Sturgess A，Coppel RL.Identification and specificity of a cDNA encodingthe 70KDa mitochondrial antigen recognized in primary biliarycirrhosis.J Immunol 19871383525-31)。因此，我們決定突變蛋白質(zhì)內(nèi)該區(qū)域，避免以嵌合蛋白質(zhì)免疫人體時(shí)的任何自身免疫應(yīng)答。本發(fā)明的MDH突變蛋白質(zhì)用于I期臨床試驗(yàn)，表明在人體中安全并具有免疫源性，也不被PBC患者的血清識(shí)別(Pérez，A.，F(xiàn).Dickinson，Z.Cinza，A.Ruíz，T.Serrano，J.Sosa，S.González，Y.Gutiérrez，C.Nazábal，O.Gutiérrez，D.Guzmán，M.Díaz，M.Delgado，E.Caballero，G. A.Alvarez，A.Martín，G.Guillén，R.Silva.Safety and preliminary immunogenicity of therecombinant outer membrane protein of Neisseria meningitidisin human volunteers.Biotech.Appl.Biochem.34121-125)。然而，尚未證明MBP可能用于人體(Simmons M.，Nelson W.M.，Wu S.J.，Hayes C.G.Evaluation of the protective efficacy of arecombinant dengue envelope B domain fusion protein againstdengue 2 virus infection in mice.Am J Trop Med Hyg.1998.58655-662)。
發(fā)明詳述本發(fā)明描述了獲得嵌合核苷酸鏈，在引入表達(dá)載體時(shí)，可產(chǎn)生能夠誘導(dǎo)血清特異性體液免疫應(yīng)答并防護(hù)登革病毒感染的嵌合蛋白質(zhì)，例如，每一病毒血清型登革病毒的DENe蛋白質(zhì)的一個(gè)區(qū)域的編碼序列與腦膜炎球菌具有脫氫酶活性的突變蛋白質(zhì)(MDH)的N末端片段相連；第二種情況，DENe蛋白質(zhì)的一個(gè)區(qū)域的編碼序列與MDH蛋白質(zhì)完整基因的兩個(gè)不同位置相連其中一個(gè)位點(diǎn)位于MDH蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域(硫辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及該基因3’末端)的編碼序列，以及第三種情況，兩種不同病毒血清型DEN-2和DEN-4的DENe蛋白質(zhì)的兩個(gè)片段在MDH基因的兩個(gè)不同位置形成嵌合序列其一位于硫辛酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼序列的特定位點(diǎn)(血清型4)，另一位于MDH基因3’末端(血清型2)。即為所謂的嵌合構(gòu)建體。
在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獲得不溶的嵌合蛋白質(zhì)。利用固定化的金屬親和層析(IMAC)進(jìn)行純化過(guò)程，以獲得純蛋白質(zhì)供免疫源性研究。
分析抗原性結(jié)果證實(shí)，所有重組嵌合蛋白質(zhì)對(duì)超免疫腹水液(hyperimmune ascitic liquids，HMAF)抗DEN強(qiáng)有力識(shí)別，融合完整MDH基因時(shí)較高，證明MDH對(duì)DENe蛋白質(zhì)區(qū)的折疊具有積極作用。使用血清型2時(shí)，獲得的所有蛋白質(zhì)可由血清型特異性中和抗體(3H5)識(shí)別，同樣融合完整MDH基因以及二聚體蛋白質(zhì)時(shí)較高。還觀(guān)察到在每種情況下，同源血清型HMAF的識(shí)別顯著高于異源血清型HMAF，證明血清型特異性表位暴露，因而可用于登革病毒以及血清分型的診斷方法。
將所有重組嵌合蛋白質(zhì)免疫小鼠，可獲得中和及保護(hù)性應(yīng)答。利用融合MDH完整基因的序列以及二聚體蛋白質(zhì)獲得的中和滴度最高，而與該片段在DENe蛋白質(zhì)中的位置無(wú)關(guān)。這顯示了MDH介導(dǎo)對(duì)免疫應(yīng)答的免疫增強(qiáng)劑效應(yīng)，可以根據(jù)由所獲抗原性結(jié)果反映出的對(duì)DENe蛋白質(zhì)折疊的影響進(jìn)行解釋。還首次證明，與現(xiàn)有技術(shù)相反，這些蛋白質(zhì)的不溶性并不影響其產(chǎn)生合適免疫應(yīng)答的能力。
各種情況下產(chǎn)生的免疫應(yīng)答在病毒中和、血細(xì)胞凝集抑制以及ELISA中均具有血清型特異性(針對(duì)所免疫的同源血清型的抗體)。產(chǎn)生血清型特異性抗體意味著它們不能識(shí)別可促進(jìn)免疫增強(qiáng)現(xiàn)象的異源血清型病毒的抗原決定簇。該特征對(duì)于開(kāi)發(fā)針對(duì)登革病毒的候選疫苗極其重要，因?yàn)橐鸪鲅缘歉餆?Hemorrhagic Dengue Fever，HDF)的原因之一即為抗體識(shí)別異源血清型。
此外表明，只利用其中一種嵌合蛋白質(zhì)免疫以后，可誘導(dǎo)針對(duì)兩種病毒血清型的抗體，因此僅使用兩種我們所獲得的重組嵌合蛋白質(zhì)，即可形成針對(duì)四種血清型的候選疫苗制劑。
根據(jù)該脂肪酸與賴(lài)氨酸(K)的ε-氨基共價(jià)結(jié)合，去除序列ETDKAT中的硫辛酸結(jié)合位點(diǎn)，獲得突變型MDH蛋白質(zhì)(Tuaillon N，Andre C，Briand JP等人.Alipoyl synthetic octadecapeptide ofdihvdrolipoamide acetyltransferase specifically recognized byanti-M2 autoantibodies in Primary Biliary Cirrhosis.JImmunol 1992；148445-50)。
使用一對(duì)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增N-末端區(qū)(從IpdA基因的起始密碼子到硫辛酸結(jié)合位點(diǎn)，135bp)和蛋白質(zhì)的C-末端(從硫辛酸結(jié)合位點(diǎn)到該基因3’端)進(jìn)行誘變，從而消除產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)的可能性，如人體臨床試驗(yàn)所證實(shí)。
生物材料的保藏根據(jù)布達(dá)佩斯公約(Budapest Treaty)，質(zhì)粒PLL1、PLL2、PLL3、PLH1、PLH2、PLH3，PAZ1、PAZ2、PAZ3、PID1、PID2和PID3保藏于Belgian Coordinated collection of Microorganism -BCCMTM，LMBP-COLLECTION，其日期及登錄號(hào)(未決)。
附圖描述

圖1.E2片段的克隆策略以獲得PLL1。
DENe2DEN-2包膜蛋白質(zhì)的片段。
N-端編碼MDH蛋白質(zhì)前45個(gè)氨基酸的核苷酸序列。
圖2.E2片段的克隆策略以獲得PLL2。
DENe2DEN-2包膜蛋白質(zhì)的片段。
MDH脫氫酶突變體。
圖3.E2片段的克隆策略以獲得PLL3。
DENe2DEN-2包膜蛋白質(zhì)的片段。
MDH脫氫酶突變體。
圖4.E1片段的克隆策略以獲得PLH1。
DENe1DEN-1包膜蛋白質(zhì)的片段。
N-端編碼MDH蛋白質(zhì)前45個(gè)氨基酸的核苷酸序列。
圖5.E1片段的克隆策略以獲得PLH2。
DENe1DEN-1包膜蛋白質(zhì)的片段。
N-端編碼MDH蛋白質(zhì)前45個(gè)氨基酸的核苷酸序列。
圖6.E1片段的克隆策略以獲得PLH3。
DENe1DEN-1包膜蛋白質(zhì)的片段。
MDH脫氫酶突變體。
圖7.E3片段的克隆策略以獲得PAZ1。
DENe3DEN-3包膜蛋白質(zhì)的片段。
N-端編碼MDH蛋白質(zhì)前45個(gè)氨基酸的核苷酸序列。
圖8.E3片段的克隆策略以獲得PAZ2。
DENe3DEN-3包膜蛋白質(zhì)的片段。
MDH脫氫酶突變體。
圖9.E3片段的克隆策略以獲得PAZ3。
DENe3DEN-3包膜蛋白質(zhì)的片段。
MDH脫氫酶突變體。
圖10.E4片段的克隆策略以獲得PID1。
DENe4DEN-4包膜蛋白質(zhì)的片段。
N-端編碼MDH蛋白質(zhì)前45個(gè)氨基酸的核苷酸序列。
圖11.E4片段的克隆策略以獲得PID2。
DENe4DEN-4包膜蛋白質(zhì)的片段。
MDH脫氫酶突變體。
圖12.E4片段的克隆策略以獲得PID3。
DENe4DEN-4包膜蛋白質(zhì)的片段。
MDH脫氫酶突變體。
圖13.獲得PD4D2的克隆策略。
DENe4DEN-4包膜蛋白質(zhì)的片段。
DENe2DEN-2包膜蛋白質(zhì)的片段。
MDH脫氫酶突變體。
實(shí)施例實(shí)施例1.獲得PLL1利用序列表中序列號(hào)1和序列號(hào)2所示寡核苷酸，從DEN-2病毒株基因型Jamaica(Deubel V.，Kinney R.M.，Trent D.W.Nucleotidesequence and deduced amino acid sequence of the nonstructuralproteins of Dengue type 2 virus，Jamaica genotypeComparativeanalysis of the full-length genome.Virology 1988.165234-244)中擴(kuò)增編碼DEN-2病毒包膜蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列(Sec.Id.No.22)。
利用XbaI/BamHI消化pM108 His質(zhì)粒，產(chǎn)生包含編碼MDH的N末端區(qū)和6個(gè)組氨酸序列的核苷酸序列(序列號(hào)23)的載體。連接以后，通過(guò)限制性酶消化來(lái)分析可能的重組子，測(cè)序陽(yáng)性克隆以驗(yàn)證連接。利用所選名為pLL1的克隆(圖1以及序列號(hào)24)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞W3110(Hill C.W.，Harnish B.W.1982.Transposition of achromosomal segment bounded by redundant rRNA genes inEscherichia coli.J Bacteriology.149449-457)。菌落在LuriaBertani(LB)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以后，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果獲得25kDA條帶，占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的10％。所獲蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)于MDH蛋白質(zhì)N末端區(qū)以及DEN-2病毒DENe蛋白質(zhì)片段大小的總和。該蛋白質(zhì)在免疫印跡中可由HMAF中包含的抗DEN-2多克隆抗體(PA)識(shí)別。將該蛋白質(zhì)命名為PLL1(序列號(hào)25)。
實(shí)施例2.純化PLL1蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化pLL1的大腸桿菌菌株于37℃生長(zhǎng)，獲得的生物質(zhì)通過(guò)弗氏壓碎器(French press)裂解。所獲重組蛋白質(zhì)主要為伴有細(xì)胞裂解沉淀的不溶性形式。利用6M脲從沉淀中提取蛋白質(zhì)，將包含PLL1蛋白質(zhì)的上清上樣G-25柱，以便去除離液劑。然后將獲得的組分上樣存在Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。利用50mM咪唑洗脫該蛋白質(zhì)，將獲得的體積上樣G-25柱，最終獲得處于配制緩沖液NaCl100mM、KCl22mM、Na2HPO410mM、pH7.2、KH2PO41mM(PBS)中的蛋白質(zhì)。該制劑供免疫學(xué)研究之用。
實(shí)施例3.PLL1的抗原性特征通過(guò)不同多克隆血清和/或小鼠單克隆抗體以及針對(duì)登革的人陽(yáng)性血清進(jìn)行識(shí)別，鑒定純化的PLL1組分的特征(表1)。
表1.PLL1蛋白質(zhì)對(duì)單克隆和多克隆抗體的反應(yīng)性。
Abs**特異性***PLL1*HMAF DEN-1+HMAF DEN-2++HMAF DEN-3-HMAF DEN-4-HMAF EEE -HMAF YFV -HMAF SLV -Mab 3H5 NT +*總計(jì)使用10μg純化的PLL1。按+至++評(píng)價(jià)獲得的信號(hào)強(qiáng)度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀釋使用。
***EEE馬腦炎病毒(Equine Encephalitis virus)。YFV黃熱病毒(Yellow Fever virus)。SLV圣路易斯腦炎病毒(Saint LouisEncephalitis virus)。NT中和特異性血清型。
在斑點(diǎn)印跡中，利用HMAF抗DEN-2獲得的識(shí)別最強(qiáng)。此結(jié)果與該克隆區(qū)域?qū)儆谘逍?的事實(shí)相符。針對(duì)其它血清型的HMAF的識(shí)別低于血清型2的情況，按DEN-1、DEN-3和DEN-4降序排列。由其它黃病毒、如黃熱病毒以及圣路易斯腦炎病毒產(chǎn)生的抗體完全沒(méi)有任何識(shí)別作用。另一方面，Mab 3H5確實(shí)具有反應(yīng)性。通過(guò)Western印跡的識(shí)別有賴(lài)于二硫鍵，因?yàn)檫€原樣品則信號(hào)丟失。最后，測(cè)定了針對(duì)抗DEN-2的3個(gè)高滴度和3個(gè)低滴度人血清的反應(yīng)性，Western印跡和斑點(diǎn)印跡均獲得了顯著信號(hào)。
實(shí)施例4.由PLL1產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的特征利用處于弗氏佐劑中的35ug純化的PLL1 i.p免疫總計(jì)25只Balb/c小鼠，10只動(dòng)物于4次劑量后取血，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗DEN抗體。獲得了針對(duì)DEN-2的高抗體滴度，未獲得針對(duì)其它血清型的反應(yīng)性(表2和表5)。此外，進(jìn)行了血細(xì)胞凝集抑制分析(HIA)，只發(fā)現(xiàn)針對(duì)DEN-2的陽(yáng)性滴度(表3和表5)。最后，進(jìn)行了體外中和分析，獲得針對(duì)DEN-2的中和滴度為1∶320。然而，未發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它血清型病毒感染的中和作用(表4和表5)。這些結(jié)果表明，PLL1可激發(fā)高度血清型特異性的抗體。
表2.PLL1免疫小鼠所獲血清的抗DEN-2抗體滴度。
表3.PLL1免疫動(dòng)物血清的HI滴度。
*HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
表4.PLL1免疫動(dòng)物血清的病毒中和分析。
*中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
表5.利用PLL1免疫動(dòng)物血清通過(guò)ELISA、HI以及病毒中和進(jìn)行的針對(duì)所有病毒血清型的交叉反應(yīng)性分析。

*每種混合物由三種血清形成。
**HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
***中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
實(shí)施例5.獲得PLL2利用序列表中序列號(hào)1和序列號(hào)3所示寡核苷酸，從DEN-2病毒株基因型Jamaica(Deubel V.，Kinney R.M.，Trent D.W.Nucleotidesequence and deduced amino acid sequence of the nonstructuralproteins of Dengue type 2 virus，Jamaica genotypeComparativeanalysis of the full-length genome.Virology 1988.165234-244)中擴(kuò)增編碼DEN-2病毒包膜蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列(Sec.Id.No.22)。
利用XbaI/EcoRI消化pM84 His質(zhì)粒，產(chǎn)生包含編碼MDH蛋白質(zhì)和6個(gè)組氨酸序列的核苷酸序列(序列號(hào)26)的載體。該消化使得可以在MDH蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)內(nèi)插入PCR擴(kuò)增片段。連接以后，通過(guò)限制性酶消化來(lái)分析可能的重組子，測(cè)序陽(yáng)性克隆以驗(yàn)證連接。利用所選名為pLL2的克隆(圖2和序列號(hào)27)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞MM294(Hanahan D.1983.Studies on transformation of Escherichia coliwith plasmids.J.Mol.Biol.166557-580)。菌落在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以后，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果獲得80kDA條帶，占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的10％。所獲蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)于MDH蛋白質(zhì)以及DEN-2病毒DENe蛋白質(zhì)片段大小的總和。該蛋白質(zhì)在免疫印跡中可由HMAF抗DEN-2識(shí)別，命名為PLL2(序列號(hào)28)。
實(shí)施例6.純化PLL2蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化pLL2的大腸桿菌菌株于37℃生長(zhǎng)，獲得的生物質(zhì)通過(guò)弗氏壓碎器裂解。獲得可溶性及不溶性?xún)煞N形式的重組蛋白質(zhì)。使用預(yù)先連接Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱從可溶性組分中進(jìn)行金屬離子親和層析。使用15mM咪唑洗柱，100mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)。另一方面，利用8M脲提取伴有不溶性組分的蛋白質(zhì)，將包含PLL2蛋白質(zhì)的上清上樣G-25柱，以便去除離液劑。然后將獲得的組分上樣存在Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。利用100mM咪唑洗脫該蛋白質(zhì)。最后將每種形式蛋白質(zhì)的純凈組分上樣G-25柱，獲得處于配制緩沖液NaCl 100mM、KCl22mM、Na2HPO410mM、pH7.2、KH2PO41mM(PBS)中的蛋白質(zhì)。該制劑供免疫學(xué)研究之用。
實(shí)施例7.PLL2的抗原性特征利用不同多克隆血清和/或小鼠單克隆抗體以及針對(duì)登革的人陽(yáng)性血清進(jìn)行識(shí)別，鑒定純化的PLL2組分的特征(表6)。
在斑點(diǎn)印跡中，利用HMAF抗DEN-2獲得的識(shí)別最強(qiáng)。針對(duì)其它血清型的HMAF的識(shí)別低于血清型2的情況，按DEN-1、DEN-3和DEN-4降序排列。由其它黃病毒、如黃熱病毒以及圣路易斯腦炎病毒產(chǎn)生的抗體完全沒(méi)有任何識(shí)別作用。盡管如此，利用斑點(diǎn)印跡和Western印跡均觀(guān)察到Mab 3H5的較高反應(yīng)性(甚至高于利用PLL1所獲反應(yīng)性)。與PLL1結(jié)果相反，在樣品中存在還原劑時(shí)，Mab 3H5的識(shí)別不變，表明這兩種蛋白質(zhì)可能構(gòu)象不同。最后，測(cè)定了針對(duì)抗DEN-2的3個(gè)高滴度和3個(gè)低滴度人血清的反應(yīng)性，通過(guò)Western印跡和斑點(diǎn)印跡均獲得了顯著信號(hào)。
表6.PLL2蛋白質(zhì)對(duì)單克隆和多克隆抗體的反應(yīng)性。
Abs**特異性*** PLL2 sol，ins*HMAF DEN-1 ++HMAF DEN-2 +++HMAF DEN-3 -HMAF DEN-4 -HMAF EEE -HMAF YFV -HMAF SLV -Mab 3H5NT +++*總計(jì)使用10μg純化的PLL2。按+至++評(píng)價(jià)獲得的信號(hào)強(qiáng)度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀釋使用。
***EEE馬腦炎病毒。YFV黃熱病毒。SLV圣路易斯腦炎病毒。NT中和特異性血清型。
實(shí)施例8.由PLL2產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的特征利用處于弗氏佐劑中的35ug純化的PLL2i.p免疫總計(jì)25只Balb/c小鼠，10只動(dòng)物于4次劑量后取血，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗DEN抗體。獲得了針對(duì)DEN-2的高抗體滴度，未獲得針對(duì)其它血清型的反應(yīng)性(表7和表10)。此外，進(jìn)行了血細(xì)胞凝集抑制分析(HI)，只發(fā)現(xiàn)針對(duì)DEN-2的陽(yáng)性滴度(表8和表10)。最后，進(jìn)行了體外中和分析，獲得針對(duì)DEN-2的中和滴度為1∶1280。與利用PLL1所獲結(jié)果類(lèi)似，未發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它血清型病毒感染的中和作用(表9和表10)。另一方面，利用PLL2兩種變體所獲結(jié)果類(lèi)似，表明蛋白質(zhì)溶解狀態(tài)不影響其產(chǎn)生功能性抗體的能力。
表7.可溶性及不溶性PLL2免疫小鼠所獲血清的抗DEN-2抗體滴度。
表8.可溶性及不溶性PLL2免疫動(dòng)物血清的HI滴度。
*HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
表9.可溶性及不溶性PLL2免疫動(dòng)物血清的病毒中和分析。
*中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
表10.利用可溶性及不溶性PLL2免疫動(dòng)物的血清通過(guò)ELISA、HI以及病毒中和進(jìn)行的針對(duì)所有病毒血清型的交叉反應(yīng)性分析。

*每種混合物由三種血清形成。
**HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
***中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
實(shí)施例9.獲得PLL3利用序列表中序列號(hào)4和序列號(hào)5所示寡核苷酸，從DEN-2病毒株基因型Jamaica(Deubel V.，Kinney R.M.，Trent D.W.Nucleotidesequence and deduced amino acid sequence of the nonstructuralproteins of Dengue type 2 virus，Jamaica genotypeComparativeanalysis of the full-length genome.Virology 1988.165234-244)擴(kuò)增編碼DEN-2病毒包膜蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列(Sec.Id.No.22)。
利用BamHI/BamHI消化pD4質(zhì)粒，產(chǎn)生包含編碼MDH蛋白質(zhì)和6個(gè)組氨酸序列且沒(méi)有終止密碼子的核苷酸序列(序列號(hào)29)的載體。該消化使得可以在MDH蛋白質(zhì)C末端區(qū)之后融合PCR擴(kuò)增片段。連接以后，通過(guò)限制性酶消化來(lái)分析可能的重組子，測(cè)序陽(yáng)性克隆以驗(yàn)證連接。利用所選名為pLL3的克隆(圖3和序列號(hào)30)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞W3110。菌落在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以后，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果獲得80kDA條帶，占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的20％。所獲蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)于MDH蛋白質(zhì)與DEN-2病毒DENe蛋白質(zhì)片段大小的總和。該蛋白質(zhì)在免疫印跡中可由HMAFI抗DEN-2識(shí)別，命名為PLL3(序列號(hào)31)。
實(shí)施例10.純化PLL3蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化pLL2的大腸桿菌菌株于37℃生長(zhǎng)，獲得的生物質(zhì)通過(guò)弗氏壓碎器裂解。獲得可溶性及不溶性?xún)煞N形式的重組蛋白質(zhì)。利用6M脲從不溶性組分中提取蛋白質(zhì)，將包含PLL3蛋白質(zhì)的上清上樣G-25柱，以便去除離液劑。然后將獲得的組分上樣存在Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用30mM咪唑洗柱，100mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)。最后將純凈的蛋白質(zhì)組分上樣G-25柱，獲得處于配制緩沖液(PBS)中的蛋白質(zhì)。該制劑供免疫學(xué)研究之用。
實(shí)施例11.PLL3的抗原性特征利用不同多克隆血清和/或小鼠單克隆抗體以及針對(duì)登革的人陽(yáng)性血清進(jìn)行識(shí)別，鑒定純化的PLL3組分的特征(表11)。
在斑點(diǎn)印跡中，利用HMAF抗DEN-2獲得的識(shí)別最強(qiáng)。針對(duì)其它血清型的HMAF的識(shí)別低于血清型2的情況，按DEN-1、DEN-3和DEN-4降序排列。由其它黃病毒、如黃熱病毒以及圣路易斯腦炎病毒產(chǎn)生的抗體完全沒(méi)有任何識(shí)別作用。盡管如此，利用斑點(diǎn)印跡和Western印跡均觀(guān)察到Mab 3H5的高反應(yīng)性(類(lèi)似于利用PLL2所獲反應(yīng)性)。與PLL1結(jié)果相反，在樣品中存在還原劑時(shí)，Mab 3H5的識(shí)別不變，表明這兩種蛋白質(zhì)可能構(gòu)象不同。最后，測(cè)定了針對(duì)抗DEN-2的3個(gè)高滴度和3個(gè)低滴度人血清的反應(yīng)性，通過(guò)Western印跡和斑點(diǎn)印跡均獲得了顯著信號(hào)。這些結(jié)果類(lèi)似于利用PLL2所獲結(jié)果。
表11.PLL3蛋白質(zhì)對(duì)單克隆和多克隆抗體的反應(yīng)性。
Abs**特異性*** PLL3*HMAF DEN-1 ++HMAF DEN-2 +++HMAF DEN-3 -HMAF DEN-4 -HMAF EEE -HMAF YFV -HMAF SLV -Mab 3H5 NT+++*總計(jì)使用10μg純化的PLL3。按+至++評(píng)價(jià)所獲得的信號(hào)強(qiáng)度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀釋使用。
***EEE馬腦炎病毒。YFV黃熱病毒。SLV圣路易斯腦炎病毒。NT中和特異性血清型。
實(shí)施例12.由PLL3產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的特征利用處于弗氏佐劑中的35ug純化的PLL3 i.p免疫總計(jì)25只Balb/c小鼠，10只動(dòng)物于4次劑量后取血，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗DEN抗體。獲得了針對(duì)DEN-2的高抗體滴度，未獲得針對(duì)其它血清型的反應(yīng)性(表12和表15)。此外，進(jìn)行了血細(xì)胞凝集抑制分析(HI)，只發(fā)現(xiàn)針對(duì)DEN-2的陽(yáng)性滴度(表13和表15)。最后，進(jìn)行了體外中和分析，獲得針對(duì)DEN-2的中和滴度為1∶1280(表14)。未發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它血清型病毒感染的中和作用(表15)。使用這三種測(cè)試，檢測(cè)到高水平的血清型特異性抗體，與利用PLL2蛋白質(zhì)免疫后獲得的抗體類(lèi)似。
表12.PLL3免疫小鼠所獲血清的抗DEN-2抗體滴度。
表13.PLL3免疫動(dòng)物血清的HI滴度。
*HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
表14.PLL3免疫動(dòng)物血清的病毒中和分析。
*中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
表15.利用PLL3免疫動(dòng)物血清通過(guò)ELISA、HI以及病毒中和進(jìn)行的針對(duì)所有病毒血清型的交叉反應(yīng)性分析。

*每種混合物由三種血清形成。
**HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
***中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
實(shí)施例13.獲得PLH1利用序列表中序列號(hào)6和序列號(hào)7所示寡核苷酸，從DEN-1病毒株基因型(Chu M.C.，O’Rourke E.J.，Trent D.W.Geneticrelatedness among structural protein genes of dengue 1 Virusstrains.J.Gen.Virol.1989.701701-1712)擴(kuò)增編碼DEN-1病毒包膜蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列(Sec.Id.No.32)。
利用XbaI/BamHI消化pM108 His質(zhì)粒，產(chǎn)生包含編碼MDH的N末端區(qū)和6個(gè)組氨酸序列的核苷酸序列(序列號(hào)23)的載體。連接以后，通過(guò)限制性酶消化來(lái)分析可能的重組子，測(cè)序陽(yáng)性克隆以驗(yàn)證連接。利用所選名為pLH1的克隆(圖4和序列號(hào)33)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞W3110。菌落在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以后，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果獲得25kDA條帶，占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的10％。所獲蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)于MDH蛋白質(zhì)N末端區(qū)與DEN-1病毒DENe蛋白質(zhì)片段大小的總和。在免疫印跡中，該蛋白質(zhì)可由HMAF中包含的抗DEN-1多克隆抗體(PA)識(shí)別。將該蛋白質(zhì)命名為PLH1(序列號(hào)34)。
實(shí)施例14.純化PLH1蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化pLH1的大腸桿菌菌株于37℃生長(zhǎng)，將獲得的生物質(zhì)通過(guò)弗氏壓碎器裂解。所獲重組蛋白質(zhì)主要為伴隨細(xì)胞裂解沉淀的不溶性形式。利用7M脲從沉淀中提取蛋白質(zhì)，將包含PLH1蛋白質(zhì)的上清上樣G-25柱，以便去除離液劑。然后將獲得的組分上樣存在Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。利用60mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)，將獲得的體積上樣G-25柱，最終獲得處于配制緩沖液(PBS)中的蛋白質(zhì)。該制劑供免疫學(xué)研究之用。
實(shí)施例15.PLH1的抗原性特征利用不同多克隆血清和/或小鼠單克隆抗體以及針對(duì)登革的人陽(yáng)性血清進(jìn)行識(shí)別，鑒定純化的PLH1組分的特征(表16)。
在斑點(diǎn)印跡中，利用HMAF抗DEN-1獲得的識(shí)別最強(qiáng)。針對(duì)其它血清型的HMAF的識(shí)別低于血清型1的情況。由其它黃病毒、如黃熱病毒以及圣路易斯腦炎病毒產(chǎn)生的抗體完全沒(méi)有任何識(shí)別作用。最后，測(cè)定了針對(duì)抗DEN-1的3個(gè)高滴度和3個(gè)低滴度人血清的反應(yīng)性，通過(guò)Western印跡和斑點(diǎn)印跡均獲得了顯著信號(hào)。
表16.PLH1蛋白質(zhì)對(duì)單克隆和多克隆抗體的反應(yīng)性Abs**特異性*** PLH1HMAF DEN-1 ++HMAF DEN-2 +HMAF DEN-3 -HMAF DEN-4 -HMAF EEE-HMAF YFV-HMAF SLV-Mab 3H5 NT -*總計(jì)使用10μg純化的PLH1。按+至++評(píng)價(jià)所獲得的信號(hào)強(qiáng)度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀釋使用。
***EEE馬腦炎病毒。YFV黃熱病毒。SLV圣路易斯腦炎病毒。NT中和特異性血清型。
實(shí)施例16.由PLH1產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的特征利用處于弗氏佐劑中的35ug純化的PLH1 i.p免疫總計(jì)25只Balb/c小鼠，10只動(dòng)物于4次劑量后取血，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗DEN抗體。獲得了針對(duì)DEN-1的高抗體滴度，未獲得針對(duì)其它血清型的反應(yīng)性(表17和表20)。此外，進(jìn)行了HI分析，只發(fā)現(xiàn)針對(duì)DEN-1的陽(yáng)性滴度(表18和表20)。最后，進(jìn)行了體外中和分析，獲得針對(duì)DEN-1的中和滴度為1∶320。然而，未發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它血清型病毒感染的中和作用(表19和表20)。這些結(jié)果表明，PLH1可激發(fā)高度血清型特異性的抗體。
表17.PLH1免疫小鼠所獲血清的抗DEN-1抗體滴度。
表18.PLH1免疫動(dòng)物血清的HI滴度。
*HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
表19.PLH1免疫動(dòng)物血清的病毒中和分析。
*中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
表20.利用PLH1免疫動(dòng)物血清通過(guò)ELISA、HI以及病毒中和進(jìn)行的針對(duì)所有病毒血清型的交叉反應(yīng)性分析。

*每種混合物由三種血清形成。
**HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
***中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
實(shí)施例17.獲得PLH2利用序列表中序列號(hào)6和序列號(hào)8所示寡核苷酸，從DEN-1病毒株基因型(Chu M.C.，O’Rourke E.J.，Trent D.W.Geneticrelatedness among structural protein genes of dengue 1 virusstrains.J.Gen.Virol.1989.701701-1712)擴(kuò)增編碼DEN-1病毒包膜蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列(Sec.Id.No.32)。
利用XbaI/EcoRI消化pM84 His質(zhì)粒，產(chǎn)生包含編碼MDH蛋白質(zhì)和6個(gè)組氨酸序列的核苷酸序列(序列號(hào)26)的載體。該消化使得可以在MDH蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)內(nèi)插入PCR擴(kuò)增片段。連接以后，通過(guò)限制性酶消化來(lái)分析可能的重組子，測(cè)序陽(yáng)性克隆以驗(yàn)證連接。利用所選名為pLH2的克隆(圖5和序列號(hào)35)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞MM294。菌落在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以后，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果獲得80kDA條帶，占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的20％。所獲蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)于MDH蛋白質(zhì)與DEN-1病毒DENe蛋白質(zhì)片段大小的總和。該蛋白質(zhì)在免疫印跡中可由HMAF抗DEN-1識(shí)別，命名為PLH2(序列號(hào)36)。
實(shí)施例18.純化PLH2蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化pLH2的大腸桿菌菌株于37℃生長(zhǎng)，將獲得的生物質(zhì)通過(guò)弗氏壓碎器裂解。獲得可溶性及不溶性?xún)煞N形式的重組蛋白質(zhì)。利用7M脲提取伴隨不溶性組分的蛋白質(zhì)，將包含PLH2蛋白質(zhì)的上清上樣G-25柱，以便去除離液劑。然后將獲得的組分上樣存在Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用40mM咪唑洗柱，100mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)。最后將純凈組分上樣G-25柱，獲得處于配制緩沖液(PBS)中的蛋白質(zhì)。該制劑供免疫學(xué)研究之用。
實(shí)施例19.PLH2的抗原性特征利用不同多克隆血清和/或小鼠單克隆抗體以及針對(duì)登革的人陽(yáng)性血清進(jìn)行識(shí)別，鑒定純化的PLH2組分的特征(表21)。
在斑點(diǎn)印跡中，利用HMAF抗DEN-1獲得的識(shí)別最強(qiáng)(高于利用PLH1所獲識(shí)別)。針對(duì)其它血清型的HMAF的識(shí)別低于血清型1的情況。由其它黃病毒、如黃熱病毒以及圣路易斯腦炎病毒產(chǎn)生的抗體完全沒(méi)有任何識(shí)別作用。最后，測(cè)定了針對(duì)抗DEN-1的5個(gè)高滴度和3個(gè)低滴度人血清的反應(yīng)性，通過(guò)Western印跡和斑點(diǎn)印跡均獲得了顯著信號(hào)。
表21.PLH2蛋白質(zhì)對(duì)單克隆和多克隆抗體的反應(yīng)性。
Abs**特異性***PLH2HMAF DEN-1+++HMAF DEN-2+HMAF DEN-3-HMAF DEN-4-HMAF EEE -HMAF YFV -HMAF SLV -Mab 3H5 NT -*總計(jì)使用10μg純化的PLH2。按+至++評(píng)價(jià)所獲得的信號(hào)強(qiáng)度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀釋使用。
***EEE馬腦炎病毒。YFV黃熱病毒。SLV圣路易斯腦炎病毒。NT中和特異性血清型。
實(shí)施例20.由PLH2產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的特征利用處于弗氏佐劑中的20ug純化的PLH2 i.p免疫總計(jì)25只Balb/c小鼠，10只動(dòng)物于4次劑量后取血，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗DEN抗體。獲得了針對(duì)DEN-1的高抗體滴度，未獲得針對(duì)其它血清型的反應(yīng)性(表22和表25)。此外，進(jìn)行了HI分析，只發(fā)現(xiàn)針對(duì)DEN-1的陽(yáng)性滴度(表23和表25)。最后，進(jìn)行了體外中和分析，獲得針對(duì)DEN-1的中和滴度為1∶1280(表24)。未發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它血清型病毒感染的中和作用。(表25)。
表22.PLH2免疫小鼠所獲血清的抗DEN-1抗體滴度。
表23.PLH2免疫動(dòng)物血清的HI滴度。
*HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
表24.PLH2免疫動(dòng)物血清的病毒中和分析。
*中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
表25.利用PLH2免疫動(dòng)物血清通過(guò)ELISA、HI以及病毒中和進(jìn)行的針對(duì)所有病毒血清型的交叉反應(yīng)性分析。

*每種混合物由三種血清形成。
**HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
***中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
實(shí)施例21.獲得PLH3利用序列表中序列號(hào)9和序列號(hào)10所示寡核苷酸，從DEN-1病毒株(Chu M.C.，O’Rourke E.J.，Trent D.W.Genetic relatedness amongstructural protein genes of dengue 1 virus strains.J.Gen.Virol.1989.701701-1712)擴(kuò)增編碼DEN-1病毒包膜蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列(Sec.Id.No.32)。
利用BamHI/BamHI消化pD4質(zhì)粒，產(chǎn)生包含編碼MDH蛋白質(zhì)和6個(gè)組氨酸序列、并且沒(méi)有終止密碼子的核苷酸序列(序列號(hào)29)的載體。該消化使得可以在MDH蛋白質(zhì)C末端區(qū)之后融合PCR擴(kuò)增片段。連接以后，通過(guò)限制性酶消化來(lái)分析可能的重組子，測(cè)序陽(yáng)性克隆以驗(yàn)證連接。利用所選名為pLH3的克隆(圖6和序列號(hào)37)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞W3110。菌落在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以后，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果獲得80kDA條帶，占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的20％。所獲蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)于MDH蛋白質(zhì)與DEN-1病毒DENe蛋白質(zhì)片段大小的總和。該蛋白質(zhì)在免疫印跡中可由HMAF抗DEN-1識(shí)別，命名為PLH3(序列號(hào)38)。
實(shí)施例22.純化PLH3蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化pLH3的大腸桿菌菌株于37℃生長(zhǎng)，將獲得的生物質(zhì)通過(guò)弗氏壓碎器裂解。獲得可溶性及不溶性?xún)煞N形式的重組蛋白質(zhì)。利用6M脲從不溶性組分中提取蛋白質(zhì)，將包含PLH3蛋白質(zhì)的上清上樣G-25柱，以便去除離液劑。然后將獲得的組分上樣存在Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用30mM咪唑洗柱，250mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)。最后將純凈的蛋白質(zhì)組分上樣G-25柱，獲得處于配制緩沖液(PBS)中的蛋白質(zhì)。該制劑供免疫學(xué)研究之用。
實(shí)施例23.PLH3的抗原性特征利用不同多克隆血清和/或小鼠單克隆抗體以及針對(duì)登革的人陽(yáng)性血清進(jìn)行識(shí)別，鑒定純化的PLH3組分的特征(表26)。
在斑點(diǎn)印跡中，利用HMAF抗DEN-1獲得的識(shí)別最強(qiáng)。針對(duì)其它血清型的HMAF的識(shí)別低于血清型1的情況。由其它黃病毒、如黃熱病毒以及圣路易斯腦炎病毒產(chǎn)生的抗體完全沒(méi)有任何識(shí)別作用。最后，測(cè)定了針對(duì)抗DEN-1的3個(gè)高滴度和3個(gè)低滴度人血清的反應(yīng)性，通過(guò)Western印跡和斑點(diǎn)印跡均獲得了顯著信號(hào)。
表26.PLH3蛋白質(zhì)對(duì)單克隆和多克隆抗體的反應(yīng)性。
Abs**特異性*** PLH3HMAF DEN-1 +++HMAF DEN-2 +HMAF DEN-3 -HMAF DEN-4 -HMAF EEE-HMAF YFV-HMAF SLV-Mab 3H5 NT -*總計(jì)使用10μg純化的PLH3。按+至++評(píng)價(jià)所獲得的信號(hào)強(qiáng)度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀釋使用。
***EEE馬腦炎病毒。YFV黃熱病毒。SLV圣路易斯腦炎病毒。NT中和特異性血清型。
實(shí)施例24.由PLH3產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的特征利用處于弗氏佐劑中的20ug純化的PLH3 i.p免疫總計(jì)25只Balb/c小鼠，10只動(dòng)物于4次劑量后取血，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗DEN抗體。獲得了針對(duì)DEN-1的高抗體滴度，未獲得針對(duì)其它血清型的反應(yīng)性(表27和表30)。此外，進(jìn)行了HI分析，只發(fā)現(xiàn)針對(duì)DEN-1的陽(yáng)性滴度(表28和表30)。最后，進(jìn)行了體外中和分析，獲得針對(duì)DEN-1的中和滴度為1∶1280(表29)。未發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它血清型病毒感染的中和作用(表30)。
表27.PLH3免疫小鼠所獲血清的抗DEN-1抗體滴度。
表28.PLH3免疫動(dòng)物血清的HI滴度。
*HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
表29.PLH3免疫動(dòng)物血清的病毒中和分析。
*中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
表30.利用PLH3免疫動(dòng)物血清通過(guò)ELISA、HI以及病毒中和進(jìn)行的針對(duì)所有病毒血清型的交叉反應(yīng)性分析。

*每種混合物由三種血清形成。
**HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
***中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
實(shí)施例25.獲得pAZ1利用序列表中序列號(hào)11和序列號(hào)12所示寡核苷酸，從DEN-3病毒株基因型(Osatomi K.，Sumiyoshi H.Complete nucleotidesequence of dengue type 3 virus genome RNA.Virology.1990.176(2)643-647)擴(kuò)增編碼DEN-3病毒包膜蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列(Seq.39)。
利用XbaI/BamHI消化pM108 His質(zhì)粒，產(chǎn)生包含編碼MDH的N末端區(qū)和6個(gè)組氨酸序列的核苷酸序列(序列號(hào)23)的載體。連接以后，通過(guò)限制性酶消化來(lái)分析可能的重組子，測(cè)序陽(yáng)性克隆以驗(yàn)證連接。利用所選名為pAZ1的克隆(圖7和序列號(hào)40)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞W3110。菌落在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以后，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果獲得25kDA條帶，占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的10％。所獲蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)于MDH蛋白質(zhì)N末端區(qū)與DEN-3病毒DENe蛋白質(zhì)片段大小的總和。在免疫印跡中，該蛋白質(zhì)可由HMAF中包含的抗DEN-3多克隆抗體(PA)識(shí)別。將該蛋白質(zhì)命名為PAZ1(序列號(hào)41)。
實(shí)施例26.純化PAZ1蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化pAZ1的大腸桿菌菌株于37℃生長(zhǎng)，將獲得生物質(zhì)通過(guò)弗氏壓碎器裂解。所獲重組蛋白質(zhì)主要為伴隨細(xì)胞裂解沉淀的不溶性形式。利用7M脲從沉淀中提取蛋白質(zhì)，將包含PLH1蛋白質(zhì)的上清上樣G-25柱，以便去除離液劑。然后將獲得的組分上樣存在Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱(Pharmacia， UK)。利用60mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)，將獲得的體積上樣G-25柱，最終獲得處于配制緩沖液(PBS)中的蛋白質(zhì)。該制劑供免疫學(xué)研究之用。
實(shí)施例27.PAZ1的抗原性特征利用不同多克隆血清和/或小鼠單克隆抗體以及針對(duì)登革的人陽(yáng)性血清進(jìn)行識(shí)別，鑒定純化的PAZ1組分的特征(表31)。
在斑點(diǎn)印跡中，利用HMAF抗DEN-3獲得的識(shí)別最強(qiáng)。針對(duì)其它血清型的HMAF的識(shí)別低于血清型3的情況。由其它黃病毒、如黃熱病毒以及圣路易斯腦炎病毒產(chǎn)生的抗體完全沒(méi)有任何識(shí)別作用。最后，測(cè)定了針對(duì)抗DEN-3的3個(gè)高滴度和3個(gè)低滴度人血清的反應(yīng)性，通過(guò)Western印跡和斑點(diǎn)印跡均獲得了顯著信號(hào)。
表31.PAZ1蛋白質(zhì)對(duì)單克隆和多克隆抗體的反應(yīng)性。
Abs**特異性***PAZ1HMAF DEN-1-HMAF DEN-2+HMAF DEN-3++HMAF DEN-4+HMAF EEE -HMAF YFV -HMAF SLV -Mab 3H5 NT -*總計(jì)使用10μg純化的PAZ1。按+至++評(píng)價(jià)所獲得的信號(hào)強(qiáng)度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀釋使用。
***EEE馬腦炎病毒。YFV黃熱病毒。SLV圣路易斯腦炎病毒。NT中和特異性血清型。
實(shí)施例28.由PAZ1產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的特征利用處于弗氏佐劑中的35ug純化的PAZ1 i.p免疫總計(jì)25只Balb/c小鼠，10只動(dòng)物于4次劑量后取血，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗DEN抗體。獲得了針對(duì)DEN-1的高抗體滴度，未獲得針對(duì)其它血清型的反應(yīng)性(表32和表35)。此外，進(jìn)行了HI分析，只發(fā)現(xiàn)針對(duì)DEN-3的陽(yáng)性滴度(表33和表35)。最后，進(jìn)行了體外中和分析，獲得針對(duì)DEN-3的中和滴度為1∶320。然而，未發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它血清型病毒感染的中和作用(表34和表35)。這些結(jié)果表明，PAZ1可激發(fā)高度血清型特異性的抗體。
表32.PAZ1免疫小鼠所獲血清的抗DEN-3抗體滴度。
表33.PAZ1免疫動(dòng)物血清的HI滴度。
*HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
表34.PAZ1免疫動(dòng)物血清的病毒中和分析。
*中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
表35.利用PAZ1免疫動(dòng)物血清通過(guò)ELISA、HI以及病毒中和進(jìn)行的針對(duì)所有病毒血清型的交叉反應(yīng)性分析。

*每種混合物由三種血清形成。
**HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
***中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
實(shí)施例29.獲得pAZ2利用序列表中序列號(hào)11和序列號(hào)13所示寡核苷酸，從DEN-3病毒株(Osatomi K.，Sumiyoshi H.Complete nucleotide sequence ofdengue type 3 virus genome RNA.Virology.1990.176(2)643-647)擴(kuò)增編碼DEN-3病毒包膜蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列(序列號(hào)39)。
利用XbaI/EcoRI消化pM84 His質(zhì)粒，產(chǎn)生包含編碼MDH蛋白質(zhì)和6個(gè)組氨酸序列的核苷酸序列(序列號(hào)26)的載體。該消化使得可以在MDH蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)內(nèi)插入PCR擴(kuò)增片段。連接以后，通過(guò)限制性酶消化來(lái)分析可能的重組子，測(cè)序陽(yáng)性克隆以驗(yàn)證連接。利用所選名為pAZ2的克隆(圖8和序列號(hào)42)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞MM294。菌落在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以后，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果獲得80kDA條帶，占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的20％。所獲蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)于MDH蛋白質(zhì)與DEN-3病毒DENe蛋白質(zhì)片段大小的總和。該蛋白質(zhì)在免疫印跡中可由HMAF抗DEN-3識(shí)別，命名為PAZ2(序列號(hào)43)。
實(shí)施例30.純化PAZ2蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化pAZ2的大腸桿菌菌株于37℃生長(zhǎng)，將獲得的生物質(zhì)通過(guò)弗氏壓碎器裂解。獲得可溶性及不溶性?xún)煞N形式的重組蛋白質(zhì)。利用7M脲提取伴隨不溶性組分的蛋白質(zhì)，將包含PAZ2蛋白質(zhì)的上清上樣G-25柱，以便去除離液劑。然后將獲得的組分上樣存在Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用40mM咪唑洗柱，100mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)。最后將純凈組分上樣G-25柱，獲得處于配制緩沖液(PBS)中的蛋白質(zhì)。該制劑供免疫學(xué)研究之用。
實(shí)施例31.PAZ2的抗原性特征利用不同多克隆血清和/或小鼠單克隆抗體以及針對(duì)登革的人陽(yáng)性血清進(jìn)行識(shí)別，鑒定純化的PAZ2組分的特征(表36)。
在斑點(diǎn)印跡中，利用HMAF抗DEN-3獲得的識(shí)別最強(qiáng)(高于利用PAZ1所獲識(shí)別)。針對(duì)其它血清型的HMAF的識(shí)別低于血清型3的情況。由其它黃病毒、如黃熱病毒以及圣路易斯腦炎病毒產(chǎn)生的抗體完全沒(méi)有任何識(shí)別作用。最后，測(cè)定了針對(duì)抗DEN-3的5個(gè)高滴度和3個(gè)低滴度人血清的反應(yīng)性，通過(guò)Western印跡和斑點(diǎn)印跡均獲得了顯著信號(hào)。
表36.PAZ2蛋白質(zhì)對(duì)單克隆和多克隆抗體的反應(yīng)性。
Abs**特異性*** PAZ2HMAF DEN-1 -HMAF DEN-2 -HMAF DEN-3 +++HMAF DEN-4 +HMAF EEE -HMAF YFV -HMAF SLV -Mab 3H5 NT-*總計(jì)使用10μg純化的PAZ2。按+至++評(píng)價(jià)所獲得的信號(hào)強(qiáng)度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀釋使用。
***EEE馬腦炎病毒。YFV黃熱病毒。SLV圣路易斯腦炎病毒。NT中和特異性血清型。
實(shí)施例32.由PAZ2產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的特征利用處于弗氏佐劑中的20ug純化的PAZ2 i.p免疫總計(jì)25只Balb/c小鼠，10只動(dòng)物于4次劑量后取血，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗DEN抗體。獲得了針對(duì)DEN-3的高抗體滴度，未獲得針對(duì)其它血清型的反應(yīng)性(表37和表40)。此外，進(jìn)行了HI分析，只發(fā)現(xiàn)針對(duì)DEN-3的陽(yáng)性滴度(表38和表40)。最后，進(jìn)行了體外中和分析，獲得針對(duì)DEN-3的中和滴度為1∶1280(表39)。未發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它血清型病毒感染的中和作用(表40)。
表37.PAZ2免疫小鼠所獲血清的抗DEN-3抗體滴度。
表38.PAZ2免疫動(dòng)物血清的HI滴度。
*HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
表39.PAZ2免疫動(dòng)物血清的病毒中和分析。
*中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
表40.利用PAZ2免疫動(dòng)物血清通過(guò)ELISA、HI以及病毒中和進(jìn)行的針對(duì)所有病毒血清型的交叉反應(yīng)性分析。

*每種混合物由三種血清形成。
**HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
***中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
實(shí)施例33.獲得pAZ3利用序列表中序列號(hào)14和序列號(hào)15所示寡核苷酸，從DEN-3病毒株(Osatomi K.，Sumiyoshi H.Complete nucleotide sequence ofdengue type 3 virus genome RNA.Virology.1990.176(2)643-647)擴(kuò)增編碼DEN-3病毒包膜蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列(序列號(hào)39)。
利用BamHI/BamHI消化pD4質(zhì)粒，產(chǎn)生包含編碼MDH蛋白質(zhì)和6個(gè)組氨酸序列并且沒(méi)有終止密碼子的核苷酸序列(序列號(hào)29)的載體。該消化使得可以在MDH蛋白質(zhì)C末端區(qū)之后融合PCR擴(kuò)增片段。連接以后，通過(guò)限制性酶消化來(lái)分析可能的重組子，測(cè)序陽(yáng)性克隆以驗(yàn)證連接。利用所選名為pAZ3的克隆(圖9和序列號(hào)44)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞W3110。菌落在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以后，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果獲得80kDA條帶，占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的20％。所獲蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)于MDH蛋白質(zhì)與DEN-3病毒DENe蛋白質(zhì)片段大小的總和。該蛋白質(zhì)在免疫印跡中可由HMAF抗DEN-3識(shí)別，命名為PAZ3(序列號(hào)45)。
實(shí)施例34.純化PAZ3蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化pAZ3的大腸桿菌菌株于37℃生長(zhǎng)，將獲得的生物質(zhì)通過(guò)弗氏壓碎器裂解。獲得可溶性及不溶性?xún)煞N形式的重組蛋白質(zhì)。利用7M脲從不溶性組分中提取蛋白質(zhì)，將包含PAZ3蛋白質(zhì)的上清上樣G-25柱，以便去除離液劑。然后將獲得的組分上樣存在Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用45mM咪唑洗柱，230mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)。最后將純凈的蛋白質(zhì)組分上樣G-25柱，獲得處于配制緩沖液(PBS)中的蛋白質(zhì)。該制劑供免疫學(xué)研究之用。
實(shí)施例35.PAZ3的抗原性特征利用不同多克隆血清和/或小鼠單克隆抗體以及針對(duì)登革的人陽(yáng)性血清進(jìn)行識(shí)別，鑒定純化的PAZ3組分的特征(表26)。
在斑點(diǎn)印跡中，利用HMAF抗DEN-3獲得的識(shí)別最強(qiáng)。針對(duì)其它血清型的HMAF的識(shí)別低于血清型3的情況。由其它黃病毒、如黃熱病毒以及圣路易斯腦炎病毒產(chǎn)生的抗體完全沒(méi)有任何識(shí)別作用。最后，測(cè)定了針對(duì)抗DEN-3的3個(gè)高滴度和3個(gè)低滴度人血清的反應(yīng)性，通過(guò)Western印跡和斑點(diǎn)印跡均獲得了顯著信號(hào)。
表41.PAZ3蛋白質(zhì)對(duì)單克隆和多克隆抗體的反應(yīng)性。
Abs**特異性*** PAZ3HMAFDEN-1 -HMAFDEN-2 -HMAFDEN-3 +++HMAFDEN-4 +HMAFEEE -HMAFYFV -HMAFSLV -Mab 3H5 NT -
*總計(jì)使用10μg純化的PAZ3。按+至++評(píng)價(jià)所獲得的信號(hào)強(qiáng)度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀釋使用。
***EEE馬腦炎病毒。YFV黃熱病毒。SLV圣路易斯腦炎病毒。NT中和特異性血清型。
實(shí)施例36.由PAZ3產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的特征利用處于弗氏佐劑中的20ug純化的PAZ3 i.p免疫總計(jì)25只Balb/c小鼠，10只動(dòng)物于4次劑量后取血，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗DEN抗體。獲得了針對(duì)DEN-3的高抗體滴度，未獲得針對(duì)其它血清型的反應(yīng)性(表42和表45)。此外，進(jìn)行了HI分析，只發(fā)現(xiàn)針對(duì)DEN-3的陽(yáng)性滴度(表43和表45)。最后，進(jìn)行了體外中和分析，獲得針對(duì)DEN-3的中和滴度為1∶1280(表44)。未發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它血清型病毒感染的中和作用(表45)。
表42.PAZ3免疫小鼠所獲血清的抗DEN-3抗體滴度。
表43.PAZ3免疫動(dòng)物血清的HI滴度。
*HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
表44.PAZ3免疫動(dòng)物血清的病毒中和分析。
*中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
表45.利用PAZ3免疫動(dòng)物血清通過(guò)ELISA、HI以及病毒中和進(jìn)行的針對(duì)所有病毒血清型的交叉反應(yīng)性分析。

*每種混合物由三種血清形成。
**HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
***中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
實(shí)施例37.獲得pID1利用序列表中序列號(hào)17和序列號(hào)18所示寡核苷酸，從DEN-4病毒株基因型(Zhao B.，Mackow E.R.，Buckler-White A.J.，MarkoffL.，Chancock R.M.，Lai C.-J.，Makino Y.Cloning full-lengthDengue type 4 viral DNA sequencesAnalysis of genes coding forstructural proteins.Virology 1986.15577-88)擴(kuò)增編碼DEN-4病毒包膜蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列(序列號(hào)46)。
利用XbaI/BamHI消化pM108 His質(zhì)粒，產(chǎn)生包含編碼MDH的N末端區(qū)和6個(gè)組氨酸序列的核苷酸序列(序列號(hào)23)的載體。連接以后，通過(guò)限制性酶消化來(lái)分析可能的重組子，測(cè)序陽(yáng)性克隆以驗(yàn)證連接。利用所選名為pID1的克隆(圖10和序列號(hào)47)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞W3110。菌落在Luria Bertani(LB)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以后，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果獲得25kDA條帶，占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的10％。所獲蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)于MDH蛋白質(zhì)N末端區(qū)與DEN-4病毒DENe蛋白質(zhì)片段大小的總和。在免疫印跡中，該蛋白質(zhì)可由HMAF中包含的抗DEN-4多克隆抗體(PA)識(shí)別。將該蛋白質(zhì)命名為PID1(序列號(hào)48)。
實(shí)施例38.純化蛋白質(zhì)PID1轉(zhuǎn)化pID1的大腸桿菌菌株于37℃生長(zhǎng)，將獲得的生物質(zhì)通過(guò)弗氏壓碎器裂解。所獲重組蛋白質(zhì)主要為伴隨細(xì)胞裂解沉淀的不溶性形式。利用6M脲從沉淀中提取蛋白質(zhì)，將包含PID1蛋白質(zhì)的上清上樣G-25柱，以便去除離液劑。然后將獲得的組分上樣存在Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。利用60mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)，將獲得的體積上樣G-25柱，最終獲得處于配制緩沖液(PBS)中的蛋白質(zhì)。該制劑供免疫學(xué)研究之用。
實(shí)施例39.PID1的抗原性特征利用不同多克隆血清和/或小鼠單克隆抗體以及針對(duì)登革的人陽(yáng)性血清進(jìn)行識(shí)別，鑒定純化的PID1組分的特征(表46)。
在斑點(diǎn)印跡中，利用HMAF抗DEN-4獲得的識(shí)別最強(qiáng)。針對(duì)其它血清型的HMAF的識(shí)別低于血清型4的情況。由其它黃病毒、如黃熱病毒以及圣路易斯腦炎病毒產(chǎn)生的抗體完全沒(méi)有任何識(shí)別作用。最后，測(cè)定了針對(duì)抗DEN-4的3個(gè)高滴度和3個(gè)低滴度人血清的反應(yīng)性，通過(guò)Western印跡和斑點(diǎn)印跡均獲得了顯著信號(hào)。
表46.PID1蛋白質(zhì)對(duì)單克隆和多克隆抗體的反應(yīng)性。
Abs**特異性*** PID1HMAFDEN-1 -HMAFDEN-2 -HMAFDEN-3 +HMAFDEN-4 ++HMAFEEE-HMAFYFV-HMAFSLV-Mab 3H5 NT -*總計(jì)使用10μg純化的PID1。按+至++評(píng)價(jià)所獲得的信號(hào)強(qiáng)度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀釋使用。
***EEE馬腦炎病毒。YFV黃熱病毒。SLV圣路易斯腦炎病毒。NT中和特異性血清型。
實(shí)施例40.由PID1產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的特征利用處于弗氏佐劑中的35ug純化的PID1 i.p免疫總計(jì)25只Balb/c小鼠，10只動(dòng)物于4次劑量后取血，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗DEN抗體。獲得了針對(duì)DEN-1的高滴度抗體，未獲得針對(duì)其它血清型的反應(yīng)性(表47和表50)。此外，進(jìn)行了HI分析，只發(fā)現(xiàn)針對(duì)DEN-4的陽(yáng)性滴度(表48和表50)。最后，進(jìn)行了體外中和分析，獲得針對(duì)DEN-4的中和滴度為1∶320。然而，未發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它血清型病毒感染的中和作用(表49和表50)。這些結(jié)果表明，PID1可激發(fā)高度血清型特異性的抗體。
表47.PID1免疫小鼠所獲血清的抗DEN-4抗體滴度。
表48.PID1免疫動(dòng)物血清的HI滴度。
*HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
表49.PID1免疫動(dòng)物血清的病毒中和分析。
*中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
表50.利用PID1免疫動(dòng)物血清通過(guò)ELISA、HI以及病毒中和進(jìn)行的針對(duì)所有病毒血清型的交叉反應(yīng)性分析。

*每種混合物由三種血清形成。
**HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
***中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
實(shí)施例41.獲得pID2利用序列表中序列號(hào)16和序列號(hào)18所示寡核苷酸，從DEN-4病毒株(Zhao B.，Mackow E.R.，Buckler-White A.J.，Markoff L.，Chancock R.M.，Lai C.-J.，Makino Y.Cloning full-length Denguetype 4 viral DNA sequencesAnalysis of genes coding forstructural proteins.Virology 1986.15577-88)擴(kuò)增編碼DEN-4病毒包膜蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列(序列號(hào)46)。
利用XbaI/EcoRI消化pM84 His質(zhì)粒，產(chǎn)生包含編碼MDH蛋白質(zhì)和6個(gè)組氨酸序列的核苷酸序列(序列號(hào)26)的載體。該消化使得可以在MDH蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)內(nèi)插入PCR擴(kuò)增片段。連接以后，通過(guò)限制性酶消化來(lái)分析可能的重組子，測(cè)序陽(yáng)性克隆以驗(yàn)證連接。利用所選名為pID2的克隆(圖11和序列號(hào)49)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞MM294。菌落在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以后，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果獲得80kDA條帶，占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的20％。所獲蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)于MDH蛋白質(zhì)與DEN-4病毒DENe蛋白質(zhì)片段大小的總和。該蛋白質(zhì)在免疫印跡中可由HMAF抗DEN-4識(shí)別，命名為PID2(序列號(hào)50)。
實(shí)施例42.純化PID2蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化pID2的大腸桿菌菌株于37℃生長(zhǎng)，將獲得的生物質(zhì)通過(guò)弗氏壓碎器裂解。獲得可溶性及不溶性?xún)煞N形式的重組蛋白質(zhì)。利用6M脲提取伴隨不溶性組分的蛋白質(zhì)，將包含PID2蛋白質(zhì)的上清上樣G-25柱，以便去除離液劑。然后將獲得的組分上樣存在Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用30mM咪唑洗柱，250mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)。最后將純凈組分上樣G-25柱，獲得處于配制緩沖液(PBS)中的蛋白質(zhì)。該制劑供免疫學(xué)研究之用。
實(shí)施例43.PID2的抗原性特征利用不同多克隆血清和/或小鼠單克隆抗體以及針對(duì)登革的人陽(yáng)性血清進(jìn)行識(shí)別，鑒定純化的PID2組分的特征(表51)。
在斑點(diǎn)印跡中，利用HMAF抗DEN-4獲得的識(shí)別最強(qiáng)(高于利用PID1所獲識(shí)別)。針對(duì)其它血清型的HMAF的識(shí)別低于血清型4的情況。由其它黃病毒、如黃熱病毒以及圣路易斯腦炎病毒產(chǎn)生的抗體完全沒(méi)有任何識(shí)別作用。最后，測(cè)定了針對(duì)抗DEN-3的5個(gè)高滴度和3個(gè)低滴度人血清的反應(yīng)性，通過(guò)Western印跡和斑點(diǎn)印跡均獲得了顯著信號(hào)。
表51.PID2蛋白質(zhì)對(duì)單克隆和多克隆抗體的反應(yīng)性。
Abs**特異性*** PID2HMAF DEN-1 -HMAF DEN-2 -HMAF DEN-3 +HMAF DEN-4 +++HMAF EEE-HMAF YFV-HMAF SLV-Mab 3H5NT -*總計(jì)使用10μg純化的PID2。按+至++評(píng)價(jià)所獲得的信號(hào)強(qiáng)度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀釋使用。
***EEE馬腦炎病毒。YFV黃熱病毒。SLV圣路易斯腦炎病毒。NT中和特異性血清型。
實(shí)施例44.由PID2產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的特征利用處于弗氏佐劑中的20ug純化的PID2 i.p免疫總計(jì)25只Balb/c小鼠，10只動(dòng)物于4次劑量后取血，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗DEN抗體。獲得了針對(duì)DEN-4的高抗體滴度，未獲得針對(duì)其它血清型的反應(yīng)性(表52和表55)。此外，進(jìn)行了HI分析，只發(fā)現(xiàn)針對(duì)DEN-4的陽(yáng)性滴度(表53和表55)。最后，進(jìn)行了體外中和分析，獲得針對(duì)DEN-4的中和滴度為1∶1280(表54)。未發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它血清型病毒感染的中和作用(表55)。
表52.PID2免疫小鼠所獲血清的抗DEN-4抗體滴度。
表53.PID2免疫動(dòng)物血清的HI滴度。
*HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
表54.PID2免疫動(dòng)物血清的病毒中和分析。
*中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
表55.利用PID2免疫動(dòng)物血清通過(guò)ELISA、HI以及病毒中和進(jìn)行的針對(duì)所有病毒血清型的交叉反應(yīng)性分析。

*每種混合物由三種血清形成。
**HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
***中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
實(shí)施例45.獲得pID3利用序列表中序列號(hào)19和序列號(hào)20所示寡核苷酸，從DEN-4病毒株(Zhao B.，Mackow E.R.，Buckler-White A.J.，Markoff L.，Chancock R.M.，Lai C.-J.，Makino Y.Cloning full-length Denguetype 4 viral DNA sequencesAnalysis of genes coding forstructural proteins.Virology 1986.15577-88)擴(kuò)增編碼DEN-4病毒包膜蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列(序列號(hào)46)。
利用BamHI/BamHI消化pD4質(zhì)粒，產(chǎn)生包含編碼MDH蛋白質(zhì)和6個(gè)組氨酸序列并且沒(méi)有終止密碼子的核苷酸序列(序列號(hào)29)的載體。該消化使得可以在MDH蛋白質(zhì)C末端區(qū)之后融合PCR擴(kuò)增片段。連接以后，通過(guò)限制性酶消化來(lái)分析可能的重組子，測(cè)序陽(yáng)性克隆以驗(yàn)證連接。利用所選名為pID3的克隆(圖12和序列號(hào)51)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞W3110。菌落在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以后，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果獲得80kDA條帶，占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的20％。所獲蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)于MDH蛋白質(zhì)與DEN-4病毒DENe蛋白質(zhì)片段大小的總和。該蛋白質(zhì)在免疫印跡中可由HMAF抗DEN-4識(shí)別，命名為PID3(序列號(hào)52)。
實(shí)施例46.純化蛋白質(zhì)PID3轉(zhuǎn)化pID3的大腸桿菌菌株于37℃生長(zhǎng)，將獲得的生物質(zhì)通過(guò)弗氏壓碎器裂解。獲得可溶性及不溶性?xún)煞N形式的重組蛋白質(zhì)。利用6M脲從不溶性組分中提取蛋白質(zhì)，將包含PID3蛋白質(zhì)的上清上樣G-25柱，以便去除離液劑。然后將獲得的組分上樣存在Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用45mM咪唑洗柱，200mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)。最后將純凈的蛋白質(zhì)組分上樣G-25柱，獲得處于配制緩沖液(PBS)中的蛋白質(zhì)。該制劑供免疫學(xué)研究之用。
實(shí)施例47.PID3的抗原性特征利用不同多克隆血清和/或小鼠單克隆抗體以及針對(duì)登革的人陽(yáng)性血清進(jìn)行識(shí)別，鑒定純化的PID3組分的特征(表56)。
在斑點(diǎn)印跡中，利用HMAF抗DEN-4獲得的識(shí)別最強(qiáng)。針對(duì)其它血清型的HMAF的識(shí)別低于血清型4的情況。由其它黃病毒、如黃熱病毒以及圣路易斯腦炎病毒產(chǎn)生的抗體完全沒(méi)有任何識(shí)別作用。最后，測(cè)定了針對(duì)抗DEN-4的3個(gè)高滴度和3個(gè)低滴度人血清的反應(yīng)性，通過(guò)Western印跡和斑點(diǎn)印跡均獲得了顯著信號(hào)。
表56.PID3蛋白質(zhì)對(duì)單克隆和多克隆抗體的反應(yīng)性。
Abs**特異性*** PID3HMAF DEN-1 -HMAF DEN-2 -HMAF DEN-3 +HMAF DEN-4 +++HMAF EEE -HMAF YFV -HMAF SLV -Mab 3H5 NT-*總計(jì)使用10μg純化的PID3。按+至++評(píng)價(jià)所獲得的信號(hào)強(qiáng)度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀釋使用。
***EEE馬腦炎病毒。YFV黃熱病毒。SLV圣路易斯腦炎病毒。NT中和特異性血清型。
實(shí)施例48.由PID3產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的特征利用處于弗氏佐劑中的20ug純化的PAZ3 i.p免疫總計(jì)25只Balb/c小鼠，10只動(dòng)物于4次劑量后取血，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗DEN抗體。獲得了針對(duì)DEN-4的高抗體滴度，未獲得針對(duì)其它血清型的反應(yīng)性(表57和表60)。此外，進(jìn)行了HI分析，只發(fā)現(xiàn)針對(duì)DEN-4的陽(yáng)性滴度(表58和表60)。最后，進(jìn)行了體外中和分析，獲得針對(duì)DEN-4的中和滴度為1∶1280(表59)。未發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它血清型病毒感染的中和作用(表60)。
表57.PID3免疫小鼠所獲血清的抗DEN-4抗體滴度。
表58.PID3免疫動(dòng)物血清的HI滴度。
*HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
表59.PID3免疫動(dòng)物血清的病毒中和分析。
*中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
表60.利用PID3免疫動(dòng)物血清通過(guò)ELISA、HI以及病毒中和進(jìn)行的針對(duì)所有病毒血清型的交叉反應(yīng)性分析。

*每種混合物由三種血清形成。
**HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
***中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
實(shí)施例49.獲得pD4D2利用序列表中序列號(hào)16和序列號(hào)21所示寡核苷酸，從DEN-4病毒株(Zhao B.，Mackow E.R.，Buckler-White A.J.，Markoff L.，Chancock R.M.，Lai C.-J.，Makino Y.Cloning full-length Denguetype 4 viral DNA sequencesAnalysis of genes coding forstructural proteins.Virology 1986.15577-88)擴(kuò)增編碼DEN-4病毒包膜E蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列(序列號(hào)46)。
利用Xba/XbaI消化pLL3質(zhì)粒，產(chǎn)生載體，其中包含MDH基因外加位于該基因3’區(qū)的6個(gè)組氨酸序列以及位于3’末端的DEN-2E片段序列。結(jié)果獲得了融合同一MDH基因的血清型2和4E蛋白質(zhì)的兩個(gè)區(qū)域。連接以后，通過(guò)限制性酶消化來(lái)分析可能的重組子，測(cè)序陽(yáng)性克隆以驗(yàn)證連接。利用所選名為pD4D2的克隆(圖13和序列號(hào)53)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞MM294。菌落在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以后，對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果獲得110kDA條帶，占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的20％。所獲蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)于MDH蛋白質(zhì)與登革病毒DENe蛋白質(zhì)的兩個(gè)片段的總和。該蛋白質(zhì)可由HMAF中包含的抗DEN-2和抗DEN-4多克隆抗體識(shí)別。將該蛋白質(zhì)命名為PD4D2(序列號(hào)54)。
實(shí)施例50.純化PD4D2蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化pD4D2的大腸桿菌菌株于37℃生長(zhǎng)，將獲得的生物質(zhì)通過(guò)弗氏壓碎器裂解。獲得的重組蛋白質(zhì)為可溶性或不溶性形式。利用6M脲從沉淀中提取蛋白質(zhì)，將包含PD4D2蛋白質(zhì)的上清上樣G-25柱，以便去除離液劑。然后將獲得的組分上樣存在Cu++離子的螯合-瓊脂糖FF柱(Pharmacia，UK)。使用30mM咪唑進(jìn)行洗滌步驟，由250mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)。最后將純凈組分上樣G-25柱，獲得處于配制緩沖液(PBS)中的蛋白質(zhì)，用于免疫學(xué)研究。
實(shí)施例51.PD4D2的抗原性特征利用不同多克隆血清和/或小鼠單克隆抗體以及針對(duì)登革的人陽(yáng)性血清進(jìn)行識(shí)別，鑒定純化的PD4D2組分的特征(表61)。
在斑點(diǎn)印跡中，利用HMAF抗DEN-2和抗DEN-4獲得的識(shí)別最強(qiáng)。兩種其它血清型的識(shí)別低于血清型2和4的情況。由其它黃病毒、如黃熱病毒以及圣路易斯腦炎病毒產(chǎn)生的抗體完全沒(méi)有任何識(shí)別作用。另一方面，Mab 3H5確實(shí)具有反應(yīng)性，與利用PLL2和PLL3所獲得的反應(yīng)性類(lèi)似。最后，測(cè)定了針對(duì)抗DEN-2和DEN-4的高、低滴度人血清的反應(yīng)性，通過(guò)Western印跡和斑點(diǎn)印跡均獲得了顯著信號(hào)。
表6 1.PD4D2蛋白質(zhì)對(duì)單克隆和多克隆抗體的反應(yīng)性。
Abs**特異性*** PD4D2HMAF DEN-1 -HMAF DEN-2 +++HMAF DEN-3 -HMAF DEN-4 +++HMAF EEE-HMAF YFV-HMAF SLV-Mab 3H5 NT -*總計(jì)使用10μg純化的PD4D2。按+至++評(píng)價(jià)所獲得的信號(hào)強(qiáng)度。
**HMAF按1∶100使用，而Mab 3H5按1∶1000稀釋使用。
***EEE馬腦炎病毒。YFV黃熱病毒。SLV圣路易斯腦炎病毒。NT中和特異性血清型。
實(shí)施例52.由PD4D2產(chǎn)生的抗體應(yīng)答的特征利用處于弗氏佐劑中的20ug純化的PD4D2 i.p免疫總計(jì)25只Balb/c小鼠，10只動(dòng)物于4次劑量后取血，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗DEN抗體。獲得了針對(duì)DEN-2和DEN-4的高抗體滴度，未獲得針對(duì)其它血清型的反應(yīng)性(表62和表65)。此外，進(jìn)行了血細(xì)胞凝集抑制分析(HI)，只發(fā)現(xiàn)針對(duì)DEN-2和DEN-4的陽(yáng)性滴度(表63和表65)。最后，進(jìn)行了體外中和分析，獲得針對(duì)DEN-2的中和滴度＞1∶1280，針對(duì)DEN-4的中和滴度＞1∶1280(表64)。未發(fā)現(xiàn)針對(duì)其它血清型病毒感染的中和作用(表65)。
表62.PD4D2免疫小鼠所獲血清的抗DEN-2和DEN-4抗體滴度。
表63.PD4D2免疫動(dòng)物血清的HI滴度。
*HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
表64.PD4D2免疫動(dòng)物血清的病毒中和分析。
*中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
表65.利用PD4D2免疫動(dòng)物血清通過(guò)ELISA、HI以及病毒中和進(jìn)行的針對(duì)所有病毒血清型的交叉反應(yīng)性分析。

*每種混合物由三種血清形成。
**HI滴度可定義為能夠抑制針對(duì)8個(gè)血細(xì)胞凝集病毒單位的鵝紅血球血細(xì)胞凝集的最高稀釋度。
***中和滴度可定義為使病毒噬斑數(shù)減少50％的最高血清稀釋度。
實(shí)施例53.保護(hù)性分析為評(píng)價(jià)利用各種所分析的變體免疫小鼠所引起的對(duì)同源致死性DEN攻擊的保護(hù)作用，每組使用15只小鼠。每只小鼠通過(guò)顱內(nèi)(intracraneal)接種接受一個(gè)100 LD50劑量的致死性DEN，觀(guān)察21天，研究致死百分率。利用4種病毒性制劑(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)免疫每組15只小鼠，用作陽(yáng)性對(duì)照。這些對(duì)照組的全部小鼠存活，陰性對(duì)照組在攻擊后7-11天開(kāi)始生病；從而獲得100％的死亡率。最后，利用所研究的融合蛋白質(zhì)免疫的各組具有80％-100％的保護(hù)作用，在所有情況下均具有相對(duì)于對(duì)照組的顯著性差異(表66)。
表66.利用所分析的蛋白質(zhì)變體免疫的小鼠在同源致死性登革病毒攻擊下的存活百分率。
*按(存活小鼠數(shù))/(小鼠總數(shù))計(jì)算。攻擊后21天取得幸存者數(shù)據(jù)。就利用pD4D2免疫的小鼠而言，15只受到DEN-4攻擊，15只受到DEN-2攻擊。
實(shí)施例54.淋巴增殖性反應(yīng)利用包含DEN-2E片段的嵌合蛋白質(zhì)(PLL1、PLL2和PLL3)免疫的各組以及安慰劑組的動(dòng)物，在最后一次給藥15天以后處死。然后收集動(dòng)物的脾臟，研究其針對(duì)登革病毒4種血清型的淋巴細(xì)胞增殖性反應(yīng)。表67顯示所得刺激指數(shù)的結(jié)果，證明獲得了血清型特異性應(yīng)答。
表67.PLL1、PLL2和PLL3免疫小鼠的淋巴細(xì)胞針對(duì)4種登革病毒血清型的刺激指數(shù)。
*刺激指數(shù)自發(fā)合成DNA的樣品每分鐘計(jì)數(shù)與對(duì)照每分鐘計(jì)數(shù)之比(cocient)。
**促分裂原(mitogen)植物凝集素(Phytohemagglutinin)。
序列表<110>CENTER FOR GENETIC ENGINEERING AND BIOTECNOLOGY<120>編碼可誘導(dǎo)抗病毒效應(yīng)的蛋白質(zhì)的嵌合鏈<130>Dengue<140>
<141>
<160>54<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>25<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(25)<223>擴(kuò)增DENe-2片段的Xba-I引物的序列<400>1cttctagaca ggctgcgcat ggaca 25<210>2<211>29<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(29)<223>擴(kuò)增DENe-2片段的Bam-HI引物的序列<400>2gtggatcctt accctcccag gcttccaaa29<210>3<211>25<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(25)<223>擴(kuò)增DENe-2片段的Eco-RI引物的序列<400>3atgaattcac gcctcccaga gatcc 25
<210>4<211>21<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(21)<223>擴(kuò)增DENe-2片段的Bam-HI引物的序列<400>4cttggatcca ggctgagaat g 21<210>5<211>31<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(31)<223>擴(kuò)增DENe-2片段的Bam-HI引物的序列<400>5gaggatcctt aaccacccag agacccaaaa t 31<210>6<211>25<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(25)<223>擴(kuò)增DENe-1片段的Xba-I引物的序列<400>6cttctagaca ggctcaaaat ggata 25<210>7<211>28<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(28)<223>擴(kuò)增DENe-1片段的Bam-HI引物的序列<400>7gaggatcctt acccgccaat agaaccga 28
<210>8<211>25<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(25)<223>擴(kuò)增DENe-1片段的Eco-RI引物的序列<400>8acgaattcac ccctcctata gatcc 25<210>9<211>24<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(24)<223>擴(kuò)增DENe-1片段的Bam-HI引物的序列<400>9acaccttgga tccagactaa aaat 24<210>10<211>26<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(26)<223>擴(kuò)增DENe-1片段的Bam-HI引物的序列<400>10ccggatccgt gaattaccca cctata26<210>11<211>29<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(29)<223>擴(kuò)增DENe-3片段的Xba-I引物的序列<400>11tttctagata gactcaagat ggacaaatt 29<210>12
<211>28<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(28)<223>擴(kuò)增DENe-3片段的Bam-HI引物的序列<400>12gaggatcctt aaccacccac tgaaccaa 28<210>13<211>25<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(25)<223>擴(kuò)增DENe-3片段的Eco-RI引物的序列<400>13aagaattcac accacccaca gatcc 25<210>14<211>23<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(23)<223>擴(kuò)增DENe-3片段的Bam-HI引物的序列<400>14acttaggatc cagactcaag atg 23<210>15<211>26<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(26)<223>擴(kuò)增DENe-3片段的Bam-HI引物的序列<400>15gaggatcctt aaccacccac tgaacc26<210>16<211>30
<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(30)<223>擴(kuò)增DENe-4片段的Xba-I引物的序列<400>16cttctagaca aagtgcgtat ggagaaattg30<210>17<211>28<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(28)<223>擴(kuò)增DENe-4片段的Bam-HI引物的序列<400>17gaggatcctt aaccaccaac agaaccaa 28<210>18<211>25<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(25)<223>擴(kuò)增DENe-4片段的Eco-RI引物的序列<400>18atgaattcag tccaccaacg ctacc 25<210>19<211>27<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(27)<223>擴(kuò)增DENe-4片段的Bam-HI引物的序列<400>19ggccatctag gatccaaagt gcgtatg27<210>20<211>28<212>DNA
<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(28)<223>擴(kuò)增DENe-4片段的Bam-HI引物的序列<400>20gaggatcctt agccaccaac cgaaccaa 28<210>21<211>26<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>引物-結(jié)合<222>(1)..(26)<223>擴(kuò)增DENe-4片段的Xba-I引物的序列<400>21attctagaag accaccaacg gaacca26<210>22<211>429<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(426)<223>編碼DEN-2包膜蛋白的286-426位氨基酸的核苷酸序列<400>22gacaggctga gaatggacaa actacagctc aaaggaatgt catactctat gtgtacagga 60aagtttaaaa ttgtgaagga aatagcagaa acacaacatg gaacaatagt tatcagagta 120caatatgaag gggacggctc tccatgtaag atcccttttg agataatgga tttggaaaaa 180agacacgtct taggtcgcct gattacagtt aacccgatcg taacagaaaa agatagccca 240gtcaacatag aagcagaacc tccattcgga gacagctaca tcatcatagg agtagagccg 300ggacaattga aactcaactg gtttaagaaa ggaagttcca tcggccaaat gtttgagaca 360acaatgagag gagcgaagag aatggccatt ttaggtgaca cagcctggga ttttggatcc 420ctgggagga 429<210>23<211>168<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(168)<223>編碼MDH頭45個(gè)氨基酸的核苷酸序列<400>23
atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagac 168<210>24<211>603<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(603)<223>質(zhì)粒pLL1中編碼quimeric蛋白的核苷酸序列<400>24atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagacag gctgcgcatg 180gacaaactac agctcaaagg aatgtcatac tctatgtgta caggaaagtt taaaattgtg 240aaggaaatag cagaaacaca acatggaaca atagttatca gagtacaata tgaaggggac 300ggctctccat gtaagatccc ttttgagata atggatttgg aaaaaagaca cgtcttaggt 360cgcctgatta cagttaaccc gatcgtaaca gaaaaagata gcccagtcaa catagaagca 420gaacctccat tcggagacag ctacatcatc ataggagtag agccgggaca attgaaactc 480aactggttta agaaaggaag ttccatcggc caaatgtttg agacaacaat gagaggagcg 540aagagaatgg ccattttagg tgacacagcc tgggattttg gaagcctggg agggtaagga 600tcc603<210>25<211>195<212>PRT<213>大腸桿菌<220>
<221>鏈<222>(1)..(195)<223>PLL1蛋白的氨基酸序列<400>25His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu1 5 10 15Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala20 25 30Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile35 40 45Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Arg Met Agp Lys Leu Gln Leu Lys Gly50 55 60Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile65 70 75 80Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly85 90 95Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys100 105 110
Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu115 120 125Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser130 135 140Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe145 150 155 160Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly165 170 175Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser180 185 190Leu Gly Gly195<210>26<211>1851<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(1851)<223>質(zhì)粒pM84 His中的MDH的核苷酸序列<400>26atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagaa 180gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatgaatt cgatggacgt acctgctgaa 240gttgcaggcg tagtcaaaga agttaaagtt aaagtcggcg acaaaatctc tgaaggtggt 300ttgattgtcg tcgttgaagc tgaaggcacg gcagccgctc ctaaagccga agcggctgcc 360gccccggcgc aagaagcccc taaagctgcc gctcctgctc cgcaagccgc gcaattcggc 420ggttctgccg atgccgagta cgacgtggtc gtattgggtg gcggtcccgg cggttactcc 480gctgcatttg ccgctgccga tgaaggcttg aaagtcgcca tcgtcgaacg ttacaaaact 540ttgggcggcg tttgcctgaa cgtcggctgt atcccttcca aagccttgtt gcacaatgcc 600gccgttatcg acgaagtgcg ccacttggct gccaacggta tcaaataccc cgagccggaa 660ctcgacatcg atatgcttcg cgcctacaaa gacggcgtag tttcccgcct cacgggcggt 720ttggcaggta tggcgaaaag ccgtaaagtg gacgttatcc aaggcgacgg gcaattctta 780gatccgcacc acttggaagt gtcgctgact gccggcgacg cgtacgaaca ggcagcccct 840accggcgaga aaaaaatcgt tgccttcaaa aactgtatca ttgcagcagg cagccgcgta 900accaaactgc ctttcattcc tgaagatccg cgcatcatcg attccagcgg cgcattggct 960ctgaaagaag taccgggcaa actgctgatt atcggcggcg gcattatcgg cctcgagatg 1020ggtacggttt acagcacgct gggttcgcgt ttggatgtgg ttgaaatgat ggacggcctg 1080atgcaaggcg cagaccgcga tttggtaaaa gtatggcaaa aacaaaacga ataccgtttt 1140gacaacatta tggtcaacac caaaaccgtt gcagttgagc cgaaagaaga cggcgtttac 1200gttacctttg aaggcgcgaa cgcgcctaaa gagccgcaac gctacgatgc cgtattggtt 1260gccgccggcc gcgcgcccaa cggcaaactc atcagcgcgg aaaaagcagg cgttgccgta 1320accgatcgcg gcttcatcga agtggacaaa caaatgcgta ccaatgtgcc gcacatctac 1380gccatcggcg acatcgtcgg tcagccgatg ttggcgcaca aagccgttca cgaaggccac 1440gttgccgccg aaaactgcgc cggccacaaa gcctacttcg acgcacgcgt gattccgggc 1500gttgcctaca cttcccccga agtggcgtgg gtgggcgaaa ccgaactgtc cgccaaagcc 1560tccggccgca aaatcaccaa agccaacttc ccgtgggcgg cttccggccg tgcgattgcc 1620aacggttgcg acaagccgtt taccaagctg atttttgatg ccgaaaccgg ccgcatcatc 1680ggcggcggca ttgtcggtcc gaacggtggc gatatgatcg gcgaagtctg ccttgccatc 1740gaaatgggct gcgacgcggc agacatcggc aaaaccatcc acccgcaccc gggcgaatcc 1800
atcggtatgg cggcggaagt ggcattgggt acttgtaccg acaaaaaaaa a 1851<210>27<211>2253<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(2253)<223>質(zhì)粒pLL2中的quimeric蛋白的核苷酸序列<400>27atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180aggctgcgca tggacaaact acagctcaaa ggaatgtcat actctatgtg tacaggaaag 240tttaaaattg tgaaggaaat agcagaaaca caacatggaa caatagttat cagagtacaa 300tatgaagggg acggctctcc atgtaagatc ccttttgaga taatggattt ggaaaaaaga 360cacgtcttag gtcgcctgat tacagttaac ccgatcgtaa cagaaaaaga tagcccagtc 420aacatagaag cagaacctcc attcggagac agctacatca tcataggagt agagccggga 480caattgaaac tcaactggtt taagaaagga agttccatcg gccaaatgtt tgagacaaca 540atgagaggag cgaagagaat ggccatttta ggtgacacag cctgggattt tggatctctg 600ggaggcgtga attcgatgaa ttcgatggac gtacctgctg aagttgcagg cgtagtcaaa 660gaagttaaag ttaaagtcgg cgacaaaatc tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720gctgaaggca cggcagccgc tcctaaagcc gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc gcgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840tacgacgtgg tcgtattggg tggcggtccc ggcggttact ccgctgcatt tgccgctgcc 900gatgaaggct tgaaagtcgc catcgtcgaa cgttacaaaa ctttgggcgg cgtttgcctg 960aacgtcggct gtatcccttc caaagccttg ttgcacaatg ccgccgttat cgacgaagtg 1020cgccacttgg ctgccaacgg tatcaaatac cccgagccgg aactcgacat cgatatgctt 1080cgcgcctaca aagacggcgt agtttcccgc ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 1140agccgtaaag tggacgttat ccaaggcgac gggcaattct tagatccgca ccacttggaa 1200gtgtcgctga ctgccggcga cgcgtacgaa caggcagccc ctaccggcga gaaaaaaatc 1260gttgccttca aaaactgtat cattgcagca ggcagccgcg taaccaaact gcctttcatt 1320cctgaagatc cgcgcatcat cgattccagc ggcgcattgg ctctgaaaga agtaccgggc 1380aaactgctga ttatcggcgg cggcattatc ggcctcgaga tgggtacggt ttacagcacg 1440ctgggttcgc gtttggatgt ggttgaaatg atggacggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 1500gatttggtaa aagtatggca aaaacaaaac gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560accaaaaccg ttgcagttga gccgaaagaa gacggcgttt acgttacctt tgaaggcgcg 1620aacgcgccta aagagccgca acgctacgat gccgtattgg ttgccgccgg ccgcgcgccc 1680aacggcaaac tcatcagcgc ggaaaaagca ggcgttgccg taaccgatcg cggcttcatc 1740gaagtggaca aacaaatgcg taccaatgtg ccgcacatct acgccatcgg cgacatcgtc 1800ggtcagccga tgttggcgca caaagccgtt cacgaaggcc acgttgccgc cgaaaactgc 1860gccggccaca aagcctactt cgacgcacgc gtgattccgg gcgttgccta cacttccccc 1920gaagtggcgt gggtgggcga aaccgaactg tccgccaaag cctccggccg caaaatcacc 1980aaagccaact tcccgtgggc ggcttccggc cgtgcgattg ccaacggttg cgacaagccg 2040tttaccaagc tgatttttga tgccgaaacc ggccgcatca tcggcggcgg cattgtcggt 2100ccgaacggtg gcgatatgat cggcgaagtc tgccttgcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160gcagacatcg gcaaaaccat ccacccgcac ccgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa 2220gtggcattgg gtacttgtac cgacaaaaaa aaa 2253<210>28<211>748<212>PRT<213>大腸桿菌<220>
<221>鏈
<222>(1)..(748)<223>PLL2的氨基酸序列<400>28His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu1 5 10 15Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala20 25 30Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile35 40 45Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly50 55 60Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile65 70 75 80Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly85 90 95Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys100 105 110Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu115 120 125Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser130 135 140Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe145 150 155 160Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly165 170 175Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser180 185 190Leu Gly Gly Val Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val195 200 205Ala Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser210 215 220Glu Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala225 230 235 240Pro Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala245 250 255Ala Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala260 265 270Glu Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala275 280 285Ala Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg290 295 300
Tyr Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser305 310 315 320Lys Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu325 330 335Ala Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met340 345 350Leu Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu355 360 365Ala Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly370 375 380Gln Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp385 390 395 400Ala Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe405 410 415Lys Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe420 425 430Ile Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu435 440 445Lys Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly450 455 460Leu Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val465 470 475 480Val Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val485 490 495Lys Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val500 505 510Asn Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val515 520 525Thr Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala530 535 540Val Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala545 550 555 560Glu Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp565 570 575Lys Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile580 585 590Val Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val595600 605Ala Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val610 615 620Ile Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu
625 630 635 640Thr Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn645 650 655Phe Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys660 665 670Pro Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly675 680 685Gly Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys690 695 700Leu Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile705 710 715 720His Pro His Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu725 730 735Gly Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys740 745<210>29<211>1821<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(1821)<223>質(zhì)粒pD4中的MDH的核苷酸序列<400>29atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500
aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800ccgcaaaaga aaaaaggatc c1821<210>30<211>2259<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(2259)<223>質(zhì)粒pLL3中編碼quimeric蛋白的核苷酸序列<400>30atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800ccgcaaaaga aaaaaggatc cgacaggctg agaatggaca aactacagct caaaggaatg 1860tcatactcta tgtgtacagg aaagtttaaa attgtgaagg aaatagcaga aacacaacat 1920ggaacaatag ttatcagagt acaatatgaa ggggacggct ctccatgtaa gatccctttt 1980gagataatgg atttggaaaa aagacacgtc ttaggtcgcc tgattacagt taacccgatc 2040gtaacagaaa aagatagccc agtcaacata gaagcagaac ctccattcgg agacagctac 2100atcatcatag gagtagagcc gggacaattg aaactcaact ggtttaagaa aggaagttcc 2160atcggccaaa tgtttgagac aacaatgaga ggagcgaaga gaatggccat tttaggtgac 2220acagcctggg attttgggtc tctgggtggt taaggatcc 2259<210>31
<211>745<212>PRT<213>大腸桿菌<220>
<221>鏈<222>(1)..(746)<223>PLL3的氨基酸序列<400>31His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu1 5 10 15Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala20 25 30Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile35 40 45Thr Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val50 55 60Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly65 70 75 80Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala85 90 95Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro100 105 110Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp115 120 125Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala130 135 140Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr145 150 155 160Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Set Lys Ala Leu165 170 175Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn180 185 190Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala195 200 205Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala gly Met210 215 220Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu225 230 235 240Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu245 250 255Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys260 265 270
Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu275 280 285Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val290 295 300Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met305 310 315 320Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met325 330 335Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp340 345 350Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys355 360 365Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu370 375 380Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val385 390 395 400Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala405 410 415Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met420 425 430Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln435 440 445Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu450 455 460Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly465 470 475 480Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu485 490 495Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp500 505 510Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr515 520 525Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gly Ile530 535 540Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile545 550 555 560Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His565 570 575Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys580 585 590Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Arg Leu Arg Met Asp
595 600 605Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe610 615 620Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile625 630 635 640Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu645 650 655Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val660 665 670Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu675 680 685Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln690 695 700Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln Met Phe705 710 715 720Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr725 730 735Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly740 745<210>32<211>429<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(429)<223>編碼DEN-1包膜蛋白的286-426位氨基酸的核苷酸序列<400>32agactaaaaa tggataaact gactttaaaa ggggtatcat atgtaatgtg cacagggtca 60ttcaagttag agaaggaagt ggctgagacc cagcatggaa ctgttctagt gcaggttaaa 120tacgaaggaa cagatgcacc atgcaagatc cccttctcgt cccaagatga gaaaggagta 180acccagaatg ggagattgat aacagccaac cccatagtca ttgacaaaga aaaaccagtc 240aacattgaag cggagccacc ttttggtgag agctatattg tggtaggagc aggtgaaaaa 300gctttgaaac taagctggtt caagaaggga agcagtatag ggaaaatgtt tgaagcaact 360gcccgtggag cacgaaggat ggccatcctg ggagacaccg catgggactt cggttctata 420ggagggtaa 429<210>33<211>615<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(615)
<223>質(zhì)粒pLH1中編碼quimeric蛋白的核苷酸序列<400>33atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180aggctcaaaa tggataaact gactttaaaa ggggtatcat atgtaatgtg cacagggtca 240ttcaagttag agaaggaagt ggctgagacc cagcatggaa ctgttctagt gcaggttaaa 300tacgaaggaa cagatgcacc atgcaagatc cccttctcgt cccaagatga gaaaggagta 360acccagaatg ggagattgat aacagccaac cccatagtca ttgacaaaga aaaaccagtc 420aacattgaag cggagccacc ttttggtgag agctatattg tggtaggagc aggtgaaaaa 480gctttgaaac taagctggtt caagaaggga agcagtatag ggaaaatgtt tgaagcaact 540gcccgtggag cacgaaggat ggccatcctg ggagacaccg catgggactt cggttctatt 600ggcgggtaag gatcc 615<210>34<211>174<212>PRT<213>大腸桿菌<220>
<221>鏈<222>(1)..(174)<223>PLH1的氨基酸序列<400>34His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu1 5 10 15Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala20 25 30Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile35 40 45Thr Leu Asp Leu Asp Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln50 55 60His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Gln Gly Thr Asp Ala Pro65 70 75 80Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn85 90 95Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val100 105 110Asn Ile Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly115 120 125Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Gln Cys Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser130 135 140Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala145 150 155 160Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly165 170
<210>35<211>2253<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(2253)<223>質(zhì)粒PLH2中編碼quimeric蛋白的核苷酸序列<400>35atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180aggctcaaaa tggataaact gactttaaaa ggggtatcat atgtaatgtg cacagggtca 240ttcaagttag agaaggaagt ggctgagacc cagcatggaa ctgttctagt gcaggttaaa 300tacgaaggaa cagatgcacc atgcaagatc cccttctcgt cccaagatga gaaaggagta 360acccagaatg ggagattgat aacagccaac cccatagtca ttgacaaaga aaaaccagtc 420aacattgaag cggagccacc ttttggtgag agctatattg tggtaggagc aggtgaaaaa 480gctttgaaac taagctggtt caagaaggga agcagtatag ggaaaatgtt tgaagcaact 540gcccgtggag cacgaaggat ggccatcctg ggagacaccg catgggactt cggatctata 600ggaggggtga attcgatgaa ttcgatggac gtacctgctg aagttgcagg cgtagtcaaa 660gaagttaaag ttaaagtcgg cgacaaaatc tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720gctgaaggca cggcagccgc tcctaaagcc gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc gcgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840tacgacgtgg tcgtattggg tggcggtccc ggcggttact ccgctgcatt tgccgctgcc 900gatgaaggct tgaaagtcgc catcgtcgaa cgttacaaaa ctttgggcgg cgtttgcctg 960aacgtcggct gtatcccttc caaagccttg ttgcacaatg ccgccgttat cgacgaagtg 1020cgccacttgg ctgccaacgg tatcaaatac cccgagccgg aactcgacat cgatatgctt 1080cgcgcctaca aagacggcgt agtttcccgc ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 1140agccgtaaag tggacgttat ccaaggcgac gggcaattct tagatccgca ccacttggaa 1200gtgtcgctga ctgccggcga cgcgtacgaa caggcagccc ctaccggcga gaaaaaaatc 1260gttgccttca aaaactgtat cattgcagca ggcagccgcg taaccaaact gcctttcatt 1320cctgaagatc cgcgcatcat cgattccagc ggcgcattgg ctctgaaaga agtaccgggc 1380aaactgctga ttatcggcgg cggcattatc ggcctcgaga tgggtacggt ttacagcacg 1440ctgggttcgc gtttggatgt ggttgaaatg atggacggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 1500gatttggtaa aagtatggca aaaacaaaac gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560accaaaaccg ttgcagttga gccgaaagaa gacggcgttt acgttacctt tgaaggcgcg 1620aacgcgccta aagagccgca acgctacgat gccgtattgg ttgccgccgg ccgcgcgccc 1680aacggcaaac tcatcagcgc ggaaaaagca ggcgttgccg taaccgatcg cggcttcatc 1740gaagtggaca aacaaatgcg taccaatgtg ccgcacatct acgccatcgg cgacatcgtc 1800ggtcagccga tgttggcgca caaagccgtt cacgaaggcc acgttgccgc cgaaaactgc 1860gccggccaca aagcctactt cgacgcacgc gtgattccgg gcgttgccta cacttccccc 1920gaagtggcgt gggtgggcga aaccgaactg tccgccaaag cctccggccg caaaatcacc 1980aaagccaact tcccgtgggc ggcttccggc cgtgcgattg ccaacggttg cgacaagccg 2040tttaccaagc tgatttttga tgccgaaacc ggccgcatca tcggcggcgg cattgtcggt 2100ccgaacggtg gcgatatgat cggcgaagtc tgccttgcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160gcagacatcg gcaaaaccat ccacccgcac ccgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa 2220gtggcattgg gtacttgtac cgacaaaaaa aaa 2253<210>36<211>727<212>PRT<213>大腸桿菌<220>
<221>鏈<222>(1)..(727)
<223>PLH2的氨基酸序列<400>36His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu1 5 10 15Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala20 25 30ValGlu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile35 40 45Thr Leu Asp Leu Asp Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln50 55 60His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr Gln Gly Thr Asp Ala Pro65 70 75 80Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn85 90 95Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val100 105 110Asn Ile Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly115 120 125Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Gln Cys Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser130 135 140Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala145 150 155 160Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Asn165 170 175Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val Val Lys180 185 190Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly Leu Ile195 200 205Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala Glu Ala210 215 220Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro Ala Pro225 230 235 240Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp Val Val245 250 255Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala Ala Ala260 265 270Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr Leu Gly275 280 285Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His290 295 300Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn Gly Ile
305 310 315 320Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala Tyr Lys325 330 335Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys340 345 350Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu Asp Pro355 360 365His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu Gln Ala370 375 380Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys Ile Ile385 390 395 400Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu Asp Pro405 410 415Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val Pro Gly420 425 430Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met Gly Thr435 440 445Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met Met Asp450 455 460Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp Gln Lys465 470 475 480Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys Thr Val485 490 495Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu Gly Ala500 505 510Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ala515 520 525Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala Gly Val530 535 540Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met Arg Thr545 550 555 560Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met565 570 575Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Asn Cys580 585 590Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly Val Ala595 600 605Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu Ser Ala610 615 620Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp Ala Ala625 630 635 640
Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr Lys Leu645 650 655Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gly Ile Val Gly660 665 670Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile Glu Met675 680 685Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His Pro Gly690 695 700Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys Thr Asp705 710 715 720Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys725<213>大腸桿菌<221>基因<222>1..(2250)<223質(zhì)粒pLH3的編碼quimeric蛋白的核苷酸序列atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740
ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800ccgcaaaaga aaaaaggatc cagactaaaa atggataaac tgactttaaa aggggtatca 1860tatgtaatgt gcacagggtc attcaagtta gagaaggaag tggctgagac ccagcatgga 1920actgttctag tgcaggttaa atacgaagga acagatgcac catgcaagat ccccttctcg 1980tcccaagatg agaaaggagt aacccagaat gggagattga taacagccaa ccccatagtc 2040attgacaaag aaaaaccagt caacattgaa gcggagccac cttttggtga gagctatatt 2100gtggtaggag caggtgaaaa agctttgaaa ctaagctggt tcaagaaggg aagcagtata 2160gggaaaatgt ttgaagcaac tgcccgtgga gcacgaagga tggccatcct gggagacacc 2220gcatgggact tcggttctat aggtgggtaa 2250<210>38<211>724<212>PRT<213>大腸桿菌<220>
<221>鏈<222>(1)..(724)<223>PLH3的氨基酸序列<400>38His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu1 5 10 15Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala20 25 30Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile35 40 45Thr Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val50 55 60Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly65 70 75 80Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala85 90 95Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro100 105 110Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp115 120 125Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala130 135 140Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr145 150 155 160Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu165 170 175Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn180 185 190Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala195 200 205
Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met210 215 220Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu225 230 235 240Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu245 250 255Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys IIe Val Ala Phe Lys Asn Cys260 265 270Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu275 280 285Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val290 295 300Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met305 310 315 320Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met325 330 335Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp340 345 350Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys355 360 365Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu370 375 380Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val385 390 395 400Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala405 410 415Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met420 425 430Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln435 440 445Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu450 455 460Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly465 470 475 480Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu485 490 495Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp500 505 510Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr515 520 525Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gly Ile
530 535 540Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile545 550 555 560Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His565 570 575Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys580 585 590Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys595 600 605Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr610 615 620Gln Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu625 630 635 640Lys Gly Val Thr Gln Asn Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr645 650 655Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly Glu660 665 670Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Gln Cys Trp675 680 685Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg690 695 700Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly705 710 715 720Ser Ile Gly Gly<210>39<211>426<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(426)<223>編碼DEN-3包膜蛋白的286-426位氨基酸的核苷酸序列<400>39agactcaaga tggacaaatt gaaactcaag gggatgagct atgcaatgtg cttgaatacc 60tttgtgttga agaaagaagt ctccgaaacg cagcatggga caatactcat taaggttgag 120tacaaagggg aagatgcacc ctgcaagatt cctttctcca cggaggatgg acaagggaaa 180gctcacaatg gcagactgat cacagccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 240aacattgagg ctgaacctcc ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 300gccctgaaaa tcaactggta caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccact 360gccagaggtg caaggcgcat ggccatcttg ggagacacag cctgggactt tggatcagtg 420ggtggt426
<210>40<211>615<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(615)<223>質(zhì)粒pAZ1中編碼quimeric蛋白的核苷酸序列<400>40atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagat 180agactcaaga tggacaaatt gaaactcaag gggatgagct atgcaatgtg cttgaatacc 240tttgtgttga agaaagaagt ctccgaaacg cagcatggga caatactcat taaggttgag 300tacaaagggg aagatgcacc ctgcaagatt cctttctcca cggaggatgg acaagggaaa 360gctcacaatg gcagactgat cacagccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 420aacattgagg ctgaacctcc ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 480gccctgaaaa tcaactggta caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccact 540gccagaggtg caaggcgcat ggccatcttg ggagacacag cctgggactt tggttcagtg 600ggtggttaag gatcc 615<210>41<211>194<212>PRT<213>大腸桿菌<220>
<221>鏈<222>(1)..(194)<223>PAZ1的氨基酸序列<400>41His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu1 5 10 15Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala20 25 30Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile35 40 45Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly50 55 60Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val65 70 75 80Ser Glu Thr His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu85 90 95Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys100 105 110Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys115 120 125Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn
130 135 140Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg145 150 155 160Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala165 170 175Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val180 185 190Gly Gly<210>42<211>2253<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(2253)<223>質(zhì)粒PAZ2中的編碼quimertic蛋白的核苷酸序列<400>42atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagat 180agactcaaga tggacaaatt gaaactcaag gggatgagct atgcaatgtg cttgaatacc 240tttgtgttga agaaagaagt ctccgaaacg cagcatggga caatactcat taaggttgag 300tacaaagggg aagatgcacc ctgcaagatt cctttctcca cggaggatgg acaagggaaa 360gctcacaatg gcagactgat cacagccaat ccagtggtga ccaagaagga ggagcctgtc 420aacattgagg ctgaacctcc ttttggggaa agtaatatag taattggaat tggagacaaa 480gccctgaaaa tcaactggta caggaaggga agctcgattg ggaagatgtt cgaggccact 540gccagaggtg caaggcgcat ggccatcttg ggagacacag cctgggactt tggatctgtg 600ggtggtgtga attcgatgaa ttcgatggac gtacctgctg aagttgcagg cgtagtcaaa 660gaagttaaag ttaaagtcgg cgacaaaatc tctgaaggtg gtttgattgt cgtcgttgaa 720gctgaaggca cggcagccgc tcctaaagcc gaagcggctg ccgccccggc gcaagaagcc 780cctaaagctg ccgctcctgc tccgcaagcc gcgcaattcg gcggttctgc cgatgccgag 840tacgacgtgg tcgtattggg tggcggtccc ggcggttact ccgctgcatt tgccgctgcc 900gatgaaggct tgaaagtcgc catcgtcgaa cgttacaaaa ctttgggcgg cgtttgcctg 960aacgtcggct gtatcccttc caaagccttg ttgcacaatg ccgccgttat cgacgaagtg 1020cgccacttgg ctgccaacgg tatcaaatac cccgagccgg aactcgacat cgatatgctt 1080cgcgcctaca aagacggcgt agtttcccgc ctcacgggcg gtttggcagg tatggcgaaa 1140agccgtaaag tggacgttat ccaaggcgac gggcaattct tagatccgca ccacttggaa 1200gtgtcgctga ctgccggcga cgcgtacgaa caggcagccc ctaccggcga gaaaaaaatc 1260gttgccttca aaaactgtat cattgcagca ggcagccgcg taaccaaact gcctttcatt 1320cctgaagatc cgcgcatcat cgattccagc ggcgcattgg ctctgaaaga agtaccgggc 1380aaactgctga ttatcggcgg cggcattatc ggcctcgaga tgggtacggt ttacagcacg 1440ctgggttcgc gtttggatgt ggttgaaatg atggacggcc tgatgcaagg cgcagaccgc 1500gatttggtaa aagtatggca aaaacaaaac gaataccgtt ttgacaacat tatggtcaac 1560accaaaaccg ttgcagttga gccgaaagaa gacggcgttt acgttacctt tgaaggcgcg 1620aacgcgccta aagagccgca acgctacgat gccgtattgg ttgccgccgg ccgcgcgccc 1680aacggcaaac tcatcagcgc ggaaaaagca ggcgttgccg taaccgatcg cggcttcatc 1740gaagtggaca aacaaatgcg taccaatgtg ccgcacatct acgccatcgg cgacatcgtc 1800ggtcagccga tgttggcgca caaagccgtt cacgaaggcc acgttgccgc cgaaaactgc 1860gccggccaca aagcctactt cgacgcacgc gtgattccgg gcgttgccta cacttccccc 1920gaagtggcgt gggtgggcga aaccgaactg tccgccaaag cctccggccg caaaatcacc 1980aaagccaact tcccgtgggc ggcttccggc cgtgcgattg ccaacggttg cgacaagccg 2040
tttaccaagc tgatttttga tgccgaaacc ggccgcatca tcggcggcgg cattgtcggt 2100ccgaacggtg gcgatatgat cggcgaagtc tgccttgcca tcgaaatggg ctgcgacgcg 2160gcagacatcg gcaaaaccat ccacccgcac ccgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa 2220gtggcattgg gtacttgtac cgacaaaaaa aaa 2253<210>43<211>747<212>PRT<213>大腸桿菌<220>
<221>鏈<222>(1)..(747)<223>PAZ2的氨基酸序列<400>43His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu1 5 10 15Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala20 25 30Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile35 40 45Thr Leu Asp Leu Asp Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Lys Leu Lys Gly50 55 60Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe Val Leu Lys Lys Glu Val65 70 75 80Ser Glu Thr His Gly Thr Ile Leu Ile Lys Val Glu Tyr Lys Gly Glu85 90 95Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Glu Asp Gly Gln Gly Lys100 105 110Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Val Thr Lys Lys115 120 125Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu Ser Asn130 135 140Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu Lys Ile Asn Trp Tyr Arg145 150 155 160Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ala Thr Ala Arg Gly Ala165 170 175Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val180 185 190Gly Gly Val Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala195 200 205Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu210 215 220Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro225 230 235 240
Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala245 250 255Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu260 265 270Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala275 280 285Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr290 295 300Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys305 310 315 320Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala325 330 335Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu340 345 350Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala355 360 365Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln370 375 380Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala385 390 395 400Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys405 410 415Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile420 425 430Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys435 440 445Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu450 455 460Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val465 470 475 480Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys485 490 495Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn500 505 510Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr515 520 525Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val530 535 540Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu545 550 555 560
Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys565 570 575Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val580 585 590Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala595 600 605Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile610 615 620Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr625 630 635 640Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe645 650 655Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro660 665 670Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly675 680 685Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu690 695 700Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His705 710 715 720Pro His Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly725 730 735Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys740 745<210>44<211>2256<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(2256)<223>質(zhì)粒pAZ3中編碼quimeric蛋白的核苷酸序列<400>44atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720
ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800ccgcaaaaga aaaaaggatc cagactcaag atggacaaat tgaaactcaa ggggatgagc 1860tatgcaatgt gcttgaatac ctttgtgttg aagaaagaag tctccgaaac gcagcatggg 1920acaatactca ttaaggttga gtacaaaggg gaagatgcac cctgcaagat tcctttctcc 1980acggaggatg gacaagggaa agctcacaat ggcagactga tcacagccaa tccagtggtg 2040accaagaagg aggagcctgt caacattgag gctgaacctc cttttgggga aagtaatata 2100gtaattggaa ttggagacaa agccctgaaa atcaactggt acaggaaggg aagctcgatt 2160gggaagatgt tcgaggccac tgccagaggt gcaaggcgca tggccatctt gggagacaca 2220gcctgggact ttggttcagt gggtggttaa ggatcc 2256<210>45<211>744<212>PRT<213>大腸桿菌<220>
<221>鏈<222>(1)..(744)<223>PAZ3的氨基酸序列<400>45His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu1 5 10 15Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala20 25 30Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile35 40 45Thr Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val50 55 60Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly65 70 75 80Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala85 90 95Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro100 105 110Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp
115 120 125Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala130 135 140Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr145 150 155 160Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu165 170 175Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn180 185 190Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala195 200 205Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met210 215 220Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu225 230 235 240Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu245 250 255Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys260 265 270Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu275 280 285Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val290 295 300Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met305 310 315 320Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met325 330 335Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp340 345 350Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys355 360 365Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu370 375 380Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val385 390 395 400Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala405 410 415Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met420 425 430Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln435 440 445
Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu450 455 460Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly465 470 475 480Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu485 490 495Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp500 505 510Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr515 520 525Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gly Ile530 535 540Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile545 550 555 560Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His565 570 575Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys580 585 590Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Arg Leu Lys Met Asp595 600 605Lys Leu Lys Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ala Met Cys Leu Asn Thr Phe610 615 620Val Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr His Gly Thr Ile Leu Ile Lys625 630 635 640Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr645 650 655Glu Asp Gly Gln Gly Lys Ala His Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn660 665 670Pro Val Val Thr Lys Lys Glu Glu Pro Val Asn Ile Glu Ala Glu Pro675 680 685Pro Phe Gly Glu Ser Asn Ile Val Ile Gly Ile Gly Asp Lys Ala Leu690 695 700Lys Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu705 710 715 720Ala Thr Ala Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala725 730 735Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly740<210>46<211>426
<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(426)<223>編碼DEN-4包膜蛋白的286-426位氨基酸的核苷酸序列<400>46aaagtccgta tggagaaatt gagaatcaag ggaatgtcat acacgatgtg ttcaggaaag 60ttttcaattg acaaagagat ggcagaaaca cagcatggga caacagtggt gaaagtcaag 120tatgaaggtg ctggagctcc gtgtaaagtc cccatagaga taagagatgt aaacaaggaa 180aaagtggttg ggcgtatcat ctcatccacc cctttggctg agaataccaa cagtgtaacc 240aacatagaat tagaaccccc ctttggggac agctacatag tgataggtgt tggaaacagc 300gcattaacac tccattggtt caggaaaggg agttccattg gcaagatgtt tgagtccaca 360tacagaggtg caaaacgaat ggccattcta ggtgaaacag cttgggattt tggttccgtt 420ggtgga426<210>47<211>615<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(615)<223>質(zhì)粒pID1中的編碼quimeric蛋白的核苷酸序列<400>47atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagattt ggatctagac 180aaagtgcgta tggagaaatt gagaatcaag ggaatgtcat acacgatgtg ttcaggaaag 240ttttcaattg acaaagagat ggcagaaaca cagcatggga caacagtggt gaaagtcaag 300tatgaaggtg ctggagctcc gtgtaaagtc cccatagaga taagagatgt aaacaaggaa 360aaagtggttg ggcgtatcat ctcatccacc cctttggctg agaataccaa cagtgtaacc 420aacatagaat tagaaccccc ctttggggac agctacatag tgataggtgt tggaaacagc 480gcattaacac tccattggtt caggaaaggg agttccattg gcaagatgtt tgagtccaca 540tacagaggtg caaaacgaat ggccattcta ggtgaaacag cttgggattt tggttccgtt 600ggtggataag gatcc 615<210>48<211>192<212>PRT<213>大腸桿菌<220>
<221>鏈<222>(1)..(192)<223>PID1的氨基酸序列<400>48His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu1 5 10 15Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala20 25 30
Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile35 40 45Thr Leu Asp Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser50 55 60Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu65 70 75 80Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly85 90 95Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys100 105 110Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn115 120 125Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Arg Pro Leu Asp Ser Tyr Ile Val130 135 140Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly145 150 155 160Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg165 170 175Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly180 185 190<210>49<211>2241<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(2241)<223>質(zhì)粒pID2中的編碼quimeric蛋白的核苷酸序列<400>49atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg aacagaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagacaa agtccgtatg 180gagaaattga gaatcaaggg aatgtcatac acgatgtgtt caggaaagtt ttcaattgac 240aaagagatgg cagaaacaca gcatgggaca acagtggtga aagtcaagta tgaaggtgct 300ggagctccgt gtaaagtccc catagagata agagatgtaa acaaggaaaa agtggttggg 360cgtatcatct catccacccc tttggctgag aataccaaca gtgtaaccaa catagaatta 420gaacccccct ttggggacag ctacatagtg ataggtgttg gaaacagcgc attaacactc 480cattggttca ggaaagggag ttccattggc aagatgtttg agtccacata cagaggtgca 540aaacgaatgg ccattctagg tgaaacagct tgggattttg gtagcgttgg tggactgaat 600tcgatgaatt cgatggacgt acctgctgaa gttgcaggcg tagtcaaaga agttaaagtt 660aaagtcggcg acaaaatctc tgaaggtggt ttgattgtcg tcgttgaagc tgaaggcacg 720gcagccgctc ctaaagccga agcggctgcc gccccggcgc aagaagcccc taaagctgcc 780gctcctgctc cgcaagccgc gcaattcggc ggttctgccg atgccgagta cgacgtggtc 840
gtattgggtg gcggtcccgg cggttactcc gctgcatttg ccgctgccga tgaaggcttg 900aaagtcgcca tcgtcgaacg ttacaaaact ttgggcggcg tttgcctgaa cgtcggctgt 960atcccttcca aagccttgtt gcacaatgcc gccgttatcg acgaagtgcg ccacttggct 1020gccaacggta tcaaataccc cgagccggaa ctcgacatcg atatgcttcg cgcctacaaa 1080gacggcgtag tttcccgcct cacgggcggt ttggcaggta tggcgaaaag ccgtaaagtg 1140gacgttatcc aaggcgacgg gcaattctta gatccgcacc acttggaagt gtcgctgact 1200gccggcgacg cgtacgaaca ggcagcccct accggcgaga aaaaaatcgt tgccttcaaa 1260aactgtatca ttgcagcagg cagccgcgta accaaactgc ctttcattcc tgaagatccg 1320cgcatcatcg attccagcgg cgcattggct ctgaaagaag taccgggcaa actgctgatt 1380atcggcggcg gcattatcgg cctcgagatg ggtacggttt acagcacgct gggttcgcgt 1440ttggatgtgg ttgaaatgat ggacggcctg atgcaaggcg cagaccgcga tttggtaaaa 1500gtatggcaaa aacaaaacga ataccgtttt gacaacatta tggtcaacac caaaaccgtt 1560gcagttgagc cgaaagaaga cggcgtttac gttacctttg aaggcgcgaa cgcgcctaaa 1620gagccgcaac gctacgatgc cgtattggtt gccgccggcc gcgcgcccaa cggcaaactc 1680atcagcgcgg aaaaagcagg cgttgccgta accgatcgcg gcttcatcga agtggacaaa 1740caaatgcgta ccaatgtgcc gcacatctac gccatcggcg acatcgtcgg tcagccgatg 1800ttggcgcaca aagccgttca cgaaggccac gttgccgccg aaaactgcgc cggccacaaa 1860gcctacttcg acgcacgcgt gattccgggc gttgcctaca cttcccccga agtggcgtgg 1920gtgggcgaaa ccgaactgtc cgccaaagcc tccggccgca aaatcaccaa agccaacttc 1980ccgtgggcgg cttccggccg tgcgattgcc aacggttgcg acaagccgtt taccaagctg 2040atttttgatg ccgaaaccgg ccgcatcatc ggcggcggca ttgtcggtcc gaacggtggc 2100gatatgatcg gcgaagtctg ccttgccatc gaaatgggct gcgacgcggc agacatcggc 2160aaaaccatcc acccgcaccc gggcgaatcc atcggtatgg cggcggaagt ggcattgggt 2220acttgtaccg acaaaaaaaa a 2241<210>50<211>747<212>PRT<213>大腸桿菌<220>
<221>鏈<222>(1)..(747)<223>PID2的氨基酸序列<400>50His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu1 5 10 15Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala20 25 30Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile35 40 45Thr Leu Asp Leu Asp Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly50 55 60Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met65 70 75 80Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly85 90 95Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys100 105 110Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn115 120 125
Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Arg Pro Leu Asp Ser Tyr130 135 140Ile Val Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg145 150 155 160Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala165 170 175Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val180 185 190Gly Gly Leu Asn Ser Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala195 200 205Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu210 215 220Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro225 230 235 240Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala245 250 255Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu260 265 270Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala275 280 285Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr290 295 300Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys305 310 315 320Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala325 330 335Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu340 345 350Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala355 360 365Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln370 375 380Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala385 390 395 400Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys405 410 415Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile420 425 430Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys435 440 445Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu
450 455 460Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val465 470 475 480Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys485 490 495Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn500 505 510Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr515 520 525Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val530 535 540Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu545 550 555 560Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys565 570 575Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val580 585 590Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala595 600 605Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile610 615 620Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr625 630 635 640Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe645 650 655Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro660 665 670Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly675 680 685Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu690 695 700Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His705 710 715 720Pro His Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly725 730 735Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys740 745<210>51<211>2256<212>DNA<213>大腸桿菌
<220>
<22l>基因<222>(1)..(2256)<223>質(zhì)粒pID3中的編碼quimeric蛋白的核苷酸序列<400>51atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagaaat ggacgtacct 180gctgaagttg caggcgtagt caaagaagtt aaagttaaag tcggcgacaa aatctctgaa 240ggtggtttga ttgtcgtcgt tgaagctgaa ggcacggcag ccgctcctaa agccgaagcg 300gctgccgccc cggcgcaaga agcccctaaa gctgccgctc ctgctccgca agccgcgcaa 360ttcggcggtt ctgccgatgc cgagtacgac gtggtcgtat tgggtggcgg tcccggcggt 420tactccgctg catttgccgc tgccgatgaa ggcttgaaag tcgccatcgt cgaacgttac 480aaaactttgg gcggcgtttg cctgaacgtc ggctgtatcc cttccaaagc cttgttgcac 540aatgccgccg ttatcgacga agtgcgccac ttggctgcca acggtatcaa ataccccgag 600ccggaactcg acatcgatat gcttcgcgcc tacaaagacg gcgtagtttc ccgcctcacg 660ggcggtttgg caggtatggc gaaaagccgt aaagtggacg ttatccaagg cgacgggcaa 720ttcttagatc cgcaccactt ggaagtgtcg ctgactgccg gcgacgcgta cgaacaggca 780gcccctaccg gcgagaaaaa aatcgttgcc ttcaaaaact gtatcattgc agcaggcagc 840cgcgtaacca aactgccttt cattcctgaa gatccgcgca tcatcgattc cagcggcgca 900ttggctctga aagaagtacc gggcaaactg ctgattatcg gcggcggcat tatcggcctc 960gagatgggta cggtttacag cacgctgggt tcgcgtttgg atgtggttga aatgatggac 1020ggcctgatgc aaggcgcaga ccgcgatttg gtaaaagtat ggcaaaaaca aaacgaatac 1080cgttttgaca acattatggt caacaccaaa accgttgcag ttgagccgaa agaagacggc 1140gtttacgtta cctttgaagg cgcgaacgcg cctaaagagc cgcaacgcta cgatgccgta 1200ttggttgccg ccggccgcgc gcccaacggc aaactcatca gcgcggaaaa agcaggcgtt 1260gccgtaaccg atcgcggctt catcgaagtg gacaaacaaa tgcgtaccaa tgtgccgcac 1320atctacgcca tcggcgacat cgtcggtcag ccgatgttgg cgcacaaagc cgttcacgaa 1380ggccacgttg ccgccgaaaa ctgcgccggc cacaaagcct acttcgacgc acgcgtgatt 1440ccgggcgttg cctacacttc ccccgaagtg gcgtgggtgg gcgaaaccga actgtccgcc 1500aaagcctccg gccgcaaaat caccaaagcc aacttcccgt gggcggcttc cggccgtgcg 1560attgccaacg gttgcgacaa gccgtttacc aagctgattt ttgatgccga aaccggccgc 1620atcatcggcg gcggcattgt cggtccgaac ggtggcgata tgatcggcga agtctgcctt 1680gccatcgaaa tgggctgcga cgcggcagac atcggcaaaa ccatccaccc gcacccgacc 1740ttgggcgaat ccatcggtat ggcggcggaa gtggcattgg gtacttgtac cgacctgcct 1800ccgcaaaaga aaaaaggatc caaagtgcgt atggagaaat tgagaatcaa gggaatgtca 1860tacacgatgt gttcaggaaa gttttcaatt gacaaagaga tggcagaaac acagcatggg 1920acaacagtgg tgaaagtcaa gtatgaaggt gctggagctc cgtgtaaagt ccccatagag 1980ataagagatg taaacaagga aaaagtggtt gggcgtatca tctcatccac ccctttggct 2040gagaatacca acagtgtaac caacatagaa ttagaacccc cctttgggga cagctacata 2100gtgataggtg ttggaaacag cgcattaaca ctccattggt tcaggaaagg gagttccatt 2160ggcaagatgt ttgagtccac atacagaggt gcaaaacgaa tggccattct aggtgaaaca 2220gcttgggatt ttggttcggt tggtggctaa ggatcc 2256<210>52<211>744<212>PRT<213>大腸桿菌<220>
<221>鏈<222>(1)..(744)<223>PID3的氨基酸序列<400>52His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu1 5 10 15
Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala20 25 30Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile35 40 45Thr Leu Asp Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val50 55 60Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly65 70 75 80Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala85 90 95Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro100 105 110Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp115 120 125Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala130 135 140Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr145 150 155 160Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu165 170 175Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn180 185 190Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala195 200 205Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met210 215 220Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu225 230 235 240Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu245 250 255Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys260 265 270Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu275 280 285Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val290 295 300Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met305 310 315 320Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met325 330 335
Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp340 345 350Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys355 360 365Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu370 375 380Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val385 390 395 400Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala405 410 415Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met420 425 430Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln435 440 445Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu450 455 460Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly465 470 475 480Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu485 490 495Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp500 505 510Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr515 520 525Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gly Ile530 535 540Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile545 550 555 560Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His565 570 575Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys580 585 590Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Lys Val Arg Met Glu595 600 605Lys Leu Arg Ile Lys Gly Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe610 615 620Ser Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val625 630 635 640Lys Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu645 650 655Ile Arg Asp Val Asn Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser
660 665 670Thr Pro Leu Ala Glu Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu675 680 685Arg Pro Leu Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu690 695 700Thr Leu His Trp Phe Arg Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu705 710 715 720Ser Thr Tyr Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala725 730 735Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly740<210>53<211>2694<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>基因<222>(1)..(2694)<223>質(zhì)粒pD4D2中的編碼quimeric蛋白的核苷酸序列<400>53atgggccacc accaccacca ccacgccatg gtagataaaa gaatggcttt agttgaattg 60aaagtgcccg acattggcgg acacgaaaat gtagatatta tcgcggttga agtaaacgtg 120ggcgacacta ttgctgtgga cgataccctg attactttgg atctagacaa agtccgtatg 180gagaaattga gaatcaaggg aatgtcatac acgatgtgtt caggaaagtt ttcaattgac 240aaagagatgg cagaaacaca gcatgggaca acagtggtga aagtcaagta tgaaggtgct 300ggagctccgt gtaaagtccc catagagata agagatgtaa acaaggaaaa agtggttggg 360cgtatcatct catccacccc tttggctgag aataccaaca gtgtaaccaa catagaatta 420gaacccccct ttggggacag ctacatagtg ataggtgttg gaaacagcgc attaacactc 480cattggttca ggaaagggag ttccattggc aagatgtttg agtccacata cagaggtgca 540aaacgaatgg ccattctagg tgaaacagct tgggattttg gttccgttgg tggtcttcta 600gaaatggacg tacctgctga agttgcaggc gtagtcaaag aagttaaagt taaagtcggc 660gacaaaatct ctgaaggtgg tttgattgtc gtcgttgaag ctgaaggcac ggcagccgct 720cctaaagccg aagcggctgc cgccccggcg caagaagccc ctaaagctgc cgctcctgct 780ccgcaagccg cgcaattcgg cggttctgcc gatgccgagt acgacgtggt cgtattgggt 840ggcggtcccg gcggttactc cgctgcattt gccgctgccg atgaaggctt gaaagtcgcc 900atcgtcgaac gttacaaaac tttgggcggc gtttgcctga acgtcggctg tatcccttcc 960aaagccttgt tgcacaatgc cgccgttatc gacgaagtgc gccacttggc tgccaacggt 1020atcaaatacc ccgagccgga actcgacatc gatatgcttc gcgcctacaa agacggcgta 1080gtttcccgcc tcacgggcgg tttggcaggt atggcgaaaa gccgtaaagt ggacgttatc 1140caaggcgacg ggcaattctt agatccgcac cacttggaag tgtcgctgac tgccggcgac 1200gcgtacgaac aggcagcccc taccggcgag aaaaaaatcg ttgccttcaa aaactgtatc 1260attgcagcag gcagccgcgt aaccaaactg cctttcattc ctgaagatcc gcgcatcatc 1320gattccagcg gcgcattggc tctgaaagaa gtaccgggca aactgctgat tatcggcggc 1380ggcattatcg gcctcgagat gggtacggtt tacagcacgc tgggttcgcg tttggatgtg 1440gttgaaatga tggacggcct gatgcaaggc gcagaccgcg atttggtaaa agtatggcaa 1500aaacaaaacg aataccgttt tgacaacatt atggtcaaca ccaaaaccgt tgcagttgag 1560ccgaaagaag acggcgttta cgttaccttt gaaggcgcga acgcgcctaa agagccgcaa 1620cgctacgatg ccgtattggt tgccgccggc cgcgcgccca acggcaaact catcagcgcg 1680gaaaaagcag gcgttgccgt aaccgatcgc ggcttcatcg aagtggacaa acaaatgcgt 1740accaatgtgc cgcacatcta cgccatcggc gacatcgtcg gtcagccgat gttggcgcac 1800aaagccgttc acgaaggcca cgttgccgcc gaaaactgcg ccggccacaa agcctacttc 1860
gacgcacgcg tgattccggg cgttgcctac acttcccccg aagtggcgtg ggtgggcgaa 1920accgaactgt ccgccaaagc ctccggccgc aaaatcacca aagccaactt cccgtgggcg 1980gcttccggcc gtgcgattgc caacggttgc gacaagccgt ttaccaagct gatttttgat 2040gccgaaaccg gccgcatcat cggcggcggc attgtcggtc cgaacggtgg cgatatgatc 2100ggcgaagtct gccttgccat cgaaatgggc tgcgacgcgg cagacatcgg caaaaccatc 2160cacccgcacc cgaccttggg cgaatccatc ggtatggcgg cggaagtggc attgggtact 2220tgtaccgacc tgcctccgca aaagaaaaaa ggatccgaca ggctgagaat ggacaaacta 2280cagctcaaag gaatgtcata ctctatgtgt acaggaaagt ttaaaattgt gaaggaaata 2340gcagaaacac aacatggaac aatagttatc agagtacaat atgaagggga cggctctcca 2400tgtaagatcc cttttgagat aatggatttg gaaaaaagac acgtcttagg tcgcctgatt 2460acagttaacc cgatcgtaac agaaaaagat agcccagtca acatagaagc agaacctcca 2520ttcggagaca gctacatcat cataggagta gagccgggac aattgaaact caactggttt 2580aagaaaggaa gttccatcgg ccaaatgttt gagacaacaa tgagaggagc gaagagaatg 2640gccattttag gtgacacagc ctgggatttt gggtctctgg gtggttaagg atcc 2694<210>54<211>891<212>PRT<213>大腸桿菌<220>
<221>鏈<222>(1)..(891)<223>PD4D2的氨基酸序列<400>54His His His His His His Met Val Asp Lys Arg Met Ala Leu Val Glu1 5 10 15Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn Val Asp Ile Ile Ala20 25 30Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Leu Ile35 40 45Thr Leu Asp Leu Asp Lys Val Arg Met Glu Lys Leu Arg Ile Lys Gly50 55 60Met Ser Tyr Thr Met Cys Ser Gly Lys Phe Ser Ile Asp Lys Glu Met65 70 75 80Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys Val Lys Tyr Glu Gly85 90 95Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn Lys100 105 110Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu Asn115 120 125Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Arg Pro Leu Asp Ser Tyr130 135 140Ile Val Ile Gly Val Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp Phe Arg145 150 155 160Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys Met Phe Glu Ser Thr Tyr Arg Gly Ala165 170 175Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val
180 185 190Gly Gly Leu Leu Glu Met Asn Ser Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala195 200 205Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu210 215 220Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro225 230 235 240Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala245 250 255Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu260 265 270Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala275 280 285Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr290 295 300Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys305 310 315 320Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala325 330 335Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu340 345 350Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala355 360 365Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln370 375 380Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala385 390 395 400Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys405 410 415Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile420 425 430Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys435 440 445Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu450 455 460Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val465 470 475 480Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys485 490 495Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn500 505 510
Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr515 520 525Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val530 535 540Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu545 550 555 560Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys565 570 575Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val580 585 590Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala595 600 605Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile610 615 620Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr625 630 635 640Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe645 650 655Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro660 665 670Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly675 680 685Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu690 695 700Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His705 710 715 720Pro His Pro Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly725 730 735Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys Gly Ser Arg Leu Arg740 745 750Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly755 760 765Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile770 775 780Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro785 790 795 800Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile805 810 815Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu820 825 830
Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro835 840 845Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln850 855 860Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly865 870 875 880Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly885 890
權(quán)利要求
1.嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是黃病毒E蛋白質(zhì)片段對(duì)應(yīng)序列與序列表中序列號(hào)26、序列號(hào)29所示突變型MDH蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)?yīng)序列、或與序列號(hào)23所示的這些序列的片段的特異性組合，當(dāng)其編碼的嵌合蛋白質(zhì)處于藥物制劑中時(shí)，能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)黃病毒的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是編碼登革病毒E蛋白質(zhì)286-426氨基酸的一種或幾種序列與MDH蛋白質(zhì)的核苷酸序列的特異性組合，其中這些序列插入和/或融合到序列表中序列號(hào)26、序列號(hào)29或序列號(hào)23所示序列，其編碼的嵌合蛋白質(zhì)能夠在受體中誘導(dǎo)血清型特異性針對(duì)登革病毒的每種血清型的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
3.權(quán)利要求1和2的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它由登革病毒各血清型1、2、3和4的E蛋白質(zhì)286-426氨基酸的編碼序列與序列號(hào)23所示編碼MDH蛋白質(zhì)前45個(gè)氨基酸的3’末端區(qū)域融合而成。
4.權(quán)利要求1和2的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它由登革病毒各血清型1、2、3和4的E蛋白質(zhì)286-426氨基酸的編碼序列與序列號(hào)26所示編碼MDH蛋白質(zhì)氨基酸45的3’末端區(qū)域融合而成。
5.權(quán)利要求1和2的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它由登革病毒各血清型1、2、3和4的E蛋白質(zhì)286-426氨基酸的編碼序列與序列號(hào)29所示編碼MDH蛋白質(zhì)的3’末端區(qū)域融合而成。
6.權(quán)利要求1和2的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是編碼登革病毒兩種不同血清型的E蛋白質(zhì)286-426氨基酸的核苷酸序列與MDH序列的組合，其中對(duì)應(yīng)于E蛋白質(zhì)的序列之一插入編碼MDH蛋白質(zhì)氨基酸45的區(qū)域，而另一序列則融合至序列號(hào)29所示同一MDH序列的3’區(qū)。
7.重組嵌合蛋白質(zhì)，其特征在于它是權(quán)利要求1、2、3、4、5和6的核苷酸鏈的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)這些蛋白質(zhì)處于藥物制劑中時(shí)，能夠在受體中誘導(dǎo)血清型特異性針對(duì)登革病毒的每種血清型的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
8.嵌合重組蛋白質(zhì)，其特征在于它是權(quán)利要求1和6的核苷酸鏈的表達(dá)產(chǎn)物，并能夠在受體中誘導(dǎo)特異性針對(duì)登革病毒的兩種同源血清型的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2和3的基本如序列號(hào)24所示的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是序列表中序列號(hào)22和序列號(hào)23所示序列的組合，其編碼嵌合蛋白質(zhì)PLL1。
10.嵌合蛋白質(zhì)PLL1，根據(jù)權(quán)利要求1、2和7，其特征在于基本具有序列表中序列號(hào)25所示氨基酸序列，是序列號(hào)24的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)PLL1處于藥物制劑中時(shí)，能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)登革-2病毒的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
11.根據(jù)權(quán)利要求1、2和4基本如序列號(hào)27所示的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是序列表中序列號(hào)22和序列號(hào)26所示序列的組合，其編碼嵌合蛋白質(zhì)PLL2。
12.嵌合蛋白質(zhì)PLL2，根據(jù)權(quán)利要求1、2和7，其特征在于基本具有序列表中序列號(hào)28所示氨基酸序列，是序列號(hào)27的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)PLL2處于藥物制劑中時(shí)，能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)登革-2病毒的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
13.根據(jù)權(quán)利要求1、2和5基本如序列號(hào)30所示的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是序列表中序列號(hào)22和序列號(hào)29所示序列的組合，其編碼嵌合蛋白質(zhì)PLL3。
14.嵌合蛋白質(zhì)PLL3，根據(jù)權(quán)利要求1、2和7，其特征在于基本具有序列表中序列號(hào)31所示氨基酸序列，是序列號(hào)30的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)PLL3處于藥物制劑中時(shí)，能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)登革-2病毒的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
15.根據(jù)權(quán)利要求1、2和3基本如序列號(hào)33所示的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是序列表中序列號(hào)23和序列號(hào)32所示序列的組合，其編碼嵌合蛋白質(zhì)PLH1。
16.嵌合蛋白質(zhì)PLH1，根據(jù)權(quán)利要求1、2和7，其特征在于基本具有序列表中序列號(hào)34所示氨基酸序列，是序列號(hào)33的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)PLH1處于藥物制劑中時(shí)，能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)登革-1病毒的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
17.根據(jù)權(quán)利要求1、2和4基本如序列號(hào)35所示的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是序列表中序列號(hào)26和序列號(hào)32所示序列的組合，其編碼嵌合蛋白質(zhì)PLH2。
18.嵌合蛋白質(zhì)PLH2，根據(jù)權(quán)利要求1、2和7，其特征在于基本具有序列表中序列號(hào)36所示氨基酸序列，是序列號(hào)35的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)PLH2處于藥物制劑中時(shí)，能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)登革-1病毒的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
19.根據(jù)權(quán)利要求1、2和5基本如序列號(hào)37所示的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是序列表中序列號(hào)29和序列號(hào)32所示序列的組合，其編碼嵌合蛋白質(zhì)PLH3。
20.嵌合蛋白質(zhì)PLH3，根據(jù)權(quán)利要求1、2和7，其特征在于基本具有序列表中序列號(hào)38所示氨基酸序列，是序列號(hào)37的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)PLH3處于藥物制劑中，能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)登革-1病毒的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
21.根據(jù)權(quán)利要求1、2和3基本如序列號(hào)40所示的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是序列表中序列號(hào)23和序列號(hào)39所示序列的組合，其編碼嵌合蛋白質(zhì)PAZ1。
22.嵌合蛋白質(zhì)PAZ1，根據(jù)權(quán)利要求1、2和7，其特征在于基本具有序列表中序列號(hào)41所示氨基酸序列，是序列號(hào)40的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)PAZ1處于藥物制劑中時(shí)，能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)登革-3病毒的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
23.根據(jù)權(quán)利要求1、2和4基本如序列號(hào)42所示的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是序列表中序列號(hào)26和序列號(hào)39所示序列的組合，其編碼嵌合蛋白質(zhì)PAZ2。
24.嵌合蛋白質(zhì)PAZ2，根據(jù)權(quán)利要求1、2和7，其特征在于基本具有序列表中序列號(hào)43所示氨基酸序列，是序列號(hào)42的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)PAZ2處于藥物制劑中時(shí)，能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)登革-3病毒的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
25.根據(jù)權(quán)利要求1、2和5基本如序列號(hào)44所示的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是序列表中序列號(hào)29和序列號(hào)39所示序列的組合，其編碼嵌合蛋白質(zhì)PAZ3。
26.嵌合蛋白質(zhì)PAZ3，根據(jù)權(quán)利要求1、2和7，其特征在于基本具有序列表中序列號(hào)45所示氨基酸序列，是序列號(hào)44的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)PAZ3處于藥物制劑中時(shí)，能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)登革-3病毒的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
27.根據(jù)權(quán)利要求1、2和3基本如序列號(hào)47所示的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是序列表中序列號(hào)23和序列號(hào)46所示序列的組合，其編碼嵌合蛋白質(zhì)PID1。
28.嵌合蛋白質(zhì)PID1，根據(jù)權(quán)利要求1、2和7，其特征在于基本具有序列表中序列號(hào)48所示氨基酸序列，是序列號(hào)47的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)PID1處于藥物制劑中時(shí)，能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)登革-4病毒的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
29.根據(jù)權(quán)利要求1、2和4基本如序列號(hào)49所示的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是序列表中序列號(hào)26和序列號(hào)46所示序列的組合，其編碼嵌合蛋白質(zhì)PID2。
30.嵌合蛋白質(zhì)PID2，根據(jù)權(quán)利要求1、2和7，其特征在于基本具有序列表中序列號(hào)50所示氨基酸序列，是序列號(hào)49的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)PID2處于藥物制劑中時(shí)，能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)登革-4病毒的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
31.根據(jù)權(quán)利要求1、2和5基本如序列號(hào)51所示的嵌合核苷酸鏈，其特征在于它是序列表中序列號(hào)29和序列號(hào)46所示序列的組合，其編碼嵌合蛋白質(zhì)PID3。
32.嵌合蛋白質(zhì)PID3，根據(jù)權(quán)利要求1、2和7，其特征在于基本具有序列表中序列號(hào)52所示氨基酸序列，是序列號(hào)51的表達(dá)產(chǎn)物，當(dāng)PID3處于藥物制劑中時(shí)，能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)登革-4病毒的中和及保護(hù)性抗體的體液免疫應(yīng)答。
33.能夠在受體中誘導(dǎo)特異性針對(duì)登革病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答的藥物制劑，根據(jù)權(quán)利要求1，其特征在于具有兩種或多種如權(quán)利要求1、2、7、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32中所述的嵌合蛋白質(zhì)以及藥物載體。
34.權(quán)利要求33的藥物制劑，其特征在于它是針對(duì)登革病毒的預(yù)防劑或治療劑，可口服、肌內(nèi)、皮下、粘膜或靜脈內(nèi)使用。
35.診斷劑，其特征在于具有一種或多種如權(quán)利要求1、2、7、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32中所述的蛋白質(zhì)，用于登革病毒的診斷和血清分型。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備編碼蛋白質(zhì)的嵌合鏈，該蛋白質(zhì)能夠在受體中誘導(dǎo)針對(duì)病毒的效應(yīng)。所述蛋白刺激針對(duì)登革病毒感染的血清型特異性體液免疫應(yīng)答及保護(hù)作用，從而防止導(dǎo)致出血及該種病理相關(guān)的臨床并發(fā)癥的非特異性血清型病毒擴(kuò)增效應(yīng)。這些核酸鏈包含屬于具有腦膜炎球菌脫氫酶活性的突變蛋白質(zhì)基因的片段與編碼登革病毒包膜蛋白質(zhì)E的一個(gè)區(qū)域的片段的特定組合。而且，所述核酸鏈插入表達(dá)載體時(shí)可產(chǎn)生具有特定性質(zhì)的嵌合蛋白質(zhì)。本發(fā)明得到的嵌合分子可用于制藥工業(yè)，以產(chǎn)生可用于人體的高血清型特異性的診斷及疫苗制劑。
文檔編號(hào)C07K14/18GK1531548SQ02814350
公開(kāi)日2004年9月22日 申請(qǐng)日期2002年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月16日
發(fā)明者L·赫米達(dá)克魯茲, R·羅德里奎茲迪亞茲, L·拉佐瓦茲奎茲, A·祖盧塔默拉勒斯, C·洛佩茲阿巴拉特圭, I·瓦爾德斯普拉多, R·D·L·C·西爾瓦羅德里奎茲, G·奇納桑提格, G·E·奎倫尼托, M·G·古茲曼提拉多, B·D·L·C·西拉瓦茲奎茲, R·R·埃斯皮諾薩佩里茲, L C 西爾瓦羅德里奎茲, L C 西拉瓦茲奎茲, L 赫米達(dá)克魯茲, 古茲曼提拉多, 呂錕 鵲涎親, 埃斯皮諾薩佩里茲, 奎倫尼托, 敉咦瓤 , 濾蠱綻 , 繕Ｌ岣, 賬, 遄勸 屠 毓 申請(qǐng)人:遺傳工程與生物技術(shù)中心, 彼德羅擴(kuò)利熱帶醫(yī)學(xué)院