專利名稱：治療多發(fā)性骨髓瘤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療多發(fā)性骨髓瘤的方法。更特別地，本發(fā)明涉及通過施用類K121抗體(K121-like antibody)誘導(dǎo)骨髓瘤細胞中編程性細胞死亡的方法。
背景技術(shù)：
多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種B細胞惡性腫瘤，其特征在于在骨髓中聚集終末分化的B細胞(漿細胞)。近來的研究鑒別了在骨髓瘤漿細胞中存在的一些遺傳和分子缺陷(Drach，J.等(2000)，Cancer ResClin Oncol.126441；Ludwig，H.等(1999)Annals Oncol.10(6)S31)。這些資料表明多發(fā)分子事件導(dǎo)致有深遠意義的細胞遺傳不穩(wěn)定性，化療抗性及骨髓新血管化增加。目前治療MM的方法是大劑量化療和/或自體周圍血干細胞移植。現(xiàn)在比較偏愛后一治療方法，因為其5年存活率較高(52％對12％)。最近，抗血管發(fā)生劑如Thalidomide在大約30％的難治患者中產(chǎn)生了客觀應(yīng)答。盡管用這樣猛烈的藥物治療，MM仍然是不可逆轉(zhuǎn)地致命的，根據(jù)治療模式的不同平均存活時間為4-6年(Kyle，RA.等(2001)The Oncologist.6(2)119).。
在美國目前有40,000名MM患者，估計每年有大約14,000名新診斷的患者(Chauhan，D.和Anderson KC.(2001)Apoptosis.6(1-2)47)。根據(jù)國家的不同，MM在世界的發(fā)生率在1.5-4.5個人/100,000個人/年之間(Hurez，D.(1993)Revue du Praticien.43(3)271)。
MM中的惡性B細胞產(chǎn)生過量的輕鏈，這是免疫球蛋白的一種成分，這些輕鏈存在于患有該疾病的患者的血清和尿液中。大約70％的MM患者產(chǎn)生κ類型輕鏈，剩余30％患者產(chǎn)生λ類型輕鏈(Kyle，RA.(1999)Path Biol.47(2)148)。
K121是一種鼠單克隆抗體(mAb)，其特異性識別人游離κ輕鏈及在κ類型骨髓瘤細胞表面上表達的抗原。這個抗原稱為κ骨髓瘤抗原或KMA(Boux，HA.等(1983)J Exp Med.1581769)。已經(jīng)確定KMA由游離κ輕鏈組成，所述輕鏈與肌動蛋白非共價締合在細胞膜上表達(Goodnow等(1985)J.Immunol.1351276)。K121與任何正?；驉盒粤馨图毎蛘吲c完整的人免疫球蛋白分子均不呈現(xiàn)交叉反應(yīng)性(Boux，HA等(1984)Eur.J.Immunol.14216)。
已經(jīng)揭示了使用K121進行定量免疫分析以測定MM患者血清和尿液中的游離κ輕鏈(Axiak，SM.(1987)J Immunol Methods.99141)。近來的文獻提示量化游離輕鏈可用于監(jiān)測這些患者病情進展及對治療的反應(yīng)(Drayson，M.(2001)Blood 97(9)2900)。
也已經(jīng)提示K121可用于將細胞毒素輸送至κ骨髓瘤細胞(Goodnow等(1985)J.Immunol.1351276)。確實已經(jīng)揭示了一種免疫毒素作為治療MM的潛在治療劑，所述免疫毒素包含與K121 scFv片段連接的溶細胞肽蜂毒肽(scFv-mel)(Dunn，RD.等，(1996)Immunotechnology 2229)。
發(fā)明概述本發(fā)明人現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)單獨的K121(即未與毒素或胞毒劑綴合)能通過誘導(dǎo)編程性細胞死亡殺死攜帶KMA的細胞。另外，本發(fā)明人已經(jīng)證實K121單獨就能防止腫瘤細胞在體內(nèi)生長。這些發(fā)現(xiàn)表明類K121抗體在治療多發(fā)性骨髓瘤中能潛在地用作主要治療劑。
因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種治療κ類型多發(fā)性骨髓瘤的方法，所述方法包括為所述治療對象施用有效量的類K121抗體，其中所述類K121抗體未與毒素或胞毒劑綴合。
本發(fā)明還提供了類K121抗體在制備治療κ類型多發(fā)性骨髓瘤的藥物中的應(yīng)用，其中類K121抗體未與毒素或胞毒劑綴合。
在所述第一方面的一個優(yōu)選的實施方案中，所述方法還包括在施用類K121抗體之前治療所述對象以降低其體液中游離κ輕鏈水平的步驟。優(yōu)選地，所述對象血清中存在的游離κ輕鏈水平被降低。游離κ輕鏈水平的降低可通過例如血漿除去法(plasmapharesis)而實現(xiàn)。優(yōu)選對所述對象進行的降低游離κ輕鏈水平的治療就在施用類K121抗體之前進行。
第二方面，本發(fā)明提供了一種在治療對象體內(nèi)進行自體造血干細胞移植的方法，所述方法包括(i)從所述對象中獲得造血祖細胞群，(ii)用類K121抗體處理所述細胞群，(iii)將步驟(ii)的經(jīng)處理的細胞群移植入所述對象中，其中類K121抗體未與毒素或胞毒劑綴合。
在第二方面的一個優(yōu)選實施方案中，所述方法還包括將類K121抗體靜脈內(nèi)注入所述對象體內(nèi)。
在第二方面的一個優(yōu)選實施方案中，自體移植方法在腫瘤細胞減滅術(shù)(cytoreductive)治療期間或之后對所述對象進行。
第三方面，本發(fā)明提供了一種殺死混合細胞群中κ類型骨髓瘤細胞的方法，所述方法包括將所述混合細胞群與類K121抗體接觸，其中所述類K121抗體未與毒素或胞毒劑綴合。
第四方面，本發(fā)明提供了一種在攜帶KMA細胞中誘導(dǎo)編程性細胞死亡的方法，所述方法包括將所述細胞暴露于類K121抗體，其中類K121抗體未與毒素或胞毒劑綴合。
在第四方面的一個優(yōu)選的實施方案中，所述攜帶KMA的細胞是κ類型骨髓瘤細胞。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述類K121抗體包含K121抗體的CDR環(huán)(CDR1，CDR2和CDR3)，如圖9a所示。在另一個實施方案中，所述類K121抗體包含K121抗體的VH和VL基因，如圖9a所示。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，所述類K121抗體是一種嵌合抗體或人源化抗體。
附圖簡述

圖1(a)通過胞質(zhì)LDH滲漏測定的mAb K121對HMy2和K562類淋巴母細胞的胞毒性活性(在492nm的吸光度)。將細胞在有或無K121 mAb(6.25μM)的情況下溫育20小時。(b)K121誘導(dǎo)細胞死亡的動力學(xué)。(c)K121殺死HMy2細胞的濃度依賴性。
圖2K121誘導(dǎo)的HMy2編程性細胞死亡的流式細胞計量分析。與PBS或K121溫育16和20小時的HMy2細胞的光散射。FSC和SSC分別相應(yīng)于細胞大小和細胞復(fù)雜度。
圖3(a)使用膜聯(lián)蛋白V-FITC對K121誘導(dǎo)的HMy2編程性細胞死亡的流式細胞計量分析。將HMy2細胞在無K121(對照)或有K121的情況下在37℃溫育16或20小時。然后將該細胞與膜聯(lián)蛋白V-FITC溫育并用碘化丙錠復(fù)染。(b).與膜聯(lián)蛋白V分析平行進行的K121 mAb對HMy2細胞的胞毒性。將HMy2細胞在無K121 mAb(對照)或有K121 mAb(5.35μM)的情況下在37℃溫育16或20小時。收獲培養(yǎng)上清以分析胞質(zhì)LDH滲漏。
圖4(a)使用TUNEL分析對K121誘導(dǎo)的HMy2編程性細胞死亡的流式細胞計量分析。將HMy2細胞在無K121(對照)或有K121的情況下在37℃溫育16或20小時。然后將細胞固定并將胞內(nèi)DNA在3’末端用熒光素-12-dUTP酶促標記。(b)與TUNEL分析平行進行的與或不與K121溫育16和20小時后HMy2細胞的胞毒性。將HMy2細胞在無K121 mAb(對照)或有K121 mAb(5.35μM)的情況下在37℃溫育16或20小時。收獲培養(yǎng)上清以分析胞質(zhì)LDH滲漏。
圖5在進行以下處理之后，SCID小鼠中HMy2分泌的人IgG的血清水平時程(a)未處理(PBS)，(b)用scFv-mel處理，或者(c)用K121 mAb處理。在第0天i.p.注射細胞(107)及在第1-3天用scFv-mel(0.5mg/劑)或K121 mAb(1.25mg/劑)處理。在處理組內(nèi)，每個符號代表一個小鼠的IgG值。
圖6抗體處理對SCID小鼠中腫瘤生長的作用。在第0天為SCID小鼠注射HMy2細胞并施用K121 Mab三天(第1，2和3天)，總劑量水平為3.0，1.5，0.3，0.15和0(PBS對照)mg。通過量化小鼠血清中人IgG而確定腫瘤生長情況。圖示數(shù)值是6只小鼠的平均值，但未處理組第6周的數(shù)值除外，該數(shù)值來自一個小鼠。
圖7抗體劑量對攜帶腫瘤的小鼠存活率的作用。
圖8在注射腫瘤細胞42天后，未處理及抗體處理的小鼠血清中人IgG水平。數(shù)值針對各個小鼠。*人IgG未檢測到；死亡。
圖9(a)K121重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)氨基酸序列和相應(yīng)的DNA序列。CDR區(qū)域以黑體字示出。(b)衍生自K121的VH基因的重疊寡核苷酸(VH1-VH6)。(c)衍生自K121的VL基因的重疊寡核苷酸(VL1-VL6)。(d)K121 VH的寡核苷酸延伸的PCR引物。(e)K121 VL的寡核苷酸延伸的PCR引物。(f)使用寡核苷酸延伸產(chǎn)生K121單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的方法圖示。
圖10通過PCR擴增K121 VH和VL基因的PCR引物。下劃線處是定向克隆入哺乳動物表達載體中的限制酶位點。cK-VH-R和cK-VL-R引物包括一個剪接受體位點(黑體字所示)。
圖11(a)用于檢測和定量轉(zhuǎn)染的CHO細胞上清中人抗體的ELISA。將轉(zhuǎn)染的CHO細胞的培養(yǎng)上清系列稀釋，使用山羊抗人Fc特異性AP綴合物檢測與固定化山羊抗人IgG+A+M結(jié)合的人抗體。使用人IgG1κ的系列稀釋液平行作標準曲線。通過顯色及在405nm測定的吸光度觀測結(jié)合的抗體。(b)用于檢測與人κ輕鏈結(jié)合的嵌合K121的ELISA。將轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的CHO細胞的培養(yǎng)上清系列稀釋，使用山羊抗人Fc特異性AP綴合物檢測與固定化人κ輕鏈結(jié)合的抗體。在顯色之后，通過在405nm的吸光度檢測結(jié)合的抗體。
圖12嵌合的K121(cK121)對HMy2和K562類淋巴母細胞的胞毒性活性，通過胞質(zhì)LDH滲漏測定。將靶細胞在37℃，在5％CO2氣氛中，在存在PBS(對照)，5.5μM鼠K121(mK121)或者0.8μM嵌合K121(cK121)的情況下溫育20小時。
圖13各個克隆分泌的cK121的濃度。cK121的濃度使用抗人IgG，IgA和IgM包被的孔通過ELISA確定。數(shù)據(jù)表示陽性克隆1-5和陰性克隆6。
圖14(a)使用人VL基因作為構(gòu)架人源化K121 VL的方法圖示。(b)人構(gòu)架VL和K121 VL的DNA序列。(c)使用PCR人源化K121 VL的寡核苷酸。
圖15(a)K121和人VH3(hVH)可變重鏈基因的DNA序列。(b)用于人源化K121中的VH誘變引物。
發(fā)明詳述本文所用短語“類K121抗體”是指一種抗體，其與具有圖9a所示VH和VL區(qū)域的抗體競爭結(jié)合κ類型骨髓瘤細胞。優(yōu)選地，術(shù)語“類K121抗體”是指一種抗體，其與具有圖9a所示VH和VL區(qū)域的抗體結(jié)合相同的表位。
所述類K121抗體優(yōu)選包含K121抗體的CDR環(huán)(CDR1，CDR2和CDR3)，如圖9a所示。所述類K121抗體可包含圖9a所示K121抗體的VH和VL基因。
類K121抗體可以通過其與K121(或嵌合或人源化形式的K121)競爭結(jié)合HMy2細胞上KMA的能力而鑒別。在這個程序中，可使用公知的程序(Hofmann K，等(1982)Biochemistry 21978-84)將K121與生物素綴合。然后通過其與生物素?；腒121競爭結(jié)合HMy2細胞上的KMA的能力而評價類K121抗體。生物素?；腒121與HMy2細胞的結(jié)合可通過加入熒光素標記的鏈親和素而確定，所述鏈親和素結(jié)合K121分子上的生物素。然后通過流式細胞計量術(shù)量化細胞的熒光染色，類K121抗體的競爭作用以相對于無競爭劑情況中獲得的熒光水平的百分率表示。
針對本發(fā)明的目的，術(shù)語“抗體”，除非特別說明，包括保留與靶抗原結(jié)合性的整個抗體的二價片段。這種片段包括例如F(ab′)2片段。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，類K121抗體是一種重組或單克隆抗體。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是嵌合的或人源化抗體。
當(dāng)在本發(fā)明的方法中使用時，類K121抗體是不與毒素或胞毒劑綴合的。“毒素”是指本領(lǐng)域已知的任何毒素，如蓖麻毒蛋白，沙卜林(saprin)，白喉毒素和假單胞菌外毒素?！鞍緞笔侵甘辜毎芙獾囊环N制劑如蜂毒肽。
在本說明書中，術(shù)語“包含”是指包含所述的要素、整數(shù)或步驟，或者要素、整數(shù)或步驟組，但不排除任何其它要素、整數(shù)或步驟，或者其它要素、整數(shù)或步驟組。
單克隆抗體本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地產(chǎn)生KMA表位的單克隆抗體。通過雜交瘤生產(chǎn)單克隆抗體的一般方法是熟知的。產(chǎn)生抗體的無限增殖細胞系可通過細胞融合產(chǎn)生，也可以通過其它技術(shù)產(chǎn)生，如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細胞，或者用Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)染?？筀MA表位產(chǎn)生的單克隆抗體組合可針對各種性質(zhì)加以篩選，即針對同種型和表位親和性加以篩選。
小鼠衍生的單克隆抗體可用于直接在體內(nèi)或者在體外進行免疫治療這兩種情況。然而，已經(jīng)觀測到當(dāng)小鼠衍生的單克隆抗體用于人體作為治療劑時，患者產(chǎn)生人抗小鼠抗體。因此，小鼠衍生的單克隆抗體用于治療，尤其是長期使用不是優(yōu)選的。然而，使用熟知的遺傳工程技術(shù)可以產(chǎn)生嵌合或人源化的抗體，所述抗體具有動物衍生的及人衍生的部分。所述動物可以是小鼠或另一種嚙齒動物如大鼠。
如果嵌合抗體的可變區(qū)是小鼠衍生的而恒定區(qū)是人衍生的，則該嵌合抗體一般比“純”小鼠衍生的單克隆抗體的免疫原性低。如果“純”小鼠衍生的抗體是不適合的，這些嵌合抗體可能更適于治療應(yīng)用，嵌合抗體產(chǎn)生嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的。例如輕鏈和重鏈可使用例如免疫球蛋白輕鏈和免疫球蛋白重鏈在單獨的質(zhì)粒中分別表達。然后將其純化并在體外裝配為完整抗體；對實現(xiàn)這種裝配的方法已有描述。見例如Scharff，M.，Harvey Lectures 69125(1974)所述。也見于Oi等，Bio Techniques 4(4)214-221(1986)；及Sun等，Hybridoma 5(1986)Suppl 1517-20所述。這種DNA構(gòu)建體可包含與編碼人恒定區(qū)的DNA連接的編碼類K121抗體的輕鏈或重鏈的可變區(qū)的功能性重排基因的DNA。淋巴樣細胞如用編碼輕鏈和重鏈的所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的骨髓瘤或雜交瘤可表達及裝配所述抗體鏈。
從還原的分離的輕鏈和重鏈中形成IgG抗體的體外反應(yīng)參數(shù)也已經(jīng)描述。見例如Beychok，S.，Cells of Immunoglobulin Synthesis，學(xué)術(shù)出版社，紐約，p.69，1979。輕鏈和重鏈在相同細胞中共表達以實現(xiàn)重鏈和輕鏈胞內(nèi)締合及連接成為完整的H2L2IgG抗體也是可能的。這種共表達可以使用相同宿主細胞中的相同或不同質(zhì)粒實現(xiàn)。
人源化抗體在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，類K121抗體是人源化的，即通過分子模型技術(shù)產(chǎn)生的抗體，其中抗體的人含量最大且小鼠抗體可變區(qū)所帶來的結(jié)合親和性幾乎不喪失或不喪失。
以下所述方法可用于人源化類K121抗體。可使用兩步方法，包括(a)選擇用作人源化的人構(gòu)架的人抗體序列，(b)確定應(yīng)選擇動物單克隆抗體的哪些可變區(qū)殘基插入選擇的人構(gòu)架中。
第一步包括選擇最佳的可利用的人構(gòu)架序列，其序列信息是可獲得的。這個選擇方法基于以下選擇標準。
(1)相同性百分率將準備人源化的動物單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列與所有已知的人抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列進行最佳排列并優(yōu)選地進行對比。
一旦這樣對比序列，記錄殘基相同性并確定相同性百分率。所有其它因素均是相同的情況下，希望的是選擇與所述動物抗體具有最高百分率相同性的人抗體。
(2)序列分歧(sequence ambiguities)在序列是通過直接蛋白質(zhì)測序而衍生的情況中，可以評價已知人抗體鏈序列中未鑒別的殘基和/或分歧的存在情況，所述分歧是序列不確定性。最常見的這種不確定性是由于在測序程序期間丟失一個氨而將一個酰胺氨基酸錯誤鑒別為一個酸性氨基酸，例如當(dāng)真正存在于蛋白質(zhì)中的殘基是谷氨酰胺殘基時不正確地鑒別是谷氨酸殘基。所有其它因素是相同的情況下，希望的是選擇這種分歧盡可能少的人抗體。
(3)Pin-區(qū)域間隔抗體鏈可變區(qū)含有結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵。包含這些鍵的半胱氨酸殘基之間的距離(殘基數(shù))稱為Pin-區(qū)域間隔(Pin-region spacing，Chothia等，J.Mol.Biol.196901(1987))。所有其它因素是相同的情況下，最希望的是所選擇的人抗體的Pin區(qū)域間隔與動物抗體的Pin區(qū)域間隔相似或相同。也希望人序列Pin區(qū)域間隔與已知抗體三維結(jié)構(gòu)的Pin區(qū)域間隔相似，以便于計算機建模。
基于前述標準，選擇具有最佳全部希望的特性組合的人抗體作為人源化動物抗體的構(gòu)架。選擇的重鏈和輕鏈可以來自相同或不同的人抗體。
本發(fā)明方法中的第二步包括確定應(yīng)選擇哪個動物抗體可變區(qū)序列接入人構(gòu)架中。這個選擇方法基于以下選擇標準(1)殘基選擇評價動物抗體序列中兩種類型的潛在可變區(qū)殘基，第一種稱為“最小殘基”。這些最小殘基包含CDR結(jié)構(gòu)環(huán)加上任何額外的如計算機建模所示的支持和/或定向所述CDR結(jié)構(gòu)環(huán)所需的殘基。
另一類型的潛在可變區(qū)殘基稱為“最大殘基”。其包含最小殘基加上任何額外的如通過計算機建模所確定的落入大約10的CDR結(jié)構(gòu)環(huán)殘基內(nèi)并具有水溶劑可及表面的殘基(Lee等，J.Biol.Chem.55379(1971))。
(2)計算機建模為鑒別潛在的可變區(qū)殘基，對以下結(jié)構(gòu)進行計算機建模，(a)準備人源化的動物抗體的可變區(qū)序列，(b)選擇的人抗體構(gòu)架序列，及(c)包含人抗體構(gòu)架序列的所有可能的重組抗體，其中已經(jīng)接入各種最小和最大動物抗體殘基。
使用適于蛋白質(zhì)建模的軟件及得自一抗體的結(jié)構(gòu)信息進行計算機建模，所述抗體(a)具有與動物抗體的那些序列最接近相同的可變區(qū)氨基酸序列，(b)具有已知的三維結(jié)構(gòu)?？梢允褂玫能浖缡荢YBYL Biopolymer Module軟件(Tripos Associates)。從中可獲得結(jié)構(gòu)信息的抗體可以是但非必須是人抗體。
基于在前述分析中獲得的結(jié)果，選擇如下重組鏈以進行人源化，所述重組鏈含有產(chǎn)生最接近動物抗體結(jié)構(gòu)的計算機建模結(jié)構(gòu)的動物可變區(qū)。
完整人抗體可通過使用人免疫球蛋白表達文庫(Stratagene Corp.，La Jolla，Calif.)產(chǎn)生，以產(chǎn)生人抗體片段(VH，VL，F(xiàn)V，F(xiàn)d，F(xiàn)ab或F(ab′)2)，及使用與產(chǎn)生嵌合抗體相似的方法用這些片段構(gòu)建完整人抗體。
施用模式類K121抗體可直接施用于需要治療多發(fā)性骨髓瘤的患者。
腫瘤細胞的生長可通過為患者施用治療有效量類K121抗體而得以抑制或降低。典型地，施用的抗體量可以是大約0.001-2000mg/kg體重/劑，更優(yōu)選為大約0.01-500mg/kg體重/劑。根據(jù)主治醫(yī)生的處方可重復(fù)施用。然而，其它量也是合適的。一般地，抗體的施用通過輸注而進行，以便可能產(chǎn)生有害作用的抗體量可以通過改變施用速度而控制。典型地，單次劑量的輸注可以持續(xù)幾個小時。然而，針對治療目的也期望持續(xù)輸注單次劑量以使得血清中抗體水平保持恒定?？扇缦螺斪㈩怟121抗體。靜脈內(nèi)(I.V.)管道可例如用0.9％NaCl和5％血清白蛋白預(yù)處理，并放置以進行靜脈內(nèi)施用。靜脈內(nèi)輸注可包含總體積為250ml的0.9％NaCl和5％人血清白蛋白，并根據(jù)觀測到的任何速度依賴性副作用而在大約2小時期間輸注完畢。例如應(yīng)在輸注期間每15分鐘及每次輸注后1小時獲取生命體征直至穩(wěn)定。在輸注之前及之后進行徹底的心肺功能檢測。隨時準備藥物包括對乙酰氨基酚，苯海拉明，腎上腺素和皮質(zhì)類固醇以處理可能發(fā)生的過敏反應(yīng)。所述抗體可根據(jù)醫(yī)生希望的結(jié)果而重復(fù)施用。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員意識到，一些骨髓瘤患者在其循環(huán)中具有顯著水平的游離κ輕鏈。由于類K121抗體與游離κ輕鏈反應(yīng)，因此其在患者體液中的存在可降低治療效力。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述治療方法還包括在施用類K121抗體之前處理治療對象，以降低其體液(例如血液)中循環(huán)的游離κ輕鏈水平的步驟。這個額外的治療步驟可包括例如血漿去除法。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，血漿去除法是通過稱為細胞分離器的設(shè)備將血漿從血細胞中去除的方法。所述分離器通過高速旋轉(zhuǎn)血液以從液體中分離細胞或者通過將血液經(jīng)過一個孔徑很小只允許血漿通過的膜而運行。將細胞回輸入患者，而含有游離κ輕鏈的血漿則棄去并用其它液體代替。在進行該步驟期間可通過靜脈給予保持血液免于凝集的藥物(例如抗凝血劑)。
類K121抗體也可用于從生物學(xué)樣品中清除惡性漿細胞，所述樣品是體液或組織樣品。從體液樣品中清除骨髓瘤細胞是本發(fā)明的一部分，并可以通過將懷疑包含惡性漿細胞的生物學(xué)液體與類K121抗體接觸而實施，所述抗體能選擇性結(jié)合惡性細胞并導(dǎo)致其編程性細胞死亡。這種方法可用于清除源于體內(nèi)的不必要的細胞，通過從患者體內(nèi)提取生物學(xué)樣品，通過類K121抗體誘導(dǎo)的編程性細胞死亡而清除惡性細胞，然后為患者補充凈化的樣品。
應(yīng)意識到包括使用類K121抗體的治療多發(fā)性骨髓瘤的方法可以單獨進行或者作為已知化療或放療方案的輔助方法進行。例如，類K121抗體治療可與藥物如苯丙氨酸氮芥或環(huán)磷酰胺治療聯(lián)合或者在其之后進行。
為了可以更清晰地理解本發(fā)明，參考以下非限制性實施例描述優(yōu)選的形式。
實施例1評定胞毒性mAb K121的胞毒性使用CytoTox96非放射性胞毒性分析試劑盒(Promega)評價，其測定在細胞溶解期間由細胞釋放入上清中的乳酸脫氫酶(LDH)。從原種培養(yǎng)物中收獲HMy2(KMA陽性)和K562(KMA陰性)細胞，以1×106個細胞/ml再懸浮于補加5％FBS的2×RPMI中。將3×104細胞等份加入96孔組織培養(yǎng)平板的各個孔中。將濃度為2.5，5.0，7.5，10，12.5μM的K121 mAb以30μl體積一式兩份加入合適的孔中。在37℃，在5％CO2氣氛中溫育20小時后，收集每個孔的上清并在3000g離心1分鐘。將澄清的上清(50μl)移至另一個96孔微滴定分析平板中，與等體積的底物混合。將該平板在室溫黑暗溫育30分鐘，并用50μl終止溶液終止反應(yīng)。在OrganonTeknika microelisa平板讀出器上(Tumhout，Belgium)測定492nm處吸光度值。單獨的培養(yǎng)基(補加2.5％FBS的1×RPMI)作為背景對照，因為培養(yǎng)基中的FBS和酚紅可導(dǎo)致明顯提高的LDH水平。針對時程研究，將HMy2細胞與12.5μM的K121 mAb溫育，在加入所述抗體4，8，12，16和20小時后收獲培養(yǎng)上清。
實施例2編程性細胞死亡分析K121對HMy2細胞的胞毒性活性的機制以兩種方式評價膜聯(lián)蛋白V結(jié)合及TUNEL分析。在這兩種分析期間進行平行LDH分析以證實發(fā)生細胞死亡。
膜聯(lián)蛋白V結(jié)合膜聯(lián)蛋白V是一種蛋白質(zhì)，其特異性結(jié)合細胞膜內(nèi)的磷脂酰絲氨酸。一旦所述膜開始出現(xiàn)破壞及磷脂“翻轉(zhuǎn)入”胞外基質(zhì)中，則發(fā)生結(jié)合。結(jié)果是該方法測定編程性細胞死亡的最早階段。以下簡要描述膜聯(lián)蛋白V結(jié)合方法。從原種培養(yǎng)物中收獲HMy2細胞，再懸浮于補加5％FBS的1×RPMI中，至密度為1×106個細胞/ml。將500μl細胞等份加入6孔組織培養(yǎng)平板中。將濃度為10.7μM的等體積的K121 mAb加入細胞中，在37℃在5％CO2氣氛中溫育分析平板。加入等體積的PBS作為陰性對照。在16和20小時從孔中通過離心收獲細胞。取一等份上清分析胞外LDH，細胞沉淀在結(jié)合緩沖液(10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl2.2H2O)中洗滌。將洗滌的細胞再懸浮于100μl結(jié)合緩沖液中，用2μl膜聯(lián)蛋白V-FITC(Bender MedSystems，Vienna，Austria)在室溫溫育15分鐘。加入另外400μl結(jié)合緩沖液，將細胞計數(shù)器用1μl的1mg/ml碘化丙錠(Sigma-Aldrich，St Louis，MI)在冰上染色15分鐘。然后使用FACScan(BD)通過流式細胞計量術(shù)分析細胞。
TUNEL分析在編程性細胞死亡的最后階段，染色體DNA經(jīng)歷一種特殊的片段化模式。TUNEL分析依賴于末端轉(zhuǎn)移酶標記片段化的DNA的3’末端。因此，該分析是測定編程性細胞死亡的最后階段。簡而言之，準備含有在K121/或PBS存在下的HMy2細胞的孔各一式兩份，如前述溫育。使用編程性細胞死亡檢測系統(tǒng)熒光素(Promega，Madison，WI)進行TdT-介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記(TUNEL)分析。制備細胞并如廠商指導(dǎo)進行分析。簡而言之，將細胞在PBS中洗滌，用10％甲醛及隨后的70％乙醇固定。胞內(nèi)DNA用熒光素-12-dUTP在3’末端酶促標記，并在FACScan上分析。
實施例3SCID小鼠腫瘤模型為評價K121在體內(nèi)的潛在抗腫瘤作用，將6周齡的SCID小鼠在第0天腹膜內(nèi)(i.p.)注射HMy2細胞。在注射腫瘤細胞之后，通過i.p.注射為小鼠施用K121抗體或PBS。由于HMy2細胞分泌人IgG，腫瘤生長的進程通過使用人IgG特異性免疫分析量化受體小鼠血清中人IgG而監(jiān)測。
實施例4量化人IgG使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)量化SCID小鼠血清中人IgG的水平。將于PBS-Az中的蛋白質(zhì)A(100μg/ml的50μl/孔)在96孔ELISA平板中在37℃溫育1小時。將孔用PBS-Az洗滌三次，并用于PBS-Az中的3％BSA在37℃封閉1小時。將孔在PBS-Az中洗滌兩次，并與50μl/孔的用PBS-Az中1％BSA稀釋2.5倍的小鼠血清在37℃溫育1小時。在用PBS-Az洗滌3次后，結(jié)合的抗體用50μl/孔的山羊抗人κ-輕鏈AP綴合物(于1％BSA-PBS-Az中1∶1000稀釋)在37℃檢測1小時。結(jié)合的抗原—抗體復(fù)合物通過加入于ELISA底物緩沖液(0.1M甘氨酸，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，pH10.4)中的對硝基苯磷酸(pNPP)底物(50μl/孔，1mg/ml)，隨后在PBS-Az中洗滌2次，在MilliQ水中洗滌1次，及在ELISA底物緩沖液中洗滌1次而觀測。在室溫生色10分鐘，通過加入3M NaOH(50μl/孔)終止反應(yīng)。在405nm的吸光度使用Organon Teknika microelisa平板讀出器(Turnhout，Belgium)確定。
為量化人IgG，在此分析中包括一個標準曲線。小鼠血清用系列稀釋的純化的IgG1κ(6μg/ml-6ng/ml；Serotec Ltd，Oxford，England)代替。
實施例5與K121溫育導(dǎo)致攜帶抗原的細胞死亡將HMy2和K562細胞與K121溫育表明mAb以時間和濃度依賴性方式誘導(dǎo)特異的靶細胞死亡(圖1)。K121的胞毒性在加入靶細胞培養(yǎng)物后大約12小時第一次檢測到，細胞死亡水平在隨后的8小時增加。K121的胞毒性作用在終濃度為3.6μM時最大，在2.5μM檢測到明顯的胞毒性。在沒有加入的補充效應(yīng)細胞或血清成分(即補體)的情況下存在觀測到的K121的胞毒性活性。
在有或無K121情況下溫育的HMy2細胞在倒置光學(xué)顯微鏡下在200×放大倍率觀測。同時研究與scFv-mel免疫毒素(Dunn，RD.等，(1996)Immunotechnology 2229)溫育的HMy2細胞。與K121 Mab溫育的細胞示出細胞收縮及膜“水泡樣”跡象。對比之下，scFv-mel導(dǎo)致細胞成塊及膜溶解。
K121處理的HMy2細胞的流式細胞計量術(shù)示出與未處理的細胞相比90°光散射性質(zhì)提高(圖2)，反映了抗體處理的細胞中內(nèi)在粒度和染色質(zhì)濃縮增加。抗體處理的細胞的前向光散射性質(zhì)也降低，表示細胞收縮。由K121處理的細胞粒度增加、染色質(zhì)濃縮及細胞收縮的組合提示這些細胞由于誘導(dǎo)編程性細胞死亡的結(jié)果而死亡。
實施例6K121與靶細胞相互作用誘導(dǎo)編程性細胞死亡使用兩種獨立的分析系統(tǒng)以確定K121殺死攜帶抗原的細胞的機制。早期編程性細胞死亡通過膜聯(lián)蛋白V與K121處理的細胞的結(jié)合而評估。用膜聯(lián)蛋白V-FITC進行免疫熒光染色表明與非抗體處理的細胞相比，在開始用K121處理后16和20小時陽性染色的HMy2細胞數(shù)增加(圖3a)。通過用碘化丙錠染色(圖3a)及LDH滲漏(圖3b)確定，膜聯(lián)蛋白V染色的細胞百分率增加與死亡細胞的比例增加相關(guān)。
使用TUNEL方法評定DNA的片段化，這是編程性細胞死亡的晚期階段。當(dāng)與未處理的細胞相比時，在與K121溫育的HMy2細胞中觀測到的熒光變化在溫育16和20小時后明顯(圖4a)，而且是與編程性細胞死亡相關(guān)的典型DNA片段化模式。同樣地，通過LDH的滲漏確定編程性細胞死亡的測定與死亡細胞數(shù)增加相關(guān)(圖4b)。當(dāng)將這些數(shù)據(jù)組合在一起時，示出K121處理的細胞正在經(jīng)歷編程性細胞死亡。
實施例7K121阻止小鼠中HMy2腫瘤細胞生長為在第0天接受107個HMy2細胞的SCID小鼠在第1，2和3天連續(xù)施用3劑K121(1.25mg/劑)(n＝6)或scFv-mel(0.5mg/劑)(n＝7)，或者施用PBS(1.25mg/劑)(n＝6)作為治療對照。在施用腫瘤細胞之前及在注射腫瘤細胞后每周一次間隔取血液樣品，通過動物血清中人IgG的出現(xiàn)情況監(jiān)測HMy2細胞的生長。在PBS處理的對照小鼠中，人IgG在6只動物血清中均檢測到(圖5a)，時間為在注射腫瘤細胞后3-8周的范圍內(nèi)首次檢測到人IgG。相似地，用免疫毒素處理的小鼠示出在注射細胞后3周人IgG水平提高(圖5b)。形成對照的是在K121處理的動物血清中在同樣時間未檢測到人IgG(圖5c)?？偟膩碚fPBS和scFv-mel處理的動物呈現(xiàn)腹脹，變得昏睡及在9周后6只小鼠中有5只死亡。用K121處理的小鼠不呈現(xiàn)這種癥狀，所有小鼠在第9周均存活，此時從該組中取一小鼠與在對照組中存活的小鼠一起處死并尸檢。K121處理的動物無明顯器官異常。然而未處理的動物在腹腔內(nèi)有大塊腫瘤，脾大，及肺萎縮。將這兩只動物的組織樣品通過免疫細胞化學(xué)方法檢測HMy2浸潤情況。這些研究清楚表明單獨的K121在免疫缺陷的(SCID)小鼠模型中能阻止人體類淋巴母細胞腫瘤細胞生長。
在第二個例子中，將SCID小鼠在第0天注射107HMy2細胞，如下在第1，2和3天接受各種劑量水平的K1211組PBS對照(n＝6)2組1.0mg K121/劑，總抗體劑量為3.0mg(n＝6)。
3組0.5mg K121/劑，總抗體劑量1.5mg(n＝6)。
4組0.1mg K121/劑，總抗體劑量0.3mg(n＝6)。
5組0.05mg K121/劑，總抗體劑量0.15mg(n＝6)。
通過量化小鼠血清中人IgG監(jiān)測腫瘤進展。
所有未處理的小鼠示出在第28天人IgG水平提高(圖6)，該組小鼠在第42天大部分(4/5)死亡(圖7)。尸檢表明脾大及肉眼可見肝臟和腎臟腫瘤。用K121處理攜帶腫瘤的小鼠示出腫瘤進展延遲發(fā)作或者完全沒有腫瘤生長，這由血清中人IgG水平示出(圖6和8)，在第56天結(jié)束試驗進行尸檢。在4個處理組中，24只小鼠有7只在第42天示出其血清中不可檢測到人IgG水平(圖8)。這些小鼠中有6只在第56天尸檢示出無明顯腫瘤生長跡象。所有未處理的小鼠在第49天死亡或者出于倫理原因而安樂死，而抗體處理組的小鼠有13/24在第56天仍存活(圖7)。
概括而言，攜帶腫瘤的小鼠以劑量依賴性方式對K121處理有反應(yīng)。在第42天在30％的小鼠中完全沒有腫瘤生長，這種作用在接受總劑量為1.5mg K121的小鼠中最明顯(圖8)。在未處理的小鼠中腫瘤進展迅速及具有浸潤性，在第49天死亡率為100％(圖7)。在此時，組合處理組示出死亡率低于10％。
實施例8使用PCR通過寡核苷酸裝配合成類K121抗體通過使用PCR延伸合成寡核苷酸而產(chǎn)生單克隆抗體的策略的一個實例已經(jīng)在文獻中加以描述(Sato等(1994)Molecular Immunology 31(5)371)。為從公布的DNA序列(如圖9a所示)中產(chǎn)生類K121單克隆抗體，VH基因可分為6個重疊寡核苷酸VH1-VH6(圖9b)。同樣，K121 VL基因可分為6個重疊寡核苷酸VL1-VL6(圖9c)。VH寡核苷酸有三個具有有義DNA序列(圖9d，VH1，3和5)，三個具有反義DNA序列(圖9d，VH2，4和6)。相似地，VL寡核苷酸有三個具有有義DNA序列(圖9e，VL1，3和5)，三個具有反義DNA序列(圖9e，VL2，4和6)。
使用Taq聚合酶的第一個PCR裝配三套寡核苷酸以生產(chǎn)三種雙鏈DNA片段(圖9f)。然后將第一次擴增的三個產(chǎn)物通過凝膠提取，分離的DNA片段用作模板使用Taq聚合酶裝配完整基因序列。在VH基因的最后裝配中，使用與所述基因的5’區(qū)域(VHF)互補的PCR引物及與所述基因3’區(qū)域(VHR)互補的反義引物，產(chǎn)生完整的K121 VH基因序列。相似地，用VL基因的5’(VLF)和3’(VLR)區(qū)域的PCR引物擴增完整的K121 VL基因。最后的基因產(chǎn)物應(yīng)加以測序以證實全部V基因的存在及保真性。
合成的K121 VH和VL基因然后應(yīng)連接入一種哺乳動物表達載體中，所述載體含有相關(guān)的小鼠Ig恒定區(qū)基因，重鏈為Cγ1，輕鏈為Cκ。然后將哺乳動物細胞系用所得載體轉(zhuǎn)染，通過如針對嵌合抗體所述免疫分析監(jiān)測功能性K121的表達。
實施例9構(gòu)建嵌合抗體cK121分離K121 VH和VL基因單克隆抗體K121的重鏈可變區(qū)基因(K121 VH)和輕鏈可變區(qū)基因(K121 VL)通過PCR分離。擴增VH和VL基因的模板是scFv-mel基因構(gòu)建體。設(shè)計用于擴增的PCR引物(圖10)以將用于定向克隆的合適限制位點導(dǎo)入哺乳動物表達載體pCMV-γ1和pCMV-KR(Mahler等，(1997)Immunotechnology 331)。
PCR擴增產(chǎn)物通過在1％瓊脂糖凝膠上電泳而分離，期望大小的DNA條帶使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen，德國)提取。然后將分離的基因片段連接入pGEM-T載體中并轉(zhuǎn)化進感受態(tài)細菌細胞JM109(Promega，美國)中。在過夜溫育后，使用載體特異性引物(M13)進行PCR篩選以篩選含有插入體的菌落。選擇VH和VL的陽性克隆，使用Wizard Mini-prep試劑盒(Promega，美國)制備質(zhì)粒DNA。將代表VH和VL的兩個克隆由Sydney University PrinceAlfred Macromolecular Analysis Centre(SUPAMAC)在ABI自動DNA測序儀上測序。K121 VH和VL的DNA序列與圖9a所示那些相同，額外的限制酶位點及核苷酸插入PCR引物(圖10)中。
將K121 VH和VL連接入表達載體中K121 VH和VL的基因使用限制酶Bam HI和Apa LI從pGEM-T克隆中切割下來。切割下來的VH和VL插入體通過凝膠提取而純化。重鏈和輕鏈的前導(dǎo)序列通過用Apa LI和Hind III限制pCMV-γ1，隨后通過凝膠提取前導(dǎo)序列插入體而分離。將Hind III和Apa LI消化的前導(dǎo)序列與K121 VH和VL基因同時連接入Hind III和BamHI限制的pCMV-γ1和pCMV-KR中。在轉(zhuǎn)化入感受態(tài)JM109細胞中之后，含有插入體的菌落使用VH和VL基因特異性引物通過PCR篩選。從陽性克隆中制備質(zhì)粒DNA，插入體通過用限制酶Bam HI和Hind III消化而證實。在此階段，應(yīng)對pCMV-γ1-cVH和pCMV-KR-cVL質(zhì)粒使用載體特異性引物測序，以證實正確的K121 VH和VLDNA序列。
將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CHO細胞中將CHO-K1(中國倉鼠卵巢)細胞在具有10％FBS(Sigma Aldrich，美國)的DMEM/F12培養(yǎng)基中生長，在37℃在5％CO2氣氛下溫育。將共5μg的質(zhì)粒制備物pCMV-γ1-cVH和pCMV-KR-cVL與4×106個CHO細胞在補加10％FBS和2mM L-谷氨酰胺(Trace Biosciences，NSW)的200μl的RPMI培養(yǎng)基(Sigma Aldrich，美國)中溫育。將細胞/DNA混合物置于試管中，在基因脈沖儀(BioRad，美國)上以如下設(shè)定進行電穿孔電阻100歐姆，0.3伏，電容Ext 960μFD，時間常數(shù)33-38毫秒。之后將細胞移至具有10％FBS的10ml的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37℃在5％CO2氣氛下生長48小時。使用含有于DMEM/F12中400μg/ml的G418抗生素(GENETICIN，Sigma Aldrich，美國)的neo選擇培養(yǎng)基選擇轉(zhuǎn)染的細胞。3天后，更換培養(yǎng)上清并將細胞擴充至150cm2的組織培養(yǎng)瓶中。7天后，通過兩個單獨的ELISA確定選擇培養(yǎng)基中cK121的表達。
實施例10確定表達的嵌合抗體cK121
如實施例4所述進行ELISA，特異性試劑有一些改變。簡而言之，為確定含有人Fc區(qū)域的嵌合抗體的表達，通過用山羊抗人IgG、IgA和IgM(50μl/孔，10μg/ml)包被96孔平板進行ELISA。然后將轉(zhuǎn)染的CHO細胞的條件培養(yǎng)基在所述孔中溫育，隨后與山羊抗人(Fc-特異性)-AP綴合物溫育并用底物pNPP(Sigma Aldrich，美國)生色。第一個ELISA的標準曲線使用系列稀釋的人IgG1κ(6μg/ml-6ng/ml)制備。并列地將轉(zhuǎn)染的CHO細胞的澄清上清進行系列稀釋并分析樣品(圖11a)。從表達cK121的CHO細胞獲得與標準曲線相似的稀釋曲線。CHO細胞條件培養(yǎng)基中cK121的濃度估計為6ng/μl。
進行第二個ELISA以證實表達的抗體與K121特異性識別的抗原結(jié)合。將第二個分析平板的孔用人游離κ輕鏈(50μl/孔，100μg/ml溶液)包被。在第二個ELISA中，澄清的CHO細胞上清示出在樣品稀釋范圍內(nèi)與人游離κ輕鏈結(jié)合(圖11b)。對比之下，在未轉(zhuǎn)染的CHO細胞條件培養(yǎng)基中未觀測到結(jié)合。
實施例11純化cK121通過硫酸銨沉淀CHO細胞條件培養(yǎng)基(1.4升)中的蛋白質(zhì)而純化cK121。在PBS-Az中深入透析重新溶解的蛋白質(zhì)之后，將樣品在蛋白質(zhì)A瓊脂糖(Sigma Aldrich，美國)上進行親和純化。洗脫的樣品在PBS pH7.4中透析，在Amicon攪拌池(Millipore，USA)上濃縮并過濾滅菌(Minisart RC15，0.2μm，Sartorius，AG)。cK121的濃度使用消光系數(shù)為14在280nm的吸光度加以評估。
實施例12cK121對HMy2和K562類淋巴母細胞的胞毒性cK121對HMy2和K562類淋巴母細胞的胞毒性使用實施例1所述胞質(zhì)LDH滲漏分析確定。純化的cK121對抗原陽性HMy2細胞呈現(xiàn)明顯胞毒性活性，與未攜帶抗原的細胞K562不反應(yīng)(圖12)。這些結(jié)果表明cK121保留誘導(dǎo)靶細胞系中細胞死亡的能力。為證實細胞死亡的機制是編程性細胞死亡，使用純化的cK121對HMy2細胞進行實施例2所述分析。
實施例13選擇穩(wěn)定分泌cK121的細胞大規(guī)模生產(chǎn)cK121需要選擇一種細胞系，其能在沒有選擇抗生素G418的情況下穩(wěn)定分泌抗體。因此，從在兩個ELISA中均產(chǎn)生陽性結(jié)果(A 405nm＞0.2)的孔中選擇克隆，通過有限稀釋克隆。隨后，將來自能生產(chǎn)分泌的cK121的單一克隆的CHO細胞在沒有抗生素的DMEM-F12中生長。選擇在沒有抗生素的情況下持續(xù)分泌cK121的細胞作為穩(wěn)定的cK121生產(chǎn)細胞。cK121 CHO細胞系的條件培養(yǎng)基通過如實施例9所述免疫分析評估，產(chǎn)生的抗體量根據(jù)人IgG1κ標準曲線確定。圖13示出5個陽性克隆(克隆1-5)，選擇這5個陽性克隆進一步表達。一個陰性克隆作為對照樣品。
為對實施例13中產(chǎn)生的cK121克隆進行進一步功能性研究，進行大規(guī)模的表達實驗?？梢约兓痗K121并可以進行動物體內(nèi)研究實驗。
實施例14使用Vκ人VL構(gòu)架區(qū)人源化K121可變輕鏈區(qū)基因(VL)的策略用于人源化K121 VL的PCR程序示意圖示于圖14a。預(yù)先鑒別人VL構(gòu)架區(qū)(hVL)，使用先前所述的基于PCR的策略(Asvadi，博士論文，UTS，1998)從cDNA中分離。對來自含有hVL基因的一個單一克隆的質(zhì)粒DNA進行測序，并與圖14b中的K121 VL的DNA序列相對比。黑體字所示的DNA序列編碼K121的互補決定區(qū)(CDR)。用于將K121的CDR1，CDR2和CDR3的DNA序列摻入hVL的構(gòu)架區(qū)的寡核苷酸示于圖14c。通過用限制酶Age1消化可將含有K121CDR2的構(gòu)架區(qū)與hVL加以區(qū)分，該限制位點在PCR引物VLC中示出。
PCR擴增如圖14a所示，PCR擴增的模板為hVL基因，第一個PCR中的反應(yīng)使用引物對VLA+VLE，VLB+VLF，VLC+VLG及VLD+VLH進行。使用TITANIUM Taq PCR試劑盒(Clontech，CA)擴增四個片段。每個反應(yīng)的產(chǎn)物通過具有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳觀測并通過凝膠提取(Promega，MA)分離。進行第二個PCR以裝配擴增的片段。所得擴增產(chǎn)物為大約380bp。根據(jù)廠商推薦的方案(Promega，MA)經(jīng)凝膠提取DNA條帶并連接入載體pGEM-T中。將等份的連接混合物轉(zhuǎn)化入JM109熱感受態(tài)細胞中，將樣品鋪板于LB-amp平板上。在37℃溫育過夜后，挑取單一菌落，根據(jù)方案在SOC培養(yǎng)基中生長過夜(Promega，MA)。質(zhì)粒DNA使用Wizard Plus Miniprep DNA純化系統(tǒng)分離。將10個克隆根據(jù)推薦的消化程序用限制酶Age1和Bam H1消化(Promega，MA)。消化產(chǎn)物在含有溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上觀測。對產(chǎn)生接近正確大小的DNA片段的單一克隆進行測序，以證實該插入體含有修飾的VL基因。人源化的K121 VL基因然后應(yīng)連接入哺乳動物表達載體pCMV-KR中，如實施例9所述。
實施例15使用人VH3構(gòu)架基因人源化K121重鏈可變區(qū)基因(VH)分離人重鏈可變區(qū)基因hVH，使用如實施例14所述PCR策略克隆。含有hVH基因的pGEM-T質(zhì)粒用作模板，進行QuikChange定點誘變試劑盒程序(圖15a)。用于將來自K121 VH的三個CDR摻入hVH構(gòu)架的引物示于圖15b。在誘變的每次循環(huán)之后，應(yīng)對質(zhì)粒進行測序以證實DNA序列是正確的。人源化的K121 VH基因然后應(yīng)連接入哺乳動物表達載體pCMV-γ1中，如實施例9所述。
討論本文所述這些實驗表明小鼠單克隆抗體K121在人類淋巴母細胞系HMy2中，在無任何附加的效應(yīng)細胞或不加入血清補體蛋白的情況下，誘導(dǎo)細胞死亡。我們先前已經(jīng)示出HMy2細胞表達一種抗原KMA，其由K121識別。當(dāng)HMy2細胞只與濃度為3.6μM的K121溫育時，通過胞內(nèi)LDH的釋放表示存在明顯的細胞死亡(圖1)。
K121的胞毒性活性的特異性由這樣的事實表明，即KMA陰性細胞系K562的處理不產(chǎn)生明顯的細胞死亡(圖1)。
對在有或無K121的情況下溫育的HMy2細胞進行顯微鏡觀測表明在存在K121的情況下存在細胞死亡。在存在K121的情況下，細胞呈現(xiàn)收縮并有膜“水泡樣”的跡象。這些作用是細胞經(jīng)歷稱為編程性細胞死亡過程的特征(Kerr，JFR.等，(1972)Br J Cancer 26239)。相反，HMy2細胞與免疫毒素scFv-mel溫育導(dǎo)致細胞成塊狀及膜溶解。與K121溫育的細胞外形很清楚地和與免疫毒素scFv-mel溫育的那些細胞不同。這些初步觀測提示使用K121導(dǎo)致細胞死亡的機制與scFv-mel的胞毒作用不同。
對經(jīng)歷K121誘導(dǎo)的細胞死亡的HMy2細胞進行光散射分析表明細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和大小與編程性細胞死亡一致(圖2)。關(guān)于K121殺死靶細胞的機制的解釋通過針對編程性細胞死亡的兩個獨立分析而證實，即分別測定該過程的早期和晚期階段(圖3及4)。因此，K121在沒有任何外源因子的情況下，在體外誘導(dǎo)攜帶KMA的細胞編程性細胞死亡。另外，K121阻止腫瘤細胞在體內(nèi)生長。將K121施用于已經(jīng)給予誘導(dǎo)腫瘤劑量的HMy2細胞的小鼠可阻止腫瘤生長，這是通過受體小鼠的血清中存在人IgG而測定的(圖5)。在PBS處理組的所有小鼠中均觀測到腫瘤生長，這由血清人IgG水平及解剖時的明顯形態(tài)學(xué)改變表明。
編程性細胞死亡是參與胚胎發(fā)育尤其免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能的重要生物學(xué)事件(Mastrangelo AJ.and Betenbaugh M.(1998)TIBTECH.1688)。與起因于壞死的細胞死亡相反，編程性細胞死亡在沒有任何病理學(xué)的情況下發(fā)生，而且不引起炎癥應(yīng)答(Kerr，JFR.等，(1972)Br JCancer 26239)。這是關(guān)于可觸發(fā)靶細胞編程性細胞死亡的潛在治療劑的應(yīng)用的一項重要考慮。
上文提及的所有出版物在此均以其全文并入?yún)⒖肌?br> 本說明書中包括的文獻，操作，材料，設(shè)備，物品等的任何討論，只是為理解本發(fā)明而提供。這并非是承認任何或所有這些構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)或者是與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的常識。
本發(fā)明熟練技術(shù)人員意識到對本發(fā)明可以加以多種改變和/或修改，如在不偏離本發(fā)明精神或范圍的前提下在特異的實施方案中示出。本發(fā)明的實施方案因此只是例證而無限制本發(fā)明之意。
序 列 表<110>PacMab Pty Ltd<120>治療多發(fā)性骨髓瘤的方法<130>500564<150>AU PR 6179<151>2001-07-06<160>50<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>119<212>PRT<213>Mus musculus<400>1Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Ala Ile Ile Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Val Tyr His Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Val Thr Val Ala Ser115<210>2<211>357<212>DNA<213>Mus musculus<400>2caggtgcagc tgcagcagtc aggggcggag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg60tcctgtacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg120cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa cactaaatat180gacccgaagt tccagggcaa ggccgctata atagcagaca catcctccaa cacagcctac240ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc taggggggtc300taccatgatt acgacgggga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt cgcctcc 357<210>3
<211>107<212>PRT<213>Mus musculus<400>3Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile35 40 45Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser65 70 75 80Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105<210>4<211>321<212>DNA<213>Mus musculus<400>4gacatcgtca tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc60gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtag cctggtatca acagaaacca120gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg acatcctacc ggtacagtgg agtccctgat180cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct240gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atccgtacac gttcggaggg300gggaccaagc tggaaataaa g 321<210>5<211>68<212>DNA<213>Mus musculus<400>5caggtgcagc tgcagcagtc aggggcggag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg60tcctgtac 68<210>6<211>66<212>DNA<213>Mus musculus<400>6caacaggaca tgtcgaagac cgaagttgta atttctgtgg atatacgtga cccacttcgt60ctccgg 66<210>7<211>73<212>DNA
<213>Mus musculus<400>7tgaagcagag gcctgaacag ggcctggagt ggattggaag gattgatcct gcgaatggta60aacactaaat atg 73<210>8<211>73<212>DNA<213>Mus musculus<400>8tgtgatttat actgggcttc aaggtcccgt tccggcgata ttatcgtctg tgtaggaggt60tgtgtcggat gga 73<210>9<211>70<212>DNA<213>Mus musculus<400>9cacagcctac ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc60taggggggtc 70<210>10<211>59<212>DNA<213>Mus musculus<400>10gatcccccca gatggtacta atgctgcccc tgatgacccc ggttccctgg tgccagtgg 59<210>11<211>65<212>DNA<213>Mus musculus<400>11gacatcgtca tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc60gtcac65<210>12<211>67<212>DNA<213>Mus musculus<400>12cccagtcgca gtggacgttc cggtcagtct tacacccatg attacatcgg accatagttg60tctttgg 67<210>13<211>65<212>DNA<213>Mus musculus<400>13tcaacagaaa ccagggcaat ctcctaaagc actgatttac tcgacatcct accggtacag60tggag65
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<223>PCR引物<400>50cggccccagt agtccccgtc gtaatcatgg tagacccctc tcgca 4權(quán)利要求
1.一種治療患者κ類型多發(fā)性骨髓瘤的方法，所述方法包括為患者施用有效量的類K121抗體，其中所述類K121抗體不與毒素或胞毒劑綴合。
2.權(quán)利要求1的方法，其進一步包括在施用類K121抗體之前處理患者，以降低其體液中存在的游離κ輕鏈的水平。
3.權(quán)利要求2的方法，其中游離κ輕鏈的水平通過血漿去除法降低。
4.在患者體內(nèi)進行自體造血細胞移植的方法，所述方法包括(i)從患者中取出造血祖細胞群，(ii)用類K121抗體處理所述細胞群，(iv)將(ii)步驟中的處理的細胞群移植入該患者中其中類K121抗體不與毒素或胞毒劑綴合。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述方法進一步包括將類K121抗體經(jīng)靜脈內(nèi)注入患者體內(nèi)。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中對患者自體移植的方法在腫瘤細胞減滅術(shù)治療期間或之后進行。
7.在混合細胞群中殺死κ類型骨髓瘤細胞的方法，所述方法包括將混合細胞群與類K121抗體接觸，其中所述類K121抗體不與毒素或胞毒劑綴合。
8.在攜帶KMA的細胞中誘導(dǎo)編程性細胞死亡的方法，所述方法包括將細胞暴露于類K121抗體，其中所述類K121抗體不與毒素或胞毒劑綴合。
9.權(quán)利要求8的方法，其中攜帶KMA的細胞是κ類型骨髓瘤細胞。
10.權(quán)利要求1-9任一項的方法，其中類K121抗體是單克隆抗體。
11.權(quán)利要求1-9任一項的方法，其中所述類K121抗體包含K121抗體的CDR環(huán)(CDR1，CDR2和CDR3)，如圖9a所示。
12.權(quán)利要求1-9任一項的方法，其中所述類K121抗體包含K121抗體的VH和VL基因，如圖9a所示。
13.權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述類K121抗體是嵌合抗體或人源化抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療多發(fā)性骨髓瘤的方法。更特別地，本發(fā)明涉及通過施用類K121抗體(K121－like antibody)誘導(dǎo)骨髓瘤細胞編程性細胞死亡的方法。
文檔編號C07K16/42GK1551783SQ02817443
公開日2004年12月1日 申請日期2002年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月6日
發(fā)明者羅伯特·林賽·雷森, 羅伯特 林賽 雷森, 多籮西 鄧恩, 羅莎奈·多籮西·鄧恩, 華 安德烈 朱, 布恩·華·安德烈·朱 申請人:派克邁伯有限公司