專利名稱：Pacap組合物及用于腫瘤成像與治療的方法
技術領域：
本發(fā)明總體上涉及核醫(yī)學及分子腫瘤造影劑或治療劑，更具體地說，涉及表達VPAC受體的腫瘤的成像或治療用的放射標記組合物。
背景技術：
癌癥是一種嚴重的細胞增殖性疾病，每年都在奪去無數(shù)的生命。僅乳腺癌一項，美國每年都有5萬多婦女罹患。傳統(tǒng)的檢查乳腺腫瘤的方法是超聲、MRI或乳房造影術加組織學方法，至于治療，則是外科手術切除后進行化療和/或放療。乳腺(以及其他)癌癥的死亡率可以通過腫瘤的早期診斷和治療而降低(Kelsey JL，Epidemiol.Rev.174-109，1989)。腫瘤早期檢測的一個有效方法是用腫瘤特異性的放射性造影劑進行閃爍造影。
已經(jīng)有很多種放射性腫瘤造影劑用于乳腺癌的檢測，取得了不同程度的成功。例如，受體特異性的生物分子，如神經(jīng)肽在納摩爾濃度水平與受體結合，在治療及診斷領域都引起了極大的關注和興趣(Fischman AJ et al.，J Nucl.Med.342253-2263，1993；HokfeltT Neuron 7867-879，1991)。
然而，唯一的商業(yè)化了的神經(jīng)肽造影劑111In-[DTPA-D-Phe1]奧曲肽(Octreotide)在檢測乳腺腫瘤方面并不是非常成功(van Eijck CHJet al.Lancet 343640-643，1994；McCready VR et al.Lancet 343617，1994)。上述van Eijck等人1994的文獻報道52例原發(fā)性乳腺癌中，用此造影劑僅有75％得到了陽性閃爍造影結果。進而，van Eijck等人報道，在13例組織學上已確定的轉移病例中，用111In-[DTPA-D-Phe1]奧曲肽進行腋窩造影只在4例中檢測到了不可觸知的含癌淋巴結。[DTPA-D-Phe1]奧曲肽用于乳腺腫瘤造影的低效能歸因于乳腺腫瘤細胞表達的造影劑靶向的癌基因受體密度過低。因而111In-[DTPA-D-Phe1]奧曲肽在乳腺腫瘤造影中的應用大大受限。
123I-Tyr3-奧曲肽也用于放射診斷造影，但沒有此劑在乳腺腫瘤造影中的評價(Krenning EP et al.，Eur.J Nucl.Med.20716-731，1993)。然而，基于111In-[DTPA-D-Phe1]奧曲肽對乳腺腫瘤的較差能力，預計123I-Tyr3-奧曲肽也不會是一種有用的乳腺腫瘤造影劑。
總的來說，任何情況下放射性碘組合物都不適合用作造影或治療劑，因為已批準的放射性碘標記的放射性藥物通常不能在臨床條件下制備。放射性碘標記的造影劑還有一些特別的局限，例如，125I標記的組合物通常不用于造影，因其半衰期過長(約59天)且核素的發(fā)射能量過低。123I標記的組合物也不是首選，因為123I是回旋加速器里產(chǎn)生的核素，制造成本高且核素的半衰期(13.3小時)太短，無商業(yè)用途。123I標記劑的發(fā)射能量也過高，不適于產(chǎn)生高質量的造影圖。
锝-99(99mTc)是一種廣泛使用的診斷用造影劑，因為它發(fā)出能量為140KeV的γ輻射，物理半衰期為6小時，易于用鉬-99/99mTc發(fā)生器現(xiàn)場制造。99mTc的短半衰期減少了對正常器官的輻射劑量，而其發(fā)射能量足以被γ照相機有效探測到。因而在90％的臨床核醫(yī)學應用中99mTc都是首選。
造影劑一般是通過一個金屬螯合部分標記上99mTc的。螯合99mTc的金屬螯合部分通常也能絡合186Re和188Re等治療用核素。因此，一個含金屬螯合劑的試劑可以根據(jù)使用核素的不同而作診斷或治療用。
M.Thakur的U.S.6,395,255披露了一個方法，用99mTc螯合劑標記基于血管活性腸肽(VIP)的試劑。U.S.6,395,255中揭示的螯合劑和標記化學過程也適用于以99mTc或放射性錸標記VIP試劑。然而，U.S.6,395,255中揭示的VIP試劑只與表達VIP受體的腫瘤細胞結合。由于某些腫瘤高密度地表達其他類型的受體，能結合這些腫瘤細胞中更寬范圍受體的造影劑或治療劑將有明顯的優(yōu)勢。
垂體腺苷環(huán)化酶激活肽(PACAP)是一個38個氨基酸的肽，最初分離于牛下丘腦(Miyata A et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.164567-574，1989)。此肽刺激單層培養(yǎng)的大鼠垂體前葉細胞的細胞間和細胞內cAMP的積累(Gottschall PE et al.，Endocrinology 127272-277，1990)。前述之Gottschall et al.，1990從牛下丘腦中分離到了一個27個氨基酸的PACAP(PACAP27)，并得出結論PACAP38和PACAP27有同等效力，來自同一個176個氨基酸的前體。
PACAP27比28個氨基酸的血管活性腸肽VIP28刺激垂體細胞腺苷酸環(huán)化酶的能力要強10倍(前述Gottschall et al.，1990)。125I-PACAP27也能夠置換結合于正常肺膜上的VIP28。VIP28的IC50值約為15nM，而PACAP27的IC50值約為1.5nM。
PACAP27高親和力地與PACAP、VIP-R1和VIP-R2的受體結合，而VIP28僅與VIP-R1和VIP-R2的受體高親合力結合(Zia F et al.，Cancer.Res.554886-4891，1995)。PACAP、VIP-R1和VIP-R2受體統(tǒng)稱為VPAC受體(Reubi JC，J.Nucl.Med.361846-1853，1995；Reubi JC et al.，Cancer Res.601305-1312，2000)，它們高水平地表達于乳腺腫瘤(Zia H et al.，Cancer Res.563486-3489，1996)和其他腫瘤細胞中(Harmar T et al.，TiPs1597-98，10 1994；Reubi JC et al.，Eur.J.Nucl.Med.241058，1997；Le Meuth Vet al.，Amer.J.Physio.260G265-74，1991；Basille M et al.Brain Res.821-2，1994；Vertrongen P et al.，Neuropeptides30491-496，1996；Olianas MC et al.，J Neurochem.671292-1300，1996；Lelievre V et al.，Neuropeptides 30313-322，1996和Parkman HP et al.，Regulatory Peptides 71185-190，1998)。例如，表達VPAC受體的腫瘤(乳腺腫瘤以外)有卵巢、子宮內膜、前列腺、膀胱、肺、食道、結腸、胰腺的腫瘤以及神經(jīng)內分泌系統(tǒng)和腦部腫瘤。
然而，用PACAP制造導向的放射藥物卻很不成功。參見，例如，Reubi JC et al.，Eur.J Nucl.Med.241058，1997顯示以N端結合DTPA后PACAP27的生物活性由100下降到了＜0.01。
因此，需要的是一種基于受體特異性生物分子如PACAP的放射標記的腫瘤造影劑或治療劑，其能高親合力地結合于特定腫瘤細胞上的一類或幾類受體。該造影劑或治療劑理想是通過金屬螯合劑標記上診斷或治療用的核素。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是放射標記的PACAP及生物活性PACAP片段與類似物在乳腺及其它表達PACAP、VIP-R1和VIP-R2受體的腫瘤的成像和治療中的應用。PACAP、VIP-R1和VIP-R2的受體此后被總稱為“VPAC受體”。
這樣，本發(fā)明提供了一種檢測能表達VPAC受體的腫瘤的方法，包括向患有或懷疑患有這類腫瘤的受試驗者使用有效量的具有分子式A或B的造影化合物。使用造影化合物后，對受試驗者的至少部分身體做閃爍造影。
分子式A和B為(A)M(I)-X1-P-X2(B)X1-P-X2-M(I)
分子式A和B中M是螯合劑(I)是一個聯(lián)結于M的造影核素；X1是0到20個天然或合成的氨基酸；P為PACAP，或其類似物或片斷；和X2是0到20個天然或合成的氨基酸。
對患有能夠表達VPAC受體的腫瘤的患者，本發(fā)明同時還提供了一種方法抑制或逆轉腫瘤的生長。包括向患有或懷疑患有這類腫瘤的受試驗者使用有效量的具有分子式C或D的治療化合物。分子式C和D為(C)M(T)-X1-P-X2(D)X1-P-X2-M(T)分子式C和D中M是螯合劑(T)是一個聯(lián)結于M的治療核素；X1是0到20個天然或合成的氨基酸；P為PACAP，或其類似物或片斷；和X2是0到20個天然或合成的氨基酸。
附圖簡述

圖1A和1B分別是MAG3和Gly-(D)Ala-Gly-Gly的結構示意。
在MAG3中，R1＝R2＝R3＝R4＝H。在四肽中，R1＝R2＝R4＝H；R3＝CH3。
圖2是本發(fā)明所述之造影劑99mTc-TP 3475的制備與標記過程的示意圖。
圖3是99mTc-TP 3475的HPLC洗脫圖譜。100％的放射活性以單峰形式洗脫，保留時間(Rt)為12.5min。TP 3475的Rt(U.V.)也是12.5min。在此層析圖譜中，U.V.峰不能測到，因為上樣的TP 3475＜0.01μg。游離的99mTc在Rt 3.2min時洗脫。X軸為洗脫時間，單位為分鐘。斜線代表梯度構成。
圖4是99mTc-TP 3475的示意圖。
圖5顯示增加PACAP27和PACAP類似物TP 3475濃度對負鼠肛門內括約肌(IAS)平滑肌張力的影響。數(shù)據(jù)顯示10-5M濃度下，PACAP27和TP 3475引起的IAS張力下降的百分數(shù)是相等的。
縮略語Aba4-氨基丁酸ADP腺苷酸-5’-二磷酸cAMP環(huán)腺苷酸單磷酸CPTA[4-(1，4，8，11-tetraazacyclotetradec-1-yl)甲基]苯甲酸HT-29一個人結腸直腸腫瘤細胞株IC5050％抑制濃度％ID/g每克組織百分注射劑量Kd解離常數(shù)
LS174T一個人結腸直腸腫瘤細胞株mCi毫居里MAG3巰乙?；拾彼?[N-[N[N-(benzylthio)acetyl]glycyl]glycyl]glycine)MD MB 231一株不依賴雌激素的人乳腺腫瘤細胞株PACAP垂體腺苷環(huán)化酶激活肽RIA放射免疫分析Rt保留時間T47D一株雌激素依賴的人乳腺腫瘤細胞株TFA三氟乙酸VIP血管活性腸肽氨基酸簡稱用于描述本發(fā)明中肽化合物的命名法遵循傳統(tǒng)每個氨基酸殘基都是氨基在左、羧基在右。除特別說明外，在分子式中表示本發(fā)明的特別實施方案時，氨基端與羧基端的基團盡管沒有特別顯示，也將被當作其在正常生pH值下的形式。在氨基酸結構式中，每個殘基通常用相應氨基酸的單字母或三字母縮寫來代表，詳列如下A丙氨酸AlaC半胱氨酸CysD天冬氨酸AspE谷氨酸Glu
F苯丙氨酸PheG甘氨酸GlyH組氨酸HisI異亮氨酸IleK賴氨酸LysL亮氨酸LeuM蛋氨酸MetN天冬酰胺AsnP脯氨酸ProQ谷氨酰胺GlnR精氨酸ArgS絲氨酸SerT蘇氨酸ThrV纈氨酸ValW色氨酸TrpY酪氨酸Tyr定義此處所述“氨基酸”一詞意義包括了天然與合成的氨基酸，D型和L型均包括?！皹藴拾被帷敝缸匀划a(chǎn)生的肽中通常見到的20種L型氨基酸中的任何一種?！胺菢藴拾被帷敝笜藴拾被嵋酝獾陌被?，不論是合成的還是自然來源的。此處“合成氨基酸”一詞也包括了經(jīng)化學修飾過的氨基酸，包括但不限于鹽、氨基酸衍生物(如酰氨)和取代產(chǎn)物。本發(fā)明的肽中所含的氨基酸，特別是氨基端和羧基端的，可以用甲基化、酰胺化、乙酰化或用其他化學基團取代進行修飾，其可以在不影響生物活性的前提下改變肽的循環(huán)半衰期。另外，本發(fā)明的肽中的一個二硫鍵聯(lián)接可有可無。
氨基酸的一般結構如下 根據(jù)側鏈R的不同，氨基酸被分為7類(1)脂肪族側鏈，(2)含羥基(OH)側鏈，(3)含硫原子的側鏈，(4)含有一個酸性或氨基基團的側鏈，(5)含堿性基團的側鏈，(6)含芳香環(huán)的側鏈，(7)脯氨酸，一種亞氨酸，其中側鏈與氨基融合。
“有PACAP生物活性”的化合物指在與VIP28對不依賴雌激素的人乳腺癌細胞株(MDA MB 231)或雌激素依賴的人乳腺癌細胞株(T47D)作用的相當劑量下，至少能刺激腺苷酸環(huán)化酶活性提高十倍或提高核癌基因表達至少十倍的化合物，測定方法見下面的例3所述。
“分離的”指通過人的行為從自然狀態(tài)改變的或移除的。例如，一個活動物中自然存在的一個核酸序列或肽不是“分離的”，但同一個核酸或肽一旦部分地或完全地與自然共存的其他物質分開來，就成了“分離的”。一個分離的核酸序列或蛋白質可以實質上純的形式存在，也可以存在于一個非自然的環(huán)境中，例如一個宿主細胞中。
此處所述關于肽的末端氨基的“保護基團”指肽合成中傳統(tǒng)使用的各種氨基末端保護基團的任一種。這些保護基團包括，例如?；Ｗo基團如甲酰基、乙?；?、苯甲?；?、三氟乙?；?、琥珀?；图籽蹒牾；龋环枷惆敝Ｗo基團如芐氧羰基；以及脂肪族氨脂基保護基團例如叔丁氧羰基或金剛烷氧羰基。合適的保護基團參見Grossand Mienhofer，eds.，The Peptides，vol.3，pp.3-88(AcademicPress，New York，1981)。
此處所述關于肽的末端羧基的“保護基團”指肽合成中傳統(tǒng)使用的各種羧基末端保護基團的任一種。此類保護基團包括，例如叔丁基、苯甲基或其他可接受的通過酯鍵或醚鍵與末端羧基基團相連的基團。
“類似物”包括任何自然產(chǎn)生的或特意制造的PACAP，其特征是有單個或多個氨基酸取代、缺失、增加或置換，但仍保留了PACAP的生物活性。此種類似物包括(a)PACAP的一個或多個氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸取代(b)增加了一個或多個氨基酸(c)一個或多個氨基酸含有不在通常的氨基酸中出現(xiàn)的取代基團(d)PACAP或其一部分與另一個肽融合(e)一個或多個非標準氨基酸殘基(即天然產(chǎn)生的蛋白質中出現(xiàn)的20種L-氨基酸以外的氨基酸)引入或取代PACAP序列(f)一個或多個非氨基酸連接基團引入或置換PACAP的一部分。
“肽”和“蛋白質”可互換使用，指至少兩個氨基酸由肽鍵或修飾的肽鍵(例如肽鍵的電子等排體)共價連接形成的化合物。對組成一個蛋白質或肽的氨基酸最大數(shù)目沒有限定。此處及后附的權利要求中所指的構成肽或蛋白質的氨基酸既可是D型也可是L型，但優(yōu)選是L型。此處所指的構成肽或蛋白質的氨基酸既可由天然過程如翻譯后加工修飾，也可由現(xiàn)有技術公知的化學修飾技術進行修飾。可以理解，修飾可在肽的任何部位進行，包括肽骨架、氨基酸側鏈以及氨基或羧基末端。在一個指定的肽中，同種類型的修飾可以在幾處以相同或不同的程度出現(xiàn)。同樣的，而一個肽中也可以有多種不同類型的修飾。修飾包括乙?；?、酰化、ADP-核糖基化、酰氨化、黃素的共價結合、血紅素部分的共價結合、核苷酸或核苷酸衍生物的共價結合、脂及脂衍生物的共價結合、磷脂酰肌醇的共價結合、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯(lián)的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI錨定的形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酸化、氧化、蛋白水解過程、磷酸化、異戊二烯基化、外消旋、硒代、硫化、tRNA介導的蛋白質的氨基酸加成，如精氨酸化和泛素化。例如，參見PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993和Wold，F(xiàn).，Posttranslational ProteinModificationsPerspectives and Prospects，pgs.1-12 inPOSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983；Seifter etal.，″Analysis for protein modifications and nonproteincofactors″，Meth Enzymol(1990)182626-646和Rattan etal.，″Protein SynthesisPosttranslational Modifications andAging″，Ann NY Acad Sci(1992)66348-62，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。
此處所述一個肽或其一部分與一個參照蛋白“有基本相似的氨基酸序列”意思是說，此肽或其部分的氨基酸序列與參考蛋白質序列的一致性或相似性超過80％。優(yōu)選的序列的一致性是超過85％，更優(yōu)選的是超過90％，特別優(yōu)選超過95％，最優(yōu)選的情況是超過98％。此處與參考肽的“序列一致性”指BLASTP和TBLASTN程序用BLAST(basiclocal alignment search tool)2.0.14算法得出的結果；計算中BLASTP和TBLASTN的設置見下面表1。BLASTP和TBLASTN程序中氨基酸序列一致性的報告在“Identities”下。計算氨基酸序列一致性的技術是本領域公知的，BLAST算法的使用見述于Altschul et al.(1990)，J.Mol.Biol.215403-10和Altschul et al.(1997)，Nucleic Acids Res.253389-3402，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。BLASTP和TBLASTN程序使用BLAST 2.0.14算法。表1-BLASTP和TBLASTN程序用BLAST2.0.14算法計算氨基酸序列一致性時的設置預期值 10
過濾 低復雜度過濾用SEG程序*取代Matrix BLOSUM62Gap existence cost 11Per residue gap cost 1Lambda ratio 0.85Word size 3*SEG程序的描述見Wootton and Federhen，Comput.Chenu.17149-163，1993.
發(fā)明詳述含PACAP或其生物活性類似物或片段的腫瘤特異性診斷造影與治療化合物應用于表達VPAC受體的腫瘤有明顯優(yōu)點。38氨基酸和27氨基酸形式的PACAP都已分離到，分別稱為PACAP38和PACAP27。SEQ IDNO1給出了PACAP38的氨基酸一級序列；SEQ ID NO2給出了PACAP27的氨基酸一級序列。PACAP38和PACAP27來自同一個176氨基酸的PACAP前體蛋白，其序列由SEQ ID NO3給出。此處“PACAP”一詞包括PACAP38(SEQ ID NO1)、PACAP27(SEQ ID NO2)以及176氨基酸的PACAP前體蛋白(SEQ ID NO3)。
PACAP可以用已知技術從牛下丘腦中分離，例見Miyata A etal，Biochena.Biophys.Res.Commun.164567-574，1989和Gottschall PE etal.，Endocrinology127272-277，1990，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。PACAP也可以通過已知方法合成產(chǎn)生，包括用生物系統(tǒng)或化學方法合成。
肽的生物合成是現(xiàn)有技術公知的，包括一個自然發(fā)生的或合成的編碼PACAP的核酸序列的轉錄和翻譯。這些核酸序列可以亞克隆入合適的質粒表達載體以在適當?shù)乃拗骷毎性鲋澈捅磉_。構建核酸序列與質粒表達載體、轉染宿主細胞、表達感興趣的核酸序列等技術都是現(xiàn)有技術廣泛使用的，具有一般技術的專業(yè)人士均熟悉有關具體條件與操作步驟的標準資料來源。例如，重組分子克隆與表達的通用技術見于Sambrook et al.，Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratories，1982及Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology，Wiley and Sons，1987，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。
適合直接合成PACAP的化學肽合成技術(包括人工和自動化技術)也是本領域技術人員所熟知的。例如，PACAP可以用傳統(tǒng)固相合成法從頭合成。在此方法中，肽鏈由一系列偶聯(lián)反應生成，取代氨基酸被按照需要的順序依次加到生長的肽鏈上。下列也是一般專業(yè)人員所熟知的各種不同的N保護基團的使用，如芐氧羰基或叔丁氧羰基；不同偶聯(lián)劑的使用，如dicyclohexylcarbodiimide(二環(huán)己基碳二亞胺(DCCI))或1.1-碳酰二咪唑；各種活性酯的使用，如N-hydroxyphthalimide或N-羥基琥珀酰亞胺的酯；各種裂解劑的使用，如三氟乙酸(TFA)、鹽酸加二氧雜環(huán)乙烷、borontris-(trifluoracetate)和溴化氰；中間產(chǎn)物分離與純化的液相反應也是專業(yè)人員熟知的。較好的肽化學合成方法按照專業(yè)人員熟知的傳統(tǒng)的Merrifield固相法進行。進一步的關于固相合成方法的資料可以參見Steward and Young，Solid Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，1969；Advancesin Enzymology32221-296，(Nold FF，ed.)，Interscience Publishers，New York，1969中Merrifield的綜述；以及Erickson and Merrifield(1990)，The Proteins261-64，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。
現(xiàn)有的造影劑和治療劑也有含生物活性PACAP片段的。本發(fā)明所述之生物活性PACAP片段可由化學或酶學手段裂解大的天然的或合成的PACAP得到，也可由上述的生物或化學合成方法得到。
現(xiàn)有的造影劑和治療劑也有含生物活性PACAP類似物的。獲得這些類似物的技術也是一般專業(yè)人員所熟知的，例如標準的重組核酸技術、固相肽合成技術及上述的化學合成技術。還可以用連接基團將PACAP的部分與其他肽連接或置換。連接基團包括，例如能夠連接PACAP氨基端部分與羧基端的成環(huán)化合物。制造類似物的技術也可見于U.S.patent 6,030,942，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入(專利6,030,942中將類似物稱為“類肽”(peptoids))。
PACAP類似物也包括一部分的氨基酸序列基本上類似PACAP的融合肽。這種融合肽的制造也可以用專業(yè)人員熟知的方法進行，例如將編碼PACAP的核酸序列與一個異源肽的序列亞克隆進同一個表達載體，使PACAP與異源肽的序列表達在同一個蛋白質里。
本發(fā)明所述之造影劑與治療劑是通過將PACAP或其生物活性片段或類似物與一個金屬螯合劑連接而成的。此處所說的“連接”指共價鍵合。螯合劑則與造影或治療核素聯(lián)結。在不影響產(chǎn)物中PACAP生物活性的前提下，螯合劑可以與PACAP或其生物活性片段或類似物在肽結構的任意點相連接。優(yōu)選的是螯合劑連接在PACAP或其生物活性片段或類似物肽的N末端或C末端，更優(yōu)選的是C末端。
這樣，本發(fā)明的造影或治療化合物優(yōu)選地包含一個由一個或多個天然或合成氨基酸構成的空間臂，連接到PACAP或其生物活性片段或類似物的N端或C端。然后螯合劑可以與這個空間臂相連?？臻g臂使核素或螯合劑產(chǎn)生的空間位阻最小化，利于保存造影劑與治療劑中的PACAP活性。
上述的本發(fā)明之造影劑的分子式A和B以及治療劑分子式C和D中，可選的空間臂用Z1、Z2表示，分別將X1、X2連接到M。帶有可選空間臂的分子式如下(A)M(I)-Z1-X1-P-X2(B)X1-P-X2-Z2-M(I)(C)M(T)-Z1-X1-P-X2(D)X1-P-X2-Z2-M(T)分子式中其他變量見發(fā)明概述中的描述。
空間臂Z1或Z2可以含有，例如1到20個氨基酸，更好的是1到4個，最好是1個氨基酸。一個特別適合的空間臂是4-氨基丁酸，也叫“Aba”。作空間臂的Aba最好用D型。
螯合劑可以由大量不同的能絡合一個金屬離子或多原子離子(如TcO)的螯合化合物中的一種或多種的殘基構成。此處所述之“螯合劑”指一種能與PACAP或其生物活性片段或類似物連接的化合物，同時還含有能結合金屬原子的供體原子。螯合劑通過配位鍵與金屬原子結合，形成環(huán)狀結構稱為“螯合復合物”或“螯合物”。
適于本發(fā)明使用的螯合劑包括NxSy螯合化合物。此處“NxSy螯合化合物”指能夠配位結合金屬核素且能與PACAP或其生物活性片段或類似物連接的，核心具有下面構造的螯合劑N2S2(例見U.S.4,897,225、U.S.5,164,176或5,120,526)；N3(例見U.S.4,965,392)；N2S3(例見U.S.4,988,496)；N2S4(例見U.S.4,988,496)；N3S3(例見U.S.5,075,099)；N4(例見U.S.4,963,688和U.S.5,227,474)或NS3。優(yōu)選的NxSy螯合化合物含N2S2，N3S或N4核心。NxSy螯合化合物的例子也可見于Fritzberg et al.，P.N.A.S.USA 854024-29，1988和Weber etal.，Bioconj.Chem.1431-37，1990。此段提到的雜志文章和美國專利均以全文形式作為參考文獻引入。
特別合適的N4螯合劑是[N-[N[N-(benzylthio)acetyl]glycyl]glycyl]glycine，也叫巰乙?；拾彼峄騇AG3，還有四肽Gly-(D)Ala-Gly-Gly(SEQ ID NO4)，見Vanbilloen HP et al.，Nucl.Med.Biol.22325-338，1995，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。Gly-(D)Ala-Gly-Gly是MAG3的一個衍生物，其中巰基被更穩(wěn)定的更易引入的氨基基團所替代。這兩種N4螯合劑的結構示意于圖1。
在肽合成過程中，可以把序列Gly-(D)Ala-Gly-Gly引入到PACAP或其生物活性片段或類似物的N端或C端，優(yōu)選是C端。優(yōu)選這一步驟是因為這樣可以避免很多麻煩，如需要單獨連接螯合劑到有可能含有保護基團和解封閉基團的肽上，HPLC純化反應混合物、質譜分析鑒定所需的產(chǎn)物等。如上面所討論的，Aba可以作Gly-(D)Ala-Gly-Gly與PACAP或其生物活性片段或類似物之間的空間臂。在肽合成過程中無需增加任何步驟就可以把Aba連接到PACAP或其生物活性片段或類似物上。用MAG3或Gly-(D)Ala-Gly-Gly螯合劑制造肽化合物、連接這些螯合劑到含Aba的肽上、以及將造影或治療核素交聯(lián)于螯合劑等過程都可在U.S.6,395,255見到描述，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。
連接NxSy螯合劑與蛋白質的方法也是熟知的，比如揭示于U.S.5,175,257和U.S.6,171,577，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。例如，NxSy螯合劑可以在非變性條件下通過活性的“連接基團”與PACAP或其生物活性片段或類似物連接，如不是這樣的條件下可能會對蛋白有不良影響。連接基團與螯合劑可以是分開的也可以是整合的。具有整合的連接基團的螯合劑被稱為“雙功能螯合劑”。連接基團要與蛋白質上的功能基團有充分的反應活性以使反應能在水溶液中進行，且不需要用加熱至高溫等可能使蛋白質變性的方式強制進行。
合適的連接基團的例子有活性酯、異硫氰酸鹽、胺、肼、馬來酰亞胺或其他Michael型受體、硫醇和活化的鹵化物。優(yōu)選的活性酯有N-羥基琥珀酰酯、磺基琥珀酰酯、苯硫基酯、2，3，5，6-四氟苯基酯和2，3，5，6-四氟苯硫基酯。后三者形成了一組位于苯環(huán)的對位(即4位)或鄰位時能增強水溶性的活性酯。這類基團的例子有CO2H、SO3-、PO32-、OPO32-、OSO3-，和N+R3，R代表H或烷基團。
其他適用于本發(fā)明的螯合劑包括線性、環(huán)狀和分枝的多氨基多羧基酸及其含磷的含氧酸對等物，例如乙二胺四乙酸(EDTA)；二乙三胺五乙酸(DTPA)；1，4，7，10-tetraazocyclododecane-N，N’N″，N″’-tetraacetic acid(DOTA)；1，4，7，10-tetraazo-cyclododecane-N，N’N″-triaceticacid(DO3A)；1-oxa-4，7，10-triazacyclododecane-N，N’N″-triacetic acid(OTTA)；trans(1，2)-cyclohexanodiethylene-triamine-pentaacetic acid(CDTPA)；1-oxa-4，7，10-triazacyclododecantriaacetic acid(DOXA)；1，4，7-triazacyclononanetriacetic acid(NOTA)和1，4，8，11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic acid(TETA)。
這些螯合劑可以用已知的任何方法與PACAP相連。例如，螯合劑可以通過一個金屬配位基團與PACAP相連，與PACAP上的氨基、巰基或羥基形成酯、氨基硫酯或硫代酰胺。而且，也可以將螯合劑通過一個直接連在螯合劑上的功能基團與PACAP相連，例如DOTA的碳環(huán)上連著一個CH2-苯基-NCS基團，見Meares et al.，JACS 1106266-6267，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。螯合劑也可經(jīng)過同質或異質的雙功能連接子間接與PACAP相連，如二胺、二環(huán)氧化物、二醇、二酸或雙功能的PEG。上述的具有內部連接基團的螯合劑被稱作“雙功能螯合劑”。最優(yōu)選的是將多氨基多羧基酸類螯合劑連接到PACAP或其生物活性片段或類似物的C端。
將PACAP或其生物活性片段或類似物上相連的金屬螯合劑與造影或治療核素相連的方法也是專業(yè)人員熟知的，例如見于U.S.5,175,257和U.S.6,171,577，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。舉例說明，造影或治療核素可以通過直接引入、模板合成和/或金屬轉移作用引入本發(fā)明之化合物。優(yōu)選使用直接引入。
直接引入時，造影或治療核素必須很容易被螯合劑絡合，例如，在水溶液中將含有螯合劑的化合物與金屬鹽水溶液簡單地暴露、混合。金屬鹽可以是任意的鹽，但最好是金屬的水溶性鹽如鹵素鹽。該鹽最好選擇得使其不干擾金屬離子與螯合劑的結合。含有螯合劑的化合物可以與緩沖性鹽如檸檬酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽和/或硼酸鹽混合以形成適宜直接引入的pH值。
對造影用途，造影核素選自99mTc；87Y；67Ga；64Cu和111In。較好的造影核素是99mTc。含有PACAP或其生物活性片段或類似物的本發(fā)明之化合物，加上一個造影核素即為“造影化合物”。
對治療用途，“治療核素”選自47Sc、64Cu、67Cu、67Ga、212Pb、68Ga、90Y、111In、152Sm、212Bi、210At、211At、177Lu、186Re和188Re。較好的治療核素是90Y、186Re和188Re。含有PACAP或其生物活性片段或類似物的本發(fā)明之化合物，加上一個治療核素即為“治療化合物”。
本發(fā)明之造影化合物可以用于檢測作為患者或疑患者的受試驗者表達VPAC的腫瘤。此處“受試驗者”包括人和非人哺乳動物。非人哺乳動物包括牛、綿羊、豬、馬、犬、貓和嚙齒動物(如大鼠、小鼠、豚鼠和兔)。表達VPAC受體的腫瘤包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睪丸癌、肝癌、腮腺癌、膽道癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、甲狀腺癌；鱗狀細胞癌；腺癌；小細胞癌；黑色素瘤以及腦腫瘤如神經(jīng)膠質瘤和神經(jīng)母細胞瘤。
在本發(fā)明的實施中，有效量的含PACAP或其生物活性片段或類似物的造影化合物可以通過任何腸道或腸道外方式遞送到受試驗者。優(yōu)選使用腸道外遞送。
適用的腸道外遞送方法包括血管內遞送(如靜脈推注、靜脈輸注、動脈推注、動脈輸注及對脈管系統(tǒng)的導管滴注)；組織外圍和組織內注射(如腫瘤外圍和腫瘤內注射)；皮下注射或埋藏包括皮下輸注(例如用滲透泵)；以及直接應用于腫瘤或腫瘤外圍組織，例如通過導管或其他內置物(含有多孔或非多孔的或凝膠狀材料的栓劑或植入物；硅橡膠膜或纖維)。皮下注射或皮下輸注優(yōu)選接近腫瘤或懷疑腫瘤位點，尤其是當腫瘤或懷疑腫瘤就在皮膚上或接近皮膚時。造影化合物優(yōu)選以單劑量單位做血管內注射，例如在傳統(tǒng)的注射媒介如等滲鹽水、血清或生物相容性等滲緩沖液(如磷酸鹽、Hepes或Tyrode’s緩沖液)中。
做血管內注射時，現(xiàn)有的造影化合物很容易滲透到實體瘤中，在瘤體內分布相對均勻，腫瘤細胞間的緊密聯(lián)結、纖維基質、間隙壓力梯度及結合位點的屏障都不構成影響。相似地，本發(fā)明的造影化合物在進行腫瘤外圍或腫瘤內遞送時也很容易在瘤體內分布。
此處本發(fā)明之造影化合物的“有效量”指能夠使受試驗者的表達PACAP或VPAC的腫瘤產(chǎn)生閃爍影像的足夠劑量。造影化合物的有效量用放射活性表示比較方便，如用mCi。一般地，造影化合物的有效量在每70kg體重約0.01mCi至約100mCi范圍，推薦每70kg體重約0.1mCi至約50mCi。
當造影化合物遞送到受試驗者后，受試驗者的至少一部分身體會產(chǎn)生閃爍影像。例如，期望在受試驗者的有腫瘤或懷疑有腫瘤的身體部位得到影像。閃爍影像的產(chǎn)生需要足夠的時間，以便被遞送的造影化合物到達腫瘤并與腫瘤細胞表達的PACAP或VPAC受體相結合。造影化合物到達腫瘤并結合一般需要幾分鐘時間。然而，如果需要的話，腫瘤造影可以在注射造影化合物后數(shù)小時進行。腫瘤可以通過任何閃爍掃描造影技術進行造影，包括平面閃爍掃描、SPECT或PET。得到受試驗者閃爍影像的技術和機器都是本領域人員熟知的。
放射標記藥物通常會滯留在腎臟。因此有必要設法盡量減小腎臟對此類藥物的保留，這樣能減輕受試驗者器官的放射負擔也能增強腫瘤的對比度。已知預先或與放射藥物同時遞送一種氨基酸(如賴氨酸)能顯著降低腎臟對放射藥物的攝取。因此，現(xiàn)有的造影方法中都選擇性地包括了預先或與放射藥物同時使用一種氨基酸以降低腎臟對造影化合物的攝取。氨基酸可以通過前述的任何適當?shù)哪c道或腸道外途徑遞送，可以與造影化合物的遞送途徑相同或不同。
具有一般技術的專業(yè)人員很容易確定對于現(xiàn)有造影化合物預先或與放射藥物同時使用的氨基酸的合適劑量，以抑制腎臟對造影化合物的攝取，例見Kobayashi H et al.，Cancer Res.563788-3795，1996；Bernard BF et al.，JNucl.Med.381929-1933，1997和Behr TM et al.，Eur.J.Nucl.Med.25201-212，1998，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。
一般地，對于現(xiàn)有造影化合物預先或與放射藥物同時使用的氨基酸的合適劑量為0.1-5g/kg體重，優(yōu)選使用0.4-2g/kg體重。預先或同時使用的首選氨基酸是D-賴氨酸。
僅僅是表達VPAC腫瘤的疑患者，而實際上并沒有患這類腫瘤的受試驗者也可能做本發(fā)明所述的造影檢查。當然結果會是陰性的。
本發(fā)明的治療化合物可以用來治療受試驗者的表達VPAC的腫瘤。實施本發(fā)明時，有效量的含PACAP或其生物活性片段或類似物的治療化合物可以通過任何腸道或腸道外方式遞送到受試驗者，同上述的造影化合物的方法。推薦使用血管內或瘤體內遞送?，F(xiàn)有的治療化合物也很容易滲透到實體瘤和/或相對均勻地方分布于腫瘤塊內，正如上面描述的造影化合物的情況。治療化合物的有效量用放射活性表示比較方便，例如用mCi。此處本發(fā)明之治療化合物的“有效量”指足以抑制或逆轉受試驗者表達VPAC的腫瘤生長的足夠量。使用給一個特定受試驗者的治療化合物的有效量取決于很多因素，如遞送方式、被治療腫瘤的分期與嚴重程度、受試驗者的體重與一般健康狀況以及處方醫(yī)師的判斷等。
通常使用于一個受試驗者的有效量是每70kg體重1mCi到1000mCi，優(yōu)選使用每70kg體重10mCi到500mCi，更優(yōu)選每70kg體重20mCi到100mCi。需要指出現(xiàn)有的治療方法包括治療化合物的多次用藥。
現(xiàn)有治療方法也可選擇地包括預先或同時使用一種氨基酸以減少腎臟對治療化合物的攝取，如上文所述。氨基酸的劑量和遞送途徑也如上文所述造影劑的方法。優(yōu)選預先或同時使用的氨基酸是D-賴氨酸。
具有一般技術的專業(yè)人員很容易確定表達VPAC的腫瘤的生長是否被抑制或逆轉，例如通過在治療前后用上述造影方法直接檢查腫瘤的尺寸大小。腫瘤的生長的抑制或逆轉也可由治療前后用物理方法估計腫瘤的大小來確定，如腫瘤組織的觸診或用卡尺等測量儀器測量組織塊的大小。
在遞送給受試驗者前，本發(fā)明的造影化合物與治療化合物優(yōu)選依已知技術制成藥物組合物。本發(fā)明之藥物組合物的特征至少是無菌和無致熱源的。此處“藥物組合物”包括人用和畜用配方。
現(xiàn)有的藥物組合物含本發(fā)明之造影化合物與治療化合物及生理學上可接受的載體媒介。優(yōu)選的生理性的載體媒介有水、緩沖水、普通鹽水、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質酸等。
本發(fā)明之藥物組合物也可含有傳統(tǒng)的藥物賦形劑和/或添加劑。適合的制藥賦形劑包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、滲透壓調節(jié)劑、緩沖劑和pH調節(jié)劑。適合的添加劑包括生理性的生物相容性緩沖劑(如鹽酸氨丁三醇tromethamine hydrochloride)，或鈣或鈉的鹽(例如氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)作添加劑(摩爾比1到50)。如果需要的話，藥物組合物中也可含少量濕潤劑、乳化劑或pH緩沖劑。口服配方可包括標準的載體如制藥等級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
本發(fā)明之藥物組合物也可含有中性或鹽形式的本發(fā)明之造影化合物與治療化合物。藥學上可接受的造影化合物與治療化合物可用的鹽包括與自由氨基形成的鹽，如鹽酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、酢漿草酸鹽和酒石酸鹽；以及與自由羧基形成的鹽，如鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鈣鹽、堿式鐵鹽和與異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸和普魯卡因形成的鹽。
現(xiàn)用以下非限制性的實例闡述本發(fā)明。
實施例1、TP 3475的制備一個PACAP27的類似物，稱為TP 3475，根據(jù)上述之U.S.6,395,255的技術制造。TP 3475由PACAP27在C末端連接螯合劑Gly-(D)Ala-Gly-Gly而成。螯合劑與PACAP27之間有一個Aba空間臂。
簡要地說，PACAP27是用標準的固相合成法合成的。C末端的Aba空間臂和螯合劑Gly-(D)Ala-Gly-Gly都是通過延續(xù)固相合成反應，將適當?shù)陌被釟埢B續(xù)地向PACAP27的C末端加成連上去的。此類似物根據(jù)其分子量命名(預測3475.17，實測3475.18)。TP 3475的一級序列見圖2及SEQ ID NO5。
實施例2、用99mTc放射標記TP 3475TP 3475按照前述U.S.6,395,255中的方法用99mTc金屬化。
如下述進行的金屬化反應產(chǎn)生了一個基于本發(fā)明的造影化合物，稱為99mTc-TP 3475。
向一個干凈的、充氮的、10毫升硅化過的小玻璃瓶中加入10ug的TP 3475在10μl pH4.6的乙酸鹽緩沖液中(100μg SnCl2.2H2O在10μl 0.005M HCl和300μl 0.067M Na3PO4，pH12中)。小瓶內容物在丙酮干冰浴中速凍。然后將小瓶放在GeneVac冷凍干燥機中凍干2小時，充氮，密封，保存于-20℃?zhèn)浣饘倩磻谩?br> 準備做金屬化反應時，將小瓶放在室溫中。將10-40mCi99mTc在200μl 0.9％NaCl中注入小瓶?；旌衔镌?00℃保溫30min，加入1ml 0.1M Na2HPO4把pH升至6-6.5。加125毫克抗壞血酸鈉作穩(wěn)定劑。在Rainin HPLC系統(tǒng)用反相C-18microbond柱做金屬化造影化合物99mTc-TP 3475的HPLC分析，0.1％TFA水溶液為溶劑A，0.1％TFA的乙腈溶液為溶劑B。梯度為溶劑B在0min時為10％，在28min時為90％。99mTc-TP 3475在22℃、24小時是穩(wěn)定的。HPLC測出22℃時的得率是定量的，在保留時間12.5分鐘處得到一個單峰。99mTc-TP3475的HPLC洗脫圖譜見圖3，99mTc-TP 3475的結構見圖4。
99mTc-TP 3475的穩(wěn)定性在37℃，100mM過量半胱氨酸、DTPA和HAS存在下進行24小時。相似的研究也在人血清中進行。HPLC分析顯示99mTc-TP 3475在測試的介質中都有優(yōu)異的穩(wěn)定性。
實施例3TP 3475與乳腺腫瘤結合的評測99mTc-TP 3475和VIP28與人結腸癌細胞株LS 174T和HT-29、以及人乳腺癌細胞株MDA MB 231(不依賴雌激素)和T47D(依賴雌激素)的結合照下述方法評測。125I-PACAP27作為對照細胞的培養(yǎng)與分析方法見前述的U.S.6,395,255。TP 3475、VIP28和125I-PACAP27的IC50和Kd值用標準方法確定。
cAMP活性與劑量函數(shù)關系的測定依賴雌激素細胞T47D和不依賴雌激素細胞MDA MB 231各約5×106個，分別用SIT培養(yǎng)基洗兩次，重懸于含1％BSA、1mg/ml桿菌肽和100μm異丁基甲基黃嘌呤的SIT培養(yǎng)基中。將濃度系列增加的TP3475、VIP28和125I-PACAP27加入細胞中，5分鐘后加入等體積乙醇終止反應。樣品振蕩混勻后凍存于-80℃以備用RIA法檢測cAMP，方法見Moody TW，Peptides 17545-555，1995，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。數(shù)據(jù)以cAMP對肽濃度作圖。
測定核癌基因c-fos與c-myc mRNA的誘導我們測定了TP 3475在人乳腺腫瘤細胞中刺激c-fos與c-myc基因表達的能力。上述的依賴雌激素細胞T47D和不依賴雌激素細胞MDA MB231各約5×106個，分別培養(yǎng)于15cm培養(yǎng)皿中，用含0.5％胎牛血清的SIT培養(yǎng)基處理4小時。將TP 3475、PACAP27和VIP28分別加入培養(yǎng)細胞中，孵育60分鐘。孵育后移去培養(yǎng)基用異硫氰酸胍分離被處理細胞的總RNA，方法見Chirgwin et al.，Biochemistry 185294-5299，1979，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。
將10μg從處理細胞中分離到的總RNA變性，于0.66M甲醛-1％瓊脂糖凝膠中分離。凝膠用溴化乙錠染色以評判RNA的完整性。然后用標準方法將RNA印跡到Nytran膜上過夜，此膜用c-fos和c-myccDNA探針在標準的Northern印跡雜交條件下雜交。c-fos和c-myccDNA探針用[32P]dCTP標記，用Bethesda Research Laboratories的隨機引物試劑盒按照廠商說明進行。雜交后洗膜，對Kodak XAR-2膠片曝光，沖洗后得到放射自顯影。處理細胞與對照細胞的c-fos與c-myc mRNA表達水平用密度掃描儀定量。
實施例4、TP 3475對負鼠肛門內括約肌(IAS)平滑肌組織的基礎張力的影響已知PACAP27能引起IAS基礎張力的濃度依賴性下降，測定見Rattan S et al.，J Pha-mcol.Exper.Theta.263722-728，1997，其公開的全部內容在此作為參考文獻引入。這里的IAS測試用依次增加的TP 3475濃度，直至達到最大下降，如下述。對照為PACAP27。平滑肌條的準備兩種性別的成年負鼠(Didelphis virginiana)在腹膜內注射戊巴比妥(40mg/kg)后處死。將大血管及外部組織包括外括約肌去除，把肛管打開釘平于有充氧Krebs’液(NaCI，118.07；KCl，4.69；CaCl2，2.52；MgSO4，1.16；NaH2PO4，1.01；NaHCO3，25和glucose，11.10)的解剖盤上，粘膜面向上。移除粘膜，從肛管最底端制備肛門內括約肌環(huán)狀平滑肌小條(約2mm×1cm)。
等長張力的測定將IAS平滑肌條轉入控溫的裝有Krebs’液的2ml“肌肉池(muscle bath)”中，持續(xù)用95％O2-5％CO2混合氣體鼓泡。肌肉條的下端用絲縫合線綁在肌肉池底部，另一端固定在等長力傳感器上(型號FTO3；Grass Instruments Co，Quincy，MA)。用Beckman Dynograph記錄儀(Beckman Instruments，Schiller Park，IL)記錄等長張力。開始給肌肉條加1g張力，讓其平衡1小時，不時沖洗。只有產(chǎn)生穩(wěn)定張力且在電場刺激下松弛的肌肉條是可用的。最佳長度與基線的確定見前述之Rattan S等人，1997。
圖5所示的結果說明10-5M的PACAP27和TP 3475引起IAS張力相等的下降。這些數(shù)據(jù)表明TP 3475的生物活性沒有因向PACAP27的C端加空間臂和螯合劑而受損。
實施例5、99mTc-TP 3475在裸鼠種植的人乳腺腫瘤細胞中的組織分布和藥代物動力學研究在荷有依賴雌激素的T47D和不依賴雌激素的MDA MB 231腫瘤的裸鼠中按下述方法進行。
將兩種腫瘤細胞各約5×106個種植于小鼠右股，待腫瘤塊形成。每個實驗組有5只荷瘤小鼠，均通過尾側靜脈注射了200-700μCi劑量的99mTc-TP 3475，含有少于1μg的造影化合物(比活性1400-2500Ci/mmol或更高)。注射后15min、1hr、2hr、4hr和24hr將動物處死，測定各種組織中的％ID/g組織。荷瘤小鼠對照組注射125I單碘化的PACAP27。注射對照動物前將125I-PACAP27調整到與99mTc-TP 3475相同的比活性。所有動物的造影均用配有專用計算機和低能量平行孔準直器的GE STARCAM γ照相機進行。
結果作為時間的函數(shù)以數(shù)字形式和直方圖形式展示。同時計算了注射化合物的腫瘤/肌肉比和肌肉/血管比。注射后15min處死的動物中，以15秒一幀進行了動態(tài)造影研究。對不同區(qū)域作了動力學曲線圖，包括腫瘤、心、肝、腎和膀胱。根據(jù)這些數(shù)據(jù)結合其它數(shù)據(jù)點可以得出重要器官中放射活性的攝取與清除的概況，包括腫瘤組織的。動物均置于代謝籠中以便確定尿中分泌的放射活性的化學本質和量。尿中的放射活性定期測定，尿樣用HPLC分析。
實施例6、99mTc-TP 3475在大鼠血液中的清除99mTc-TP 3475在血液中的清除在Sprague-Dawley大鼠中按下述方法進行。三只Sprague-Dawley大鼠，體重均為約250克，從一側尾靜脈注射1mCi的99mTc-TP 3475，注射后1、5、10、15和30分鐘和1、2、4、6、18和24小時從另一側尾靜脈取三份系列血樣。血樣稱重，用標準閃爍計數(shù)方法測定放射活性，以注射時制備的99mTc溶液為標準。％ID/g對時間作圖。
99mTc-TP 3475的血液清除是兩相的，α-t1/2和β-t1/2分別為約6分鐘和90分鐘。這些數(shù)據(jù)表明75％的99mTc-TP 3475放射活性在注射后12分鐘從循環(huán)中清除。
實施例7、腫瘤大小與99mTc-TP 3475比活性對腫瘤攝取的影響腫瘤大小對99mTc-TP 3475攝取的影響用實施例5中的荷瘤小鼠研究了腫瘤大小對造影化合物攝取的影響，方法如下述。將99mTc-TP 3475和125I-PACAP27(作為對照)注射到荷瘤小鼠。腫瘤直徑用游標卡尺度量。在注射后的最佳造影時間進行實驗，時間點依據(jù)來自實施例5。數(shù)據(jù)以％ID/g對腫瘤絕對重量作圖。實驗中，化合物比活性與注射量保持恒定，以保證遞送的受體特異性的肽分子數(shù)量一致。
注射的99mTC-TP 3475的比活性對腫瘤攝取的影響受體特異性的造影劑或治療劑的腫瘤攝取會與注射的受體特異性的化合物的量成函數(shù)關系。用實施例5中的荷瘤小鼠研究了99mTc-TP3475注射量的影響，方法如下述，注射量用比活性代表。制備5份比活性在1000-25,000Ci/mmol范圍的99mTc-TP 3475。5組每組5只荷瘤小鼠每只注射固定的放射活性劑量(~700μCi)，分別含0.1、0.5、1、1.5或2μg的99mTc-TP 3475。注射后24小時測定組織分布。比較腫瘤和其他組織對化合物的攝取以及放射活性從組織中的清除。
實施例8、減少腎臟對99mTc-TP 3475的攝取5只小鼠組成的治療組注射少于1微克，200-700μCi劑量99mTc-TP3475(比活性為1400-2500Ci/mmol或更高)的同時注射50毫克D-賴氨酸。對照組5只小鼠只接受99mTc-TP 3475。治療組和對照組動物在注射后15分鐘、1、2、4和24小時處死，測定腎組織的％ID/g。
實施例9、99mTc-TP 3475的受體特異性為確定99mTc-TP 3475在任乳腺腫瘤中的受體特異性，用PACAP進行受體阻斷實驗。在荷有T47D移植片的裸鼠上，99mTc-TP 3475的腫瘤攝取在預先注射PACAP的情況下下降了約50％。
另一個受體阻斷實驗如下進行。靜脈內注射99mTc-TP 3475之前30分鐘，上述的荷瘤小鼠靜脈內注射多至50μg的TP 3475在100μlPBS中。依據(jù)實施例5得到的最佳造影時間對動物進行造影，然后處死定量測定組織分布。用這些數(shù)據(jù)可以確定99mTc-TP 3475的受體特異性，反映為腫瘤組織攝取放射活性的下降，以及可能的其他組織中，如肺、肝、腎。
實施例10、99mTc-TP 3475與人腫瘤的結合用下述方法測定99mTc-TP 3475和99mTc-VIP28與鱗狀上皮細胞癌、腺癌、小細胞癌、黑色素瘤、神經(jīng)膠質瘤、神經(jīng)母細胞瘤以及肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睪丸癌、肝癌、腮腺癌、膽道癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、腎癌、膀胱癌、腦瘤、前列腺癌、甲狀腺癌的結合。99mTc-VIP28的制備見上述的U.S.6,395,255。
將每種腫瘤的樣品在恒冷切片機上切片成10-20μm厚度，封裝為顯微玻片。封好的玻片在-20℃儲存至少3天，以增強組織對玻片的粘附。玻片復溫至室溫，于22℃在50mM Tris HCl，pH7.4；2％BSA；2mM EGTA；1mM桿菌肽和5mm MgCl2中與30pM99mTc-TP 3475或99mTc-VIP28在存在或不存在單碘化的125I-PACAP27或125I-VIP28的情況下孵育90分鐘。
孵育后，玻片用冰冷的50mM Tris HCl，pH-7.4，0.25％BSA洗四次，水洗一次，用干燥空氣流干燥。玻片對3H Ultra膠片(Amersham，England)曝光一周。放射自顯影圖用計算機輔助的圖像分析系統(tǒng)定量。膠片同時對125I放射自顯影標準曝光。在每種腫瘤中測定99mTc-TP3475或99mTc-VIP28的Kd值和抑制放射碘標記的對應物的IC50值。
實施例11、99mTc-TP 3475與99mTc-Sesta-MIBI和In-111-DTPA-D-Phe1-奧曲肽的功效比較我們比較了99mTc-TP 3475、99mTc-Sesta-MIBI和In-111-DTPA-D-Phe1-奧曲肽用于乳腺腫瘤造影的功效。125I-PACAP作為對照。99mTc-Sesta-MIBI盡管不是受體特異性試劑但還是被FDA批準可能會成為最常用的乳腺造影劑。111In-DTPA-D-Phe1-奧曲肽是一個商業(yè)化的造影劑，針對乳腺腫瘤細胞上一類受體(SSTR受體)。
111In-DTPA-D-Phe1-奧曲肽和99mTc-Sesta-MIBI來自放射制藥廠商。99mTc-TP 3475用上述方法制備，125I-PACAP用標準技術制備。所有藥物的藥代動力學和組織分布均在荷瘤小鼠上用實施例5方法進行。由于SSTR和VPAC受體是不同的，99mTc-TP 3475和111In-DTPA-D-Phe1-奧曲肽共同注射給荷瘤小鼠。共注射的99mTc-TP3475和111In-DTPA-D-Phe1-奧曲肽在鼠組織中的計量用各自相應核素的特征能量窗口進行(±15或20％)；即140 KeV計99mTc、173KeV和247 KeV計111In。待99mTc完全衰變(10-12個半衰期)后對111In再進行一次組織計量。
第24小時點上，腫瘤對99mTc-TP 3475的24小時攝取約為0.2％ID/g。這與腫瘤對125I-PACAP的攝取(0.23±0.03％I.D./g)相當，高于對111In-DTPA-D-Phe1-奧曲肽的攝取(0.09±0.01％ID/g)和對99mTc-Sesta-MIBI的攝取(0.18±0.0％I.D/g)。
這里所引用的文獻均以全文形式作為參考引用。本發(fā)明是通過特定的實施方案及各種附圖進行描述的，但應當知曉可以用其他類似的實例或對上述的實例進行修飾和添加，在未偏離本發(fā)明的情況下而實現(xiàn)與本發(fā)明樣的功能。因此，本發(fā)明不應被局限于任何單獨的實施方案，而是應該根據(jù)后附的權利要求的廣度和范圍進行解釋。
序列表<110>馬休卡(馬休).L.塔可爾<120>PACAP組合物及用于腫瘤成像與治療的方法<130>8321-121 PC<150>60/344,511<151>2001-10～19<160>5<170>Fast SEQ for Widows Version 4.0<210>1<211>38<212>PRT<213>人類<400>1His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30Gln Arg Val Lys Asn Lys35<210>2<211>27<212>PRT<213>人類<400>2His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu20 25<210>3<211>176<212>PRT<213>人類<400>3Met Thr Met Cys Ser Gly Ala Arg Leu Ala Leu Leu Val Tyr Gly Ile
SEQUEN-11 5 10 15Ile Met His Ser Ser Val Tyr Ser Ser Pro Ala Ala Ala Gly Leu Arg20 25 30Phe Pro Gly Ile Arg Pro Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Glu Asp Gly Asn35 40 45Pro Leu Pro Asp Phe Gly Gly Ser Glu Pro Pro Gly Ala Gly Ser Pro50 55 60Ala Ser Ala Pro Arg Ala Ala Ala Ala Trp Tyr Arg Pro Ala Gly Arg65 70 75 80Arg Asp Val Ala His Gly Ile Leu Asn Glu Ala Tyr Arg Lys Val Leu85 90 95Asp Gln Leu Ser Ala Gly Lys His Leu Gln Ser Leu Val Ala Arg Gly100 105 110Val Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ala Gly Asp Asp Ala Glu Pro Leu115 120 125Ser Lys Arg His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr130 135 140Arg Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys145 150 155 160Arg Tyr Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys Gly Arg Arg Ile Ala Tyr Leu165 170 175<210>4<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N4螯合劑<221>變異體<222>2<223>D-型<400>4Gly Ala Gly Gly1<210>5<211>32<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>PACAP類似物TP 3475
SEQUEN-1<221>變異體<222>28<223>Xaa＝4-氨基丁酸<221>變異體<222>30<223>D-型<400>5His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 100 115Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Xaa Gly Ala Gly Gly20 25 30
權利要求
1.一種檢測受試驗者中能夠表達VPAC受體的腫瘤的方法，該受試驗者為這種腫瘤的患者或疑似患者，包括(1)給受試驗者使用有效量的具有分子式A或B的造影化合物；和(2)在受試驗者的至少一部分身體產(chǎn)生閃爍影像，其中分子式A和B是(A)M(I)-X1-P-X2(B)X1-P-X2-M(I)對于分子式A和BM為螯合劑，在分子式A中，當X1為0且P為PACAP27(SEQ IDNO2)時，M不是多氨基-多羧基酸類螯合劑；(I)是聯(lián)結于M的造影核素；X1是從0到20的天然或合成的氨基酸；P是PACAP，或具有PACAP生物活性的其類似物或片段；和X2是從0到20的天然或合成的氨基酸。
2.權利要求1的方法，其中M含有一個NxSy螯合化合物。
3.權利要求2的方法，其中的NxSy螯合化合物含有一個N2S2或N3S核心。
4.權利要求2的方法，其中的NxSy螯合化合物含有一個N4核心。
5.權利要求2的方法，其中的NxSy螯合化合物含有MAG3或Gly-(D)Ala-Gly-Gly。
6.權利要求1的方法，其中分子式B的螯合劑M含有一個多氨基-多羧基酸。
7.權利要求1的方法，其中I選自下列組99mTc、87Y、67Ga、64Cu和111In。
8.權利要求7的方法，其中I為99mTc。
9.權利要求1的方法，其中分子式A的造影化合物還含有一個空間臂Z1連接X1和M，分子式B的造影化合物還含有一個空間臂Z2連接X2和M。
10.權利要求9的方法，其中空間臂Z1和空間臂Z2分別含4-氨基丁酸。
11.權利要求1的方法，其中P含有SEQ ID NO2。
12.權利要求1的方法，其中造影化合物為99mTc-TP 3475。
13.權利要求1的方法，其中能夠表達VPAC的腫瘤選自下列組肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睪丸癌、肝癌、腮腺癌、膽道癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、腎癌、膀胱癌、腦瘤、前列腺癌、甲狀腺癌；鱗狀細胞癌；腺癌；小細胞癌；黑色素瘤、神經(jīng)膠質瘤和神經(jīng)母細胞瘤。
14.權利要求1的方法，其中受試驗者為非人哺乳動物。
15.權利要求1的方法，其中受試驗者使用的造影劑有效量從每70kg體重約0.01mCi至約100mCi。
16.權利要求1的方法，其中受試驗者使用的造影劑有效量從每70kg體重約0.1mCi至約50mCi。
17.權利要求1的方法，進一步包括了使用賴氨酸的步驟，先于或與造影劑同時使用以減少腎臟對造影劑的攝取。
18.一種抑制或逆轉患有腫瘤的受試驗者內表達VPAC受體的腫瘤生長的方法，包括對受試驗者使用有效量的分子式為C或D的組合物，分子式C和D為(C)M(T)-X1-P-X2(D)X1-P-X2-M(T)其中M為螯合劑；(T)是聯(lián)結于M的治療核素；X1是從0到20的天然或合成氨基酸；P是PACAP，或具有PACAP生物活性的其類似物或片段；和X2是從0到20的天然或合成氨基酸。
19.權利要求18的方法，其中M含有一個NxSy螯合化合物。
20.權利要求19的方法，其中的NxSy螯合化合物含有一個N2S2或N3S核心。
21.權利要求19的方法，其中的NxSy螯合化合物含有一個N4核心。
22.權利要求21的方法，其中的NxSy螯合化合物含有一個MAG3或Gly-(D)Ala-Gly-Gly。
23.權利要求18的方法，其中T選自下列組47Sc、64Cu、67Cu、67Ga、212Pb、68Ga、90Y、111In、153Sm、212Bi、210At、211At、177Lu、186Re和188Re。
24.權利要求23的方法，其中T選自下列組90Y、186Re或188Re。
25.權利要求18的方法，其中分子式C的治療化合物還含有一個空間臂Z1連接X1和M，分子式D的治療化合物還含有一個空間臂Z2連接X2和M。
26.權利要求25的方法，其中空間臂Z1和空間臂Z2分別含4-氨基丁酸。
27.權利要求18的方法，其中P含有SEQ ID NO2。
28.權利要求18的方法，其中表達VPAC的腫瘤選自下列組肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、喉癌、食道癌、睪丸癌、肝癌、腮腺癌、膽道癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、腎癌、膀胱癌、腦瘤、前列腺癌、甲狀腺癌；鱗狀細胞癌；腺癌；小細胞癌；黑色素瘤、神經(jīng)膠質瘤和神經(jīng)母細胞瘤。
29.權利要求18的方法，其中受試驗者為非人哺乳動物。
30.權利要求18的方法，其中受試驗者使用的造影化合物有效量從每70kg體重約1mCi至約1000mCi。
31.權利要求18的方法，其中受試驗者使用的造影化合物的有效量從每70kg體重約10mCi至約500mCi。
32.權利要求18的方法，其中受試驗者使用的造影化合物的有效量從每70kg體重約20mCi至約100mCi。
33.權利要求18的方法，進一步包括了使用賴氨酸的步驟，先于或與治療化合物同時使用，以減少腎臟對治療化合物的攝取。
全文摘要
表達VPAC受體的腫瘤可以用含PACAP的化合物或生物活性的PACAP類似物片段進行造影或治療。
文檔編號C07K14/47GK1571680SQ02820681
公開日2005年1月26日 申請日期2002年10月21日 優(yōu)先權日2001年10月19日
發(fā)明者馬休卡·馬休·L·塔可爾 申請人:托馬斯杰斐遜大學