專利名稱：用于治療神經(jīng)退行性疾病的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及用于基因傳遞的組合物和方法。本發(fā)明特別涉及用腺伴隨病毒作為載體的基因傳遞系統(tǒng)傳遞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)來(lái)治療由神經(jīng)退行性疾病引起的預(yù)先存在的神經(jīng)元損傷，如帕金森氏病。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是主要的公共健康問(wèn)題。帕金森氏病(PD)僅在美國(guó)就影響了一百萬(wàn)人以上。PD在臨床上表現(xiàn)為自主運(yùn)動(dòng)減少、行走困難、姿勢(shì)不穩(wěn)定、僵硬和顫動(dòng)。PD是一種進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病，主要影響黑質(zhì)(SN)中的多巴胺能(DA)神經(jīng)元。目前，多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是通過(guò)系統(tǒng)給予治療藥物來(lái)治療的。但是系統(tǒng)給藥經(jīng)常是無(wú)效的，因?yàn)樗幬锊荒芡ㄟ^(guò)血腦屏障。即使這些化合物能成功穿過(guò)血腦屏障，他們將導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用。因此，許多可能有效的化合物如蛋白質(zhì)，不能通過(guò)系統(tǒng)給藥。
目前可以獲得的治療PD的目標(biāo)在于替代紋狀體中的多巴胺以恢復(fù)運(yùn)動(dòng)功能。但是，必須開(kāi)發(fā)阻止或減緩持續(xù)進(jìn)行的退化進(jìn)程的治療干涉(Dunnett等，Nature(1999)399A32-39)。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)是目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)多巴胺能(DA)神經(jīng)元最有效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并經(jīng)驗(yàn)證在體內(nèi)和體外都可增強(qiáng)多巴胺能(DA)神經(jīng)元存活(Bjorklund等，Brain Res.(2000)88682-98；Bohn，M.C.，Mol.Ther.(2000)1494-496；Ozawa等，J.Neural Transm.Suppl.(2000)58181-191)。但是，GDNF蛋白給藥到中樞神經(jīng)系統(tǒng)是成問(wèn)題的。GDNF僅在很短的時(shí)間內(nèi)保留活性，而且由于GDNF較大，不能穿過(guò)血腦屏障，這使直接給藥到腦成為僅有的可行的傳遞方法。這必然要求立體定位注射傳遞GDNF到腦或腦室內(nèi)(ICV)，該傳遞方式嚴(yán)重地限制了它的治療應(yīng)用。因此，在體內(nèi)基因直接轉(zhuǎn)移提供了更有效的傳遞GDNF的方法。
腺伴隨病毒(AAV)曾成功的用于基因治療的基因傳遞。腺伴隨病毒(AAV)基因組是線性的，包含大約4681個(gè)核苷的單鏈DNA分子。AAV基因組通常在兩端各有一個(gè)反向末端重復(fù)區(qū)(ITR)，兩端之內(nèi)為非重復(fù)基因組。該ITR的長(zhǎng)度大約145bp。該ITR具有多重功能，包括作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，作為病毒基因組的包裝信號(hào)?；蚪M內(nèi)部非重復(fù)部分包括兩個(gè)大的可讀框，已知是AAV復(fù)制(rep)基因和衣殼(cap)基因。該rep和cap基因編碼可使病毒復(fù)制并包裝成病毒體的病毒蛋白。具體地說(shuō)，由AAV rep區(qū)域表達(dá)至少4個(gè)病毒蛋白，根據(jù)它們的表觀分子量命名為Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。AAV cap區(qū)域編碼至少3個(gè)蛋白，VP1、VP2和VP3。
通過(guò)去除AAV基因組內(nèi)非重復(fù)部分(即rep和cap基因)并在ITR中間插入外源基因，將AAV改造成傳遞目的基因。所述外源基因通常功能性連接一個(gè)外源啟動(dòng)子(組成型、細(xì)胞特異型、或誘導(dǎo)型)，該啟動(dòng)子在適合的條件下可在患者的靶細(xì)胞中啟動(dòng)基因表達(dá)。還可包括終止信號(hào)如多聚腺苷酸化位點(diǎn)。
AAV依賴于輔助病毒，即它需要與一個(gè)輔助病毒(例如，腺病毒、皰疹病毒或牛痘)共同感染才能形成AAV病毒體。在沒(méi)有輔助病毒共同感染時(shí)，AAV是潛伏狀態(tài)，病毒基因組插入到宿主細(xì)胞染色體中，但是不產(chǎn)生可感染的病毒體。之后通過(guò)輔助病毒感染“援助”整合基因組，使它復(fù)制并包裝其基因組成為感染AAV病毒體。AAV可感染不同種細(xì)胞，而輔助病毒必須是與宿主細(xì)胞同種的。例如，人AAV在犬科腺病毒共同感染犬科細(xì)胞中可以復(fù)制。
在嚙齒類和靈長(zhǎng)類PD模型中，研究表明利用AAV、腺病毒(Ad)或慢病毒載體型系統(tǒng)傳遞GDNF基因保護(hù)黑質(zhì)DA神經(jīng)元，如果在注射神經(jīng)毒素前或剛剛注射后給藥則還可恢復(fù)黑質(zhì)紋狀體通路(Choi-Lundberg等，Science(1997)275838-841；Mandel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)9414083-14088；Bilang-Bieuel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)948818-8823；Choi-Lundberg等，Exp.Neurol.(1998)154261-275；Mandel等，Exp.Neurol.(1999)160205-214；Kirik等，J.Neurosci.(2000)204686-4700；Bensadoun等，Exp.Neurol.(2000)16415-24；以及Kordower等，Science(2000)290767-773)。然而以前的研究表明當(dāng)DA神經(jīng)元損壞后延遲給予GDNF，剩下的DA神經(jīng)元是少量和大量的恢復(fù)功能反應(yīng)了仍然存活的DA神經(jīng)元和保持黑質(zhì)紋狀體的聯(lián)系的數(shù)量(Kirik等，J.Neurosci.(2000)204686-4700；Connor等，Gene Therapy(1999)61936-1951；Winkler等，J.Neurosci.(1996)167206-7215；Natsume等，Exp.Neurol.(2001)169231-238)。因此，以前沒(méi)有證明在退化進(jìn)程的晚期長(zhǎng)期利用AAV載體系統(tǒng)傳遞GDNF的效力。
PD是特征為進(jìn)行性DA退化的疾病，在明顯的癥狀出現(xiàn)以前DA神經(jīng)元數(shù)就明顯減少了。因此，臨床上更重要的是弄清楚以延遲的方式傳遞GDNF基因是否能夠挽救在已經(jīng)存在重度的黑質(zhì)紋狀體DA退化的動(dòng)物模型的DA神經(jīng)元和改善行為。此外，還不清楚載體源性GDNF在黑質(zhì)中能否由軸突末端向DA神經(jīng)元細(xì)胞體逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。
發(fā)明概述為了治療已經(jīng)存在的神經(jīng)元損傷，本領(lǐng)域需要替代方法傳遞GDNF。本發(fā)明以下面的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)AAV載體介導(dǎo)GDNF基因傳遞到重度的黑質(zhì)紋狀體多巴胺能(DA)去神經(jīng)的患者，促進(jìn)黑質(zhì)(SA)中DA神經(jīng)元的存活，提高酪氨酸羥化酶(TH)-陽(yáng)性DA纖維的密度，甚至在退化進(jìn)程發(fā)生以后改善行為和生化缺陷。此外轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的GDNF在黑質(zhì)中由紋狀體到DA細(xì)胞體逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，甚至在DA細(xì)胞大量喪失之后，保持黑質(zhì)紋狀體通路的功能聯(lián)系。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療已經(jīng)存在的神經(jīng)元損傷的哺乳動(dòng)物患者的方法。該方法包括給予患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)重組AAV病毒體，所述重組AAV病毒體包括有效連接包括啟動(dòng)子的表達(dá)控制元件的編碼GDNF多肽的多核苷酸，在體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)該多核苷酸的條件下提供治療效果。
在某些實(shí)施方案中，已經(jīng)存在的神經(jīng)元損傷包括中度或重度黑質(zhì)網(wǎng)狀體多巴胺能(DA)去神經(jīng)。
在另外的實(shí)施方案中，神經(jīng)細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，重組AAV病毒體給藥到所述患者的紋狀體內(nèi)。
在其它實(shí)施方案中，利用強(qiáng)力輸送系統(tǒng)(CED)將重組AAV病毒體給藥到紋狀體。
在某些實(shí)施方案中患者是人。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療已經(jīng)存在的神經(jīng)元損傷的哺乳動(dòng)物患者的方法。已經(jīng)存在的神經(jīng)元損傷包括中度到重度黑質(zhì)紋狀體DA去神經(jīng)，該方法包括將包含重組AAV病毒體的組合物給藥到患者的紋狀體，所述重組AAV病毒體包含有效連接包括啟動(dòng)子的表達(dá)控制元件的編碼GDNF多肽的多核苷酸，在導(dǎo)致體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的條件下，通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞來(lái)表達(dá)多核苷酸以達(dá)到治療效果。
此外，所述重組AAV病毒體可以利用CED給藥到所述患者的紋狀體。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療已經(jīng)存在的神經(jīng)元損傷的哺乳動(dòng)物患者的方法。已經(jīng)存在的神經(jīng)元損傷包括中度到重度黑質(zhì)紋狀體DA去神經(jīng)，該方法包括利用CED將包含重組AAV病毒體的組合物給藥到患者的紋狀體，所述重組AAV病毒體包含有效連接包括啟動(dòng)子的表達(dá)控制元件的編碼GDNF多肽的多核苷酸，在導(dǎo)致體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的條件下，通過(guò)體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)表達(dá)多核苷酸以達(dá)到治療效果。
在任何上述方法中，所述啟動(dòng)子可以是病毒啟動(dòng)子，例如，MLP、CMV或RSV LTR啟動(dòng)子。
如果利用CED，則可以用滲透泵或輸液泵給藥。
在上述任何方法中的多核苷酸還可以包括在5’位置而且符合編碼GDNF多肽的序列的讀框的分泌序列。此外，所述多核苷酸可以編碼人GDNF，例如人pre-pro-GDNF。
本發(fā)明還提供了治療哺乳動(dòng)物患者上述疾病或紊亂的組合物，該組合物包含重組AAV病毒體，所述重組AAV病毒體包含有效連接包括啟動(dòng)子的表達(dá)控制元件的編碼GDNF多肽的多核苷酸，在導(dǎo)致體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的條件下達(dá)到治療效果。本發(fā)明的組合物可以是任選包含藥學(xué)上可接受的載體的藥學(xué)組合物。
此外，本發(fā)明提供1.組合物在治療已經(jīng)存在的神經(jīng)元損傷的哺乳動(dòng)物患者中的應(yīng)用，將所述組合物給藥到所述患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其中所述組合物包含重組腺伴隨病毒(AAV)病毒體，其中所述病毒體包含有效連接包括啟動(dòng)子的表達(dá)控制元件的編碼神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)多肽的多核苷酸。
2.第1項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述患者是人。
3.第1項(xiàng)或第2項(xiàng)任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述已經(jīng)存在的神經(jīng)元損傷包括中度到重度黑質(zhì)紋狀體多巴胺能(DA)去神經(jīng)。
4.1-3項(xiàng)任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述多核苷酸還包括5’位置分泌序列和可讀框中編碼GDNF多肽的序列。
5.1-4項(xiàng)任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述多核苷酸編碼人GDNF。
6.第5項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述多核苷酸編碼人pre-pro-GDNF。
7.1-6項(xiàng)任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述組合物給藥到所述患者的紋狀體。
8.上述的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述啟動(dòng)子是病毒啟動(dòng)子。
9.第8項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述啟動(dòng)子是MLP、CMV或RSV LTR啟動(dòng)子。
10.上述的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述重組AAV病毒體給藥到所述患者的紋狀體。
11.第10項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述重組AAV病毒體通過(guò)強(qiáng)力輸送系統(tǒng)(CED)給藥到紋狀體。
12.第11項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述給藥是通過(guò)滲透泵進(jìn)行的。
13.第11項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述給藥是通過(guò)輸液泵進(jìn)行的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容想到本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方案。
附圖簡(jiǎn)述

圖1a和1b為AAV載體示意圖。在圖1a中，LacZ受CMV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制。在圖1b中，小鼠GDNF cDNA在C-末端與FLAG多肽的編碼序列融合并受CMV啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制。ITR，反向末端重復(fù)區(qū)；CMV，巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子；內(nèi)含子，人生長(zhǎng)素的第一個(gè)內(nèi)含子；多聚A，SV40多腺苷酸化信號(hào)序列。
圖2表示用AAV-GDNFflag轉(zhuǎn)導(dǎo)后從293個(gè)細(xì)胞中提取出的細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)印記分析。用模擬物(1道)或AAV-LacZ(2道)轉(zhuǎn)導(dǎo)的293個(gè)細(xì)胞作為陰性對(duì)照。用AAV-GDNFflag轉(zhuǎn)導(dǎo)(3道)后36個(gè)小時(shí)，分別用抗-GDNF和抗-FLAG抗體檢測(cè)到GDNFflag融合蛋白的表達(dá)。
圖3表示用AAV-GDNFflag轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物中增加的存活的DA神經(jīng)元。用AAV-GDNFflag、AAV-LacZ或模擬物轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)9天后的大鼠E14中腦細(xì)胞培養(yǎng)物中計(jì)數(shù)TH-IR(DA)神經(jīng)元的數(shù)目。培養(yǎng)物中加入rhGDNF(10ng/ml)作為陽(yáng)性對(duì)照。誤差條圖顯示s.em.(*P＜0.01)。
圖4a-4e描述在紋狀體中GDNFflag的表達(dá)并逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到SN。AAV-GDNFflag注入到病變紋狀體4周后，殺死大鼠，為了進(jìn)行免疫組織化學(xué)而處理通過(guò)紋狀體和SN的冠狀切片。用抗-FLAG抗體檢測(cè)紋狀體中GDNFflag轉(zhuǎn)基因表達(dá)(圖4a和4b)。通過(guò)用多克隆抗-TH抗體(4c)和單克隆抗-FLAG抗體(4d)雙免疫熒光染色來(lái)確定同側(cè)SN中GDNFflag的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。4c和4d的覆蓋圖(4e)表明FLAG和TH-陽(yáng)性神經(jīng)元共同定位在SN中。在致密部的廣闊區(qū)域檢測(cè)雙陽(yáng)性神經(jīng)元。該圖表明觀察到TH和FLAG的最明顯的共同定位區(qū)域。(a，bar＝100μm；b，bar＝25μm；c-e，bar＝50μm)。
圖5a-5e表明AAV-GDNFflag注射對(duì)紋狀體中TH-IR纖維的效果在AAV-LacZ注射動(dòng)物的損傷側(cè)的TH-IR纖維的密度明顯減少(圖5a和5c)。相反，AAV-GDNFflag注射動(dòng)物證明在處理的紋狀體中TH-IR纖維的密度增加(圖5b和5d)。圖5c和5d分別顯示圖5a和5b的損傷側(cè)的箭頭處的高度放大的觀察區(qū)域。圖5e表明用圖5b的完整側(cè)上的箭頭顯示區(qū)域中密集的TH-IR纖維。(圖5a-5b，bar＝1mm；圖5c-5e，bar＝50μm)。
圖6a-6f表明用CTB逆行標(biāo)記，6-OHDA損傷產(chǎn)生4周后。SN切片用CTB(圖6a和6d)和TH(圖6b和6e)雙重染色。在損傷側(cè)(圖6a-6c)和對(duì)側(cè)(圖6d-6f)兩側(cè)的CTB陽(yáng)性細(xì)胞也是TH-IR陽(yáng)性，代表DA神經(jīng)元。在損傷側(cè)(圖6a-6c)，通過(guò)CTB逆行標(biāo)記TH-陽(yáng)性神經(jīng)元表明在損害4周后一些DA神經(jīng)元保持與紋狀體損傷的聯(lián)系。圖6c是圖6a和6b的覆蓋圖。圖6f是圖6d和6e的覆蓋圖(bar＝50μm)。
圖7a-7f表明在SN中AAV-GDNFflag對(duì)TH-和CTB-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的影響。通過(guò)中腦的冠狀切片顯示AAV載體給藥20周后TH-IR(圖7a-7c)和CTB-陽(yáng)性(圖7d-7f)黑質(zhì)神經(jīng)元。在殺死動(dòng)物前3天向紋狀體兩側(cè)注射CTB。分別來(lái)自AAV-LacZ注射動(dòng)物的損傷側(cè)(圖7a和7d)和AAV-GDNFflag注射動(dòng)物的損傷側(cè)(圖7b和7e)和完整半球(圖7c和7f)的SN實(shí)例。(圖7a-7c，bar＝200μm；圖7d-7f，bar＝100μm)。
圖8表明接受AAV-GDNFflag注射的大鼠損傷SN中TH-陽(yáng)性和CTE-陽(yáng)性神經(jīng)元的百分率與用AAV-LacZ注射的動(dòng)物比較明顯增加(n＝8)。用陽(yáng)性細(xì)胞的百分率來(lái)表示數(shù)據(jù)(損傷/未損傷半球，*P＜0.01)。
圖9a-9b表明GDNFflag對(duì)行為恢復(fù)的影響。經(jīng)脫水嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)和圓筒實(shí)驗(yàn)檢查紋狀體內(nèi)注射AAV-GDNFflag(n＝20)、AAV-LacZ(n＝16)或載體(n＝8)的大鼠。接受AAV-GDNFflag的大鼠中觀察到脫水嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)明顯減少。相反，用AAV-LacZ注射組或載體注射組的大鼠表現(xiàn)出穩(wěn)定的旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)以每60分的轉(zhuǎn)數(shù)表示。(圖9a)。通過(guò)圓筒實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)6-OHDA損害后的自發(fā)前肢使用。在AAV處理前，通過(guò)對(duì)側(cè)肢使用頻率的減少說(shuō)明大鼠明顯地表現(xiàn)為偏向同側(cè)(總接觸的23-25％)。20周時(shí)AAV-GDNFflag處理的大鼠逐漸地改善達(dá)到接近正常(總的47％)。相反，接受AAV-LacZ或載體的大鼠的對(duì)側(cè)肢使用頻率的減少持續(xù)存在。用總數(shù)的百分率表示對(duì)側(cè)(右)前腳接觸(*P＜0.01)。(圖9b)。
圖10a和10b表明AAV-GDNFflag(n＝8)或AAV-LacZ(n＝8)注射20周后6-OHDA-病變中含有的多巴胺(圖10a)和DOPAC和HVA(多巴胺代謝物)(圖10b)。數(shù)據(jù)表示完整紋狀體的百分率(P＜0.01)。
圖11(SEQ ID NOS1和2)表示人pre-pro-GDNF的核苷酸序列和氨基酸序列。成熟的GDNF分子為氨基酸位置78-211。
圖12(SEQ ID NOS3和4)表示大鼠pre-pro-GDNF的核苷酸序列和氨基酸序列。成熟的GDNF分子為氨基酸位置78-211。
圖13(SEQ ID NOS6和7)表示小鼠pre-pro-GDNF的核苷酸序列和氨基酸序列。成熟的GDNF分子為氨基酸位置107-240。
發(fā)明詳述除非另有說(shuō)明，實(shí)施本發(fā)明應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)病毒學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行。所述技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分地解釋。參見(jiàn)，例如Sambrook等Molecular CloningALaboratory Manual(最近版本)；DNA CloningA Practical Approach，第I&II卷(D.Glover，編輯)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，編輯，最近版本)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames & S.Higgins，編輯，最近版本)；Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins，編輯，最近版本)；CRC Handbook of Parvoviruses，第I&II卷(P.Tijssen，編輯)；Fundamental Virology，第2版，第I&II卷(B.N.Fields and D.M.Knipe，編輯)；Freshney Culture of Animal Cells，A Manual of BasicTechnique(Wiley-Liss，第3版)；以及Ausubel等(1991)Current Protocolsin Moleular Biology(Wiley Interscience，NY)。
除非本文另有清楚的說(shuō)明，在本說(shuō)明書(shū)和附件權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式“一個(gè)”“一種”和“其(該，所述)”包括復(fù)數(shù)含義。
A.定義在本發(fā)明的描述中，將使用下列術(shù)語(yǔ)，特此簡(jiǎn)要說(shuō)明定義如下本文使用的術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子多肽”或“GDNF多肽”是指任何來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，是與任何多種已知GDNF基本同源和功能相當(dāng)。三種哺乳動(dòng)物有代表性的GDNF示于圖11、12和13。大鼠(圖12，SEQ ID NO4)和人(圖11，SEQ ID NO2)蛋白質(zhì)之間的同源度是大約93％，所有哺乳動(dòng)物GDNF具有相似高度同源性。所述GDNF以單體、二聚體或其他多聚體的生物活性形式存在。因此，本文使用的術(shù)語(yǔ)“GDNF多肽”包括活性單體GDNF以及活性多聚體GDNF、活性糖基化和非糖基化形式的GDNF和活性截短形式的分子。
本文使用的“功能相當(dāng)”是指GDNF多肽保留部分或全部神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的特性，但是與天然的GDNF分子的程度不一定相同。
“同源”是指兩個(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽部分之間相似的百分?jǐn)?shù)。當(dāng)兩個(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽序列至少大約50％相似，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80-85％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95-99％或在規(guī)定的分子長(zhǎng)度內(nèi)更多序列相似或序列相同，則所述序列彼此“基本同源”。本文使用的基本同源還指與特定的多核苷酸或多肽序列完全相同的序列。
“同一性”通常是指兩個(gè)多核苷酸或多肽序列分別準(zhǔn)確的核苷酸與核苷酸或氨基酸與氨基酸的對(duì)應(yīng)。同一性百分率可通過(guò)兩個(gè)分子之間序列信息的直接對(duì)比來(lái)測(cè)定，通過(guò)排列序列，計(jì)算兩列序列之間匹配的準(zhǔn)確數(shù)，除以最短序列，結(jié)果乘以100。
可以應(yīng)用容易買到的計(jì)算機(jī)程序幫助分析相似性和同一性，例如ALIGN、Dayhoff，M.O(Atlas of Protein Sequence and Structure，M.O.Dayhoff編輯，5增刊3353-358，國(guó)家生物醫(yī)學(xué)研究基金，華盛頓，其修改Smith和Waterman Advances in Appl.Math.2482-489，1981的用于肽分析的局部同源運(yùn)算法則)。在Wisconsin序列分析包(WisconsinSequence Analysis Package)第8版本中可以獲得測(cè)定核苷酸序列相似性和同一性的程序(由Genetics Computer Group，Madison，WI獲得)，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，這些程序也依賴于Smith和Waterman運(yùn)算法則。通過(guò)制造商推薦和前面提到Wisconsin序列分析包中所述的默認(rèn)參數(shù)容易使用這些程序。例如，特定核苷酸序列與參考序列的相似性百分比可以利用默認(rèn)打分表和6個(gè)核苷酸位點(diǎn)的空位罰分的Smith和Waterman的同源運(yùn)算法則來(lái)測(cè)定。
本

發(fā)明內(nèi)容
中另一個(gè)建立相似性百分比的方法是利用愛(ài)丁堡大學(xué)擁有版權(quán)，由John F.Collins和Shane S.Sturrok開(kāi)發(fā)，由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)發(fā)行的MPSRCH軟件包。這套軟件包在默認(rèn)參數(shù)用于記分表中使用Smith和Waterman運(yùn)算法則(例如，空位開(kāi)放罰分為12、空位延長(zhǎng)罰分為1、一個(gè)空位為6)。由該數(shù)據(jù)產(chǎn)生“匹配”值反應(yīng)“序列相似性”。本領(lǐng)域通常已知其他計(jì)算序列間同一性或相似性百分比的合適的程序，例如，另一種對(duì)比程序是BLAST，使用默認(rèn)參數(shù)。例如，BLASTN和BLASTP可應(yīng)用下列默認(rèn)參數(shù)來(lái)使用遺傳密碼＝標(biāo)準(zhǔn)；過(guò)濾器＝無(wú)；鏈＝兩條；截止值＝60；預(yù)期值＝10；矩陣＝BLOSUM62；種類＝50個(gè)序列；按...排序＝HIGH SCORE；數(shù)據(jù)庫(kù)＝非豐余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank+CDS翻譯+Swiss蛋白質(zhì)+Spupdate+PIP。這些程序的詳細(xì)內(nèi)容可在下列網(wǎng)址中找到http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
此外，同源性可通過(guò)多核苷酸在下列條件下雜交來(lái)測(cè)定，所述條件是在同源的區(qū)域形成穩(wěn)定的雙鏈，然后用單鏈特異性核酸酶消化，消化片段的大小測(cè)定。在例如針對(duì)特殊系統(tǒng)定義的的嚴(yán)格條件下通過(guò)DNA印跡雜交實(shí)驗(yàn)來(lái)確定DNA序列是基本同源的。定義的適合雜交條件是本領(lǐng)域的技術(shù)。參見(jiàn)，例如，Sambrook等，同上；DNA Cloning，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上。
“GDNF變體”是指參照GDNF分子有生物活性的衍生物，或所述衍生物保留想要的活性的片段，例如本文所述實(shí)驗(yàn)中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。一般地說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“變體”指具有天然多肽序列和結(jié)構(gòu)、而相對(duì)于天然分子一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入、取代(通常是保守的)和/或缺失的化合物，只要所述改變不破壞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。優(yōu)選所述變體具有至少與天然分子相同的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性。用于制造編碼GDNF變體的多核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的并在下面進(jìn)一步描述。
對(duì)于GDNF缺失變體，通常缺失范圍是大約1-30個(gè)殘基，更通常為大約1-10個(gè)殘基，典型的是大約1-5個(gè)臨近的殘基，或在所述范圍內(nèi)的任何整數(shù)。設(shè)想存在N-末端、C-末端和內(nèi)部缺失。為了保持最大的生物活性，通常將缺失導(dǎo)入到與其它TGF-β超家族成員低同源的區(qū)域。通常選擇缺失以保持GDNF蛋白產(chǎn)物在受影響的區(qū)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)，例如，半胱氨酸交聯(lián)。缺失變體的非限制性實(shí)施例包括缺失GDNF1-40 N-末端氨基酸的截短的GDNF蛋白質(zhì)產(chǎn)物，或缺失GDNF C-末端殘基的變體或其結(jié)合物。
對(duì)于GDNF插入變體，氨基酸序列插入通常包括N-和/或C-末端融合，融合范圍從一個(gè)殘基到包含一百個(gè)或更多殘基的多肽的長(zhǎng)度，以及內(nèi)部加入單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。內(nèi)部插入通常范圍是大約1-10個(gè)殘基，更通常為大約1-5個(gè)殘基，常常是1-3個(gè)氨基酸殘基，或在所述范圍內(nèi)的任何整數(shù)。N-末端插入變體的實(shí)例包括異源N-末端信號(hào)序列與GDNF N-末端的融合，以及其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子序列衍生的氨基酸序列的融合。
GDNF取代變體有至少一個(gè)GDNF氫基酸序列的氨基酸殘基除去，由一個(gè)不同的殘基插入到它的位置。所述取代變體包括等位基因的變體，其特征在于在單種種群中自然發(fā)生的核苷酸序列的改變，它可能導(dǎo)致或不導(dǎo)致氨基酸改變。特別優(yōu)選的取代是保守的，即這些取代是在與它們的側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)的取代。具體地說(shuō)，氨基酸通常分為4種(1)酸性的—天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性的—賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性的—丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；以及(4)不帶電的極性的—甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)分類為芳香族氨基酸。例如，可以預(yù)見(jiàn)的是用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用絲氨酸取代蘇氨酸、或用結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸取代相似的保守的氨基酸，這些取代不會(huì)對(duì)生物活性有大的影響。
例如，該GDNF分子可以包括直至大約5-10個(gè)保守的或非保守的氨基酸取代，或甚至大約15-25個(gè)保守的或非保守的氨基酸取代，或5-25之間任何整數(shù)，只要保持想要的分子功能完整。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)可以很容易地測(cè)定目的分子允許改變的區(qū)域。
GDNF氨基酸序列的特定突變可以包括糖基化位點(diǎn)的修飾(例如，絲氨酸、蘇氨酸、或天冬酰胺)。在任何天冬酰胺-連接的糖基化識(shí)別位點(diǎn)或通過(guò)插入O-聯(lián)糖類修飾的分子的任何位點(diǎn)的氨基酸取代或缺失導(dǎo)致失去糖基化或部分糖基化。天冬酰胺-連接的糖基化識(shí)別位點(diǎn)包括適當(dāng)?shù)募?xì)胞糖基化酶特異性識(shí)別的三肽序列。這些三肽序列是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser，其中Xaa可以是除了Pro外的任何氨基酸。在糖基化識(shí)別位點(diǎn)的第一或第三個(gè)氨基酸位置的一個(gè)或兩個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸取代或缺失的改變(和/或在第二位置上氨基酸缺失)導(dǎo)致在修飾的三肽序列非糖基化。因此適當(dāng)改變的核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)生不在該位點(diǎn)糖基化的變體。或者，GDNF氨基酸序列可以修飾以加上糖基化位點(diǎn)。
識(shí)別突變GDNF氨基酸殘基或區(qū)域的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。一種已知所述方法是“丙氨酸掃描突變”。參見(jiàn)例如，Cunningham和Wells，Science(1989)2441081-1085。在這個(gè)方法中，鑒別氨基酸殘基或目標(biāo)殘基組(例如，帶電的殘基如Arg、Asp、His、Lys以及Glu)并用中性或帶負(fù)電氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸和多聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與細(xì)胞內(nèi)外周圍水環(huán)境之間的相互作用。通過(guò)在取代的位點(diǎn)引入另外的或替代的殘基精確定位對(duì)取代敏感的功能的結(jié)構(gòu)域。因此，測(cè)定引入氨基酸序列變異的靶位點(diǎn)，在相應(yīng)的靶密碼子或DNA序列的區(qū)域上進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，篩選表達(dá)的GDNF變體以對(duì)需要的活性和活性程度進(jìn)行最優(yōu)組合。
誘變最關(guān)鍵的位點(diǎn)包括在側(cè)鏈體積、電荷、和/或疏水性的方面不同物種GDNF蛋白的氨基酸明顯不同的位點(diǎn)。其它的目標(biāo)位點(diǎn)是那些來(lái)自不同物種的在GDNF-樣蛋白的特定殘基上是同樣的位點(diǎn)。所述位置通常對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性是重要的。這些位點(diǎn)起初是以相關(guān)的保守方式取代的。如果所述取代導(dǎo)致生物活性的改變，那么引入更大改變(典型取代)，和/或制造其它插入或缺失，并篩選所得產(chǎn)物的活性。
GDNF活性的測(cè)定是本領(lǐng)域已知的，包括增強(qiáng)中腦神經(jīng)元培養(yǎng)物中多巴胺的吸收的能力和增強(qiáng)交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的存活的能力。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)6,362,319。
“帕金森氏病樣癥狀”包括肌肉顫抖、肌肉無(wú)力、僵硬、運(yùn)動(dòng)徐緩、姿勢(shì)和平衡的改變、癡呆和相似癥狀，通常是帕金森氏病或其它神經(jīng)變性的疾病伴有的。
“載體”是指任何遺傳元件，例如質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體、病毒、病毒粒體等，當(dāng)與適當(dāng)?shù)目刂埔蜃舆B接時(shí)它們能夠復(fù)制并能在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)運(yùn)基因序列。因此，該術(shù)語(yǔ)包括克隆和表達(dá)載體，以及病毒載體。
“AAV載體”是指由腺伴隨病毒血清型衍生的載體，非限制性包括AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7和AAV-8。AAV載體可以具有全部或部分缺失一個(gè)或多個(gè)AAV野生型基因，優(yōu)選rep和/或cap基因，但是保留功能性側(cè)接ITR序列。功能性ITR序列對(duì)AAV病毒體的拯救、復(fù)制和包裝是必須的。因此，本文定義的AAV載體包括至少病毒復(fù)制和包裝順式需要的那些序列(例如，功能性ITR)。所述ITR不必是野生型核苷酸序列，可以是經(jīng)改變的，例如，經(jīng)過(guò)核苷酸的插入、缺失或取代，只要該序列提供功能性拯救、復(fù)制和包裝。
“AAV輔助功能”是指可以表達(dá)提供AAV基因產(chǎn)物的AAV衍生的編碼序列，所述產(chǎn)物再對(duì)生產(chǎn)性AAV復(fù)制反式起作用。因此，AAV輔助功能包括兩個(gè)主要AAV可讀框(ORF)，即rep和cap。所述Rep表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)證實(shí)具有多種功能，其中包括AAV DNA復(fù)制起點(diǎn)的識(shí)別、結(jié)合和產(chǎn)生切口；DNA解旋酶活性；以及由AAV(或其它異源的)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。所述Cap表達(dá)產(chǎn)物提供必要的包裝功能。本文使用AAV輔助功能來(lái)補(bǔ)充AAV載體失去的反式AAV功能。
術(shù)語(yǔ)“AAV輔助構(gòu)建物”通常是指包括提供AAV載體缺失的AAV功能的核苷酸序列的核酸分子，它用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)載體來(lái)傳遞目標(biāo)核苷酸序列。AAV輔助構(gòu)建物通常用于提供AAV rep和/或cap基因的瞬時(shí)表達(dá)來(lái)補(bǔ)充失去的細(xì)胞裂解性AAV復(fù)制必須的AAV功能；但是輔助構(gòu)建物缺少AAV ITR并且不能自我復(fù)制和自我包裝。AAV輔助構(gòu)建物可以是質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、病毒或病毒粒體。描述了許多AAV輔助構(gòu)建物，例如常用的編碼Rep和Cap表達(dá)產(chǎn)物的質(zhì)粒pAAV/Ad和pIM29+45。參見(jiàn)例如，Samulski等(1989)J.Virol.633822-3828；以及McCarty等(1991)J.Virol.652936-2945。已有許多其它編碼Rep和Cap表達(dá)產(chǎn)物的載體的介紹。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,139,941和6,376,237。
術(shù)語(yǔ)“附屬功能”是指非AAV衍生的病毒和/或細(xì)胞的功能(AAV依賴其進(jìn)行復(fù)制)。因此，該術(shù)語(yǔ)包括在AAV復(fù)制中需要的蛋白和RNA包括那些涉及AAV基因轉(zhuǎn)錄活化、時(shí)期專一的AAV mRNA剪接、AAVDNA復(fù)制、Cap表達(dá)產(chǎn)物的合成和AAV衣殼裝配的部分?；诓《镜母綄俟δ芸捎扇魏我阎妮o助病毒如腺病毒、皰疹病毒(除了1型單純皰疹病毒)和牛痘病毒衍生。
術(shù)語(yǔ)“附屬功能載體”通常是指包含提供附屬功能的核苷酸的核酸分子。附屬功能載體可以轉(zhuǎn)染適合的宿主細(xì)胞，然后所述載體在宿主細(xì)胞中能夠支持AAV病毒體產(chǎn)生。從該術(shù)語(yǔ)中特別排除在外的是自然存在的傳染性病毒體，例如腺病毒、皰疹病毒或牛痘病毒體。因此，附屬功能載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子或粘粒的形式。
特別證明了完全補(bǔ)充的腺病毒基因不需要附屬的輔助功能。具體地說(shuō)，不能DNA復(fù)制和晚期基因合成的腺病毒突變體表明是AAV復(fù)制許可的。Ito等，(1970)J.Gen.Virol.9243；Ishibashi等，(1971)Virology45317。同樣地，E2B和E3區(qū)域內(nèi)的突變體顯示出支持AAV復(fù)制，說(shuō)明E2B和E3區(qū)域可能不參與提供附屬的功能。Carter等，(1983)Virology126505。但是，E1區(qū)域缺陷或缺失E4區(qū)域的腺病毒不能支持AAV復(fù)制。因此，E1A和E4區(qū)域可能是AAV復(fù)制直接或間接需要的。Laughlin等，(1982)J.Virol.41868；Janik等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA781925；Carter等，(1983)Virology126505。其它特征性Ad突變體包括E1B(Laughlin等，(1982)，同上；Janik等，(1981)，同上；Ostrove等，(1980)Virology104502)；E2A(Handa等，(1975)J.Gen.Virol.29239；Strauss等，(1976)J.Virol.17140；Myers等，(1980)J.Virol.35665；Jay等，(1981)Proc.Aatl.Acad.Sci.USA782927；Myers等，(1981)J.Biol.Chem.256567)；E2B(Carter，腺伴隨病毒輔助功能，I CRC Handbook of Parvoviruses(P.Tijssen編輯，1990))；E3(Carter等，(1983)，同上)；以及E4(Carter等，(1983)，同上；Carter(1995))。盡管通過(guò)具有E1B編碼區(qū)域突變的腺病毒提供的附屬功能的研究產(chǎn)生不一致的結(jié)果，但是Samulski等，(1988)J.Virol.62206-210，最近報(bào)道E1B55k是AAV病毒體產(chǎn)生所需要的，而E1B19k不是。此外，國(guó)際公開(kāi)WO97/17458和Matshushita等，(1998)GeneTherapy5938-945描述了編碼多種Ad基因的附屬功能載體。
特別優(yōu)選附屬功能載體包括腺病毒VARNA編碼區(qū)域、腺病毒E4 ORF6編碼區(qū)域、腺病毒E2A 72 kD編碼區(qū)域、腺病毒E1A編碼區(qū)域、和缺少完整E1B55k區(qū)域的腺病毒E1B編碼區(qū)域。在國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO01/83797中描述了所述載體。
“能夠支持有效的rAAV病毒體產(chǎn)生”是指附屬功能載體或系統(tǒng)在特定的宿主細(xì)胞中，能夠提供與腺病毒輔助病毒感染該宿主細(xì)胞能獲得的大體相當(dāng)?shù)幕蚋咚降膔AAV病毒體產(chǎn)生的輔助功能。因此，附屬功能載體或系統(tǒng)支持有效的rAAV病毒體產(chǎn)生的能力可以通過(guò)比較應(yīng)用附加載體或系統(tǒng)獲得的rAAV病毒體滴度與應(yīng)用傳染性腺病毒感染獲得的滴度來(lái)確定。更具體地說(shuō)，如果相同數(shù)量的宿主細(xì)胞獲得的病毒體量少于用腺病毒感染的量的不大于200倍，更優(yōu)選不大于100倍，最優(yōu)選相等或高于用腺病毒感染獲得的量，則附屬功能載體或系統(tǒng)支持有效的rAAV病毒體產(chǎn)生與用傳染性腺病毒獲得的大致相當(dāng)或更高。
“重組病毒”是指經(jīng)過(guò)遺傳改變的病毒，例如，通過(guò)添加或插入異源核酸構(gòu)建物到粒子中。
“AAV病毒體”是指完整病毒體，如野生型(wt)AAV病毒體(包括與AAV衣殼蛋白外殼結(jié)合的線性單鏈AAV核酸基因組)。在這點(diǎn)上，任何互補(bǔ)單鏈AAV核酸分子，例如有意義鏈或無(wú)意義鏈，都可以包裝到任何AAV病毒體中，并且兩條鏈同樣地具有傳染性。
“重組AAV病毒體”或“rAAV病毒體”本文定義為有傳染性的復(fù)制缺陷病毒，包括AAV蛋白衣殼，封裝著側(cè)接AAV ITR的目的異源核苷酸序列。rAAV病毒體是在具有AAV載體的、AAV輔助功能和引入其中的附屬功能合適的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的。如此，所述宿主細(xì)胞具有編碼AAV多肽的能力，為了以后的基因傳遞，這就需要將AAV載體(包括目的重組核苷酸序列)包裝到傳染性重組病毒體中。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”是用于指細(xì)胞吸收外源DNA，當(dāng)外源DNA導(dǎo)入到細(xì)胞膜內(nèi)時(shí)即轉(zhuǎn)染了該細(xì)胞。許多轉(zhuǎn)染技術(shù)通常是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如，Graham等，(1973)Virology52456，Sambrook等，(1989)Molecular Cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，Davis等，(1986)Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier，和Chu等，(1981)Gene13197。所述技術(shù)可以用于將一個(gè)或多個(gè)外源DNA部分(如核苷酸整合載體和其它核酸分子)引入到合適的宿主細(xì)胞中。
術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”表示例如微生物、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，它們能夠或已經(jīng)用于接受AAV輔助構(gòu)建物、AAV載體質(zhì)粒、附屬功能載體、或其它轉(zhuǎn)運(yùn)DNA。術(shù)語(yǔ)包括轉(zhuǎn)染的原始細(xì)胞的子代。因此，本文使用的“宿主細(xì)胞”通常是指用外源DNA序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞?？梢岳斫庥捎谧匀弧⑴既换蛴心康牡耐蛔?，單一親代細(xì)胞的子代在形態(tài)學(xué)或遺傳或總DNA互補(bǔ)上與原始的親代不需要完全一致。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞系”是指在體外能夠繼續(xù)或延長(zhǎng)生長(zhǎng)和分裂的細(xì)胞群體。通常，細(xì)胞系是由單一的祖代細(xì)胞衍生的無(wú)性(繁殖)系的群體。本領(lǐng)域深知在所述無(wú)性(繁殖)系的群體的保存或轉(zhuǎn)運(yùn)中染色體組型可能發(fā)生自發(fā)的或誘導(dǎo)的改變。因此，細(xì)胞系衍生的細(xì)胞是指可以不與祖代細(xì)胞或培養(yǎng)物準(zhǔn)確一致，所述細(xì)胞系包括所述變體。
術(shù)語(yǔ)“異源的”涉及核酸序列如編碼序列和控制序列，表示通常不連接在一起的序列，和/或通常不是特定的細(xì)胞具有的序列。因此，核酸構(gòu)建物或載體的“異源”區(qū)域是在另一個(gè)核酸分子中或與另一個(gè)核酸分子相連的核酸節(jié)段，而在自然中與所述另外的分子無(wú)關(guān)。例如，核酸構(gòu)建物的異源區(qū)域可以包括編碼序列和非天然的編碼序列側(cè)翼序列。異源編碼序列的另一個(gè)例子是編碼序列本身是自然中不存在的構(gòu)建物(例如，具有與天然基因不同的密碼子的合成序列)。同樣地，本發(fā)明的目的認(rèn)為用不是細(xì)胞中正常存在的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是異源的。等位基因的變異或自然發(fā)生的突變事件不會(huì)產(chǎn)生本文使用的異源DNA。
“編碼序列”或“編碼”特定蛋白的序列是，當(dāng)處于合適的調(diào)節(jié)序列的控制下在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄(在DNA的情況)和翻譯(在mRNA的情況)成多肽的核酸序列。編碼序列的邊界是由5’末端(氨基)的起始密碼子和3’末端(羧基)的終止密碼子決定的。編碼序列可以包括，但不限于，來(lái)自原核的或真核的mRNA的cDNA、來(lái)自原核的或真核的DNA的基因組DNA序列、甚至合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列通常是位于編碼序列的3’端。
“核酸”序列是指DNA或RNA序列。該術(shù)語(yǔ)包括含任何已知DNA和RNA堿基類似物的序列，例如，但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨甲基-2-硫代尿嘧啶、5-羧基甲基-氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基肌苷、2.2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基烏嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基烏嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷、5’-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤。
術(shù)語(yǔ)DNA“控制序列”是指啟動(dòng)子序列、多聚腺苷酸信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)區(qū)域、復(fù)制起點(diǎn)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(“IRES”)、增強(qiáng)子等的集合，它們共同提供在受體細(xì)胞中編碼序列的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。不是所有的這些控制序列都需要存在，只要選定的編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄并翻譯。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”通常意義是指包括DNA調(diào)節(jié)序列的核苷酸區(qū)域，其中所述調(diào)節(jié)序列是由能夠結(jié)合RNA聚合酶和啟動(dòng)子下游(3’-方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的基因衍生來(lái)的。轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子包括“誘導(dǎo)型啟動(dòng)子”(有效連接啟動(dòng)子的多核苷酸序列表達(dá)是通過(guò)分析物、輔因子、調(diào)節(jié)蛋白等誘導(dǎo)的)和“組成型啟動(dòng)子”。
“有效連接”是指元件的排列，其中所描述的成分配置成得以執(zhí)行它們通常的功能。因此，控制序列可操作地連接到編碼序列能影響編碼序列的表達(dá)?？刂菩蛄胁恍枰c編碼序列鄰近，只要它們能控制編碼序列的表達(dá)。因此例如，間插不可翻譯但可轉(zhuǎn)錄的序列可以存在于啟動(dòng)子序列和編碼序列之間，仍然可以認(rèn)為啟動(dòng)子序列是“有效連接”到編碼序列。
“分離(的)”當(dāng)就核苷酸序列而言，是指所述分子在基本上沒(méi)有其它同型的生物學(xué)大分子的情況下存在。因此，“編碼特定的多肽的分離的核酸分子”是指基本沒(méi)有其它不編碼所述多肽的核酸分子的核酸分子；但是所述分子可以包括一些對(duì)所述組分基本特征沒(méi)有有害影響的其它堿基或部分。
在整個(gè)申請(qǐng)中描述特定核酸分子中核苷酸序列的相應(yīng)位置時(shí)，例如，當(dāng)特定核苷酸序列描述成位于相對(duì)于另一序列的“上游”、“下游”、“3’”或“5’”時(shí)，可以理解成所述序列在DNA分子的“有義鏈”或“編碼”鏈中的位置，這是本領(lǐng)域通用的。
特定AAV多肽的“功能同系物”或“功能等同物”包括由天然多肽序列衍生的分子，以及以與參考AAV分子相似的方式發(fā)揮作用以達(dá)到需要結(jié)果的重組產(chǎn)生或化學(xué)合成的多肽。因此，AAV Rep 68或Rep 78功能同系物包括那些多肽的衍生物和類似物—包含內(nèi)部或其氨基或羰基末端的單一或多個(gè)氫基酸添加、取代和/或缺失，只要保留完整的活性。
特定腺病毒核苷酸區(qū)域“功能同系物”或“功能等同物”包括由異源腺病毒血清型衍生的相似的區(qū)域、由另一個(gè)病毒或細(xì)胞來(lái)源的核苷酸區(qū)域、以及以與參考核苷酸區(qū)域相似方式發(fā)揮作用以達(dá)到預(yù)期結(jié)果的重組產(chǎn)生或化學(xué)合成的多核苷酸。因此，腺病毒VA RNA基因區(qū)域或腺病毒E2a基因區(qū)域的功能同系物包含所述基因區(qū)域的衍生物和類似物—包括在該區(qū)域內(nèi)單一的或多個(gè)核苷酸堿基的添加、取代和/或缺失，只要同系物保留以背景以上可檢測(cè)到的水平提供其固有的支持AAV病毒體產(chǎn)生的附屬功能。
“強(qiáng)力輸送系統(tǒng)”是指藥物的任何非手動(dòng)傳遞。本發(fā)明中，AAV的強(qiáng)力輸送系統(tǒng)(CED)的實(shí)例可以通過(guò)輸液泵或滲透泵來(lái)實(shí)現(xiàn)。下面有CED的更詳細(xì)的描述。
術(shù)語(yǔ)“中樞神經(jīng)系統(tǒng)”或“CNS”包括脊椎動(dòng)物的大腦和脊髓的所有細(xì)胞和組織。因此，該術(shù)語(yǔ)包括但不限于神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦脊髓液(CSF)、胞間隙、骨、軟骨等。CNS的各區(qū)域與不同行為和/或功能相關(guān)。例如，大腦的基底神經(jīng)節(jié)與運(yùn)動(dòng)功能，尤其是自主運(yùn)動(dòng)有關(guān)?；咨窠?jīng)節(jié)是由6對(duì)神經(jīng)核組成尾狀核、殼核、蒼白球、伏隔核、丘腦底部的核、以及黑質(zhì)。盡管被內(nèi)囊分開(kāi)，但尾狀核和殼核共有細(xì)胞結(jié)構(gòu)學(xué)、化學(xué)和生理學(xué)特性，通常是稱為紋狀體。在帕金森氏患者中退化的黑質(zhì)提供主要的多巴胺能的輸入基底神經(jīng)節(jié)。
本文可交換的使用術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”、“個(gè)體”或“患者”是指脊椎動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括，但不限于鼠科動(dòng)物、猿、人、畜牧動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物和寵物。
“有效量”是足夠起到有益的或需要作用的劑量。有效量可以一次或多次給藥、應(yīng)用或劑量。
B.常規(guī)方法本發(fā)明的基礎(chǔ)是意外發(fā)現(xiàn)AAV載體介導(dǎo)的GDNF基因傳遞以延遲方式逆轉(zhuǎn)多巴胺能(DA)神經(jīng)元的進(jìn)行性退化，同時(shí)保存功能性黑質(zhì)紋狀體的通路。如在實(shí)施例中特別描述，帕金森氏病的可接受的動(dòng)物模型接受表達(dá)FLAG肽標(biāo)記的GDNF(AAV-GDNFflag)或β-半乳糖苷酶(AAV-LacZ)的AAV載體注射到病變紋狀體中。FLAG免疫染色證明GDNFflag的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到黑質(zhì)(SN)。在AAV-GDNFflag組中，紋狀體中酪氨酸羥化酶(TH)-陽(yáng)性DA纖維的密度和SN中的TH-陽(yáng)性或霍亂毒素B亞單位(CTB，神經(jīng)元示蹤物)-標(biāo)記的神經(jīng)元的數(shù)量比AAV-LacZ組明顯的增加。與對(duì)照組相比，AAV-GDNFflag組紋狀體中多巴胺水平及其代謝物顯著高于對(duì)照組。AAV-GDNFflag注射后觀察到一致的解剖學(xué)的和生物化學(xué)的改變，顯著的行為恢復(fù)。這些數(shù)據(jù)出乎意料地顯示應(yīng)用以AAV為基礎(chǔ)的傳遞系統(tǒng)延遲傳遞的GDNF基因即使是在進(jìn)行性退化開(kāi)始以后也是有效的。
因此，本發(fā)明提供治療神經(jīng)退行性疾病和其它神經(jīng)損傷已經(jīng)發(fā)生后的神經(jīng)疾病的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，神經(jīng)損傷是由于帕金森氏病或損害或非正常功能的多巴胺能的神經(jīng)細(xì)胞。
因此，本發(fā)明可以用于將編碼GDNF多肽的多核苷酸傳遞給患有任何嚴(yán)重神經(jīng)退行性疾病的患者，包括但不限于，帕金森氏病(PD)、肌萎縮性(脊髓)側(cè)索硬化(ALS)、癲癇癥、阿爾茨海默氏病等。此外，本發(fā)明可以用于將GDNF傳遞給以下疾病患者由于暫時(shí)的或永久的血流向部分神經(jīng)系統(tǒng)的停止引起的神經(jīng)損傷，如中風(fēng)；或由于接觸神經(jīng)毒素引起的神經(jīng)損傷，如癌癥的化療劑紫杉醇、順式鉑氨或長(zhǎng)春花新堿和AIDS化療劑ddI或ddC，以及慢性代謝性疾病引起的神經(jīng)損傷，如糖尿病或腎功能疾病。
如上解釋，GDNF是可以由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞鑒別出或獲得的蛋白質(zhì)并具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的活性。更詳細(xì)地說(shuō)，GDNF是多巴胺能的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)，其特征部分在于它能增加黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的胚胎前體吸收多巴胺，此外它能促進(jìn)副交感神經(jīng)和交感神經(jīng)細(xì)胞的存活。
GDNF是大約39kD糖基化蛋白質(zhì)，天然形式以同型二聚體存在。GDNF最初翻譯成pre-pro-GDNF多肽、蛋白水解處理的信號(hào)序列，分子的“前”部分導(dǎo)致產(chǎn)生GDNF的成熟形式。人和嚙齒類動(dòng)物中，單一基因產(chǎn)生可變剪接的形式。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)6,362,319。兩種形式包含一致的信號(hào)肽序列和一致的蛋白水解處理序列。蛋白水解裂解產(chǎn)生相同成熟的134氨基酸殘基形式。因此，用于本發(fā)明AAV載體的GDNF多核苷酸可以編碼任一或兩種形式，可以編碼完整的pre-pro-分子、pre-分子、pro-分子、成熟的GDNF多肽、或這些形式如上定義的生物學(xué)活性變體。
已知許多GDNF多核苷酸和氨基酸序列。三種有代表性的哺乳動(dòng)物GDNF序列描述于本文的圖11、12和13。人GDNF核苷酸和氨基酸序列特別表示于圖11(SEQ ID NO1和2)。大鼠GDNF核苷酸和氨基酸序列表示于圖12(SEQ ID NO3和4)，小鼠GDNF核苷酸和氨基酸序列表示于圖13(SEQ ID NO6和7)。大鼠和人蛋白質(zhì)之間的同源度是大約93％，所有哺乳動(dòng)物GDNF具有相似的高度同源度。本領(lǐng)域已知另外的GDNF核苷酸和氨基酸序列。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)6,221,376和6,363,319，和Lin等，Science(1993)2601130-1132(大鼠和人的序列)，以及NCBI登錄號(hào)AY052832、AJ001896、AF053748、AF063586和L19063(人序列)；NCBI登錄號(hào)AF184922、AF497634、X92495、NM019139(大鼠序列)；NCBI登錄號(hào)AF516767(大熊貓序列)；NCBI登錄號(hào)XM122804、NM010275、D88351S1、D49921、U36449、U37459、U66195(小鼠序列)；NCBI登錄號(hào)AF469665(日本(NipponiaNippon)序列)；NCBI登錄號(hào)AF106678(Macaca mulatta序列)；以及NCBI登錄號(hào)NM131732和AF329853(斑馬魚(yú)(zebrafish)序列)。如上解釋，任何這些序列及其變體(如和這些序列基本同源的和功能相當(dāng)?shù)男蛄?可用于本發(fā)明方法。
AAV-傳遞GDNF多核苷酸的功效可以用任何本領(lǐng)域已知的多種上述疾病的動(dòng)物模型測(cè)試。例如，帕金森氏病的最廣泛應(yīng)用的動(dòng)物模型通常通過(guò)給予毒素來(lái)復(fù)制多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)退行性病變。單側(cè)注射6-羥基多巴胺(6-OHDA)到小鼠或大鼠的黑質(zhì)中導(dǎo)致同側(cè)紋狀體和黑質(zhì)致密部神經(jīng)元損失，對(duì)側(cè)半球很少改變。同樣地，脫氧麻黃堿誘導(dǎo)的神經(jīng)毒素導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元和5-羥色胺能神經(jīng)元的神經(jīng)退行性病變，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為它與人類疾病緊密相連。治療藥物的功效可以通過(guò)應(yīng)用脫水嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為的行為結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)。
另一個(gè)帕金森氏病模型是用神經(jīng)毒素N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)來(lái)構(gòu)建。MPTP給予哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠和猴。將MPTP給予猴的結(jié)果是不僅損失黑質(zhì)致密部和紋狀體中的多巴胺能神經(jīng)元和5-羥色胺能神經(jīng)元，還在行為上與人帕金森氏病患者表現(xiàn)相似，如運(yùn)動(dòng)不能和姿勢(shì)僵硬。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)6,362,319。
對(duì)比上述帕金森氏病的動(dòng)物模型，許多近交品系小鼠的獲得證明多巴胺能細(xì)胞數(shù)量是逐步下降的。例如，D2受體缺陷小鼠可以通過(guò)同源重組產(chǎn)生，其行為特征類似其患有帕金森氏病患者。Fitzgerald等，(1993)Brain Res.608247-258。第二個(gè)實(shí)施例是振動(dòng)(weaver)突變小鼠中腦的多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量隨時(shí)間逐步下降直到40％。Verina等，(1997)Exp.Brain Res.1135-12；Adelbrecht等，(1996)Mol.Brain Res.43291-300；Mitsumoto等，(1994)Science2651107-1110。
本實(shí)施例應(yīng)用了Sauer和Oertel部分PD模型(Sauer和Oertel，Neuroscience(1994)59401-415)。在這個(gè)模型中，層內(nèi)注射6-OHDA誘導(dǎo)開(kāi)始于損害后1-2周的DA神經(jīng)元進(jìn)行性逆行性變性并持續(xù)8-16周。這種正在進(jìn)行的DA神經(jīng)元的損耗與PD的病程更相似，并且作為用于治療的研究的動(dòng)物模型比完全模型更適合，其構(gòu)建破壞中前腦內(nèi)側(cè)束，因此引起DA神經(jīng)元的迅速退化。在下面詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)中，在載體注射前大鼠表現(xiàn)出一致的行為缺陷。脫水嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)的外觀通常是在紋狀體多巴胺量消耗≥90％才表現(xiàn)出來(lái)(Hudson等，Brain Res.(1993)626167-174)。但是，對(duì)PD患者和動(dòng)物模型的研究表明可能存在比多巴胺暗示的水平更多的存活的DA神經(jīng)元(Javoy-Agid等，Neuroscience(1990)38245-253；Fearnley和Lees，Brain(1991)1142283-2301；Schulzer等，Brain(1994)117509-516)。在本文使用的模型中，CTB-陽(yáng)性神經(jīng)元在SN損傷側(cè)的數(shù)量在損傷4周后是對(duì)側(cè)值的28.9％。這與以前用熒光金(FG)-逆行標(biāo)記證明的28.8％(損傷35天后)(Kozlowski等，Exp.Neurol.(2000)1661-15)或34％(損傷4周后)(Sauer和Oertel，Neuroscience(1994)59401-415)的損傷的SN中FG-陽(yáng)性細(xì)胞的研究是一致的。此外，大部分CTB-標(biāo)記的神經(jīng)元是TH-陽(yáng)性，表明黑質(zhì)紋狀體投射的部分在AAV載體注射時(shí)保持完整的。盡管不希望受特定理論的限制，還是認(rèn)為完整的黑質(zhì)紋狀體投射和DA神經(jīng)元的殘余部分可以作為GDNF基因傳遞后再生和功能恢復(fù)的基礎(chǔ)。
描述了其它神經(jīng)退行性疾病的動(dòng)物模型，其可用于在除了PD外的神經(jīng)退行性疾病的治療中評(píng)價(jià)AAV傳遞GDNF多核苷酸的治療功效。例如，Martin等，(1995)Brain Res.683172-178描述了癲癇癥的動(dòng)物模型，Matheson等，(1997)NeuroReport81739-1742和Oppenheim等，(1995)Nature373344-346描述了由物理性損傷導(dǎo)致的神經(jīng)退行性病變的模型，以及Sagot等，(1996)J.Neurosci.162335-2341描述了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化的動(dòng)物模型。
包含GDNF編碼序列的重組AAV病毒體可以應(yīng)用以下充分描述的本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)產(chǎn)生。野生型AAV和輔助病毒可以用于提供產(chǎn)生rAAV病毒體的必要的復(fù)制功能(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,139,941)?；蛘撸o助功能基因的質(zhì)粒結(jié)合一個(gè)眾所周知的輔助病毒感染可用作復(fù)制功能來(lái)源(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,622,856和美國(guó)專利號(hào)5,139,941)。同樣地，包含附屬功能基因的質(zhì)粒可以結(jié)合野生型AAV感染使用，以提供必要的復(fù)制功能。當(dāng)與rAAV病毒體聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，這三種方法都足以產(chǎn)生rAAV病毒體。本領(lǐng)域眾所周知的其它方法也可以由技術(shù)人員用來(lái)產(chǎn)生rAAV病毒體。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，三重轉(zhuǎn)染方法(詳細(xì)描述于美國(guó)專利號(hào)6,001,650)用于產(chǎn)生rAAV病毒體，因?yàn)樵摲椒ú恍枰獞?yīng)用傳染性輔助病毒，在沒(méi)有任何可檢測(cè)的輔助病毒存在下，啟動(dòng)rAAV病毒體產(chǎn)生。這是通過(guò)三種載體用于rAAV病毒體的產(chǎn)生來(lái)實(shí)現(xiàn)AAV輔助功能載體、附屬功能載體、以及rAAV表達(dá)載體。但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員意識(shí)到，這些載體編碼的核酸序列可以以不同結(jié)合的兩個(gè)或多個(gè)載體提供。
如本文解釋，AAV輔助功能載體編碼“AAV輔助功能”序列(即rep和cap)，其反式作用用于生產(chǎn)性AAV復(fù)制和包衣殼。優(yōu)選AAV輔助功能載體支持有效的AAV載體產(chǎn)生，不產(chǎn)生任何可檢測(cè)的wtAAV病毒體(即，AAV病毒體包括功能性rep和cap基因)。所述載體的一個(gè)實(shí)例pHLP19描述于美國(guó)專利號(hào)6,001,650。AAV輔助功能載體的rep和cap基因可以由任何已知AAV血清型衍生，如上述解釋。例如，AAV輔助功能載體可以具有由AAV-2衍生的rep基因和由AAV-6衍生的cap基因；本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以意識(shí)到可能有其它rep和cap基因組合，限定特征是有能力支持rAAV病毒體產(chǎn)生。
附屬功能載體編碼核苷酸序列用于AAV賴以復(fù)制的非AAV衍生病毒和/或細(xì)胞功能(即“附屬功能”)。附屬功能包括AAV復(fù)制需要的功能，包括但不限于與AAV基因轉(zhuǎn)錄活化有關(guān)的部分、時(shí)期專一的AAV mRNA剪接、AAV DNA復(fù)制、cap表達(dá)產(chǎn)物的合成、以及AAV衣殼的組裝。以病毒為基礎(chǔ)的附屬功能可由任何眾所周知的輔助病毒如腺病毒、皰疹病毒(除了單純皰疹病毒1型)和牛痘病毒衍生。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用附屬功能質(zhì)粒pLadeno5(關(guān)于pLadeno5詳述于美國(guó)專利號(hào)6,004,797)。該質(zhì)粒提供用于AAV載體產(chǎn)生的全套腺病毒附屬功能，但是缺少形成能復(fù)制的腺病毒必須的成分。
為了更進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面提供了關(guān)于重組AAV表達(dá)載體、AAV輔助和附屬功能、包含AAV病毒體的組合物、以及病毒體的傳遞的更詳細(xì)的討論。
重組AAV表達(dá)載體重組AAV(rAAV)表達(dá)載體應(yīng)用已知技術(shù)構(gòu)建，以便至少提供在轉(zhuǎn)錄方向上有效連接成分、控制元件(包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域)、目的GDNF多核苷酸以及轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。控制元件選擇在哺乳動(dòng)物肌肉細(xì)胞中有功能的。包含有效連接成分的最終構(gòu)建物以功能性AAV ITR序列為邊界(5’和3’)。
AAV ITR區(qū)域的核苷酸序列是已知的。參見(jiàn)例如，Kotin，R.M(1994)Human Gene Therapy5793-801；K.I.“細(xì)小病毒及其復(fù)制”Fundamental Virology，第2版，(B.N.Fields和D.M.Knipe編輯)(AAV-2序列)。用于本發(fā)明載體的AAV ITR不需要有野生型核苷酸序列，并且是可以改變的，例如，核苷酸的插入、缺失或取代。此外，AAV ITR可由任何多種AAV血清型衍生，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7和AAV-8等。此外，AAV表達(dá)載體側(cè)接選擇核苷酸序列的5’和3’ITR的不必一致或由相同的AAV血清型分離株衍生，只要它們功能是想要的，即允許由宿主細(xì)胞基因組或載體切除和挽救在目的序列，并且當(dāng)AAV Rep基因產(chǎn)物存在于細(xì)胞中時(shí)允許整合DNA分子進(jìn)入到受體細(xì)胞基因組。
用于AAV載體的合適的GDNF多核苷酸分子的大小是小于大約5kb。選定的多核苷酸序列與指導(dǎo)在患者體內(nèi)轉(zhuǎn)錄或其表達(dá)的控制元件有效連接。所述控制元件可以包括通常與選擇基因連接的控制序列。或者，可以使用異源控制序列?？捎玫漠愒纯刂菩蛄型ǔ０切┯刹溉閯?dòng)物或病毒基因的編碼序列衍生的。實(shí)例包括，但不限于，神經(jīng)元-特異性烯醇化酶啟動(dòng)子、GFAP啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、小鼠乳腺瘤病毒LTR啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(Ad MLP)；單純皰疹病毒(HSV)啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子如CMV立即早期啟動(dòng)子區(qū)域(CMVIE)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、合成啟動(dòng)子、雜合啟動(dòng)子等。此外，本文也使用由非病毒基因衍生的序列，如鼠科的金屬硫蛋白基因。所述啟動(dòng)子序列可由例如Stratagene市售獲得(San Diego，CA)。
具有以AAV ITR為邊界的目的GDNF多核苷酸分子的AAV表達(dá)載體可以通過(guò)直接插入選定的序列到從其切除AAV主要可讀框(ORF)處的AAV基因組中。AAV基因組的其它部分也可以缺失，只要保留足夠部分ITR以允許復(fù)制和包裝功能。所述構(gòu)建物可以應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,173,414和5,139,941；國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO92/01070(1992年1月23日公開(kāi))和WO93/03769(1993年3月4日公開(kāi))；Lebkowski等，(1988)Molec.Cell.Biol.83988-3996；Vincent等，(1990)Vaccines 90(Cold Spring HarborLaboratory Press)；Carter(1992)Current Opinion in Biotechnology3533-539；Muzyczka(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol15897-129；Kotin(1994)Human Gene Therapy5793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy1165-169；以及Zhou等，(1994)J.Exp.Med.1791867-1875。
或者，AAV ITR可以由病毒基因組或由包含它的AAV載體切出獲得，所述AAV載體包含相同的和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)將其與存在于另一個(gè)載體的選定核酸構(gòu)建物的5’和3’端融合，例如那些描述于Sambrook等，同上的技術(shù)。例如，可在20mM Tris-Cl pH7.5、10mMMgCl2、10mM DDT、33μg/ml BSA、10mM-50mM NaCl，和40μMATP、0.01-0.02(Weiss)單位T4 DNA連接酶在0℃(用于“粘性末端”連接)或1μM ATP、0.3-0.6(Weiss)單位T4 DNA連接酶在14℃(用于“平端”連接)下完成連接。分子間的“粘性末端”連接通常是在30-100μg/ml總DNA濃度(5-100nM總的終濃度)下進(jìn)行。包含ITR的AAV載體描述于例如，美國(guó)專利號(hào)5,139,941。其中特別介紹了幾種AAV載體，其可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(“ATCC”)中可獲得，保藏號(hào)為53222、53223、53224、53225和53226。
此外，嵌合基因可以合成產(chǎn)生，包括安排一個(gè)或多個(gè)選定的核酸序列5’和3’端的AAV ITR序列?？梢允褂貌溉閯?dòng)物肌肉細(xì)胞中用于表達(dá)嵌合基因序列的優(yōu)選密碼子。完全嵌合序列由通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊寡聚核苷酸裝配。參見(jiàn)例如，Edge(1981)Nature292756；Nambair等，(1984)Science2231299；Jay等，(1984)J.Biol.Chem(1984)2596311。
關(guān)于本發(fā)明的目的，用于從AAV表達(dá)載體產(chǎn)生rAAV病毒體的合適的宿主細(xì)胞包括微生物、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，它們可以是或已經(jīng)是用作異源DNA分子的受體并能夠在懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)。該術(shù)語(yǔ)包括已經(jīng)轉(zhuǎn)染的原始細(xì)胞的子代。因此，本文使用的“宿主細(xì)胞”通常是指經(jīng)外源DNA序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。穩(wěn)定的人細(xì)胞系的細(xì)胞293(通過(guò)例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號(hào)ATCC CRL1573容易獲得)是本發(fā)明的實(shí)踐中優(yōu)選的。詳細(xì)地說(shuō)，人細(xì)胞系293是用腺病毒5型DNA片段(Graham等，(1977)J.Gen.Virol.3659)轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系，并表達(dá)腺病毒E1a和E1b基因(Aiello等，(1979)Virology94460)。所述293細(xì)胞系是容易轉(zhuǎn)染的，并提供特別方便的產(chǎn)生rAAV病毒體的平臺(tái)。
AAV輔助功能包含上述AAV表達(dá)載體的宿主細(xì)胞必須有能力提供AAV輔助功能，為了復(fù)制和使側(cè)接AAV ITR的核苷酸序列包衣殼以產(chǎn)生rAAV病毒體。AAV輔助功能通常是可以表達(dá)產(chǎn)生AAV基因產(chǎn)物的AAV-衍生的編碼序列，AAV基因產(chǎn)物再反式作用用于生產(chǎn)性AAV復(fù)制。本文使用AAV輔助功能以補(bǔ)充AAV表達(dá)載體失去的必要的AAV功能。因此，AAV輔助功能包括一個(gè)或兩個(gè)AAV主要ORF，稱作rep和cap編碼區(qū)域，或其功能性同系物。
“AAV rep編碼區(qū)域”是指本領(lǐng)域公認(rèn)的編碼復(fù)制蛋白R(shí)ep78、Rep68、Rep52和Rep40的AAV基因組的區(qū)域。這些Rep表達(dá)產(chǎn)物擁有多種功能，包括識(shí)別、結(jié)合并切斷AAV DNA復(fù)制的起始點(diǎn)、DNA解旋酶活性和調(diào)節(jié)AAV(或其它異源的)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。Rep表達(dá)產(chǎn)物共同需要用于復(fù)制AAV基因組。AAV rep編碼區(qū)域的描述參見(jiàn)例如，Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.15897-129；和Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy5793-801。AAV rep編碼區(qū)域的合適同系物包括也是已知的介導(dǎo)AAV-2DNA復(fù)制的人皰疹病毒6(HHV-6)rep基因(Thomson等，(1994)Virology204304-311)。
“AAV cap編碼區(qū)域”是指本領(lǐng)域意公認(rèn)的編碼衣殼蛋白VP1、VP2和VP3或其功能性同系物的AAV基因組的區(qū)域。這些Cap表達(dá)產(chǎn)物提供用于包裝病毒基因組共同需要的包裝功能。關(guān)于AAV cap編碼區(qū)域的描述參見(jiàn)例如，Muzyczka，N.和Kotin，R.M.(同上)。
AAV輔助功能通過(guò)用AAV輔助構(gòu)建物在用AAV表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞之前或同時(shí)導(dǎo)入宿主細(xì)胞。因此，AAV輔助構(gòu)建物提供至少瞬時(shí)表達(dá)AAV rep和/或cap基因以補(bǔ)充失去的生產(chǎn)性AAV感染必須的AAV功能。AAV輔助構(gòu)建物缺少AAV ITR并且不能自我復(fù)制和包裝。
這些構(gòu)建物可以是質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、病毒或病毒粒體的形式。參見(jiàn)例如，Samulski等，(1989)J.Virol.633822-3828；以及McCarty等，(1991)J.Virol.652936-2945中，描述了許多AAV輔助構(gòu)建物，例如通常使用的編碼Rep和Cap表達(dá)產(chǎn)物的質(zhì)粒pAAV/Ad和pIM29+45。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,139,941中描述了編碼Rep和Cap表達(dá)產(chǎn)物的許多其它載體。
AAV表達(dá)載體和AAV輔助構(gòu)建物可以構(gòu)建成包含一個(gè)或多個(gè)可隨意選擇的標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)在合適的選擇性培養(yǎng)基中，使用包含可選擇標(biāo)記的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞賦予抗生素抗性或敏感性、賦予顏色或改變其抗原特性的基因。在本發(fā)明的實(shí)踐中可用的多種可選擇的標(biāo)記基因包括潮霉素B抗性基因(編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH))，通過(guò)賦予抗G418抗性可以篩選哺乳動(dòng)物細(xì)胞(可由Sigma獲得，St.Louis，Mo.)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道其它合適的標(biāo)記。
AAV附屬功能宿主細(xì)胞(或包裝細(xì)胞)必須也是具有提供非AAV-衍生功能或“附屬功能”的能力，生產(chǎn)rAAV病毒體。附屬功能是非AAV-衍生的病毒和/或細(xì)胞的功能，依靠該功能AAV可以復(fù)制。因此，附屬功能至少包括那些AAV復(fù)制需要的非AAV蛋白質(zhì)和RNA，包括那些涉及AAV基因轉(zhuǎn)錄的活化、時(shí)期專一的AAV mRNA剪接、AAV DNA復(fù)制、Cap表達(dá)產(chǎn)物的合成和AAV衣殼裝配。以病毒為基礎(chǔ)的附屬功能可以由任何已知的輔助病毒衍生的。
具體地說(shuō)，附屬功能可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法導(dǎo)入并繼而在宿主細(xì)胞中表達(dá)。通常，附屬功能通過(guò)用無(wú)關(guān)的輔助病毒感染宿主細(xì)胞來(lái)提供。已知許多合適的輔助病毒，包括腺病毒；皰疹病毒如單純皰疹病毒1和2型；和牛痘病毒。本文還使用非病毒附屬功能，例如通過(guò)應(yīng)用任何不同的已知因子使細(xì)胞同步提供的那些。參見(jiàn)例如，Buller等，(1981)J. Virol.40241-247；McPherson等，(1985)Virology147217-222；Schlehofer等，(1986)Virology152110-117。
或者，附屬功能可以應(yīng)用以上定義的附屬功能載體提供。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)6,004,797和國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO01/83797。提供附屬功能的核酸序列可以由天然來(lái)源獲得，如由腺病毒體的基因組獲得，或應(yīng)用本領(lǐng)域已知的重組或合成方法來(lái)構(gòu)建。如上解釋，證明附屬輔助功能不需要完全補(bǔ)充腺病毒基因。具體地說(shuō)，沒(méi)有DNA復(fù)制和晚期基因合成能力的腺病毒突變體證明允許AAV復(fù)制。Ito等，(1970)J.Gen.Virol.9243；Ishibashi等，(1971)Virology45317。同樣，在E2B和E3區(qū)域內(nèi)的突變證明支持AAV復(fù)制，表明E2B和E3區(qū)域可能不涉及提供附屬功能。Carter等，(1983)Virology126505。但是，E1區(qū)域缺陷或E4區(qū)域缺失的腺病毒不能支持AAV復(fù)制。因此，E1A和E4區(qū)域可能是AAV復(fù)制直接或間接需要的。Laughlin等，(1982)J.Virol.41868；Janik等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA781925；Carter等，(1983)Virology126505。其它特征性Ad突變體包括E1B(Laughlin等，(1982)，同上；Janik等，(1981)，同上；Ostrove等，(1980)Virology104502)；E2A(Handa等，(1975)J.Gen.Virol.29239；Strauss等，(1976)J.Virol.17140；Myers等，(1980)J.Virol.35665；Jay等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA782927；Myers等，(1981)J.Biol.Chem.256567)；E2B(Carter，腺病毒相關(guān)病毒輔助功能，I CRC Handbook ofParvoviruses(P.Tijssen編輯，1990))；E3(Carter等，(1983)，同上)；以及E4(Carter等，(1983)，同上；Carter(1995))。盡管通過(guò)具有E1B編碼區(qū)域突變的腺病毒提供的附屬功能的研究產(chǎn)生不一致的結(jié)果，但是Samulski等，(1988)J.Virol.62206-210最近報(bào)道E1B55k是AAV病毒體產(chǎn)生所需要的，而E1B19k不是。此外，國(guó)際公開(kāi)WO97/17458和Matshushita等，(1998)Gene Therapy5938-945描述了編碼不同Ad基因的附屬功能載體。
特別優(yōu)選的附屬功能載體包括腺病毒VARNA編碼區(qū)域、腺病毒E4 ORF6編碼區(qū)域、腺病毒E2A 72 kD編碼區(qū)域、腺病毒E1A編碼區(qū)域、缺少完整的E1B55k編碼區(qū)域的腺病毒E1B區(qū)域。所述載體描述于國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO01/83797。
作為用輔助病毒感染宿主細(xì)胞或用附屬功能載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的結(jié)果，附屬功能表達(dá)反式激活A(yù)AV輔助構(gòu)建物以產(chǎn)生AAV Rep或Cap蛋白。Rep表達(dá)產(chǎn)物從AAV表達(dá)載體中除去重組DNA(包括目的DNA)。Rep蛋白還用于復(fù)制AAV基因組。表達(dá)的Cap蛋白組裝成衣殼，并將重組AAV基因組包裝到所述衣殼中。因此，接著生產(chǎn)性AAV復(fù)制，并將DNA包裝成rAAV病毒體。
重組AAV復(fù)制后，rAAV病毒體可用多種常規(guī)的純化方法從宿主細(xì)胞中純化，例如，柱層析、CsCl梯度等。例如，可以使用多個(gè)柱純化步驟，如通過(guò)陰離子交換柱、親合柱和/或陽(yáng)離子交換柱純化。參見(jiàn)例如，國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO02/12455。此外，如果用感染來(lái)表達(dá)附屬功能，那么殘余的輔助病毒可用已知方法滅活。例如，腺病毒可通過(guò)加熱到大約60℃如20分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間來(lái)滅活。由于AAV是對(duì)熱非常穩(wěn)定的，而輔助腺病毒是熱不穩(wěn)定的，所以這樣的處理僅對(duì)輔助病毒有效的滅活。
所得的包括目的GDNF核苷酸序列的rAAV病毒體之后可以利用下述技術(shù)用于基因傳遞。
組合物組合物包括足夠的遺傳物質(zhì)以生產(chǎn)治療有效量的目的GDNF，即足夠減少或改善所述疾病的癥狀的量或足夠獲得想要的益處的量。該組合物也包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。所述賦形劑包括任何其本身對(duì)接受所述組合物的個(gè)體不產(chǎn)生有害抗體的藥用物質(zhì)，并且使用時(shí)可以沒(méi)有不適當(dāng)?shù)亩拘?。藥學(xué)上可接受的賦形劑包括，但不限于，山梨糖醇、任何不同TWEEN化合物、液體例如水、鹽水、甘油和乙醇。藥學(xué)上可接受的鹽可以包括，例如無(wú)機(jī)酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；有機(jī)酸鹽如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。此外，輔助物質(zhì)如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物等，可以存在于所述介質(zhì)中。藥學(xué)上可接受的賦形劑徹底的討論可在REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中獲得。
一個(gè)特別有用的制劑包括重組AAV病毒體和一個(gè)或多個(gè)二羥基的或多羥基的醇，以及任選去污劑如山梨聚糖酯。參見(jiàn)例如，國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO00/32233。
根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的是，可以經(jīng)驗(yàn)性確定必須加入的病毒載體的有效量。有代表性的劑量在下面詳述。在治療過(guò)程中可以一劑性、連續(xù)或間斷地給藥。測(cè)定最有效的平均值和給藥劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并隨病毒載體、治療的組合物、靶細(xì)胞、以及患者而改變?？梢杂弥委熱t(yī)師選擇的劑量水平和模式來(lái)完成單次或多次給藥。
可以理解通過(guò)傳遞重組病毒體表達(dá)一個(gè)以上轉(zhuǎn)基因。或者，如本文描述也可以將分別表達(dá)一個(gè)或多個(gè)不同轉(zhuǎn)基因的載體傳遞到CNS。此外，還企圖通過(guò)本發(fā)明的方法傳遞所述病毒載體聯(lián)合其它合適的組合物和療法。例如，可以通過(guò)共同給予表達(dá)GDNF到CNS(例如，到紋狀體尾狀核或殼核)中的重組AAV病毒體和其它藥物如AADC、多巴胺前體(例如，左旋多巴)、多巴胺合成抑制劑(例如，卡比多巴)、多巴胺代謝抑制劑(例如，MaOB抑制劑)、多巴胺興奮劑或拮抗劑可以先于或接著或同時(shí)與編碼GDNF的重組病毒體給藥來(lái)治療帕金森氏病。例如，編碼AADC的基因可以與編碼GDNF的基因一起給藥到CNS。同樣，左旋多巴和任選的卡比多巴可系統(tǒng)給藥。這樣，顯然通過(guò)能將左旋多巴轉(zhuǎn)換成多巴胺的AADC可恢復(fù)PD患者中自然失去的多巴胺。轉(zhuǎn)基因在誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下，為了調(diào)節(jié)所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可以給予某些系統(tǒng)傳遞的化合物如幕黎甾酮、松甾酮、四環(huán)素或aufin。
AAV病毒體的傳遞應(yīng)用體內(nèi)或體外(也稱活體外)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)可以將重組AAV病毒體導(dǎo)入CNS細(xì)胞以治療已經(jīng)存在的神經(jīng)元損傷。如果在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，想要的受體細(xì)胞可以從患者中取出，用rAAV病毒體轉(zhuǎn)導(dǎo)并再引入到患者?；蛘?，可以使用同系或異種細(xì)胞，那些細(xì)胞在患者中不會(huì)產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)。此外，神經(jīng)祖細(xì)胞可以在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)并隨后傳遞到CNS。
描述了合適的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞傳遞和導(dǎo)入到患者的方法。例如，通過(guò)混合重組AAV病毒體與細(xì)胞以在合適的介質(zhì)中轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞可在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)，包含目的DNA的那些細(xì)胞可以應(yīng)用常規(guī)技術(shù)如DNA印跡和/或PCR，或應(yīng)用可檢測(cè)的標(biāo)記來(lái)篩選。然后可以將轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞配制到藥用組合物中，如上所述，通過(guò)如下所述的多種技術(shù)將所述組合物以一個(gè)劑量或多劑量導(dǎo)入到患者中。
對(duì)于體內(nèi)傳遞，可將rAAV病毒體配制到藥用組合物中，并且可以直接以規(guī)定方式給予一個(gè)劑量或多個(gè)劑量。治療有效量可包括大約從106到1015的rAAV病毒體，更優(yōu)選107到1012，甚至更優(yōu)選大約108到1010的rAAV病毒體(或病毒基因組，也稱“vg”)，或在這些范圍內(nèi)的任何值。通常，可傳遞0.01-1ml的組合物，優(yōu)選0.01-約.5ml，優(yōu)選大約0.05-0.3ml，如0.08、0.09、0.1、0.2等，在這些范圍內(nèi)的任何整數(shù)的組合物都可傳遞。
體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的重組AAV病毒體或細(xì)胞可通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域已知的神經(jīng)外科學(xué)的技術(shù)如立體定位注射(參見(jiàn)例如，Stein等，J.Virol 733424-3429，1999；Davidson等，PNAS 973428-3432，2000；Davidson等，Nat.Genet.3219-223，1993；以及Alisky和Davidson，Hum.GeneTher.112315-2329)，用針、導(dǎo)管或相關(guān)的裝置注射直接傳遞到CNS或大腦，例如腦室區(qū)，以及紋狀體(例如，紋狀體的尾狀核或殼核)，脊髓和神經(jīng)肌肉連接，或小腦小葉。由于事實(shí)上立體定位坐標(biāo)不能正好對(duì)準(zhǔn)注射位點(diǎn)，所以小腦注射是復(fù)雜的；在小腦小葉的大小以及它們的完全三維方向上存在著動(dòng)物與動(dòng)物的變異。因此，霍亂毒素亞單位b(CTb)可以用于確定注射的精確位置，并揭示注射位點(diǎn)可轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)元的集合體?？勺⑸涞椒肿訉?，浦肯野細(xì)胞層，顆粒細(xì)胞層和小腦活樹(shù)的白質(zhì)，但是不延伸到深層小腦核。
給藥到CNS的一種模式使用強(qiáng)力輸送系統(tǒng)(CED)。這樣，可將重組病毒體傳遞到大腦大區(qū)域的許多細(xì)胞。此外，傳遞的載體有效地在CNS細(xì)胞(例如，神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)中表達(dá)轉(zhuǎn)基因。任何強(qiáng)力輸送裝置可適用于病毒載體的傳遞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該裝置是滲透泵或輸液泵。滲透泵和輸液泵可由多個(gè)供應(yīng)商處市售獲得，(例如Alzet公司、Hamilton公司、Alza，Inc.、Palo Alto、California)。病毒載體通常通過(guò)下面的CED裝置傳遞。將導(dǎo)管、套管或其它注射裝置插入到選定患者的CNS組織中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地測(cè)定適合作為靶的CNS的常規(guī)區(qū)域。例如，當(dāng)傳遞AAV-GDNF來(lái)治療PD時(shí)，紋狀體是大腦的靶合適區(qū)域。例如從ASI Instruments，Warren，MI可獲得立體定位圖和定位裝置。也可用由患者大腦的CT和/或MRI成像獲得的解剖圖來(lái)完成定位，以幫助操縱注射裝置到選定的靶位點(diǎn)。此外，因?yàn)楸疚拿枋龅姆椒梢詫?shí)施使得相關(guān)的較大大腦區(qū)域接受病毒載體，需要較少的灌輸套管。因此外科的并發(fā)癥與穿入次數(shù)有關(guān)，這個(gè)模式的傳遞系統(tǒng)比常規(guī)傳遞技術(shù)所見(jiàn)的副作用減少。關(guān)于CED傳遞的詳細(xì)描述參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)6,309,634。
在PD的情況下，傳遞給證明存在黑質(zhì)紋狀體多巴胺能(DA)去神經(jīng)的患者，例如中度到重度去神經(jīng)。通常當(dāng)患者表現(xiàn)出可見(jiàn)的PD癥狀時(shí)，就發(fā)生了中度到重度去神經(jīng)，至少大約60％-70％到超過(guò)90％的現(xiàn)有的神經(jīng)元已經(jīng)失去。因此，“中度”去神經(jīng)是指失去至少大約60％-70％的神經(jīng)元，而“重度”去神經(jīng)是指失去至少大約90％的神經(jīng)元。
一種神經(jīng)元失去的測(cè)量是通過(guò)CNS中多巴胺活性的水平。因此，“中度”去神經(jīng)是指一個(gè)或兩個(gè)紋狀體半球中失去至少大約60％-70％的多巴胺含量，而“重度”去神經(jīng)的反應(yīng)是一個(gè)或兩個(gè)紋狀體半球中至少失去大約90％。為了測(cè)量多巴胺量，給予患者標(biāo)記的示蹤物。標(biāo)記的探測(cè)說(shuō)明多巴胺的活性。標(biāo)記的示蹤物優(yōu)選可在整體動(dòng)物的大腦中體內(nèi)觀察到的，例如，正電子放射X光斷層(PET)掃描或其它CNS成像技術(shù)。用于選擇示蹤物的合適的標(biāo)記包括任何可由光譜、光化學(xué)、免疫化學(xué)、電、光學(xué)或化學(xué)方法檢測(cè)的組分。本發(fā)明有用的標(biāo)記包括放射標(biāo)記(例如，18F、3H、125I、35S、32p等)、酶、比色標(biāo)記、熒光染色等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記18F和DOPA用于多巴胺活性的量化。因此，在這個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)元丟失程度用[18F]-氟-DOPA作為示蹤物來(lái)測(cè)量。另一個(gè)多巴胺活性的測(cè)量應(yīng)用標(biāo)記示蹤物6-[18F]-氟-L-m-酪氨酸(18F-FMT)。FMT與利用多巴胺的細(xì)胞結(jié)合。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)6,309,634測(cè)量體內(nèi)多巴胺含量的方法。
神經(jīng)元的再生和由此疾病的治療也可以通過(guò)如上所述測(cè)量多巴胺的水平來(lái)監(jiān)測(cè)。本文使用的疾病的治療是指減輕或消除所述疾病的癥狀，以及神經(jīng)元的再生。因此，可以由比較治療前后的多巴胺的水平來(lái)衡量神經(jīng)元再生?；蛘?，用可以看到的疾病癥狀作為治療的測(cè)量指標(biāo)。
神經(jīng)組織分析和生化分析組織可由治療的患者獲得，并用常規(guī)的程序來(lái)處理評(píng)價(jià)神經(jīng)元退化、再生和分化。在本發(fā)明中，它可用于評(píng)價(jià)例如，多種紋狀體和黑質(zhì)(SN)的細(xì)胞，例如檢測(cè)紋狀體和SN的冠狀切片。隨著時(shí)間的過(guò)去進(jìn)行測(cè)量可以表明遠(yuǎn)離載體給藥位點(diǎn)的細(xì)胞改正的增加。
多巴胺及其代謝物HVA和DOPAC的水平可以應(yīng)用以前描述的高壓液相層析法(HPLC)來(lái)測(cè)定(Shen，Y.，Hum.Gene Ther.(2000)111509-1519)。尤其是如果載體編碼可分泌型GDNF，也可收集CSF并用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)水平或酶活性。
也可通過(guò)腹膜內(nèi)注射脫水嗎啡-HCl測(cè)試患者的周期性轉(zhuǎn)動(dòng)行為。
C.實(shí)驗(yàn)下面是實(shí)施本發(fā)明的具體實(shí)施方案的實(shí)施例。該實(shí)施例僅提供例證性說(shuō)明目的，并不是企圖以任何方式來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
努力確保使用的有關(guān)數(shù)據(jù)(例如，量、溫度等)的精確，但是當(dāng)然允許一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。
材料和方法動(dòng)物和外科準(zhǔn)備成年雄性Wistar大鼠(重200-250g)以12h光照/黑暗循環(huán)養(yǎng)在隨意使用食物和水的籠子內(nèi)。實(shí)驗(yàn)依照J(rèn)ichi Medical School的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行。按照Sauer和Oertel，Neuroscience(1994)59401-415中的描述來(lái)制備大鼠局部PD模型。簡(jiǎn)要地說(shuō)，大鼠接受在左側(cè)紋狀體中立體定位注射溶于4μl的抗壞血酸鹽(0.05％)中的20μg6-羥基多巴胺(6-OHDA；以游離堿計(jì)算；Sigma，St.Louis MO)，以下列坐標(biāo)前后(AP)+1.0mm，中間-側(cè)面(ML)3.0mm，背腹(DV)-4.5mm。相對(duì)于前囪和硬腦膜表面計(jì)算該立體定位坐標(biāo)。4周后，動(dòng)物進(jìn)行脫水嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)的測(cè)試(0.1mg/kg腹膜內(nèi)給藥)，并且在進(jìn)一步的研究中僅包括在60分鐘內(nèi)表現(xiàn)7次/分鐘或更多對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)的那些動(dòng)物。為了評(píng)定黑質(zhì)紋狀體的退化程度，死前3天將神經(jīng)示蹤物CTB(1％蒸餾水溶液，1μl；List Bidogical Laboratories，Campbell，CA，USA)注射到紋狀體兩側(cè)(n＝5，AP＝+1mm，ML＝3.0mm，DV＝-4.5mm)。這可進(jìn)行反向標(biāo)記6-OHDA損害后4周的SN中保持功能性投射紋狀體的DA神經(jīng)元亞群。PD動(dòng)物模型隨意接受AAV-GDNFflag(n＝32)，AAV-LacZ(n＝2)，或介質(zhì)(0.1M PBS；n＝8)在三個(gè)不同位點(diǎn)(每個(gè)位點(diǎn)2μl，1013載體基因拷貝/ml)注射到左側(cè)紋狀體，應(yīng)用下列坐標(biāo)(AP＝+1.5mm，+1.0mm和+0.5mm；ML＝2.6mm，3.0mm和3.2mm；DV＝-4.5mm)。注射速度設(shè)定在1μl/分，在緩慢抽出前將針多停留在該處7分鐘。為了評(píng)價(jià)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的GDNFflag蛋白，將一些大鼠(在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)AAV-GDNFflag注射組，n＝4；AAV-LacZ注射組，n＝2)分別在AAV注射后2、4和8周處死用于組織學(xué)。載體注射后20周，大鼠隨意分組并處死用于生化分析或免疫組織化學(xué)分析。在8只大鼠中，死前3天兩側(cè)注射CTB到紋狀體。
行為測(cè)試AAV載體注射后，每2周通過(guò)腹膜內(nèi)注射脫水嗎啡-HCl(0.1mg/kg)來(lái)測(cè)定大鼠旋轉(zhuǎn)行為。如以前所述(Shen，Y.，Hum.Gene Ther.(2000)111509-1519)，在觀察期≥60分鐘期間計(jì)算完全身體轉(zhuǎn)動(dòng)的總數(shù)。自發(fā)的肢體使用每4周應(yīng)用圓筒實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià)(Kirik等，J.Neurosci.(2000)204686-4700)。將大鼠置于一個(gè)足夠自由運(yùn)動(dòng)的大的透明玻璃筒內(nèi)。當(dāng)它們用后腿站起10次以后，期間至少一只爪子在圓筒壁上，計(jì)算兩只前爪接觸圓筒壁的數(shù)目至少20次。對(duì)側(cè)的前爪接觸的數(shù)據(jù)用總數(shù)的百分比表示。
生化分析在戊巴比妥鈉麻醉下殺死大鼠，立即將腦解剖并置于干冰上。用鋒利的不銹鋼管在紋狀體兩側(cè)打孔。濕的組織樣品稱重并貯藏于-80℃直到后面分析使用。用如以前所述(Shen，Y.，Hum.Gene Ther.(2000)111509-1519)的高壓液相層析(HPLC)來(lái)評(píng)價(jià)多巴胺及其代謝物HVA和DOPAC的水平。
免疫組織化學(xué)在深度麻醉下用PBS灌輸大鼠接著用冰冷的4％PEA。解剖大腦，然后在4％PEA中后-固定4小時(shí)。紋狀體和SN的冠狀切片(30μm)在0.3％H2O2的PBS中處理30分鐘，并用3％胎牛血清(FBS)的PBS/0.1％Triton X-100封閉1小時(shí)。然后將切片用TH(1∶1000，小鼠抗-TH單克隆抗體；Chemicon，Temecula，CA，USA)，CTB(1∶10000，山羊抗CTB抗血清；List Biologic，Campbell，CA，USA)或FLAG(1∶1000，抗-FLAGM2抗體，Sigma，St.Louis，MO)的第一抗體在4℃孵育過(guò)夜。接著用生物素?；牡诙贵w(抗第一抗體)在室溫下孵育1小時(shí)(1∶400，SantaCruz，CA)。用抗生物素蛋白-生物素?；倪^(guò)氧(化)物酶復(fù)合物方法(Vectastain ABC試劑盒；Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)以3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為色素原來(lái)顯色切片。
對(duì)于FLAG/TH雙重免疫熒光染色，切片繼續(xù)在包含5％正常山羊血清的PBS封閉溶液中在室溫下孵育1小時(shí)，單克隆小鼠抗-FLAG抗體(1∶250，Sigma)和多克隆兔抗-TH抗體(1∶500)在4℃過(guò)夜，羅丹明-偶聯(lián)的山羊抗-小鼠IgG(1∶200；Santa Cruz，Santa Cruz，CA)和FITC-偶聯(lián)的山羊抗-兔IgG(1∶200；Santa Cruz，Santa Cruz，CA)在室溫下2小時(shí)。檢測(cè)切片并在聚焦掃描激光顯微鏡下觀察(TCS NT；Leica，Heidelberg，Germany)。對(duì)于CTB/TH雙重免疫熒光染色，使用抗-CTB(1∶5000，抗CTB山羊抗血清)和小鼠抗-TH(1∶500)抗體。
用于TH-陽(yáng)性神經(jīng)元和CTB-標(biāo)記神經(jīng)元的定量分析，計(jì)算300-μm間隔貫穿SN兩側(cè)的切片。用NIH Image 1.59軟件來(lái)測(cè)量在每隔300μm貫穿紋狀體的嘴尾切片上TH-IR纖維的光密度(Kozlowski等，Exp.Neurol.(2000)1661-15)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表示為平均值±s.e.m.。應(yīng)用重復(fù)-測(cè)量方差分析(ANOVA)接著Tukey真實(shí)差異顯著性(HSD)測(cè)驗(yàn)(StatView 5.0軟件)進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
實(shí)施例1重組AAV載體的構(gòu)建表達(dá)FLAG-標(biāo)記的GDNF(AAV-GDNFflag，圖1a)或β-半乳糖苷酶(AAV-LacZ，圖1b)的重組AAV載體如下構(gòu)建。6-OHDA病變或注射脫水嗎啡引起內(nèi)源表達(dá)GDNF(Ohta等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)27218-22；Zhou等，Neuroreport(2000)113289-3293)，區(qū)別轉(zhuǎn)基因衍生的GDNF和內(nèi)源GDNF對(duì)評(píng)價(jià)基因傳遞的作用是必要的。因此，構(gòu)建了表達(dá)FLAG-標(biāo)記的GDNF的AAV載體。
AAV載體質(zhì)粒pAAV-GDNFflag是由以前描述的pAAV-GDNF質(zhì)粒衍生的(Fan等，Neurosci.Lett.(1998)24861-64)。這個(gè)質(zhì)粒包含F(xiàn)LAG序列(DYKDDDDK(SEQ ID NO5))羧基末端標(biāo)記的小鼠GDNFcDNA(Matsushita等，Gene(1997)203149-157)，在人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子下，在AAV-2基因組的反向末端重復(fù)區(qū)(ITR)之間的人促生長(zhǎng)素的第一個(gè)內(nèi)含子和猿病毒40(SV40)多腺苷酸化信號(hào)序列。
以前描述了(Fan等，Neurosci.Lett.(1998)24861-64)AAV載體質(zhì)粒pAAV-LacZ，輔助質(zhì)粒pHLP19和pladenol。Pladeno5描述于美國(guó)專利號(hào)6,004,797。應(yīng)用磷酸鈣共沉淀法將載體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染接近融合的人293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，收獲細(xì)胞并通過(guò)三次冷凍和解凍循環(huán)使細(xì)胞溶解。用如以前所述的(Masushita等，GeneTherapy(1998)5938-945)兩次CsCl順序連續(xù)梯度來(lái)提純AAV載體(AAV-GDNFflag和AAV-LacZ)。通過(guò)定量DNA斑點(diǎn)雜交分析來(lái)評(píng)價(jià)，AAV-GDNFflag的最終粒子滴度是1.6×1013載體基因組拷貝數(shù)/ml，AAV-LacZ的最終粒子滴度是2.1×1013載體基因組拷貝數(shù)/ml。
實(shí)施例2
體外表達(dá)AAV-GDNFflag為了檢測(cè)體外表達(dá)的GDNFflag融合蛋白，將293細(xì)胞用AAV-GDNFflag或AAV-LacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)(5000載體基因組拷貝數(shù)/細(xì)胞)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后36小時(shí)，通過(guò)15％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞溶解產(chǎn)物并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore，Bedford，MA，USA)。剩余的蛋白質(zhì)-結(jié)合位點(diǎn)用5％脫脂奶粉TBS在室溫下封閉1小時(shí)。將膜用小鼠抗-FLAG M2抗體(1∶1000，Sigma，St Louis，MO)或兔抗-GDNF抗體(1∶2000，SantaCruz，Santa Cruz，CA)在4℃孵育過(guò)夜，接著用綴合辣根過(guò)氧化物酶的第二抗-小鼠或抗-兔抗體(1∶2500，Amersham，Arliongton Heights，IL)在室溫下孵育2小時(shí)。用ECL系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的信號(hào)(Amersham)。
在蛋白質(zhì)印跡分析上，通過(guò)抗-GDNF和抗-FLAG抗體在AAV-GDNFflag-轉(zhuǎn)導(dǎo)的293細(xì)胞的溶解產(chǎn)物中檢測(cè)GDNFflag融合蛋白。在AAV-LacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物中沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)(圖2)。
為了鑒定AAV-載體衍生的GDNFflag融合蛋白的生物活性，制備了大鼠胎兒DA神經(jīng)元的原代培養(yǎng)物。簡(jiǎn)單地說(shuō)，從14天Wistar大鼠胚胎中解剖出腹側(cè)中腦，切碎并用0.25％胰酶的PBS孵育15分鐘。將分離的細(xì)胞以初始密度為105個(gè)細(xì)胞/皿鋪到35mm多聚-L-賴氨酸預(yù)包被的平皿中，并用補(bǔ)充B27(Gibco BRL)、100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、25mM KCl和2mM谷氨酰胺的神經(jīng)基本-SFM培養(yǎng)基(Gibco BRL)在37℃孵育。在AAV載體處理平皿中，用AAV-GDNFflag或AAV-LacZ(5000載體基因組拷貝數(shù)/細(xì)胞)感染培養(yǎng)物。陽(yáng)性對(duì)照皿或陰性對(duì)照皿中，向培養(yǎng)物加入終濃度為10ng/ml的重組人GDNF(rhGDNF，Santa Cruz)或BSA。培養(yǎng)基每隔3天更換一半新鮮的培養(yǎng)基，rhGDNF或BSA保持相同濃度。9天后，用4％多聚甲醛(PFA)固定細(xì)胞30分鐘，并進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色以檢測(cè)GDNFflag和TH的表達(dá)。如描述(Sawada等，J.Neurochem.(2000)741175-1184)計(jì)算TH-IR細(xì)胞存在的數(shù)目。
酪氨酸羥化酶(TH)免疫染色顯示在AAV-GDNFflag轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物中存活的TH-免疫反應(yīng)性(TH-IR)的細(xì)胞比在AAV-LacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物中多兩倍(圖3)。這些結(jié)果證實(shí)AAV-GDNFflag能推動(dòng)生物活性GDNFflag融合蛋白體外產(chǎn)生，F(xiàn)LAG肽的添加不能改變GDNF對(duì)DA神經(jīng)元的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性效應(yīng)，允許通過(guò)抗-FLAG抗體鑒定外源表達(dá)GDNFflag融合蛋白。
實(shí)施例3在紋狀體中表達(dá)GDNFflag并逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到SN用抗-FLAG抗體在AAV-GDNFflag注射2、4、8和20周后檢測(cè)紋狀體中GDNFflag轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在貫穿紋狀體的注射位點(diǎn)周圍檢測(cè)FLAG免疫反應(yīng)性(FLAG-IR)細(xì)胞。這些細(xì)胞顯示出典型形態(tài)學(xué)的中等刺狀神經(jīng)元(圖4a和4b)。此外，在紋狀體內(nèi)注射AAV-GDNFflag 4周和8周后在同側(cè)SN的致密部用抗-TH和抗-FLAG抗體雙重免疫熒光染色檢測(cè)雙重陽(yáng)性細(xì)胞(圖4c-4e)。注射AAV載體8周后，13.1±2.4％(n＝4)的TH-IR細(xì)胞重疊分散在SN的FLAG-IR細(xì)胞，表明有些轉(zhuǎn)基因GDNFflag得以進(jìn)入到DA神經(jīng)元。在紋狀體或SN的對(duì)側(cè)沒(méi)有觀察到FLAG-IR細(xì)胞，在AAV-LacZ或載體注射的大鼠中的這些區(qū)域也沒(méi)有。在AAV-LacZ注射的大鼠中，盡管在注射后2-20周在紋狀體中檢測(cè)到X-gal陽(yáng)性細(xì)胞，但是沒(méi)能在SN中發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶信號(hào)。
這些結(jié)果表明AAV-GDNFflag能夠促進(jìn)GDNFflag融合蛋白在紋狀體中的表達(dá)，并且GDNFflag融合蛋白而不是AAV載體本身能從紋狀體末端逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到SN中的DA神經(jīng)元。
實(shí)施例4恢復(fù)紋狀體中DA神經(jīng)支配為了測(cè)定AAV-GDNFflag能否恢復(fù)病變紋狀體中DA神經(jīng)元支配，注射20周后在300-μm間隔貫穿紋狀體切片上檢查T(mén)H-IR纖維末端的程度。在AAV-LacZ注射的大鼠中，病變紋狀體中TH-IR纖維的密度顯著減少至僅僅13.5±3.0％的完整側(cè)(圖5a和5c)。相反，注射AAV-GDNFflag的大鼠中，TH-IR纖維的密度顯著增加，達(dá)到接近48.7±7.3％的完整側(cè)(圖5b、5d和5e)。保持的TH-IR纖維分布在注射位點(diǎn)周圍，說(shuō)明TH-IR纖維的神經(jīng)支配通過(guò)GDNFflag在紋狀體中表達(dá)而恢復(fù)。
CTB反向-標(biāo)記在評(píng)價(jià)黑質(zhì)紋狀體的功能上比單獨(dú)用抗-TH免疫染色更精確，因?yàn)橹挥蠧TB標(biāo)記的SN神經(jīng)元保持功能性黑質(zhì)紋狀體投射，而抗-TH免疫染色只證明在神經(jīng)元體中存在TH酶。在AAV-GDNFflag組，比SN中存在更多的CTB標(biāo)記的DA神經(jīng)元，說(shuō)明在紋狀體中表達(dá)的GDNFflag能夠恢復(fù)DA神經(jīng)元并促進(jìn)紋狀體的功能性投射。此外，紋狀體中高水平的多巴胺及其代謝物支持通過(guò)紋狀體內(nèi)注射AAV-GDNFflag成功的恢復(fù)黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)，說(shuō)明在黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中長(zhǎng)期保持多巴胺的活性。
實(shí)施例5黑質(zhì)紋狀體投射的保持霍亂毒素亞單位B(CTB，神經(jīng)元示蹤物)(Leman等，Brain Res.Brain Res.Protoc.(2000)5298-304)注射到紋狀體的兩側(cè)以評(píng)價(jià)剩余的黑質(zhì)紋狀體通路的程度。死前3天注射同樣坐標(biāo)的6-OHDA，逆向標(biāo)記DA神經(jīng)元亞群保持紋狀體投射。在AAV載體處理的時(shí)間點(diǎn)，即6-OHDA注射后4周，受損SN中CTB-陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目是28.9±3.7％的完整的對(duì)側(cè)(n＝5)。用抗-CTB和抗-TH抗體雙重免疫熒光染色說(shuō)明SN中大部分CTB-陽(yáng)性神經(jīng)元也是TH-陽(yáng)性(圖6)。受損側(cè)上TH-IR神經(jīng)元的百分比是34.9±2.6％(n＝4)的完整側(cè)。這些結(jié)果說(shuō)明一些部分黑質(zhì)紋狀體連接在受損后4周仍然保持。AAV載體注射后20周，在注射AAV-LacZ的大鼠中觀察到廣泛地失去TH-IR細(xì)胞(19.5±2.0％的完整側(cè))和CTB-陽(yáng)性細(xì)胞(17.9±1.6％的完整側(cè))。相反，注射AAV-GDNFflag導(dǎo)致TH-IR神經(jīng)元和CTB-陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加，分別達(dá)到57.3±6.2％和50.8±8.5％的對(duì)側(cè)(圖7和8，P＜0.01)。
這些結(jié)果證明在損傷后4周紋狀體內(nèi)注射AAV-GDNFflag使SN中DA神經(jīng)元恢復(fù)存活并促進(jìn)保持黑質(zhì)紋狀體投射。
實(shí)施例6紋狀體內(nèi)注射AAV-GDNFflag后行為的恢復(fù)6-OHDA給藥后4周，三組所有大鼠(AAV-GDNFflag，n＝20；AAV-lacZ，n＝16；載體；n＝8)證明在脫水嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和圓筒實(shí)驗(yàn)中相同的損害程度，說(shuō)明DA損耗的水平相當(dāng)。
在接受AAV-GDNFflag的大鼠中觀察到脫水嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)在載體注射后4周開(kāi)始減少(圖9a)。該減少是逐漸進(jìn)行并持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)(20周)。相反，AAV-LacZ或載體注射組的大鼠在相同時(shí)期表現(xiàn)出相當(dāng)穩(wěn)定的旋轉(zhuǎn)速度。
圓筒實(shí)驗(yàn)用于測(cè)定受損大鼠的自發(fā)的前肢使用(圖9b)。AAV處理前，6-OHDA損傷后每組大鼠表現(xiàn)出相同顯著的偏向同側(cè)，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)根據(jù)減少對(duì)側(cè)肢的使用頻率(23％-25％的總接觸數(shù))。從注射后4周觀察到接受AAV-GDNFflag的大鼠顯著的改進(jìn)，逐漸地進(jìn)步并在20周達(dá)到接近正常的水平(47％的總接觸數(shù))。相反，在接受AAV-LacZ或載體的大鼠在20周內(nèi)保持相同水平的對(duì)側(cè)肢使用。AAV-GDNFflag注射的大鼠與AAV-LacZ或載體注射的大鼠在脫水嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和圓筒實(shí)驗(yàn)上的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示出顯著的差異(P＜0.01)。
實(shí)施例7病變紋狀體的多巴胺含量的保存為了檢測(cè)AAV-GDNFflag注射后行為的恢復(fù)與黑質(zhì)紋狀體多巴胺產(chǎn)生是否相關(guān)，在注射后20周測(cè)定紋狀體中多巴胺及其代謝物的水平，高香草酸(HVA)和3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)。在AAV-GDNFflag注射組(n＝8)中，紋狀體受損側(cè)的多巴胺水平是50.9±7.7％的對(duì)側(cè)完整側(cè)，而在AAV-LacZ注射組(n＝8)保持在11.5±4.8％的對(duì)側(cè)(圖10，P＜0.01)。此外，在AAV-GDNFflag注射組中HVA和DOPAC的水平更高。在兩組之間的紋狀體完整側(cè)上沒(méi)有觀察到多巴胺或其代謝物的水平有顯著差異。
上述實(shí)施例表明AAV載體介導(dǎo)的GDNF基因傳遞到可接受PD動(dòng)物模型的紋狀體中保護(hù)更晚期退化的SN神經(jīng)元，并保持它們與紋狀體的連接。
在本研究中，從注射后4-8周檢測(cè)與AAV-GDNFflag注射側(cè)同側(cè)的SN細(xì)胞中的GDNFflag。應(yīng)用抗-FLAG和抗-TH抗體雙重免疫熒光染色確定這些SN細(xì)胞是DA細(xì)胞。AAV載體處理后8周在致密部的廣泛區(qū)域觀察到FLAG-IR細(xì)胞，盡管FLAG-IR細(xì)胞的百分比似乎是低的(13.1％TH-IR細(xì)胞)。GDNF表現(xiàn)為對(duì)DA神經(jīng)元在皮摩爾范圍內(nèi)非常有效的作用，所以小量的GDNFflag蛋白質(zhì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)并且在死的時(shí)候通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)不到，可以保護(hù)對(duì)毒素-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的黑質(zhì)DA神經(jīng)元。相反，紋狀體中注射AAV-LacZ的大鼠證明在SN中沒(méi)有β-半乳糖苷酶信號(hào)。與以前研究一致(Chamberlin等，Brain Res.(1998)793169-175)，AAV載體本身在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不是逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的，但是GDNFflag蛋白是從紋狀體到在SN中DA神經(jīng)元逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的。GDNFflag蛋白在紋狀體中的顯著表達(dá)也在注射后20周檢測(cè)到。GDNFflag產(chǎn)生的持續(xù)提供了在單獨(dú)AAV載體注射后黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的長(zhǎng)期恢復(fù)。AAV-GDNFflag注射后病變紋狀體中保持TH-IR的密度。
因此，紋狀體中AAV-介導(dǎo)的GDNF基因傳遞作為PD和其它CNS退化疾病的神經(jīng)保護(hù)的基因治療是有效的。
因此，提供治療神經(jīng)退化疾病的新方法。盡管已經(jīng)在某種程度上詳細(xì)的描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是應(yīng)該理解可以進(jìn)行不背離本發(fā)明權(quán)利要求定義的精神和范圍的明顯改變。
工業(yè)適用性本發(fā)明公開(kāi)了治療已經(jīng)存在神經(jīng)元損傷的患者的組合物和方法。所述組合物和方法使用以腺伴隨病毒為基礎(chǔ)的基因傳遞系統(tǒng)來(lái)傳遞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)到患有神經(jīng)退行性疾病如帕金森氏病患者。
序列表<110>0ZAWA，KeiyaMURAMATSU，Shin-ichi<120>用于治療神經(jīng)變性疾病的組合物和方法<130>0800-0028.40<140>未給定<141>2002-08-28<150>60/315,838<151>2001-08-29<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>633<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(633)<220>
<223>人工序列的描述人GDNF<400>1atg aag tta tgg gat gtc gtg gct gtc tgc ctg gtg ctg ctc cac acc 48Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr1 5 10 15gcg tcc gcc ttc ccg ctg ccc gcc ggt aag agg cct ccc gag gcg ccc 96
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gca tgt tgc aga ccc atc gcc ttt gat gat gac ctg tcg ttt tta gat 576Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp180 185 190gat aac ctg gtt tac cat att cta aga aag cat tcc gct aaa agg tgt 624Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys195 200 205gga tgt atc 633Gly Cys Ile210<210>2<211>211<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人GDNF<400>2Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr1 5 10 15Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala Pro20 25 30Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu Ser35 40 45Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val50 55 60Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp65 70 75 80
Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala85 90 95Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg100 105110Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr115 120 125Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr130 135 140Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu145 150 155 160Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln165 170 175Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp180 185 190Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys195 200 205Gly Cys Ile210<210>3<211>633<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(633)<220>
<223>人工序列的描述大鼠GDNF<400>3atg aag tta tgg gat gtc gtg gct gtc tgc ctg gtg ttg ctc cac acc 48Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr1 5 10 15gcg tct gcc ttc ccg ctg ccc gcc ggt aag agg ctt ctc gaa gcg ccc 96Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Leu Leu Glu Ala Pro20 25 30gcc gaa gac cac tcc ctc ggc cac cgc cgc gtg ccc ttc gcg ctg acc 144Ala Glu Asp His Ser Leu Gly His Arg Arg Val Pro Phe Ala Leu Thr35 40 45agt gac tcc aat atg ccc gaa gat tat cct gac cag ttt gat gac gtc 192Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val50 55 60atg gat ttt att caa gcc acc atc aaa aga ctg aaa agg tca cca gat 240Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg Ser Pro Asp65 70 75 80aaa caa gcg gcg gca ctt cct cga aga gag agg aac cgg caa gct gca 288Lys Gln Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala85 90 95gct gcc agc cca gag aat tcc aga ggg aaa ggt cgc aga ggc cag agg 336Ala Ala Scr Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg100 105 110ggc aaa aat cgg ggg tgc gtc tta act gca ata cac tta aat gtc act384Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr115 120 125gac ttg ggt ttg ggc tac gaa acc aag gag gaa ctg atc ttt cga tat 432Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr130 135 140
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<223>人工序列的描述大鼠GDNF<400>4Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His Thr1 5 10 15Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Leu Leu Glu Ala Pro20 25 30Ala Glu Asp His Ser Leu Gly His Arg Arg Val Pro Phe Ala Leu Thr
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權(quán)利要求
1.一種組合物在治療已經(jīng)存在神經(jīng)元損傷的哺乳動(dòng)物患者中的應(yīng)用，該應(yīng)用將所述組合物給予到所述患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其中所述組合物包含重組腺伴隨病毒(AAV)病毒體，其中所述病毒體包含編碼神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)多肽的多核苷酸，該多核苷酸與包括啟動(dòng)子的表達(dá)控制元件有效連接。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述患者是人。
3.權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中所述已經(jīng)存在的神經(jīng)元損傷包括中度到重度黑質(zhì)紋狀體多巴胺能(DA)去神經(jīng)。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述多核苷酸還包括位于5’位而且符合編碼GDNF多肽的序列的讀框的分泌序列。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述多核苷酸編碼人GDNF。
6.權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中所述多核苷酸編碼人pre-pro-GDNF。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述組合物給到所述患者的紋狀體中。
8.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述啟動(dòng)子是病毒啟動(dòng)子。
9.權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中所述啟動(dòng)子是MLP、CMV或RSV LTR啟動(dòng)子。
10.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的應(yīng)用，其中所述重組AAV病毒體給藥到所述患者的紋狀體中。
11.權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述重組AAV病毒體利用強(qiáng)力輸送系統(tǒng)(CED)給藥到紋狀體。
12.權(quán)利要求11的應(yīng)用，其中所述給藥用滲透泵完成。
13.權(quán)利要求11的應(yīng)用，其中所述給藥用輸液泵完成。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于治療已經(jīng)存在神經(jīng)元損傷的患者的組合物和方法。所述組合物和方法使用以腺伴隨病毒(AAV)為基礎(chǔ)的基因傳遞系統(tǒng)來(lái)傳遞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)到患有神經(jīng)退行性病癥(例如帕金森氏病)的患者。
文檔編號(hào)C07K14/475GK1575340SQ0282132
公開(kāi)日2005年2月2日 申請(qǐng)日期2002年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月29日
發(fā)明者小澤敬也, 村松慎一, 池口邦彥, 中野今治 申請(qǐng)人:田邊制藥株式會(huì)社