專利名稱：水稻轉(zhuǎn)座子基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻(Oryza sativa)非自主性轉(zhuǎn)座子(nonautonomoustransposon)基因，自主性轉(zhuǎn)座子(autonomous transposon)基因，以及轉(zhuǎn)座酶基因，同時(shí)還涉及使轉(zhuǎn)座子基因發(fā)生轉(zhuǎn)座的方法以及通過轉(zhuǎn)座而轉(zhuǎn)化的植物。
背景技術(shù)：
基因破壞(gene disruption)一直作為分析水稻(Oryza sativa)基因組的工具。為了達(dá)到破壞水稻基因組的目的，已經(jīng)使用的方法有通過將其中以轉(zhuǎn)座酶基因(催化轉(zhuǎn)座的酶)作為活化因子進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的水稻株與其中導(dǎo)入分離因子的水稻株進(jìn)行配對，從而活化分離因子的方法；使用T-DNA的方法；以及使用逆轉(zhuǎn)座子的方法等。但是，對水稻自發(fā)突變的分析顯示一直以來并沒有被用于發(fā)現(xiàn)活化轉(zhuǎn)座子(細(xì)胞工程增補(bǔ)卷，植物細(xì)胞工程第14期，“植物基因組研究指南”2000年2月，Shujun出版社)。
在另一方面，全基因組測序計(jì)劃正在確定包括水稻在內(nèi)的許多植物的核苷酸序列，其結(jié)果被不斷地補(bǔ)充入數(shù)據(jù)庫。同時(shí)，動植物的轉(zhuǎn)座子基因、可動基因在某種程度上具有獨(dú)特的核苷酸序列，其信息使得針對轉(zhuǎn)座子開展的更為廣泛的研究成為可能。但是，到目前為止尚有許多解釋未得到證實(shí)。此外，在由γ-射線誘導(dǎo)的水稻突變體中發(fā)現(xiàn)了一推定的轉(zhuǎn)座子基因的核苷酸序列(Tetsuya Nakazaki等，“轉(zhuǎn)座子樣序列多態(tài)性插入可突變小顆?；?slender-granule gene)slg位點(diǎn)”，日本育種協(xié)會第100屆研討會8月會議，2001年10月)。
本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，水稻基因組核苷酸序列的轉(zhuǎn)座子基因有一特征性反向重復(fù)序列。通過對可能的轉(zhuǎn)座子核苷酸序列使用不同的實(shí)驗(yàn)方法，本發(fā)明人證實(shí)該核苷酸序列為一轉(zhuǎn)座子基因(非自主性轉(zhuǎn)座子)。
此外，本發(fā)明人還在非自主性轉(zhuǎn)座子基因的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了自主性轉(zhuǎn)座子基因。同時(shí)本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座酶基因，所述的基因能使所述的轉(zhuǎn)座子基因發(fā)生轉(zhuǎn)座。
解決問題的方法本發(fā)明人由1號染色體開始，對水稻基因組序列中的長末端重復(fù)序列(LTR)進(jìn)行了檢測，并將其逐一登記入數(shù)據(jù)庫。本發(fā)明人注意到在登記號為AP002843的克隆中有一LTR(見表1)，對該序列進(jìn)行深入研究后發(fā)現(xiàn)在臨近LTR的下游有兩個(gè)轉(zhuǎn)座子基因特征性反向重復(fù)序列，分別位于第144459～144473位堿基及第144874～144888位堿基(見圖1，SEQID NO6)。本發(fā)明人證實(shí)，位于兩個(gè)反向重復(fù)序列中間的核苷酸序列(SEQ ID NO1)為一非自主性轉(zhuǎn)座子基因，通過例如花藥培養(yǎng)的常用的人工處理即可使其發(fā)生顯著轉(zhuǎn)座，在下文中將以實(shí)施例對此進(jìn)行說明。
表1AP002843水稻基因組DNA，1號染色體，PA登記號 AP002843NCBI SRS 基因組-網(wǎng)生物體 水稻NCBI SRS位點(diǎn) AP002843148762 bp DNA PLN 2001年1月26日特征 位置/限定詞來源 1...148752/染色體＝“1”
/克?。健癙0407B12”/栽培品種＝“Nipponbare”/生物體＝“水稻”/測序分子＝“DNA”LTR 139482...139690/注釋＝“5’端LTR”CDS 139739...144052/基因＝“P0407B12.28”/注釋＝“可能由于CDS讀碼框錯(cuò)碼造成失活”/注釋＝“假基因，與Oryza longistaminata，可能為gag/多蛋白U72725”/假LTR 144047...144255/注釋＝“3’端LTR”CDS 聯(lián)合(144653...144692，145148...145311)/密碼子起始＝1/基因＝“P0407B12.29”/注釋＝“假定的蛋白”/蛋白_編號＝“BAB17191.1”/翻譯＝“MRRSHGGGGRKRSVPSSSHPEKKAIDRIKREDAGRRAGRVSLVQPLAAFPATDGGGGGGLARLLRWW”接下來，本發(fā)明人用Blast搜索工具，對非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ IDNO1)進(jìn)行了同源性搜索(搜索DNA同源性)。大部分搜索結(jié)果都為該轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1)本身，但同時(shí)也獲得了另兩個(gè)被預(yù)期為轉(zhuǎn)座子基因的序列，其登記號分別為AP004236和AP003968。將AP004236和AP003968的核苷酸序列進(jìn)行比較，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)兩者都位于第6號染色體上，且是同一個(gè)重疊區(qū)域的序列。
因此，非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1)的第1～253位堿基與AP004236的第89360～89612位堿基之間的同源性為252/253(99％)，且非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1)的第254～430位堿基與AP004236的第94524～94700位堿基之間的同源性為177/177(100％)。它們都是高度保守的序列。
非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1，430個(gè)bp)以及轉(zhuǎn)座子(SEQID NO2，5341個(gè)bp)都有長度為15個(gè)bp的反向重復(fù)序列，并且都將TTA和TAA作為識別和插入位點(diǎn)。
對SEQ ID NO2(5341個(gè)bp)進(jìn)行的開放讀碼框(ORF)搜索結(jié)果顯示，有兩個(gè)推定的讀碼框ORF I和ORF II。
圖9的上半部分顯示的是包含SEQ ID NO2的轉(zhuǎn)座子基因結(jié)構(gòu)。非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1，430個(gè)bp)位于第1～253位堿基及第5165～5341位堿基，ORF I位于第1526～1914位堿基及第1939～2663位堿基，ORF II位于第3190～4557位堿基。
此外，為了獲得與包含SEQ ID NO2基因相似的基因，本發(fā)明人用Blast搜索工具，對SEQ ID NO2進(jìn)行了同源性搜索(搜索DNA同源性)，其結(jié)果除SEQ ID NO2本身外，還有登記號為AP004753(2號染色體)及AP003714(6號染色體)的兩個(gè)序列。這兩個(gè)克隆具有相同的核苷酸序列(SEQ ID NO3)，并且位于不同的染色體上(數(shù)個(gè)拷貝)。由于該核苷酸序列同樣存在于秈稻(indica)(一種水稻的變種)，該基因必然在由粳稻(japonica)至秈稻的多個(gè)變種中具有保守性。SEQ ID NO3(5166個(gè)bp)與SEQ ID NO2一樣具有反向重復(fù)序列，同樣也將TAA(3個(gè)bp)作為識別和插入位點(diǎn)。
對SEQ ID NO3進(jìn)行開放讀碼框(ORF)搜索獲得了ORF I和ORF II，兩者可能編碼兩種蛋白。圖9的下半部分顯示的是包含SEQ ID NO3(5341個(gè)bp)的轉(zhuǎn)座子基因結(jié)構(gòu)。非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1，430個(gè)bp)位于第1～170位堿基及第5092～5166位堿基，但兩者中間缺乏非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1，430個(gè)bp)的同源核苷酸序列。ORF I位于第1630～2652位堿基，ORF II位于第2959～4407位堿基。
比較粳稻(AP004753和AP003714)和秈稻所包含的SEQ ID NO3的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)兩者之間的同源性大于90％，其結(jié)果顯示于圖10。此外，本發(fā)明人還檢測了非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1，430個(gè)bp)在秈稻內(nèi)的突變率，其結(jié)果如圖11所示序列同源性大于95％。
本發(fā)明人目前對SEQ ID NO2及SEQ ID NO3的ORF I功能尚不了解。
為了了解ORF II是否編碼轉(zhuǎn)座酶(催化轉(zhuǎn)座的酶)，本發(fā)明人對ORFII編碼的氨基酸序列是否與已知的轉(zhuǎn)座酶基因具有相同的保守區(qū)域進(jìn)行了檢驗(yàn)。SEQ ID NO2及SEQ ID NO3的ORF II編碼的氨基酸序列分別被標(biāo)記為SEQ ID NO4和5。這兩個(gè)ORF II編碼的氨基酸序列(SEQID NO4及5)之間的比對(alignment)顯示于圖12，兩者的同源性大于75％(77％)。這兩個(gè)氨基酸序列都具有DXG/AF/F基序和YREK基序(Q.H.Le，K.Turcotte和T.Bureau，Genetics 1581081-1088(2001))，因此可得出其均屬于IS轉(zhuǎn)座酶家族的結(jié)論。
SEQ ID NO2和3的ORF II核苷酸序列之間的同源性同樣大于75％(79.3％)。
因此，本發(fā)明為一水稻轉(zhuǎn)座子基因，其由一種核苷酸序列組成，該核苷酸序列與SEQ ID NO1之間的同源性至少為95％。與SEQ ID NO1同源性至少為95％的DNA被認(rèn)為具有非自主性轉(zhuǎn)座子的功能，用花藥培養(yǎng)或化學(xué)試劑處理可使其發(fā)生轉(zhuǎn)座。本發(fā)明還為一水稻轉(zhuǎn)座子基因，其中插入有增強(qiáng)子或啟動子。
此外，本發(fā)明為一水稻轉(zhuǎn)座子基因，其核苷酸序列與SEQ ID NO2或3之間的同源性至少為90％。與SEQ ID NO2或3的同源性至少為90％的DNA被認(rèn)為具有自主性轉(zhuǎn)座子的功能，用花藥培養(yǎng)或化學(xué)試劑處理可使其發(fā)生轉(zhuǎn)座。
本發(fā)明還為一水稻轉(zhuǎn)座酶基因，其DNA與SEQ ID NO2的第3190～4557位堿基或SEQ ID NO3的第2959～4407位堿基之間的同源性至少位75％。與上述核苷酸序列同源性大于等于75％的DNA被認(rèn)為具有能夠使轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座的功能。
本發(fā)明還為一轉(zhuǎn)座酶基因，其編碼的蛋白質(zhì)由SEQ ID NO4或5的氨基酸序列或上述氨基酸序列發(fā)生一或數(shù)個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列組成。該轉(zhuǎn)座酶可為一水稻轉(zhuǎn)座子基因，其氨基酸序列與SEQ ID NO4或5之間的同源性至少為75％。
此外，本發(fā)明還為編碼該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)座酶基因。本發(fā)明也包括含有上述任一轉(zhuǎn)座子基因的質(zhì)粒。本發(fā)明同樣包括含有啟動子和任一上述轉(zhuǎn)座酶基因的質(zhì)粒。為達(dá)到該目的可使用Ti質(zhì)粒和pBI-121質(zhì)粒等雙重載體。本發(fā)明中適用的啟動子包括花椰菜花葉病病毒35s啟動子，熱休克啟動子，趨化性(chemotaxis)啟動子及其他啟動子。本發(fā)明對整合啟動子和上述基因組的方法并沒有限制，基因工程的一般方法即可適用。
本發(fā)明包括轉(zhuǎn)導(dǎo)入上述轉(zhuǎn)座子基因的轉(zhuǎn)化體(transformant)。植物為優(yōu)選的宿主，尤其是水稻、大麥、小麥或玉米。通過使用基因工程的一般方法，我們可將這些基因組插入上述質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化這些植物。
本發(fā)明還包括轉(zhuǎn)導(dǎo)入啟動子和上述轉(zhuǎn)座酶基因的轉(zhuǎn)化體。如果有必要的話還可轉(zhuǎn)導(dǎo)其他轉(zhuǎn)座子基因。上述啟動子皆適用于本發(fā)明。植物為優(yōu)選的宿主，尤其是大麥、小麥或玉米。通過使用基因工程的一般方法，我們可將上述基因組插入上述質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化這些植物。
本發(fā)明的內(nèi)容還包含使任一上述轉(zhuǎn)座子基因發(fā)生轉(zhuǎn)座的方法，包括對任一上述轉(zhuǎn)化體進(jìn)行花藥培養(yǎng)或化學(xué)試劑處理。
本發(fā)明還包括通過任一上述方法使上述轉(zhuǎn)座子基因發(fā)生轉(zhuǎn)座，并用其轉(zhuǎn)化的植物或種子。水稻或其鄰種如大麥、小麥或玉米為優(yōu)選的植物。
本發(fā)明還包括確定轉(zhuǎn)座子基因整合區(qū)域的方法，包括用任一上述方法使任一上述轉(zhuǎn)座子基因發(fā)生轉(zhuǎn)座，由所獲植物提取DNA，用在轉(zhuǎn)座子基因內(nèi)沒有酶切位點(diǎn)的內(nèi)切酶消化上述DNA，連接所獲DNA片段，PCR擴(kuò)增上述DNA片段，并確定上述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列。上述PCR所用引物為包含來自SEQ ID NO1的5’端的10個(gè)連續(xù)堿基的寡聚核苷酸，優(yōu)選方案為10～20個(gè)連續(xù)堿基，更優(yōu)選方案為10～15個(gè)堿基；以及包含來自SEQ ID NO1的3’端10個(gè)連續(xù)堿基的寡聚核苷酸，優(yōu)選方案為10～20個(gè)連續(xù)堿基，更優(yōu)選方案為10～15個(gè)堿基；或包含與上述序列互補(bǔ)的核苷酸的序列的寡聚核苷酸。由于包含來自SEQ ID NO1的5’端10～15個(gè)連續(xù)堿基的寡聚核苷酸與包含來自SEQ ID NO1的3’端10～15個(gè)連續(xù)堿基的寡聚核苷酸互相重疊，因此如果該寡聚核苷酸少于15個(gè)連續(xù)堿基的話，我們可以使用單一引物。也就是說，我們可以使用包含來自SEQ ID NO1的5’端10～15個(gè)連續(xù)堿基的寡聚核苷酸，或包含與其互補(bǔ)的10～15個(gè)連續(xù)堿基的寡聚核苷酸作為PCR引物。通過這一方法，確定轉(zhuǎn)座子基因的整合部位即可發(fā)現(xiàn)被破壞的基因組。


圖1為登記號為AP002843的基因組核苷酸序列的一部分(SEQ ID NO6)。轉(zhuǎn)座子基因特征性反向重復(fù)序列位于第144459～144473及第144874～144888位堿基，緊接著LTR之后。
圖2為包含四種水稻變種成熟葉轉(zhuǎn)座子DNA的DNA區(qū)域(登記號AP002843)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(實(shí)施例2)。Nihonbare在850bp附近的條帶表明一轉(zhuǎn)座子基因(430個(gè)bp)插入了該區(qū)域。而Koshihikari，Hitomebore以及Yamahoushi的條帶均在420bp附近，則表明沒有轉(zhuǎn)座子基因插入。
圖3為包含Nihonbare種子不同愈傷組織(callus)內(nèi)轉(zhuǎn)座子DNA的DNA區(qū)域(登記號AP002843)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(對比例1)。
圖4為包含Nihonbare花藥不同愈傷組織內(nèi)轉(zhuǎn)座子DNA的DNA區(qū)域(登記號AP002843)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(實(shí)施例3)。在420bp附近的條帶表明缺失轉(zhuǎn)座子基因。
圖5為Nihonbare花藥不同愈傷組織內(nèi)轉(zhuǎn)座子DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(實(shí)施例4)。第1泳道為Nihonbare對照，第2～10泳道為由花藥愈傷組織再生的植物。用包含部分轉(zhuǎn)座子核苷酸序列的探針檢測DNA條帶。與Nihonbare對照相比，第2和第6泳道顯示有陽性條帶(用箭頭表示)。
圖6為實(shí)施例4中再生水稻中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化體表型的照片。這種水稻的葉子短且卷曲。
圖7為包含Nihonbare種子不同愈傷組織內(nèi)轉(zhuǎn)座子DNA的DNA區(qū)域PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(實(shí)施例5)。上緣的數(shù)字表明5-氮胞苷的濃度。在300bp附近的條帶表明該片段缺失轉(zhuǎn)座子基因(430bp)。
圖8為4個(gè)克隆的堿基序列，該4個(gè)克隆皆缺失轉(zhuǎn)座子基因(430bp)。
圖9為包含SEQ ID NO2及3的核苷酸序列的轉(zhuǎn)座子基因結(jié)構(gòu)。
圖10為粳稻(AP004753和AP003714)和秈稻(支架6962(Scaffold6962))在SEQ ID NO3區(qū)域的核苷酸序列同源性。
圖11為秈稻轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1，430bp)的突變率。
圖12為SEQ ID NO2和3的ORF II編碼的氨基酸序列之間的比對。兩者之間的同源性大于75％(77.8％，同源氨基酸在圖中用*標(biāo)記)，且兩者都具有DXG/AF/F基序和YREK基序。上方的線條為SEQ ID NO4的氨基酸序列(對應(yīng)于SEQ ID NO2的ORF II)，下方的線條為SEQ ID NO5的氨基酸序列(對應(yīng)于SEQ ID NO3的ORF II)。
圖13-左圖為包含Nihonbare花藥不同愈傷組織內(nèi)轉(zhuǎn)座子DNA的DNA區(qū)域(登記號AP004236)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(實(shí)施例6)。在1.2Kbp處的條帶表明轉(zhuǎn)座子基因的缺失。圖13-右圖為包含來自Nihonbare種子的不同愈傷組織內(nèi)轉(zhuǎn)座子DNA的DNA區(qū)域(登記號AP004236)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(對比例2)。
圖14為表明在不同水稻變種中自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2，在照片的上緣顯示)存在或缺失的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(實(shí)施例7)。箭頭所示的DNA條帶表明在Nihonbare(第1泳道)和Koshihikari(第2泳道)中存在自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2)，而在Taichung No.65(第3泳道)和Kasarasu(第4泳道)中則該DNA條帶缺失。
圖15為轉(zhuǎn)導(dǎo)入Nihonbare自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2)的Taichung No.65花藥愈傷組織DNA的凝膠電泳結(jié)果(實(shí)施例8)。箭頭所示的DNA條帶表明在原始Taichung No.65(第2泳道)內(nèi)缺失自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2)，但在轉(zhuǎn)導(dǎo)入自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2)的Taichung No.65(第3～6泳道)內(nèi)卻存在該基因。
圖16為包含轉(zhuǎn)導(dǎo)入Nihonbare自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2，實(shí)施例8)的Taichung No.65花藥愈傷組織非自主性轉(zhuǎn)座子基因DNA區(qū)域PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果。在L06基因位點(diǎn)觀察到的DNA條帶大小提示非自主性轉(zhuǎn)座子基因的缺失。
圖17為提示在L02基因位點(diǎn)缺失非自主性轉(zhuǎn)座子基因的DNA片段的核苷酸序列。在該位點(diǎn)缺失了非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1)的核苷酸序列。
圖18為提示在L06基因位點(diǎn)缺失非自主性轉(zhuǎn)座子基因的DNA片段的核苷酸序列。在該位點(diǎn)缺失了非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1)的核苷酸序列。
具體實(shí)施例方式
首先，本發(fā)明為水稻非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1)，該DNA大小為430bp。該轉(zhuǎn)座子基因有大小為15bp的末端反向重復(fù)序列，以及一個(gè)大小為215bp的對稱結(jié)構(gòu)(CT)。
接下來本發(fā)明還包括兩種轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2及3)，兩者都為自主性轉(zhuǎn)座子基因，分別編碼轉(zhuǎn)座酶(SEQ ID NO4及5)。
自主性轉(zhuǎn)座子基因的特點(diǎn)為其自身編碼轉(zhuǎn)座酶，具有可動的特點(diǎn)，并能誘導(dǎo)非自主性轉(zhuǎn)座子基因的轉(zhuǎn)座。而非自主性轉(zhuǎn)座子基因缺乏轉(zhuǎn)座酶，不具有可動的特點(diǎn)，并且需要在自主性轉(zhuǎn)座子基因的協(xié)助下進(jìn)行轉(zhuǎn)座。比較自主性轉(zhuǎn)座子基因與非自主性轉(zhuǎn)座子基因的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，除缺失的DNA區(qū)域外，兩者的核苷酸序列具有同源性且高度保守。
攜帶本發(fā)明轉(zhuǎn)座子的植物，或用本發(fā)明轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化的植物，或攜帶本發(fā)明轉(zhuǎn)座酶基因的植物，或用本發(fā)明轉(zhuǎn)座酶基因轉(zhuǎn)化的植物能通過放射線照射、化學(xué)試劑處理、或花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)而活化，從而使本發(fā)明的轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座。由于用上述方法可使轉(zhuǎn)座子高度活化，因此可輕而易舉使人工轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座。
化學(xué)試劑法為用化學(xué)試劑處理植物如水稻的種子、葉、根、及腋芽的莖；或處理其愈傷組織。例如用5-氮胞苷或5-氮脫氧胞嘧啶處理這些植物的方法一般為將植物移植于含有0.01mM～5mM上述化學(xué)試劑的固體或液體培養(yǎng)基中，優(yōu)選濃度為0.05mM～2mM。在本文中，愈傷組織為通過在加入合適濃度植物生長素或細(xì)胞激動素的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物器官如根、葉或莖等，使已分化的植物器官去分化，而形成的一個(gè)細(xì)胞團(tuán)塊。該細(xì)胞團(tuán)塊未分化，且在分化中具有全能性。分化全能性指該細(xì)胞團(tuán)塊能再生為新的器官如芽或根等。例如一片葉子可由愈傷組織介導(dǎo)產(chǎn)生上百個(gè)克隆。
花藥培養(yǎng)是一種產(chǎn)生雙單倍體(doubled haploid)培養(yǎng)的方法。從水稻雄蕊頂端取下花藥，并在加入以植物生長素類激素為主并輔以多倍體誘導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)如秋水仙堿等激素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。由于單倍體細(xì)胞能輕易變成雙倍體細(xì)胞，因此能夠簡單地由花藥獲得雙倍體細(xì)胞，即攜帶一套基因的雙倍體細(xì)胞。由花藥培養(yǎng)的水稻愈傷組織自發(fā)地把染色體數(shù)目增加一倍，從而在長時(shí)期培養(yǎng)內(nèi)獲得雙單倍體培養(yǎng)。通過愈傷組織培養(yǎng)可獲得純合體種子或突變植物。我們在再生培養(yǎng)中主要使用加入細(xì)胞激動素類激素的培養(yǎng)基。
由于插入了發(fā)生轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子基因而遭到破壞的轉(zhuǎn)座子基因可用探針進(jìn)行檢測，其制備方法為用轉(zhuǎn)座子基因內(nèi)適當(dāng)?shù)膬蓚€(gè)不同核苷酸序列設(shè)計(jì)一套引物，PCR擴(kuò)增得到探針。檢測轉(zhuǎn)化水稻突變體與其基因之間的關(guān)系使得我們能夠闡明該基因的功能。
用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽系統(tǒng)(transposon tagging system)簡單地確認(rèn)一條被破壞的基因是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)?，F(xiàn)有許多方法如轉(zhuǎn)座子顯示等可直接確定轉(zhuǎn)座子的確切整合部位。但是這些方法的操作方法往往都很復(fù)雜。本發(fā)明人用反向PCR建立了一種簡單的方法。在這種方法中，在轉(zhuǎn)座子基因內(nèi)部設(shè)計(jì)PCR引物是一個(gè)非常重要的關(guān)鍵步驟。由植物中提取DNA，用合適的限制性內(nèi)切酶消化DNA(我們在本例中用AluI)，該內(nèi)切酶在轉(zhuǎn)座子基因內(nèi)部必須沒有酶切位點(diǎn)，再用連接酶使DNA發(fā)生分子內(nèi)連接以形成環(huán)狀分子。將所獲環(huán)狀DNA作為模板，設(shè)計(jì)一套引物進(jìn)行PCR，該兩個(gè)引物起初互相指向?qū)Ψ降南喾捶较?，但在連接后的環(huán)狀DNA分子內(nèi)則互相指向?qū)Ψ?。用于反向PCR的引物可以是至少包含來自SEQID NO1的5’端的10個(gè)連續(xù)堿基的寡聚核苷酸，以及至少包含來自SEQID NO1的3’端的10個(gè)連續(xù)堿基的寡聚核苷酸，優(yōu)選方案為選擇末端反向重復(fù)序列的內(nèi)部區(qū)域(SEQ ID NO1的5’端和3’端的15個(gè)連續(xù)堿基)；或是包含與核苷酸序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸。對所獲PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序可明確轉(zhuǎn)座子基因的整合部位。以應(yīng)用非自主性轉(zhuǎn)座子(SEQ ID NO1)為例，將增強(qiáng)子或啟動子整合至非自主性轉(zhuǎn)座子能誘導(dǎo)增強(qiáng)子或啟動子與非自主性轉(zhuǎn)座子一起發(fā)生轉(zhuǎn)座。確切地說，將插入增強(qiáng)子或啟動子的基因組轉(zhuǎn)導(dǎo)入水稻或其他植物；或培養(yǎng)其花藥；或用化學(xué)試劑對其進(jìn)行處理；或誘導(dǎo)其基因組發(fā)生轉(zhuǎn)座，我們能證明被轉(zhuǎn)座基因組側(cè)翼的其他基因組的活性表達(dá)，并且獲得許多具有功能的突變體。
在上述例子中，我們可使用花椰菜花葉病病毒35s啟動子作為啟動子，以及35s啟動子內(nèi)的一系列四套增強(qiáng)子區(qū)域作為增強(qiáng)子(位于序列的-90～-440區(qū)域)。除攜帶SEQ ID NO1的基因組反向重復(fù)序列內(nèi)部區(qū)域以外，對于增強(qiáng)子的整合位點(diǎn)沒有任何其他限制。同樣，除攜帶SEQ IDNO1的基因組反向重復(fù)序列內(nèi)部區(qū)域，以及在其整合位點(diǎn)緊鄰下游區(qū)域沒有蛋氨酸存在以外，對于啟動子的整合位點(diǎn)也沒有任何其他限制。如果不影響轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的話，增強(qiáng)子和啟動子的優(yōu)選整合位點(diǎn)都為SEQ IDNO1的250附近。我們可以使用將SEQ ID NO1基因組切成兩段核苷酸片段的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，或是使用PCR制備的克隆位點(diǎn)整合增強(qiáng)子和啟動子。
發(fā)明作用由于長期以來人們不了解水稻基因，因此本發(fā)明第一次證明了水稻的可動性轉(zhuǎn)座子基因。此外，本發(fā)明人還通過諸如花藥培養(yǎng)等簡單的方法證實(shí)了非自主性轉(zhuǎn)座子基因是可轉(zhuǎn)座的。也就是說我們成功地提供了一種使非自主性轉(zhuǎn)座子基因發(fā)生人工轉(zhuǎn)座的新方法。
在下文所列舉的實(shí)施例中，我們證明了通過諸如花藥培養(yǎng)等人工方法可使非自主性轉(zhuǎn)座子基因缺失。此外，我們還直接證實(shí)了非自主性轉(zhuǎn)座子基因插入的位點(diǎn)。由于我們發(fā)現(xiàn)了可實(shí)現(xiàn)人工轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子基因，我們第一次成功地建立了水稻轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽系統(tǒng)。
本發(fā)明還進(jìn)一步證實(shí)了水稻的轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2及3)，以及基因組內(nèi)包括的轉(zhuǎn)座酶基因。本發(fā)明人通過諸如花藥培養(yǎng)或藥物處理等簡單的方法證實(shí)了轉(zhuǎn)導(dǎo)入自主性轉(zhuǎn)座子基因的水稻轉(zhuǎn)座子基因可發(fā)生轉(zhuǎn)座。也就是說本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化這些植物的簡單人工方法，籍此方法可將自主性轉(zhuǎn)座子基因或轉(zhuǎn)座酶基因人工轉(zhuǎn)導(dǎo)入水稻或其他植物。
本發(fā)明的自主性轉(zhuǎn)座子基因可用作隨機(jī)誘變劑，以及在水稻及其他植物內(nèi)建立轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽系統(tǒng)。本發(fā)明可用于制備數(shù)十種轉(zhuǎn)座子隨機(jī)發(fā)生轉(zhuǎn)座的植物品種。由于植物在自然生長過程種發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)座的幾率極小，因此可在植物組織培養(yǎng)所獲的花藥愈傷組織或5-氮胞苷處理的種子愈傷組織中有效地誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座的發(fā)生。有效誘導(dǎo)水稻以外的植物發(fā)生轉(zhuǎn)座同樣也是可行的，只需通過某種轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)導(dǎo)自主性轉(zhuǎn)座子即可。所獲突變植物的分析可通過基因分析或反向基因分析完成。
基因分析是一種分離導(dǎo)致突變體發(fā)生突變的原因基因的方法。如果本發(fā)明的轉(zhuǎn)座子基因與某種突變體表現(xiàn)型相關(guān)，該表現(xiàn)型的原因基因可通過標(biāo)簽(轉(zhuǎn)座子)被分離。
例如，如果希望尋找耐鹽的水稻品種，可以通過檢測轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽系統(tǒng)的種子培育而成的水稻的耐鹽性，從而發(fā)現(xiàn)所需的水稻品種。
反向基因分析是一種由野生宿主群中分離失去某種基因功能的突變體的方法。如果用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽標(biāo)記某種所需基因，則該基因相關(guān)的表現(xiàn)型應(yīng)該被突變。由不同的突變體分離DNA，并建立標(biāo)簽基因組文庫。我們可由公共儲存中心獲取這樣的轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽系統(tǒng)。通過篩選轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽系統(tǒng)，我們可用PCR將所需的基因-轉(zhuǎn)座子作為一個(gè)整體分離。
基因組工程的最新進(jìn)展使得制備一套與整個(gè)水稻基因組相對應(yīng)的突變體以及與不同突變體相對應(yīng)的轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫成為可能。使用者可通過搜索該數(shù)據(jù)庫定購所需的種子。
下文中列舉的實(shí)施例能夠詳細(xì)說明本發(fā)明，但其原意并非為限制本發(fā)明的使用范圍。
實(shí)施例1由一種水稻的栽培品種Nihonbare(Kikuchi等(1998)植物生物技術(shù)1545-48)提取DNA。為了擴(kuò)增位于轉(zhuǎn)座子DNA兩端的兩個(gè)末端反向重復(fù)序列之間的中心DNA區(qū)，我們用包含SEQ ID NO7的序列的寡聚核苷酸作為PCR引物。PCR反應(yīng)系統(tǒng)為GeneAmp9600系統(tǒng)(ABI Co.)。每個(gè)反應(yīng)體系(100μl)由200ng DNA，2.5單位TaKaRa Ex Taq酶(TakaraCo.)10μl 10×Ex Taq緩沖液，8μl dNTP混合物(每種dNTP為2.5mM)，以及200pmol引物組成。每個(gè)PCR循環(huán)包括94℃變性30秒，55℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸12分鐘?？偣?5個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用1％ SeaKemGTG瓊脂糖凝膠(FMC Co.)分離DNA。擴(kuò)增的DNA片段大約450bp，由凝膠回收DNA片段后用TA克隆試劑盒(In Vitrogen)將其亞克隆入pCRII-TOPO質(zhì)粒。用310 DNA測序儀(ABI Co.)對所有克隆進(jìn)行測序。所確定的核苷酸序列被命名為SEQ ID NO1，由430bp組成。
實(shí)施例2由4種水稻栽培品種Nihonbare，Koshihikari，Hitombore及Yamahoushi的葉子提取DNA。為了用PCR擴(kuò)增包含轉(zhuǎn)座子基因(登記號AP002843)的DNA區(qū)域，我們用包含SEQ ID NO8及9的序列的寡聚核苷酸作為PCR引物。每個(gè)反應(yīng)體系(100μl)由200ng DNA，2.5單位AmpliTaq Gold酶(ABI Co.)10μl 10×GeneAmp PCR緩沖液(含15mM MgCl2)，10μlGeneAmp混合物(每種dNTP為2mM)，以及200pmol引物組成。每個(gè)PCR循環(huán)包括96℃變性30秒，55℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸1分鐘?？偣?5個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用2％ LO3瓊脂糖凝膠(Takara Co.)分離DNA。圖2為瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。僅在Nihonbare(第2泳道)上可見一在850bp附近的條帶。850bp附近的條帶提示該DNA片段包含實(shí)施例1中所述的SEQ ID NO1轉(zhuǎn)座子基因(430bp)。同時(shí)在Koshihikari，Hitomebore和Yamahoushi中發(fā)現(xiàn)不包含轉(zhuǎn)座子基因的DNA條帶，大小為420bp。在這些水稻變種中，包含SEQ ID NO1的基因僅在Nihonbare中存在提示該基因的作用可能為轉(zhuǎn)座元件。
對比例1
用3％次氯酸鈉溶液處理Nihonbare種子15～30分鐘使其滅菌，滅菌水漂洗后接種于內(nèi)置20ml～30ml培養(yǎng)基的90mm×20mm的皮氏培養(yǎng)皿(Iwaki Co.)中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種9粒種子，30℃、光照下誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中含有4g CHU(N6)BasalSalt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g內(nèi)消旋肌醇(Sigma Co.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(gelrite)(Wako)的固體培養(yǎng)基組成。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第10天，誘導(dǎo)種子的愈傷組織被植入內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm的皮氏培養(yǎng)皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生長培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g內(nèi)消旋肌醇(SigmaCo.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。
在培養(yǎng)兩周后由種子愈傷組織提取DNA。為了通過PCR擴(kuò)增包含轉(zhuǎn)座子DNA的DNA區(qū)域，我們用實(shí)施例2中提及的包含SEQ ID NO8及9的序列的寡聚核苷酸作為PCR引物。每個(gè)反應(yīng)體系(100μl)由200ngDNA，2.5單位AmpliTaq Gold酶(ABI Co.)，10μl 10×GeneAmp PCR緩沖液(含15mM MgCl2)，10μl GeneAmp混合物(每種dNTP為2mM)，以及200pmol引物組成。每個(gè)PCR循環(huán)包括96℃變性30秒，55℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸1分鐘?？偣?5個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用2％ LO3瓊脂糖凝膠(Takara Co.)分離DNA。圖3為瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。僅發(fā)現(xiàn)一條在850bp附近的條帶。該850bp附近的條帶提示該DNA片段包含轉(zhuǎn)座子基因。缺失轉(zhuǎn)座子基因的DNA片段預(yù)期大小為420bp，在電泳中卻沒有發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)大小在420bp附近的DNA條帶的概率為0/64個(gè)愈傷組織(0％)。因此，該結(jié)果證明在種子愈傷組織中轉(zhuǎn)座子基因是不可動的。
實(shí)施例3將Nihonbare的谷穗在出現(xiàn)前即收割下來，在10℃冷處理10天，再用1％次氯酸鈉溶液滅菌1分鐘，并用無菌水漂洗。將花藥由花上摘下，接種于內(nèi)置3ml液體培養(yǎng)基的35×10mm皮氏培養(yǎng)皿(CORNING Co.)中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種50個(gè)花藥，30℃、光照下誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液體培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4周后，誘導(dǎo)花藥的愈傷組織被植入內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm的皮氏培養(yǎng)皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生長培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mlα-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激動素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。
在培養(yǎng)兩周后由花藥愈傷組織提取DNA。為了通過PCR擴(kuò)增包含轉(zhuǎn)座子DNA的DNA區(qū)域，我們用實(shí)施例2中提及的包含SEQ ID NO8及9的序列的寡聚核苷酸作為PCR引物。每個(gè)反應(yīng)體系(100μl)由200ngDNA，2.5單位AmpliTaq Gold酶(ABI Co.)10μl 10×GeneAmp PCR緩沖液(含15mM MgCl2)，10μl GeneAmp混合物(每種dNTP為2mM)，以及200pmol引物組成。每個(gè)PCR循環(huán)包括96℃變性30秒，55℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸1分鐘?？偣?5個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用2％ LO3瓊脂糖凝膠(Takara Co.)分離DNA。圖4為瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。如圖4所示，有兩條分別位于850bp和420bp的DNA條帶。850bp附近的條帶提示該DNA片段包含轉(zhuǎn)座子基因。420bp附近的條帶提示該DNA片段缺失轉(zhuǎn)座子基因。發(fā)現(xiàn)大小在420bp附近的DNA條帶的概率為11/64個(gè)愈傷組織(17.2％)。
本實(shí)施例中大小為420bp左右的DNA條帶提示該片段缺失轉(zhuǎn)座子基因，且是花藥愈傷組織的PCR產(chǎn)物，將所擴(kuò)增的DNA片段(大小為420bp左右，N＝5)由凝膠上回收，并用TA克隆試劑盒(In Vitrogen)將其亞克隆至pCRII-TOPO質(zhì)粒。用310 DNA測序儀對這5個(gè)克隆進(jìn)行了測序。這些核苷酸序列的比對證明了在這5個(gè)克隆中轉(zhuǎn)座子基因的缺失(數(shù)據(jù)在本文中未顯示)。因此，本發(fā)明人在核苷酸序列水平上證實(shí)了轉(zhuǎn)座子基因的缺失。
在對比例1中，子葉盤(種子)細(xì)胞培養(yǎng)的轉(zhuǎn)座子基因是不可動的，但是在本實(shí)施例中，花藥細(xì)胞培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)座子基因在很大概率上是可動的。
實(shí)施例4將Nihonbare的谷穗在出現(xiàn)前即收割下來，在10℃冷處理10天，再用1％次氯酸鈉溶液滅菌1分鐘，并用無菌水漂洗。將花藥由花上摘下，接種于內(nèi)置3ml液體培養(yǎng)基的35×10mm皮氏培養(yǎng)皿(CORNING Co.)中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種50個(gè)花藥，30℃、光照下誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液體培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4周后，誘導(dǎo)花藥的愈傷組織被植入內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm的皮氏培養(yǎng)皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生長培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2ml α-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激動素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。將生長培養(yǎng)兩周后的花藥愈傷組織移植入內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm皮氏培養(yǎng)皿中，30℃、光照下再生培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4.3g MS Basal Salt Mixture(Gibcobrl Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。
用CTBA法由9棵花藥愈傷組織再生幼苗提取DNA。用限制性內(nèi)切酶Hind III消化所提取的DNA，0.8％ LO3瓊脂糖(Takara Co.)凝膠電泳，再通過堿印跡法將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上(HybondN+)(AmershamCo.)。Southern雜交用試劑盒為DIG發(fā)光DNA檢測試劑盒(Roche Co.)。用于制備探針的是PCR DIG探針合成試劑盒(Roche Co.)。為了通過PCR擴(kuò)增包含轉(zhuǎn)座子DNA的內(nèi)部DNA區(qū)域，我們用實(shí)施例2中提及的包含SEQ ID NO10及11(兩者都位于SEQ ID NO1(轉(zhuǎn)座子基因)的內(nèi)部)的序列的寡聚核苷酸作為PCR引物。圖5為瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。如圖5所示，與Nihonbare對照相比較，在第2和第6泳道發(fā)現(xiàn)了兩條新的條帶(箭頭所示)。這兩條條帶表明轉(zhuǎn)座子基因插入了這些幼苗，并隨后被破壞。
在本實(shí)施例的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)座子基因插入新的基因位點(diǎn)這一事實(shí)得到了證實(shí)。此外，如圖6所示還在再生水稻中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)形態(tài)學(xué)突變的例子(其相關(guān)基因尚未發(fā)現(xiàn))，該突變例可能提示有形態(tài)學(xué)相關(guān)基因由于轉(zhuǎn)座子基因的插入而遭到破壞。
實(shí)施例5用3％次氯酸鈉溶液處理Nihonbare種子15～30分鐘使其滅菌，滅菌水漂洗后接種于內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm的皮氏培養(yǎng)皿(IwakiCo.)中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種9粒種子，30℃、光照下誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g內(nèi)消旋肌醇(SigmaCo.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。
數(shù)天后，水稻種子子葉盤內(nèi)開始形成愈傷組織，并在培養(yǎng)的第10天逐漸變成乳白色，長度達(dá)到5mm。將該5mm長、乳白色的愈傷組織分別移植入添加了0mM、0.01mM、0.03mM、0.05mM、0.1mM或0.3mM5-氮胞苷(Sigma Co.)的生長培養(yǎng)基中，并在30℃、光照下生長培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal SaltMixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g內(nèi)消旋肌醇(Sigma Co.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。
在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后，用Dneasy植物袖珍型試劑盒(QIAGEN)提取種子愈傷組織DNA。為了通過PCR擴(kuò)增包含轉(zhuǎn)座子DNA的DNA區(qū)域，我們用包含SEQ ID NO12及13的寡聚核苷酸作為PCR引物。
我們用HotStarTaq Master Mix試劑盒(QIAGEN)制備PCR反應(yīng)混合物。
每個(gè)PCR循環(huán)包括96℃變性30秒，55℃復(fù)性1分鐘，72℃延伸1分鐘。總共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用2％ LO3瓊脂糖凝膠(Takara Co.)分離DNA。
在添加了0.03mM～0.3mM 5-氮胞苷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的愈傷組織DNA中，可觀察到兩條分別位于730bp和300bp的條帶(圖7)。730bp附近的條帶提示該DNA包含一轉(zhuǎn)座子基因。而300bp附近的條帶則提示該DNA不包含轉(zhuǎn)座子基因(430bp)。
將300bp的DNA片段由凝膠上回收，并用TA克隆試劑盒(InVitrogen)將其亞克隆至pCRII-TOPO質(zhì)粒。用310 DNA測序儀(ABI Co.)對所獲4個(gè)克隆進(jìn)行測序。圖8為該4個(gè)克隆核苷酸序列的多重比對。在這4個(gè)克隆中均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子基因序列。
本實(shí)施例顯示，一種去甲基化試劑5-氮胞苷甚至可在種子愈傷組織中誘導(dǎo)本發(fā)明轉(zhuǎn)座子基因的轉(zhuǎn)座。在此結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們可預(yù)期用一粒種子可獲得數(shù)百個(gè)由該轉(zhuǎn)座子基因轉(zhuǎn)座的克隆。
實(shí)施例6將Nihonbare的谷穗在出現(xiàn)前即收割下來，在10℃冷處理10天，再用1％次氯酸鈉溶液滅菌1分鐘，并用無菌水漂洗。將花藥由花上摘下，接種于內(nèi)置3ml液體培養(yǎng)基的35×10mm皮氏培養(yǎng)皿(CORNING Co.)中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種50個(gè)花藥，30℃、光照下誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液體培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4周后，誘導(dǎo)花藥的愈傷組織被植入內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm的皮氏培養(yǎng)皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生長培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2ml α-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激動素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。將生長培養(yǎng)兩周后的花藥愈傷組織移植入內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm皮氏培養(yǎng)皿中，30℃、光照下再生培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4.3g MS Basal Salt Mixture(Gibcobrl Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，10ml 6-芐氨基嘌啉溶液(Sigma Co.)，2ml α-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。
在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后，提取花藥愈傷組織DNA(Kikuchi等(1998)植物生物技術(shù)1545-48)。為了通過PCR擴(kuò)增包含轉(zhuǎn)座子DNA的DNA區(qū)域，我們用包含SEQ ID NO14(AP004236的第88933～88962位堿基)及SEQ ID NO15(AP004236的第95545～95574位堿基)的序列的寡聚核苷酸作為PCR引物。每個(gè)反應(yīng)體系(100μl)由200ng DNA，2.5單位TaKaRa LA Taq酶(Takara Co.)，10μl 10×LA PCR緩沖液II，6μl 25mM MgCl2，8μl dNTP混合物(每種dNTP為2.5mM)，以及100pmol引物組成。
每個(gè)PCR循環(huán)包括94℃變性30秒和68℃延伸12分鐘。總共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用0.8％ LO3瓊脂糖凝膠(Takara Co.)分離DNA。位于6.6kbp附近的條帶提示該DNA條帶包含本發(fā)明轉(zhuǎn)座子基因(5341bp)。由于本發(fā)明轉(zhuǎn)座子基因的大小約為5.4kbp，因此我們可預(yù)計(jì)位于1.2kbp附近的條帶缺失該轉(zhuǎn)座子基因。本實(shí)施例中獲得一位于1.2kbp附近的DNA條帶(圖13)。以上這些結(jié)果表明花藥愈傷組織的轉(zhuǎn)座子基因是可動的。發(fā)現(xiàn)大小在1.2kbp附近的DNA條帶的概率為3/64個(gè)愈傷組織(4.7％)。本實(shí)施例證明水稻攜帶SEQ ID NO2的MITE在花藥愈傷組織內(nèi)是可動的。
對比例2將水稻的一個(gè)栽培品種Nihonbare的種子用3％次氯酸鈉溶液處理15～30分鐘使其滅菌，滅菌水漂洗后接種于內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm的皮氏培養(yǎng)皿(Iwaki Co.)中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種9粒種子，30℃、光照下誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g內(nèi)消旋肌醇(Sigma Co.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第10天，誘導(dǎo)種子的愈傷組織被植入內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm的皮氏培養(yǎng)皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生長培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal SaltMixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g內(nèi)消旋肌醇(Sigma Co.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。在生長培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)兩周后由種子愈傷組織提取DNA(Kukuchi等(1998)植物生物技術(shù)1545-48)。為了通過PCR擴(kuò)增包含轉(zhuǎn)座子DNA的DNA區(qū)域，我們用包含SEQ IDNO14及15的序列的寡聚核苷酸作為PCR引物。每個(gè)反應(yīng)體系(100μl)由200ng DNA，2.5單位TaKaRa LA Taq酶(Takara Co.)10μl 10×LA PCR緩沖液II，6μl 25mM MgCl2，8μl dNTP混合物(每種dNTP為2.5mM)，以及100pmol引物組成。每個(gè)PCR循環(huán)包括94℃變性30秒和68℃延伸12分鐘?？偣?5個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用0.8％ LO3瓊脂糖凝膠(TakaraCo.)分離DNA。在所有種子愈傷組織樣品中均可發(fā)現(xiàn)一條位于6.6kbp附近的DNA條帶，但卻沒有位于1.2kbp附近的條帶(圖13)。該結(jié)果提示在種子愈傷組織中轉(zhuǎn)座子基因是不可動的。發(fā)現(xiàn)大小在1.2kbp附近的DNA條帶的概率為0/64個(gè)愈傷組織(0％)。
實(shí)施例7在本實(shí)施例中，為了尋找不攜帶自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2)的栽培品種，并闡明在攜帶與不攜帶自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2)的愈傷組織內(nèi)非自主性轉(zhuǎn)座子基因的轉(zhuǎn)座效率之間是否有區(qū)別，我們由各栽培品種誘導(dǎo)了不攜帶自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2)的花藥愈傷組織，并檢測了其中非自主性轉(zhuǎn)座子基因的轉(zhuǎn)座效率。
用CTAB法提取了四種水稻栽培品種Nihonbare、Koshihikari、Taichung No.65和Kasarasu葉子DNA。所提取DNA用限制性內(nèi)切酶HindIII消化，1.0％ LO3瓊脂糖凝膠電泳分離，堿印跡法將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜(HybondN+，Amersham Co.)后，用DIG發(fā)光DNA檢測試劑盒(RocheCo.)進(jìn)行Southern雜交檢測。制備探針?biāo)迷噭┖袨镻CR DIG探針合成試劑盒(Roche Co.)為了通過PCR擴(kuò)增自主性轉(zhuǎn)座子基因特異性DNA區(qū)域，我們用包含SEQ ID NO16及17的序列的寡聚核苷酸作為PCR引物。Southern雜交的結(jié)果顯示在Nihonbare和Koshihikari中各有一個(gè)自主性轉(zhuǎn)座子基因的拷貝存在，但在Taichung No.65和Kasarasu中則沒有(圖14)。
隨后我們由Taichung No.65花藥誘導(dǎo)了愈傷組織，并對非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1)是否發(fā)生轉(zhuǎn)座進(jìn)行了檢測。
將Taichung No.65的谷穗在形成前即由頂芽上收割下來，10℃冷處理10天，1％次氯酸鈉溶液滅菌處理1分鐘后無菌水漂洗。將花藥由穎果上摘下，接種于內(nèi)置3ml液體培養(yǎng)基的35×10mm皮氏培養(yǎng)皿(CORNINGCo.)中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種50個(gè)花藥，30℃、光照下誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液體培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4周后，誘導(dǎo)花藥的愈傷組織被植入內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm的皮氏培養(yǎng)皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生長培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2ml α-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激動素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。
在生長培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)兩周后由花藥愈傷組織提取DNA(Kukuchi等(1998)植物生物技術(shù)1545-48)。為了通過PCR擴(kuò)增自主性轉(zhuǎn)座子基因特異性DNA區(qū)域，我們用包含SEQ ID NO18及19(L02)、SEQ ID NO20及21(L06)、SEQ ID NO22及23(L07)的序列的寡聚核苷酸作為PCR引物。每個(gè)反應(yīng)體系(100μl)由200ng DNA，2.5單位AmpliTaq Gold酶(ABI Co.)，10μl 10×GeneAmp PCR緩沖液(包含15mM MgCl2)，10μl Gene Amp混合物(每種dNTP為2mM)，以及200pmol引物組成。每個(gè)PCR循環(huán)包括96℃變性30秒，55℃復(fù)性1分鐘，以及72℃延伸1分鐘?？偣?5個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用2％ LO3瓊脂糖凝膠(Takara Co.)電泳分離DNA。結(jié)果顯示在不攜帶自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1)的Taichung No.65的L02、L06和L07位點(diǎn)都沒有發(fā)生非自主性轉(zhuǎn)座子基因的轉(zhuǎn)座(表2，第一行)。但是如對比例3中所示，在攜帶自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2)的Nihonbare花藥愈傷組織中，非自主性轉(zhuǎn)座子基因以高效率(10.9％～31.3)發(fā)生轉(zhuǎn)座。
表2

對比例3將Nihonbare的谷穗在出現(xiàn)前即收割下來，在10℃冷處理10天，再用1％次氯酸鈉溶液滅菌1分鐘，并用無菌水漂洗。將花藥由花上摘下，接種于內(nèi)置3ml液體培養(yǎng)基的35×10mm皮氏培養(yǎng)皿(CORNING Co.)中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種50個(gè)花藥，30℃、光照下誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液體培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4周后，誘導(dǎo)花藥的愈傷組織被植入內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm的皮氏培養(yǎng)皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生長培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mlα-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激動素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。在生長培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)兩周后由花藥愈傷組織提取DNA。為了通過PCR擴(kuò)增包含轉(zhuǎn)座子基因DNA的DNA區(qū)域，我們用實(shí)施例7中提及的包含SEQ ID NO5及1的序列的寡聚核苷酸作為PCR引物。每個(gè)反應(yīng)體系(100μl)由200ngDNA，2.5單位AmpliTaq Gold酶(ABI Co.)，10μl 10×GeneAmp PCR緩沖液(包含15mM MgCl2)，10μl Gene Amp混合物(每種dNTP為2mM)，以及200pmol引物組成。每個(gè)PCR循環(huán)包括96℃變性30秒，55℃復(fù)性1分鐘，以及72℃延伸1分鐘。總共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用2％ LO3瓊脂糖凝膠(Takara Co.)電泳分離DNA。我們發(fā)現(xiàn)兩條位于850bp和420bp附近的DNA條帶。850bp附近的條帶提示該DNA包含一轉(zhuǎn)座子基因。而420bp附近的條帶則提示這些DNA片段中缺失了轉(zhuǎn)座子基因。發(fā)現(xiàn)大小在420bp附近的DNA條帶的概率為11/64個(gè)愈傷組織(17.2％)。
實(shí)施例8在本實(shí)施例中，我們分離了包含自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2)的DNA區(qū)域，將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入不攜帶自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2)的栽培品種(Taichung No.65)內(nèi)，并檢測該栽培品種中非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1)發(fā)生轉(zhuǎn)座的概率。
為了擴(kuò)增一水稻栽培品種Nihonbare包含自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ IDNO2)的DNA區(qū)域，我們設(shè)計(jì)了兩個(gè)引物核苷酸序列SEQ ID NO24和25以進(jìn)行PCR反應(yīng)，兩者的序列分別位于目的DNA區(qū)域(SEQ ID NO2)的緊鄰上游和下游。我們合成了SEQ ID NO24和25的寡聚核苷酸，并用其作為PCR引物。用CTAB法提取Nihonbare葉子DNA。每個(gè)反應(yīng)體系(100μl)由200ng DNA，2.5單位TaKaRa LA Taq酶(Takara Co.)，10μl 10×LAPCR緩沖液II，6μl 25mM MgCl2，8μl dNTP混合物(每種dNTP為2.5mM)，以及100pmol引物組成。每個(gè)PCR循環(huán)包括94℃變性30秒以及68℃延伸1分鐘?？偣?5個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用0.8％ LO3瓊脂糖凝膠(Takara Co.)電泳分離DNA。我們獲得了包含自主性轉(zhuǎn)座子基因、大小約為6.6kbp的DNA條帶。切膠回收DNA片段(6.6kbp附近)，并用TA克隆試劑盒(In Vitrogen)將其亞克隆至pCRII-TOPO質(zhì)粒，選擇ApaI和KpnI作為酶切位點(diǎn)將多克隆位點(diǎn)由pCRII-TOPO質(zhì)粒中切除出來，亞克隆至攜帶一選擇性標(biāo)記物基因(耐潮霉素基因)且能用于植物轉(zhuǎn)染的二元載體，并用電穿孔法將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化土壤桿菌(Agrobacteria)EHA101。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化土壤桿菌感染花藥愈傷組織三天前，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化土壤桿菌劃線接種至含有卡那霉素(Wako)和潮霉素(Wako)的AB培養(yǎng)基上。
隨后，將包含自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2)的DNA片段(約6.6kbp)由重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)至一水稻栽培品種TaichungNo.65的花藥愈傷組織內(nèi)。
將Taichung No.65的谷穗在出現(xiàn)前即收割下來，在10℃冷處理10天，再用1％次氯酸鈉溶液滅菌1分鐘，并用無菌水漂洗。將花藥由花上摘下，接種于內(nèi)置3ml液體培養(yǎng)基的35×10mm皮氏培養(yǎng)皿(CORNING Co.)中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種50個(gè)花藥，30℃、光照下誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液體培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4周后，誘導(dǎo)花藥的愈傷組織被植入內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm的皮氏培養(yǎng)皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生長培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mlα-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激動素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。
在生長培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)兩周后，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化土壤桿菌轉(zhuǎn)染TaichungNo.65花藥愈傷組織。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化土壤桿菌劃線接種至AB培養(yǎng)基表面培養(yǎng)3天后，用刮鏟將其刮下，與添加了10mg/L乙酰丁香酮的AAM培養(yǎng)基(25ml)混勻。將混有轉(zhuǎn)染用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化土壤桿菌的培養(yǎng)基置于皮氏培養(yǎng)皿(IWAKI)內(nèi)。將于生長培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)兩周的花藥愈傷組織置于金屬絲網(wǎng)內(nèi)，浸入轉(zhuǎn)染混合培養(yǎng)基2分鐘。隨后將金屬絲網(wǎng)置于無菌紙巾上以除去多余培養(yǎng)基。用鑷子將濾紙固定于共生培養(yǎng)基上，將愈傷組織置于濾紙上，外科膠帶密封，28℃黑暗中培養(yǎng)3天。我們所使用的共生培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)，10g葡萄糖(Wako)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)，10mg乙酰丁香酮的固體培養(yǎng)基。共生培養(yǎng)3天后，將愈傷組織置于錐形瓶內(nèi)，加入100ml無菌水，振蕩后將水棄去。用無菌水洗滌數(shù)次后，再用添加了500mg/ml carbenisillin的漂洗液洗滌后，將愈傷組織移植入皮氏培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)植入9個(gè)愈傷組織，外科膠帶密封后25℃光下培養(yǎng)一個(gè)月。我們所使用的選擇培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，2.878g脯氨酸(ICN)，0.1g內(nèi)消旋肌醇(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，500mg潮霉素(Wako)，50mg羧芐青霉素(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。
在選擇培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)3～4周后，我們檢測了耐潮霉素愈傷組織內(nèi)Nihonbare自主性轉(zhuǎn)座子基因以及非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1)可能發(fā)生的轉(zhuǎn)座。
根據(jù)(Kikuchi等(1998)植物生物技術(shù)1545-48)內(nèi)所述方法由耐潮霉素愈傷組織提取DNA。為了通過PCR擴(kuò)增包含自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO2)的DNA區(qū)域，我們用包含分別位于目的DNA區(qū)域(SEQID NO2)緊鄰上游和下游的SEQ ID NO24及25的序列的寡聚核苷酸作為PCR引物。
每個(gè)反應(yīng)體系(100μl)由200ng DNA，2.5單位TaKara LA Taq酶(Takara Co.)，10μl 10×LAPCR緩沖液，6μl 25mM MgCl2，8μl dNTP混合物(每種dNTP為2.5mM)，以及100pmol引物組成。每個(gè)PCR循環(huán)包括94℃變性30秒以及68℃延伸12分鐘?？偣?5個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用0.8％ LO3瓊脂糖凝膠(Takara Co.)電泳分離PCR產(chǎn)物。如圖15所示，我們證實(shí)了Nihonbare自主性轉(zhuǎn)座子基因在耐潮霉素的TaichungNo.65愈傷組織中發(fā)生了轉(zhuǎn)座。
為了通過PCR擴(kuò)增包含非自主性轉(zhuǎn)座子基因的DNA區(qū)域，我們用包含SEQ ID NO18及19(L02)、SEQ ID NO20及21(L06)、SEQ ID NO22及23(L07)的序列的寡聚核苷酸作為PCR引物。我們用HotStarTaqMaster Mix試劑盒(QIAGEN)制備PCR反應(yīng)混合物。每個(gè)PCR循環(huán)包括96℃變性30秒，55℃復(fù)性1分鐘，以及72℃延伸2分鐘。總共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用2％ LO3瓊脂糖凝膠(Takara Co.)電泳分離DNA。我們檢測了38個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)入自主性轉(zhuǎn)座子基因的愈傷組織內(nèi)非自主性轉(zhuǎn)座子基因缺失的概率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一DNA條帶(箭頭所示)，該條帶提示在L06基因位點(diǎn)有非自主性轉(zhuǎn)座子基因的缺失(圖16)。非自主性轉(zhuǎn)座子基因在L02、L06、L07基因位點(diǎn)缺失的概率約為0～5.3％(表2，第2行)。
將提示非自主性轉(zhuǎn)座子基因在L02和L06基因位點(diǎn)缺失的DNA片段由凝膠回收，并用TA克隆試劑盒(In Vitrogen)亞克隆至pCRII-TOPO質(zhì)粒。用310 DNA測序儀(ABI Co.)測定所獲克隆的核苷酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些克隆中都沒有非自主性轉(zhuǎn)座子基因(圖17、18)。
上述結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)導(dǎo)入Nihonbare自主性轉(zhuǎn)座子基因的TaichungNo.65花藥愈傷組織內(nèi)非自主性轉(zhuǎn)座子基因被誘導(dǎo)發(fā)生了轉(zhuǎn)座。
在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們可得出如下結(jié)論，即SEQ ID NO2所表達(dá)的轉(zhuǎn)座子基因不僅能在花藥愈傷組織內(nèi)自主轉(zhuǎn)座，還能調(diào)節(jié)非自主性轉(zhuǎn)座子基因的轉(zhuǎn)座。
實(shí)施例9在本實(shí)施例中，我們檢測了SEQ ID NO3在經(jīng)5-氮胞苷處理的花藥愈傷組織以及子葉盤愈傷組織內(nèi)的轉(zhuǎn)座活性。
將Nihonbare的谷穗在出現(xiàn)前即收割下來，在10℃冷處理10天，再用1％次氯酸鈉溶液滅菌1分鐘，并用無菌水漂洗。將花藥由花上摘下，接種于內(nèi)置3ml液體培養(yǎng)基的35×10mm皮氏培養(yǎng)皿(CORNING Co.)中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種50個(gè)花藥，30℃、光照下誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液體培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4周后，誘導(dǎo)花藥的愈傷組織被植入內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm的皮氏培養(yǎng)皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生長培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2ml α-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激動素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。在生長培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)兩周后根據(jù)(Kikuchi等(1998)植物生物技術(shù)1545-48)內(nèi)所述方法由花藥愈傷組織提取DNA。
將水稻的一個(gè)栽培品種Nihonbare的種子用3％次氯酸鈉溶液處理15～30分鐘使其滅菌，滅菌水漂洗后接種于內(nèi)置20～30ml培養(yǎng)基的90×20mm的皮氏培養(yǎng)皿(Iwaki Co.)中，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種9粒種子，30℃、光照下誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g內(nèi)消旋肌醇(Sigma Co.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第10天，誘導(dǎo)種子的愈傷組織被植入內(nèi)置20～30ml添加了0mM、0.1mM、0.5mM 5-氮胞苷(Sigma Co.)的生長培養(yǎng)基中，30℃、光照下生長培養(yǎng)24小時(shí)。我們所使用的培養(yǎng)基為1L培養(yǎng)基中包含4gCHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS維生素溶液(SigmaCo.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g內(nèi)消旋肌醇(Sigma Co.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脫乙酰吉蘭糖膠(Wako)的固體培養(yǎng)基。在生長培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)兩周后用Dneasy植物袖珍試劑盒(Qiagen)由種子愈傷組織提取DNA。
為了通過PCR擴(kuò)增包含轉(zhuǎn)座子DNA的DNA區(qū)域，我們用包含SEQID NO26及27的序列的寡聚核苷酸作為PCR引物。每個(gè)反應(yīng)體系(100μl)由200ng DNA，2.5單位TaKaRa LA Taq酶(Takara Co.)10μl10×LAPCR緩沖液II，6μl 25mM MgCl2，8μl dNTP混合物(每種dNTP為2.5mM)，以及100pmol引物組成。每個(gè)PCR循環(huán)包括94℃變性30秒和68℃延伸12分鐘?？偣?5個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用0.8％ LO3瓊脂糖凝膠(Takara Co.)分離PCR產(chǎn)物。
結(jié)果顯示包含SEQ ID NO3的核苷酸序列的轉(zhuǎn)座子基因在花藥愈傷組織和子葉盤愈傷組織中均沒有發(fā)生轉(zhuǎn)座，但在經(jīng)5-氮胞苷處理的子葉盤愈傷組織中轉(zhuǎn)座的發(fā)生率很高(表3)。
表3

包含SEQ ID NO3的核苷酸序列的轉(zhuǎn)座子基因有一自主性轉(zhuǎn)座子基因的結(jié)構(gòu)，其中還包括一轉(zhuǎn)座酶的編碼序列，因此可被5-氮胞苷活化，并控制非自主性轉(zhuǎn)座子基因(SEQ ID NO1)的轉(zhuǎn)座。
實(shí)施例10用Dneasy植物袖珍試劑盒(QIAGEN)提取一水稻栽培品種Kasarasu的成熟葉DNA。為了通過PCR擴(kuò)增緊鄰插入轉(zhuǎn)座子基因的DNA區(qū)域，我們使用反向PCR法。我們包含來自SEQ ID NO1的5’端15個(gè)堿基(5’-CCATTGTGACTGGCC-3’)的寡聚核苷酸作為PCR引物。PCR所使用的系統(tǒng)為GeneAmp9600系統(tǒng)(ABI Co.)。用于制備PCR反應(yīng)溶液的使HotStarTaq Master Mix試劑盒(QIAGEN)。每個(gè)PCR循環(huán)包括96℃變性30秒，44～58℃復(fù)性1分鐘，以及72℃延伸1分鐘。總共45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用2％LO3瓊脂糖凝膠(Takara Co.)電泳分離PCR產(chǎn)物。將所擴(kuò)增的DNA片段用TA克隆試劑盒(In Vitrogen)亞克隆至pCRII-TOPO質(zhì)粒。用310 DNA測序儀(ABI Co.)測定所獲克隆的核苷酸序列。
序列表序列表<110>獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)<120>水稻轉(zhuǎn)座子基因<130>FS02-290PCT<160>27<210>1<211>430<212>DNA<213>水稻<400>1ggccagtcac aatgggggtt tcactggtgt gtcatgcaca tttaataggg gtaagactga 60ataaaaaatg attatttgca tgaaatgggg atgagagaga aggaaagagt ttcatcctgg 120tgaaactcgt cagcgtcgtt tccaagtcct cggtaacaga gtgaaacccc cgttgaggcc 180gattcgtttc attcaccgga tctcttgcgt ccgcctccgc cgtgcgacct ccgcattctc 240ccgcgccgcg ccggattttg ggtacaaatg atcccagcaa cttgtatcaa ttaaatgctt 300tgcttagtct tggaaacgtc aaagtgaaac ccctccactg tggggattgt ttcataaaag 360atttcatttg agagaagatg gtataatatt ttgggtagcc gtgcaatgac actagccatt 420gtgactggcc 430<210>2<211>5341<212>DNA<213>水稻<400>2ggccagtcac aatggaggtt tcactggtgt gtcatgcaca tttaataggg gtaagactga 60ataaaaaatg attatttgca tgaaatgggg atgagagaga aggaaagagt ttcatcctgg 120tgaaactcgt cagcgtcgtt tccaagtcct cggtaacaga gtgaaacccc cgttgaggcc 180gattcgtttc attcaccgga tctcttgcgt ccgcctccgc cgtgcgacct ccgcattctc 240ccgcgccgcg ccgcgccacg cctccttccc gcgtgaacat tcctccttcc cgcgcgagcg 300attccaccat ctcccccgtc cggcgcctac ggagtacacc gcaaccggtc gccccaatcc 360ggcgcctaga ccgtgaccca cccgccatct tccgcaagac cgaatcccca acccacccac 420catcttccgc cgcccccgtc cccgtccccg gccatggatc cgtcgccggc cgtggatccg 480tcgccggccg tggatccgtc gccggctgct gaaacccggc ggcgtgcaac cgggaaagga 540ggcaaacagc gcgggggcaa gcaactagga ttgaagaggc cgccgccgat ttctgtcccg 600gccaccccgc ctcctgctgc gacgtcttca tcccctgctg cgccgacggc catcccacca 660cgaccaccgc aatcttcgcc gattttcgtc cccgattcgc cgaatccgtc accggctgcg 720ccgacctcct ctcttgcttc ggggacatcg acggcaaggc caccgcaacc acaaggagga 780ggatggggac caacatcgac catttcccca aactttgcat ctttctttgg aaaccaacaa 840gacccaaatt catggtacat gtattttctt ctttttctgt tactttcaac ctacggtaac 900tctaattcat ggatgagact actgccattg tgcagttcaa tgctttttct tcatgttata 960tttcgtccag ctgtgagtta tggtttgaag attgctgtgg ttgtttcatt gctgagtatg 1020tgaaagatag atggatgaaa gagagaatta tattttagtc tgtaatcttg ctcatccagt 1080tgctcatgta tgaccttggt tctagaatgt tgccctgact gtatgcttaa tgttcagaga 1140agtgatgcct aaagcagtga gatcagtggg atcagattag ctatcgacat ataatattag 1200ctatctcagt tgtgaaagag agatgggtga aaaggcaccc cttggattaa ttctgtagta 1260tcaaattctg caccttgtct gtccatatgt tctgcttggt tggtgggtgc agtgcatttg 1320taaaaaatag tttgcttctg atccttaata tatgtaacag ggaatgaatt ttcacccatc 1380tcagttgtaa aggtactgtc ttgctatgca atatgtgtaa attgacaaac ctgaaaatag 1440tctgtttgga atttgcaaaa gcaattcgat agtttggaat ttccaaacct cagtcagcag 1500taggcaatcc attttagttc ttgctatgca caaaaacagt acacctgata tgctcatttt 1560aatacaactt ttttgtctct gttacagttt ggtcaggggt tatcctccag gagggtttgt 1620caattttatt caacaaaatt gtccgccgca gccacaacag caaggtgaaa attttcattt 1680cgttggtcac aatatgggat tcaacccaat atctccacag ccaccaagtg cctacggaac 1740accaacaccc caagctacga accaaggcac ttcaacaaac attatgattg atgaagagga 1800caacaatgat gacagtaggg cagcaaagaa aagatggact catgaagagg aagagagact 1860ggtattcatc ggatactttt acatttccat atgtctttgt tttgactaat acttgacagg 1920tcattaactg attcttgtag gccagtgctt ggttgaatgc ttctaaagac tcaattcatg 1980ggaatgataa gaaaggtgat acattttgga aggaagtcac tgatgaattt aacaagaaag 2040ggaatggaaa acgtaggagg gaaattaacc aactgaaggt tcactggtca aggttgaagt 2100cagcgatctc tgagttcaat gactattgga gtacggttac tcaaatgcat acaagcggat 2160actccgacga catgcttgag aaagaggcac agaggctgta tgcaaacagg tttggaaaac 2220cttttgcgtt ggtccattgg tggaagatac tcaaagatga gcccaaatgg tgtgctcagt 2280ttgaatcaga gaaagacaag agcgaaatgg atgctgttcc agaacagcag tcacgtccta 2340ttggtagaga agcagcaaag tctgagcgca atggaaagcg caagaaagaa aatgttatgg 2400aaggcattgt cctcctaggg gacaatgtcc agaaaattat aaaggtccac gaagaccgga 2460
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1.一種水稻轉(zhuǎn)座子基因，其由一種核苷酸序列組成，該核苷酸序列與SEQ ID NO1具有至少95％的同源性。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)座子基因，其中插入有增強(qiáng)子或啟動子。
3.一種水稻轉(zhuǎn)座子基因，其由一種核苷酸序列組成，該核苷酸序列與SEQ ID NO2或SEQ ID NO3具有至少90％的同源性。
4.一種水稻轉(zhuǎn)座酶基因，其由一種核苷酸序列組成，該核苷酸序列與SEQ ID NO2的第3190～4557位堿基或SEQ ID NO3的第2959～4407位堿基具有至少75％的同源性。
5.編碼一種蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)座酶基因，所述的蛋白質(zhì)由SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的氨基酸序列、或在上述氨基酸序列中發(fā)生一或數(shù)個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列組成。
6.一種轉(zhuǎn)座酶，其由一種蛋白質(zhì)組成，所述的蛋白質(zhì)具有SEQ IDNO4或SEQ ID NO5的氨基酸序列、或在上述氨基酸序列中發(fā)生一或數(shù)個(gè)氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。
7.含有權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)座子基因的質(zhì)粒。
8.含有一種啟動子及權(quán)利要求4或5的轉(zhuǎn)座酶基因的質(zhì)粒。
9.轉(zhuǎn)化體，其中轉(zhuǎn)導(dǎo)入權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)座子基因。
10.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化體，其中的宿主為植物。
11.權(quán)利要求10中的轉(zhuǎn)化體，其中所述的植物為水稻、大麥、小麥或玉米。
12.轉(zhuǎn)化體，其中轉(zhuǎn)導(dǎo)入一種啟動子及權(quán)利要求4或5的轉(zhuǎn)座酶基因。
13.權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化體，其中的宿主為植物。
14.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)化體，其中所述的植物為大麥、小麥或玉米。
15.使權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)座子基因發(fā)生轉(zhuǎn)座的方法，包括對權(quán)利要求9至14中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行花藥培養(yǎng)或用化學(xué)試劑對其進(jìn)行處理。
16.權(quán)利要求15中的方法，其中所述的化學(xué)試劑為5-氮胞苷或5-氮脫氧胞嘧啶。
17.使權(quán)利要求1中的轉(zhuǎn)座子基因發(fā)生轉(zhuǎn)座的方法，包括培養(yǎng)水稻的花藥或用5-氮胞苷或5-氮脫氧胞嘧啶處理水稻的種子、葉或腋芽莖或由其產(chǎn)生的愈傷組織。
18.轉(zhuǎn)化的植物或其種子，其中的轉(zhuǎn)座子基因通過權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)的方法而發(fā)生轉(zhuǎn)座。
19.權(quán)利要求18的植物或其種子，其中所述的植物為水稻、大麥、小麥或玉米。
20.確定轉(zhuǎn)座子基因整合部位的方法，其包括以下步驟通過權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)的方法使權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)座子基因發(fā)生轉(zhuǎn)座，自前述步驟所獲得的植物中提取DNA，用在轉(zhuǎn)座子基因內(nèi)部沒有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化所述的DNA，連接由前述步驟所獲得的所述的DNA片段，對由前述步驟所獲得的所述DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測定由前述步驟所獲得的所述PCR產(chǎn)物的核苷酸序列，其中進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)將包含來自SEQ ID NO1的5’端的至少10個(gè)連續(xù)堿基的序列的寡聚核苷酸以及包含來自SEQ ID NO1的3’端至少10個(gè)連續(xù)堿基的序列的寡聚核苷酸、或包含與上述寡聚核苷酸互補(bǔ)的序列的寡聚核苷酸用作引物組。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻(Oryza sativa)非自主性轉(zhuǎn)座子基因，自主性轉(zhuǎn)座子基因，以及轉(zhuǎn)座酶基因，同時(shí)還涉及使轉(zhuǎn)座子基因發(fā)生轉(zhuǎn)座的方法以及通過轉(zhuǎn)座而轉(zhuǎn)化的植物。本發(fā)明人檢測了水稻基因組核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)了非自主性轉(zhuǎn)座子基因，自主性轉(zhuǎn)座子基因和轉(zhuǎn)座酶基因，并證實(shí)了轉(zhuǎn)導(dǎo)入這些基因的水稻栽培品種中轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座。
文檔編號C07K14/415GK1582335SQ02822088
公開日2005年2月16日 申請日期2002年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月8日
發(fā)明者菊池一浩, 平野博之, 和田正三 申請人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)