專利名稱：食物致敏原,檢測食物過敏原的方法和檢測誘導(dǎo)食物過敏原的食物的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種包含食物過敏性病人體內(nèi)IgE抗體能夠識別的多種天然和/或變性過敏原的混合物、通過使用該混合物免疫動物制備的抗體、利用所述抗體檢測食物過敏原和誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物的方法。本發(fā)明給對食物過敏的病人提供了安全性，這是因為本發(fā)明有助于理解食物過敏反應(yīng)的發(fā)生機制，開發(fā)和檢驗低過敏原性的食物，檢測食物、食物原料和諸如食物制作機器及過程之類的食物制作環(huán)境中的過敏原。
食物過敏反應(yīng)是易感個體攝取的食物中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的物質(zhì)(以下稱為食物過敏原)所導(dǎo)致的有害免疫反應(yīng)。食物過敏反應(yīng)能夠?qū)е缕ぱ?、哮喘、消化道障礙、過敏反應(yīng)性休克等。根據(jù)疾病發(fā)生的機制將過敏反應(yīng)分為I型至IV型。食物過敏反應(yīng)主要是I型過敏反應(yīng)，其中IgE抗體和攝入體內(nèi)的食物過敏原發(fā)生反應(yīng)。近年來，食物過敏病人的數(shù)目一直在上升。這種現(xiàn)象導(dǎo)致了醫(yī)學(xué)和食品工業(yè)領(lǐng)域中的嚴重問題。
為了預(yù)防這種危害，有必要通過標簽給消費者提供有關(guān)信息。FAO/WHO聯(lián)合食品標準委員會(食品法規(guī)聯(lián)合委員會(CodexAlimentarius Commision))已經(jīng)認識到食品標簽上注明包含已知為食物過敏原的八種原料中任何一種的必要性，并建議各成員國實施該標簽系統(tǒng)(1999年6月)。考慮到食物過敏原的嚴重性和經(jīng)常性，日本已頒布了24條標簽法規(guī)(2002年4月生效)。應(yīng)該注意的是這些規(guī)定不是要求注明過敏原性物質(zhì)或食物過敏原本身，而是要求注明包含過敏原性物質(zhì)和食物過敏原的食物，即誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物。
誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物包括蛋、奶、肉、魚、甲殼動物和軟體動物、谷類、豆類和堅果、水果、蔬菜、啤酒酵母或明膠。類似地，卵清蛋白、類卵粘蛋白、溶菌酶、酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、面筋、α-淀粉酶抑制劑等都是誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物。
另外，(1)不考慮現(xiàn)有的知識，必然還有許多其他食物和成分(食物過敏原)能夠?qū)е率澄镞^敏反應(yīng)；(2)誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物和成分(食物過敏原)是多樣的，對這些過敏原的反應(yīng)根據(jù)不同的食物過敏性病人而異；和(3)如后面的實施例中所述，在誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的單一食物中存在有多種已知和未知的過敏原。然而，使用傳統(tǒng)的方法不易于檢測如此眾多的誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物或食物過敏原。
食物通過加熱、冷凍、干燥、鹽化、發(fā)酵、酶處理等方法(以下稱為食物加工方法)制作，以改善和穩(wěn)定它們的可消化性、保存期限、口感、物理特性等。雖然食物加工方法影響蛋白質(zhì)，改變它們的分子結(jié)構(gòu)(如使蛋白質(zhì)變性)，但是很少論及這些食物加工方法是否能夠?qū)е率澄镞^敏原的形成。
本發(fā)明闡明了以下一些事實(1)一些加熱過的食物成分表現(xiàn)出變應(yīng)原性；(2)取決于該食物加熱與否，誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的單一食物中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的組分或表位可能發(fā)生改變。即，制備了a)未加熱過的蛋類抗原，b)通過對a)中的抗原加熱制作的加熱過的蛋類抗原，c)通過將從多個食物過敏性病人匯集(pooled)的血清(稱為匯集的病人血清)和a)(去除了(depleted)未加熱過的蛋類抗原的血清)相混合制備的血清，和d)通過將匯集的病人血清和b)(去除了加熱過的蛋類抗原的血清)相混合制備的血清。a)和c)或a)和d)之間，和b)和c)或b)和d)之間反應(yīng)的結(jié)果表明，去除了未加熱過的蛋類抗原的血清不能和未加熱過的蛋類抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，但能夠和加熱過的蛋類抗原發(fā)生反應(yīng)；類似地，去除了加熱過的蛋類抗原的血清不能和加熱過的蛋類抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，但能夠和未加熱過的蛋類抗原發(fā)生反應(yīng)?？傊?，食物過敏性病人攜帶有對加工和未加工食物都特異的IgE抗體，導(dǎo)致食物過敏反應(yīng)。但是目前為止，還沒有簡單的方法能夠檢測加工后食物中的過敏原或其成分。
篩選雞蛋、花生、酪蛋白、β-乳球蛋白、面筋中食物過敏原的方法能夠由商業(yè)途徑獲得(食品與開發(fā)，Vol.35，p10-11)。但是，所有這些方法或其中的一些具有以下一種或多種缺陷(1)這些方法不能總是檢測到食物過敏性病人對之敏感的抗原。也就是說，它們不能夠總是檢測到病人IgE抗體所能識別的物質(zhì)；(2)這些方法能夠檢測已知抗原，且每種方法僅能檢測到一種過敏原(單一的抗原)；(3)這些利用檢測單一抗原的抗體的方法不適用于含抑制性物質(zhì)的食物；(4)如下面的實施例中所示，這些利用檢測單一抗原的抗體的方法不能對誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物進行精確的定量；(5)這些利用檢測單一抗原的抗體的方法不適用于檢查不含抗原的誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物(如利用通過和卵白中的卵清蛋白相接觸制備的單一抗體的方法不適用于檢查蛋黃、蛋黃醬等。而已知食物過敏反應(yīng)由蛋黃所致)；(6)這些利用檢測單一抗原的抗體的方法不適用于檢查加工過的食物，這是因為它們不能夠檢測變性或分子修飾過的過敏原；和(7)抗天然和變性β-乳球蛋白、卵清蛋白和α-酪蛋白的單克隆抗體已有報道(Allergy，Vol.50，p309)。但如果食物加工方法去除或改變了其表位，則這些方法的用途就會減小，這是因為單克隆抗體僅能檢測食物過敏原分子中的單一表位。
雖然利用從對大米(日本專利公開2000-65820)、蛋和奶(日本肉類科學(xué)，vol.39，p166-169)過敏的病人體內(nèi)獲得的血清篩選食物過敏原的方法已有報道，并在醫(yī)院里得以應(yīng)用，但是不適用于檢查團體，也不適用于食品加工廠，這是因為這些方法需要從病人體內(nèi)獲得大量血清。雖然依賴于過敏反應(yīng)的食物抗原檢測法已有報道(FFI J.，No.180，p77-82)，但是復(fù)雜的方法學(xué)和實驗室動物飼養(yǎng)使得該方法在多數(shù)食品加工廠里不適用。雖然已經(jīng)建立了利用流式系統(tǒng)和酶標抗體和利用微電極的過敏原感受器的方法(日本食品工業(yè)，Vol.42，p53-56)，在這些方法投入實際應(yīng)用之前有許多問題尚待解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的完成是為了解決上述傳統(tǒng)方法中的問題。本發(fā)明的目的是提供(1)包含食物敏感性病人的IgE抗體能夠識別的多種已知和/或未知以及天然和/或變性食物過敏原的混合物(為方便起見，稱為本發(fā)明的第一項發(fā)明)，(2)通過用混合物免疫動物而制備的抗體(稱為本發(fā)明的第二項發(fā)明)，和(3)利用所述抗體檢測食物過敏原和誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物的方法(稱為本發(fā)明的第三項發(fā)明)。
附圖簡述

圖1所示為標準抗原和病人IgE抗體之間的反應(yīng)，以及標準抗原和本發(fā)明中的抗標準抗原抗體的抗體之間的反應(yīng)。
圖2所示為攜帶有對天然和變性蛋類蛋白特異的IgE抗體的病人血清。
實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的第一項發(fā)明可以這樣完成(1-i)從食物過敏性病人匯集的血清中分離IgE抗體，和(1-ii)利用親和層析和免疫沉淀之類的免疫學(xué)方法，從經(jīng)過或不經(jīng)過食物制作方法處理的食物或其成分(下面總稱為食物)中分離上述IgE抗體能夠識別的多種物質(zhì)(換句話說，食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的多種食物過敏原)。
本發(fā)明的第一項發(fā)明也可以這樣完成(2-i)按常規(guī)方法對食物成分進行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移到膜上，(2-ii)利用膜、匯集的病人血清、抗人IgE的偶聯(lián)抗體和顯色試劑進行Western印跡分析(換句話說，制作食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的多種食物過敏原的圖譜)，(2-iii)類似地，利用膜、按常規(guī)方法將食物成分免疫動物制備的動物血清、偶聯(lián)的抗動物IgG的抗體和顯色試劑進行Western印跡分析，然后(2-iv)比較二者的Western印跡分析圖譜，測定前者中不存在而后者中存在的條帶(換句話說，就是食物過敏性病人的IgE不能夠識別的多種物質(zhì))的分子大小，并(2-v)根據(jù)上述結(jié)果，通過凝膠過濾層析之類的傳統(tǒng)方法從食物成分中分離食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的多種食物過敏原。
本發(fā)明的第二項發(fā)明是抗食物過敏原的動物抗體(被稱為識別多種抗原的抗體)，該抗體通過將多種食物過敏原(包括加工和/或未加工的食物過敏原)免疫動物而制備，其中的食物過敏原通過上述的第一項發(fā)明制備，且能夠被食物過敏性病人的IgE抗體所識別。
本發(fā)明的第三項發(fā)明是檢測食物過敏原和誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物的方法，該方法的特征在于利用識別多種抗原的抗體。
上述的食品制作方法中熱處理的溫度范圍和食品加工方法的溫度范圍相同，優(yōu)選在40和250攝氏度之間，更優(yōu)選在60和120攝氏度之間。通過將原料抗原和在兩個至六個不同的溫度下加熱過的抗原相混合，制備抗原。食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的食物過敏原組分根據(jù)本發(fā)明的第一項發(fā)明從混合物制備，并用其接種動物。
如果檢測的目標僅限于加熱過的食物，則食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的食物過敏原組分用本發(fā)明的第一項發(fā)明從加熱過的食物制備，并用其接種動物。
舉例來說，接種的動物可以是兔、山羊、綿羊、大鼠、小鼠、豚鼠、馬、豬、雞等。在免疫期間，需要部分采血，測定抗食物過敏原抗體的滴度。本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。如下面所述的實施例所示，即使在一種食物過敏反應(yīng)誘導(dǎo)性食物中也存在食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的多種已知和未知食物過敏原。通過使用多種食物過敏原免動物，易于制備識別多種食物過敏原的多價抗體，即識別多種抗原的抗體。
作為針對食物過敏性病人IgE抗體能夠識別的食物過敏原的動物抗體，動物的抗血清可以直接使用。對于含食物過敏性病人IgE抗體不能識別的組分，進行吸收處理及傳統(tǒng)的IgG純化后使用抗血清。
本發(fā)明中檢測食物過敏原和誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物的方法無限制地適用于包含過敏原的食物。舉例來說，誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物的例子是蛋、奶、肉、魚、甲殼動物和軟體動物、谷類、豆類和堅果、水果、蔬菜、啤酒酵母和明膠。更具體地說，蛋的蛋白和蛋黃、奶及其奶酪、肉類的豬肉、牛肉、雞肉和羊肉，魚類的鯖魚、日本花鯖、沙丁魚、金槍魚、鮭魚、鱈魚、平魚和鮭魚魚子醬，甲殼動物和軟體動物類的蟹、小蝦、貽貝、魷魚、章魚、龍蝦和鮑魚，谷類的小麥、米、蕎麥、黑麥、大麥、燕麥、玉米、黍、谷子和稗，豆類和堅果類的大豆、花生、可可豆、豌豆、腰果、榛子、巴西堅果、杏仁、椰子果和核桃，水果類的蘋果、香蕉、橘、桃、獼猴桃、草莓、瓜、鱷梨、葡萄、芒果、梨、芝麻和芥菜，蔬菜類的西紅柿、蘿卜、土豆、菠菜、洋蔥、大蒜、竹筍、南瓜、地瓜、芹菜、歐芹、山藥、松蘑，含有它們的食物及其成分(如卵清蛋白、類卵粘蛋白、溶菌酶、酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、面筋、α-淀粉酶抑制劑)。這些食物可以通過加熱、冷凍、干燥、鹽化、發(fā)酵、酶加工等進行處理。
一般說來，食物過敏性病人的IgE抗體的識別可能性為50％或更大的過敏原被稱作主要過敏原，否則稱作次要過敏原。有些病人對主要過敏原不敏感，而對次要過敏原敏感。因此，篩選食物過敏原的方法應(yīng)該既檢測主要過敏原，又檢測次要過敏原。本發(fā)明的篩選方法能夠檢測食物過敏性病人能夠識別的天然和變性的多種過敏原。
為了制備符合這種要求的抗體，本發(fā)明作了研究并有以下發(fā)現(xiàn)。
即，按常規(guī)方法對食物成分進行SDS-PAGE分析，并將凝膠轉(zhuǎn)移到膜上(i)利用膜、匯集的病人血清、抗人IgE的偶聯(lián)抗體和顯色試劑進行Western印跡分析；(ii)類似地，利用膜、通過常規(guī)地將食物成分免疫動物制備的動物血清、偶聯(lián)的抗動物IgG的抗體和顯色試劑進行Western印跡分析；(iii)比較二者的Western印跡分析圖譜，有以下發(fā)現(xiàn)(1)存在有在兩塊膜上都得以染色的條帶，(2)存在有在前者未得以染色，而在后者得以染色的條帶(換句話說，就是食物過敏性病人的IgE能夠識別的多種非過敏原性物質(zhì))，和(3)和前者染色條帶相比，僅后者染色條帶分布在更大和/或更小分子量位置上；(iv)根據(jù)上述結(jié)果，通過凝膠過濾層析方法從食物成分中分離食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的多種食物過敏性組分，并用之接種動物，制備抗多種食物過敏原的抗體?？梢詫ν?、山羊、綿羊、大鼠、小鼠、豚鼠、馬、豬和雞等恒溫動物進行接種。可以采用本技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員所掌握的任何一種接種方法。
如上所述制備的抗體可在本發(fā)明的食物過敏原檢測方法中使用?？贵w可以固定在微量滴定板、PVDF膜、硝酸纖維素膜、層析條、試管、小珠、尼龍膜等上面，應(yīng)用在酶免分析、免疫印跡分析、點印跡分析、免疫層析和抗體芯片等免疫學(xué)方法中。
如上所述，本發(fā)明的食物過敏原檢測方法旨在檢測食物和食品制作機器和加工過程之類的環(huán)境中的多種食物過敏原。優(yōu)選使用從食物獲得的液體提取物進行分析。雖然提取介質(zhì)通常是水、磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、酒精等，但并不局限于這些，只要過敏原能夠得以提取即可。為了提高過敏原從食物中的提取效率，可以根據(jù)需要加入蛋白質(zhì)變性劑(如SDS或脲)、含有SH的抗氧化劑(如2-巰基乙醇)等?？梢酝ㄟ^擦拭(用拭子等拭抹)環(huán)境獲取的液體和用洗瓶捕獲的氣體進行測定，確定在機器或加工過程等食品制作環(huán)境中存在的多種過敏原。
只要本發(fā)明中食物過敏原檢測方法的原理是酶免分析、免疫印跡分析和熒光多免疫珠法等免疫學(xué)方法即可，并不局限于一種特定的方法。舉例來說，三明治ELISA、競爭法、直接法等都是酶免分析方法。如果對抗體加以標記，可以使用酶(如過氧化物酶、堿性磷酸酶和β-半乳糖苷酶)、熒光物質(zhì)(如異硫氰酸熒光素)、生物發(fā)光物質(zhì)(如熒光素-熒光素酶)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)(如發(fā)光氨，吖啶衍生物和金剛烷衍生物)、生物素、抗生物素蛋白、膠體金、放射活性物質(zhì)(如32P)等。
下面列舉本發(fā)明檢測方法的實例，說明三明治ELISA、競爭法和直接法程序的要點。
為了實施三明治ELISA，制備本發(fā)明中識別多種過敏原的標記抗體(識別多種抗原的抗體)。通過吸附或化學(xué)結(jié)合將識別本發(fā)明中多種抗體的非標記抗體固定在ELISA板上。然后，使用不干擾反應(yīng)體系的蛋白質(zhì)如明膠和兔血清白蛋白封閉板上未固定有抗體的區(qū)域。將從食物、食物成分或食物制作環(huán)境中獲得的提取物(此后稱為樣品)或標準抗原加到板上，進行第一次抗原-抗體反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，洗板。為了進行第二次抗原-抗體反應(yīng)，往板上加入上述的標記抗體，固定在板上的抗體能夠捕捉過敏原。洗板，去除過量的標記抗體，加入檢測試劑(如過氧化物酶的情況下加入1，2-苯二胺和H2O2，堿性磷酸酶的情況下加入對-硝基苯磷酸鹽)。通過檢測標記物和檢測試劑之間反應(yīng)物的量對過敏原進行檢測或定量。
改變往ELISA板上加入的標準抗原或誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物(如蛋和奶)的量來繪制標準曲線。利用標準曲線對食物過敏原或誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物進行定量。如果定量的值是1ppm或更多，則樣品可能是誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物。
由于利用檢測單一抗原的抗體的方法必須將通過檢測單一抗原的抗體得到的值轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的食物的含量，這樣會產(chǎn)生定量誤差。
單一抗原以類卵粘蛋白和卵清蛋白為例，整個蛋中類卵粘蛋白和卵清蛋白的濃度分別約為4％和2％。然而，蛋黃既不含類卵粘蛋白，也不含卵清蛋白。相應(yīng)地，(1)僅檢測類卵粘蛋白或卵清蛋白的方法不適用于檢測蛋黃蛋白質(zhì)；(2)如果通過整蛋繪制的標準曲線用于檢測蛋白，則進行兩次或更多次定量，而非一次；和(3)如果實際值超出了定量范圍，則確定為極高的定量值。
類似地，由于酪蛋白和β-乳球蛋白在全部奶類蛋白中的含量分別約為80％和10％，因此存在一個問題，就是識別單一抗原的抗體不能對利用酪蛋白鈉、乳清蛋白等進行強化加工的奶類進行精確定量，本發(fā)明中識別多種抗原的抗體就不存在或較少存在這種問題。
對于競爭法，將定量的標準抗原直接固定在用非反應(yīng)性蛋白封閉的固相上。然后，將識別過敏原的酶聯(lián)抗體和樣品同時加到板上。將板靜置一定時間，然后洗板，去除未結(jié)合的物質(zhì)。往板上加入顯色底物，隨后終止反應(yīng)。對固定的過敏原和經(jīng)樣品預(yù)處理的酶聯(lián)抗體之間的反應(yīng)進行檢測。
對于直接法，使樣品直接吸附在用非反應(yīng)性蛋白封閉的固相上，使樣品和識別過敏原的酶聯(lián)抗體反應(yīng)。隨后，應(yīng)用上述的同樣步驟檢測樣品中的過敏原。
對于上述的三明治ELISA、競爭法和直接法中的任何一種方法，都可以使用熒光、生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光底物進行顯色。根據(jù)該測定的目的、樣品性質(zhì)、原理等，本技術(shù)領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可以對本發(fā)明方法的其他條件作相應(yīng)變動。
本發(fā)明中檢測食物過敏原的方法能夠靈敏地檢測食物和食物原料的提取物中0.1或1.0ng/ml或更多的過敏原。
工業(yè)適用性包含食物過敏性病人IgE抗體能夠識別的多種天然和/或變性過敏原和本發(fā)明抗體的混合物有助于理解食物過敏反應(yīng)發(fā)生的機制，開發(fā)降低食物過敏原變應(yīng)原性的技術(shù)。本發(fā)明中檢測食物過敏原的方法有助于驗證低過敏反應(yīng)性技術(shù)的實用性，檢測食物中的食物過敏原、誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物和諸如食物制作機器和方法之類的食物制作環(huán)境。相應(yīng)地，本發(fā)明有助于為保障食物過敏性病人的安全性，解決最近食物過敏性病人的增加引發(fā)的醫(yī)療和工業(yè)問題。
實施例下面的實施例更具體地解釋了本發(fā)明，但對本發(fā)明的范圍不作限制。本說明書中的縮略詞是本技術(shù)領(lǐng)域中常用的。
實施例1(制備各種食物的標準抗原)(1)雞蛋、鵪鶉蛋和鴨蛋1kg雞蛋去殼，勻漿，凍干，研細，制備標準雞蛋抗原。10-g抗原懸于10倍體積的pH7.0磷酸鹽緩沖液(以下縮寫為PBS)后，分在5個試管中，不加熱或分別在60、80、100、120攝氏度加熱30分鐘。然后，混合在一起，混勻制備樣品。以類似方法制備鵪鶉蛋和鴨蛋的樣品。
(2)牛奶1L奶在低溫下攪拌，使之固化，沉積奶類脂肪，并通過能吸收的棉花將之過濾。該程序重復(fù)3次，將濾液凍干，研細，制備標準牛奶抗原。類似地，如(1)中所述制備樣品。
(3)小麥和大米室溫下，1kg小麥粉用5倍量的加有4M尿素的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.6)提取2小時，并同時加以攪拌，然后離心。對上清液進行透析，凍干，然后研細，制備標準小麥抗原。類似地，如(1)中所述制備樣品。類似地，從大米粉中制備樣品。
(4)蕎麥室溫下，1kg蕎麥粉用5倍量的加有1％NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.4)提取2小時，并同時加以攪拌，然后離心。對上清液進行透析，凍干，然后研細，制備標準蕎麥抗原。類似地，如(1)中所述制備樣品。
(5)花生1kg花生研細，用5倍量的正己烷脫脂2小時，并同時加以攪拌。將該程序重復(fù)3次后，去除正己烷，室溫下將制備物用5倍量的加有1％NaCl的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.4)提取2小時，并同時加以攪拌，然后離心。對上清液進行透析，凍干，然后研細，制備標準花生抗原。類似地，如(1)中所述制備樣品。
(6)大豆如(5)中所述制備大豆標準抗原。類似地，如(1)中所述制備樣品。
實施例2(各種純化的食物過敏原)(1)純化的雞蛋過敏原將雞蛋中的主要過敏原之一——卵清蛋白懸于10倍體積的pH7.0磷酸鹽緩沖液(以下縮寫為PBS)后，分在5個試管中，不加熱或分別在60、80、100、120攝氏度加熱30分鐘。然后，混合在一起，混勻制備樣品。以類似方法制備類卵粘蛋白樣品。已知卵清蛋白和類卵粘蛋白是位于蛋清中的蛋白質(zhì)。
(2)純化的牛奶過敏原如實施例2(1)所述類似方法制備酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白樣品。已知β-乳球蛋白和α-乳清蛋白是位于奶類乳清蛋白中的蛋白質(zhì)。
實施例3(抗體的制備)(1)抗各種標準食物抗原的兔抗體的制備實施例1中制備的各種樣品用弗氏完全佐劑(用于第一次接種)和非完全佐劑(用于第二次及其后的接種)進行乳化，接種日本白兔4至6次。在接種期間，部分采血，確定針對抗原的抗體的產(chǎn)生，然后采集全部血液。這樣，抗體即得以制備。
(2)抗各種純化食物抗原的抗體的制備類似地，如上所述制備抗各種純化食物抗原的抗體。
實施例4(用免疫印跡法檢測各種食物過敏原)(1)匯集的病人血清和兔抗體將20例RAST(放射變應(yīng)原吸附試驗)評分為2或以上(特異性IgE抗體＞0.7UA/ml)的病人體內(nèi)獲得的、抗蛋、奶或小麥的血清等量相混合，制備匯集的血清?？沟?、奶和小麥的兔抗體是實施例3(1)中制備的。
(2)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上述的標準蛋抗原、奶抗原和小麥抗原和2-巰基乙醇一起加熱3分鐘，在濃度為10％的微型平板膠上進行電泳。凝膠電轉(zhuǎn)移至PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上。使用膠體金染色試劑盒(BioRad)檢測部分膜上的蛋白質(zhì)。
(3)免疫染色用1％人血清白蛋白(HSA)對上述的PVDF膜進行封閉。然后，將膜用包含0.05％吐溫20的PBS(PBST)洗，和匯集的病人血清(100倍稀釋液)或兔抗體(1000倍稀釋液)于室溫下反應(yīng)2小時。洗膜，和二級抗體，即堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗人IgE-ε鏈山羊抗體(2500倍稀釋)或堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗兔IgG抗體(4000倍稀釋液)于室溫下反應(yīng)1小時。用PBST洗膜，和化學(xué)發(fā)光底物4-甲基-4(3-磷酸苯基)螺[1，2-二氧環(huán)烷-3，2-金剛烷]鈉鹽于室溫下反應(yīng)30分鐘，使之在感光片上曝光，檢測堿性磷酸酶的去磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生的光子。結(jié)果如圖1所示。
如圖1所示，匯集的病人血清產(chǎn)生了多條帶(圖1的泳道1、4和7)和存在于各食物中病人IgE能夠識別的多種過敏原。
然而，兔抗體檢測到了病人IgE能夠識別的食物過敏原(圖1的泳道2、5和8)。
兩種血清都能夠識別的物質(zhì)如下蛋中的卵清蛋白、類卵粘蛋白、溶菌酶和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白；奶中的酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；小麥中的glyadine和α-淀粉酶抑制劑；蕎麥的132-kDa、84-kDa、27-kDa和11-kDa物質(zhì)；花生的107-kDa、72-kDa、35-kDa和28-kDa物質(zhì)。
另外，兔抗體不能檢測病人IgE不能識別的非食物性過敏原。
(4)過敏原的濃縮和分離不能識別過敏原之外物質(zhì)的抗體如以下方法制備將用匯集的病人血清染色的條帶分子量分布和用動物抗體染色的條帶分子量分布相比較，發(fā)現(xiàn)與前者相比后者中有些條帶分布在更高或更低分子量位置(圖1)。通過凝膠過濾層析，從標準抗原中收集和食物過敏性病人IgE能夠識別的食物過敏原分子量相當?shù)慕M分(以下稱為過敏原組分)。樣品如實施例1所述制備，并將之免疫動物，制備抗過敏原組分的抗體。利用抗體如上所述進行Western印跡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗體通常識別收集的病人血清能夠識別的食物抗原(圖1的泳道3、6和9)。
通過免疫沉淀、利用病人IgE抗體的親和層析和離子交換層析，完成這些過敏原的濃縮和分離。
實施例5(點印跡法檢測主要過敏原和其加熱過的制備物)在PBS中浸泡的PVDF膜置于點印跡裝置后，使純化的主要過敏原(卵清蛋白、類卵粘蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶、酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、α-淀粉酶抑制劑和glyadine)和其加熱過的制備物吸附在膜上，用添加有3％RSA的TBS封閉，并用TBST洗膜。抗蛋-過敏原組分、奶過敏原組分和小麥過敏原組分的抗體(稀釋2000倍)加到膜上，室溫下反應(yīng)1小時。然后，將生物素偶聯(lián)的抗兔IgG綿羊抗體和HRP偶聯(lián)的抗生物素蛋白(4000倍)加到膜上，洗膜，將膜和化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，并通過感光片檢測產(chǎn)生的光子。
上述的抗體檢測到了卵清蛋白、類卵粘蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶、酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、α-淀粉酶抑制劑和glyadine等主要過敏原。這些抗體還檢測到了上述純化敏原的加熱制備物。
實施例6(通過三明治ELISA檢測蛋、奶和小麥過敏原)(1)抗體下面實驗程序使用實施例4(4)中制備的抗蛋、奶和小麥中過敏原組分的抗體，和根據(jù)傳統(tǒng)方法制備的偶聯(lián)有生物素的抗體。
(2)包被和封閉微孔板上的抗體
100μl上述抗體(10μg/ml)分別加到ELISA板(Nunc)的各孔中，4攝氏度靜置過夜，洗板(添加有150mM-NaCl和0.05％吐溫20的20mM Tris-HCl緩沖液，pH7.4)，25攝氏度下用0.1％RSA(Sigma)封閉1小時。
(3)蛋、奶及小麥過敏原的檢測去除孔中的封閉溶液，每孔各加95μl稀釋液(添加有0.1％RSA、150mM NaCl和0.05％吐溫20的20mM Tris-HCl緩沖液，pH7.4)和5μl各食物的PBS提取物，25攝氏度下靜置2小時。類似地，每孔各加實施例1中所述的5μl蛋、奶和小麥標準抗原的懸液，25攝氏度下靜置2小時。用300μl洗液洗5次后，每孔各加100μl生物素偶聯(lián)的抗體(10000倍稀釋液)，25攝氏度下靜置1h。然后每孔各加100μl過氧化物酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白(2500倍稀釋液)，25攝氏度下靜置30分鐘。洗板后，每孔各加100μl 3，3’，5，5’-四聯(lián)苯胺溶液，25攝氏度下避光反應(yīng)30分鐘。通過微孔板讀數(shù)儀讀取各孔的光密度值(檢測波長450nm，參照波長630nm)。
結(jié)果如表1所示。表1表明各種食物提取物中的蛋、奶和小麥過敏原能夠得以檢測。
表1.檢測各種食物中的蛋、奶和小麥過敏原食物 抗蛋過敏原抗奶過敏原抗小麥過敏原組分的抗體組分的抗體組分的抗體煮好的蛋 ○××奶 × ○ ×面包(實驗室制作的) × × ○布丁(實驗室中使用蛋 ○○×和奶制作)法式吐司(實驗室中使 ○○○用蛋、奶和小麥制作)○檢測到；×未檢測到(下列的表相同)實施例7(用三明治ELISA方法評價食物過敏原檢測試劑盒的基本特性)(1)標準抗原的稀釋試驗根據(jù)實施例6，對實施例1中制備的蛋、奶和小麥標準過敏原進行定量。在作圖紙上對這些結(jié)果作圖，繪制大致通過原點的標準曲線。
(2)同批分析之間的再現(xiàn)性評價根據(jù)上述方法，制備位于檢測范圍內(nèi)的5個不同濃度的蛋標準過敏原樣品A和樣品E，并同時進行5組分析。如表2所示，CV值低于5％。因此，確證了同批重復(fù)性。
表2.用三明治ELISA方法對蛋標準過敏原檢測檢測進行同批分析之間的重現(xiàn)性評價1234 5Mean SD CV(％)A1.1651.0791.0681.075 1.0641.0900.0423.87B0.7560.7110.6990.689 0.6930.7100.0273.84C0.5440.5050.5000.497 0.5070.5110.0193.74D0.2330.2220.2360.222 0.2270.2280.0062.79E0.1750.1650.1790.173 0.1700.1720.0053.06(3)評價日間(day-to-day)分析的再現(xiàn)性根據(jù)上述方法，制備位于檢測范圍內(nèi)的5個不同濃度的奶標準過敏原樣品A和樣品E，并連續(xù)5天進行分析。如表2所示，CV值低于5％。因此，確證了日間重復(fù)性。
表3.用三明治ELISA方法對奶標準過敏原檢測檢測進行日間分析之間的再現(xiàn)性評價1 2 345 MeanSD CV(％)A2.356 2.387 2.3462.3212.241 2.330 0.0552.37B1.353 1.306 1.2741.2461.254 1.287 0.0443.40C0.956 0.949 0.9280.9210.899 0.931 0.0232.45D0.295 0.292 0.2750.2810.278 0.284 0.0093.10E0.195 0.183 0.1860.1840.182 0.186 0.0052.82
這些結(jié)果表明本方法能夠快速、穩(wěn)定地檢測分布在食物和其成分中的多種食物過敏原。經(jīng)證實，該方法能夠檢測0.5ng/ml或更多的食物過敏原或包含食物過敏原的食物。
實施例8(食物過敏性病人攜帶有抗天然和加熱食物過敏原的IgE抗體)以蛋過敏原為例，證實了食物過敏性病人攜帶有抗天然和加熱食物過敏原的IgE抗體。將整個蛋(未加熱過的蛋抗原)溶解于PBS(1.0％，w/v)中。一半體積的溶液于120攝氏度加熱30分鐘(加熱過的蛋抗原)。10倍稀釋的各溶液加到ELISA板上，每孔各100μl。包被，洗板，用添加有1％HAS的PBS封閉，并再次洗板。由此制備包被有天然蛋抗原的板和包被有加熱過的蛋抗原的板。
然后，天然蛋抗原或加熱過的蛋抗原(1、5、50、100、500和1000ng/ml)加到實施例4(1)(1000倍稀釋液)中所述匯集的病人血清中，37攝氏度下反應(yīng)2小時，加以離心。由此制備兩種類型的血清。前者和后者分別稱為去除天然蛋抗原的血清和去除加熱過的蛋抗原的血清。
然后，往包被有天然蛋抗原的板和包被有加熱過的蛋抗原的板中加入去除天然蛋抗原的血清和去除加熱過的蛋抗原的血清，每孔各100μl，37攝氏度下靜置2小時，用PBST洗板，往板中加入生物素偶聯(lián)的抗人IgE-ε山羊抗體(2500倍稀釋液)，每孔各100μl，37攝氏度下靜置1小時，用PBST洗板。加入堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白(37攝氏度下靜置30分鐘)和發(fā)光底物，讀取發(fā)光程度(發(fā)光計CT-9000D，Diatron)。結(jié)果如圖2所示。
如圖2所示，證實了去除了加熱過的蛋抗原的血清(圖2中表示為○)能夠特異地和天然蛋抗原發(fā)生反應(yīng)(圖2中左圖)，但是該血清不能和加熱過的抗原發(fā)生反應(yīng)(圖2中右圖)。而去除了天然蛋抗原的血清(圖2中表示為●)能夠特異地和加熱過的蛋抗原發(fā)生反應(yīng)(圖2中右圖)，但是該血清不能和天然抗原發(fā)生反應(yīng)(圖2中左圖)。
這些結(jié)果證明了食物過敏性病人攜帶有特異性識別天然和加熱蛋的IgE抗體。
因此，檢測食物過敏原的方法能夠檢測加熱過的和天然的過敏原。
實施例9(使用通過接種加熱抗體制備的抗體增強ELISA強度)即使對實施例4所述的抗過敏原組分的抗體進行了測定，通過抗體和加熱過的樣品之間的反應(yīng)獲得的ELISA強度(光強度，OD值)可能比抗體和天然樣品之間的反應(yīng)低。這可能依賴于(1)從加熱過的樣品中提取的蛋白質(zhì)濃度比從天然樣品中提取的蛋白質(zhì)濃度低；和(2)即使蛋白質(zhì)濃度調(diào)成一致，加熱過的樣品和抗體之間的反應(yīng)性也比天然樣品和抗體之間的反應(yīng)性低。因此，研究制備反應(yīng)性更強的抗體。
實施例4(1)中所述的蛋過敏原組分于120攝氏度高壓處理30分鐘，冷卻，用加有4M脲的PBS勻漿，離心。上清液加以冷凍干燥，研細制備抗原，并如實施例3(1)所述用它制備兔抗體(此后稱為抗高壓處理蛋抗原的抗體)。根據(jù)實施例6所述方法，抗體和實施例8中包被有天然蛋抗原的板和包被有加熱過的蛋抗原的板進行反應(yīng)。
結(jié)果如表4所示。表4表明利用通過免疫高壓處理的食物過敏原制備的抗體檢測到了天然和加熱過的蛋抗原，且ELISA強度幾乎相同。因此上述的問題得到了解決。
表4.利用通過免疫加熱過的抗體制備的抗體增強ELISA強度抗體 ELISA強度包被有天然蛋抗原的 包被有加熱過的蛋抗板 原的板抗蛋過敏原組分的 100 36抗體抗高壓處理的蛋抗 100 118原的抗體抗蛋過敏原組分的抗體和標準蛋抗原板之間的反應(yīng)獲得的ELISA強度(OD值)表示為100。
實施例10(測定食物過敏原和誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物-1)驗證本發(fā)明中識別多種抗原的抗體(實施例3所述抗體)和實施例7所述方法是否能夠檢測含有食物過敏原的食物。利用實施例7所述繪制的標準曲線，進行定量，計算量化指數(shù)(測定值/實際值×100)。從蛋黃、蛋清、蛋黃醬和整蛋醬獲得的結(jié)果如表5所示。
測定利用蛋清中的單一抗原制備的抗體時，表5說明(1)不能夠險測到蛋黃，而能夠檢測到蛋清，和(2)從標準曲線獲得的標準蛋抗原的測量值是實際值的2至60倍。
測定本發(fā)明中識別多種抗原的抗標準蛋抗原的抗體時，表5說明(3)能夠檢測到蛋黃和蛋清，和(4)標準蛋抗原的測量值和實際值幾乎相等。從這些結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中識別多種抗原的抗標準蛋抗原的抗體能夠檢測蛋類中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的事物或蛋類加工食品中的成分，并加以定量。
表5.利用各種抗體對蛋和蛋產(chǎn)品進行檢測和/或定量的可能性樣品測定識別多種抗原的 識別單一抗原的 識別單一抗原的抗體(抗標準蛋 抗體(抗類卵粘 抗體(抗卵白蛋抗原的抗體) 蛋白的抗體) 白的抗體)蛋黃檢測的可○ × ×能性量化指數(shù)74-106蛋清檢測的可○ ○ ○能性量化指數(shù)105-170 240-310 6,330-13,150蛋黃檢測的可○ × ×醬 能性整蛋檢測的可○ ○ ○醬 能性實施例11(測定食物過敏原和誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物-2)如實施例10所述檢驗乳清、酪蛋白、乳鐵蛋白和酪蛋白水解物。結(jié)果如表6所示。
表6顯示(1)本發(fā)明中識別多種抗原的抗標準奶抗原的抗體能夠檢測誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的奶和其成分，并加以定量；但是(2)通過免疫乳清中的物質(zhì)制備的識別單一抗原的抗體不能對它們加以定量。表6中符號△表示能夠加以定量，但是量化指數(shù)低于表5。
表6.利用各種抗體對標準奶抗原進行檢測和/或定量的可能性樣品測定 識別多種抗原的 識別單一抗原的 識別單一抗原的抗體(抗標準奶 抗體(抗酪蛋白 抗體(抗β-乳球抗原的抗體) 的抗體) 蛋白的抗體)乳清檢測的可 ○ × ○能性量化指數(shù) 160-230 320-1,080酪蛋檢測的可 ○ ○ ×白 能性量化指數(shù) 38-47 170-180乳鐵檢測的可 ○ △ ×蛋白能性酪蛋檢測的可 ○ × △白水能性解物
權(quán)利要求
1.一種混合物，它包含食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的多種天然和/或變性食物過敏原。
2.一種抗體，它是利用權(quán)利要求1中的食物過敏原混合物免疫動物所制備的。
3.利用權(quán)利要求2的抗體檢測食物過敏原的方法。
4.利用權(quán)利要求2的抗體檢測誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物的方法。
5.權(quán)利要求4中的誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物，其中食物是蛋、奶、肉、魚、甲殼動物和軟體動物、谷物、豆類和堅果、水果、蔬菜、啤酒酵母、明膠或包含其中一項或多項的食物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測食物過敏原的方法、抗體和用于制備該抗體的抗原。本發(fā)明的抗原是包含食物過敏性病人的IgE能夠識別的多種未變性和/或變性的食物過敏原的混合物。本發(fā)明的抗體通過利用上述的抗原接種動物制備。本發(fā)明中檢測食物過敏原的方法涉及到上述抗體。該方法能夠?qū)κ澄镞^敏原和誘導(dǎo)食物過敏反應(yīng)的食物進行檢測，因此有助于確保食物過敏性病人的安全性。
文檔編號C07K16/00GK1592754SQ0282209
公開日2005年3月9日 申請日期2002年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月5日
發(fā)明者森松文毅, 高畑能久, 松本貴之, 宮澤伊都美, 清水宗茂 申請人:日本肉類批發(fā)商株式會社