專利名稱：造血干細(xì)胞的增殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)增殖造血干細(xì)胞的方法。更精確地說，本發(fā)明涉及一種在M-CSF存在的情況下培養(yǎng)Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞的方法，一種通過在M-CSF存在的情況下培養(yǎng)Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞來增殖造血干細(xì)胞的方法，一種通過所述增殖方法獲得的造血干細(xì)胞群，一種含有M-CSF的用于培養(yǎng)Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞的試劑盒，以及一種含有M-CSF的用于增殖造血干細(xì)胞的試劑。
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞被定義為既有產(chǎn)生所有血細(xì)胞如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、T和B淋巴細(xì)胞(多能性)的能力，又有更新自身的能力(自我更新能力)的細(xì)胞。在骨髓移植中，被移植骨髓中的造血干細(xì)胞起著主要作用，因而骨髓移殖又可稱為造血干細(xì)胞移植。目前，骨髓移殖已經(jīng)成為許多疑難病癥如各種血液病、癌癥、免疫缺陷、先天性代謝障礙的根本療法。然而在這類移植中，供體的人白細(xì)胞抗原(HLA)必須和受體的相同，并且供體短缺現(xiàn)在是公眾關(guān)注的一個目標(biāo)。
目前外周血經(jīng)常用作造血干細(xì)胞源以代替骨髓。只有少量包括造血干細(xì)胞在內(nèi)的CD-34陽性細(xì)胞可能存在于健康個體的外周血中，然而這類細(xì)胞中很多可以在給骨髓持續(xù)施用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)時從骨髓轉(zhuǎn)移到外周血中。利用血液成分分離器，可以在這個階段中從外周血中采集大量外周造血干細(xì)胞/造句的前體細(xì)胞，并可用于移植。但是，在造血干細(xì)胞流動至外周血的效率以及供體的安全性上存在一些問題有待解決。
作為造血干細(xì)胞的另一種來源，可以使用臍帶血進行臍帶血干細(xì)胞的移植。但是，由于臍帶血中造血干細(xì)胞數(shù)量少，這種臍帶血干細(xì)胞移植目前局限于兒童。
在這種背景下，迄今已經(jīng)嘗試了一系列的方法以期獲得一種體外增殖造血干細(xì)胞的方法。例如，為了增殖造血干細(xì)胞，已有研究報告顯示了在有細(xì)胞因子如干細(xì)胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、白介素-11(IL-11)、G-CSF、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、類fms酪氨酸激酶(Flt-3)配體(FL)、促血小板生成素(TPO)的情況下，細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果。當(dāng)與這些細(xì)胞因子或任何其他的生長因子一起培養(yǎng)時，造血前體細(xì)胞以及由它們分化而得的細(xì)胞可以得到高度增殖，但以此模式培養(yǎng)的造血干細(xì)胞的增殖率僅有少許幾倍，沒有達(dá)到令人滿意的水平(Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，13648-13653，1997；Matsunaga等，Blood，92，452-461，1998；Bryder等，Blood，96，1748-1755，2000)。造血前體細(xì)胞通常被定義為具有體外集落形成能力的細(xì)胞。但是，由于不進行自我更新并且不能長期產(chǎn)生血細(xì)胞，造血前體細(xì)胞作為移植的血細(xì)胞源是沒有價值的。
此外，一種與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)以增殖造血干細(xì)胞的技術(shù)已被嘗試，但是在這種技術(shù)中細(xì)胞的增殖率依然只有少許幾倍(Moore等，Blood，89，4337-4347，1997)。
另一方面，如果可以直接把細(xì)胞因子、生長因子或其他類似物給活體施用從而顯著增殖活體內(nèi)的造血干細(xì)胞，那么例如臍帶血或其他只含有少量造血干細(xì)胞的類似物則有可能用作移植源。但是，截止目前，沒有人報道過與此有關(guān)的成功實驗。
本發(fā)明的一個目的是通過在體外用細(xì)胞因子或生長因子提高造血干細(xì)胞的增殖水平，實現(xiàn)體外增殖的造血干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用，而截止目前其增殖水平一直是不足的。另一個目的是通過細(xì)胞因子對活體的直接施用進行造血干細(xì)胞的體內(nèi)增殖。

發(fā)明內(nèi)容
作為為解決上述問題而進行的廣泛調(diào)查的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對譜系標(biāo)志(Lin)呈陰性或弱陽性且可以包含造血干細(xì)胞的細(xì)胞受到巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)或任何其他細(xì)胞因子的刺激時，造血干細(xì)胞的增殖水平可以得到提高，由此得以完成本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明涉及一種在有巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的情況下培養(yǎng)Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞的方法。
本發(fā)明也涉及在有巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的情況下通過培養(yǎng)Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞來增殖造血干細(xì)胞的方法。
另外，本發(fā)明涉及由上述方法獲得的造血干細(xì)胞群。
本發(fā)明也涉及包含巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的用于培養(yǎng)Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞的試劑盒。
另外，本發(fā)明涉及包含巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的用于提高造血干細(xì)胞增殖的試劑。
發(fā)明實施方式本發(fā)明的培養(yǎng)方法和增殖方法其特征在于在有M-CSF的情況下培養(yǎng)Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞。本發(fā)明人在有M-CSF的情況下培養(yǎng)Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞以研究造血干細(xì)胞能否得到增殖。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)有M-CSF的細(xì)胞培養(yǎng)與缺少M-CSF的細(xì)胞培養(yǎng)相比，產(chǎn)生了造血干細(xì)胞的顯著增殖。因此，本發(fā)明的培養(yǎng)方法可用于造血干細(xì)胞的增殖。另外，由本發(fā)明的增殖方法得到的造血干細(xì)胞群可以用作造血干細(xì)胞的移植源。
優(yōu)選地，Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞在一個用作Lin標(biāo)引的細(xì)胞表面標(biāo)志的基礎(chǔ)上進行采集。Lin意為“譜系標(biāo)志”，它包括例如紅細(xì)胞標(biāo)志Ter119、粒細(xì)胞標(biāo)志Gr-1、單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞標(biāo)志Mac-1(CD11b)以及T細(xì)胞標(biāo)志Ly1。已知造血干細(xì)胞存在于Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞部分中。
Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞可以通過用標(biāo)記過的能識別Lin的抗體處理骨髓細(xì)胞的單細(xì)胞懸液并利用細(xì)胞分選器如流式細(xì)胞儀去除標(biāo)記的細(xì)胞來采集。對于小鼠細(xì)胞，例如，經(jīng)過StemSepTM(StmeCellTechnologies Inc.)處理過的細(xì)胞廣泛用作Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞，所述StemSepTM包含一個用于制備造血前體細(xì)胞的抗體混合物。在實施例中，通過使用StemSepTM獲得的細(xì)胞占未處理細(xì)胞的0.5％。
由此獲得的細(xì)胞在有M-CSF的情況進行培養(yǎng)，對培養(yǎng)條件(包括培養(yǎng)基、培養(yǎng)周期和培養(yǎng)板)沒有特別限定，但適當(dāng)?shù)剡M行選擇以便所述細(xì)胞可以在所選條件下保持良好狀態(tài)。在實施例中，例如，將準(zhǔn)備的Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞以4×104細(xì)胞/孔的量接種到一個6孔的組織培養(yǎng)用微板上，用含有5％FBS和10μg/ml慶大霉素(Sigma)的RPMI1640(Gibco-BRL)在5％CO2、37℃下培養(yǎng)6天。但是，本發(fā)明并不局限于此。
M-CSF可以從例如Pepro Tech Inc.購買，但也可以通過將M-CSF編碼基因?qū)牒线m的蛋白表達(dá)載體以任何普通的遺傳工程技術(shù)產(chǎn)生。對在此所用的M-CSF沒有特別限定。最好根據(jù)此處所用動物細(xì)胞來選擇M-CSF，但得自其他任何不同物種的M-CSF在可接受的活性范圍內(nèi)都可以使用。
更加優(yōu)選地，將適合的細(xì)胞因子和生長因子加入到正在培養(yǎng)的細(xì)胞中。加入的細(xì)胞因子和生長因子可以是任何已報道對造血干細(xì)胞的維持、生長促進和分化誘導(dǎo)有效的種類(Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，13648-13653，1997；Matsunaga等，Blood，92，452-461，1998；Bryder等，Blood，96，1748-1755，2000)，比如SCF、IL-3、IL-6、IL-11、G-CSF、GM-CSF、FLT、TPO、白血病抑制因子(LIF)、堿性的成纖維細(xì)胞生長因子(堿性的FGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子(IGF)，但本發(fā)明并不局限于上述因子。
如上所述，造血干細(xì)胞被定義為既有產(chǎn)生所有血細(xì)胞(多能性)的能力，又有自我更新能力(自我更新能力)的細(xì)胞。因此，優(yōu)選一種能夠確認(rèn)細(xì)胞的這兩種能力的方法，以確證造血干細(xì)胞是否能夠得到增殖。例如，使用小鼠細(xì)胞時，它們可以通過長期的增長分析進行確認(rèn)。這一方法將在實施例部分更詳細(xì)地進行描述。簡單地說，將包含造血干細(xì)胞的細(xì)胞移植到一動物體內(nèi)，對該動物進行監(jiān)控以確證來源于干細(xì)胞的血細(xì)胞是否長期存在于該動物血液中。目前，這是造血干細(xì)胞量化的最可靠方法(Harrison等，Bxp.Hematol.，21，206-219，1993)。
在使用人類細(xì)胞時，可以應(yīng)用的是一種使用NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重度免疫缺陷綜合病)小鼠或β2-微球蛋白缺陷型NOD/SCID小鼠作為移植用動物的方法(Larochelle等，Nat.Med.，2，1329-1337，1996；Kollet等，Blood，95，3102-3105，2000)。
加入到細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基中的M-CSF濃度優(yōu)選地為約0.1-100ng/ml，更加優(yōu)選地為約1-50ng/ml，最為優(yōu)選地為約5-20ng/ml。通過加入0、1、10或100ng/ml的M-CSF來檢測造血干細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入10ng/ml的M-CSF時，它可以顯著提高細(xì)胞增殖能力，但是加入100ng/ml的M-CSF則阻礙了細(xì)胞增殖。這提示對于造血干細(xì)胞的增殖存在著一個優(yōu)化的濃度范圍。
進一步通過c-Kit和Sca-1的陽性選擇從Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞中選擇的細(xì)胞并沒有顯示用M-CSF處理的造血干細(xì)胞的增殖，而c-Kit和Sca-1已知為造血干細(xì)胞標(biāo)志。在Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞在M-CSF受體(c-fms)陰性部分中。由此，認(rèn)為M-CSF并非直接作用于造血干細(xì)胞，而是M-CSF對造血干細(xì)胞增殖的影響是通過對其他任何細(xì)胞比如c-fms陽性細(xì)胞的間接作用或通過源于這些細(xì)胞的一些因子而引起的。
本發(fā)明進一步提供一種包含M-CSF的用于培養(yǎng)Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞的試劑盒。所述培養(yǎng)試劑盒包含M-CSF以及合適的細(xì)胞因子、培養(yǎng)基等，因而可用于體外培養(yǎng)Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞。
此外，如上所述由于M-CSF提高包含造血干細(xì)胞的細(xì)胞增殖，它可以用作提高造血干細(xì)胞增殖的試劑。所述含有M-CSF的用于提高造血干細(xì)胞增殖的試劑可以包含與M-CSF一起使用的合適細(xì)胞因子和生長因子。如果為提高造血干細(xì)胞而加入此試劑的細(xì)胞培養(yǎng)物能夠產(chǎn)生足夠的造血干細(xì)胞體外增殖，那么從少量體外骨髓、外周血或臍帶血增殖而來的細(xì)胞即可用作造血干細(xì)胞源。另外，如果直接在活體內(nèi)施用M-CSF能夠帶來顯著的造血干細(xì)胞體內(nèi)增殖，那么在移植中即使是少量的造血干細(xì)胞亦是足夠的，而且如果是這樣的話，則臍帶血移植不僅能夠用于兒童也可能用于成人。
附圖簡述

圖1顯示利用StemSepTM進行抗Lin抗體混合物標(biāo)記的從小鼠骨髓得到的細(xì)胞群的流式血細(xì)胞計數(shù)圖。圖注“柱處理前”表示沒有通過MACS LS+柱處理的細(xì)胞群的分析數(shù)據(jù)；圖注“柱處理后”顯示通過該柱處理的細(xì)胞群的分析數(shù)據(jù)?？梢岳斫釹temSepTM的處理提供了譜系標(biāo)志(Lin)-陰性或弱陽性細(xì)胞。
圖2顯示M-CSF促進細(xì)胞增殖的活性。圖中，“供體細(xì)胞百分比”一欄表示源于Ly5.1小鼠的Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞在Ly5.2小鼠外周血中的比例，將源于Ly5.1小鼠的Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞用不同類型的細(xì)胞因子進行處理，隨后將其與源于Ly5.2小鼠的細(xì)胞一起移植到經(jīng)致死輻照的Ly5.2小鼠體內(nèi)，移植后6個月對Ly5.2小鼠的外周血進行分析?！靶迈r的”代表未用細(xì)胞處理；“SCF+IL-11+FLT”代表含有M-CSF以及SCF、IL-11和Flt-3的細(xì)胞培養(yǎng)物；“SCF+IL-11+TPO”代表含有M-CSF以及SCF、IL-11和TPO的細(xì)胞培養(yǎng)物。
圖3顯示小鼠外周血白細(xì)胞的各種分化標(biāo)志的表達(dá)，為此，將Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞用SCF、IL-11和Flt-3與10ng/ml的M-CSF一起進行培養(yǎng)，將得到的細(xì)胞移植入小鼠體內(nèi)并且在移植6個月之后對小鼠外周血進行分析。簡單地說，用生物素化的各種分化標(biāo)志的抗體和PE標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白進行外周血白細(xì)胞的染色，隨后用FITC標(biāo)記的抗小鼠Ly5.1抗體進行復(fù)染色，以流式細(xì)胞儀對此進行分析。圖中，垂直軸代表分化標(biāo)志Mac-1、Gr-1、B220或CD3e的表達(dá)強度；水平軸代表Ly5.1(源于移植細(xì)胞)的表達(dá)強度。
本發(fā)明的最佳實施方式參照下列實施例對本發(fā)明進行具體描述，但本發(fā)明并不局限于所述實施例1(骨髓細(xì)胞的采集)從C57BL/6J-Ly5.1小鼠(杰克遜實驗宣)的大腿骨和脛骨中采集骨髓細(xì)胞，懸浮于包含5％小牛血清(FBS，ImmunbiologicalLaboratory)的Hunks平衡鹽溶液(Gibco-BRL)(下文稱為HBSS)中，使用配有22號針頭的1ml注射器制成浮游有細(xì)胞的懸浮液。使用40μm孔徑的尼龍網(wǎng)(Falcon)對浮游有細(xì)胞的懸浮液進行過濾以去除細(xì)胞團聚體。通過以1,100轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心5分鐘進行清洗，隨后再次懸浮于HBSS中，形成骨髓細(xì)胞的單細(xì)胞浮游懸浮液。
(Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞的制備)使用StemSepTM(StemCell Technologies INC.)進行小鼠造血前體細(xì)胞的制備，根據(jù)該試劑盒所附手冊制備分化抗原-陰性或弱陽性(Lin＜弱陽性)的細(xì)胞。首先，將抗分化抗原的生物素化的抗體混合物加到單細(xì)胞懸浮液中，在冰上反應(yīng)20分鐘，隨后以HBSS洗滌，以1,100轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。再次將細(xì)胞懸浮于HBSS中，加入一種用于與生物素化的抗體結(jié)合的四聚抗體復(fù)合物混和物，在冰上反應(yīng)40分鐘，隨后加入磁性膠質(zhì)進一步反應(yīng)40分鐘。讓細(xì)胞懸浮液通過MACS LS+柱(Miltenyi Biotec.)以吸附被標(biāo)記的細(xì)胞，收集未標(biāo)記的細(xì)胞。將藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(Pharmingen)加入到一部分收集的細(xì)胞中，并用EPICS-XL流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)進行分析。如圖1所示，收集的細(xì)胞為Lin＜弱陽性的原始細(xì)胞群。
(培養(yǎng))將由此獲得的Lin＜弱陽性細(xì)胞以4×104細(xì)胞/孔的量接種至一個組織培養(yǎng)用的6孔微板中，用包含5％FBS和10μg/ml慶大霉素(Sigma)的RPMI 1640(Gibco-BRL)在5％CO2、37℃下培養(yǎng)6天。將SCF、IL-11、FLT和TPO作為細(xì)胞因子加入到培養(yǎng)物中，其濃度為100ng/ml。加入M-CSF以證實效果，其終濃度為1、10或100ng/ml。在此所用的全部細(xì)胞因子都從Pepro Tech.Inc購得。
(將培養(yǎng)細(xì)胞移植到小鼠中)在有細(xì)胞因子的情況下培養(yǎng)6天后，用移液管從微板收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在HBSS中，加入106個從C57BL/6J-Ly5.2小鼠(NipponClea)中制備的新鮮骨髓細(xì)胞，以1,100轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。最后，將細(xì)胞懸浮在400μl 1mM含HEPES的HBSS中，并將其通過尾靜脈移植入經(jīng)致死輻照(800倫琴)的C57BL/6J-Ly5.2小鼠體內(nèi)。
(移植細(xì)胞衍生的白細(xì)胞的檢測)細(xì)胞移植6個月后，用涂有肝素的毛細(xì)管從每只小鼠的尾尖采集25μl的外周血，隨后立即懸浮在含有10單位/ml的肝素的500μl磷酸緩沖液(PBS(-)；Gibco-BRL)中。通過以1,100轉(zhuǎn)/分離心5分鐘去除上清液，將細(xì)胞懸浮在500μlHBSS中。隨后，加入10μl用PBS(-)稀釋10倍的FITC標(biāo)記的抗小鼠Ly5.1(Pharmingen)，在冰上暗反應(yīng)30分鐘。通過以1,100轉(zhuǎn)/分離心5分鐘收集細(xì)胞，隨后于室溫下懸浮在含有155mM氯化銨(NH4Cl)、10mM碳酸氫鉀(KHCO3)和0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的500μl溶血溶液中。重復(fù)溶血處理兩次。以HBSS洗滌細(xì)胞，通過以1,100轉(zhuǎn)/分離心5分鐘收集細(xì)胞，隨后懸浮在含有2μg/ml 7-氨基放線菌素D、0.2％牛血清白蛋白、0.05％疊氮化鈉和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)的HBSS中，并用EPICS-XL流式細(xì)胞儀進行分析。
如圖2中所示，移植細(xì)胞衍生的白細(xì)胞比例依賴于M-CSF的濃度而增長。這可以反映在培養(yǎng)周期過程中造血干細(xì)胞自我更新的增長。但是，M-CSF在高濃度時出現(xiàn)了對造血干細(xì)胞更新的抑制作用，這可以理解為M-CSF對造血干細(xì)胞更新的促進作用嚴(yán)格受其濃度的控制(圖2)。
如表1所示，將結(jié)果量化。將等于106個骨髓細(xì)胞的骨髓重建活性(種群重建單位，RU)定義為1個單位。在表1中所示計算公式的基礎(chǔ)上，對在有細(xì)胞因子存在的情況下在培養(yǎng)前與培養(yǎng)后的造血干細(xì)胞的活性按照種群重建單位進行比較。由于加入10ng/ml的M-CSF使得RU進一步增長了兩倍多，因此已從試驗上證實M-CSF可用于造血干細(xì)胞的增殖。
如果造血干細(xì)胞能夠像上述那樣高度增殖，就有可能減少用于造血干細(xì)胞移植所要收集的干細(xì)胞數(shù)量。對于這一效應(yīng)，從保證供體安全性的角度來看本發(fā)明是有價值的。
表1 M-CSF對造血干細(xì)胞增殖的影響

RU＝％Ly5.1(100-％Ly5.1)(對移植細(xì)胞衍生的白細(xì)胞的分化抗原的檢測)在細(xì)胞移植6個月后，用涂有肝素的毛細(xì)管從每只小鼠的尾尖采集100μl的外周血，立即懸浮在含有10單位/ml的肝素的2ml磷酸緩沖液(PBS(-)；Gibco-BRL)中，隨后分成4份用于抗體染色。洗滌細(xì)胞并懸浮在500μl HBSS中，每管加入2μl生物素化的抗小鼠Mac-1、抗小鼠Gr-1、抗小鼠B220或抗小鼠CD3e(Pharmingen小鼠譜系組)作為抗分化抗原的抗體，在冰上進行抗體反應(yīng)20分鐘。反應(yīng)后，以HBSS洗滌細(xì)胞兩次，并再次懸浮在500μl的HBSS中。另外，加入0.5μl PE標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(Pharmingen)和1μl FITC標(biāo)記的抗小鼠Ly5.1(Pharmingen)，在冰上暗反應(yīng)20分鐘。隨后，通過以1,100轉(zhuǎn)/分離心5分鐘來收集細(xì)胞，隨后于室溫下懸浮在含有155mM氯化銨(NH4Cl)、10mM碳酸氫鉀(KHCO3)和0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的500μl溶血溶液中。重復(fù)溶血處理兩次。以HBSS洗滌細(xì)胞，通過以1,100轉(zhuǎn)/分離心5分鐘收集細(xì)胞，隨后懸浮在含有2μg/ml 7-氨基放線菌素D、0.2％牛血清白蛋白、0.05％疊氮化鈉和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)的HBSS中，并用EPICS-XL流式細(xì)胞儀進行分析。
如上所述，造血干細(xì)胞既有自我更新的能力，又有分化成所有血細(xì)胞的能力。如果造血干細(xì)胞不存在，移植細(xì)胞衍生的血細(xì)胞將于細(xì)胞移植3個月后消失。如圖3所示，移植后6個月，表達(dá)髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的分化抗原的移植細(xì)胞衍生的(Ly5.1小鼠骨髓源)細(xì)胞在移殖后的小鼠中被檢測出來。這證實了移植細(xì)胞群包含造血干細(xì)胞(圖3)。
盡管詳細(xì)地并參考特定的實施方式對本發(fā)明進行了描述，然而對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明精神和保護范圍的前提下能夠進行各種的改變和改良是顯而易見的。
本申請建立在申請日為2001年10月30日(申請?zhí)?001-331940)的日本申請基礎(chǔ)上，此處引用其內(nèi)容作為參考。
工業(yè)實用性本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法、增殖方法、由所述方法獲得的造血干細(xì)胞群、培養(yǎng)用的試劑盒以及用于促進增殖的試劑使得造血干細(xì)胞的體外增殖成為可能，這些可以應(yīng)用于造血干細(xì)胞的移植。此外，增殖試劑的直接施用使得利用少量的造血干細(xì)胞進行細(xì)胞移植成為可能。
權(quán)利要求
1.一種用于在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的存在下培養(yǎng)Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞的方法。
2.一種通過在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的存在下培養(yǎng)Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞來增殖造血干細(xì)胞的方法。
3.一種由權(quán)利要求2所述的方法獲得的造血干細(xì)胞群。
4.一種含有巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的用于培養(yǎng)Lin-陰性或弱陽性細(xì)胞的試劑盒。
5.一種含有巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)的用于促進造血干細(xì)胞增殖的試劑。
全文摘要
一種用于在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M－CSF)的存在下培養(yǎng)Lin－陰性或弱陽性細(xì)胞的方法；一種通過在M－CSF的存在下培養(yǎng)Lin－陰性或弱陽性細(xì)胞來增殖造血干細(xì)胞的方法；由所述的增殖方法獲得的造血干細(xì)胞群；一種含有M－CSF的用于培養(yǎng)Lin－陰性或弱陽性細(xì)胞的試劑盒；以及一種含有M－CSF的用于增殖造血干細(xì)胞的試劑。
文檔編號C07K14/435GK1606615SQ02825620
公開日2005年4月13日 申請日期2002年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月30日
發(fā)明者名和克彥, 蓮村麻衣, 今田千晴 申請人:第一制藥株式會社